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Universidade Federal de Ouro Preto Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
INFLUÊNCIA DA UTILIZAÇÃO DA DESFERRIOXAMINA, QUELANTE DE FERRO,
SOBRE O CURSO DA INFECÇÃO PELO Trypanosoma cruzi EM CAMUNDONGOS
Jerusa Marilda Arantes
0uro Preto, MG 2006
INFLUÊNCIA DA UTILIZAÇÃO DA DESFERRIOXAMINA, QUELANTE DE FERRO,
SOBRE O CURSO DA INFECÇÃO PELO Trypanosoma cruzi EM CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração Imunoparasitologia de Protozoários. Orientadora: Profa Cláudia Martins Carneiro Co-Orientadora: Profa Maria Lúcia Pedrosa
Ouro Preto, MG 2006
ARANTES, J.M. Agradecimentos
i
A Deus,
“ Que em sua infinita bondade, e pela força que age sobre nós, podendo fazer muito
mais do que pedimos ou imaginamos, agradeço por ter me dado coragem de
conquistar meus objetivos e de me acalentar nos momentos de fraqueza. A ti ofereço
minha vida.....”
A minha mãe e a minha avó,
A quem devo toda a minha gratidão e que desde minha infância, incentivaram-me a
estudar sempre. Sou grata pelo amor, carinho e confiança em mim depositada.
Obrigada por serem exemplos de dignidade e fortaleza, sempre me mostrando os fatos
e a vida como realmente são e nunca me deixando desistir.
A minha querida irmã,
Pelo carinho e pelo apoio de sempre. Por todas as vezes que mesmo sem dominar
muito bem o assunto, ficava me olhando, ouvindo, dando conselhos e sugestões.
ARANTES, J.M. Agradecimentos
ii
À professora Cláudia, pela orientação dedicada e compreensiva que influenciou de
forma decisiva a conclusão deste trabalho e pelo apoio, ensinamento e incentivo em
importantes etapas da minha formação profissional. Obrigada por esta convivência
mais que agradável, onde eu pude aprender que competência, aprendizagem e
liderança somente fazem sentido se vierem acompanhadas de gentileza, atenção, bom
humor e principalmente amizade.
À Maria Chaves, agradeço pela disponibilidade com que me acolheu no laboratório,
pela acessibilidade, competência com que me ensinou tudo o que sei de técnicas
histopatológicas. Pela amizade, paciência e pelas conversas que muito contribuíram
para meu crescimento profissional e pessoal.
Ao professor Washington Tafuri em especial, que desde a minha monografia de
conclusão de curso, acreditou e apoiou a continuidade do projeto com fantásticas
sugestões. Pelo enorme carinho, respeito e incentivo áqueles que estão apenas
começando a seguir a enorme estrada por ele trilhada.
Ao amigo Vitor, pela grande amizade, companheirismo, lealdade em todos estes anos
de convivência no laboratório. Pela cumplicidade e alegria que dividimos em todas as
etapas da nossa formação profissional. Muito obrigada por tudo.
À professora Maria Lúcia, pela oportunidade e confiança a mim depositada. Pela co-
orientação dedicada, enriquecedora e compreensiva e pelo decisivo estímulo à
conclusão deste trabalho.
Aos meus queridos amigos do laboratório de Histopatologia, Ana Luíza, Amanda,
Carolina, Fernanda, Juliana Santiago, Juliana Vitoriano, Vanessa, Sheler, Tália, Nádia,
Wendel, Rodrigo, Bruno e Rodolfo que me apoiaram no desenvolvimento do trabalho e
pela contribuição de cada um em algum momento. Pela agradável convivência,
amizade e compreensão.
Agradeço a todos que direta ou indiretamente participaram da realização deste
trabalho, em especial a Vanessa, Maísa, Daniela, Amanda, Hélen, Arnaldo, Lílian,
ARANTES, J.M. Agradecimentos
iii
Geovan, Jaqueline que foram imprescindíveis para a execução do mesmo. A minha
mais profunda gratidão.
A todos os professores e colegas de pós-graduação que de diversas maneiras
colaboraram para a viabilização deste trabalho. Em especial a Dani, Arlete, Vitor,
Lizziane, Maísa, Darlen, Michele e André pelo carinho, apoio e amizade.
A professora Terezinha pelo inóculo dos animais.
Ao professor Alexandre e a professora Marta de Lana pela agradável convivência,
sugestões e incentivo.
A Hélen, Lêda, professora Marta e amigos do laboratório de histopatologia pelas
enriquecedoras sugestões feitas durante a análise prévia.
Ao professor Marcelo Silva, funcionários e alunos do laboratório de Nutrição
Experimental da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto pelo
acolhimento e apoio durante a execução do trabalho.
A todos os funcionários do Biotério da Universidade Federal de Ouro Preto que
apoiaram a realização deste trabalho, em especial, Cristina e Marcos pela amizade e
apoio constante.
Á Cida, secretária do Nupeb, pela disponibilidade, sempre.
Ao Fábio, por todas as vezes que tivemos que deixar de lado algo que faz de nossas
vidas momentos saudáveis e felizes. Agradeço-te pela compreensão, paciência,
carinho, amizade e pelo incentivo dado a cada momento.
ARANTES, J.M. Resumo
iv
Utilizaram-se camundongos Swiss machos com trinta dias de idade, divididos em
quatro grupos experimentais: (1) controle não-tratado - CNT; (2) controle tratado - CT;
(3) infectado com a cepa Y do T. cruzi e não-tratado - INT e (4) infectado com a cepa Y
do T. cruzi e tratado - IT. Os animais tratados receberam 5mg/animal/dia de
Desferrioxamina (DFA) durante os 14 dias que precederam a infecção (500 formas
sanguíneas da cepa Y do T. cruzi via intraperitoneal). Após a infecção, o grupo IT
recebeu DFA por mais 21 dias. Nos grupos infectados, tratados ou não, avaliaram-se a
curva de parasitemia diária, período pré-patente, patente, pico de parasitemia, dia do
pico de parasitemia, taxa de mortalidade, e nos animais que sobreviveram à fase
aguda da infecção, hemocultura, PCR e ELISA. Nos quatro grupos experimentais
foram realizadas a dosagem de ferro no fígado, ferro sérico e hemoglobina. Avaliou-se
também o peso dos animais, o peso relativo do coração, fígado, baço e linfonodo e as
alterações histopatológicas, bem como o parasitismo tecidual nestes órgãos. Os
animais foram necropsiados no 14o e 21o dia após a infecção (DAI). No grupo IT, a
média dos níveis de parasitemia, a taxa de mortalidade apresentaram-se menores em
relação ao grupo INT. Não foram observadas diferenças significativas no período pré-
patente. O pico de parasitemia no grupo INT foi no 11o dia e no grupo IT no 10o. O
período patente no grupo INT (11 dias) foi significativamente menor que no grupo IT
(21 dias). Cinco animais do grupo IT e 1 animal do grupo INT sobreviveram à infecção.
Todos os animais tratados apresentaram hemocultura negativa na fase aguda e crônica
da infecção enquanto o animal não-tratado apresentou hemocultura positiva nas duas
fases. A PCR apresentou-se positiva em todos os animais tratados avaliados aos 60
DAI e 3 destes apresentaram PCR negativa aos 240 DAI. O animal infectado e não-
tratado apresentou PCR positiva aos 60 e 240. Todos os animais apresentaram ELISA
positiva aos 60 e 240 DAI. Os animais infectados apresentaram menores níveis de
ferro no fígado que os animais não-infectados no 14o e 21o DAI. Os animais do grupo
INT apresentaram maiores concentrações de ferro sérico quando comparados aos
animais dos grupos CNT e IT no 21o DAI. No 14o DAI, os animais do grupo IT
apresentaram níveis mais baixos de hemoglobina quando comparados ao grupo CT. O
tratamento com a DFA reduziu o peso corporal dos animais infectados ou não. Entre o
14o e 21o DAI, observou-se aumento de peso relativo do coração, baço, fígado e
linfonodo apenas no grupo INT. Os animais infectados, tratados ou não apresentaram
alterações histológicas semelhantes no coração. O fígado dos animais do grupo IT,
apresentou menor intensidade de alterações e a avaliação dos órgãos linfóides
ARANTES, J.M. Resumo
v
demonstrou resposta mais precoce no grupo IT. Não foram observadas diferenças em
relação ao parasitismo tecidual nos órgãos analizados dos animais infectados, tratados
ou não com DFA. Estes resultados demonstram que a diminuição dos níveis de ferro
do hospedeiro contribui para a melhora do quadro clínico da infecção.
ARANTES, J.M. Abstract
vi
Male Swiss mice with thirty days of age, were divided in four experimental groups: (1)
no-treated control - NTC; (2) treated control - TC; (3) no-treated and infected with Y
strain of T. cruzi - NTI; (4) treated and infected with Y strain of T. cruzi - TI. Animals
treated received daily doses (5mg/animal/day) of desferrioxamine (DF) during 14 days
before the infection (500 blood forms of Y strain of T. cruzi via intraperitoneal). After
infection, treated groups received DF for more 21 days. In TI and NTI groups
parasitaemia, prepatent period, patent period, day of maximum parasitemia mortality
were evaluated daily. Hemoculture, PCR and ELISA were performed in animals that
had survived to the acute phase. In all groups iron evaluations were performed by
means of the dosage of iron levels in the liver, hemoglobin and serum iron. One also
evaluated the weight of the animals, the relative weight and the histopathological
alterations, as well as tissue parasitism in the heart, liver, spleen and lymph nodes.
These animals had been sacrificed in 14o and 21o days after the infection. Treatment
produced a less severe disease. All treated animals that had survived to the acute
phase of the infection presented negative hemoculture in the acute and chronic phase
of the infection while no treated present positive hemoculture in both phases. All treated
animals presented positive PCR assay in the acute phase and 3 of these presented
negative PCR in the chronic phase. No treated animal presented positive PCR in both,
acute and chronic phase. Treated and no treated animals presented positive ELISA in
the acute and chronic phase. Infected groups presented minors levels of iron in the liver
when compared to no infected groups, treated or no treated. NTI group presented
greater levels of serum iron when compared to NTC and TI in 21o days after infection. In
14o day after infection, the TI presented lower levels of hemoglobin than NTI group. DF
treatment diminished the corporal weight of the infected animals or not. Between 14o
and 21o day after infection, were observed increase of relative weight of the heart,
spleen, liver and lymph nodes only in the NTI group. The infected, treated or no treated
animals presented similar histological alterations in the heart. The liver of the animals of
IT group, presented minor intensity of alterations and the evaluation of the lymphatic
organs demonstrated precocious reply in IT group. Differences in relation to tissue
parasitism in the analyzed organs of the infected treated or no treated animals had not
been observed. These results demonstrate that the reduction of the host iron levels
contributes for the improvement of the clinical picture of the infection.
ARANTES, J.M. Lista de Gráficos
vii
Gráfico 1 - Curvas de parasitemia média em camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, submetidos ou não ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção. .................................................................................................... 31
Gráfico 2 - Taxa de mortalidade cumulativa de camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi submetidos ou não ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção. .................................................................................................... 32
Gráfico 3 - Média da quantidade de ferro no fígado realizada no 14o e 21o dia após a infecção em camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado . ....................................... 35
Gráfico 4 - Média da dosagem de ferro sérico realizada no 21o dia após a infecção ..... 36
Gráfico 5 - Média da dosagem de hemoglobina realizada antes da infecção e no 14o dia após a infecção nos camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado . ........................ 37
Gráfico 6 - Média do peso corporal dos camundongos Swiss antes da infecção e aos 7, 14 e 21 dias após a infecção nos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado. ...................................................................... 38
Gráfico 7 - Peso relativo do coração, baço, fígado e linfonodo dos animais pertencentes aos grupos controle não-tratado, controle tratado, infectado não-tratado e infectado tratado no 14o e 21o dias após infecção..................................................................40
ARANTES, J.M. Lista de Figuras
viii
Figura 1 – Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=32), infectados com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados (n=16) ou não (n=16) com desferrioxamina. .............. 21
Figura 2 - Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=80), infectados (n=40) ou não (n=40) com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com desferrioxamina. ....................................... 22
Figura 3 - Produtos específicos de 330pb do minicírculo de kDNA do Trypanosoma cruzi obtidos com os iniciadores S35 e S36 em DNA extraído do sangue de camundongos infectados com a cepa Y, tratados com desferrioxamina e não-tratado, coletados nas fases aguda e crônica da infecção e visualizados em gel de poliacrilamida a 6%, corado pela prata ........................................................................... 33
Figura 4 - Fotomicrografia de secções de coração de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: ausência de alterações inflamatórias ou degenerativas; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório discreto e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório moderado e (F) intenso constituído em todos os campos por células mononucleadas. Observa-se a presença de degeneração hialina em todos os grupos infectados e a presença de ninhos (C) e amastigotas isoladas (D) (setas). Hematoxilina Eosina X600. ............ 42
Figura 5 - Fotomicrografia de secções de fígado de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: focos inflamatórios discretos; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório moderado e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório discreto e (F) discreto constituído em todos os campos por células mononucleadas. Hematoxilina Eosina X600. .................................................................................................................................... 43
Figura 6 - Fotomicrografia de secções de baço de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) e (F). Hematoxilina Eosina X600. .................................................................................................................................... 44
Figura 7 - Fotomicrografias de secções de linfonodo de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: quadro histológico compatível com normalidade; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) discreta hiperplasia folicular e (D) hiperplasia folicular instalada; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E e F) hiperplasia folicular. Hematoxilina Eosina B X300; A,C-F X130 ..................................................... 45
Figura 8 - Fotomicrografias de secções histológicas, de animais pertencentes aos grupos infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados (A, C, E e G) ou não (B, D, F e H) com desferrioxamina, submetidas à reação imuno-histoquímica anti-Trypanosoma cruzi. (A) amastigotas isoladas, processo inflamatório intenso e difuso; (B) ninho de amastigotas, inflamação discreta; (C) ninho de amastigotas e foco inflamatório ativo; (D) amastigota isolada e raras células inflamatórias;
ARANTES, J.M. Lista de Figuras
ix
(E,F,G,H) amastigotas isoladas e ninhos de amastigotas. Peroxidase Anti-Peroxidase X1000 .............................................................................................................. 46
ARANTES, J.M. Lista de Tabelas
x
Tabela 1- Hemocultura, PCR e ELISA realizados nas fases aguda (60 dias) e crônica (240 dias) nos camundongos que sobreviveram à infecção pela cepa Y do Trypanosoma cruzi tratados ou não com desferrioxamina ..................................... 34
ARANTES, J.M. Sumário
xi
1 - Introdução .................................................................................................................. 1
2 - Objetivos .................................................................................................................. 18 2.1 - Objetivo geral ..................................................................................................... 19 2.2 - Objetivos específicos ......................................................................................... 19
3 - Animais, materiais e métodos .................................................................................. 20 3.1 - Animais e tratamentos utilizados ....................................................................... 21 3.2 - Infecção e parâmetros biológicos avaliados ...................................................... 23
3.2.1 - Curva de parasitemia .................................................................................. 23 3.2.2 - Taxa de mortalidade .................................................................................... 24 3.2.3 - Hemocultura ................................................................................................ 24 3.2.4 - Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................... 24 3.2.5 - ELISA .......................................................................................................... 25
3.3 - Parâmetros relacionados à avaliação do ferro ................................................... 26 3.3.1 - Ferro tecidual .............................................................................................. 26 3.3.2 - Ferro sérico ................................................................................................. 26 3.3.3 - Níveis de hemoglobina ................................................................................ 27
3.4 - Necrópsias, coleta, fixação e processamento do material para microscopia óptica ......................................................................................................................... 27 3.5 - Técnica de Imuno-histoquímica para identificação do T. cruzi .......................... 28 3.6 - Análise estatística .............................................................................................. 29
4 - Resultados ............................................................................................................... 30 4.1 - Curva de parasitemia ......................................................................................... 31 4.2 - Taxa de mortalidade .......................................................................................... 32 4.3 - Hemocultura ...................................................................................................... 33 4.4 - PCR ................................................................................................................... 33 4.5 - ELISA ................................................................................................................. 34 4.6 - Ferro tecidual ..................................................................................................... 35 4.7 - Dosagem de ferro sérico .................................................................................... 36 4.8 - Níveis de hemoglobina ...................................................................................... 37 4.9 - Peso dos animais............................................................................................... 38 4.10 - Peso relativo dos órgãos ................................................................................. 39 4.11 - Análise histopatológica .................................................................................... 41
5 - Discussão ................................................................................................................. 47
6 - Conclusões ............................................................................................................... 60
7 - Perspectivas futuras ................................................................................................. 62
8 - Referências Bibliográficas ........................................................................................ 64
1 - Introdução
ARANTES, J.M. Introdução
2
A doença de Chagas é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma
cruzi e é transmitida por insetos hematófagos da subfamília Triatominae (Chagas,
1909). As estimativas indicam uma prevalência da infecção em 13 milhões de pessoas,
uma incidência anual de 200.000 novos casos e que existam cerca de 3,0 - 3,3 milhões
de indivíduos sintomáticos (WHO, 2003).
