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Biotecnologia de soja
Transgenia e
Marcadores Moleculares
rpriolli@usp.br
Melhoramento Genético Objetivo
• Aumento da frequência de genes ou de
combinações genéticas de interesse econômico,
através de ferramentas como cruzamentos e
seleção, para maximizar a produção nas condições
ambientais existentes
A soja é resultado de um
longo processo de seleção
realizada pelo homem
Glycine soja
Glycine max
Biotecnologia
• Aplicação dos mecanismos que
envolvem:
– Tecnologia do DNA recombinante
– Marcadores moleculares
– Cultura de tecidos
– Biologia celular e molecular
– Informática
Construindo um transgene
Plasmídeos e vetores
• ocorrem naturalmente em algumas bactérias
• são moléculas de DNA dupla fita e circular
• muitas vezes carregam genes para resistência a antibióticos
• têm replicação independente da replicação cromossômica
Características importantes dos
vetores
• Origem de replicação
• Genes para resistência a
antibióticos
– Permite que a célula
hospedeira cresça em meio
seletivo
• Múltiplos sítios de
clonagem
– Permite a inserção de DNA
exógeno
pCAMBIA1301
11837 bp
lacZ a lpha
Gus firs t exon
Gus se cond exon
kana mycin (R )
hygromycin (R)
pV S 1 sta
Ca ta lase intron
T-B order (r ight)
Histidine tag
pB R322 bom
T-B order (le ft)
Nos poly-A
Ca MV 3 5S polyA
Ca MV 35S promoter
Ca MV 3 5S promote r
pB R322 or i
pV S 1 rep
BamH I (11046)
Bgl II (8)
Bst EII (2050)
Bst XI (10782)
EcoR I (11025)
Hind III (11076)
Kpn I (11041)Nco I (1)
Pst I (11068)
Sac I (11035)
Sac II (8383)
Sal I (11058)
Sma I (11043)
Xba I (11052)
Nhe I (2014)
Nhe I (5458)
Sph I (2455)
Sph I (11074)
Xho I (8901)
Xho I (9995)
Enzimas de restrição
• Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em
pontos específicos, geralmente em sequencias
de 4, 6 e 8 bases palíndromas
DNA recombinante
DNA ligase
Métodos de transformação
Inserção do DNA recombinante-
• INDIRETO
Agrobacterium
• DIRETA
Biobalística
Eletroporação - Protoplastos e Tecidos íntegros
Transformação por Agrobacterium
• Bactérias do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA
para dentro da célula da planta
• No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de
plantas, ou inoculada no tecido da planta, transferindo parte do seu DNA
para as células da planta
Transformação por Biobalística
• Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com DNA e
aceleradas em direção ao tecido da planta (hélio comprimido)
• As partículas perfuram a parede celular e penetram dentro da
célula
• Utilizado quando não é possível por incompatibilidade biológica o
uso de Agrobacterium
• Vetores - não requerem sequencias especiais
• Micropartículas - ouro ou tungstênio - 0,4 a 1,5 mm
Partículas de ouro Partículas de tungstenio
Acelerador de partículas com alta pressão de gás hélio (Biorad).
Esquema de funcionamento
TRANSFORMAÇÃO POR
ELETROPORAÇÃO
• Consiste em submeter os protoplastos e DNA a
um campo elétrico de intensidade controlada
• Choque elétrico - formação de poros
reversíveis na membrana plasmática
permitindo a entrada do DNA
• Fatores importantes
– Duração do pulso
– Voltagem aplicada
Esquema de eletroporção
Cubetas para eletroporção
Eletroporador
CULTIVO E REGENERAÇÃO DE PLANTAS A
PARTIR DE PROTOPLASTOS
E F
G H
A B
C D
Tipos de Transgênicos
• 1ª Geração
Características de produção
–redução do custo de produção
–resistência a herbicida, doenças e insetos
–Estresse ambiental
• 2ª Geração
Características de consumo
–agregar valor ao produto final
–melhoria nutricional
–melhor conservação pós-colheita
Variedades e eventos de transgenia
http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database
Soja: Transgênicos de 1ª geração
– GTS 40-3-2 soja tolerante ao herbicida glifosato (Roundup
Ready) da MONSANTO
• Introdução do gene cp4 epsps (5-enolpiruvil chiquimato-3-fosfato sintase)
