View
216
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
16/09/2015
1
Detecção de M.O. Em Alimentos
1
Detecção de M.O. Em Alimentos
Métodos quantitativos
grupos específicos de m.o.
• aeróbios
• anaeróbios
• psicrotróficos
• termodúricos
• coliformes
• bolores
• leveduras
Métodos qualitativos
presença de uma dada espécie
• patogénicos
2
16/09/2015
2
Detecção de M.O. Em Alimentos
Métodos padrão
publicados por organizações de referência
WHO FAO FDA
Métodos recomendados
3
Detecção de M.O. Em Alimentos
• amostra representativa do total
• método reprodutível
• adequado ao método de detecção
• conhecimento do tipo e natureza do produto
• recolha asséptica
• quantidade suficiente para replicadas
• mantida em condições que não permitam morte ou crescimento de m.o. até análise
• rotulagem completa
Amostragem
4
16/09/2015
3
Detecção de M.O. Em Alimentos
• após recepção, deve ser rapidamente analisada
• parte não usada deve ser armazenada adequadamente• por vezes tempo longo
Amostragem
5
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem directa
• contagem ao microscópio• não diferencia células viáveis das mortas
• nº de m.o. tem que ser grande (>106 mL-1)
• não eficaz para alimentos com partículas
Métodos quantitativos
6
16/09/2015
4
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem directa
• Unidades Formadoras de Colónias (CFU) em agar não selectivo
• alíquotas obtidas por diluições
• diferentes meios podem originar diferentes resultados
• condições de incubação variam com grupos de m.o.
Métodos quantitativos
7
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem directa
• CFU em meio diferencial não selectivo• meio suplementado com agente capaz de diferenciar
grupos de m.o.
• indicadores de pH, redox
Métodos quantitativos
8
16/09/2015
5
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem directa
• CFU em meio de agar selectivo• meio suplementado com agentes selectivos ou
inibidores
• condições de incubação variam com m.o.
Métodos quantitativos
9
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem directa
• CFU em meio de agar selectivo e diferencial• meio suplementado com agentes que permitem
crescimento selectivo de um grupo de m.o., inibindo o crescimento de outros m.o. semelhantes
• agente adicional permite desenvolvimento de colónias com características diferentes, entre as seleccionadas
Métodos quantitativos
10
16/09/2015
6
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem indirecta
• diluição até extinção em caldos não selectivos• diluições em série da amostra
• transferência de uma alíquota para um caldo não selectivo
• incubação
• tempo e temperatura dependem do grupo de m.o.
• crescimento (turbidez) ou não crescimento
• a partir da amostra mais diluída que deucrescimento calcula-se nº de m.o.
• valor pode divergir fortemente do real
• pouco usado para determinação em alimentos
Métodos quantitativos
11
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem indirecta
• nº mais provável em caldos selectivos• diluições em série da amostra
• transferência de uma alíquota para um caldo com agente selectivo
• incubação
• tempo e temperatura dependem do grupo de m.o.
• crescimento ou não crescimento
• a partir dos tubos com crescimento em 3 diluiçõessucessivas, estima-se nº de células viáveis
• tabelas estatísticas
• valor pode divergir fortemente do real
• usado para determinação de coliformes e coliformesfecais em água e alimentos
Métodos quantitativos
12
16/09/2015
7
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos de contagem indirecta
• ensaio de redução de pigmentos• pigmentos que mudam de cor com estado de
oxidação
• mudança causada por metabolismo e crescimento microbiano
• taxa de redução do pigmento durante incubaçãodirectamente proporcional à carga microbiana inicialno alimento
• pouco rigoroso com diversos alimentos
• usado para determinação de qualidademicrobiológica em leite não tratado
Métodos quantitativos
13
Detecção de M.O. Em Alimentos
• contagem de grupos microbianos danificados em meio selectivo
• coliformes e patogénicos com danos subletaispodem morrer em meio de agar selectivo
• não são detectados
• criadas condições de reparação em meio não selectivo
• posteriormente colocados em meio selectivo
Métodos quantitativos
14
16/09/2015
8
Detecção de M.O. Em Alimentos
• isolamento de patogénicos
• diversos passos• incubada em meio não selectivo
• reparação de possíveis células danificadas
• incubada em meio selectivo