Essa enfermidade é caracterizada por uma fase aguda de curta duração,
seguida por uma fase crônica que na ausência de tratamento específico, pode persistir
por toda a vida do indivíduo. A fase aguda se instala após um período de incubação de
sete a dez dias; sintomas gerais como febre, linfadenopatia, esplenomegalia e edema
são observados, mas a infecção pode passar despercebida devido à escassez de
sintomas clínicos (Prata, 2001). Por outro lado, pacientes imunossuprimidos e crianças
podem desenvolver uma fase aguda mais grave, com envolvimento cardíaco e
encefalomielite (Zhang e Tarleton, 1999). Parasitismo tecidual mais frequente e
elevada parasitemia (Prata, 2001) são característicos nesta fase, entretanto, com a
instalação da resposta imune tendem a diminuir até tornarem-se subpatentes na fase
crônica (Giordanengo et al., 2002).
A fase crônica pode apresentar-se assintomática por período variável
caracterizando a forma indeterminada ou inaparente da doença de Chagas (Prata,
2001). Nesta forma, o indivíduo apresenta ausência de sintomas, exames
eletrocardiográficos e radiológicos do tórax e abdomem normais e parasitemia baixa ou
ausente. Entretanto, a suspeita da infecção pode ser confirmada por testes sorológicos
(ELISA, IFI, HAI) ou evidenciada por testes parasitológicos (Hemocultura,
Xenodiagnóstico e PCR) como demonstrado por Chiari et al., (1989), Barreto e Lanni
(1994) e Gomes et al., (1998). A forma indeterminada é a mais freqüente ocorrendo em
70% dos indivíduos (Tanowitz et al., 1992; Prata, 2001). Contudo, cerca de 30% destes
desenvolvem a fase crônica sintomática em um período variável de 10 a 30 anos após
a infecção (Amato Neto, 1986; Dias, 1989; Brener e Gazzinelli, 1997) caracterizando as
formas clínicas cardíaca e digestiva, (Moncayo, 1999), esta última compreendendo o
megacólon e/ou megaesôfago. A ocorrência de manifestações cardíacas e digestivas
caracteriza a forma mista da doença (Tanowitz et al., 1992; Prata, 2001). As razões
pelas quais a doença se manifesta de forma distinta ainda permanecem desconhecidas
e diferenças regionais na distribuição dessas formas clínicas também têm sido
registradas (Coura et al., 1983; Rezende e Moreira, 1988).
ARANTES, J.M. Introdução
3
Cepas diferentes do T. cruzi têm sido utilizadas nos estudos das fases aguda e
crônica da infecção, o que é de extrema relevância, devido a grande heterogeneidade
observada no comportamento biológico de populações distintas do parasito (Andrade e
Magalhães, 1996). Análises moleculares de diferentes cepas do T. cruzi têm
demonstrado também que as populações do parasito são extremamente polimórficas
(Buscaglia e Di Noia, 2003) e a correlação entre a genética do parasito, suas
propriedades biológicas e a susceptibilidade a droga tem sido evidenciada por diversos
estudos in vivo e in vitro (Andrade et al., 1985; Andrade e Magalhães, 1997; Laurent et
al., 1997; Revollo et al., 1998; Toledo et al., 2002; Toledo et al., 2003).
A presença de populações geneticamente distintas vem sendo sugerida como
fator determinante das alterações observadas em diferentes formas clínicas da doença
(Vago et al., 2000), possivelmente devido ao tropismo tecidual característico de cada
população (Macedo, 2004). Os estudos de Andrade et al. (1999) corroboram com esta
hipótese. Ao infectarem camundongos BALB/c simultaneamente com duas diferentes
populações do parasito (cepa JG e clone CoL1.7G2), os autores demonstraram uma
clara diferença na distribuição tecidual para as duas populações. Do mesmo modo,
Vago et al. (2000) através da caracterização genética do T. cruzi diretamente de
tecidos de pacientes na fase crônica da doença, verificaram que em um indivíduo com
cardiopatia e processo inflamatório no esôfago, foram detectadas diferentes
populações nos respectivos órgãos através da assinatura do kDNA. Por outro lado,
Franco et al. (2003) em infecções mistas de ratos com a cepa JG (isolado de um
paciente com megaesôfago) e o clone Cl_Brener miotrópico, verificaram alteração no
tropismo tecidual dos estoques, quando comparados às populações isoladas,
sugerindo que outros fatores podem influenciar no curso da infecção.
Andrade (1974) ao analisar a variação entre cepas do T. cruzi sob o aspecto
morfobiológico e comportamental em camundongos propôs o primeiro critério de
classificação para a espécie. Três tipos foram estabelecidos: Tipo I - (cepa Y e
Peruviana) de multiplicação rápida, picos de parasitemia e mortalidade altos e
precoces, predominância de formas finas e reticulotropismo na fase inicial da infecção;
Tipo II - (16 cepas isoladas no Recôncavo Baiano) de multiplicação lenta, picos
irregulares de parasitemia entre 12o e 20o dias, predominância de formas largas ao
longo da infecção, mas com formas finas em pequeno número na fase inicial, e
tropismo predominante para o miocárdio; Tipo III - (cepa Colombiana) de multiplicação
lenta, altos picos de parasitemia entre o 20o e 30o dias de infecção, baixas taxas de
ARANTES, J.M. Introdução
4
mortalidade, predominância de formas largas ao longo da infecção com envolvimento
predominante do músculo esquelético.
A resposta imune do hospedeiro apresenta importante papel no controle da
infecção pelo T. cruzi, pois através de seus mecanismos de ação, o parasito é
continuamente combatido, diminuindo sua multiplicação nos tecidos. Grande parte das
manifestações clínicas da doença de Chagas deve-se a ativação da resposta imune
dirigida contra o parasito (Aliberti et al., 1996). A mobilização do sistema imune é
importante na redução da carga parasitária, mas por outro lado, eventualmente
contribui para o aparecimento das manifestações clínicas crônicas devido às respostas
auto-imunes (Leon e Engman, 2001). No entanto, tanto o parasito quanto a resposta
imune podem persistir indefinidamente no hospedeiro e as lesões teciduais resultantes
da atividade prolongada de ambos causam alterações morfofuncionais características
da doença (Tarleton, 2001).
Vários estudos têm sido realizados no intuito de compreender a relação entre o
T. cruzi e seus hospedeiros, e como esta interação pode direcionar o curso da
infecção. Aparentemente, a ativação de diferentes células do sistema imune e
moléculas solúveis por elas produzidas desempenham participação direta no controle
da carga parasitária durante a fase aguda da infecção (Aliberti et al., 1999). O T. cruzi é
capaz de induzir a ativação/produção de proteínas e enzimas efetoras da imunidade
inata natural. Porém, a forma tripomastigota consegue resistir ao ataque da via
alternativa do Complemento, o que permite a instalação da infecção.
A resposta imune inata é essencial na resistência do hospedeiro contra a
invasão por protozoários. As células Natural Killer (NK) são importantes por limitarem o
crescimento parasitário e por iniciarem o desenvolvimento da resposta imune adquirida
(Scott et al., 1995).
O papel dos macrófagos como primeira linha de defesa do organismo contra
patógenos intracelulares está bem estabelecido (Taliaferro e Pizzi, 1955; Mackaness,
1969). Kierszenbaum et al. (1976) demonstraram que o tratamento de macrófagos com
sílica torna camundongos mais susceptíveis à infecção pelo T. cruzi, mesmo com a
utilização de cepas avirulentas, por bloquear a fagocitose.
A capacidade dos macrófagos participarem da destruição de certos parasitos
envolve vários mecanismos complexos que dependem da cepa do parasito (Milder et
al., 1977; Alcantara e Brener, 1978), da forma evolutiva (Milder et al., 1977; Nogueira et
al., 1980; Kloetzel et al., 1984; Umezawa et al., 1985), além do estado de ativação dos
ARANTES, J.M. Introdução
5
macrófagos (Nogueira et al., 1977). Borges et al. (1992) descreveram que a ativação
dos macrófagos peritoniais, avaliada pela capacidade destas células liberarem peróxido
de hidrogênio (H2O2), dependia do hospedeiro e da cepa do parasito utilizada no
estudo. O mais importante sinal para a ativação dos macrófagos é o IFN-γ, que
desempenha papel significativo na destruição do T. cruzi (Plata et al., 1984; Murray et
al., 1985). Outras citocinas como o TNF-α e fatores inespecíficos, como o LPS
(lipopolissacarídeo), podem estar envolvidos no processo de ativação dos macrófagos
(Alcina e Fresno, 1987). Quando o T. cruzi inicia sua interação molecular em
macrófagos, a produção de IL-12 é induzida e, além de estimular a proliferação de
linfócitos T, ativa as células NK a produzirem IFN-γ, cuja função é induzir o
recrutamento de macrófagos para a atividade microbicida (Aliberti et al., 1996). Dessa
forma o TNF-α, produzido pelos macrófagos durante a infecção, interage de forma
sinérgica tanto com IL-12 como com IFN- , ativando os macrófagos a expressarem a
enzima óxido-nítrico (NO) sintase induzida e a produzirem NO (Miller et al., 2002).
Alguns estudos mostraram que camundongos resistentes à infecção apresentaram
elevada produção de NO, estimulada pelo aumento da produção de IFN- (Plata et al.,
1984; Reed, 1988; Vespa et al., 1994).
A imunidade celular também é importante na defesa contra o T. cruzi e as
células T representam a maior parte das células no infiltrado inflamatório do miocárdio
de pacientes com a forma cardíaca da doença (Reis et al., 1993; Higuchi et al., 1997)
sendo hábeis em reagir ao parasito (Mosca et al., 1985; Morato et al., 1986) e a
antígenos do hospedeiro relacionados a doença de Chagas (Gazzinelli et al., 1990;
Dutra et al., 2000). Provavelmente as células T são as principais ”orquestrantes” da
reatividade imune (Dutra et al., 2005).
Animais deficientes destas células são ainda mais susceptíveis à infecção
(Tarleton et al., 1996). A necessidade das células T CD4 pode estar relacionada a sua
capacidade em auxiliar na produção de anticorpos e citocinas como o IFN- (Brener,
1986; Tarleton et al., 1996). Por outro lado, o papel das células T CD8 pode estar
associado ao fato do T. cruzi poder infectar qualquer tipo de célula. As células não-
linfóides infectadas expressam apenas moléculas do MHC de classe I, que não são
reconhecidos por linfócitos T CD4, mas poderiam ser identificadas por células T CD8
efetoras (Lenzi et al., 1996). Estudos in vitro indicam que células infectadas com o T.
cruzi são reconhecidas por linfócitos T CD8 obtidos de animais infectados com o
ARANTES, J.M. Introdução
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mesmo parasito (Nickell et al., 1993). Animais deficientes no gene β2-microgobulina,
não expressam moléculas de classe I, perdem linfócitos T CD8 e são altamente
susceptíveis à infecção pelo T. cruzi (Tarleton et al., 1992).
A resposta das diferentes sub-populações de linfócios T nem sempre é benéfica
para o hospedeiro. A produção de IFN-γ na fase aguda da infecção pelo T. cruzi em
camundongos está associada à resistência (Reed, 1988; Nabors et al., 1991; Minoprio
et al., 1993) e a sua depleção exacerba a parasitemia e aumenta a mortalidade (Torrico
et al., 1991; Petray et al., 1993). Similarmente, IL-12, relacionada à resposta Th1,
promove resistência em camundongos (Silva et al., 1998). Por outro lado, o oposto
acontece com o padrão Th2, onde a IL-10 está associada a susceptilidade à infecção
pelo T. cruzi em camundongos (Silva et al., 1992; Reed et al., 1994).
Evidências da ocorrência de imunidade humoral estão representadas pela
presença de anticorpos atuando na defesa contra o parasito em diversos estudos
experimentais e humanos. Em infecções agudas no modelo murino foi observado que
ocorre ativação policlonal intensa de linfócitos B, com hiperprodução de
imunoglobulinas (Minoprio et al., 1989). Contudo, a distribuição de isotipos permanece
invariável ao longo do curso da infecção e é caracterizada pela predominância de
IgG2a e IgG2b (D’Império et al., 1986).
A doença de Chagas pode ser avaliada através do acompanhamento de sua
evolução em diferentes modelos experimentais como ratos, camundongos, roedores
silvestres, cães, coelhos, primatas e cobaios, nos quais é possível reproduzir os
distintos aspectos patológicos da doença humana. O modelo murino tem apresentado
uma maior preferência por diversos pesquisadores pela facilidade de obtenção,
manutenção e pequeno porte. Os camundongos têm também sido utilizados no estudo
de diversos parâmetros na relação parasito-hospedeiro, como por exemplo, no
comportamento de cepas do T. cruzi, na eficácia de várias drogas para a terapia e na
resposta imunológica e histopatológica do hospedeiro (Brener et al., 1976; Andrade et
al., 1985; Ben Younés-Chennoufi et al., 1988; Rottenberg et al., 1988).
No modelo murino, a doença de Chagas se desenvolve de forma diferente da
observada em humanos. Nestes animais, a fase aguda da infecção é caracterizada por
alta parasitemia e mortalidade, grande disseminação do parasito e imunossupressão
(Minoprio et al., 1989).
O curso da infecção aguda ou crônica pelo T. cruzi em camundongos depende
do background genético do hospedeiro (Pizzi et al., 1949; Trischmann et al, 1978;
ARANTES, J.M. Introdução
7
Corsini et al., 1980; Soares et al., 2001) e do parasito isolado (Brener, 1965; Postan et
al., 1983; Soares et al., 2001).
O acometimento cardíaco é a principal causa de morbidade e mortalidade na
doença de Chagas, com diferentes níveis de danos ao sistema de condução e com a
ocorrência de falha cardíaca em muitos casos graves (Prata, 2001). Diversos estudos
confirmaram que durante o curso da infecção cardíaca, ocorrem alterações
microvasculares induzidas pelo parasito que podem conduzir a degeneração
miocárdica e inflamação crônica (Factor et al., 1985; Morris et al., 1990; Petkova et al.,
2001).