presente em Agrobacterium tumefaciens
– ACS-GMOO5-3 soja tolerante ao herbicida glifosinato de
amônia (LibertyLink)da BAYER
• Introdução do gene gene PAT presente em Streptomyces
viridochromogenes
– BPS-CV127-9 soja tolerante ao herbicida imidazolinona
(chlorsulfuron, imazapyr e imazaquim) da BASF
• Introdução do gene csr1-2 de mutantes de A. Thaliana (serina por uma
asparagina)
- MON87701 soja tolerante a lagartas
• Introdução do gene Cry1Ac de ação biocída presente em Bacillus
thuringiensis
– Metabolismo dos principais ácidos graxos em soja e genes
associados
Soja: Transgênicos de 2ª geração
10.2%
Palmitic
(C16:0)
3.8%
Stearic
(C18:0)
23.8%
Oleic
(C18:1)
49.1%
Linoleic
(C18:2)
8.1%
Linolenic
(C18:3)
SAD FAD2-1 FAT-A FAD3
= 81% of fatty acids insaturated
Silenciamento do Gene Fad2-1
Duas cópias do gene
ativas
– DP-305423 soja com alto teor de ácido graxo
oleico da Pioneer Hi-Bred • Inserção de cópia de uma porção de gene GmFad2-1 provocando a
supressão (silenciamento) do gene
– G94-1, G94-19, G168 soja com alto teor de ácido
graxo oleico da Du Pont Canada • Inserção de cópia de uma porção de gene GmFad2-1 provocando a
supressão (silenciamento) do gene
Soja: Transgênicos de 2ª geração
Marcadores Moleculares
Marcadores Moleculares
• Todo e qualquer fenótipo
molecular oriundo de um gene
expresso ou sequência de DNA
(expressa ou não) onde se
pode detectar polimorfismo
• Fisicamente ligados a locos
que determinam
características de interesse
econômico (QTLs)
– Necessidade de ocorrência de
desequilíbrio de ligação para
detectar a ligação entre os locos
Alguns tipos de marcadores
de DNA
• RFLP
• VNTR
• RAPD
• SSR
• AFLP
• SNP
Hibridização
PCR
RFLP e PCR
Contribuições dos Marcadores Moleculares no
Melhoramento
Caracterização de germoplasma
Diversidade genética e genealogia
A
B
C
D
E
R
Seleção de genitores
Caracterização de germoplasma
Identificação de acessos
Caracterização de germoplasma
Proteção Varietal
Seleção Assistida por Marcadores - SAM
Ferrugem asiática– Phakopsora pachyrhizi
Marcador AFLP
Genótipo selecionado
Mapa
• Mapeamento genético
População de São Paulo
9.291.000 habitantes em 2.600.00 domicílios
Soymap
http://bldg6.arsusda.gov/cregan/soymap.htm
Akaya et al (1993)
Morgante et al (1994)
Cregan et al (1999)
Song et al (2004)
Choi et al (2007)
MARCADORES MOLECULARES
RFLPs: Restriction Fragment Length Polymorphisms; (Botstein et al. 1980) RAPDs: Random Amplified Polymorphic DNAs; (Williams et al. 1990; Welsh & McClelland, 1990) AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms; (Zabeau & Vos, 1993; Lin & Kuo, 1995) Microssatélites ou SSRs: Simple Sequence Repeats; (Hamada et al. 1982; Tautz & Renz, 1984)
MARCADORES MOLECULARES
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms); (Schimid et al., 2003; Zhu et al., 2003)
MARCADORES MULTILOCO
DOMINANTES NÃO-ESPECÍFICOS
Não são dirigidos a uma região particular do
genoma
Revelam polimorfismo em dezenas de locos
simultaneamente
Desenvolvidos para cada espécie
Identificação dos heterozigotos
MARCADORES LOCO-ESPECÍFICOS
CODOMINANTES
CONCEITO DE MARCADOR dominante e codominante
dominante codominante P1 P2 P1 P2
P1 P2 P1 x P2
Ex: RAPD
P1 P2 P1 x P2
Ex: SSR
AA
A
A
A
a
a
a
a
aa Aa AA aa a
A
A
Equipamentos para
amplificação por
PCR
Equipamentos para
eletroforese em géis
de agarose
CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
Amplificação aleatória de fragmentos de DNA
Amplificação do DNA com um pequeno e único
“primer” (9 a 10 pb) de seqüência arbitrária e com
seqüência alvo desconhecida
Random Amplified Polymorphic DNA
Isolamento do DNA
(total, cloroplasto ou mitocondrial)
Reação de PCR com um “primer”
Separação dos fragmentos de DNA em gel
de agarose
Visualização de fragmentos de DNA
usando Brometo de Etídeo
RAPD: passo a passo
PCR
Separação das fitas de DNA (94oC, 5 min.)