• cultivada em meio de agar com agentes selectivos e diferenciais
• ensaio não categórico• requer confirmação por outros métodos
• pode demorar 10 – 12 dias
Métodos qualitativos
15
Detecção de M.O. Em Alimentos
• enterotoxina de S. aureus• extracção da toxina a partir de 100 g do
alimento
• concentração da toxina em água esterilizada ou soro fisiológico
• presença de toxina avaliada por anticorpo específico
• método de precipitação microslide
• métodos alternativos
• ensaio radioimunológico (RIA), ensaioimunoenzimático (ELISA), aglutinação em latex reversa passiva (RPLA)
• ressonância de plasma de superfície (SPR), sensor de fibra óptica
Ensaios para toxinas bacterianas
16
16/09/2015
9
Detecção de M.O. Em Alimentos
• enterotoxina de S. aureus• método de precipitação microslide
Ensaios para toxinas bacterianas
17
Detecção de M.O. Em Alimentos
• neurotoxina de C. botulinum• extracção da toxina a partir do alimento
• parte do extracto tratado com tripsina• activar toxinas de tipos não proteolíticos (B, E)
• outra parte não tratada• tipos proteolíticos (A, B)
• ambos extractos injectados em ratos• verificar efeitos durante 48 h vs. ratos controlo
Ensaios para toxinas bacterianas
18
16/09/2015
10
Detecção de M.O. Em Alimentos
• outras toxinas
• métodos específicos para toxinas de diversas bactérias patogénicas e bolores
• disponíveis na literatura
• disponibilidade comercial
Ensaios para toxinas bacterianas
19
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos tradicionais• lentos e trabalhosos
• métodos rápidos• carga microbiana, patogénicos e toxinas
• automação parcial
• alguns aprovados oficialmente
• úteis durante processamento
• usados para monitorizar processos de limpeza e higienização
• específicos, sensíveis, relativamente rigorosos, menos trabalhosos
• eficácia pouco clara em alimentos poucocontaminados
Métodos rápidos / Automação
20
16/09/2015
11
Detecção de M.O. Em Alimentos
• impressão digital metabólica
• cada espécie possui requisitos únicos de C e N• fornecer conjunto apropriado de açúcares (fonte de
C) ou a. a. (fonte de N)
• metabolizados, com produção de compostosespecíficos
• reagem com indicador padrão metabólico único
Métodos rápidos / Automação
21
Detecção de M.O. Em Alimentos
• impressão digital metabólica
• requisitos• culturas puras
• condições fisiológicas óptimas
• kits comerciais para vários m.o.
• placas de 96 poços
Métodos rápidos / Automação
22
16/09/2015
12
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ensaios imunológicos para patogénicos
• utilização de anticorpos
• detecção de células, toxinas, metabolitos
• simples
• pouco equipamento
• resultados fáceis de interpretar
• podem não diferenciar entre células vivas e mortas
• m.o. danificados podem alterar morfologia e fisiologia
• expressão alterada de antigénios
Métodos rápidos / Automação
23
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ensaios imunológicos para patogénicos
• sucesso depende de disponibilidade de anticorpo específico para antigénio
• anticorpos policlonais e monoclonais
Métodos rápidos / Automação
24
16/09/2015
13
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ensaios imunológicos para patogénicos
• anticorpos policlonais (PAb)• conjunto de anticorpos com diferentes origens
celulares
• produzidos contra diferentes epitopos do mesmo antigénio
• podem apresentar reacção cruzada com antigénios de diferentes m.o.
Métodos rápidos / Automação
25
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ensaios imunológicos para patogénicos
• anticorpos monoclonais (MAb)• homogéneos
• grande especificidade
Métodos rápidos / Automação
26
16/09/2015
14
Detecção de M.O. Em Alimentos
• separação imunomagnética
• pequenas partículas superparamagnéticasrevestidas com anticorpos
• partículas só exibem propriedades magnéticas napresença de campo magnético externo
Métodos rápidos / Automação
27
Detecção de M.O. Em Alimentos
• separação imunomagnética
• 1º passo• suspensão com m.o. de interesse misturada com
partículas magnéticas
• tubo com complexo magnético colocado emseparador magnético e líquido retirado
• 2º passo• complexo lavado várias vezes com tampão
• remoção de contaminantes
• células recolhidas para ensaios posteriores
• PCR, imunológicos, biossensores
Métodos rápidos / Automação
28
16/09/2015
15
Detecção de M.O. Em Alimentos
• separação imunomagnética
• método directo• m.o. alvo misturado com partículas magnéticas
revestidas com anticorpo específico para esse m.o.