Os camundongos sobreviventes a um longo período de infecção pelo T. cruzi
podem desenvolver miocardite intensa e lesões na inervação autonômica do coração
(Tafuri, 1970; Machado et al., 1975), na microcirculação (Factor et al., 1985) e
mudanças eletrocardiográficas, parecidas com aquelas encontradas na miocardite
chagásica humana (Laguens et al., 1981a). A inflamação do miocárdio é de extrema
importância em todo o processo patológico da doença de Chagas, devido à maneira
como as reações ao T. cruzi se desenvolvem no coração. O acometimento do
miocárdio em camundongos cronicamente infectados parece ser conseqüência do
parasitismo e da inflamação durante os primeiros estágios da doença (Schlemper et al.,
1983). A miocardite pode ser induzida experimentalmente através de injeções múltiplas
de antígenos sub-celulares específicos do T. cruzi (Teixeira et al., 1975) ou através da
transferência de células do baço de animais imunizados para animais normais
(Laguens et al., 1981b) sugerindo a participação do sistema imune na patogênese da
miocardite crônica.
Estudos histológicos do coração de indivíduos que vieram a óbito em
decorrência da doença, mostraram fibrose intersticial difusa, infiltração linfocítica e
miocitólise, mesmo na ausência de parasitos (Engman e Leon, 2002). Em 1999, Zhang
e Tarleton demonstraram que o DNA do parasito e suas proteínas podem estar
presentes no foco inflamatório, mesmo na ausência de formas amastigotas intactas.
Estes dados foram confirmados pelo encontro de grande porcentagem destas formas
em biópsias cardíacas de indivíduos cronicamente infectados (Anez et al., 1999).
A imunossupressão e a autoimunidade presentes durante a infecção pelo T.
cruzi podem ser explicadas pela ativação policlonal das células B, que afeta
mecanismos regulatórios imunes (Minoprio, 2001). Antígenos persistentes do T. cruzi
podem se tornar focos para as células T específicas mediando o processo de
ARANTES, J.M. Introdução
8
hipersensibilidade tardia, que conduz a lesões nos tecidos dos hospedeiros (Ben
Younés-Chennoufi et al., 1998; Tarleton e Zhang, 1999; Tarleton, 2001).
Fatores nutricionais também influenciam no desenvolvimento da infecção. O
ferro, dentre todos os micronutrientes, é o metal pesado mais encontrado nos tecidos e
fluidos corporais (Crichton e Ward, 1992). Este mineral é essencial para a
sobrevivência de praticamente todas as células vivas, sendo requerido para o
crescimento e proliferação das mesmas. Além disso, possui papel importante no
transporte de elétrons, síntese de DNA e várias reações redox essenciais (Letendre,
1985).
O ferro é um elemento versátil, altamente reativo, que existe em duas valências
naturais, ferroso (2+) e férrico (3+), e esta propriedade é a base de seu papel biológico
essencial no transporte de oxigênio e reações redox, particularmente na respiração
celular. Em um ambiente aeróbico, de pH neutro, o ferro existe na forma oxidada férrica
(Fe3+), utilizada pelas células em associação com uma variedade de proteínas e
compostos. A formação de intermediários reativos de oxigênio e radicais livres tóxicos
é requerida por muitos processos celulares, que incluem respostas anti-tumorais e
morte fagocítica de patógenos. Porém, estas espécies reativas são potencialmente
perigosas e quando o ferro está presente em excesso, pode ocorrer dano tecidual
(Griffiths et al., 1999).
Muitos estudos têm demonstrado que o excesso de ferro no organismo pode se
tornar tóxico pela indução da produção de espécies reativas de oxigênio, como O2- e
OH. O fígado é o principal órgão de estocagem de ferro durante a ocorrência de
doenças por acúmulo de ferro como a hemocromatose genética e o excesso de ferro
neste órgão contribui para o desenvolvimento de cirrose e carcinoma hepatocelular
(Niederau et al., 1985, Griffiths et al., 1999). Em algumas situações patológicas,
incluindo a talassemia e a siderose experimental, a deposição excessiva de ferro pode
ocorrer nos rins e a toxicidade neste órgão vem sendo demonstrada (Landing et al.,
1989). Apesar da função do ferro no coração ainda não ser totalmente conhecida, sua
homeostase é importante para a sua funcionalidade normal. Sabe-se que o ferro
cataliza a formação de radicais livres via reações de Fenton, onde pode causar danos
nos compostos de todas as classes bioquímicas incluindo membranas lipídicas,
proteínas e DNA (Lesnefsky, 1994; McCord, 1996).
A deficiência de ferro prejudica a função de vários compostos que estão ligados
a ele. Há redução da atividade da ribonucleotídeo redutase, requerida para a síntese
ARANTES, J.M. Introdução
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de DNA (Bergeron, 1986), diminuição da atividade das desidrogenases contendo ferro-
enxofre, do ciclo do ácido cítrico (Davies et al., 1982) e diminuição da concentração de
mioglobina e hemoglobina (Siimes et al., 1980).
A manutenção da homeostase celular de ferro não é somente um requerimento
geral para o crescimento e proliferação de todas as células, mas é também de extrema
importância para a regulação do sistema imune. A sua deficiência predispõe o
hospedeiro a infecções por interferir tanto na resposta celular quanto na humoral
(Weinberg, 1984; Galan et al., 1988; Blakley e Hamilton, 1988; Kent et al., 1990). As
deficiências no status de ferro também são conhecidas por prejudicarem a função das
células do sistema imune, especialmente dos linfócitos (Baliga et al., 1982). O ferro
modula a expressão de moléculas de superfície de células T (Santos et al., 1994), a
função fagocítica de macrófagos (Jiang et al., 1993) e a atividade de células NK
(Nishiya et al., 1982). Além disso, o ferro diminui a atividade do IFN- em células
mielomonocíticas humanas (Weiss et al., 1992) e reduz a produção de NO em células
microgliais murinas (Saleppico et al., 1996). Estudos das funções celulares em quadros
clínicos que reportam excesso de ferro, como por exemplo a talassemia, demonstraram
função prejudicada ou alterada de células T CD4 (de Sousa, 1989).
Algumas citocinas podem influenciar o metabolismo de ferro e, por sua vez, o
status deste metal alterado no organismo, pode influenciar a produção das mesmas. O
TNF-α possui papel significativo na homeostase de ferro por ser um dos principais
fatores na modulação do metabolismo de ferro durante a inflamação. Silver et al. (1997)
sugeriram que a expressão do gene TNF-α pode ser controlada por ferro intracelular.
Esse fato tem sido corroborado por estudos, que demonstraram que a sua aplicação
em animais experimentais ou em humanos levou a uma redução da concentração de
ferro sérico (Tanaka et al., 1987). Estes achados demonstraram uma possível interação
entre TNF-α e ferro durante a inflamação. A hipoferremia associada à infecção ou
inflamação é provavelmente mediada por TNF-α, que também inibe a liberação de ferro
de macrófagos peritoneais, uma vez que macrófagos de camundongos com excesso
de ferro produzem mais TNF-α (Omara et al., 1994).
Kuvibidila et al. (2004) demonstraram que a deficiência de ferro em
camundongos reduziu os níveis de IL-12p40 e IFN- enquanto a subnutrição aumentou
os níveis de IL-10. Estes dados sugerem que a deficiência de ferro altera o balanço
entre as citocinas pró e anti-inflamatórias e desse modo pode afetar a imunidade
humoral e celular.
ARANTES, J.M. Introdução
10
No hospedeiro vertebrado, o ferro encontra-se em associação com proteínas
ligantes de alta afinidade como a lactoferrina e a transferrina, não estando disponível
livremente para os microrganismos (Aisen e Listowsky, 1980). O primeiro pool de ferro
no organismo é o do ferro associado à hemoglobina e, como ela está sempre sendo
seqüestrada dentro dos eritrócitos, o ferro não está diretamente disponível para
patógenos extracelulares (Bothwell et al., 1979).
A lactoferrina tem uma grande afinidade pelo ferro e está localizada nas
superfícies mucosas e secreções exócrinas como muco e lágrimas, que podem, desta
maneira dificultar o crescimento dos microrganismos nestas vias de entrada. A
transferrina é uma glicoproteína que se encontra no sangue dos hospedeiros
vertebrados, constituindo o segundo pool de ferro do organismo. Ela é a mais
importante proteína de transporte no plasma (Bothwell et al., 1979), e a sua alta
afinidade pelo ferro limita a disponibilidade do metal para os microrganismos. O
receptor de transferrina (TfR1) é expresso em várias células que requerem o ferro para
o seu desenvolvimento. O TfR1 de camundongo é uma glicoproteína de 200 KDa
composta de duas cadeias idênticas ligadas a dissulfeto, cada uma sendo capaz de se
ligar a transferrina. A ligação da transferrina ao seu receptor, seguido pela endocitose
do complexo ligante-receptor, consiste no principal mecanismo celular de captação de
ferro. O ferro incorporado é estocado também em depósitos de ferritina e os TfR1 são
reciclados na superfície da célula. Recentemente, outra molécula com a mesma
similaridade estrutural e funcional a da TfR1 foi clonada e recebeu o nome de TfR2. O
papel da TfR2 no metabolismo de ferro permanece desconhecido, apesar da
transfecção dentro de células que perderam o TfR1 resultar em captação de ferro de
transferrina (Kawabata et al., 1999). Em contraste ao TfR1 que é regulado pela
concentração de ferro intracelular, o TfR2 não parece ser regulado da mesma maneira
(Kawabata et al., 2000).
Como relatado acima, a obtenção de ferro pelos patógenos não é fácil. Para
superar esta dificuldade, algumas espécies de bactérias patogênicas produzem
algumas moléculas, denominadas sideróforas, que possuem alta afinidade pelo ferro.
Estas moléculas de baixo peso molecular competem com a transferrina pelo metal
(Neilands, 1981).
O mecanismo básico pelo qual a forma amastigota do T. cruzi obtém os
micronutrientes do hospedeiro mamífero para sua multiplicação intracelular ainda é
desconhecido. Tem-se investigado o papel das proteínas dos hospedeiros,
ARANTES, J.M. Introdução
11
principalmente, a transferrina no transporte destes micronutrientes para estas formas
parasitárias. Os receptores de transferrina têm sido encontrados em praticamente
todas as células, e aumentam em quantidade com a proliferação das mesmas (Barnes
et al., 1980; Weiel et al., 1984). Em trabalhos relacionando os receptores do T. cruzi
para a transferrina humana e o seu papel, Lima e Villalta (1989), mostraram que as
formas amastigotas apresentam receptores para esta proteína. O ferro é essencial para
o crescimento desta forma parasitária e é obtido da transferrina através da endocitose
mediada por receptores.
A relação parasito-hospedeiro é complexa, não somente os patógenos
desenvolvem estratégias para a obtenção de nutrientes dentro dos hospedeiros
vertebrados, como estes, por sua vez, conseguem obter meios de inviabilizar a
sobrevivência dos agentes infecciosos por diferentes mecanismos. Como foi verificado
por Weinberg em 1978, em muitas doenças infecciosas ocorre um ajuste no
metabolismo de ferro caracterizado pela hipoferremia, onde há redução dos níveis de
saturação da transferrina. A hipoferremia é predominantemente o resultado do
seqüestro de ferro dentro de estoques intracelulares do sistema fagocitário
mononuclear (Roeser, 1980; Letendre e Holbein, 1983). Como todos os
microorganismos patogênicos requerem ferro para o crescimento e virulência, a
resposta hipoferrêmica é protetora porque reduz a disponibilidade do ferro para os
patógenos extracelulares (Weinberg, 1978). Dessa maneira, a hipoferremia é um
benefício questionável na defesa contra parasitos intracelulares que replicam dentro do
sistema fagocitário mononuclear utilizando os pools de ferro intracelular do hospedeiro
(Lalonde e Holbein, 1984).
Deste modo, as alterações nos níveis de ferro podem afetar a relação parasito-
hospedeiro. Se uma quantidade suficiente de ferro não for disponível para o patógeno a
sua propagação poderá se tornar dificultada e a infecção atenuada (Payne e
Finkelstein, 1978).
Os dados da literatura em relação à deficiência de ferro e a resistência às
infecções têm levado alguns investigadores a sugerir duas diferentes hipóteses. Alguns
defendem que a deficiência de ferro predispõe a infecção (Baggs e Miller, 1973;
Cummins et al., 1978; Duncombe et al., 1979; Kuvibidila et al., 1981; Humbert e Moore,
1983; Weinberg, 1984; Galan et al., 1988; Blakley e Hamilton, 1988; Kent et al., 1990) e
outros defendem que a deficiência de ferro protege contra a infecção (Sword, 1966;
Weinberg, 1974; Murray et al., 1975; Jones et al., 1977; Pushman e Ganzoni, 1977;
ARANTES, J.M. Introdução
12
Murray et al., 1978; Murray et al., 1981; Raventos-Suarez et al., 1982; Lalonde e
Holbein, 1984; Harvey et al., 1985; Pollack et al., 1987; Bullen et al., 1991; Griffiths e
Bullen, 1999). Trabalhos realizados por estas duas vertentes apóiam tais suposições.
Muitos estudos relataram que a deficiência do ferro protege contra infecções e
mostraram uma alta resistência de camundongos deficientes em ferro quando
comparados a animais controles submetidos a diversas infecções experimentais,
incluindo Plasmodium chabaudi (Harvey et al., 1985), Listeria monocytogenes (Sword,
1966), T. cruzi (Lalonde e Holbein, 1984), Plasmodium berghei (Murray et al., 1975),
Plasmodium falciparum (Heywood e Harvey, 1985) e Salmonella typhimurium (Jones et
al., 1977; Puschman e Ganzoni, 1977).
A deficiência de ferro em humanos também gera controvérsias em relação à
infecção. Em estudos epidemiológicos de adultos deficientes em ferro na Indonésia e
Quênia foi observada alta taxa de morbidade devido a infecções em relação a
indivíduos não-anêmicos (INACG, 1977; Keusch et al., 1983). Em seu trabalho, Murray
et al. (1978) mostraram que a administração de ferro a africanos deficientes do metal
levou a um maior numero de infecções como tuberculose, malária e brucelose quando
comparado àqueles que não receberam o metal.
É muito difícil comparar os estudos em animais e humanos. O que é mais
relevante diz respeito à saturação da transferrina, que é conhecida pela sua
importância crucial na relação entre o hospedeiro e a invasão dos microorganismos
(Weinberg, 1974; Baltimore et al., 1982) e também ao risco de infecção (Payne e
Finkelstein, 1978; Beisel, 1982), que é muito diferente em camundongos e em
humanos. Em camundongos, a saturação normal da transferrina é em torno de 70-85%
(Elin e Wolff, 1974; Mainou-Fowler e Brock, 1985; Brock e Mainou-Fowler, 1986),
enquanto em humanos a saturação normal é em torno de 33%. Puschman e Ganzoni
(1977) presumiram que uma deficiência moderada de ferro em camundongos pode
aumentar a resistência à infecção por Salmonella pela diminuição na saturação da
transferrina. O ferro só pode aumentar a incidência da infecção se sua concentração é
aumentada no sangue ou localmente, ou se a saturação da transferrina aumenta acima
de 60% (Weinberg, 1971).
