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BIOTECNOLOGIAENGENHARIAGENÉTICA

Manualdeapoioàs

AulasPráticasLaboratoriais

2019-2020

CarlosSinogas

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 2

ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA.................................................................................................................................................................3

Vestuárioecomportamentos...................................................................................................................................................................3 Riscosfísicos....................................................................................................................................................................................................3 Riscosquímicos..............................................................................................................................................................................................4 Riscosbiológicos............................................................................................................................................................................................5 Planeamento....................................................................................................................................................................................................5 Procedimentosgerais..................................................................................................................................................................................5

REGISTOSERELATÓRIOS....................................................................................................................................................................................6 TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMLABORATÓRIODEMICROBIOLOGIA........................................................................7

Meiosdecultura.............................................................................................................................................................................................7 Esterilização....................................................................................................................................................................................................8 TubosdeculturaePlacasdePetri.........................................................................................................................................................8 Instrumentosparatransferênciadeculturas...................................................................................................................................8 Câmarasdecultura.......................................................................................................................................................................................9 Frigorífico.........................................................................................................................................................................................................9

MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃO.......................................................................................................................................................................10 A.Esterilizaçãoporcalorhúmido.......................................................................................................................................................10 B.Esterilizaçãoporcalorseco..............................................................................................................................................................11 C.Esterilizaçãoporgases........................................................................................................................................................................11 D.Radiações..................................................................................................................................................................................................11 E.Filtraçãoestéril......................................................................................................................................................................................11 F.Desinfetanteseantissépticos...........................................................................................................................................................11

PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS.....................................................................................................................................................................12 1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES......................................................................................................................................12 3. VERIFICAÇÃOECALIBRAÇÃODEPIPETAS..............................................................................................................................17 4. CULTURADEBACTÉRIARECOMBINANTE(E.coli)...............................................................................................................20 5. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-LiseAlcalina.............................................................................................................21 6. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-MiniPrep....................................................................................................................22 7. DIGESTÃOCOMENZIMASDERESTRIÇÃO................................................................................................................................23 8. ANÁLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE..................................................................................................................................24 9. PREPARAÇÃODEBACTÉRIASCOMPETENTES.......................................................................................................................25 10. TRANSFORMAÇÃO..........................................................................................................................................................................26 11. SELEÇÃODERECOMBINANTES...............................................................................................................................................27 12. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–InduçãodaExpressão.........................................................................28 13. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–PAGE...........................................................................................................29 14. CROMATOGRAFIADEEXCLUSÃOMOLECULAR................................................................................................................31 15. DOTBLOT(proteínas)...................................................................................................................................................................33

ANEXOS.....................................................................................................................................................................................................................34 EnzimasdeRestrição................................................................................................................................................................................34 TabelaPeriódica.........................................................................................................................................................................................35

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PROCEDIMENTOSDESEGURANÇA(Adaptadode“BiotechnologyExplorations”,ASMPress)

EnsinareaprendernolaboratóriodeBiotecnologiaenvolvesempreumcertonívelderiscoparaooperadorecompanheiros.Novosequipamentos,reagentesemateriaisbiológicossãoparteintegrantedostrabalhosexperimentaisqueenvolvemácidosnucleicoseproteínas.Osestudantesestãoaaprendernovastécnicas,usandoreagentesemateriaisbiológicosenovosequipamentosqueapresentamalgumrisconocontextodasuautilizaçãolaboratorial.Nãosendopossívelfazeraexperimentaçãosemusarosequipamentos,osreagenteseomaterialbiológico,espera-sedosestudantesqueadotemasatitudesadequadasparaminimizaçãodosriscosassociados.

“Alertapermanente”,umconceitoimportadodospilotosdeavião,criaoenquadramentoparaamanutençãodasegurançaapropriadafaceaosriscosinerentes.Talcomoopilotodeveestaralertaparaasuaenvolvente,comconstantevigilânciaparaasuasegurançaeadosoutros,assimosestudantesdebiotecnologiadevemfazernolaboratório.Opilototemsempredesaber“ondeestá,paraondevaiecomoláchegar”.Traduzidoparaoambientelaboratorial,osestudantesdevemestarconcentradosnastarefasquedesenvolvem,compreenderoequipamento,osreagenteseosmateriaisbiológicosqueusam,devendoseguirospassosadequadosàconduçãodaexperiência.Aomesmotempocadaestudantedeveconheceroqueosseuscolegasfazemeosprotocolosqueseguem.

Nesteenquadramentosãoquatroasprincipaisquestõesdesegurançaquesecolocam:

¾ Vestuárioecomportamentos¾ Riscosfísicos¾ Riscosquímicos¾ RiscosBiológicos

VestuárioecomportamentosReduziraomínimoospertencespessoaiseoutrosmateriaisnabancadadetrabalho.Casacos,sacoseoutrospertencesdeverãoserdepositadosnobengaleiroàentradadolaboratório.

Usodebataobrigatório(Sempre),paraevitarsujaroucontaminararoupa.

Cabelo,quandocomprido,devidamenteapanhadoparaevitarasuaigniçãonachamaouacontaminaçãoquímicaoubiológica.

Sapatosfechadossãorecomendados,poisosabertosnãoprotegemdeeventuaisrespingosquepossamcair.

ProteçãodosolhosepelenuaaquandodautilizaçãodeUV

Luvasdescartáveissãoexigíveisquandosemanipulamcertosreagentesoumicrorganismos.

Édesaconselhadoousodejoias,emespecialanéisepulseirasqueimpedemoadequadousodasluvas.

Comer,beber,mascarpastilhaselásticas,aplicarcosméticoséproibidonolaboratório,paraqueeventuaiscontaminaçõesnãosejamdirigidasparazonasnãoprotegidas.Roerasunhas,lápis,canetasededosnabocaigualmenteproibido,pelasmesmasrazões.

Osestudantesdevemconhecerecompreenderbemotrabalhoafazer.Umaboaprogramaçãoémeiocaminhoparaumaboaexecução.Odocentedeveráserquestionadosemprequesurjamdúvidassobreosprocedimentosaseguir.

Asmãosdevemsersemprelavadasantesdeiniciarotrabalhoedepoisdeconcluídaaexperimentação,paraquecontaminantesnãosejamintroduzidosnemtransportadosparaforadolaboratório.

Asbancadasdetrabalhodevemsersemprelimpasesanitarizadascomálcoolantesdoiníciodotrabalhoedepoisdesteconcluído.Nãoseconheceoqueoutrosestudantespossamterdeixadonolaboratório,nemsepretendedeixarcontaminaçõesparaquemvieraseguir.

Riscosfísicos

UFogo

Identificaralocalizaçãodochuveiro,dosextintoresedosbaldesdeareia.

Identificaralocalizaçãodosquadroselétricosedatorneirageraldogás.

Aquecerprodutosaaltastemperaturaspodeprovocarqueimaduras.

Assoluçõesaquecidasnomicro-ondas,emespecialasagaroses,podemficarsobreaquecidaseentraremebuliçãoexplosivaapósagitação,provocandoqueimadurasgraves.

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Bicos de gás e lamparinas

Conhecercomosedeveacenderobicodegás.