• partículas em contacto com m.o. ligam-se atravésdo anticorpo primário
Métodos rápidos / Automação
29
Detecção de M.O. Em Alimentos
• separação imunomagnética
• método indirecto• anticorpo primário adicionado à suspensão
• liga-se ao m.o. alvo
• adicionam-se partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário (específico para anticorpoprimário)
• complexos separados com concentrador magnético
Métodos rápidos / Automação
30
16/09/2015
16
Detecção de M.O. Em Alimentos
• separação imunomagnética
• eficaz na captura de• E. coli O157:H7
• Salmonella• Listeria
• captura não específica de bactérias não alvo
• taxa de captura variável (10 % - 70 %)
Métodos rápidos / Automação
31
Detecção de M.O. Em Alimentos
• aglutinação em latex reversiva passiva (RPLA)
• detecção de toxinas de patogénicos• S. aureus• C. perfringens• B. cereus• V. cholera• E. coli
Métodos rápidos / Automação
32
16/09/2015
17
Detecção de M.O. Em Alimentos
• aglutinação em latex reversiva passiva (RPLA)
• anticorpo específico para toxina imobilizado em partículas de latex
• misturado com amostra em placas de poços• padrão difuso indica presença da toxina
• anel ou botão indica ausência
Métodos rápidos / Automação
33
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• muito usado para detecção de patogénicos e suas toxinas
• Salmonella• L. monocytogenes• E. coli O157:H7
• C. jejuni
Métodos rápidos / Automação
34
16/09/2015
18
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• medida quantitativa da ligação do antigénio ao anticorpo primário, utilizando um anticorpo secundário conjugado com uma enzima
• reacção positiva quantificada por medição daintensidade num espectrofotómetro
• quantidade de enzima presente proporcional à quantidade de antigénio
Métodos rápidos / Automação
35
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• método indirecto• antigénio imobilizado na placa
• feito reagir com anticorpo primário
• após lavagem, adiciona-se anticorpo secundário com enzima
• liga-se ao anticorpo primário
• adiciona-se solução com substrato paradesenvolvimento de coloração
Métodos rápidos / Automação
36
16/09/2015
19
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• método sandwich• anticorpo imobilizado na placa
• captura o antigénio
• adiciona-se anticorpo secundário, específico para o antigénio, com enzima
• forma “sandwich”
• antigénio necessita pelo menos dois locais de ligação para os dois anticorpos
Métodos rápidos / Automação
37
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• método competitivo• células bacterianas ou antigénios imobilizados na
placa
• separadamente preparam-se misturas do anticorpo primário com várias diluições da bactéria ou antigénio (amostra)
• adiciona-se mistura à placa com antigénio
Métodos rápidos / Automação
38
16/09/2015
20
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• método competitivo• lavagem da placa
• remoção de anticorpos não ligados
• quanto mais antigénio na amostra, menosanticorpo disponível para se ligar ao antigénio daplaca – competição
• adiciona-se um conjunto anticorpo secundário-enzima-substrato
• quanto maior a concentração de antigénio naamostra, mais fraca a cor
Métodos rápidos / Automação
39
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
• limite de detecção relativamente alto• 106 – 107 células/mL
• muito elevado para produtos alimentares
• necessário passo prévio de enriquecimento
Métodos rápidos / Automação
40
16/09/2015
21
Detecção de M.O. Em Alimentos
• imunofluorescência
• semelhante a ELISA
• anticorpo de detecção ligado a composto queemite fluorescência ao formar complexo com antigénio
• detecção por microscópio de flurescência, câmaradigital ou espectrofluorímetro
Métodos rápidos / Automação
41
Detecção de M.O. Em Alimentos
• imunofluorescência
• método directo• ligação do antigénio ao conjunto anticorpo
específico-marcador fluorescente
• método indirecto• anticorpo secundário ligado a marcador complexa o
anticorpo primário
Métodos rápidos / Automação
42
16/09/2015
22
Detecção de M.O. Em Alimentos
• imunocromatografia por fluxo lateral
• variante do ELISA sandwich realizado numa membrana
• rápido, fácil, barato
• despiste inicial• anticorpo de captura imobilizado na membrana
• anticorpo de detecção ligado a corante colocadonoutra zona da membrana
• coloca-se amostra com antigénio numa extremidadeda membrana
• liga-se ao anticorpo de detecção
Métodos rápidos / Automação
43
Detecção de M.O. Em Alimentos
• imunocromatografia por fluxo lateral• complexo desloca-se por capilaridade até zona de
detecção
• 2 zonas de captura
• específica para antigénio
• específica para anticorpos não ligados (controlo)
• 1 linha colorida (controlo) resultado negativo
• 2 linhas coloridas resultado positivo
Métodos rápidos / Automação
44
16/09/2015
23
Detecção de M.O. Em Alimentos
• citometria de fluxo• caracterização rápida baseada em diversos
parâmetros
• morfologia
• conteúdo em ácidos nucleicos
• antigenicidade superficial
Métodos rápidos / Automação
45
Detecção de M.O. Em Alimentos
• citometria de fluxo