O organismo humano adulto contém de 3 a 5 g de ferro, aproximadamente 2 g
como hemoglobina e 8 mg como enzimas. Ambas as formas são muito importantes
para a função normal do indivíduo. O ferro é bem conservado pelo organismo;
aproximadamente 90% é recuperado e reutilizado extensivamente. Na deficiência de
ARANTES, J.M. Introdução
13
ferro, os valores de transferrina (expressos como capacidade total de ligação de ferro)
são elevados, maiores que os normais, 410 µg DL-1, com saturação de ferro no soro
abaixo de 16% (Finch et al., 1982).
Quelantes têm sido utilizados em estudos que avaliam a relação entre doenças
e o status de ferro. As evidências de que quelantes de ferro atenuam as lesões pós-
isquêmicas em uma variedade de sistemas orgânicos, inclusive em músculos
esqueléticos, documentam a participação do ferro na patogênese da lesão tecidual
pós-isquêmica (Ambrosio et al., 1987; Paller et al., 1988; Sardinha, 1994).
Os quelantes de ferro podem também induzir fortemente a transcrição de NO
sintase (NOS) e aumentar a liberação de IL-1B em macrófagos alveolares humanos
(Rouser et al., 1968; Tang et al., 1997). Estas observações sugerem que os quelantes
de ferro podem modular certos mediadores regulando os processos inflamatórios
(Rouser et al., 1968).
O Desferal (mesilato de desferrioxamina) foi lançado no mercado em 1963 como
um medicamento no tratamento do excesso de alumínio e ferro decorrente da
talassemia. Ele vem sendo empregado com sucesso na clínica médica como agente de
remoção de ferro em casos de doenças de estoques de ferro, no tratamento de
envenenamento por ferro e como um auxílio na normalização de estoques de ferro
(Keberle, 1964). Para ser efetivo, o medicamento deve ser administrado por infusões
parenterais com doses diárias de 100 a 150 mg/kg em humanos (Modell e Berdoukas,
1984; Brittenham, 1988). A desferrioxamina (DFA) como consequência de seu rápido
metabolismo (Aouad et al., 2002), possui um período curto de meia-vida no plasma, e
deve ser administrada lentamente por um determinado tempo (Summers et al., 1979;
Lee, 1993).
Este quelante contém como substância ativa a DFA, um sideróforo hexadentado
natural que contém tiohidroxamato produzido por Streptomyces pylosis (Keberle, 1964;
Barry et al., 1974). Este agente é capaz de promover a excreção de ferro do organismo
pela formação de complexos predominantemente com os íons trivalentes do ferro. Em
decorrência de suas propriedades quelantes, a DFA é capaz de deslocar o ferro na
forma livre, encontrado tanto no plasma como nas células, dando origem ao complexo
ferrioxamina. Uma vez ligado, o ferro é inativado metabolicamente não resultando na
formação de espécies ativas de oxigênio.
A DFA tem sido empregada em estudos que buscam avaliar a relação entre
infecção e status de ferro (Dhur et al., 1989) e atua tanto no meio intracelular quanto no
ARANTES, J.M. Introdução
14
extracelular. Dois mecanismos são propostos para esta ação, a indução da deficiência
de ferro por limitar sua disponibilidade dentro da célula ou a interferência direta com a
aquisição de ferro pelo parasito (Hershko e Peto, 1988).
Muitos estudos de triagens clínicas bem como estudos in vivo e in vitro têm
demonstrado que alguns tumores agressivos em humanos, particularmente
neuroblastoma e leucemia, são sensíveis à terapia de quelação de ferro pela DFA
(Donfrancesco et al., 1996; Richardson, 1997). Algumas células cancerosas são mais
susceptíveis aos efeitos dos quelantes do que as células normais, que podem desta
maneira ser utilizados na oncoterapia. Estudos em animais têm apresentado uma
variedade de evidências confirmando a eficácia da DFA em inibir o crescimento de
tumores. A DFA inibiu ou causou a regressão total do carcinoma hepatocelular em
camundongos (Hann et al., 1992), inibiu o crescimento de carcinoma mamário em ratos
Fisher (Wang et al., 1999) e também prolongou a vida de camundongos com leucemia
do tipo L1210 (Wolfe et al., 1988).
Oexle et al. (1999) têm demonstrado que a expressão de algumas enzimas
envolvidas no ciclo do ácido cítrico é reduzida após a exposição à DFA. Por exemplo, a
depleção de ferro celular utilizando a DFA resultou em um decréscimo na expressão de
aconitase mitocondrial, citrato sintase, isocitrato desidrogenase e succinato
desidrogenase. Em contraste, a suplementação com ferro aumentou a expressão
destas enzimas. Portanto, a depleção de ferro resulta em um decréscimo no consumo
de oxigênio mitocondrial e formação de ATP via fosforilação oxidativa e um aumento na
glicogênese. Outros alvos da DFA incluem proteínas envolvidas no controle do ciclo
celular, como a p53, que têm sua expressão induzida (An et al., 1998).
Em relação ao sistema imune foi demonstrado que a DFA bloqueia a expressão
do receptor de IL-2 em células T humanas e inibe a síntese de DNA como um resultado
da inativação da ribonucleotídeo redutase (Carotenuto et al., 1986). Este quelante
também apresenta efeitos antivirais inibindo a replicação do citomegalovírus in vitro
(Cinatl et al., 1994, 1995) sendo efetivo na redução da lesão mediada por radicais livres
posterior ao trauma (Shadid et al., 1998; Martelius et al., 1999). O tratamento com DFA
suprime os sintomas clínicos e patológicos da encefalomielite alérgica em ratos, com
redução das lesões inflamatórias no sistema nervoso central e da resposta de células T
(Bowern et al., 1984). Tanjii et al. (2001) demonstraram que a DFA aumenta a
expressão de cyclooxygenase-2 e prostaglandina em macrófagos humanos.
ARANTES, J.M. Introdução
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Muitos agentes quelantes podem ter uma atividade potencial anti-tripanomicida
porque fazem a privação seletiva do ferro o que pode inibir a proliferação de certos
patógenos (Cabantchick et al., 1996; Singh et al., 1997; Cinque et al., 1998).
Em relação a doenças parasitárias, a DFA apresenta efeitos inibidores no
crescimento do Plasmodium falciparum (Hershko e Peto, 1988) e das formas
sangüíneas do T. brucei (Breidbach et al., 2002), sendo também considerada uma
droga promissora contra o T. gondii em camundongos (Mahmoud, 1999). Em relação
ao T. cruzi, observou-se redução da patogenicidade em camundongos infectados pela
cepa Brasil do T. cruzi (Lalonde e Holbein, 1984), infecção branda com a cepa YuYu e
ausência de alterações na parasitemia e mortalidade de camundongos infectados pela
cepa Y (Pedrosa et al., 1990). Estudos em malária humana demonstraram que,
somente o tratamento com a DFA ou a sua combinação com a terapia padrão,
aumentou a remoção dos parasitos na malária assintomática e complicada (Traore et
al., 1991; Gordeuk et al., 1992; Mabeza et al., 1996).
Os primeiros trabalhos correlacionando o T. cruzi com as alterações nos níveis
de ferro e a infecção foram realizados por Lalonde e Holbein (1984) e por Loo e
Lalonde (1984). Os autores observaram que os camundongos infectados com (103 ou
104) formas sangüíneas da cepa Brasil do T. cruzi e com estoques intracelulares de
ferro aumentados pela injeção de ferro-dextran (5mg de ferro/animal 5o DAI)
apresentaram maior mortalidade. O ferro-dextran (ferric hydroxide dextran complex) é
amplamente utilizado para aumentar os níveis de ferro no corpo (Holbein et al., 1979).
Por outro lado, a diminuição dos estoques de ferro do hospedeiro com DFA (10
mg/animal 5o e 6o DAI) e dieta deficiente em ferro reduziu a patogenicidade.
Também através de estudos sobre os efeitos da deficiência e da suplementação
de ferro na evolução da infecção experimental de camundongos por diferentes cepas
do T. cruzi, Pedrosa et al. (1990) apresentaram resultados que variaram em
decorrência do tipo da cepa utilizada, cepa Y e CL (1.400 formas sangüíneas) e cepa
YuYu (15.000 formas sangüíneas). O tratamento com ferro-dextran (5 mg de
ferro/animal 5o DAI) resultou em maior parasitemia e mortalidade com a cepa Y, maior
parasitemia com a cepa CL e nenhum efeito com a cepa YuYu. O tratamento com DFA
(10 mg/ animal 5o DAI) não provocou alteração com as cepas Y e CL e uma infecção
branda com a cepa YuYu. Posteriormente, Pedrosa et al. (1993), em trabalhos
utilizando camundongos convencionais e gnotobióticos, obtiveram os mesmos
resultados em relação à cepa Y do T. cruzi.
ARANTES, J.M. Introdução
16
Diversos fatores inerentes ao hospedeiro e dependentes do parasito como o
inóculo e cepa, podem conferir diferenças no que se refere ao tropismo celular,
parasitemia e capacidade de produzir lesões. Segundo Brener (1977, 1985) a cepa Y
produz elevado pico de parasitemia dos sete aos 12 dias de infecção, alta taxa de
mortalidade, intenso parasitismo no baço, células fagocíticas do fígado nos primeiros
estágios de infecção e miotropismo nos estágios mais tardios. A cepa Y é considerada
reticulotrópica, parasitando baço, fígado e medula óssea (Melo e Brener, 1978).
No trabalho realizado por Postma et al. (1998) procurou-se otimizar a DFA no
tratamento do Plasmodium vinckei em camundongos. A droga foi administrada através
de injeções subcutâneas múltiplas ou infusão intraperitoneal da droga livre e múltiplas
injeções subcutâneas da DFA na forma lipossomal. As múltiplas injeções subcutâneas
da droga antes e durante a infecção controlaram a parasitemia, enquanto somente as
injeções anteriores à infecção não controlaram a parasitemia. A supressão da
parasitemia e a sobrevivência dos camundongos a longo prazo (mais de 1 mês após
infecção) foram obtidas pela infusão intraperitoneal iniciada um dia antes da infecção
ou por injeções subcutâneas da DFA na forma lipossomal anterior à infecção (Postma
et al., 1998). Os resultados deste trabalho também indicaram que a exposição contínua
do parasito a doses baixas da DFA (130 mg/Kg/dia) é suficiente para remover a
parasitemia, enquanto altas doses (800-1500 mg/Kg/dia) são insuficientes (Postma et
al., 1998).
Resultados preliminares em nosso laboratório demonstraram que camundongos
infectados com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do T. cruzi e
submetidos a alterações nos níveis de ferro com a utilização da DFA (10 mg/animal a
cada 2 dias de experimentação) ou do ferro-dextran (5 mg de ferro/animal - 2 vezes por
semana) apresentaram diferentes resultados. Os animais tratados com ferro-dextran
apresentaram um aumento da proliferação in vivo do parasito e maior gravidade das
lesões cardíacas. Já os animais tratados com DFA associados à dieta deficiente de
ferro apresentaram decréscimo na concentração de hemoglobina, diminuição da
proliferação in vivo do parasito e melhora do quadro histopatológico cardíaco (Arantes,
2003).
Os trabalhos que avaliam os efeitos do tratamento com desferrioxamina em
protozoários utilizaram tratamentos curtos e não ao longo da infecção. Na infecção
pelo T. cruzi, Lalonde e Holbein (1984) utilizaram a desferrrioxamina no 5o e 6o dia
após a infecção (DAI) e Pedrosa et al., (1990) no 5o DAI. Como ocorre uma rápida
ARANTES, J.M. Introdução
17
remoção da DFA da circulação (Brittenham, 1988), foi hipotetizado neste trabalho se
um tratamento mais longo com o quelante poderia afetar mais intensamente o
desenvolvimento da infecção pelo T. cruzi. A cepa Y foi escolhida por ser uma cepa
parcialmente resistente ao tratamento sendo avaliado durante a fase aguda da
infecção, se a quelação do ferro interfere na virulência do parasito e sobrevida do
hospedeiro.
Estes resultados indicam que a manipulação dos níveis de ferro do hospedeiro,
principalmente no que diz respeito a sua redução com a utilização de doses diárias da
DFA, antes e durante a infecção, em muito poderá contribuir para a melhora do quadro
clínico da doença de Chagas.
2 - Objetivos
ARANTES, J.M. Objetivos
19
2.1 - Objetivo geral
Avaliar a influência da utilização de um quelante de ferro, DFA, sobre o curso da
infecção pela cepa Y do T. cruzi em camundongos Swiss.
2.2 - Objetivos específicos
Em animais infectados pela cepa Y do T. cruzi, submetidos ou não ao
tratamento com DFA, determinar:
1. a curva de parasitemia, período pré-patente, período patente,
níveis de parasitemia e a taxa de mortalidade;
2. hemocultura, ELISA e PCR nos animais resistentes à fase aguda
da infecção.
Em animais não-infectados e infectados pela cepa Y do T. cruzi,
submetidos ou não ao tratamento com DFA, avaliar:
1. os níveis de hemoglobina antes da infecção e no 14o dia após a
infecção;
2. os níveis de ferro sérico e tecidual (fígado) no 14o e 21o dia após a
infecção;
3. o peso relativo e as alterações histopatológicas bem como o
parasitismo tecidual no coração, fígado, baço e linfonodo no 14o e
21o dia após a infecção.
3 - Animais, materiais e métodos
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
21
3.1 - Animais e tratamentos utilizados
Foram utilizados 112 camundongos Swiss machos, com aproximadamente trinta
dias de idade e aproximadamente 20 g de peso corporal, provenientes do Biotério da
UFOP e alimentados durante o período de avaliação com ração comercial.
Para a avaliação da parasitemia diária, mortalidade, hemocultura, PCR e ELISA,
utilizaram-se 32 animais infectados pelo T. cruzi sendo 16 tratados pela DFA (Figura 1).
Os demais animais (80) foram divididos em quatro grupos experimentais: (1) controle
não-tratado - CNT; (2) controle tratado com DFA - CT; (3) infectado com a cepa Y do T.
cruzi e não-tratado - INT e (4) infectado com a cepa Y do T. cruzi e tratado com DFA -
IT sendo utilizados para avaliar os outros parâmetros (Figura 2).
Figura 1 – Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=32), infectados com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados (n=16) ou não (n=16) com desferrioxamina.
n=
32 c
am
un
don
gos
30
dia
s d
e ida
de
-14 0
Não-tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=16
Inóculo
500 formas cepa Y
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n= 16
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
Infectado
n=16
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
Infectado
n=16
32
Parasitemia e mortalidade diária
60 240 dias
Coleta de sangue
Hemocultura
PCR
ELISA
Tratamento
n=
32 c
am
un
don
gos
30
dia
s d
e ida
de
-14 0
Não-tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=16
Inóculo
500 formas cepa Y
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n= 16
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
Infectado
n=16
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
Infectado
n=16
32
Parasitemia e mortalidade diária
60 240 dias
Coleta de sangue
Hemocultura
PCR
ELISA
n=
32 c
am
un
don
gos
30
dia
s d
e ida
de
-14 0
Não-tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=16
Inóculo
500 formas cepa Y
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n= 16
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
Infectado
n=16
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
Infectado
n=16
32
Parasitemia e mortalidade diária
60 240 dias
Coleta de sangue
Hemocultura
PCR
ELISA
Tratamento
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
22
Os animais tratados com desferrioxamina (Desferal - Novartis) receberam o
medicamento pela via intraperitoneal (5mg/animal/dia) durante 14 dias que precederam
à infecção até o 32o DAI (Figura 1) ou 21o (Figura 2). Os camundongos pertencentes
aos grupos controle receberam a mesma quantidade (mL) do diluente do medicamento
(água para injeção) no mesmo período. Ambos os experimentos foram realizados em
duplicata sendo n=8 (Figura 1) e n=10 (Figura 2) para cada experimento, totalizando
n=16 e n=20, respectivamente, para cada grupo.
