Alda Ernestina dos Santos

23/10/20141

Universidade Federal do Rio de JaneiroInstituto de Pesquisas de Produtos Naturais

Composição química e atividade inseticida dos óleos voláteis das folhas de Eucalyptus

spp. utilizadas pela população de Luz-MG no combate à dengue

Projeto de Pesquisa para Exame de Qualificação

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INTRODUÇÃO Óleos voláteisCaracterísticas

� Plantas aromáticas (Asteraceae, Poaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Zingiberaceae,Pinaceae, Apiaceae, Cupressaceae)

� “Produto obtido a partir de matéria prima vegetal p or hidrodestilação ou destilação por arraste a vapor; ou partir do epicar po de espécies de Citrus por processo mecânico” (Norma ISO 9235.2)

� Produzidos por estruturas secretoras especializadas

� Geralmente líquidos voláteis, lipossolúveis, incolo res e menos densos que a água

� Funções diversas nos vegetais

� Cerca de 20-60 componentes (majoritário(s) com 20-7 0% de abundância)

� Predominância de terpenos principalmente monoterpen oides (90%) esesquiterpenoides

Bakalli et al . (2008); Schmidt (2010); Vitti & Brito (2003); Fra nz & Novak (2010)

3

INTRODUÇÃO Óleos voláteisTerpenos

Figura 1: Exemplos de terpenos componentes de óleos voláteis diversos

Monoterpenos

O

O

CitronelalCymbopogon winterianus

NeralCitrus x limon

PulegonaMentha pulegium

Dewick (2002)

O

ThujonaArtemisia absinthium

α-felandrenoZingiber officinale

OH

MentolMentha x piperita

Sesquiterpenos

O

α-bisabolenoOriganum vulgare

α-gurjunenoAchyrocline satureoides

α-humulenoHumulus lupulus

β-cariofilenoCinnamomum zeylanicum

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INTRODUÇÃO Óleos voláteisAtividade sobre insetos

� Atividade inseticida e/ou repelente� Atividade sobre Aedes , Anopheles e Culex� Óleo de citronela – 1901 até 1940� Citronela, limão e eucalipto – repelentes de uso tóp ico recomendados pela US Environmental

Protection Agency

Menos tóxicos para os organismos não alvosGeralmente não induzem à resistênciaMenor ecotoxicidade

Mecanismos de ação não são bem estabelecidosCurto período de ação devido à alta volatilidade

Toxicidade aguda em ratosOral: LC 50 = 2170-3664 mg/KgInalação: LC 50 = 5.95 mg/LDérmica: LC 50 = 4280 mg/Kg

Toxicidade aguda em ratosOral: LC 50 = 4200 mg/KgInalação: LC 50 = 7.05 mg/LDérmica: LC 50 = 5000 mg/Kg

Nerio et al . (2010); Katz et al . (2008); George et al . (2014); Knaak & Fiuza (2010)

N

O

DEETN,N- dietil- m-toluamida

5

INTRODUÇÃO EucalyptusCaracterísticas

Figura 2 : E. pilularis em área de cultivo

� Myrtaceae; cerca de 700 espécies; origem Australian a� Eucalyptus = eu, “bem” + kalyptós , “coberto”� Fácil adaptação climática; cultivado em todo o mund o (madeira e óleos voláteis)� Árvores de grande porte e odor característico� Grande interesse comercial (indústrias farmacêutica e alimentícia e da perfumaria)� 1855 - introdução de E. globulus no Brasil

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http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Starr_020203-0027_Eucalyptus_pilularis.jpg

Zrira et al . (2004); Cheng et al . (2009); Vitti & Brito (2003)

Figura 3 : Frutos secos de E. pilularis

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INTRODUÇÃO EucalyptusÓleos voláteis

Zrira et al . (2004); Doran (1991) Brooker & Kleinig (2006)

� Folhas, cascas, brotos e frutos� Apenas 200 espécies avaliadas quanto à composição qu ímica� Mistura de 50-100 componentes, principalmente monot erpenos

O

1,8-cineolE. globulus

β-ocimenoE. curtisii

β-pinenoE. tenuipes

α-pinenoE. rubiginosa

α-thujenoE. alba

OH

globulolE. camaldulensis

OH

espatulenolE. alba

germacreno DE. varia

OH

trans -nerolidolE. deglupta

Figura 4: Exemplos de terpenos componentes dos óleo s voláteis de Eucalyptus spp.

