Barreira Intestinal, Microbioma e Saúde -...

Barreira Intestinal,

Microbioma e Saúde

Adérson Omar Mourão Cintra Damião

Departamento de Gastroenterologia da FMUSP

Workshop Microbioma, Probióticos e Saúde - ILSI

São Paulo, SP, 07/11/16

Agenda

Barreira intestinal

Instalação da microbiota intestinal

Simbiose (eubiose) versus disbiose

A doença inflamatória intestinal (DII) como

paradigma de disbiose

O futuro: Biologia de Sistemas (“interactoma”)

Agenda

Barreira intestinal

Instalação da microbiota intestinal

Simbiose (eubiose) versus disbiose

A doença inflamatória intestinal (DII) como

paradigma de disbiose

O futuro: Biologia dos Sistemas

Barreira Intestinal

Mundo externo

(ambiente)

Mundo interno

(organismo)

König J et al. Clin Transl Gastroenterol 2016; 7(10): e196

Componentes da barreira intestinal

Componente não

imunológico acidez gástrica

secreções digestivas

motilidade GI

microbiota/microbioma

barreira de cél. epiteliais

membrana basal

camada aquosa

camada de muco (mucina,

fator trefoil)

defensinas (cél. de Paneth,

neutrófilos)

König J et al. Clin Transl Gastroenterol 2016; 7(10): e196

Vindigni SM et al. Therap Adv Gastroenterol 2016; 9: 606-25

Componentes da barreira intestinal

Componente não

imunológico acidez gástrica

secreções digestivas

motilidade GI

microbiota/microbioma

barreira de cél. epiteliais

membrana basal

camada aquosa

camada de muco (mucina,

fator trefoil)

defensinas (cél. de Paneth,

neutrófilos)

Componente

imunológico IgA secretora

imunidade inata: neutrófilos,

cél. apresentadoras de ag –

macrófagos, cél. dendrítica,

cél. epitelial (cél. M)

imunidade adquirida ou

adaptativa (cél. T e B)

König J et al. Clin Transl Gastroenterol 2016; 7(10): e196

Vindigni SM et al. Therap Adv Gastroenterol 2016; 9: 606-25

Barreira Intestinal

NOD2 = nucleotide-binding oligomerization domain 2

CARD15 = caspase recruitment domain

Adapt. de Korzenik JR et al. Nat Rev Drug Discov 2006:5: 197-209

Vandenbroucke K et al. Gastroenterology 2004; 127:502-13

Es

co

re h

isto

lóg

ico

P = 0,001

Lactococcus lactis secretor

de Fator Trefoil (TFF)

Colite experimental por DSS

Probióticos “turbinados”Lactococcus lactis hipersecretor de fator trefoil

Barreira Intestinal

NOD2 = nucleotide-binding oligomerization domain 2

CARD15 = caspase recruitment domain

Adapt. de Korzenik JR et al. Nat Rev Drug Discov 2006:5: 197-209

Escherichia coli Nissle 1917

Isolada nas fezes de um soldado alemão na época da

Primeira Guerra Mundial pelo Prof Alfred Nissle

(Freiburg, Alemanha).

O soldado fora deslocado para a região dos Balcãs

(Dobrudja), área endêmica de infecção por Shigella. Foi

o único a não contrair diarreia.

Cepa passou a ser conhecida como E. coli Nissle 1917.

Scaldaferri F et al. World J Gastroenterol 2016; 22: 5505-11

Escherichia coli Nissle 1917 equivalente à

mesalazina na manutenção da remissão clínica em

pacientes com RCU (12 meses)

Kruis W et al. Gut 2004;53;1617-23

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0E. coli Mesalazina E. coli Mesalazina

Pa

cie

nte

s c

om

re

ca

ída

(%

)

“Per protocol” “Intention to treat”

33,9%36,4%

45,1%37,0%

N=110 N=112 N=162 N=165

RCU em remissãoProbabilidade de permanecer em remissão

Escherichia coli Nissle 1917 vs Mesalazina

(Curvas de Kaplan-Meier)