Figura 2 - Delineamento experimental. Camundongos Swiss machos (n=80), infectados (n=40) ou não (n=40) com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com desferrioxamina.
n=
80 c
am
undongos
30 d
ias d
e idade
-14 0
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=40
Dosagem de Hemoglobina
Inóculo
500 formas cepa Y
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n= 40
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n=20
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
Infectado
n=20
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=20
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
Infectado
n=20
14 21 dias
Parasitemia e mortalidade diária
Dosagem de
hemoglobina,
ferro sérico e
tecidual.
Necrópsias
n=
80 c
am
undongos
30 d
ias d
e idade
-14 0
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=40
Dosagem de Hemoglobina
Inóculo
500 formas cepa Y
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n= 40
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
n=20
Tratado
DFA 5 mg/animal/dia
Infectado
n=20
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
n=20
Não tratado
Recebeu diluente
do medicamento
Infectado
n=20
14 21 dias
Parasitemia e mortalidade diária
Dosagem de
hemoglobina,
ferro sérico e
tecidual.
Necrópsias
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
23
3.2 - Infecção e parâmetros biológicos avaliados
Após 14 dias de tratamento com a DFA ou com o diluente do medicamento, os
animais foram inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas
sangüíneas da cepa Y do T. cruzi.
3.2.1 - Curva de parasitemia
A parasitemia foi determinada diariamente após a infecção até a negativação por
cinco dias consecutivos, através da coleta de 5 µL de sangue da veia caudal dos
camundongos. A contagem dos tripomastigotas foi realizada pela técnica de Brener
(1962) e as curvas representam a contagem média/dia de infecção. Foram avaliados os
seguintes parâmetros:
Período pré-patente (PPP)
O PPP corresponde ao período compreendido entre a inoculação e o primeiro
dia de detecção do parasito no sangue periférico do animal através do exame a fresco
e foi expresso em dias.
Período patente (PP)
O PP corresponde ao período compreendido entre o primeiro dia de exame a
fresco positivo até a completa negativação da parasitemia e foi expresso em dias.
Pico de parasitemia (PMP)
O PMP corresponde ao valor máximo de parasitemia encontrado e foi expresso
em número de tripomastigotas sangüíneos/0.1 mL de sangue.
Dia do pico de parasitemia (DPP)
O DPP corresponde ao dia de ocorrência do máximo de parasitemia e foi
expresso em dias.
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
24
3.2.2 - Taxa de mortalidade
Para a determinação da taxa de mortalidade, os animais foram acompanhados
diariamente e a mortalidade registrada sendo expressa em porcentagem cumulativa.
3.2.3 - Hemocultura
A hemocultura foi realizada de acordo com a metodologia de Filardi e Brener
(1987) no 600 e 2400 DAI. Para este exame, cerca de 0,5 mL de sangue foram
coletados assepticamente do seio venoso retro-orbital dos animais que sobreviveram à
fase aguda da infecção (n=6). O sangue foi distribuído em dois tubos, cada um com 3
mL de meio LIT (Camargo, 1964), incubados na estufa a 28ºC e uma gota do
sedimento foi examinada ao microscópio para detectar o parasito aos 30, 60, 90 e 120
dias após a incubação.
3.2.4 - Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As amostras de sangue foram coletadas no 600 e 2400 DAI. Duzentos microlitros
de sangue do plexo venoso retro-orbital dos animais que sobreviveram à fase aguda da
infecção (n=6) foram acrescentados ao dobro de volume de Guanidina/EDTA 6,0 M e
conservados a temperatura ambiente. Uma semana após a coleta, o lisado foi fervido
por 7 minutos e mantido à temperatura ambiente. A extração de DNA das amostras foi
realizada com fenol-clorofórmio, posteriormente precipitado com etanol, secado,
ressuspendido em água e conservado a 4°C segundo protocolo de Gomes et al.
(1998), com ligeiras modificações. A PCR foi processada pela mistura de 2uL da
solução de DNA de cada amostra, Tris-HCl 10mM (pH 9,0), Triton X-100 0,1%, KCl
75mM, MgCl2 3,5mM, 0,2mM de cada desoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
Sigma Company Ltda), 0,5U de Taq DNA polimerase (Platinum, Invitrogen), 25 pmoles
de cada iniciador (S35 e S36 descritos por Ávila et al. (1991), Invitrogen ) para 9 L de
reação. A essa mistura foi adicionado 30 uL de óleo mineral e então, submetida a
amplificação em termociclador (MJ Research, PTC-150) nas seguintes condições: uma
etapa inicial de desnaturação do DNA a 95 C por 5 minutos; 35 ciclos de amplificação
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
25
com desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento dos iniciadores a 65 C por 1
minuto e extensão a 72 C por 1 minuto e uma etapa final de extensão a 72ºC por 10
minutos. O DNA amplificado foi visualizado por eletroforese em gel de poliacrilamida a
6% revelado pela prata (Santos et al., 1993)
3.2.5 – Pesquisa de anticorpos anti- T.cruzi (ELISA)
As amostras de soro foram coletadas no 600 e 2400 DAI dos animais que
sobreviveram à fase aguda da infecção (n=6) e testadas a uma diluição de 1:80 em
PBS segundo a metodologia de Voller et al. (1976).
Microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato foram sensibilizadas
com extrato antigênico alcalino, na concentração de 3 g de proteína/mL, obtido de
cultura exponencial da cepa Y de T. cruzi em meio LIT (Vitor e Chiari, 1987). Após
incubação por 18h, a 4oC, o excesso de solução antigênica foi removido por quatro
lavagens sucessivas com solução salina contendo Tween 20 a 0,05%. Após a lavagem,
os soros foram incubados a 37oC por 45 minutos.
A seguir, foi adicionado o conjugado anti-IgG de camundongo, marcado com
peroxidase (Sigma). Entre as etapas da reação, as placas de ELISA foram submetidas
a quatro lavagens com PBS-Tween 20. A reação foi interrompida pela adição de ácido
sulfúrico 4N (32 l por poço) e as leituras realizadas no leitor de microplaca (BIO RAD,
Modelo 3550) com filtro de 490 nm. Controles positivos e negativos foram processados
concomitantemente às amostras avaliadas, em cada placa.
A ELISA foi considerada positiva quando a leitura, em densidade ótica, foi maior
do que a média, somada a duas vezes ao desvio padrão do valor obtido de 10 soros de
animais não-infectados pelo T. cruzi (Gusmão et al., 1984).
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
26
3.3 - Parâmetros relacionados à avaliação do ferro
3.3.1 - Ferro tecidual
As dosagens de ferro tecidual foram realizadas no 140 e 210 DAI, sendo utilizado
o método de orto-fenantrolina. A hidroxilamina reduz o ferro 3+ a ferro 2+ e este é
associado com orto-fenantrolina. Esta substância produz coloração na amostra que é
proporcional a concentração de ferro. Durante a necrópsia foram coletados 10 mg do
fígado de cada animal, submetidos à digestão em 2 mL de ácido nítrico concentrado
em tubos de ensaio que foram colocados no digestor Kieldahl a 110ºC.
Logo após a evaporação do ácido, o resíduo seco foi resuspenso em 2 mL de
ácido clorídrico concentrado, e o material foi transferido para um balão volumétrico com
capacidade para 10 mL e completado o volume com água deionizada.
A 0,5 mL da solução obtida foram adicionados 0,2 mL de solução de
hidroxilamina 10%, 4,1 mL de tampão acetato 2 M pH 3,5 e 0,2 mL de orto-fenantrolina
a 0,1%. Para a leitura no espectrofotômetro utilizou-se um branco contendo 0,5 mL de
água deionizada, 0,2 mL de hidroxilamina, 4,1 mL de tampão acetato pH 3,5 e 0,2 mL
de orto-fenantrolina. A leitura foi realizada a 510 nm. O padrão foi obtido a partir de
uma curva feita com uma solução de padrão de ferro 500 g/mL. Os valores foram
obtidos em mg/0,1 g de tecido.
3.3.2 - Ferro sérico
As dosagens de ferro no soro foram realizadas no 140 e 210 DAI de acordo com
Goodwin et al. (1966) com modificações utilizando-se Kit comercial (Labtest, Cat 38,
ANVS: 10009010014, Lagoa Santa, MG, Brasil).
Em pH ácido, os íons férricos são dissociados e reduzidos a íons ferrosos por
ação da hidroxilamina. A intensidade da cor magenta brilhante formada após a adição
da Ferrozine é proporcional à quantidade de ferro na amostra.
Em um volume de 0,250 µL de tampão fornecido pelo Kit foram adicionados 62,5
µL de soro para cada teste, para o padrão foram adicionados 62,5 µL de padrão de
ferro sérico e para o branco foram adicionados 62,5 µL de água destilada que foi usada
para zerar o espectrofotômetro. Foi homogenizado e lido a 560nm e obtida a
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
27
absorbância 1 (A1). Foram adicionados, em cada tudo, 6,2 µL de ferrozine, incubado a
37ºC em banho-maria por dez minutos. Logo após foi realizada a leitura da
absorbância 2 (A2). Para se obter a concentração de ferro nas amostras, A1 foi
subtraído de A2, dividido pela absorbância do padrão e multiplicado pela concentração
do padrão. Os valores foram obtidos em unidades convencionais (μg/dL).
3.3.3 - Níveis de hemoglobina
A avaliação dos níveis de hemoglobina foi realizada antes da infecção e no 140
DAI, através de Kit comercial (Labtest, Cat 43, Lagoa Santa, MG, Brasil).
O ferro, no estado ferroso, do grupo heme da hemoglobina, oxihemoglobina e
carboxihemoglobina é oxidado para o estado férrico pelo ferriocianeto, contido no
reagente de cor fornecido pelo Kit, formando a hemiglobina (Hi). Esta combina-se com
o cianeto ionizado, também contido no reagente de cor e produz o cianeto de
hemoglobina (HiCN), que é submetido à leitura no espectrofotômetro com um
comprimento de onda de 540 nm.
Foram retirados 5 µL de sangue da cauda dos animais de cada grupo e
misturado a 1,25 µL do reagente de cor. Para o padrão foi misturado 1,25 µL do
reagente a 5 µL de padrão de hemoglobina. A fim de se obter a concentração de
hemoglobina na amostra, a absorbância da amostra foi dividida pela absorbância do
padrão e multiplicada pela concentração do padrão. Os valores foram obtidos em
unidades convencionais (μg/dL).
3.4 - Necrópsias, coleta, fixação e processamento do material para microscopia
óptica
Todos os camundongos foram pesados semanalmente e no dia da necrópsia.
Os animais foram necropsiados no 140 e 210 DAI. Cada animal recebeu um número
que apenas foi decodificado ao final de todos os experimentos.
Foi realizada a retirada do coração, baço, fígado e linfonodo in totum que foram
imediatamente pesados. Posteriormente foram realizados cortes transversais dos
órgãos e obtidos fragmentos com aproximadamente 2 mm de espessura, fixados em
formol tamponado a 10% (pH 7,2) por 24 horas.
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
28
Os fragmentos submetidos à fixação química foram desidratados em
concentrações crescentes de álcoois (70%, 80%, 90% e três trocas de álcool absoluto),
diafanizados em duas trocas de xilol, embebidos e incluídos em parafina histológica.
Os blocos de parafina foram submetidos à microtomia e de cada bloco
obtiveram-se cortes com espessura de 3 m. Foram confeccionadas duas lâminas, a
primeira foi corada pelo método da Hematoxilina-Eosina para observações rotineiras
das alterações histopatológicas e avaliadas ao microscópio óptico (em 100 campos
microscópicos, com a objetiva de 40X). Foram realizadas descrições histopatológicas
de todos os cortes atentando-se para as alterações degenerativas e inflamatórias.
Para quantificar o parasitismo tecidual no coração, baço, fígado e linfonodo
utilizou-se a técnica de imuno-histoquímica peroxidase anti-peroxidase na segunda
lâmina.
3.5 - Técnica de Imuno-histoquímica para identificação do T. cruzi
Os cortes histológicos foram desparafinizados em duas trocas de xilol de 15
minutos cada, hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100%, 90%, 80%,
70%) por três minutos em cada. Seguiu-se a lavagem em água corrente por 5 minutos
e em PBS pH 7,2-7,4 por 5 minutos.
Posteriormente, os cortes foram submetidos ao bloqueio da peroxidase
endógena em um banho de 30 minutos em PBS/Peróxido de Hidrogênio (240 mL de
PBS e 10 mL de Peróxido de Hidrogênio a 30%) à temperatura ambiente. Os cortes
histológicos passaram então por três banhos consecutivos em PBS de 5 minutos cada.
Após a secagem das bordas dos cortes com papel absorvente, aplicou-se o soro
normal de cabra diluído na proporção 1:40 em PBS, por 30 minutos em câmara úmida
à temperatura ambiente, com o objetivo de bloquear as reações cruzadas
inespecíficas.
Em seguida, secou-se o excesso de soro normal de cabra e as lâminas foram
incubadas com anticorpo primário (anti-T. cruzi produzido em coelho, diluição 1:1000
em PBS/Albumina a 0,1%) em câmara úmida à 37ºC, por uma hora. Seguiram-se três
banhos de 5 minutos cada em PBS.
As bordas dos cortes foram secas novamente e aplicou-se o anticorpo
secundário (anti-IgG de coelho, produzido em cabra). A seguir, as lâminas foram
ARANTES, J.M. Animais, materiais e métodos
29
incubadas em câmara úmida por 30 minutos e, posteriormente, lavadas em 3 banhos
de 5 minutos cada, em PBS.
Procedeu-se a secagem das bordas, a aplicação do complexo peroxidase-anti-
peroxidase (PAP diluído 1:250 em PBS/Albumina a 0,1%) e as lâminas foram
incubadas por 30 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. Seguiram-se três
banhos de 5 minutos cada, em PBS.
A revelação da reação da peroxidase foi obtida através da incubação em
solução de DAB (50 mg de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 l de Peróxido
de Hidrogênio 30%) durante 5 minutos. No intuito de interromper a revelação os cortes
foram mergulhados em PBS por três vezes. Posteriormente foram lavados em água
corrente por 5 minutos, contracorados com Hematoxilina de Harris por dez segundos,
lavados em água corrente por 5 minutos e desidratados em concentrações crescentes
de álcool (70%, 80%, 90% e 100%), diafanizados em xilol e montados em Entellan
(Merck ).
3.6 - Análise estatística
A parasitemia foi analisada pelo teste não-paramétrico Kolmogorov-Sminorv
(KS) que compara a área sob a curva entre duas amostras (Conares, 1980).
Os demais resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As
análises estatísticas dos dados foram realizadas usando o MINITAB 13 Software (State
College, PA). Os dados foram testados pela ANOVA, análise bivariada. Quando as
alterações foram significativas, o teste de Tukey foi realizado para determinar as
diferenças específicas entre as médias.
Diferenças com valores de P < 0,05 foram consideradas significativas.