Nuncaabandonarumbicooulamparinaacesa.Evitarmovimentá-losquandoacesos.

Flamejarosinstrumentoseostuboscomcuidadoparaevitarformaçãodeaerossóis.

Nãousarmaterialfacilmenteinflamávelnasproximidadesdachama(atençãoaoálcool).

Autoclave

Evitarexposiçãoaosvaporesdaautoclaveaquandodasuaabertura.Podemprovocarqueimaduras.

Usarluvasisolantespararemovermateriaisdaautoclave

Vidros partidos e material cortante

Osvidrospartidosdeverãoserremovidoscomauxíliodepinçaouluvas,nuncacomasmãosdesprotegidas.

Nãocolocarvidrospartidosnolixocomum.

Seapropriadorecolherparadescontaminação.

Usarlâminascortantescomauxíliodepinçasouluvas.

Equipamento elétrico e de eletroforese

Verificaroscaboselétricosdosequipamentosenuncausarcabosdefeituosos.

Evitarousodematerialelétricopróximodeágua.

Desligaroequipamento(botãoOFF)antesdeoligaràcorrente.Nuncaligaroudesligarumaparelhodeeletroforesesemantescortaracorrente(botãoOFF).

Nuncaabrirumatinadeeletroforesesemantesdesligaracorrenteelétrica.

Transiluminador de UV

AousarotransiluminadordeUV,nuncaoligueantesdebaixaratampaprotetora.

Desliguealuzantesdelevantaratampaeremoverogel.

RiscosquímicosPrestaratençãoàsnotasdosprotocolossobreosriscosassociadosaalgunsreagenteseseguirasinstruçõesdodocente.

Nuncapipetaràboca.Usarpipetadoresmecânicos.

Osrestosdeprodutosquímicosnãodevemserrejeitadosparaoesgoto.

Localizarochuveiroeosistemadelavagemdeolhos.

Aroupaatingidaporreagentesquímicosdeveráserdeimediatoremovidaeapeleemcontactoserabundantementelavada.

Nãoremoverprodutosquímicosdolaboratório.

Algunsreagentesquímicosausarnasexperiênciastêmassociadosriscosparticulares.Ousodereagentesemsoluçãooupré-misturadosreduzoníveldeexposiçãoeotempodasuautilização.Aquantidademanipuladaétambémimportante.Algunsreagentescomriscosespecíficosautilizarnassessõeslaboratoriais:

Acrilamidaebis-acrilamida–Mutagénico,carcinogénicoeneurotóxicoquandoinaladoouingerido.Usarapenassoluçõespreviamentepreparadasecomluvas.

Persulfatodeamónio–Oxidantepotente.Manterafastadodemateriaiscombustíveisedefontesdecalor.

Clorofórmio–Potentesolventeorgânico

DTT(Ditiotreitol)-Provocairritaçãonosolhos,pele,membranasdasmucosasetratorespiratório.

Etanol–Inflamável.

Brometodeetídio(soluções)–Mutagénico.Usarluvas.

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SDS(laurilsulfatodesódio)–Irritantedosolhosedapele.

Ácidosebasesconcentrados–Corrosivos.Provocamqueimadurasaocontacto.

RiscosbiológicosDesinfetaraáreadetrabalhoantesedepoisdemanipularmicrorganismos.

Usarlixíviadiluída(10%dehipocloritodesódio)paradescontaminaráreaseinstrumentoseventualmentecontaminados.

Evitarasmãosnabocaounosolhos.

Flamejarcuidadosamenteinstrumentosetubosparaevitaraformaçãodeaerossóis.

Nãoremovermicrorganismosdolaboratório.

TratartodasasamostrasdeDNA,plasmídeosebactériascomomaterialcontaminado.

Rejeitarasculturaseoutromaterialcontaminadonotabuleiroparaautoclavar.

Nãojuntarmaterialnãocontaminadonotabuleiroparaautoclavar.

Nãorejeitarnolixocomumoquequerquesejaquetenhacontactadobactérias.

Sebemqueosmicrorganismosausarnaexperimentação(E.coli)nãocoloquemriscosbiológicosparticularesdeveter-sesempreemmentequesãocriadascondiçõesdecrescimentodosmesmos.Orisconaturalmenteaumentacomaquantidadedebactériaseoutrosmicrorganismos,eventualmentepatogénicos,podemcontaminarasculturaseseramplificados.

PlaneamentoNãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.

ProcedimentosgeraisTodososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodosriscosassociadosàmanipulação,numaperspetivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréautilizaçãodobomsensodooperadornostrabalhosarealizar.

Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.

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REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraçãodorelatóriofinalouparaaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosduranteaexecuçãodotrabalhoexperimentalfacilitarãoaaprendizagemeainterpretaçãodosresultadosobtidos,emespecialquandoestessãoinesperados.

Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjetivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresuscetíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintessecções:

Título Identificadordoconteúdodorelatório

Resumo Pequenotextodequeconstemosobjetivosalmejadoseasconclusõesobtidas

Objetivo Razãodeserdotrabalhorealizado

Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciaempreendida

Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho

Materialereagentes Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado

Protocoloexperimental

Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito

Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos

Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos

Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjetivo,decorrentedosresultadosobtidos

Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas

Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho

Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdassecçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo

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TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMLABORATÓRIODEMICROBIOLOGIAAodesenvolvimentodostrabalhosemBiotecnologiaéfundamentalrecorreràstécnicasprópriasdaMicrobiologiaparaamanipulação,crescimentoemanutençãodebactériaseoutroshospedeirosdeDNAsrecombinantes.

Osmicrorganismossãoubíquos.Podemencontrar-senosolo,noar,naágua,nacomida,nosesgotosenassuperfíciescorporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladoànossavolta,onossoambienteestárepletodemicrorganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismoénecessáriosepararestaspopulaçõesmistas,deformaamanipularnolaboratórioaschamadasculturaspuras,culturasdeumaúnicaestirpe.Apesardofornecimentodeestirpesbacterianaspurasparaarealizaçãodostrabalhos,asculturaspodemvirasercontaminadas.

Paraisolareestudarosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealgunsequipamentoslaboratoriaisbásicosedaaplicaçãodetécnicasespecíficasusandomateriaisparticulares.Naspráticasqueaplicaremosnodecursodestadisciplina,ter-se-áderecorreràstécnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacomutilizaçãodosequipamentosemateriaisespecíficosqueseindicam:

Equipamento Autoclaveedispositivosdefiltraçãoestéril

Ansaseagulhas.PipetasemicropipetasBanhosdeáguaeestufasFrigoríficoFluxolaminar(conveniente)

Materiais ÁguadestiladadequalidadeMeiosdecultura(bactérias)LíquidoSemissólidoSólidoTubosparaculturaPlacasdePetri

MeiosdeculturaAsobrevivênciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrienteseconvenientescondiçõesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenasnecessitamdesubstânciasolúveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaçãoenzimáticadeoutrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluçãocontendoestesnutrientesédesignadacomomeiodecultura.Emgeral,osmeiosdeculturasãolíquidos,semissólidosousólidos.Ummeiolíquidosemagentesolidificanteédesignadoporcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,originaummeiosólidoousemissólido.Oagaréumextratodealgasmarinhas,umcarbohidratocomplexoquecontemmaioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarémuitoadequadocomoagentesolidificanteporqueseliquefazacercade100ºCesolidificaa40ºC.Devidoaestaspropriedades,osmicrorganismos,emespecialospatogénicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37ºCsemreceiosdeliquefaçãodomeiosolidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraçãodeagardaordemdos1,5a1,8%.Umaconcentraçãoinferiora1%resultanummeiosemissólido.