Kruis W et al. Gut 2004;53;1617-23

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Pro

ba

bil

ida

de

de

ma

nte

r a

re

mis

sã

o (

%)

0 100 200 300 400 500

Tempo para recaída (dias)

Mesalazina (n=112)

Escherichia coli Nissle 1917 (n=110)

Taxa de remissão na RCU distal ativa com diferentes

doses de enema de E. coli Nissle 1917

Matthes H et al. BMC Complement and Altern Med 2010, 10:13

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

Admissão 2 semanas 4 semanas 8 semanas

Taxa d

e r

em

issão

(c

um

ula

tiva)

Placebo

10 mL enema

20 mL enema

40 mL enema

P=0,0446

Estrutura e mecanismos de

ação da Escherichia coli

Nissle 1917

Scaldaferri F et al. World J Gastroenterol 2016; 22: 5505-11

LPS: Lipopolissacáride

IL-2: Interleucina-2

TNF: Fator de Necrose Tumoral

IFN: Interferon

Efeito direto

antimicrobiano Inibe colonização por bactérias patogênicas

Inibe síntese de toxinasFlagelo

LPS DNA,

circular,

cromossomo

único

Adere às células

epiteliais

Estimula produção de defensinas pelas células epiteliais

Reforça as “tight junctions” (aumenta a expressão de proteínas ZO-1 e ZO-2)

Células

epiteliais

intestinais

Fímbrias

“Tight

junctions”

Propriedades

imunomoduladorasCélula

dendrítica

Leucócitos

Reduz citocinas pró-

inflamatórias (IL-2, TNFα, IFNγ)

Aumenta citocinas anti-

inflamatórias

Barreira Intestinal

NOD2 = nucleotide-binding oligomerization domain 2

CARD15 = caspase recruitment domain

Adapt. de Korzenik JR et al. Nat Rev Drug Discov 2006:5: 197-209

TLRs e interação com sistemas intracelulares

Adapt. de Sartor RB. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2006; 3: 390-407

Transcrição de genes pró-inflamatórios e anti-inflamatórios

Receptores Toll-like (TLR)

Adapt. de Beutler B et al. Annu Rev Immunol 2006; 24: 353-89

Barreira Intestinal

NOD2 = nucleotide-binding oligomerization domain 2

CARD15 = caspase recruitment domain

Adapt. de Korzenik JR et al. Nat Rev Drug Discov 2006:5: 197-209

O” Neill LA.Nat Immunol 2004;5:776-778

Watanabe T et al. Nat Immunol 2004;5:800-808

NOD2 = nucleotide-binding oligomerization domain 2

CARD15 = caspase recruitment domain

LRRs = repetições ricas em leucina

MDP = muramil dipeptídeo

Via NF- Kappa B

Via NF- Kappa B

Mutação do NOD2NormalCrohn

Proteína NOD2/CARD 15 e efeitos

sobre a via NF-Kappa B

O” Neill LA.Nat Immunol 2004;5:776-778

Watanabe T et al. Nat Immunol 2004;5:800-808

NOD2 = nucleotide-binding oligomerization domain 2

CARD15 = caspase recruitment domain

LRRs = repetições ricas em leucina

MDP = muramil dipeptídeo

Via NF- Kappa B

Via NF- Kappa B

Mutação do NOD2NormalCrohn

Proteína NOD2/CARD 15 e efeitos

sobre a via NF-Kappa B

Agenda

Barreira intestinal

Instalação da microbiota intestinal

Simbiose (eubiose) versus disbiose

A doença inflamatória intestinal (DII) como

paradigma de disbiose

O futuro: Biologia dos Sistemas

Microbiota Intestinal – Instalação

INTRAUTERINA

Estéril ?

6m a 2 anos

Microbiota do adulto

CONTATOS ÍNTIMOS

AMAMENTAÇÃO

“Bifidus Factors”

Bifidobacterium

E.coli

Ent. faecalis

NASCIMENTO

Damião AOMC et al. Probióticos. In: Nutrição Oral, Enteral e Parenteral

na Prática Clínica. Waitzberg DL (ed). Editora Atheneu, SP, 4ª ed., 2009. p. 2115-38

Microbiota e microbioma intestinal

~25.000

2-20.000.000

Saúde intestinal e sistêmica: resultado de interações equilibradas

Ser humano

Micróbiosintestinais

Número de células Número de genes

(~100-1000X mais)

(10X maisou 1:1?)