• células ligadas a composto fluorescente• composto fluorescente pode estar ligado a anticorpo
• passam individualmente através de um túnel• detecção por raio laser
• analisada e representada interacção com cadacélula
• falta de discriminação entre células vivas e mortas
Métodos rápidos / Automação
46
16/09/2015
24
Detecção de M.O. Em Alimentos
• bioluminescência
• medida de ATP na amostra• medida indirecta da carga microbiana
• só células viáveis retêm ATP
• usa sistema luciferina/luciferase, na presençade Mg2+
• quantifica ATP de células lisadas
• bastante sensível em alimentos e equipamento
• rápido, pode ser automatizado
Métodos rápidos / Automação
47
Detecção de M.O. Em Alimentos
• bioluminescência
• detecção de genes responsáveis porbioluminescência bacteriana
• gene lux de bactérias luminescentes clonado emm.o. a detectar
• luciferase bacteriana leva células viáveis a emitir luz
• método permite controlar eficácia de processos de destruição ou remoção de m.o. em alimentos
• existe equipamento automatizado
Métodos rápidos / Automação
48
16/09/2015
25
Detecção de M.O. Em Alimentos
• hibridização
• pequenas sondas de DNA específicas de um grupo de patogénicos
• prepara-se sonda com 20 – 40000 nucleótidos
• sequência de DNA ou rRNA das células
• sequência de a. a. de uma toxina
• sondas marcadas após hibridização
• 32P – detecção por autoradiografia
• sistema enzimático – detecção colorimétrica
• existem sondas comerciais e aprovadas paraSalmonella e L. monocytogenes
Métodos rápidos / Automação
49
Detecção de M.O. Em Alimentos
• PCR (reacção em cadeia da polimerase)
• técnica baseada em DNA mais usada
• amplificação de sequência genética específicapara um patogénico
• cópias separadas em gel para identificação
Métodos rápidos / Automação
50
16/09/2015
26
Detecção de M.O. Em Alimentos
• PCR (reacção em cadeia da polimerase)
• Multiplex PCR• genes múltiplos num único ensaio
• L. monocytogenes, S. enterica, E. coli, Campylobacter, Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, V. vulnificus
Métodos rápidos / Automação
51
Detecção de M.O. Em Alimentos
• PCR (reacção em cadeia da polimerase)
• PCR quantitativo em tempo real (qPCR)
• permite alguma automação• sonda com marcador fluorescente e com extintor
hibridiza com DNA alvo
• marcador fluorescente libertado no fim daamplificação
• sinal fluorescente medido
• quantificação
Métodos rápidos / Automação
52
16/09/2015
27
Detecção de M.O. Em Alimentos
• PCR (reacção em cadeia da polimerase)
• métodos não diferenciam células vivas das mortas
• utilização da transcriptase reversa (RT-PCR)
• mRNA que só é transcrito em células viáveis usadopara amplificação
• mRNA sintetiza cDNA, usando RT
• cDNA amplificado
• permite também detectar alguns vírus
• norovirus, rotavirus, vírus entéricos
Métodos rápidos / Automação
53
Detecção de M.O. Em Alimentos
• impressão genética
• detecção e identificação de patogénicos
• isolamento do DNA
• digestão com enzimas de restrição
• amplificação ou hibridização de fragmentos
• existem sistemas automatizados• padrão de DNA comparado com base de dados
• identificação do m.o. de origem
Métodos rápidos / Automação
54
16/09/2015
28
Detecção de M.O. Em Alimentos
• impressão genética
• electroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
• DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD)
• polimorfismo de comprimento de fragmentoamplificado (AFLP)
• polimorfismo de comprimento de fragmentosde restrição (RFLP)
• sequências repetitivas de DNA (rep-PCR)
Métodos rápidos / Automação
55
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ensaios de patogenicidade
• utilizam-se modelos animais ou células de mamíferos
• determinação de doses letal e infecciosa
• efeitos citopatogénicos por microscopia• danos na membrana, organelos, ...
• citotoxicidade quantificada por ensaioscolorimétricos
• células mortas coradas
Métodos rápidos / Automação
56
16/09/2015
29
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ensaios de patogenicidade
• mecanismo de patogénese celular• adesão
• invasão
• formação de placa
• apoptose
Métodos rápidos / Automação
57
Detecção de M.O. Em Alimentos
• aparelhos capazes de detectar complexosquímicos ou biológicos
• antigénio-anticorpo
• enzima-substrato
• receptor-ligando
• apoptose
• sinal eléctrico, óptico ou mássico
• equipamento automático ou semi-automático
• rápidos (24-72 h)
Detecção de patogénicos por biossensores
58
16/09/2015
30
Detecção de M.O. Em Alimentos
• detecção baseada em• utilização de substrato
• expressão fenotípica da virulência
• marcadores fisiológicos ou estruturais
• análise genética
• interacção de patogénicos com células eucariotas
• utilização de um dos princípios ou combinações
• baseados em anticorpos mais versáteis
Detecção de patogénicos por biossensores
59
Detecção de M.O. Em Alimentos
• métodos• electroquímicos
• impedância e amperométricos
• ópticos
• fibra óptica e ressonância de plasma de superfície
• mais populares – sensibilidade, disponibilidade, fácil interpretação
• termométricos
• termístor e piroeléctricos
• mássicos
• piezoeléctricos e acústica superficial