“Primers” ligam-se as fitas de DNA (35 a 65oC, 30s.)
Taq DNA polimerase Sintetiza novas fitas de DNA (72 o C, 2-5 min.)
Separação das fitas de DNA para início de um novo ciclo (94o C, 30s.)
Polymerase Chain Reaction
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
EXTENSÃO DESNATURAÇÃO
RAPD
DNA
Taq-DNA
polim.
“Primers”
Nucleotídeos
Genótipo A Genótipo B
A B
CARACTERÍSTICAS (RAPD)
1. AMPLIFICA VÁRIOS LOCOS
2. POLIMORFISMO: PRESENÇA / AUSÊNCIA
3. MARCADOR DOMINANTE
PADRÃO RAPD
1. “Mismatches” no sítio do “primer”
2. Surgimento de um novo sítio
3. Comprimento de uma região amplificada entre dois sítios de “primers”
CAUSAS DO POLIMORFISMO:
CRITÉRIOS PARA A LEITURA DAS BANDAS:
1. “REPRODUTIBILIDADE” 2. ESPESSURA
3. TAMANHO 4. SEGREGAÇÃO ESPERADA
Avaliação de recursos genéticos
“Fingerprint” : Identificação de materiais
Análise da diversidade genética Caracterização de germoplasma Rápida Identificação de marcadores ligados a uma
característica de interesse -Polimorfismo na região de interesse Nível de Polimorfismo – muitas marcas / ensaio
RAPD: utilização e vantagens
Identificação de cultivares
Pureza dos Híbridos Detecção de variação somaclonal; Estrutura genética de populações e domesticação
Mapeamento genômico
Não é necessário conhecimento prévio do genoma da
espécie Custo baixo em relação aos outros marcadores
RAPD: utilização e vantagens
RAPD:
LIMITAÇÕES &
DESVANTAGENS
Dominantes; Falta de conhecimento prévio da identidade dos
produtos de amplificação; Problemas com reprodutibilidade entre laboratórios;
Custos: Plásticos
Agarose Enzima
EXEMPLO
Restriction Fragment Length Polymorphism •Hibridação molecular: corte do DNA com enzima de restrição e posterior
hibridação com sonda pela homologia das sequências
•Examina diferenças nos fragmentos de DNA digeridos
•Polimorfísmo deriva de mutações pontuais, inserções e deleções
•Requer grande quantidade de DNA genômico com alto grau de pureza
•Utilização de sondas radioativas ou por quimioluminescência (a frio)
Enzimas de restrição: •Reconhecem e cortam seqüências específicas do DNA;
•Sítios palindrômicos - RADAR
•Centenas de enzimas disponíveis:
EcoRI: 5’ GAATT C 3’
3’ G TTAA G 5’
HaeIII: 5’ GGCC 3’
3’ CCGG 5’
Alteram o tamanho do fragmento de restrição
RFLP • Método:
• 1) Extração e digestão do DNA.
• 2) Eletroforese
• 3) “Southern blotting”
• 4) Marcação da sonda
• 5) Autorradiografia
RFLP
SONDA MARCADOR
- cDNA library -
transcrição reversa
do mRNA
-gDNA library -
fragmentos de DNA
genômico clonados
ao acaso.
- Loco: combinação
Sonda/enzima
- Informativo
- Alelos distinguíveis
RFLP
Figura 1. Perfil de RFLP para as 18 linhagens
endogâmicas de milho com 4 diferentes enzimas de
restrição (Bam HI, Eco RI, Eco RV e Hind III). (A)
Sonda BNL6.32, (B) UMC128 e (C) UMC107.