Paraalémdasnecessidadesnutritivas,váriosoutrosfatoresambientaisprecisamdesercontroladosparaosucessodaculturadosmicrorganismos,comosejamopH,atemperatura,oambientegasosoouapressãoosmótica.

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EsterilizaçãoAesterilizaçãoéumdospontos-chaveparaosucessodotrabalhoemmicrobiologia.Paratrabalharemcondiçõesdeesterilidadeéfundamentalousodematerialestérileaaplicaçãodetécnicasadequadas.Aesterilizaçãoéprocessopeloqualsãoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistécnicasparaaesterilizaçãoderotinaemlaboratóriosãoasseguintes:

Calor Calorseco(arquente)

160ºCa180ºCdurante1/2horaa3horasMaterialdevidroemvazioCalorhúmido(vapor)Circulaçãodevapora100ºC.Esterilizaçãointermitente(soluçõestermolábeis)Autoclave.Vaporsobpressão,temperaturasacimados100ºC(meiosdecultura,soluções

termo-estáveis)Filtração Membranasfiltrantescomporosde0,05µma0.8µm

RemoçãodemicrorganismosdesoluçõestermolábeisporfiltraçãoProdutosquímicos Óxidodeetileno

MaterialdeplásticoBeta-propiolactonaTecidosvivos,materiaisbiológicos

TubosdeculturaePlacasdePetriTubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplásticoconstituemosprincipaissuportesparaodesenvolvimentodasculturasdemicrorganismos.Ummeionutritivoadequadonaformadecaldonutritivooudeagaréusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetriapenasseusameiosólido.Umambienteestérilépreservadonostubosdeculturaporváriostiposdetampas.Historicamenteéorolhãodealgodão,desenvolvidoporSchroederevonDuschnoséculodezanove.Hojeemdia,amaiorpartedoslaboratóriosusamtampasemformademanga,emmetalouplásticoresistenteaocalor.Avantagemdestastampasresidenofactodenãoexigiremtantotrabalhonasuapreparaçãoeseremmaisfacilmenteremovidasereintroduzidasnostubosduranteamanipulação.Mantem-se,contudo,apráticadeprotegerumadasextremidadesdaspipetascomrolhãodealgodãocardado(hidrófobo).

AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfícieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.Sãocompostasporumabasecircularinferior,ondeécolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoeligeiramentemaiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetrideváriasdimensõesparadiferentesexigênciaslaboratoriais.Narotinasãousadasplacasdecercade10cmdediâmetro.Omeionutritivoestéril,contendoagar,numvolumede15a20mLévertidonasplacasquandoaindaquenteapósfusãodoagaredeixadoarrefeceratemperaturainferiora40ºC.Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassãoincubadasemposiçãoinvertidaparaevitarqueasgotasdecondensação,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,tombemsobreasuperfíciedoagar.

InstrumentosparatransferênciadeculturasExisteanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasdearmazenamentoamanutençãoparaculturasdeanálise.Éoprocessodesubculturaquetemdenecessariamenteserefetuadocomtécnicaestérilparaevitarpotenciaiscontaminaçõesdassubculturas.

Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprópriosparaamanipulação,sãoinstrumentosmuitoduráveisdefácilutilização.Sãofacilmenteesterilizáveisnomomentodasuautilizaçãoporincineraçãoàchama,numaposiçãoquaseverticalatéometalficaraorubro.Importarádepoisdeixararrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismosambientaisviáveiséinferior.Depoisdearrefecidos,paranãoinativarosmicrorganismosatransferir,podemserusadaspara"picar"umaculturasólidaoulíquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeveráserdeimediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada.

Aspipetassãooutrosdosinstrumentosdetransferênciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Sãocalibradasepermitematransferênciadequantidadesdeculturaslíquidaspreestabelecidas.Sãodevidroouplástico,comumaextremidadeafiladaeoutraparaaaspiraçãoeexpulsãodolíquidoquecontenham.Podemseresterilizadasporcalorsecoouhúmido,conformeotipodematerialdequesãoconstituídas.Apesardetradicionalmentesereminstrumentospara"pipetaràboca"éproibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliaresmecânicosdisponíveisparaoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidadelargadapipeta.

AspipetasPasteur,tubosdevidronãograduadoscomumadasextremidadesafiladassãotambémdeusomuitofrequenteemtrabalhosdemicrobiologia,tambémpelasuafacilidadedeesterilizaçãoextemporânea.

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CâmarasdeculturaDascondiçõesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevanteséasuatemperaturaótimadecrescimento.Asestufassãousadasparaamanutençãodatemperaturaótimadosmicrorganismosemcrescimentoduranteoperíododecultura.Sãocâmarasemqueatemperaturaambienteinteriorécontroladaportermóstato,paraqueamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamemgeralumsistemadecirculaçãodearaquecidoe,paraevitaradesidrataçãodosmeiosemincubação,deverãocontertambémumafontedevapordeágua(umrecipientecomáguanoseuinterior,quandonãovenhampreparadasparaoefeitodeorigem).

Osbanhosdeágua(banho-maria)comáguaatemperaturacontroladaportermóstatoconstituemoutrodosinstrumentosfrequentementeempreguesparaacriaçãodascondiçõesdetemperaturaótimadecrescimentodosmicrorganismos.Oíntimocontactodaáguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemosmicrorganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrápidaeeficaztransferênciadocalor.Alémdisso,osbanhoscomagitaçãofacilitamtambémoarejamentodasculturas,degrandeimportânciaparaocrescimentodosmicrorganismosaeróbios.Adesvantagemdobanhodeáguaresidenofactodesópoderserusadoparaasculturasemmeiolíquido,aocontráriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolíquidocomoemmeiosólido.

FrigoríficoOfrigoríficoéoutradaspeçasfundamentaisemlaboratóriodemicrobiologia.Oambientedebaixatemperaturaquedisponibilizaédamaiorrelevânciaparaamanutençãoearmazenamentodasculturascelularesemfasedenãocrescimentoentreosperíodosdesubculturaeparaaconservaçãodosmeiosesterilizadoseoutrosreagentes.Tambémassoluçõesecompostostermolábeistêmperíodosdeconservaçãomaisalargadosquandoarmazenadosabaixastemperaturas.

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MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃOEsterilizaçãoéumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremàsuperfícieounointeriordeummaterial,podendoseralcançadopelaexposiçãodomaterialaagentesletaisfísicosouquímicosou,nocasodoslíquidos,pelaseparaçãomecânicadosorganismosatravésdefiltrações.Existemmuitasformasdeesterilizarmateriaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomodadisponibilidadedemeiosdetrabalho.