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INTRODUÇÃO EucalyptusÓleos voláteis

Tabela 1: Compostos majoritários observados em Eucalyptus spp. Coletadas em regiões diversas

Classificação quanto à composição

� Medicinais – 1,8-cineol como majoritário (acima de 70%); produt os farmacêuticos� Industriais – felandreno ou piperitona; desinfetantes, obtenção do timol e mentol� Perfumaria – citral ou citronelal; essências

Tapondjou et al ., (2005)Camarões39.5αααα-pinenoE. saligna

Medhi et al ., (2010)Irã69.51,8-cineolE. camaldulensis

Vilela et al ., (2009)Brasil89.91,8-cineolE. globulus

Elaissi et al ., (2011)Tunísia54.01,8-cineolE. citriodora

Ribeiro et al ., (2013)Brasil72.9(+) - limonenoE. staigeriana

Grbovic et al ., (2010)Montenegro28.6p-cimenoE. camaldulensis

Oyedeji et al ., (1999)Nigéria32.9αααα- thujenoE. alba

Zrira et al ., (2004)Marrocos87.81,8-cineolE.cinerea

Brophy et al ., (2009)Austrália31.0ββββ-pinenoE. tenuipes

Cheng et al ., (2009)Taiwan22.52αααα-pinenoE. camaldulensis

ReferênciaPaís da coleta(%)Composto Espécie

Bizzo et al . (2009)7

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INTRODUÇÃO EucalyptusAtividade inseticida e repelente

Tabela 2: Atividade de Eucalyptus spp. sobre espécies diversas de insetos

Maciel et al . (2010) ; Batish et al . (2008)

� Potencialidade como inseticida e/ou repelente

� Baixa toxicidade para mamíferos

� Facilidade de obtenção

A. aegypti

Larvicida

Adulticida

Repelente

Manimaran et al ., (2013)Aedes aegyptiLarvicidaE. globulus

Alzogaray et al ., (2011)Blattella germanicaNinficidaE. dunnii

Yang et al ., (2004)Pediculus humanusOvicidaE. globulus

Lucia et al ., (2009)Aedes aegyptiFumiganteE. grandis

Kumar et al ., (2012)Musca domesticaPupicidaE. globulus

Medhi et al ., (2010)Anopheles stephensiLarvicidaE. camaldulensis

Sritabutra & Soonwera (2013)Aedes aegyptiRepelenteE. citriodora

Roh et al ., (2013)Tetranychus urticaeRepelenteE. elata

Jemâa et al ., (2013)Ectomyelois ceratoniaeAdulticidaE. camaldulensis

ReferênciaEspécie alvoAtividadeavalidada

Espécie

9

10

INTRODUÇÃO Dengue

Figura 5: Municípios brasileiros infestados com A. aegypti

OMS (2002) ; Barreto & Teixeira (2008)

� Presente em mais de 100 países� 50-100 milhões de casos anuais� 2,5 bilhões de pessoas em áreas de risco� Aedes aegypti – DENV-1; DENV-2, DENV-3 e DENV-4� Controle – inseticidas sintéticos e campanhas de sen sibilização

http://noticias.r7.com/saude/noticias/numero-de-mor tes-por-dengue-20100711.html

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INTRODUÇÃO Luz-MG

Tabela 3: Casos de dengue notificados no Brasil, Mi nas Gerais e Luz entre 2009-2013

IBGE (2006) ; IBGE (2010)