Detecção de patogénicos por biossensores
60
16/09/2015
31
Detecção de M.O. Em Alimentos
• fibra óptica
• baseado no ensaio imunológico sandwich
• intensidade luminosa proporcional à quantidadede antigénio presente
• aparelho semi-automático capaz de detectar 4 patogénicos em simultâneo
Detecção de patogénicos por biossensores
61
Detecção de M.O. Em Alimentos
• fibra óptica
• detecção eficaz• esporos de Bacillus anthracis, Franciscella tularensis,
esporos de Bacillus globigii, toxina de C. botulinum, Yersinia pestis, Brucella melitensis, vírus vaccinia
• detecção de patogénicos em diversos alimentos• L. monocytogenes, C. jejuni, Salmonella, E. coli
O157:H7
• detecção de micotoxinas• ocratoxina A, fumonisina B, aflatoxina B1,
deoxinivalenol
Detecção de patogénicos por biossensores
62
16/09/2015
32
Detecção de M.O. Em Alimentos
• fibra óptica
• limites de detecção• bactérias
• 103 – 104 CFU mL-1
• toxinas
• 0.5 – 20 ng mL-1
Detecção de patogénicos por biossensores
63
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ressonância de plasma de superfície (SPR)
• quantifica cinética de ligação de 2 moléculas• não requer marcador fluorescente
• ressonância medida é deslocada para maioresc.d.o. pela presença de um complexo antigénio-anticorpo
• desvio proporcional à quantidade de moléculasligadas
Detecção de patogénicos por biossensores
64
16/09/2015
33
Detecção de M.O. Em Alimentos
• ressonância de plasma de superfície (SPR)
• vantagens• muito rápido (< 30 min)
• sensor pode ser reutilizado para mesmo analito
• muito sensível (ng)
• sistemas comerciais disponíveis
Detecção de patogénicos por biossensores
65
Detecção de M.O. Em Alimentos
• imunosensores electroquímicos
• extensão do ELISA• enzima conjugada a anticorpo produz catálise de um
substrato
• alteração de pH, iões, consumo de O2
• sinal eléctrico medido num transductor
• potenciométricos, capacitivos, amperométricos
• muito sensíveis
• rápidos (30 – 90 min)
• usados na detecção de Salmonella, E. coliO157:H7
Detecção de patogénicos por biossensores
66
16/09/2015
34
Detecção de M.O. Em Alimentos
• biosensores piezoeléctricos
• detectam variações de massa na superfície de um cristal de quartzo
• anticorpos usados para capturar um patogénicoaumentam a massa
• variação num campo eleéctrico oscilante aplicado
• detecção de enterotoxinas de Staphylococcus
• detecção de células de Salmonella typhimurium, S. paratyphi, L. monocytogenes, B. cereus, E. coli O157:H7
Detecção de patogénicos por biossensores
67
Detecção de M.O. Em Alimentos
• sensores de bioimpedância
• alteração na condutância e impedância do meiodevida a metabolismo microbiano
• substratos inertes convertidos em compostos iónicose subprodutos ácidos (láctico, acético, a. a.)
• medição de condutância e impedância permiteseguir crescimento microbiano em função do tempo (T constante)
Detecção de patogénicos por biossensores
68
16/09/2015
35
Detecção de M.O. Em Alimentos
• sensores de bioimpedância
• possível calcular carga inicial e tempo de geração
Detecção de patogénicos por biossensores
69
Detecção de M.O. Em Alimentos
• sensores de bioimpedância
• detectam apenas células viáveis
• existem sistemas comercializados• controlo de qualidade
• monitorização de patogénicos
• contaminação do leite
• detecção e contagem de Listeria, Campylobacter, E. coli, Staphylococcus, Salmonella
• aceite pela AOAC
• falta de sensibilidade
• tempo de resposta relativamente longo (24 –48 h)
Detecção de patogénicos por biossensores
70
16/09/2015
36
Detecção de M.O. Em Alimentos
• sensores de bioimpedância
• desenvolvimento de “biochips” para aumentarsensibilidade
• células confinadas a pequeno volume• rápida conversão de substratos pelas bactérias
• detecção mais rápida e sensível
• L. monocytogenes
Detecção de patogénicos por biossensores
71
Detecção de M.O. Em Alimentos
• FTIR (IV com transformada de Fourier)
• radiação IV sensível a composição molecular daparede celular e citoplasma
• espectro ou “impressão digital”
• comparado com biblioteca de espectros
• classificação ou identificação de diversas espéciese estirpes de patogénicos
• Yersinia, Staphylococcus, Salmonella, Listeria, Klebsiella, Escherichia, Enterobacter, Citrobacter
Detecção de patogénicos por biossensores
72
16/09/2015
37
Detecção de M.O. Em Alimentos
• FTIR (IV com transformada de Fourier)
• rápido
• não destrutivo
• requer transferência das células para superfíciereflectora
Detecção de patogénicos por biossensores
73
Detecção de M.O. Em Alimentos
• dispersão de luz
• fonte de luz monocromática polarizada incidenas células
• luz dispersa produz perfis distintivos
• identificação e detecção de bactérias
• amostras diferenciadas com base em• índice de refracção
• tamanho
• forma
• composição
Detecção de patogénicos por biossensores
74
16/09/2015
38
Detecção de M.O. Em Alimentos
• dispersão de luz
• reprodutibilidade afectada por• fase de crescimento
• meio de crescimento
• temperatura de crescimento
• arejamento
• diluição do meio
• sucesso limitado na detecção de célulasindividuais
• simples
• não invasivo
• rápido (< 1 min)