1012?

3,3X1013?

1014?

3,8X1013?

Human Microbiome Consortium. Nature 2012;486:207-214

Manichanh C et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012; 9: 599-608

Doré J et al. United Eur Gastroenterol J 2013; 1: 311-8

Durchschein F et al. World J Gastroenterol 2016; 22: 2179-94

Marchesi JR et al. Gut 2016; 65: 330-9

População bacteriana intestinalDiferenças entre a microbiota luminal e a associada à mucosa

Microbiota

luminal

Microbiota

associada à

mucosa

P

Índice de

diversidade

4,96 ± 0,37 4,14 ± 0,56 < 0,001

Firmicutes 41,4% 29,1% < 0,0001

Bacteroidetes 20,2% 26,3% < 0,05

Actinobacteria 22,0% 12,6% < 0,0001

Proteobacteria 9,3% 19,3% < 0,0001

Ringel Y et al. Gut Microbes 2015; 6: 173-81

Microbiota Intestinal – Instalação

INTRAUTERINA

Estéril ?

6m a 2 anos

Microbiota do adulto

CONTATOS ÍNTIMOS

AMAMENTAÇÃO

“Bifidus Factors”

Bifidobacterium

E.coli

Ent. faecalis

NASCIMENTO

Damião AOMC et al. Probióticos. In: Nutrição Oral, Enteral e Parenteral

na Prática Clínica. Waitzberg DL (ed). Editora Atheneu, SP, 4ª ed., 2009. p. 2115-38

ECZEMA ATÓPICO

Ação profilática dos probióticos

0%

10%

20%

30%

40%

50%

Placebo Lactobacillus GG

(1x1010)

n=64n=68

Kalliomäki M et al. Lancet 2001; 357:1076-79

p=0,008

Eczema

atópico

aos 2

anos

PROBIÓTICOS

Eczema Atópico

2 anos1 4 anos2

Placebo

n=68

Lactobacillus GG

n=64

Placebo

n=54

Lactobacillus GG

n=53

46% 23% 46% 26%

1. Kalliomäki M et al. Lancet 2001; 357: 1076 - 79

2. Kaliomäki M et al. Lancet 2003; 361: 1869 - 71

PROBIÓTICOS – ATOPIAConcentração de Óxido Nítrico

Expirado

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Placebo Sem história

de alergia

Óxido

Nítrico

(ppb)

Kalliomaki M et al. Lancet 2003; 361: 1869-71

Lactobacillus

GG P=0,03

Microbiota e Gravidez

1º trimestre 3º trimestre

controle ↑ Proteobacteria

↑ Actinobacteria

Diversidade

Transferência da microbiota para

camundongos “germ-free”

Padrão de

“síndrome metabólica”•Resistência à insulina

•Inflamação

•Ganho de peso

“Útil” na gravidez

(crescimento do feto, lactação)Karen O et al. Cell 2012; 150:470-80

Dieta/Disbiose/Colite

Devkota S et al. Nature 2012; 487: 104-8

Sartor RB. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012; 9: 561-2

Knockout IL-10

↑Bilophilia wadsworthia

Dieta/Disbiose/Colite

Devkota S et al. Nature 2012; 487: 104-8

Sartor RB. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012; 9: 561-2

Knockout IL-10

Interação de: Suscetibilidade genética

Fator ambiental (dieta)

Barreira intestinal alterada

Microbiota intestinal (disbiose)

Resposta imunológica/

inflamatória

Agenda

Barreira intestinal

Instalação da microbiota intestinal

Simbiose (eubiose) versus disbiose

A doença inflamatória intestinal (DII) como

paradigma de disbiose

O futuro: Biologia dos Sistemas

Microbiota Intestinal - Ações

PROTEÇÃO

Resistência à

colonização

(Bifido e Lacto)IMUNOMODULAÇÃO

“Estado de alerta”