Anoçãodeesterilidade(estéril=infecundo)encontra-sefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia(ausênciadesepsis=putrefação)eadedesinfeção(livrardainfeção).Estessignificadosliteraiscorrespondem,defacto,àsnoçõestécnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimo-nosaesterilizaçãoquandosepretendeimpedirapropagaçãodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambientedesprovidodemicrorganismoseadesinfeçãoquandoseaplicamtécnicasdestinadasaeliminarmicrorganismospotencialmentepatogénicosparaooperador.

Destasnoções,aaprofundarnoexercíciodaexperimentaçãoquesedesenvolveránadisciplina,importaconsideraremparticularastécnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaçãodemicrorganismosviáveis:aesterilização.

A.EsterilizaçãoporcalorhúmidoOaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaéaautoclave,comumprincípiodefuncionamentoidênticoàspanelasdepressãodomésticas.Asautoclavesdelaboratóriooperamnormalmentesobumapressãode1,02Baraumatemperaturade121ºC.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem15-30minutos,sendoavariaçãodotempodeesterilizaçãodevidaàrelaçãosuperfície/volumedosmateriaisaseremesterilizados.

Temperatura

Osendósporosdasbactériassãoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiçãopodeserconseguidaseforaplicadovaporsobrepressão.Umatemperaturade121ºCofereceumaboamargemdesegurançaseformantidaduranteumespaçodetempoapropriado.

Humidade

Acoagulaçãodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehámedidaqueestaéremovidaatemperaturanecessáriaparahavercoagulaçãoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecidoficarámais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposiçãoparaaesterilização,quenasituaçãoextremadeesterilizaçãoemcalorsecoseráde170ºCduranteumahora.Emconclusão,vaporexcessivamentequenteperdealgumadasuaeficáciacomoagenteletalparaalémdepoderserlesivoparaosmateriaisaseremtratados.

Pressão

Apressão,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisónãoexercequalquerefeitonaesterilização,sendoútilapenasparaelevaratemperaturadovaporacimados100°C.

Tempo

Otempoénecessárioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaseremesterilizados.Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaçãosãoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosnãosãotodosinativadosdeumavez.Avelocidadedemorteéumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidadedetempodeexposiçãoaoagenteletal,umaproporçãoqueéconstanteparaumadadapopulação.Normalmentedemora11a12minutosa121°C(calorhúmido)paraeliminarosendósporosdasbactériastermofílicas,osagentesmaisresistentesnasmanipulaçõesdodia-a-dia.

Purga

Oarrelativamentefrionacâmaradeesterilizaçãoémuitomaispesadoqueovaporàtemperaturadeesterilização.Senãoforpermitidaasaídadoarcria-seumaestratificaçãonaautoclavequeconduzaumafaltadeuniformizaçãodastemperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsãolentosamisturar-se,asdiferençasdetemperaturaentrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooarporvapordeágua(purga).

Natureza do carregamento

Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremmaistempodeesterilização,sendopreferívelesterilizarpequenosvolumesdecadavez(émaiseficazesterilizar5balõesdeumlitroqueumbalãodecincolitros).Osfrascosdevemsertapadoscomalgodãooupapel.Sefornecessáriousartampasroscadas,estasdevemirpoucoapertadas

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paraaautoclavedemodoapermitiremasaídadeareentradadevaporeanãocriaçãodegrandesdiferenciaisdepressãoquepodemlevaraorebentamentodosfrascosnaautoclave.

B.EsterilizaçãoporcalorsecoOcalorsecoéusadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaissólidostermo-estáveisealgunscomponentesdemeiosoualimentosqueficariamimprópriosseexpostosaovapor.Trata-setambémdeumdosmétodosdeesterilizaçãomaisusadosedemuitofácilaplicação.Oequipamentoindispensáveléapenasumaestufadealtatemperatura(160-200ºC).Paraalémdeterdesertidaemcontaaresistênciatérmicadosmateriaisaesterilizarporestatécnica,aoutraprecauçãoaconsiderarprende-secomaminimizaçãodapossibilidadedecontaminaressesmateriaisdepoisdaesterilização.

C.EsterilizaçãoporgasesOincrementodousodematerialdeplásticodeutilizaçãoúnicacomoseringas,caixasdePetri,tubosdecultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaçãoqueusagasestóxicosparaaeliminaçãodosmicrorganismosdemateriaistermosensíveis.Aaplicaçãodestatécnicarequerautilizaçãodeequipamentosprópriosqueforcemacirculaçãodogástóxicoatravésdetodasassuperfíciesdosmateriais,oqueatornadedifícilutilizaçãoemlaboratóriosdetiponãoindustrial.

Oóxidodeetilenoéogásusadocommaiorfrequêncianestetipodeesterilizações.Estegás,aocontráriodemuitosprodutosquímicostóxicos,époucocorrosivoenãoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendofacilmenteremovidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperíodosdeexposiçãoparaseobteraesterilização(váriashoras),areatividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposdeplásticoseanecessidadedeequipamentosprópriosedisponibilidadedogás.

D.RadiaçõesAlgunsprocessoscomerciaisusamasradiaçõesparaaesterilizaçãoafriodecertosmateriaiscomoprodutosfarmacêuticos,porexemplo.Radiaçõesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgamaproduzidosapartirdecobalto-60oucésio-139ederaioscatódicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresdeeletrõessãoasmaisutilizadas.

Airradiaçãocomluzultravioletanãoéumaformamuitosatisfatóriadeesterilizaçãodadaasuafracacapacidadedepenetraçãonosmateriaiseprodutosaesterilizar.É,contudo,deutilizaçãofrequentenadiminuiçãodoníveldecontaminaçãodeespaçosconfinados,comosalasestéreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteúteistambémparaareduçãodainfecciosidadeviraldevidoàsalteraçõesinduzidasnomaterialgenéticodaspartículasviraisexpostas.

E.FiltraçãoestérilOprincipalmétodoparaaesterilizaçãodelíquidosquecontenhamcomponentestermosensíveiscomovitaminas,proteínaseantibióticos,porexemplo,éafiltração.Tradicionalmenteosmicrobiologistasesterilizavamestesprodutosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomáceasefibrasdeasbesto,previamenteesterilizadosemautoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstituídosporfiltrosdeacetatodeceluloseoupolicarbonatosnosquaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraçõescomelevadosgrausdeprecisão.Existematualmentedisponíveisnomercadofiltrosdeváriosporosecapacidadesfiltrantes.Osmaisfrequentese,porisso,maisacessíveissãofiltrosdeporosde0,45µmou0,2µmdediâmetro,queretêmosmicrorganismospresentesnassoluções.

Paraesterilizarumasoluçãoporfiltração,nãohámaisquepassaressasoluçãoatravésdeumdestesfiltrospelaaplicaçãodeumapressãopositivanolíquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefaçãodoarnocontentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatécnicarequerarecolhadofiltradoemcondiçõesdeassepsiaparaimpediracontaminaçãodolíquidoesterilizado.

Salvorarasexceções,afiltraçãoestérilnãoretémaspartículasvirais.Nãopodendoserconsideradocomométodode"esterilizaçãodevírus".Afiltraçãoestérilémesmoumatécnicafrequentementeusadaemvirologiaparaapurificaçãodesuspensõesviraisporeliminaçãodebactériaspotencialmentecontaminantes.

