PCR-REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE

HEMILLY RAYANNE F. SILVA

Universidade de Pernambuco – UPELaboratório de Resistência Microbiana- LRM

HISTÓRICO

• 1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, doinglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary Mullis;

• 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou esteprocesso;

• 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho.

O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA PELA DNA POLIMERASE?

OBJETIVO DA PCR

É a obtenção de muitas cópias de uma sequênciaespecífica de ácido nucléico, a partir de uma fitamolde, ou seja, consiste na produção de DNA, invitro.

COMO É FEITO?

Em primeiro lugar, deve-se extrair o materialgenético(DNA) da célula ou outro material a serestudado.

COMO É FEITO?

REAGENTES PARA A REAÇÃO

• DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É acatalisadora da extensão dos primers; Aumento na suaconcentração pode resultar na diminuição da suaespecificidade;

• SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íonsdiversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condiçõesda reação;

REAGENTES PARA A REAÇÃO

• MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são

cofatores indispensáveis para a atividade da enzima;

• dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade

da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com aatividade da polimerase e diminuindo o anelamento doprimer.

REAGENTES PARA A REAÇÃO

COMO ESCOLHER O PRIMER?

PRIMER/INICIADOR

• Sintetizados quimicamente;

• 15 a 25 bases ;

• Define limites alvo a amplificar;

• Serve como ponto de início para a replicação;

• Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duasdireções (para frente e para trás);

• Banco de Dados International Nucleotide Sequence Database(www.insdc.org)

• GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology Laborstory(EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)

COMO É FEITO?Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquinatermocicladora que possui como função fazer ciclosde temperaturas pré-estabelecidos com temposexatos específicos para as reações seguintes daanálise.

COMO É FEITO?

ETAPAS DO CICLO

• 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita doDNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador iráelevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irápromover a separação da fita dupla de DNA em duas fitassimples através da quebra das pontes de hidrogênio.

92C

3’5’

3’ 5’

+

5’3’

5’ 3’

ETAPAS DO CICLO

• 2-Anelamento: Cada fita simples do DNA que foidesnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeiascomplementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primersse anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para aenzima polimerase.

5’3’

5’ 3’

Forward primer Reverse primer

ETAPAS DO CICLO• 3-Extensão:Aquece-se novamente o tubo a 72ºC

(temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) paraa duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final doprimer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNAligando-os por complementaridade, formando assim umanova fita dupla.

PRODUTO FINAL DA PCR

• DNA primeira copia

• PCR

DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCRFinalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença deprodutos amplificados; Em geral isso é realizado pelaeletroforese em gel de agarose ou acrilamida.

PCR

PONTOS IMPORTANTES PARA O BOM

FUNCIONAMENTO DA PCR

PONTOS IMPORTANTES:

• Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente ótimas.Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos nãoespecíficos, reduzindo a concentração do produto desejado.Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final dareação, resultando em baixa concentração do produto desejado;

• A temperatura de anelamento depende do comprimento e composiçãodos primers. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta emanelamento não-específico e, portanto, amplificação não-espeífica.Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta numa reduzidaconcentração do produto.

PONTOS IMPORTANTES:

• Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estarintacta. Uma qualidade pobre de DNA, irá frequentemente conteriniciadores que deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtasdentro do molde;

• A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveriaser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária parauma PCR ótima;

• Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser suficientementeamplificado em 30 ciclos. A pureza do molde também influencia noresultado da reação.

PCR

APARECIMENTO DE BANDAS INESPECÍFICAS NA PCR O QUE FAZER?

SUGESTÃO

• Reduza a quantidade de DNA;

• Diminuir o tempo de anelamento da reação;

• Aumente a temperatura de anelamento;

• Reduza a concentração da enzima;

• Reduza a concentração de Mg²⁺;

• Aumento do tempo de desnaturação;

• Aumento da temperatura de desnaturação;

• Reduza o tempo de extensão;

• Reveja os desenhos dos primers.

BANDAS INESPECÍFICAS

PCR

A REAÇÃO ESTAVA FUNCIONANDO ANTES, MAS AGORA EU NÃO OBTENHO NENHUM

PRODUTO. O QUE FAZER?

SUGESTÃO

• Tenha certeza que todos os componentes estão na reação(tampão, DNA, primers…);

• Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP(são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

• Utilize um estoque novo de primers;

• Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtivernenhum fragmento verifique todas os componentes.

VANTAGENS DA TÉCNICA

• Capacidade de amplificar uma sequência precisa deDNA;

• Rápida;

• De baixo custo;

LIMITAÇÕES

• Necessidade de conhecer a sequência de DNA aamplificar para que possam sersintetizados primers específicos;

• Facilidade de contaminação da amostra;

• Extensão limitada da sequência a se amplificar;

• Limitada extensão da sequência;

• Incorporação errônea de bases durante areplicação.

PRINCIPAIS USO DA PCR