“Inflamação fisiológica”

Resiliência bacteriana

Resposta imune equilibrada

Tolerância – cél.T reg (IL-10,TGF-), cél. dendrítica

BENEFÍCIOS NUTRICIONAIS

Vitaminas

Substratos energéticos

Microbiota Intestinal

Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5:274-84; Nat Rev Immunol 2010;10:735-44

Curr Opin Gastroenterol 2012; 28: 63-69; Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012; 9: 599-608

Simbiose

(Equilíbrio)

Iannitti & Palmieri. Clin Nutr 2010; 29: 701-25

Cerf-Bensussan & Gaboriau-Routhiau. Nat Rev Immunol 2010;10: 735-44

Simbiose (ou eubiose) versus Disbiose

Simbiose versus Disbiose

Simbiose

(Equilíbrio)

Disbiose

(Desequilíbrio)

Fatores genéticos

Estilo de vida (dieta, estresse)

Infecções

Higiene/Alergia

Antibióticos

Iannitti & Palmieri. Clin Nutr 2010; 29: 701-25

Cerf-Bensussan & Gaboriau-Routhiau. Nat Rev Immunol 2010;10: 735-44

Simbiose

(Equilíbrio)

Disbiose

(Desequilíbrio)

Fatores genéticos

Estilo de vida (dieta, estresse)

Infecções

Higiene/Alergia

Antibióticos

Simbiose versus Disbiose

Situações associadas.: SII, DDC, DII,

halitose, atopia, doenças autoimunes,

obesidade, câncer de cólon, “pouchitis”

Iannitti & Palmieri. Clin Nutr 2010; 29: 701-25

Cerf-Bensussan & Gaboriau-Routhiau. Nat Rev Immunol 2010;10: 735-44

Simbiose

(Equilíbrio)

Disbiose

(Desequilíbrio)

Fatores genéticos

Estilo de vida (dieta, estresse)

Infecções

Higiene/Alergia

Antibióticos

Alt. Inflamatórias

Alt. Imunológicas

Simbiose versus Disbiose

Situações associadas.: SII, DDC, DII,

halitose, atopia, doenças autoimunes,

obesidade, câncer de cólon, “pouchitis”

Iannitti & Palmieri. Clin Nutr 2010; 29: 701-25

Cerf-Bensussan & Gaboriau-Routhiau. Nat Rev Immunol 2010;10: 735-44

Simbiose

(Equilíbrio)

Disbiose

(Desequilíbrio)

Fatores genéticos

Estilo de vida (dieta, estresse)

Infecções

Higiene/Alergia

Antibióticos

Situações associadas.: SII, DDC, DII,

halitose, atopia, doenças autoimunes,

obesidade, câncer de cólon, “pouchitis”

Alt. Inflamatórias

Alt. Imunológicas

Diarreia

Dor abdominal

Flatulência

Meteorismo

Borborigmos

Iannitti & Palmieri. Clin Nutr 2010; 29: 701-25

Cerf-Bensussan & Gaboriau-Routhiau. Nat Rev Immunol 2010;10: 735-44

Young VB. Curr Opin Gastroenterol 2012; 28: 63-69

Simbiose versus Disbiose

Agenda

Barreira intestinal

Instalação da microbiota intestinal

Simbiose (eubiose) versus disbiose

A doença inflamatória intestinal (DII) como

paradigma de disbiose

O futuro: Biologia de Sistemas

Doença Inflamatória Intestinal - DII

0 -

% d

e p

ac

ien

tes

co

m ≥

10

.00

0cfu

/µL

Controle

n=40

5 -

10 -

15 -

20 -

25 -

30 -

35 -

40 -

Gastroenterology 2002; 122:44-54

RCU

n=19

CROHN

n=54

DII – Concentrações Bacterianas

Biopsias ileocolônicas

P<0,05

DII – Bactérias intestinais na mucosa

BACTÉRIAS RCU CROHN

Proteobacteria ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

Enterobacteriaceae ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

Clostridium histolyticum/

lituseburense↑ ↑ ↑ ---

Clostridium occoides/ Eubact.