Limitações - RFLP
Custos Instalação
Insumos Enzimas
Membranas
Hibridizações Radioativas
N-Radiativas
Nível de Polimorfismo – poucos locos / ensaio
Laborioso
Vantagens dos RFLPs
Robusto
Boa transferibilidade entre laboratórios
Codominante → Heterozigosidade
Não requer informação prévia de seqüência
Baseado em homologia de seqüência → análise filogenética
entre espécies;
Aplicável a qualquer planta
Poder discriminatório: * nível de população ou espécies
(sondas cópia única)
* nível de indivíduos
(sondas múltiplas cópias)
Microssatélites (SSR)
– Seqüências curtas (1 a 6 bases) repetidas em tandem
– Presentes em procariotos e eucariotos
– Presentes em regiões codificantes e não codificantes
– Maioria das repetições são dinucleotídeos • (AC) n (AG) n (AT)n
Microssatélites (SSR)
• Polimorfismo devido a diferenças no número de repetições – Escorregamento da DNA polimerase durante a
replicação
– Crossing-over desigual entre cromátides irmãs
• Codominantes
• Normalmente loco simples e multi-alélico
Presentes em diversos organismos
(CA)n – (TG)n: mais freqüentes em mamíferos
50.000 a 100.000 cópias por genoma
(AT)n: mais freqüente em plantas
Soja: (AG/AT)n (CCT/GGA)n (CCG/GGC)n
Par de “primers” específicos
(“Forward” e “Reverse” ~ 20 bases cada)
ALELOS 2 pb de diferença
CARACTERÍSTICAS
Microssatélites
Microssatélites (SSR)
• Detecção do polimorfismo – Seqüenciador – Géis de agarose – Géis de acrilamida (detecta diferenças de até 2pb)
• coloração direta: nitrato de prata (barato) • Coloração indireta: marcação radioativa ou fluorescente
Desenvolvimento de marcadores
microssatélites
Método tradicional
Outras estratégias
• Busca em banco de genes
• Utilização de sequências ESTs
• Utilização de BACs (Bacterial
Artificial Chromosomes
Microssatélites (SSR)
• Problemas – Custo e trabalho envolvidos no desenvolvimento dos
primers • Construção de bibliotecas genômicas • sequenciamento • Triagem dos melhores primers
Possibilidade de se usar seqüências depositadas em banco de dados
Nenhuma seqüência disponível
Usar SSRs conhecidos para isolar
clones de uma Biblioteca
(B)
Usar seqüências de SSRs como
sondas contra DNA digerido:
Biblioteca Enriquecida
Seqüênciar clones positivos
Desenhar “primers” específicos
Detectar polimorfismo
Metodologia e Visualização
dos SSRs
Metodologia :
Extração DNA
PCR com “primers” específicos
(“flanqueiam” as repetições)
Separação dos fragmentos
Visualização:
Agarose ou Metaphor: Agarose + BET, UV;
Acrilamida + Prata ou Radioisótopos
Sequenciador + fluorescência
Microssatélites (Gel de poliacrilamida 6%)
Amplified Fragment Length Polymorphism
CARACTERÍSTICAS
MARCADOR DOMINANTE
DISPERSO NO GENOMA
GRANDE NÚMERO DE LOCOS POR ANÁLISE
NÃO É ESPÉCIE-ESPECÍFICO
NÃO NECESSITA DE INFORMAÇÃO DE SEQÜÊNCIA
ROBUSTO, REPRODUZÍVEL ENTRE LABORATÓRIOS
RÁPIDO
ETAPAS AFLP
5. ANÁLISE EM GEL
1. DIGESTÃO DO DNA
2. LIGAÇÃO DE ADAPTADORES ESPECÍFICOS
3. PRÉ-AMPLIFICAÇÃO (oligonucleotídeo com
nenhuma ou apenas uma base seletiva)
4. AMPLIFICAÇÃO SELETIVA (oligonucleotídeo
com três bases seletivas)
DIGESTÃO
2) ENZIMA DE CORTE FREQÜENTE:
Reconhece a cada 04 pb – MseI , Rsa I
1) ENZIMA DE CORTE RARO:
Reconhece a cada 06 a 08 pb – EcoRI, Not I
1 a
FRAGMENTOS GERADOS PELA CLIVAGEM:
Fragmentos grandes
(cliv. da enzima rara em ambas as extremidades)
Fragmentos pequenos
(cliv. da enzima freqüente em ambas as
extremidades)
Fragmentos
intermediários
rara/freqüente
(cliv. combinada)
AFLP
4 a 5 Kb
Boa Visualização
Classe 1
Classe 2
Classe 3
LIGAÇÃO DE
ADAPTADORES
ESPECÍFICOS
1) Seqüências específicas complementares às
extremidades coesivas resultantes da clivagem