� 17.486 habitantes � Agricultura e pecuária� Cultivo de Eucalyptus spp. (fonte de madeira)� 693 hectares de área plantada� 35.000 toneladas anuais� Espécies mais cultivadas: E. pellita , E. pilularis , E. paniculata e E. saligna� Uso popular das folhas (sub produto) no combate ao Aedes aegypti

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Geral

OBJETIVOS

Estudo da composição química dos óleos voláteis das folhas de E. pilularis , E. pellita e E. saligna , bem como avaliação de sua atividade sobre Aedes aegypti

Específicos

I) Obtenção dos óleos voláteis através da hidrodestila ção

II) Análise da composição química por CGAR-EM

III) Determinação das propriedades físicas dos óleos o btidos

IV)Avaliação da atividade sobre ovos, larvas, pupas e insetos adultos de A. aegypti

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JUSTIFICATIVA

I) Grande interesse científico e popular sobre Eucalyptus spp.

II) Potencial dos óleos voláteis como fonte de subs tâncias inseticidas e/ou repelentes

III) Escassez de estudos químicos com E. pilularis , E. pellita e E. saligna

IV) Importância de agregar valor aos sub-produtos d estas espécies

V) Necessidade da busca por alternativas no control e de Aedes aegypti

VI) Relevância de estudos que visem à confirmação ci entífica das propriedades relatadas pelo uso popular de espécies vegetais

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METODOLOGIA

Coleta das folhasE. pilularis, E. pelitta, E. saligna

Secagem à sombra 5 dias

Óleos voláteisComposição química e qualidade

Hidrodestilação

IdentificaçãoBotânica

Prof. Cassia Sakuragui

Análise por CGAR-EM

Clevenger por 3 horas

Controle de qualidade

Óleo volátil

Coluna: DB-5 ms (25m x 0.25mm x 0.25 µm)Injetor: 260°C; Detector: 290°C; 1 mL/min.60-290°C (3°C/min)

NIST 21 e NIST 107; Índice de Kovats; Adams (2007)

Densidade relativa – picnômetro (20°C)Rotação óptica – polarímetro Acatec PD-5000Índice de refração – refratômetro de Abbe 2WAJTeor de 1,8-cineol – CGAR-EM

ISO 3044Densidade relativa (20°C) = 0,858 – 0,877Rotação óptica (20°C) = (-2) a (+4)Índice de refração = 1,4500 – 1,4590Teor de 1,8-cineol > 70%

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METODOLOGIA

Colônia de cultivo

10-12 dias

Óleos voláteisAtividade sobre A. aegypti

Ovos

Larvas

Ovos A. aegyptiInstituto de Biologia

do Exército

Atividade ovicida (48 horas)12.5 – 150 ppm

tiras com 100 ovos(-) tween 80 (0,01%)

Atividade larvicida (24 horas)25 – 200 ppm

25 larvas de 3° estádio(+) temefós (6ppm); (-) tween 80 (0,01%)

Pupas

Atividade pupicida (24 e 48horas)75 – 250 ppm

25 pupas recém emergidas(+) temefós (6ppm); (-) tween 80 (0,01%)

Fêmeas adultas

Atividade adulticida (24 horas)150 – 500 ppm

20 fêmeas (5-6 dias de idade)60 min. exposição kit OMS

(+) dichlorvos (0,8 ppm)

Atividade repelente 0.5, 1 e 2 mg/cm 2

50 fêmeas (4-8 dias de idade)(+) OFF! (SC Johnson)

Análise estatísticamédia ± desvio padrão, % de mortalidade, % de proteç ão

LC50 e LC90 por análise de ProbitAnova – teste de Tukey 5% significância 14

Govindarajan et al. (2011)

OMS (2005)

Panneerselvam et al. (2011)

OMS (1981)OMS (2009)

Resultados Esperados

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� Conhecer a composição química dos óleos voláteis

� Resultados experimentais X uso popular; agregar val or às folhas

� Controle de qualidade. Interesse comercial?