Detecção de patogénicos por biossensores
75
Detecção de M.O. Em Alimentos
• sensores baseados em células
• célula serve de transdutor ao emitir sinalespecífico durante interacção com analito de interesse
• sinal produzido em s - min
• medem perturbações à actividade fisiológicanormal da célula quando exposta a um patogénico ou molécula
• L. monocytogenes, E. coli, O2, pesticidas
• não invasivo
• rápido (< 1 min)
Detecção de patogénicos por biossensores
76
16/09/2015
39
Detecção de M.O. Em Alimentos
• sensores baseados em células
• sensor baseado numa célula B geneticamentemanipulada
• muito baixas quantidades de bactérias patogénicas
• E. coli O157:H7, esporos de B. anthracis, Y. pestis• alguns min
• célula artificial (“liposoma”)• detecção de toxinas formadoras de poros
• ng em 30 min
• biochip baseado em células de mamífero• detecção de alergénios e vírus
Detecção de patogénicos por biossensores
77
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
grande quantidade de novos alimentos
• necessidade de avaliar crescimentomicrobiano
• diversos parâmetros de processamento, embalagem e armazenamento
• métodos tradicionais de análise• complexos, lentos e caros
• métodos preditivos – modelos matemáticos• falta de rigor
• eficazes para obter informação rápida
• seleccionar informação mais relevante, usadapara estudos tradicionais
78
16/09/2015
40
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
métodos tradicionais
• ensaios de desafio
• alimento inoculado com m.o. emcondições de comercialização
• armazenado em condições típicas
• analisado durante armazenamento• crescimento microbiano ou produção de
toxinas
• diversas variáveis• ingredientes
• factores intrínsecos e extrínsecos
• possível manipulação indevida
• …
79
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
métodos tradicionais
• ensaios de armazenamento
• alimento armazenado em condiçõesnormais
• amostras analisadas a intervalosregulares
• deterioração e m.o. patogénicos
• resultados permitem prever tempo de prateleira e seguranças nas condições de armazenamento usadas
• não se consegue informação útil se houver exposição a temperaturaindevida, mesmo por períodos curtos
80
16/09/2015
41
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
métodos tradicionais
• ensaios acelerados
• eficazes em alimentos com grande tempo de prateleira
• aumento de temperatura aumenta a taxa de crescimento microbiano e a deterioração
• necessário calcular temperatura de modo a não destruir os m.o. de interesse
• alimento tem flora microbiana variada
81
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
microbiologia preditiva
• modelos matemáticos
• previsão crescimento de m.o.• usam dados obtidos a partir de ensaios de
crescimento, em laboratório, com condições variáveis
• pH, aw, T, conservantes
82
16/09/2015
42
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
microbiologia preditiva
• modelo da raiz quadrada
• relação linear entre raiz quadrada da taxade crescimento e temperatura
• r – taxa de crescimento
• b – declive da regressão linear
• T – temperatura do alimento
• Tmin – temperatura mínima teórica de crescimento
minr=b( )T T
83
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
microbiologia preditiva
• modelo da raiz quadrada
• expansão do modelo para incorporar aw e pH
• eficácia decresce com quantidade de parâmetros usados
w wmin min minr=b a -a pH-pH ( )T T
84
16/09/2015
43
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
microbiologia preditiva
• modelo sigmoidal (USDA)
• testado em laboratório para vários m.o. e variáveis
• L. monocytogenes, S. aureus, Salmonellaspp., Shigella flexneri, E. coli O157:H7, Aeromonas hydrophila
• T, pH, aw, [NaCl], [NaNO2], aerobiose ou anaerobiose
85
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
microbiologia preditiva
• modelo sigmoidal (USDA)
• curvas de crescimento estatisticamenteajustadas
• regressão não linear + funções de Gompertz
• permitem obter tempo lag, constante máxima de crescimento, carga microbiana máxima
86
16/09/2015
44
Detecção de M.O. Em Alimentos
Pre
vis
ão d
o c
resc
imento
m
icro
bia
no e
m a
limento
s
microbiologia preditiva
• modelo sigmoidal (USDA)
• N – log(CFU/mL)
• t – tempo
• A – log(CFU/mL) inicial
• C – diferença de log(CFU/mL) entre tempo t e tempo 0
• M – tempo ao qual o crescimento é máximo
• B – taxa de crescimento relativo ao tempo M
A exp( exp[ ( )])N C B t M
87
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite e produtos lácteos
• Directiva Europeia 92/46/CEE e documentos associados
• para além dos métodos especificados, podem ser usados outros reconhecidos internacionalmente
88
16/09/2015
45
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• coliformes
• contagem em placa antes da incubação
• fosfatase
• peroxidase
• ausência de patogénicos
89
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• amostragem
• a partir do equipamento de embalagem ou câmara de refrigeração
• o mais rápido possível após processamento
• transportadas a 0 ºC – 4 ºC
• 3 amostras (ensaios em quintuplicado)
• medição de T ao chegar ao laboratório