pelas enzimas de restrição:
Adaptadores EcoRI, adapatdores MseI
2) Adaptadores: 20 a 30 pb,
seqüências diferentes para cada adaptador
AFLP
2 a
PRÉ-AMPLIFICAÇÃO E
AMPLIFICAÇÃO
AFLP
3 a
• PRIMERS SEQÜÊNCIA ARBITRÁRIA
Características: - 20 a 25 nucleotídeos complementares
aos adaptadores
- 01 a 03 nucleotídeos de seqüência
arbitrária ( extremidade 3´ ) = Ação
Seletiva
Ação Seletiva Dos “Primers”
• 1a ETAPA : “primers” com apenas 01 nucleotídeo
arbitrário, não-marcados
01 em cada 04 bases (A, T, C, G) → 1 : 16 fragmentos
amplificados
• 2a ETAPA : “primers” com 03 nucleotídeos arbitrários,
aumento da intensidade de seleção, terminal 5´marcado
01 em cada 43 x 43 // 1 : 4096 fragmentos /
corte de enzima rara
GAATTCN
CTTAAGN
NTTAA
NAATT
5’ AATTC N
3’ G N
5’ AATTC N
3’ G N
N T 3’
N AAT 5’
N T 3’
N AAT 5’
Eco RI + Mse I
AATTC T
TTAAG A
C TTA
G AAT
AATTCAAC
TTAAGTTG
TTGTTA
AACAAT
AATTC N
G N
N T
N AAT MseI
AATTC N
TTAAG N
N TTA
N AAT
EcoRI
C 5’
A5’
AAC5’
AAC 5’
TTAA 5’
5’ TA
GAATTCN
CTTAAGN
NTTAA
NAATT
5’ AATTC N
3’ G N
5’ AATTC N
3’ G N
N T 3’
N AAT 5’
N T 3’
N AAT 5’
Eco RI + Mse I
AATTC T
TTAAG A
C TTA
G AAT
AATTCAAC
TTAAGTTG
TTGTTA
AACAAT
AATTC N
G N
N T
N AAT MseI
AATTC N
TTAAG N
N TTA
N AAT
EcoRI
C 5’
A5’
AAC5’
AAC 5’
TTAA 5’
5’ TA
A. AFLP ANALYSIS
- digestão, ligação, PCRs
B. ELETROFORESE VERTICAL
- gel desnaturante de poliacrilamida (6%)
- 4h
C. GEL
- método radiativo: transferido para papel de filtro, secagem a vácuo (1h), exposição filme hipersensível 10 a 15 dias
- método coloração prata: solução fixadora, solução reveladora (1h)
AFLP Polimerização Montagem Transferência
Aplicação de Amostras
Detecção do polimorfismo
Coloração com prata
P32 ou P33
Fluorescência
AFLP
• Perfil AFLP contêm de 50 e 100 fragmentos amplificados (80-500 pb) provenientes de muitos sítios do genoma,
• Interpretado como marcador dominante
• Entretanto, usando scaner automáticos de gel, heterozigotos podem ser distinguidos de homozigotos pela intensidade do sinal.
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Substituições
• Transição
– purina purina
– pirimidina pirimidina
• Transversão
– purina pirimidina
– pirimidina purina
• Inserções/deleções
(Indel)
Polimorfismos resultantes da alteração de uma única
base no genoma
A G
T C
A ou G T ou C
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
• Co-dominante
Para que uma variação seja considerada SNP
deve ocorrer em pelo menos 1% da
população
http://www.siriusgenomics.com/technology/
SNPs – Identificação
• Sequenciamento direto
– amplificação por PCR e sequenciamento de
fragmentos genômicos e de regiões gênicas
equivalentes de vários indivíduos
• Análise eletrônica da variação de ponto banco
de dados
– sequências de projetos genomas
– bibliotecas de cDNA de diferentes indivíduos
(EST’s)
Diferentes estratégias para comparar regiões
específicas do DNA de diferentes indivíduos
SNPs – Sequenciamento direto
• Necessidade de desenho de
primers para amplificar
segmentos de DNA de 400-
700 pb
• Adiciona-se à extremidade
5’ extensões que irão
facilitar o pareamento dos
primers posteriormente
usados para o
sequenciamento do
fragmento amplificado
Considerações Finais
“Biotecnologia define-se pelo uso de
conhecimentos sobre os processos
biológicos e sobre as propriedades
dos seres vivos, com o fim de
resolver problemas e criar produtos
de utilidade“
Convenção sobre Diversidade Biológica da ONU
Muito obrigada pela atenção!
Agradecimentos pela concessão de material :
Dra Luciana Becchimol (IAC)
Dra Maria Imaculada Zucchi (APTA Piracicaba)
Dra Mariza Monteiro (CTC)
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