F.DesinfetanteseantissépticosMúltiplosreagentesquímicossãodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaçãodemicrorganismos.Osprodutosusadosna"limpeza"deutensíliosdiversos,frequentementedemasiadotóxicosparaserusadosdiretamentenoHomem,sãochamadosdedesinfetantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmoobjetivodeeliminareventuaismicrorganismos,sãoantissépticos.Particularmenteeficazemuitoútilnolaboratório,paraeliminaçãodevírusemicrorganismoséasoluçãodehipocloritodesódio(lixívia)comquesetratamosmateriaisdelaboratórioapósexposiçãoaagentesinfeciosos.

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 12

PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS

1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadedosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetaseparaumraciocíniooperacionaltantodasdiluiçõesexpressascomopotênciasde10comonaformadeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.

Material e reagentes

¾ Soluçãoconcentradadeazul-de-metileno¾ Sorofisiológico(salino)¾ Micropipetasdiversas¾ Tubosdeensaio¾ Espectrofotómetro

Procedimento (por grupo)

Diluições decimais

1. Marquemicrotubos(de1a10)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Solvente(mL) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

Corante(μL) 1500 150

Soluçãoprecedente(μL) 150 150 150 150 150 150 150

Diluição(10P

xP)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,usandoa

mesmacuvete).6. Elaboreumgráficocomosresultadosobtidos

Diluições centesimais

7. Marque8microtubos(de1a8)8. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

Solvente(mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Corante(μL) 5000 50

Soluçãoprecedente(μL) 50 50 50 50 50 -

Diluição(10P

xP)

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 13

9. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.10. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos11. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,usandoa

mesmacuvete).12. Elaboreumgráficocomosresultadosobtidos

Diluições de três em três

1. Marque12tubosdeensaio(de1a12)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Solvente(mL) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Corante(mL) 5,0 2,5

Soluçãoprecedente(mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Diluição(10P

xP)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõespreparadasa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,

usandoamesmacuvete).6. Elaboreumgráficocomosresultadosobtidos.

TPC

Diluições milesimais

Estabeleçaoprotocoloparaarealizaçãodeumexercícioidênticoaosanteriores,mascomdiluiçõesmilesimais.

Diluição única

Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenocomoprocederiaparaapreparaçãode5mLdecadaumadasseguintesdiluições:¾ Diluiçãode5x10P

2P

¾ Diluiçãode5x10P

-2P

Preparação de soluções

Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:

¾ NaOH0,1N¾ SOB4BHB2B0,1N¾ NaCl0,1M¾ NaCl100mM¾ Glicerol10%(fórmulaCB3BHB8BOB3B)¾ Glucose10%(fórmulaCB6BHB12BOB6B)¾ Etanol70%(fórmulaCB2BHB6BOB2B)

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 14

Registo de observações e Resultados

PIPETAGENS E DILUIÇÕES

Operador: Data: ____/____/____

Diluiçõesdecimais

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1

2

3

4

5

6

7

8

Diluiçõescentesimais

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1

2

3

4

5

6

7

8

Diluiçõesdetrêsemtrês

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 15

Gráficos

Notas:

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 16

SOLUÇÕES

Operador: Data: ____/____/____

Componentes Peso/volume

Diluição

5X10P

2P

Diluição

5X10P

-2P

NaOH0,1N(100mL)

SOB4BHB2B0,1N(100mL)

NaCl0,1M(100mL)

NaCl100mM(100mL)

Glicerol10%(100mL)

Glucose10%(100mL)

Etanol70%(100mL)

Notas:

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 17

3. VERIFICAÇÃOECALIBRAÇÃODEPIPETAS

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Autilizaçãofrequentedaspipetasdisponíveisnolaboratórioporestudantessemexperiêncialevaautilizaçõesincorretasdonderesultaquealgunsdosvolumesindicadosnosvisoresnãocoincidamcomasquantidadesmedidas.Nestecontextoéimportanteconheceraformadecalibraraspipetasausar.

Material e reagentes

¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos,coposdeboémia¾ Balançadeprecisão

Procedimento (por grupo)

Ajustedevolume(5µL)

1. Utilizeumapipetade20µL2. Ajusteoindicadordevolumeaos5µL3. Pipete,nabalança,paratubocalibrado5µL4. Observeopesoindicado5. Sesuperioraos5mg,reduzaovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.6. Seinferioraos5mg,aumenteovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.7. Quandoaquantidadedeáguadestiladapesadaforde5mg,anoteaindicaçãodevolumeque,napipeta,

correspondeaos5µL.

Ajustedevolume(50µL)

1. Utilizeumapipetade200µL2. Repitaospassosdoprocedimentoanterior(de1.a7.)paraamassade50mg(correspondentea50µL)

Ajustedevolume(500µL)

1. Utilizeumapipetade1000µL2. Repitaospassosdoprocedimentoinicial(de1.a7.)paraamassade500mg(correspondentea500µL)

Calibraçãodepipeta(200µL)

1. Meça,nabalança,umvolumede10µLparacopotarado.Anoteopeso2. Repitamaisduasvezesestadeterminação3. Repitaospontos1e2paraosvolumesde20µL;50µL;100µL;150µLe200µL4. Façamédiasdecadaconjuntodetrêspesagenshomólogas5. Desenheográficodecalibraçãodapipeta,fazendocorresponderosvolumesindicadosnovisorcomospesos

avaliados.

NB

Osprocedimentosparaoutrosvolumesououtraspipetassãoidênticos.

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 18

REGISTO DE OBSERVAÇÕES E RESULTADOS

CALIBRAÇÃODEPIPETAS

Operador: Data: ____/____/____

Calibraçãodepipeta20µL

Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações

1µL

2µL

5µL

10µL

15µL

20µL

Calibraçãodepipeta200µL

Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações

10µL

20µL

50µL

100µL

150µL

200µL

Calibraçãodepipeta1000 µL

Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações

50µL

100µL

200µL

500µL

750µL

1000µL

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 19

Calibraçãodepipeta

Notas:

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 20

4. CULTURADEBACTÉRIARECOMBINANTE(E.COLI)

Material e Reagentes

¾ Bactériarecombinante

¾ LB10X:¾ Bacto-triptona 100g¾ Extratodelevedura 50g¾ NaCl 100g¾ H2Odestiladaaté 1000mL

pH7,5.¾ Autoclavar.Conservarestérila4°C.¾ Diluirextemporâneaeesterilmentea1:10comáguaestéril.¾ Ampicilina1000X

50mg/mLemágua.¾ Esterilizarporfiltração,conservara–20°C

Protocolo Experimental

1. Preparar50mLdemeioLB1Xcontendoampicilina(50μg/mL).2. Inocularcombactériacontendooplasmídeoapreparar.3. Incubar37°Cduranteumanoitesobagitação.4. Registarocrescimentodabactéria