4 - Resultados
ARANTES, J.M. Resultados
31
4.1 - Curva de parasitemia
A parasitemia dos animais infectados, tratados ou não está representada no
Gráfico 1. Entre os dois grupos analisados (INT e IT) não foram observadas diferenças
significativas entre os períodos pré-patente (INT= 7 dias e IT= 7 dias), entretanto,
diferenças significativas no período patente foram detectadas (INT= 11 dias e IT= 21
dias). O dia do pico de parasitemia dos animais não-tratados ocorreu no 11o dia e dos
animais tratados no 10o dia. Já a média dos níveis de parasitemia nos animais
infectados e tratados (274.666 tripomastigotas/0,1 mL de sangue) foi cinco vezes
menor do que a dos animais infectados e não-tratados (1.397.000 tripomastigotas/0,1
mL de sangue) (p<0,05).
Gráfico 1 - Curvas de parasitemia média em camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi, submetidos (---) ou não ( ) ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Dias após a infecção
Núm
ero
de p
ara
sitas/0
,1 m
lde s
angu
e x
10
3
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Dias após a infecção
Núm
ero
de p
ara
sitas/0
,1 m
lde s
angu
e x
10
3
ARANTES, J.M. Resultados
32
4.2 - Taxa de mortalidade
No Gráfico 2 estão representadas as taxas de mortalidade cumulativa dos
camundongos infectados pelo T. cruzi, tratados ou não com a DFA. No grupo infectado
não-tratado observou-se uma taxa de sobrevida de 6,25% e uma taxa de mortalidade
de 93,75% dos animais e a mortalidade foi observada a partir do 13º DAI. No grupo
infectado tratado a taxa de sobrevida foi de 31,25% e mortalidade de 67,75%, a partir
do 14º DAI.
Gráfico 2 - Taxa de mortalidade cumulativa de camundongos Swiss inoculados intraperitonealmente com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do Trypanosoma cruzi submetidos (------) ou não ( ) ao tratamento com desferrioxamina até o 32o dia após a infecção.
Dias após a infecção
Perc
entu
al de m
ort
alid
ade
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Dias após a infecção
Perc
entu
al de m
ort
alid
ade
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Dias após a infecção
Perc
entu
al de m
ort
alid
ade
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
ARANTES, J.M. Resultados
33
4.3 - Hemocultura
Dos animais infectados e tratados (n=16), 5 (31,25%) sobreviveram à fase
aguda e apresentaram hemocultura negativa no 30o, 60o, 90o e 180o dias após a
incubação. Por outro lado, dos 16 animais infectados e não-tratados apenas um
(6,25%) sobreviveu à fase aguda e apresentou hemocultura positiva neste mesmo
período (Tabela 1).
4.4 - PCR
Dos cinco animais infectados e tratados que sobreviveram à infecção, todos
apresentaram PCR positiva na fase aguda (60 DAI). Na fase crônica (240 DAI) a PCR
foi negativa em três destes animais. O único animal infectado não-tratado que
sobreviveu à infecção apresentou PCR positiva nas fases aguda (60 DAI) e crônica da
infecção (240 DAI) (Tabela 1 – Figura 3).
Figura 3 - Produtos específicos de 330pb do minicírculo de kDNA do Trypanosoma cruzi obtidos com os iniciadores S35 e S36 em DNA extraído do sangue de camundongos infectados com a cepa Y, tratados com desferrioxamina e não-tratado, coletados nas fases aguda e crônica da infecção e visualizados em gel de poliacrilamida a 6%, corado pela prata
PM
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
Br C- 1A 1C 2A 2C 3A 3C 4A 4C 5A 5C 6A 6C C+ PMPM
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
Br C- 1A 1C 2A 2C 3A 3C 4A 4C 5A 5C 6A 6C C+ PMPM
200 pb
300 pb
400 pb
500 pb
Br C- 1A 1C 2A 2C 3A 3C 4A 4C 5A 5C 6A 6C C+ PM
ARANTES, J.M. Resultados
34
4.5 - ELISA
Anticorpos específicos da classe IgG foram detectados no soro de todos os
animais infectados, tratados ou não nas fases aguda e crônica da infecção (Tabela 1).
Tabela 1- Hemocultura, PCR e ELISA realizados nas fases aguda (60 dias) e crônica (240 dias) nos camundongos que sobreviveram à infecção pela cepa Y do Trypanosoma cruzi.
Hemocultura
PCR
ELISA
Animais Aguda Crônica Aguda Crônica Aguda Crônica
IT
1 - - + - + + 2 - - + - + + 3 - - + + + + 4 - - + - + + 5 - - + + + +
INT 6 + + + + + +
IT: grupo infectado tratado e INT: grupo infectado não-tratado com desferrioxamina - negativo + positivo / aguda (60DAI) e crônica (240 DAI)
ARANTES, J.M. Resultados
35
4.6 - Ferro tecidual
Em relação à dosagem de ferro no fígado representada no Gráfico 3, observou-
se diferença significativa (p<0,05) entre os animais infectados e não-infectados no 14o
e 21o DAI. Os animais infectados tratados ou não apresentaram menor quantidade de
ferro no fígado que os animais não-infectados.
Gráfico 3 - Média da quantidade de ferro no fígado realizada no 14o e 21o dia após a infecção em camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT).
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
4
5
6
7
CNT CT INT IT
Mg/0
,1g
de
tecid
o
*
*
**
21 dias após a infecção
14 dias após a infecção
0
1
2
3
4
5
6
7
0
1
2
3
4
5
6
7
CNT CT INT IT
Mg/0
,1g
de
tecid
o
*
*
**
21 dias após a infecção
14 dias após a infecção
ARANTES, J.M. Resultados
36
4.7 - Dosagem de ferro sérico
Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos no 14o DAI. No
21o DAI verificou-se diferença significativa (p<0,05) entre o grupo infectado não-tratado
quando comparado aos grupos controle não-tratado e infectado tratado (Gráfico 4). Os
animais infectados não-tratados apresentaram em média maior concentração de ferro
sérico (273,47 µg/dL) quando comparados aos animais dos grupos controle não-tratado
(100,9 µg/dL) e infectado tratado (119,28 µg/dL).
Gráfico 4 - Média da dosagem de ferro sérico realizada no 21o dia após a infecção nos
camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT).
0
100
200
300
400
500
600
700
g/d
L
21 dias após a infecção
*
CNT CT INT IT
*
0
100
200
300
400
500
600
700
g/d
L
21 dias após a infecção
**
CNT CT INT IT
**
ARANTES, J.M. Resultados
37
4.8 - Níveis de hemoglobina
Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de hemoglobina
avaliados antes da infecção entre os diferentes grupos. Observou-se diferença
significativa (p<0,05) entre os animais infectados e não-infectados tratados pela DFA
no 14o DAI (Gráfico 5). Os animais infectados tratados apresentaram em média níveis
mais baixos de hemoglobina (7,14 µg/dL) quando comparados aos animais não-
infectados tratados que apresentaram em média níveis mais elevados de hemoglobina
(10,9 µg/dL).
Gráfico 5 - Média da dosagem de hemoglobina realizada antes da infecção e no 14o dia após a infecção nos camundongos Swiss pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT).
0
5
10
15
20
25
g/d
l 0
5
10
15
20
25Antes da infecção
14 dias após a infecção
*
CNT CT INT IT
0
5
10
15
20
25
g/d
l 0
5
10
15
20
25Antes da infecção
14 dias após a infecção
*
CNT CT INT IT
ARANTES, J.M. Resultados
38
4.9 - Peso dos animais
No Gráfico 6 está representada a média do peso dos animais dos grupos CNT,
CT, INT e IT antes da infecção e aos 7, 14 e 21 DAI.
Observou-se diferença significativa em relação ao tratamento com DFA nos dias
7, 14 e 21 após a infecção. Os animais tratados com DFA, infectados ou não,
apresentaram em média um menor peso corporal do que os animais não-tratados,
infectados ou não (p<0,05).
Gráfico 6 - Média do peso corporal dos camundongos Swiss antes da infecção e aos 7, 14 e 21 dias após a infecção nos grupos controle não-tratado ( ), controle tratado ( ), infectado não-tratado ( ) e infectado tratado ( ).. Letras diferentes representam diferenças significativas.
Dias após a infecção
0 7 14 21
Peso (
g)
a
a
b
ba
a
b
b
a
a
b
b
10
15
20
25
30
35
Dias após a infecção
0 7 14 21
Peso (
g)
a
a
b
ba
a
b
b
a
a
b
b
10
15
20
25
30
35
ARANTES, J.M. Resultados
39
4.10 - Peso relativo dos órgãos
O coração, baço, fígado e linfonodo cervical dos animais foram pesados após
sacrifício e o peso relativo calculado considerando-se o peso corporal de cada animal.
Os resultados estão apresentados no Gráfico 7. Não foram observadas diferenças
significativas nos grupos controle, tratados com DFA ou não entre 14 e 21 dias.
No coração (Gráfico 7A) observou-se aumento significativo no peso relativo no
21o DAI no grupo infectado não-tratado quando comparado ao seu respectivo controle.
Quando foi comparado o peso relativo do coração entre o 14o e 21o DAI, observou-se
aumento do peso relativo apenas no grupo infectado (p<0,05).
No baço, fígado e linfonodo (Gráficos 7B, 7C e D) observou-se aumento
significativo no peso relativo nos grupos infectados, tratados ou não, quando
comparados aos seus respectivos controles no 21o DAI. No 14o DAI apenas o grupo
infectado tratado com DFA apresentou maior peso relativo quando comparado ao seu
controle. Observou-se aumento do peso relativo do fígado e linfonodo entre o 14o e 21o
DAI apenas no grupo infectado (p<0,05).
ARANTES, J.M. Resultados
40
Gráfico 7 - Peso relativo do coração, baço, fígado e linfonodo dos animais pertencentes aos grupos controle não-tratado (CNT), controle tratado (CT), infectado não-tratado (INT) e infectado tratado (IT) no 14o e 21o dias após infecção. * representa diferença significativa entre os grupos infectados e seus controles. # representa diferença significativa entre os grupos infectados, tratados ou não no 21o dia em relação ao 14o dia após a infecção.
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
Coração
Fígado
Baço
Linfonodo
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0
0,0025
0,005
0,0075
0,01
0
0,025
0,05
0,075
0,1
A B
C D
CNT CT INT IT INT IT
14 dias14 dias 21 dias21 dias 14 dias14 dias 21 dias21 dias
CNT CT INT IT INT IT
* #* #
**
** #
** # *
*
ARANTES, J.M. Resultados
41
4.11 - Análise histopatológica
Nos animais controle, tratados ou não, necropsiados no 14o (Figura 4 A) e 21o
(Figura 4 B) DAI as secções histológicas do coração, mostraram estruturas
características, sem sinais de alterações indicativos de lesão ou qualquer tipo de
processo inflamatório. Nos animais do grupo infectado, tratados ou não com DFA
verificou-se processo inflamatório variando de discreto a moderado no 14o DAI e de
moderado a intenso no 21o DAI em ambos os grupos. Não foi verificada diferença entre
os dois grupos.
Nas secções histológicas do fígado dos animais controle, tratados ou não com
DFA, necropsiados no 14o e no 21o DAI, verificou-se processo inflamatório focal e
discreto (Figuras 5 A e B). Nos animais do grupo infectado não-tratado necropsiados no
14o DAI (Figura 5 C), o fígado apresentou processo inflamatório mononuclear
moderado e difuso, com degeneração hidrópica, hialina e necrose. No 21o DAI
observou-se um agravamento deste quadro (Figura 5 D) com aumento na quantidade
de células inflamatórias e no tamanho dos infiltrados. Os animais pertencentes ao
grupo infectado e tratado apresentaram morfologia hepática mais preservada do que o
grupo não-tratado, tanto no 14o quanto no 21o DAI (Figuras 5 E e F).
Nas secções histológicas do baço dos animais controle, tratados ou não com
DFA, necropsiados no 14o e no 21o DAI, verificou-se aspecto morfológico compatível
com normalidade (Figuras 6 A e B). O baço dos animais do grupo infectado e não-
tratado necropsiados no 14o DAI apresentou hiperplasia e hipertrofia da polpa branca e
no 21o DAI um aumento de reatividade com congestão (Figura 6 C e D). No 14o DAI, o
baço dos animais pertencentes ao grupo infectado e tratado apresentou alta reatividade
no 14o DAI que se manteve no 21o DAI, sendo mais intensa a hiperplasia e hipertrofia
levando a confluência folicular do que no grupo não-tratado (Figuras 6 E e F).
Nos cortes histológicos de linfonodo observa-se hiperplasia folicular nos animais
infectados. Esta hiperplasia é precoce nos animais tratados com DFA no 14o DAI
(Figuras 7 A-F).
Não foram observadas diferenças em relação ao parasitismo tecidual avaliado
no coração, baço, fígado e linfonodo dos animais infectados, tratados ou não com DFA,
no 14o e no 21o DAI. Entretanto, o parasitismo foi menor nos dois grupos no 21o em
comparação ao 14o DAI (Figuras 8 A-H).
ARANTES, J.M. Resultados
42
Figura 4 - Fotomicrografia de secções de coração de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: ausência de alterações inflamatórias ou degenerativas; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório discreto e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório moderado e (F) intenso constituído em todos os campos por células mononucleadas. Observa-se a presença de degeneração hialina em todos os grupos infectados e a presença de ninhos (C) e amastigotas isoladas (D) (setas). Hematoxilina Eosina X600.
ARANTES, J.M. Resultados
43
Figura 5 - Fotomicrografia de secções de fígado de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: focos inflamatórios discretos; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) processo inflamatório moderado e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) processo inflamatório discreto e (F) discreto constituído em todos os campos por células mononucleadas. Hematoxilina Eosina X600.
ARANTES, J.M. Resultados
44
Figura 6 - Fotomicrografia de secções de baço de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) e (D) intenso; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E) e (F). Hematoxilina Eosina X600.
ARANTES, J.M. Resultados
45
Figura 7 - Fotomicrografias de secções de linfonodo de camundongos (A) e (B) Grupo controle tratado com desferrioxamina: quadro histológico compatível com normalidade; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi: (C) discreta hiperplasia folicular e (D) hiperplasia folicular instalada; Grupo infectado com a cepa Y do Trypanosoma cruzi tratado com desferrioxamina: (E e F) hiperplasia folicular. Hematoxilina Eosina B X300; A,C-F X130
ARANTES, J.M. Resultados
46
Figura 8 - Fotomicrografias de secções histológicas, de animais pertencentes aos grupos infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi, tratados ou não com desferrioxamina, submetidas à reação imuno-histoquímica anti- Trypanosoma cruzi. (A) amastigotas isoladas, processo inflamatório intenso e difuso; (B) ninho de amastigotas, inflamação discreta; (C) ninho de amastigotas e foco inflamatório ativo; (D) amastigota isolada e raras células inflamatórias; (E,F,G,H) amastigotas isoladas e ninhos de amastigotas. Peroxidase Anti-Peroxidase X1000
5 - Discussão
ARANTES, J.M. Discussão
48
O ferro é importante na patogênese de muitas doenças. Lima e Villalta (1989)
demonstraram que o ferro é essencial para o crescimento das formas amastigotas do
T. cruzi e é obtido da transferrina por meio da endocitose mediada por receptores
presentes nestas formas, confirmando desta maneira que fatores nutricionais também
podem influenciar o curso da infecção pelo T. cruzi. Uma hipótese a ser considerada é
que se houver diminuição nos níveis de ferro no hospedeiro, o parasito poderá ter
dificuldades em sobreviver.
