Métodos para detecção de Métodos para detecção de alérgenos em alimentos alérgenos em alimentos

Gerlinde TeixeiraGerlinde Teixeira

Departamento de Departamento de ImunobiologiaImunobiologia

Universidade Federal Universidade Federal FluminenseFluminense

Antigenos vs AlérgenosAntigenos vs Alérgenos

Antigeno Antigeno – ImunógenoImunógeno

Qualquer substância capaz de estimular Qualquer substância capaz de estimular linfócitoslinfócitos

– Proteinas, lipoproteinas, glicoproteinas, Proteinas, lipoproteinas, glicoproteinas,

– Hapteno Hapteno Qualquer substância capaz de estimular Qualquer substância capaz de estimular

linfócitos desde que acoplado a uma linfócitos desde que acoplado a uma proteina proteina

– Moléculas pequenas como os corantes Moléculas pequenas como os corantes

Antigenos vs AlérgenosAntigenos vs Alérgenos

AlergenoAlergeno– Qualquer substancia que leva a Qualquer substancia que leva a

reações adversas sejam mediadas porreações adversas sejam mediadas por Linfócitos B – produção de IgE ou IgGLinfócitos B – produção de IgE ou IgG Linfócitos T – produção de citocinas de Linfócitos T – produção de citocinas de

padrão padrão – Th1 - InfTh1 - Inf, Il-1, Il-2, TNF, Il-1, Il-2, TNF– Th2 - Il-4, Il-5, Il-6, Il-10, Th2 - Il-4, Il-5, Il-6, Il-10,

Resposta a antígenos Resposta a antígenos alimentaresalimentares

Tolerância oral

Imunização sistêmica

Anticorpos sistêmicos

Células B e T sistêmicas

Resposta local – Th3

Anticorpos sistêmicos

Células B e T sistêmicas

Resposta local – Th1 / Th2

Proteínaalimentar

Via oral

Contexto fisiológico

Contexto inflamatório

Classificação dos Classificação dos Alérgenos alimentaresAlérgenos alimentares CrustáceosCrustáceos

– LagostaLagosta– CamarãoCamarão– SiriSiri

MoluscosMoluscos– MexilhõesMexilhões– lulaslulas

PeixesPeixes Clara de ovoClara de ovo LeiteLeite

SementesSementes– GergelimGergelim– GirassolGirassol– Sementes de algodão Sementes de algodão – MostardaMostarda

Nozes Nozes AmendoimAmendoim Morango Morango LegumesLegumes Trigo Trigo

Reações adversas a Reações adversas a alimentos alimentos

Os sinais e sintomas consequentes Os sinais e sintomas consequentes a uma variedade de reações a uma variedade de reações fisiopatologicas que podem ser fisiopatologicas que podem ser mediadas por mecanismosmediadas por mecanismos– Imunológicos Imunológicos – Não imunológicos Não imunológicos

Mecanismos envolvidos Mecanismos envolvidos nas alergias alimentaresnas alergias alimentares Mediados por IgEMediados por IgE

– Reações anafiláticas leves ao choqueReações anafiláticas leves ao choque Mediadas por IgG e seus subtiposMediadas por IgG e seus subtipos

– Reações anafiláticas leves ao choque Reações anafiláticas leves ao choque – DiarreiaDiarreia– Inflamação intestinal crônicaInflamação intestinal crônica– Dermatite herpetiformeDermatite herpetiforme

IgAIgA– Insuficiência renalInsuficiência renal

Estrutura da Estrutura da ImunoglobulinaImunoglobulina

As cinco classes de IgAs cinco classes de Ig

O que determna O que determna – a classe são as regiões FCa classe são as regiões FC– a especificidade a região Faba especificidade a região Fab

É possivel ter uma especificidade com as 5 É possivel ter uma especificidade com as 5 classesclasses

As formas poliméricasAs formas poliméricas

IgAIgA

IgMIgM

Propriedades das Ig’s Propriedades das Ig’s humanashumanas

IgGIgG IgAIgA IgMIgM IgDIgD IgEIgE

Classe de cadeia HClasse de cadeia H

Subclasse de cadeia HSubclasse de cadeia H 1 a 1 a 44

1, 1, 22

Tipo de cadeia LTipo de cadeia L e e e e e e e e

e e

Fixação do Fixação do complementocomplemento

++ 00 ++++++++ 00 00

Meia vida sérica (dias)Meia vida sérica (dias) 2323 66 55 33 22

Transferência Transferência PlacentáriaPlacentária

++ 00 00 00 00

Lise bacterianaLise bacteriana ++ ++ ++++++ ?? ??