• coliformes, fosfatase e peroxidase
• manter a 6 ºC para contagem em placa
• ensaios < 24 h após amostragem
90
16/09/2015
46
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• contagem de colónias
• amostra incubada a 6 ºC, 5 dias
• preparar diluições e incubar em meio agar
• 21 ºC, 25 h
• contar colónias nas placas com 10-300 colónias
• calcular nº de organismos (N) por mL
n° total de colónias contadas
volume total × diluiçãoN
91
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• contagem de colónias
• se existirem placas com 10-300 colónias em mais que umadiluição:
1 2( 0.1 )
CN
V n n d
C – soma das colónias em todas as placasV – vol. aplicado a cada placan1 – nº de placas para a 1ª diluiçãon2 – nº de placas para a 2ª diluiçãod – diluição usada para a 1ª contagem
92
16/09/2015
47
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• contagem de colónias (ex:)• 1 mL de volume aplicado
• diluição 10-2 – 173 e 145 colónias
• diluição 10-3 – 15 e 8 colónias
• contagens abaixo de 5x104 CFU mL-1 são satisfatórias
• contagens acima de 5x105 CFU mL-1, não
4
-2
173+145+15+8 341= = =15500=1.6×10
0.0222+ 0.1 2 10N
93
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio de coliformes
• inocular leite não diluído em meio agar lactose bile vermelho violeta (VRBA)
• preparar placas controlo só com meio
• incubar a 30 ºC, 24 h
• contar colónias vermelhas, com diâmetro de pelo menos0.5 mm
• características de coliformes
• contar também colónias vermelhas atípicas
• colónias atípicas confirmadas por inoculação em caldo bile verde brilhante
• 30 ºC, 24 h
• colónias que formam gás são coliformes
94
16/09/2015
48
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio de coliformes
• cálculos
• contar colónias dos 2 ensaios
• resultados satisfatórios se não forem encontradascolónias
• resultados não satisfatórios se > 5 CFU mL-1
• se pasteurização foi correcta, presença de coliformes indicacontaminação pós-pasteurização
95
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• fosfatase alcalina existe em leite de mamíferos
• destruída em condições de pasteurização
• amostras mantidas a 0 – 4 ºC, não mais que 2 dias antes da análise
• espectrofotometria
• fluorimetria
• colorimetria
96
16/09/2015
49
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• método espectrofotométrico
• usa fenilfosfato dissódico como substrato
• convertido em fenol pela enzima
• fenol reage com corante para formar indofenol
• intensidade da cor azul produzida medida porespectrofotómetro
• método lento e com níveis de detecção relativamentealtos
97
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• método espectrofotométrico
• lípidos e proteínas interferentes precipitados com sais de zinco e bário
• necessário preparar curva de calibração para cada ensaio
• resultados < 4 mg fenol mL-1 são satisfatórios
• valores > 1 mg requerem investigação na produção
98
16/09/2015
50
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• método fluorimétrico
• método automatizado
• muito sensível
• medida cinética contínua
• fosfatase presente na amostra hidrolisa substrato nãofluorescente a composto muito fluorescente
• intensidade de fluorescência medida a 38 ºC
• resultado expresso em miliunidades /L
• 1 unidade – quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 mmol min-1 L-1 de amostra
99
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• método fluorimétrico
• requer curva de calibração
• valores < 500 mU L-1 considerados satifatórios
100
16/09/2015
51
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• fosfatase microbiana
• mais termorresistente que a de mamíferos
• pode resistir a pasteurização mal efectuada
• originária de falta de higene ou de presença de psicrotróficos no leite não tratado
• aquecer amostra a 63 ºC, 30 min e realizar ensaio de fluorimetria
101
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• reactivação
• pode ocorrer se leite pasteurizado a temperaturaexcessivamente alta
• pode ocorrer se leite armazenado a temperatura demasiadoelevada, após pasteurização
• verificar se iões Mg2+ capazes de reactivar enzima
102
16/09/2015
52
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• teor de fosfatase pode ser devido a fosfatase microbiana e reactivação
• reactivação pode mascarar presença de fosfatase de mamífero
103
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• ensaio colorimétrico de Aschaffenburg & Mullen
• não reconhecido internacionalmente
• eficaz para rastreio
• não capaz de detectar níveis baixos de enzima
104
16/09/2015
53
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da fosfatase
• ensaio colorimétrico de Aschaffenburg & Mullen
• amostra aquecida à temperatura ambiente antes do ensaio
• p-nitrofenol fosfato dissódico hidrolisado pela enzima
• produz p-nitrofenol
• cor amarela
• intensidade medida em espectrofotómetro (405 nm)
105
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da peroxidase
• inactivada a 75 – 80 ºC
• se leite sobreaquecido durante pasteurização (> 75 ºC) ocorre inactivação
• ensaio da peroxidase negativo