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 21

5. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-LISEALCALINA

Material e Reagentes

¾ Bactériarecombinante

¾ LB1Xcomampicilina.¾ Lisozima(pó)¾ Isopropanol¾ 5MNaCl¾ Etanolpuroe70%¾ TEpH8,0

10mMTris-HClpH8,01mMEDTA)

¾ Pronase20mg/mLemáguaAuto-digeridadurante2horasa37°C.Conservara–20ºC

¾ PronaseMix:Pronase 50µL10%SDS 86µlH2O 860µl

¾ RNAseA10mg/mLem:10mMTris-HClpH7,515mMNaClIncubadapor15minutosa100°Cearrefecimentolento.Conservara–20ºC

¾ RNAsemix:RNAseA 40µlTEpH8,0 10mL

¾ SoluçãoI:25mMTris-HClpH8,050mMGlucose10mMEDTA

¾ SoluçãoII:0,2NNaOH1%SDS

¾ SoluçãoIII:5MKOAc 60mLAc.acéticoglacial 11,5mLH2Odestilada 28,5mLpH4,8

¾ Fenol:clorofórmio:Fenoldestilado 50mLClorofórmio 50mLAlcoolisoamílico 1mL8-hidroxiquinoleína 0,1gTEpH8,0 15mL

(usarapenasafaseorgânica,decoramarela,nãoagitar)

Protocolo Experimental

1. Usar20mLdeculturasaturadadebactériarecombinante.

2. Centrifugar4.000XGdurante15minutosa4°C.3. Lavarosedimentodebactériascom5mLdeLB.4. Decantareescorrerosobrenadante.5. Ressuspenderosedimentocom2mLdeSoluçãoI.6. Adicionar10mgdelisozima.Misturar.7. Repousar10minutosàtemperaturaambiente.8. Adicionar4mLdeSoluçãoII.9. Misturarporinversão.10. Repousar10minutosnogelo.11. Adicionar3mLdeSoluçãoIII.12. Misturar.Repousar10minutosnogelo.13. Centrifugar7.000XGdurante30minutosa4°C.14. Filtrarosobrenadanteporgazehidrófila.15. Adicionar0,6volumesdeisopropanol.16. Repousar10minutosàtemperaturaambiente.17. Centrifugar7.000XGdurante30minutos.18. Decantar.

19. Lavaroprecipitadocometanola70%.20. Lavaroprecipitadocometanola96%.21. Secaroprecipitado.22. Dissolvercom500μLdeRNAse-mix.23. Incubara37°Cdurante60minutos.24. Adicionar100μLdePronase-mix.25. Incubara37°Cdurante30minutos.26. Extrair2vezescomfenol:clorofórmio(igual

volume).27. Tomarafaseaquosa,seminterfase.28. Adicionar0,04vol.de5MNaCl(24µL)e2vol.de

etanolpuro(1,2mL).29. Precipitarduranteumanoitea–20ºC.30. RecuperarDNAplasmídicoporcentrifugação

(7.000XGdurante30minutos).31. Dissolvercom50μLdeTEpH8,0.32. Avaliaraconcentraçãodeumaalíquotaporleitura

daDOa260nm(50µg/mL=1UDO)

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6. PREPARAÇÃODEDNAPLASMÍDICO-MINIPREP

Material e Reagentes

(mesmosdatécnicadaLiseAlcalina)

Protocolo Experimental

1. Inocular5mLdeLBcomcadacolóniaaanalisar.2. Incubara37ºCduranteumanoitecomagitação.3. Pipetar2x1,5mLdesuspensãoparadoismicrotubos,damesmacultura4. Centrifugar1minutonamicrocentrífuga.(sobrenadantetransparente)5. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante.6. Ressuspenderosedimentodoprimeirotubocom100μLdeSoluçãoI,homogeneizandocomamicropipeta7. Transferirasuspensãoparaosegundotuboeressuspenderosedimento,homogeneizandocomamicropipeta8. Adicionar200μLdeSoluçãoII9. Misturarporinversão.10. Adicionar150μLdeSoluçãoIII11. Misturarporinversão12. AgitarfortementeàmãoparapartirDNAcromossomal.13. Centrifugar5minutosnamicrocentrífuga.14. Pipetar400μLdesobrenadantelímpido(seminterfacenemprecipitadosobrenadante).15. Adicionar250μLdeisopropanol.16. Repousar10minutosàtemperaturaambiente.17. Centrifugar20minutosnamicrocentrífuga.18. Decantar.19. Lavaroprecipitadocometanolpuro.20. Centrifugar5minutosnamicrocentrífuga,seosedimentotiversidodescoladodotuboounãoforvisível.21. Decantar,escorreresecar.22. Dissolvercom50μLdeRNAse-mixouTE23. Incubara37°Cdurante30minutos.24. Usar10μLparadigestãocomenzimaderestrição25. Conservarremanescentecongeladoa-20ºCemtubodevidamentemarcado

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 23

7. DIGESTÃOCOMENZIMASDERESTRIÇÃO

Material e Reagentes

¾ SoluçãodeDNAaanalisar¾ Enzimasderestrição:

BamHI(10U/µL)EcoRI(20U/µL)SalI(20U/µL)

¾ Fenol:clorofórmio¾ Tampãodeenzima10X(dofabricante)

Exemplodetampão:- 1MKOAc- 250mMTris/Acetato,pH7,6- 100mMMgOAc- 5mMb-Mercaptoetanol- 100μg/mLBSA

Protocolo Experimental

1. Emmicrotubo,adicionarsequencialmente:a. HB2BOestéril 20,5µL (ad.25µLfinal)1b. SoluçãodeDNA 1µL (1µg)c. T.enzima10X 2,5µL (1Xfinal)d. Soluçãodeenzima 1µL (10Unidades)

2. Misturarnovortex.3. Centrifugarbrevementeparalevartudoparaofundodotubo.4. Incubara37°Cdurante1hora.5. Desproteinizarpelofenol:clorofórmio:

a. Adicionar25µLdefenol:clorofórmio.b. Misturarbem.c. Centrifugar1minutonamicrocentrífuga.d. Pipetarfaseaquosaparanovotubo.

6. Tomar10µLparaanáliseemgel.

1 A quantidade de água a adicionar dependerá do volume de solução de DNA e será a necessária para completar os 25 µL

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8. ANÁLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE

Material e Reagentes

¾ SoluçãodeDNAaanalisar¾ DNAmarcador:lambdaXBstEII¾ TBE10X

890mMTris890mMÁcidobórico20mMEDTApH8,0

¾ AgarosemédiaoubaixaEEO(SigmaTipoIIouV)¾ Brometodeetídio10mg/mL¾ Dye-DNAs(IndicadordeMigração):

25%Ficoll4000,25%OrangeG

Protocolo Experimental

1. Preparaçãodogela. Prepararomoldeparaogel(comopenteinserido)b. Pesaraagarosenecessáriaparabalãoapropriadoaovolumefinal(marcarnobalãoovolumefinal

pretendido)c. Fundiraagarose(0,7%)emcercade90%volumefinal,comáguadestiladad. Arrefeceracercade50°C.e. Adicionar5%deTBE10X(0,5Xfinal).f. Adicionar0,005%Brometodeetídio(0,5µg/mLfinal)g. Completarovolumefinalcomáguadestiladah. Misturareverternomoldei. Deixarsolidificar

2. Colocarogelnoaparelho,“apenas”submersoemTBE0,5X.3. AplicarasamostrasdeDNAcontendo10a20%deDye-DNAs.4. AplicarumaamostradeDNAmarcador(0,5a1µg)5. Procederàseparaçãoeletroforética(75V),atéconvenientemigração.6. VisualizarnotransiluminadorsobluzUV(300a320nm).7. Observarogel8. Registarasbandas(desenhar)9. Fotografarogelcomfiltrovermelhodegelatina.