� Avaliação em diferentes estágios de desenvolvimento = resultados mais completos

� Atividade larvicida – análise por MEV, possíveis mod ificações estruturais

� Atividade adulticida – análise da composição química do vapor do óleos empregando HS-SPME CG-EM

� Atividade repelente – análise da atividade repelente das velas produzidas com o sumo das folhas de Eucalyptus spp.

Perspectivas

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Equipe Envolvida

Identificação botânica das espécies

Profª. Cássia M. Sakuragui – IB/UFRJ

Química

Prof. Ricardo M. Kuster – IPPN/UFRJ

Msc Alda Ernestina dos Santos

Atividade BiológicaProfª. Naomi Kato Simas – FF/UFRJ

Celso Evangelista dos Santos – IPPN/UFRJ

Alunos Mestrando – 1 aluno

Iniciação científica – 2 alunos

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Orçamento Material de consumo

Quadro 1: Gastos com material de consumo

R$ 671,50Gasto total com material de consumo

10,45500 g10,45Cultivo dos insetosSacarose

100,00-100,00DiversasMaterial de escritório

109,002 ml109,00CromatografiaPadrão de n-alcanos

33,70250 g33,70Tratamento dos óleosNa2SO4 anidro

12,606 Pcts. 100 unid.2,10Teste larvicidaCopos descartáveis

64,00Pct. 1000 unidades64,00Testes biológicosPonteiras micropipeta

24,80Pct. 100 unidades24,80Cultivo dos insetosPipetas descartáveis

7,95500 g7,95Cultivo dos insetosRação canina

48,003 unidades16,00Testes biológicosRack para tubos

53,00Pct. 500 unidades53,00Testes biológicosTubos eppendorf

90,002 x 50 mL45,00Testes biológicosTween 80

18,00200 mL18,00Teste de repelênciaOFF! spray

95,00250 mg95,00Teste larvicidaTemephos

50,00250 mg50,00Teste inseticidaDichlorvos

Valor totalQuantidadeValor unitário

Finalidade Material

Material de consumo (valores expressos em reais)

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Orçamento Material permanente

Quadro 2: Gastos com material permanente

R$ 5761,00Total solicitado para a realização do projeto

R$ 5044,50Gasto total com material permanente

204,002102,00HidrodestilaçãoSuporte universal

74,00174,00HidrodestilaçãoTermômetro

346,001346,00HidrodestilaçãoManta aquecedora

349,001349,00HidrodestilaçãoAparato tipo Clevenger

34,5056,90Cultivo dos insetosBandeja plástica

158,001158,00Det. da densidadePicnômetro

1940,0011940,00Det. índice de refraçãoRefratômetro de Abbe

369,001369,00Coleta do material vegetalPodão e cabo extensor

1200,003400,00Testes biológicosMicropipeta monocanal

370,001370,00Testes biológicosAgit. tubos tipo vórtex

Valor totalQuantidadeValor unitário

Finalidade Material

Material permanente (valores expressos em reais)

Cronograma de Execução

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XXXXXElaboração de artigos e relatórios científicos

XXXXApresentação em eventos científicos

XXXXXAnálise dos resultados obtidos

XXXAvaliação das atividades inseticida e repelente

XXImplementação da colônia de A. aegypti

XXXAnálise da composição química dos óleos

XXDeterminação das propriedades físico químicas

XXObtenção dos óleos voláteis das folhas

XColeta e identificação de Eucalyptus spp.

XPesquisa e levantamento bibliográfico

87654321

TRIMESTRESATIVIDADE

Quadro 3: Cronograma de execução

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

20

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UMA BREVE HISTÓRIA DA MEDICINA

Doutor eu tenho uma dor ...

2000 a.C. - Aqui, coma essas raízes.1000 d.C. - Raízes são pagãs, reze.1850 d.C. - Rezas são superstição, beba essa poção.1940 d.C. - Essa poção é inútil, tome essa pílula.1985 d.C. - Essa pílula é inócua, tome esse antibióti co.2000 d.C. - Antibiótico é artificial, coma essa raiz.

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