Atividade anti-viralAtividade anti-viral ++ ++++++ ++ ?? ??

Propriedades das IgG’s Propriedades das IgG’s humanashumanas

IgG1IgG1 IgG2IgG2 IgG3IgG3 IgG4IgG4

Abundancia (% de IgG Abundancia (% de IgG total)total)

7070 2020 0606 0404

Meia vida no soroMeia vida no soro 2323 2323 77 2323

Passagem placentáriaPassagem placentária ++++++

++ ++++++

++++++

Fixação de complementoFixação de complemento ++ ++ ++++++

--

Ligação a Receptores FCLigação a Receptores FC ++++++

-- ++++++

++

Idiotipo Idiotipo

Hipersensibilidade Tipo IHipersensibilidade Tipo I

Hipersensibilidade imediata Hipersensibilidade imediata mediada por IgE e IgG1mediada por IgE e IgG1

Mecanismo de açãoMecanismo de ação

Estimulo antigênico com proteínas Estimulo antigênico com proteínas heterólogasheterólogas

Ativação de Linfócitos Th2Ativação de Linfócitos Th2– produção de Il4, Il5, Il6produção de Il4, Il5, Il6

Mudança de isotipo para IgEMudança de isotipo para IgE– Ocupação dos rFc de alta afinidade dos Ocupação dos rFc de alta afinidade dos

mastócitosmastócitos

Ativação de MastócitosAtivação de Mastócitos

Novo estimulo Novo estimulo antigênico antigênico

Ligação do Ligação do antígeno à IgE antígeno à IgE

Degranulação dos Degranulação dos mastócitosmastócitos

Inflamação Inflamação

Patologia Humana, Robbins

Hipersensibilidade Tipo Hipersensibilidade Tipo IIIIII

Hipersensibilidade mediata Hipersensibilidade mediata

mediada por imunocomplexos de mediada por imunocomplexos de IgGIgG

Mecanismos de açãoMecanismos de ação

As lesões teciduais As lesões teciduais – IgG ativa inúmeros mediadores séricos, em IgG ativa inúmeros mediadores séricos, em

especial o sistema complementoespecial o sistema complemento Os complexos se formam Os complexos se formam

predominantemente na circulação predominantemente na circulação Lesão Lesão

– deposito nas paredes dos vasos sanguíneos deposito nas paredes dos vasos sanguíneos da microcirculação principalmente em da microcirculação principalmente em estruturas de filtragem, como o glomérulo estruturas de filtragem, como o glomérulo renal, articulação, etcrenal, articulação, etc

Formação do Formação do imunocomplexoimunocomplexo Só se formam na Só se formam na

presença de antígenos presença de antígenos com múltiplos com múltiplos epitopos (>2)epitopos (>2)

Quando moléculas de Quando moléculas de antígenos solúveis e antígenos solúveis e anticorpos estão anticorpos estão presentes numa presentes numa relação molar relação molar apropriada, podem apropriada, podem unir-se umas às outrasunir-se umas às outras formando uma rede formando uma rede multimolecular.multimolecular.

Hipersensibilidade Tipo Hipersensibilidade Tipo IVIV

Hipersensibilidade tardia Hipersensibilidade tardia

mediada por célulasmediada por células

Mecanismos de açãoMecanismos de ação

Mediada por células, Mediada por células, – linfócitos Tlinfócitos T– macrófagos ativadosmacrófagos ativados– Citocinas Il 1, Il 2, TNF, INFCitocinas Il 1, Il 2, TNF, INF