Para se estudar e correlacionar a deficiência de ferro e infecção, muitos agentes
quelantes também têm sido utilizados. A DFA é uma droga bastante utilizada na terapia
de quelação de ferro. Estudos em malária humana demonstraram que somente o
tratamento com a DFA ou a sua combinação com a terapia padrão, aumentou a
remoção dos parasitos na malária assintomática e complicada (Traore et al., 1991;
Gordeuk et al., 1992; Mabeza et al., 1996).
Em relação à doença de Chagas, estudos iniciais sugeriram que a deficiência de
ferro poderia agravar a infecção pelo T. cruzi em roedores (Lee et al., 1977). Por outro
lado, Lalonde e Holbein (1984) mostraram que a depleção dos estoques de ferro pelo
agente quelante DFA e uma dieta deficiente em ferro causava proteção contra a
infecção em camundongos. Arantes (2003) demonstrou que camundongos infectados
com 500 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y do T. cruzi submetidos ao
tratamento com DFA ou com dieta deficiente de ferro apresentaram resultados
semelhantes.
Considerando a hipótese de que o ferro é importante para a proliferação do
parasito, a sua remoção através da utilização deste quelante pode dificultar a
proliferação do mesmo, reduzindo seus níveis na corrente sanguínea. Neste trabalho
foi observada a redução dos níveis de parasitemia e um maior período patente no
grupo infectado e tratado com DFA, mostrando que a gravidade da infecção pela cepa
Y em camundongos foi atenuada pelo tratamento com este quelante, confirmando a
hipótese do estudo. Provavelmente, quanto menor a quantidade de ferro disponível
para o parasito, maior seria a dificuldade de reprodução do mesmo. Estes dados
também foram observados por Hershko e Peto (1988) que apontaram que a DFA inibe
o crescimento de agentes infecciosos, como na malária, por interferir com os
mecanismos de aquisição de ferro pelo patógeno ou por reduzir os estoques de ferro
do hospedeiro. Em trabalhos de Pedrosa et al. (1990), a cepa Y do T. cruzi não foi
sensível a este tipo de tratamento, sendo verificado apenas sua sensibilidade à
ARANTES, J.M. Discussão
49
ausência total de ferro na dieta. Os autores acreditam que isto foi possível devido à
multiplicação rápida da cepa Y nos camundongos e ao menor tempo para esta alcançar
o pico de parasitemia, quando comparado à cepa YuYu, que por apresentar uma
multiplicação mais lenta no hospedeiro foi sensivel ao tratamento com DFA. O inóculo
utilizado por estes autores (1400 formas tripomastigotas) foi maior que o utilizado neste
experimento (500 formas tripomastigotas) e o modo de tratamento, apenas uma dose
de DFA no 5o DAI, foi diferente do utilizado neste trabalho, o que poderia explicar as
diferenças observadas nos resultados obtidos nos dois protocolos experimentais.
Os efeitos benéficos do tratamento com DFA não são somente observados em
parasitos. Weinberg (1994) demonstrou in vivo seu efeito contra Pneumocystis carinii
através de injeções diárias da droga, e encontrou redução na intensidade da infecção
em ratos e camundongos e alterações na morfologia do fungo. Estes autores
demonstraram ao comparar injeções intraperitoneais diárias e semanais que a terapia
semanal reduz em menor intensidade os trofozoítos do que a terapia diária.
Os efeitos limitantes na proliferação de parasitos pela DFA podem estar
relacionados a outros fatores que não sejam somente a restrição da disponibilidade de
ferro para o patógeno (Hershko e Peto, 1988). É sugerido que este resultado benéfico
pode ser devido à imunomodulação induzida pela droga. Dados in vitro indicam que a
fagocitose do ferro pelos macrófagos reduz sua habilidade em eliminar patógenos, o
que pode explicar, em parte, o efeito inibitório do ferro na atividade de IFN- (Weiss et
al., 1992). O tratamento com DFA em crianças com malária cerebral resultou na
estimulação de vias efetoras de IFN- e aumentou os níveis de nitrito e nitrato no soro,
produto estável final do NO (Weiss et al., 1997). O NO é um radical de duração curta
que está envolvido em vários processos biológicos, como por exemplo, relaxamento
vascular, neurotransmissão e citotoxidade celular contra vários microorganismos
(Nathan, 1987; MacMicking et al., 1997).
O NO e o metabolismo do ferro estão funcionalmente ligados, enquanto o NO
regula a expressão de mRNA no metabolismo celular de ferro, nomeados receptores
de mRNA de ferritina e transferrina em níveis pós-transcripcionais, via ativação de
proteínas regulatórias do ferro (Drapier et al., 1993; Weiss et al., 1993), o ferro inibe a
expressão de NO sintase (iNOS), enzima responsável pela elevada formação de NO
em macrófagos, após estimulação por citocinas (Weiss et al., 1994).
Depois de avaliadas as interações regulatórias entre o ferro e o metabolismo do
NO na defesa imune contra a infecção por Plasmodium falciparum (Fritsche et al.,
ARANTES, J.M. Discussão
50
2001), observaram que a estimulação por citocinas em células intestinais humanas ou
macrófagos de camundongos, resultou no aumento de formação de NO e diminuição
da sobrevivência do plasmódio em co-cultura com eritrócitos humanos. A adição da
DFA antes do tratamento com citocinas aumentou a formação do NO e morte do
parasito, mas não apresentou nenhum efeito na formação de inibidor de NO (L-N6). O
efeito da droga na remoção do parasito parece ser devido ao aumento da geração de
NO mais do que a limitação da disponibilidade de ferro para o parasito (Fritsche et al.,
2001).
Em relação à infecção pelo T. cruzi, a resposta protetora depende da imunidade
inata e adquirida, requerendo a participação de macrófagos, células NK, linfócitos B e T
e produção de diferentes citocinas, que possuem importantes papéis na regulação da
replicação do parasito e da resposta imune (Tarleton, 2003; Silva et al., 2003). A fase
aguda da infecção é caracterizada pela ativação de macrófagos e produção de
citocinas inflamatórias, especialmente TNF- e IL-12 (Silva et al., 1995; Aliberti, 1996),
que ativam a produção de IFN- por células NK (Cardillo, 1995). O IFN- é crucial para
a defesa contra o parasito, porque em parte, sua combinação com TNF- leva a
síntese da enzima iNOS por macrófagos, resultando na produção de NO, que por sua
vez, controla a replicação do T. cruzi (Vespa et al., 1994; Martins et al., 2001).
Dada a importância do NO contra a proliferação do T. cruzi, pode-se especular
que uma das ações da DFA poderá ter sido o aumento da síntese de NO no
hospedeiro, além da diminuição do ferro, que controla a replicação do parasito,
consistindo também em uma das hipóteses que explicam a diminuição de parasitos
circulantes nos animais infectados e tratados em relação aos animais infectados.
Camundongos Swiss são susceptíveis à infecção pelo T. cruzi e apresentam modesta
indução de iNOS frente a infecção, em relação a camundongos C57BL6 que são
resistentes ao T. cruzi e respondem à infecção com uma forte indução do gene iNOS
em fagócitos (Malvezi et al., 2004). Portanto, a DFA pode ter favorecido maior
resistência ao hospedeiro atuando de duas formas: 1- reduzindo a oferta de ferro para
o parasito e 2- ampliando a produção de NO pelo hospedeiro, ambas, favorecendo a
eliminação do parasito. Estas duas hipóteses deverão ser confirmadas em novos
experimentos.
Neste trabalho, além das médias dos níveis de parasitemia dos animais
infectados e tratados se apresentarem menores que a dos animais somente infectados,
ARANTES, J.M. Discussão
51
também foi demonstrada uma taxa menor de mortalidade (IT=67,75%; INT= 93,65%).
Os animais tratados com DFA, apresentando uma menor quantidade de parasitos na
corrente sanguínea, são provavelmente mais resistentes à infecção e sobrevivem mais
tempo a ela.
Lalonde e Holbein (1984) demonstraram que a depleção dos estoques de ferro
com DFA e dieta deficiente em ferro, promoveu a redução da mortalidade em
camundongos infectados pelo T. cruzi. Harvey et al. (1985) também demonstraram que
a deficiência de ferro protegeu camundongos contra a infecção por Plasmodium
chabaudi. Os animais que receberam dieta deficiente em ferro exibiram menor
parasitemia e mortalidade do que os animais que receberam dieta com ferro.
Nos animais que sobreviveram à infecção, coletou-se sangue na fase aguda e
crônica da infecção (fase aguda: 60 DAI e fase crônica: 240 DAI de acordo com
Miyamoto et al., 2006) para a realização dos exames parasitológicos (hemocultura e
PCR) e sorológicos (ELISA).
Os testes parasitológicos como a hemocultura ou xenodiagnóstico têm
apresentado alta especificidade, mas a sensibilidade destas técnicas é baixa. A
hemocultura alcança na forma crônica da doença, 0% a 94% de positividade (Gomes et
al., 1999). Embora tenham ocorrido aprimoramentos no diagnóstico parasitológico da
doença de Chagas crônica, a baixa sensibilidade dos exames indiretos é uma limitação
para sua aplicação ao diagnóstico e controle pós-terapêutico (Portela-Lindoso e
Shikanai-Yasuda, 2003).
Neste trabalho, os animais infectados e tratados com a DFA apresentaram
hemocultura negativa e o animal somente infectado apresentou hemocultura positiva
nas fases aguda e crônica da infecção. Esse resultado foi surpreendente, uma vez que
grupos de animais infectados com a Cepa Y e tratados com benznidazol na fase aguda
da infecção apresentam 50% de hemocultura positiva enquanto animais não tratados
apresentam 100% de hemocultura positiva (Filardi e Brener, 1987). Diante desses
resultados um questionamento é se estes animais infectados e tratados haviam se
curado da infecção. Como a hemocultura apresenta baixa sensibilidade e não pode ser
utilizada sozinha como critério de cura, foi utilizado a PCR e ELISA, como métodos de
avaliação da infecção nestes animais.
Recentemente, técnicas moleculares como a PCR vêm demonstrando níveis
variados de sensibilidade na detecção de DNA do T. cruzi (44.6-100%) em amostras de
pacientes (Ávila et al., 1993; Brito et al., 1995; Castro et al., 2002; Gomes et al., 1998).
ARANTES, J.M. Discussão
52
Esta variação pode resultar, dentre outros fatores, das diferenças genéticas dos
parasitos (Portela-Lindoso e Shikanai-Yasuda, 2003) e principalmente dos protocolos
utilizados (Gomes et al., 1998).
A infecção pelo T. cruzi vem sendo indiretamente diagnosticada através de
testes sorológicos como ELISA. Este método é empregado devido a sua simplicidade,
baixo custo e bom desempenho. Um problema associado a este teste é a possível
reação cruzada entre antígenos do T. cruzi, Leishmania spp e Trypanosoma rangeli,
que podem levar a resultados falso-positivos e reduzem a sua sensibilidade (Umezawa
et al., 2003). Além disso, diversos trabalhos demonstram que a sorologia convencional
pode permanecer muito tempo positiva mesmo após o tratamento efetivo (Andrade et
al., 1991a/b) enquanto a pesquisa de anticorpos líticos pode negativar mais
precocemente (Krettli et al., 1982; Martins-Filho et al., 1995).
Entre os animais infectados e tratados com DFA que sobreviveram à fase aguda
da infecção (n=5), todos foram positivos pela PCR e pela ELISA na fase aguda da
infecção; enquanto na fase crônica 3 animais foram negativos pela PCR. O animal
infectado que sobreviveu a infecção foi positivo em ambas as fases. Esses resultados
indicam que não ocorreu cura parasitológica dos camundongos infectados e tratados
pela DFA. Entretanto, uma diminuição significativa da parasitemia foi verificada tanto
pela curva de parasitemia, quanto pela taxa de positividade dos exames
parasitológicos. Esse fato associado à menor mortalidade observada no grupo tratado,
sugere que embora o tratamento com a DFA não tenha curado os animais, ele
desempenha um papel protetor importante durante o curso da infecção. Breidbach et
al. (2002), avaliaram a inibição das formas sangüíneas do Trypanosoma brucei pela
DFA e observaram que a incubação do parasito com o quelante levou a inibição da
síntese de DNA e menor consumo de oxigênio, o que indica que a DFA pode afetar a
ribonucleotídeo redutase e oxidase alternativa.
Dallman et al. (1986) demonstraram que a deficiência de ferro no organismo
acontece em três estágios, com sobreposição destes. O primeiro estágio é
caracterizado pela diminuição na concentração de ferritina sérica que reflete perda nos
estoques de ferro no baço, fígado e medula óssea. O segundo estágio é caracterizado
por um aumento na capacidade de ligação de ferro e diminuição da concentração de
ferro sérico. No último estágio, as concentrações de hemoglobina e hematócrito
diminuem, e os estoques de ferro no baço e fígado tornam-se bastante exauridos.
ARANTES, J.M. Discussão
53
Os animais infectados (tratados ou não) apresentaram uma menor quantidade
de ferro no fígado no 14o e 21o DAI provavelmente relacionado à regulação do ferro
pelo organismo frente à infecção pelo T. cruzi.
A hepcidina é um hormônio produzido pelo fígado, secretado na circulação,
envolvido na regulação do ferro no organismo, que atua na diminuição da absorção
pelos enterócitos e na posterior liberação do ferro dos macrófagos e hepatócitos. Este
hormônio contribui para a diminuição da absorção do ferro intestinal na presença de
processos inflamatórios o que favorece a anemia associada à inflamação (Fleming e
Bacon, 2005).
No presente trabalho, a liberação da hepcidina pelo fígado poderia explicar a
diminuição do ferro tecidual encontrada nos animais infectados (tratados ou não).
Provavelmente, esta liberação causou a diminuição da absorção de ferro pelos
enterócitos e conseqüentemente o seu transporte para o fígado. Aliado a isto, a
diminuição do ferro pode ser explicada pela infecção pelo T. cruzi, na própria
necessidade do parasito em adquirir ferro para seu metabolismo.
Após o 40o DAI no trabalho realizado por Pedrosa et al. (1990), observou-se
diminuição da quantidade de ferro no fígado de animais infectados com a cepa Y e CL
e tratados com DFA e no baço deste mesmo grupo, quando infectados com a cepa Y.
O tratamento com DFA não alterou os níveis de ferro no fígado e baço em
camundongos convencionais e germfrees no 15o dia após infecção pelo T. cruzi
(Pedrosa et al., 1993). Lalonde e Holbein (1984) apenas verificaram redução nos
estoques de ferro do organismo (48% no fígado e 15% no baço) de animais não-
infectados quando associaram o tratamento com DFA e uma dieta deficiente em ferro.
Apesar dos níveis de ferro tecidual no 14o DAI apresentarem-se diminuídos nos
animais infectados (tratados ou não) os níveis de ferro sérico apresentaram-se
normais. Já no 21o DAI, observou-se um aumento dos níveis de ferro sérico. Supõe-se
que de alguma forma o parasito desencadeie uma maior liberação de ferro do fígado
aumentando sua concentração no plasma dos animais infectados (tratados ou não). A
diminuição dos níveis de ferro sérico no grupo dos animais infectados e tratados está
correlacionada a quelação do ferro plasmático pela ação da DFA.
Letendre (1985) observou que durante as infecções há uma redução nos níveis
de ferro circulante devido à diminuição da liberação do ferro do sistema fagocitário
mononuclear, restringindo a quantidade de ferro para parasitos extracelulares, mas
sendo um benefício questionável no caso de parasitos intracelulares como o T. cruzi,
ARANTES, J.M. Discussão
54
que se aloja em células fagocíticas mononucleares do sistema fagocitário mononuclear.