rectale↑ ↑ ↑ ↑

Bacteroides/ Prevotella ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

Bactérias redutoras de sulfato ↑ ↑ ↑ ↑

Bifidobacterium ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Lactobacillus ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Scand J Gastroenterol 2002; 37:1034-41

Disbiose e DII

Características RCU CrohnBolsite

(“pouchitis”)

1. Diversidade (Firmicutes,

Bacteroidetes)

(Firmicutes)

2. Estabilidade

3. Perfil ↑ Actinobacteria

↑ Proteobacteria

Bacteroidetes

( família

Prevotellaceae)

Roseburia

↑ Enterobacteriaceae

↑ Ruminococcus gnavus

(Crohn ileal)

↑ Proteobacteria

Bacteroidetes

4. Bifido / Lacto

5. Faecalibacterium

prausnitzii

6. Bactérias

“agressivas”

↑ Desulfovibrio sp

↑ Fusobacterium

varium

↑ Fusobacterium

nucleatum

↑ E. coli

(↑ virulência, invasiva)

↑ E. coli

(↑virulência, invasiva)

↑ E. coli (AIEC)

Manichanh C et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2012;9:599-608

Jonkers D et al. Drugs 2012; 72:803-23

Disbiose na doença de Crohn

Pacientes x Controles

(Gel de Eletroforese)

Joossens M et al. Gut 2011;60:631-7

Bandas Bactérias

Mediana

Pacientes

com Crohn

(n=68)

Controles

(n=139) p

(a) 9,68 F. prausnitzii 0 (0-2,51) 6,41 (0,26-10,92) 8,9 x 10-7

(b) 10,79

Espécies desc.

de Clostridium

(cluster XIVa)

0,57 (0-2,39) 1,63 (0,78-2,93) 0,03

(c) 11,00Ruminococcus

gnavus0 (0-2,35) 0 (0-0) 2,1 x 10-7

(d) 11,51 F. prausnitzii 0 (0-0,79) 0,91 (0-2,38) 1,4 x 10-5

(e) 14,60 Dialister invisus 0 (0-0) 0 (0-1,15) 0,04

(f) 16,24 Bifido adolescentis 0 (0-2,38) 3,89 (0-9,72) 5,4 x 10-6

Disbiose na doença de Crohn

Pacientes x Parentes x Controles

(PCR)

Joossens M et al. Gut 2011;60:631-7

15

12

9

6

3

0

Crohn Parentes

assintom.

Controles

Nú

mer

o d

e F.

pra

usn

itzi

i(l

og

10/

g f

ezes

) 15

12

9

6

3

0

Crohn Parentes

assintom.

Controles

12

9

6

3

0

Crohn Parentes

assintom.

Controles

Nú

mer

o d

e B

. ad

ole

scen

tis

(lo

g 1

0/g

fez

es)P= 2,61 . 10-11

P= 6,00 . 10-3

Nú

mer

o d

e R

. gn

avu

s(l

og

10/

g f

ezes

)

P= 1,59 . 10-10

F. prausnitzii Ruminococcus gnavus Bifido adolescentis

Disbiose na doença de Crohn

Parentes assintomáticos x Controles

(Gel de eletroforese)

Joossens M et al. Gut 2011;60:631-7

Mediana

Bandas Bactérias Parentes

assintomáticos

n=84

Controles

n=55 P

8.55 Ruminococcus

torques

1.83 (0,42-3,74) 0 (0-2,21) 0.02

11.35 Membro do

grupo

Escherichia

coli-Shigella

0 (0-0) 0 (0-0,20) 0.01

16.89 Collinsella

aerofaciens

0 (0-0) 0 (0-0,78) 0.004

Doença de Crohn e microbiota intestinal

Indivíduos normais

Parentes assintomáticos

de pacientes com Crohn

Pacientes com Crohn

Simbiose

Disbiose I

Perfil de bactérias que

degradam mucinaDisbiose II

Perfil de redução de

formação de butirato,

além da degradação

de mucina

Joossens et al. Gut 2011;60: 631-637

Progressão da DII

Adaptado de Dalau RS & Chang EB. J Clin Invest 2014;124:4190–6.