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9. PREPARAÇÃODEBACTÉRIASCOMPETENTES

Material e Reagentes

¾ E.ColiXL1B

¾ LB10X¾ Tetraciclina1000X:

12,5mg/mLem50%etanol.Conservara–20°C.¾ 100mMCaClB2B(filtraçãoestéril)¾ Glicerol50%(v/v)(filtraçãoestéril)

Protocolo Experimental

1. Inocular10mLdeLB1X(Tetraciclinaopcional)comcolóniadeE.coliXL1B(ouequivalente).2. Incubara37°Csobforteagitação,duranteumanoite.3. Usar2mLdaculturasaturadaparainocular10mLdeLBpré-aquecidoa37°C.4. Incubara37°Csobforteagitaçãoaté0,2UDOa600nm(cercade2X10P

7Pbactérias/mL)-2a4horas.2

5. Arrefeceros10mLdaculturadurante20minutos,embanhodegelo.6. Centrifugar3.000XGdurante15minutosa4°C.7. Decantar.8. Ressuspenderosedimentodebactériasem5mLde100mMCaClB2B.9. Repousar20minutosnogelo.10. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4°C.11. Decantar.12. Ressuspenderosedimentodebactériascom2mLde100mMCaClB2B.13. Adicionar20%deglicerola50%(10%final)14. Repartiralíquotasde500µLpormicrotubos15. Repousardurante1horaa4ºC16. Conservarcongeladoa-80ºC17. Testaraeficáciadetransformaçãocom50µLdebactériascompetentes3

2 Dadas as limitações de tempo, dever-se-á utilizar a suspensão bacteriana fornecida e iniciar o processo a partir do ponto 5) do protocolo. 3 As bactérias competentes poderão ser usadas, sem congelação, imediatamente antes da adição do glicerol.

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 26

10. TRANSFORMAÇÃO

Material e Reagentes

¾ Bactériascompetentes¾ SoluçãodeDNAsplasmídico(pDNA)¾ LB10X¾ Ampicilina1000X¾ PlacasdeAgar/LB/Amp:

Bacto-Agar 7.5gLB10X 50mLHB2BOaté 500mL

Autoclavar,Deixararrefecera50ºC.Adicionar500μLdeAmpicilina1000X.Repartirdeimediatopelasplacasdepetri.

Protocolo Experimental

1. Pipetarparaummicrotubo5µLdesoluçãodepDNA.2. Pipetarparaoutromicrotubo5µLdesoluçãodepDNAdiluídaa1:100.3. Adicionar50µLdebactériascompetentesacadatubo.4. Homogeneizarnovortex.5. Repousar10minutosnogelo.6. Incubara37°Cdurante5minutos.7. Adicionar1mLdemeioLBpré-aquecido(semantibiótico).8. Incubara37°Cdurante1hora.9. Centrifugar1minutonamicrocentrífuga(sobrenadantelímpido).10. Decantar.11. Ressuspenderasbactériasem200µLdemeioLB.12. EspalharuniformementesobreplacadepetricomAgar/LB/Ampatésecar.13. Incubara37°Cemestufaduranteumanoite.14. Observarcrescimento.

Biotecnologia/EngenhariaGenética2019/20 27

11. SELEÇÃODERECOMBINANTESDepoisdeefetuadoumatransformação,váriostiposdebactériaspodemsurgirnaplacadepetri.SendoapenasinteressantesasbactériastransformadascomoDNApretendido,énecessárioeliminareventuaiscontaminantesnãorelacionados,bactériasnãotransformadasoutransformadascomoutrosDNAs

Material e Reagentes

¾ Placasdepetricomcolóniastransformadasisoladas¾ Tubosdeensaiocom5mLdeLB/Amp¾ Palitosesterilizados

Protocolo Experimental

1. Identificarumadúziadecolóniasnaplacacomasbactériastransformadas2. Marcarostubosdeensaioparaidentificaçãodasbactériasaanalisar3. Picarcadacolóniaindividualmentecomumpalito(Nãoremoveratotalidadedacolónia)4. Mergulharopalitonorespetivotubodeensaio5. Incubara37°Cemestufaduranteumanoite,sobagitação.6. Observaraturvaçãodasuspensãobacteriana.7. Tomardecadacultura1,5mLparatuboeppendorf8. ExtrairoDNAplasmídicopelatécnicadaMINIPREP9. Analisarpeloprocessoadequado

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12. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–INDUÇÃODAEXPRESSÃOApartirdecolóniadebactériatransformada,queexprimaumaproteínarecombinante,extraireanalisaremgeldeeletroforeseosperfisproteicosdabactériainduzidaenãoinduzida.

OsubclonepCS938.15éumsistemadeexpressãoemE.coliquecontemasequênciadogeneB646LinseridaajusantedopromotorLacZealinhadacomocodãodeiniciaçãoATG.Estesistemainduzidocomumanálogodalactose,oIPTG,sintetizaumaproteínacompesomolecularcorrespondenteàp73fundidacomaenzimaGalactosidase(170KDa).

Material e Reagentes

- Bactériarecombinante(pCS938.15)- LB/Amp- IPTG100mM

Protocolo experimental

1. RessuscitarculturadebactériarecombinanteemmeiodeculturaLB/Amp/Agar(sólido)2. Expandirumacolóniaem10mLdemeioLB/Amp(líquido)3. Incubar37ºC,sobagitação,duranteumanoite4. Adicionar4mLdeLB/AMPpré-aquecidoa2erlenmeyersesterilizados5. Inocular1mLdeculturabacterianaacadaerlenmeyer6. Adicionaraumdostubos(INDUZIDO)50µLdeIPTG100mM7. Incubarasduasculturasa37ºCdurante30minutos,sobagitação8. Tomar,decadacultura,para2microtubos,1mLdesuspensão(4tubos)

a. Centrifugar2minutosb. Decantarerejeitarsobrenadantesc. Congelar-20ºCumtubodebactériainduzidaeoutrodebactérianãoinduzida

9. Ressuspenderossedimentosdosoutrostuboscom1,5mLdesalinoa. AvaliareregistaraDOa550nm

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13. ANÁLISEDEPROTEÍNARECOMBINANTE–PAGE

Material e Reagentes

¾ Extratosdebactériarecombinante(pCS938.15)comexpressãoinduzidaenãoinduzida

¾ Acrilamidaa50%(esterilizadaporfiltração)¾ Bisacrilamidaa1,25%¾ Tris1,5MpH8.8¾ Tris1,5MpH6.8¾ SDS10%¾ TEMED10%¾ Persulfatodeamónio10%(extemporâneo)¾ TampãoLaemmli10X:

