Doença Residual Mínima

Doença Residual MínimaDoença Residual Mínimaemem

HematologiaHematologia

Realizado Realizado por:por:

João João RodriguesRodrigues

Linfomas Não HodgkinLinfomas Não Hodgkin

• Dificuldade de DetecçãoDificuldade de Detecção

• Grande disseminaçãoGrande disseminação

Linfomas Não HodgkinLinfomas Não Hodgkin

• Razão de eliminação da doença:Razão de eliminação da doença:

– CompletaCompleta

– MRDMRD

– InexistenteInexistente

Doença Residual MínimaDoença Residual Mínima

Nível mais baixo de doença detectável Nível mais baixo de doença detectável pelos métodos disponíveis.pelos métodos disponíveis.

Técnicas de detecçãoTécnicas de detecção

• MorfologiaMorfologia

• Citometria de fluxoCitometria de fluxo

• CitogenéticaCitogenética

• Biologia MolecularBiologia Molecular

Tecnicas Moleculares

• Southern Blot

• PCR

• DNA Chips

ExtracçãoExtracção

• Southern Blot

ExtracçãoExtracção

PCR (Polymerase Chain Reaction)PCR (Polymerase Chain Reaction)

• Um par de primers sintéticos Um par de primers sintéticos

hibridizam com cada cadeia do DNA hibridizam com cada cadeia do DNA

alvo.alvo.

• Primers delimitam uma área que é Primers delimitam uma área que é

amplificada exponencialmente.amplificada exponencialmente.

• Síntese de uma cadeia Síntese de uma cadeia

complementar de DNA, por acção de complementar de DNA, por acção de

uma polimerase, através da adição uma polimerase, através da adição

sequencial de deoxinucleótidos.sequencial de deoxinucleótidos.

Annealing

Desnaturação

Extensão

PCRPCR

• No fim de cada ciclo, o número No fim de cada ciclo, o número

de moléculas de DNA duplica.de moléculas de DNA duplica.

PCRPCR• Métodos de detecçãoMétodos de detecção

–Electroforese em GelElectroforese em Gel

–Electroforese CapilarElectroforese Capilar

PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real

PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real

• Métodos de detecção do produto de Métodos de detecção do produto de

amplificação:amplificação:

– Específicos da sequênciaEspecíficos da sequência

• Fluorescence Resonanse Energy TransferFluorescence Resonanse Energy Transfer

• Sondas TaqManSondas TaqMan

• Molecular BeaconsMolecular Beacons

– Não específicos da sequênciaNão específicos da sequência

• SYBR GreenSYBR Green

PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real

PCR em Tempo RealPCR em Tempo Real

• DNA ChipsDNA Chips

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Rearranjos clonais ou translocações Rearranjos clonais ou translocações envolvendo:envolvendo:

– Imunoglobulinas (Ig)Imunoglobulinas (Ig)

– Receptores das celulas T (TCR)Receptores das celulas T (TCR)

– Outros GenesOutros Genes

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 14;18 – BCL-2/IgHTranslocação 14;18 – BCL-2/IgH– Cromossoma 14Cromossoma 14

– Cromossoma 18Cromossoma 18

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 14;18 – BCL-2/IgHTranslocação 14;18 – BCL-2/IgH

– 70-90% dos LNH B Foliculares.70-90% dos LNH B Foliculares.

– 50% dos linfomas B de células 50% dos linfomas B de células indiferenciadas.indiferenciadas.

– 20-30% dos linfomas B de células grandes 20-30% dos linfomas B de células grandes difusas.difusas.

– Não está presente em outros linfomas.Não está presente em outros linfomas.

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 14;18 – BCL-2/IgHTranslocação 14;18 – BCL-2/IgH

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 11;14 – BCL-1/IgHTranslocação 11;14 – BCL-1/IgH– Cromossoma 11Cromossoma 11

– Cromossoma 14Cromossoma 14

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 11;14 – BCL-1/IgHTranslocação 11;14 – BCL-1/IgH

– 10-20% Células B prolinfociticas.10-20% Células B prolinfociticas.

– 20-25% dos mielomas múltiplos.20-25% dos mielomas múltiplos.

– 2-5% das LLC.2-5% das LLC.

– Linfoma esplénico, etc.Linfoma esplénico, etc.

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 11;14 – BCL-1/IgHTranslocação 11;14 – BCL-1/IgH

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Rearranjos das populações Rearranjos das populações linfocitáriaslinfocitárias

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Diferenciação das células BDiferenciação das células B

– IgHIgH

– IgIgkk

– IgIgλλ

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Diferenciação das células TDiferenciação das células T

–TCR TCR δδTCR TCR γγ//δδ

–TCR TCR γγ

–TCR TCR ββTCR TCR αα//ββ

–TCR TCR αα

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Monoclonalidade TMonoclonalidade T

– TCR TCR ββ

• Cromossoma 7Cromossoma 7

– TCR TCR ββ

– TCR TCR ββ

•80% das LLA-T CD3-80% das LLA-T CD3-

•95% das LLA-T CD3+95% das LLA-T CD3+

•1/3 LLA-B percursoras1/3 LLA-B percursoras

•0-7% Células B maturas0-7% Células B maturas

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Monoclonalidade TMonoclonalidade T

– TCR TCR γγ

• Cromossoma 7Cromossoma 7

– TCR TCR γγ

– TCR TCR γγ

•>90 % LLA-T, LGL e LLP-T>90 % LLA-T, LGL e LLP-T

•50-75% LNH-T periféricos e micoses 50-75% LNH-T periféricos e micoses fungoidesfungoides

•60% LLA-B60% LLA-B

•Não presente em proliferações de cél. Não presente em proliferações de cél. NKNK

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Monoclonalidade TMonoclonalidade T

– TCR TCR δδ

• Cromossoma 14Cromossoma 14

– TCR TCR δδ

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

•Monoclonalidade BMonoclonalidade B

– Nas Cadeias Pesadas:Nas Cadeias Pesadas:• VH-JHVH-JH• DH-JHDH-JH

– IgHIgH

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Monoclonalidade BMonoclonalidade B

– Nas Cadeias Leves:Nas Cadeias Leves:

• Ig KIg K

– Ig Ig κκ

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Monoclonalidade BMonoclonalidade B

– Nas Cadeias Leves:Nas Cadeias Leves:

•Ig Ig λλ

– Ig Ig λλ

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 9;22 – BCR/ABLTranslocação 9;22 – BCR/ABL

– BCR – Cromossoma 22BCR – Cromossoma 22

– ABL – Cromossoma 9ABL – Cromossoma 9

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 9;22 – BCR/ABLTranslocação 9;22 – BCR/ABL

RNA RNA RT-PCRRT-PCR cDNA cDNA

Técnicas MolecularesTécnicas Moleculares

• Translocação 9;22 – BCR/ABLTranslocação 9;22 – BCR/ABL