Dietas de exclusão Dietas de exclusão

Um dos princiapis tratamentos para Um dos princiapis tratamentos para as alergias alimentaresas alergias alimentares– Pode ter como consequencia Pode ter como consequencia

as deficiencias alimentaresas deficiencias alimentares Dificuldade para os cuidadores de Dificuldade para os cuidadores de

pacientes alergicospacientes alergicos Dificuldade de integração de algumas Dificuldade de integração de algumas

crianças às atividades sociais que crianças às atividades sociais que envolvem a alimentaçãoenvolvem a alimentação

AlérgenosAlérgenos

Como a reação a alergenos é Como a reação a alergenos é potencialmente severa se faz potencialmente severa se faz necessário regulamentações de seu necessário regulamentações de seu controle.controle.– Rotulagem - alerta da presença dos Rotulagem - alerta da presença dos

principais alergenos principal meio de principais alergenos principal meio de previnirprevinir como ocorre para o gluten como ocorre para o gluten

Métodos para detecção de Métodos para detecção de antígenos alimentaresantígenos alimentares

Através de anticorpos Através de anticorpos – Anticorpos de pacientes alergicosAnticorpos de pacientes alergicos– Produção de anticorpos policlonaisProdução de anticorpos policlonais– Produção de anticorpos monoclonaisProdução de anticorpos monoclonais

Purificação de proteínas  Purificação de proteínas   - Precipitação  - Precipitação – Colunas de purificaçãoColunas de purificação

Análise de alimentos Análise de alimentos baseado em IgE humanabaseado em IgE humana

Por colunas de afinidadePor colunas de afinidade Testes de ELISATestes de ELISA Radio imunoensaioRadio imunoensaio

ImmunoblottingImmunoblotting

Reagentes utilizando anticorpos Reagentes utilizando anticorpos Mono-especificosMono-especificos

Imunoblotting com antígenos Imunoblotting com antígenos

Produção de anticorpos Produção de anticorpos policlonais policlonais

Obtida a fração antigenica imunizar o Obtida a fração antigenica imunizar o animal com >100 animal com >100 g de antígeno g de antígeno associado a um adjuvanteassociado a um adjuvante

dia o 14 21 28

Primária Secundáriasangria sangria

Ag + adjuvante

Ag

ProduçãoProduçãode Ac de Ac monoclonaismonoclonais

Esquema da técnica do Esquema da técnica do ELISAELISA

Cobertura da placa com cada

fração

Lavar a placa 2x Incubar com ptn não relacionada

Lavar a placa 2x

Incubação com soro imune

Lavar a placa 6x

Incubação com substrato cromógeno

Lavar a placa 6x Incubação Ac marcado com

enzima

interromper com H2SO4

Ler a 490nm

ResultadosResultados

Baixa reatividade no ELISABaixa reatividade no ELISA Razões para istoRazões para isto

a diminuição de reação AgACmenos Ac marcado

menor atividade ezimáticamenos cor

adesividade baixa adesividade baixa das frações das frações proteicas ao proteicas ao

plástico plástico

baixa baixa

antigenicidade antigenicidade

ELISA DE CAPTURAELISA DE CAPTURA

Sensibilidade aumentadaSensibilidade aumentada Permite a quantificação Permite a quantificação

Ac anti X Ptn inespecífica + Ag a ser testado

Ac anti X de outro animal

Finalização da reação com Ac marcado

ImunoblotImunoblot

– Preparar o extrato proteico Preparar o extrato proteico – Correr um gel de poliacrilamidaCorrer um gel de poliacrilamida– Transferir para nitroceluloseTransferir para nitrocelulose– Reação imunologica semelhante ao Reação imunologica semelhante ao

ELISAELISA– Leitura da absorbancia para Leitura da absorbancia para

determinação da intensidade de determinação da intensidade de reação.reação.

Polymerase chain reaction Polymerase chain reaction (PCR)(PCR)

Vantagem Vantagem – a alta afinidadea alta afinidade

DesvantagensDesvantagens– PreçoPreço– Determinação das sequencias de Determinação das sequencias de

iniciaçãoiniciação

Antígenos sequenciadosAntígenos sequenciados

Mais de 600Mais de 600 EspécieEspécie Nome vulgarNome vulgar AllergenoAllergeno Número de aminoácidosNúmero de aminoácidos