Tris250mMGlicina1,92MSDS1%pH8.3

¾ Tampãodeeléctrodos:T.Laemmli1X

¾ Tampãodeamostra(2X):Tris125mMpH6.8SDS4%Glicerol20%BME10%Azuldebromofenol0,2%

¾ Soluçãodecoloração:AzuldeCoomassie0,2%Metanol50%Ácidoacéticoglacial10%

¾ SoluçãodediferenciaçãoMetanol10%Ácidoacéticoglacial10%

Protocolo Experimental

Preparação do gel

1. Montaromoldeparaogel2. Preparargeldeseparação–10%acrilamida(emerlenmeyer):

a. Acrilamida50% 12mL4b. Bisacrilamida1,25% 9mLc. Tris1,5MpH8.8 15mLd. SDS10% 600μLe. H2O 22,8mLf. TEMED10% 300μLg. Persulfatodeamónioa10% 300μL

3. Homogeneizarsemintroduzirmuitoar.Verternomolde.4. Adicionarpequenovolumedeáguanasuperfíciedogel(semmisturar)5. Deixarpolimerizar(20a30min)6. Preparargelde“stacking”(emerlenmeyer):

a. Acrilamida50% 750μLb. Bisacrilamida1,25% 800μLc. Tris1,5MpH6.8 625μLd. SDS10% 75μLe. H2O 5,1mLf. TEMED10% 75μLg. Persulfatodeamónioa10% 75μL

7. Removeraáguasobrenadantedogeldeseparação8. Colocaropente.Verterogeldestackingnomolde9. Deixarpolimerizar(10a20minutos)

4 Se as soluções disponíveis de acrilamida e bisacrilamida não tiverem as concentrações que se indicam, as quantidades a usar deverão ser calculadas por forma a que seja usada a mesma quantidade relativa da substância. A compensação do volume final dever-se-á fazer na quantidade de água a usar.

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Electroforese

1. Montarogelnatinadeeletroforese2. Encherascâmarasdoselétrodoscomotampãodeeletroforese3. Prepararasamostrasdeproteínas:4. Medir,paramicrotubo,50μLdesoluçãodeproteína5. Adicionar50μLdetampãodeamostra6. Homogeneizar7. Incubarembanhodeáguaferventedurante10minutos8. Aplicar50μLdeamostraporpoçodogel,registandoalocalizaçãodecadaamostra9. Ligaracorrenteelétrica(70volts)atéaoindicadordemigraçãoseposicionarnofimdogel(5horas)10. Desmontarosistemarecuperandoogel

Coloração das proteínas

1. Mergulharogelemabundantesoluçãodecoloração2. Corardurante30minutoscomagitação3. Passarogelparasoluçãodediferenciação.4. Mergulharemabundantesoluçãodediferenciação5. Diferenciarcomagitaçãoatécontrasteconveniente(mudarsoluçãoquandonecessário)6. Observaremtransiluminadordovisível7. Registarosresultados(desenharasbandas).Fotografar

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14. CROMATOGRAFIADEEXCLUSÃOMOLECULAR

Material e Reagentes

¾ Amostradeproteínaatestar(1mg/mL)¾ Colunadecromatografiade30cmX1cm¾ Agarlavado¾ Sorofisiológico(SF)¾ Microtuboseppendorf¾ Azidadesódio10%

Procedimento experimental

1. Prepararacoluna:a. HomogeneizarasuspensãodeagarlavadocomSFb. Compipetainvertidaencheracoluna(~20cm),semdeixarsecarasuperfície

2. LavaracolunacomtrêsvolumesdeSF3. DeixarescoaraquasetotalidadedoSFsobrenadante(nãodeixarsecar)4. Aplicar2mLdeamostradeproteína5. Deixarescoaraquasetotalidadedaamostra(nãodeixarsecar)6. CarregaracolunacomSFpermanente7. Armazenar,senecessário,sobSFcontendoazidadesódioa0,02%8. Recolheramostrasde1,5mL(20tubos).Marcarmicrotubos9. Revelarapresençadaproteínanasfraçõesrecolhidaspelatécnicade“Dot-Blot”10. LeraDOdetodasasamostrasrecolhidasa280nm.Registar11. Avaliaraconcentraçãoproteicadecadaamostra12. Estabeleceremgráficoacurvadaeluiçãodaproteína

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Registo de observações e Resultados

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR

Operador: Data: ____/____/____

Gráficos

Notas:

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15. DOTBLOT(PROTEÍNAS)

Material e Reagentes

¾ Amostradeproteínaatestaro Lisozima10mg/ml

¾ Papeldefiltro3MM¾ Soluçãocorantedeproteínas

o AzuldeCoomassie0,2%o Metanol50%o Ácidoacéticoglacial10%

¾ Soluçãodiferenciadorao Metanol50%o Ácidoacético10%

Procedimento experimental

1. Preparardiluiçõesdaamostra 1 2 3 4 5 6

Solução de proteína 30 μl Diluição anteriro - 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl SF - 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl 20 μl

Concentração proteica (mg/ml) RESULTADO (+/-)

2. Cortarfragmentodepapel3MM2X5cm3. Marcarposiçõesdaamostracomlápisdecarvão(distânciasde0,5cm)4. Aplicar2 μldecadadiluiçãodeamostra,emsequência5. Deixarsecaraoar6. Prepararcoranteediferenciador

a. 10mldecoranteemplacadepetrib. 2X10mldediferenciadorem2placasdepetri

7. Colocaropapelnasoluçãocorante8. Corardurante5minutoscomagitaçãointermitente9. Descorardurante2X5minutoscomagitaçãointermitente10. Analisareregistarosresultados

Observações

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ANEXOS

EnzimasdeRestriçãoCaracterísticasdasenzimasderestriçãodisponíveisparaarealizaçãodostrabalhoslaboratoriais.

UBamH I

5´...G^GATCC...3´

3´...CCTAG^G...5´

Origem:BacillusamyloliquefaciensH

ReaçãoEnzimática:¾ 150mMNaCl¾ 10mMTris-HCl¾ 10mMMgCl2¾ 1mMdithiothreitol¾ 100µg/mLBSA.¾ pH7.9¾ Incubaçãoa37°C.

Inativaçãopelocalor:Não

UEco RI

5´...G^AATTC...3´

3´...CTTAA^G...5´

Origem:E.coliRY13

ReaçãoEnzimática:¾ 50mMNaCl¾ 100mMTris-HCl¾ 10mMMgCl2¾ 0.025%TritonX-100¾ pH7.5¾ Incubaçãoa37°C

Inativaçãopelocalor:65°CX20minutos

USal I

5´...G^TCGAC...3´

3´...CAGCT^G...5´

Origem:StreptomycesalbusG

ReaçãoEnzimática:¾ 150mMNaCl¾ 10mMTris-HCl¾ 10mMMgCl2¾ 1mMdithiothreitol¾ 100µg/mLBSA¾ pH7.9¾ Incubaçãoa37°C.

Inativaçãopelocalor:65°CX20minutos

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TabelaPeriódica

CarlosSinogas