No trabalho realizado por Pedrosa et al. (1990) os níveis de ferro sérico em
camundongos tratados com DFA e infectados pelas cepas Y, CL e YuYu do T. cruzi
não sofreram redução. Lalonde e Holbein (1984) mostraram que camundongos não-
infectados pelo T. cruzi e tratados com DFA não apresentaram mudanças significativas
nos níveis de ferro sérico, enquanto os animais infectados e tratados apresentaram
suficientes estoques de ferro para manterem uma resposta imune normal. O protocolo
utilizado pelos autores acima diferiu do utilizado neste trabalho, pois tanto o inóculo
quanto a dose e a forma de administração da DFA foram diferentes.
No presente trabalho não se observou a diminuição de ferro sérico,
provavelmente porque as formas amastigotas do T. cruzi, ao se estabelecerem nas
células do sistema fagocítico mononuclear, na incapacidade de obtenção do ferro
necessário a sua sobrevivência diretamente do sistema fagocitário mononuclear,
favoreceram a liberação do mesmo para o soro. Uma vez no soro, este se liga a
transferrina e só então é disponibilizado para o parasito intracelular via endocitose
mediada por receptores.
Como observado por Bothwell et al. (1979), o primeiro pool de ferro no sangue
do hospedeiro vertebrado é constituído pelo ferro associado à hemoglobina. A
dosagem da hemoglobina é importante para se correlacionar à deficiência férrica do
hospedeiro quando submetido a dietas deficientes, infecções ou algum tipo de
tratamento que acarrete alterações nos níveis de ferro.
Alterações relacionadas aos níveis de hemoglobina foram descritas em várias
infecções por tripanosomas (Esievo et al., 1982; Igbokwe e Anosa, 1989). Estas
alterações foram observadas na infecção pelo T. cruzi e incluem redução no número de
plaquetas (Cardoso e Brener, 1980; Ruiz et al., 1989), no número de eritrócitos
(Cardoso e Brener, 1980) e no valor do hematrócrito (Lalonde e Holbein, 1984).
Marcondes et al. (2000) observaram que a infecção experimental aguda pelo T.
cruzi está associada à anemia, trombocitopenia, leucopenia e hipoplasia da medula
óssea. Contudo, os mecanismos responsáveis por estas alterações hematológicas não
são bem entendidos.
Pedrosa et al. (1990) avaliaram a deficiência de ferro e correlacionaram os
efeitos desta deficiência à evolução da doença de Chagas. Os autores mostraram que
a hipohemoglobinemia apresentada pelo hospedeiro foi permanente no grupo de
camundongos alimentados com dieta sem ferro, provavelmente porque os baixos
ARANTES, J.M. Discussão
55
estoques de ferro não foram suficientes para compensar a eritropoiese que segue a
anemia. Nos animais tratados com DFA houve recuperação dos níveis de hemoglobina
quando infectados com as cepas CL e Y, sugerindo que este tratamento não interferiu
nas necessidades adequadas para a eritropoiese.
A diminuição dos níveis de hemoglobina observados no grupo dos animais
infectados e tratados em relação ao grupo dos animais não-infectados e tratados, é
explicada pela infecção pelo T. cruzi associado à ação da DFA na dose administrada
no presente trabalho.
Neste trabalho, os animais tratados com DFA, infectados ou não, apresentaram
em média um menor peso corporal do que os animais não-tratados de forma
semelhante ao observado por Hershko e Peto (1988). Possivelmente isto se deva a
ação do quelante que tenha levado à diminuição do peso corporal, ou o fármaco tenha
causado um desequilíbrio de ferro no organismo. A comparação do grupo infectado ao
controle mostrou que a infecção pelo T. cruzi não provocou redução do peso dos
animais. Carlomagno et al. (1987) demonstraram que o ganho de peso, os níveis de
proteínas e albumina no soro dos camundongos infectados pelo T. cruzi, não diferiram
em comparação aos animais controles, comprovando que a infecção não conduziu à
perda de peso.
No 14o e 21o DAI foram observadas diferenças significativas nos pesos relativos
do coração, baço, fígado e linfonodo em relação à infecção pelo T. cruzi. No 21o DAI os
órgãos dos animais infectados não-tratados apresentaram pesos relativos maiores do
que dos animais infectados tratados, possivelmente em decorrência do próprio
processo de infecção, com alterações nos órgãos afetados, sendo semelhantes ao
controles no 14o DAI. No 14o e 21o DAI, o baço, fígado e linfonodo dos animais do
grupo infectado não-tratado e infectado tratado com DFA apresentaram aumento de
peso em relação aos seus respectivos controles bem como em relação ao grupo
infectado no 14o DAI (p<0,05). No 21o DAI os grupos infectado tratado e infectado
foram semelhantes. Entre o 14o e o 21o DAI, observou-se aumento de peso relativo do
coração, baço, fígado e linfonodo apenas no grupo infectado não-tratado.
Possivelmente a ação da DFA é mais precoce, antes mesmo do 14o, e permite que os
animais infectados e tratados elaborem uma resposta imune mais efetiva do que os
animais infectados, aumentando sua sobrevida.
Experimentos em camundongos (Alden et al., 1987) e autópsias de crianças
desnutridas mostraram que o coração sofre hipotrofia proporcional ao grau de perda de
ARANTES, J.M. Discussão
56
peso (Webb et al., 1986; Freeman et al., 1994). Herschko e Peto (1988) avaliando os
efeitos da DFA em ratos infectados por malária, mostraram que houve um ganho de
peso no baço de animais infectados pelo Plasmodium berghei. Por outro lado durante a
fase aguda da infecção pelo T. cruzi, a esplenomegalia e linfadenopatia relacionadas à
ativação policlonal de células B e T são características marcantes (Minoprio et al.,
1986a; Minoprio et al., 1986b).
A partir de várias indicações sobre a importância do ferro no desenvolvimento da
doença de Chagas, pode ser observado que alterações em seus níveis podem não só
mudar o curso da infecção, mas juntamente com o agente patogênico, podem alterar a
integridade dos diversos tecidos e órgãos afetados.
Os processos patogênicos na fase aguda da infecção no camundongo são
complexos e nele estão envolvidos o parasito, sua multiplicação, morte intracelular e os
mecanismos imunológicos, com as respostas humoral e celular, que levam às lesões
características dessa fase.
No curso destes processos, o surgimento de alterações nos órgãos e tecidos
está relacionado também ao tropismo da cepa e conseqüentemente ao maior
parasitismo dos diferentes setores do organismo (Andrade et al., 1970; Andrade, 1974).
O tempo de infecção e o inóculo utilizado podem também ser fatores relevantes no
curso da infecção.
Em estudos histopatológicos de ratos inoculados com as cepas Y, 12 SF e
Colombiana, Chapadeiro et al. (1980) descreveram lesões das fases aguda e crônica e
mostraram a importância do inóculo na intensidade destas. Inóculos baixos da cepa Y,
não determinaram lesões ou estas eram de grau leve. Nos ratos infectados com
inóculos médios e altos desta cepa, as lesões histopatológicas estavam presentes em
todos os grupos estudados.
Marinho et al. (1999) avaliaram a influência da carga parasitária em relação ao
parasitismo, patologia e ativação de sistema imune na fase crônica da doença de
Chagas. Os autores observaram que camundongos infectados com um inóculo maior
da cepa Y do T. cruzi (105 parasitos), apresentaram maior parasitemia, intensidade do
processo inflamatório no coração e músculo esquelético e maior ativação do sistema
imune do que os camundongos infectados com um inóculo menor (103 parasitos).
A forma aguda da doença representa uma infecção generalizada pelo T. cruzi,
pois suas formas amastigotas podem ser encontradas nas secções histológicas de
quase todos os órgãos e no interior de vários tipos celulares, usualmente com a
ARANTES, J.M. Discussão
57
presença de infiltrado inflamatório mononuclear, congestão aguda e edema. A
inflamação é o processo patológico básico nos tecidos afetados, com a presença de
células inflamatórias, que incluem macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células T
(Villalta e Kierszenbaum, 1983; 1984).
Apesar dos mecanismos envolvidos na patogênese de órgãos alvos do T. cruzi
não serem elucidados completamente, a persistência do parasito e os eventos auto-
imunes têm sido apontados como fundamentais na formação das lesões teciduais
(Tarleton, 1999).
Neste trabalho, os órgãos analisados são importantes para o entendimento das
lesões provocadas pelo T. cruzi e dos processos decorrentes dos tratamentos
empregados na experimentação. A inflamação do miocárdio é de extrema importância
em todo o processo patológico da doença, devido à maneira como as reações ao
parasito se desenvolvem neste órgão. O fígado é o principal órgão metabólico do corpo
e os hepatócitos têm a função de desintoxicação e de metabolização de muitas
substâncias exógenas. O baço e o linfonodo são órgãos importantes na resposta imune
e remoção do T. cruzi, sendo ao mesmo tempo alvo e componente ativo de resistência
à infecção pelo T. cruzi (Olivieri et al., 2002).
Os animais infectados não-tratados e tratados apresentaram alterações
semelhantes no coração, com variações dentro dos grupos na intensidade das
alterações histológicas.
O tratamento com o quelante não alterou a integridade dos órgãos nos grupos
não-infectados. O fígado dos animais do grupo infectado e tratado, apresentou menor
intensidade de alterações, sugerindo proteção pela DFA no 14o e 21o DAI quanto ao
baço este apresentou maior reatividade (hiperplasia e hipertrofia de polpa branca) do
que os animais não-tratados, compatível com resposta mais precoce neste grupo e
eventual proteção.
Lima et al. (2001) demonstraram que camundongos infectados com uma cepa
macrofagotrópica do T. cruzi (cepa Peruviana), desenvolveram esplenomeglia devido a
hiperplasia reativa com quantidades aumentadas de linfócitos e macrófagos,
culminando em desintegração do parasito e necrose de células parasitadas. A necrose
vem sendo atribuída à liberação de citocinas tóxicas, incluindo TNF-α, de macrófagos
parasitados. As lesões necróticas apresentaram-se mais intensas em camundongos
susceptíveis (C3H e Swiss) do que em camundongos resistentes (DBA).
Bowern et al. (1984) demonstraram que o tratamento com DFA na
ARANTES, J.M. Discussão
58
encefalomielite alérgica no cérebro e medula espinhal de ratos levou a lesões sem
inflamação. É possível que o ferro influencie na migração e atividade de células imune
efetoras, que agem na formação de radicais livres. Por outro lado, Pedrosa et al.
(1993), não observaram diferenças na avaliação histopatológica dos órgãos dos
camundongos pertencentes ao grupo tratado com DFA, tratados com ferro-dextran e
seus controles.
No estudo histopatológico do coração dos animais infectados, tratados ou não,
foi observada a presença de parasitismo, processos inflamatórios e degenerativos.
Ribeiro dos Santos et al. (1991) observaram no modelo murino, que as lesões difusas
do miocárdio e as lesões de fibras cardíacas não-parasitadas estão ligadas aos
mecanismos de imunidade celular desde a fase aguda da doença. Como demonstrado
por Grimaud e Andrade (1984), a integridade das miocélulas é mantida mesmo na
presença do ninho parasitário, mas a partir do momento que as formas parasitárias
começam a se desintegrar as alterações nestas células têm início, levam à necrose e
induzem o aparecimento do infiltrado inflamatório. A determinação da inflamação aguda
é também confirmada por Silva et al. (1985), segundo os autores, a inflamação é
devido a formação de um complexo antígeno-anticorpo, a partir da liberação de
produtos antigênicos do parasito no interstício.
Apesar da redução dos níveis de parasitemia no grupo infectado e tratado com
DFA, não foram observadas diferenças significativas em relação ao parasitismo
tecidual avaliado no coração, baço, fígado e linfonodo dos animais infectados, apenas
a redução na intensidade do parasitismo do 14o para o 21o DAI, como era de se
esperar. Entretanto, de acordo com Melo e Brener (1978) não há correlação entre os
níveis de parasitemia e o número de parasitos intracelulares no coração durante o
curso da infecção pela cepa Y. Segundo Alvarenga (1960), o parasitismo hepático
também é escasso e se limita quase que exclusivamente às células de Kupffer.
A única droga disponível para o uso clínico que age diretamente no parasito é o
benznidazol. É um derivado nitro conhecido por reduzir os níveis de parasitismo e
eliminar os sintomas da fase aguda (Coura et al., 2002). Contudo, a eficácia da terapia
anti-T. cruzi na fase crônica é ainda controvérsia (Andrade et al., 1991a/b; Galvão et
al., 1993; Segura et al., 1994; Coura et al., 2002). Em decorrência disso, vários outros
caminhos bioquímicos estão sendo identificados como potenciais alvos quimioterápicos
contra o T. cruzi, entre eles estão os inibidores da biossíntese de esterol, da cisteína
protease, do metabolismo do pirofosfato e da biossíntese de novo da purina (Urbina e
ARANTES, J.M. Discussão
59
Docampo, 2003).
A DFA, ao dificultar a disponibilização do ferro para os parasitos poderá ser de
grande valia para o esclarecimento dos efeitos das reduções de ferro durante a
infecção pelo T. cruzi. Além disso, outros estudos precisam ser realizados para
esclarecer os efeitos imunomoduladores da DFA no curso da infecção pelo T. cruzi e,
eventualmente, considerando que a DFA favoreceu o hospedeiro, reduzindo a
parasitemia e mortalidade do mesmo, a associação DFA/Benznidazol poderá contribuir
para a quimioterapia da doença de Chagas. Experimentos utilizando outras variáveis
tais como cepas que apresentem diferentes graus de susceptibilidade/resistência à
quimioterapia, cepas não letais para camundongos, camundongos naturalmente
resistentes à infecção pelo T. cruzi, quelantes mais potentes, precisam ser ainda
estudados para avaliar o real efeito dos níveis de ferro durante a infecção chagásica
tanto aguda quanto crônica.
6 - Conclusões
ARANTES, J.M. Conclusões
62
O tratamento com a DFA em dose de 5mg/dia/animal reduz a taxa de
mortalidade e o número de parasitos circulantes, no entanto, não afeta o parasitismo
tecidual.
A infecção por si só, reduz o ferro hepático, enquanto a associação
DFA/infecção mostra uma tendência a maior redução.
A infecção aumenta os níveis de ferro sérico; na associação DFA/infecção os
níveis de ferro sérico são mantidos.
O tratamento com DFA reduz os níveis de hemoglobina apenas nos animais
infectados.
O tratamento com a DFA reduz o peso dos animais independente da infecção.
Porém, o peso cardíaco nos animais infectados e tratados é mantido possivelmente
pelo desenvolvimento de uma resposta imune mais precoce, sendo observada pelo
aumento do peso relativo dos órgãos linfóides (fígado, baço e linfonodo) no 14o DAI e
pelo maior acometimento histopatológico do baço e linfonodo.
7 – Perspectivas futuras
ARANTES, J.M. Perspectivas futuras
64
Variações no período de tratamento bem como na forma de administração do
medicamento;
Testes in vitro utilizando diferentes quelantes;
Avaliar a modulação dos quelantes de ferro na resposta imune durante a infecção
pelo T. cruzi;
Associação de quelantes de ferro ao Benznidazol na fase aguda da infecção, com o
objetivo de avaliar os benefícios sobre o curso da infecção, utilizando cepas com
diferentes graus de susceptibilidade/resistência ao benznidazol;
Avaliação histopatológica do infiltrado inflamatório (quantificação de linfócitos CD4,
CD8, CD3 e neutrófilos);
8 - Referências Bibliográficas
ARANTES, J.M. Referências Bibliográficas
65
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