Perfil de

microbiota

Atividade da

doença

Estágios Saudável Assintomático Doença ativa

Medicamentos

Dieta

Mudanças no

estilo de vida

Remissão Recaída Complicações

Estenose

Fibrose

Fístulas

Cirurgia

História natural da doença

Modelo de progressão da DII do estágio

pré-clínico ao clínico

Adaptado de Torres J et al. Gut 2016; 65:1061-9

Insulto secundário•Infecções•Drogas...

• Perda da barreira• Perda da tolerância

bacteriana• Disbiose

• Tabagismo• Ambiente• Higiene• Dieta • Expansão/amplificação

da inflamação• Ativação da resposta

adquirida• Anticorpos circulantes

• Resposta imune não controlada• Lesão intestinal• Remodelação

tecidual• Sintomas

Diagnóstico de DIIInflamaçãosubclínica

Início da doença(assintomático)

Predisposiçãogenética

Fatoresambientais

ATG16L1NOD2IL23RMHC...

Agenda

Barreira intestinal

Instalação da microbiota intestinal

Simbiose (eubiose) versus disbiose

A doença inflamatória intestinal (DII) como

paradigma de disbiose

O futuro: Biologia de Sistemas (“interactoma”)

Expossoma

Microbioma

Genoma

Imunoma

DII

Patogênese da doença inflamatória intestinal (DII)

O jogo dos “omas”

Fiocchi C. J Gastroenterol Hepatol 2015; 30 (Suppl 1): 12-18

Souza HSP et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2016; 13: 13-27

O “interactoma” da DII:

Uma rede de interações positivas e negativas

Outros omas

Expossoma(Ambiente)

Microbioma(Microbiota intestinal)

Genoma(Genes)

Imunoma(Resposta imune)

Fiocchi C et al, 2016 (in press)

Expossoma(Inúmeros fatores)

Genoma(n=206 associações)

Imunoma(~1000 células e moléculas)

DII

Microbioma(1014 bactérias + fungos

+ vírus)

Interactoma na DII

Fiocchi C et al, 2016 (in press)

Expossoma

Microbioma

Genoma

Imunoma

Interação (rede) de DII tipo 1:Tratamento: intervenções sobre micróbios e aspectos imunes

DII

Expossoma

Microbioma

Genoma

Imunoma

Interação (rede) de DII tipo 2:Tratamento: microbiano, immune e intervenções genômicas

DII

Expossoma

Microbioma

Genoma

Imunoma

Interação (rede) de DII tipo 3:Tratamento: estilo de vida e intervenções imunológicas

DII

Biologia de sistemas: em busca dos “nós”

Clinical / basic

investigators

Bioinformatics

biologists

IBD

interactome

network

CCF/Emory UCLA CSBM Caltech UCSD

Complementary expertise needed to

define IBD networks and identify

specific molecular target for therapy

Cortesia Dr C. Fiocchi

IBD Systems Biology Approach

Cortesia Dr. D. Iliopoulos

From patients to therapy

Microbiomaintestinal

Genoma Imunoma

Expossoma

Análise

“ômica”

Análise

“ômica”

Análise

“ômica”

Análise

“ômica”

Terapia personalizada:

• Identificação correta do alvo (nós)

• Especificidade absoluta

• Potencialmente “curativo”

Integração

“multiômica”

das várias

redes na DII

Interactomada DII

O interactoma da DII: implicações terapêuticas

(conceito de tratamento personalizado)

Adapt. de Fiocchi C. J Gastroenterol Hepatol 2015; 30 (Suppl 1): 12-18

Obrigado

IBD Systems Biology Approach

Cortesia Dr. D. Iliopoulos

From patients to therapy

DII – Etiopatogenia

Defeito na

imunidade

inata

Amplificação da

resposta adquirida

Suscetibilidade

genética

Fatores

ambientais

Diminuição da

tolerância

Redução da

apoptose

DII

Nature 2007; 448: 427-34

Gut 2011; 60: 1739-1753

N Engl J Med 2011; 365: 1713-1725

J Clin Invest 2014; 124: 4190-6