• só avalia qualidade
• se leite devidamente pasteurizado, ensaio é positivo
106
16/09/2015
54
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite pasteurizado
• ensaio da peroxidase
• enzima decompõe H2O2
• O libertado oxida 1,4-fenilenodiamina a indofenol
• passa de incolor a púrpura
• intensidade da cor proporcional a concentração daenzima
• resultado positivo se formar cor em 30 s
• negativo se não aparecer cor
• não específico se aparecer cor após 30 s
107
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite não tratado
• coliformes
• contagem de colónias a 30 ºC
• Leite não tratado para lacticínios
• contagem de colónias a 30 ºC
• S. aureus
108
16/09/2015
55
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite não tratado
• amostragem
• amostras transportadas a 0 – 4 ºC
• tempo até análise não deve exceder 36 h
109
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite não tratado
• contagem de colónias
• preparar diluições do leite
• inocular em agar de contagem de placas com leite
• 30 ºC, 72 h
• valores < 2.0104 CFU mL-1 são satisfatórios
110
16/09/2015
56
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite não tratado
• ensaio de coliformes
• proceder como no leite pasteurizado
• valores < 100 CFU mL-1 são satisfatórios
111
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite UHT e esterilizado
• contagem de colónias
• após pré-incubação a 30 ºC
• se houver probabilidade esporos termorresistentes, incubara 55 ºC
• ensaio visa detectar m.o viáveis
• não deverão existir durante tempo de prateleira
112
16/09/2015
57
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Leite UHT e esterilizado
• contagem de colónias
• embalagem incubada a 30 ºC, 15 dias (55 ºC, 7 dias)
• abrir e retirar alíquotas assepticamente
• incubar em agar de contagem de placas com leite
• 30 ºC, 72 h
• contar colónias visíveis
• calcular CFU mL-1
• valor 100 CFU mL-1 satisfatórios
113
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• ensaios para E. coli
• presença de L. monocytogenes e Salmonella
• S. aureus para queijos
114
16/09/2015
58
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• ensaios para E. coli• amostras diluídas e incubadas em meios apropriados para
verificar produção de gás, fluorescência e coloração
• calcula-se nº mais provável por mL (g) de E. coli
115
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• lacticínios líquidos
• natas, iogurtes, bebidas lácteas
• ausência de L. monocytogenes em 1 g
• ausência de Salmonella em 25 g
• teores de coliformes
• patamar para nº de bactérias é 0
116
16/09/2015
59
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• lacticínios líquidos
• nata pasteurizada
• além dos ensaios genéricos
• fosfatase
• aquecer a 66 ºC, 30 min, em vez de 63 ºC
• método espectrofotométrico
• método fluorimétrico
• método colorimétrico (só rastreio)
• peroxidase
117
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• lacticínios líquidos
• nata UHT e esterilizada
• além dos ensaios genéricos
• contagem de colónias
• após pré-incubação em recipiente aberto
118
16/09/2015
60
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• lacticínios líquidos
• nata não tratada
• além dos ensaios genéricos
• semelhante à análise de leite não tratado
119
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• lacticínios líquidos
• bebidas lácteas pasteurizadas
• além dos ensaios genéricos
• fosfatase, método fluorimétrico
120
16/09/2015
61
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• lacticínios líquidos
• iogurtes
• ensaios genéricos
• tamponizar a pH 7.5 na preparação das amostras
121
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• gelados e sobremesas refrigeradas
• ausência de Salmonella em 25 g
• ausência de L. monocytogenes em 1 g
• contagem de colónias e coliformes facultativos
• amostras fundidas a 37 ºC, em banho de água
122
16/09/2015
62
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• gelados e sobremesas refrigeradas
• contagem de colónias
• agar com leite, incubação a 30 ºC, 72 h
• < 105 CFU g-1 é satisfatório
• > 5105 CFU g-1 não satisfatório
• ensaio de coliformes
• < 10 coliformes/g é satisfatório
• > 100 coliformes/g não satisfatório
123
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• produtos desidratados
• Salmonella
• ensaio de coliformes
124
16/09/2015
63
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• queijos
• varia com tipo de queijo
• pasta dura, macia ou fresco
• varia com tipo de leite
• tratado ou não
• ausência de Salmonella em 25 g
• ausência de L. monocytogenes em 1 g de queijo de pasta dura
• 25 g nos outros
• S. aureus excepto para queijo de pasta dura feito com leite pasteurizado
• E. coli em queijos de pasta macia
• coliformes em queijo de pasta macia feito com leitetratado
125
Detecção de M.O. Em Alimentos
Exemplos de aplicação
• Produtos lácteos
• queijos
• queijos de pasta macia e fresco
• < 100 E. coli/g satisfatório para queijo feito com leitepasteurizado
• < 10000 E. coli/g satisfatório se for usado leite nãopasteurizado
• amostras preparadas a pH 7.5
126
Recommended