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PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS POR MEIO DA
INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)
LUIS FONSECA MATOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
FEVEREIRO - 2004
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS POR MEIO DA
INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)
LUIS FONSECA MATOS
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Produção Animal.
Orientadores:
Prof. Dr. Reginaldo da Silva Fontes
Dr. Horst-Dieter Reichenbach
CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ
FEVEREIRO – 2004
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS POR MEIO DA
INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)
Luis Fonseca Matos
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Produção Animal.
Aprovada em 11 de fevereiro de 2004
Comissão examinadora:
___________________________________________________________________ Prof. ª Maria Clara Caldas Bussiere (Doutora, Fisiologia da Reprodução) - UENF
___________________________________________________________________ Prof. Francisco Aloizio Fonseca (Ph. D., Reprodução Animal) - UENF
Dr. Horst-Dieter Reichenbach (Ph. D., Reprodução Animal) - LFL (Orientador)
___________________________________________________________________ Prof. Reginaldo da Silva Fontes (Ph.D., Reprodução Animal) - UENF
(Orientador)
ii
Aos meus pais
DEDICO
iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) e ao
Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento do
curso.
Ao Instituto Bávaro de Pesquisas Agropecuárias (LFL – Alemanha), pela
oportunidade e apoio para a realização das pesquisas.
À Fundação Estadual do Norte Fluminense (FENORTE), ao Serviço
Acadêmico de Intercâmbio Alemão (DAAD) e à Fundação Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão das bolsas
de estudo e intercâmbio.
Ao Instituto Goethe-Mannheim, pelo curso de alemão oferecido e pela
dedicação de seus funcionários aos estrangeiros.
Ao amigo e orientador Reginaldo da Silva Fontes, pela amizade, pelo
constante incentivo e pela credibilidade para realização da tese.
Ao amigo e orientador Dr. Horst-Dieter Reichenbach, pela amizade, pelo
importante auxílio nas dificuldades no dia-a-dia, durante o período de permanência
na Alemanha e pelo apoio no desenvolvimento da pesquisa científica.
Ao professor Angelo José Burla Dias, pela amizade e auxílio na correção da
tese.
À professora Célia Raquel Quirino, pelas orientações nas análises
estatísticas.
iv
Aos técnicos e colegas do Instituto Bávaro de Pesquisas Agropecuárias (LFL
- Alemanha), Myrian Weppert, Sérgio Machado, Christine Fuhrmann, Jördis Semmer,
Dr. Johannes Butikamp e Marc Boelhauve, pela amizade e apoio para a realização
das pesquisas.
Aos amigos, Georg Poettinger e Susi, pela amizade e auxílio nos problemas
do dia-a-dia.
A todos os colegas e professores do curso de pós-graduação, pelo convívio
e amizade.
A todos aqueles que, embora não tenham sido aqui citados, participaram
direta ou indiretamente na realização desta tese.
v
BIOGRAFIA
Luis Fonseca Matos, filho de Maria de Lourdes Fonseca Matos e Rubens
Matos do Couto, nasceu em 10 de novembro de 1974, na cidade do Rio de Janeiro,
RJ.
Concluiu o Curso Técnico de Química pela Escola Técnica Federal de
Campos, em 1992.
Em março de 1993, ingressou no curso de Medicina Veterinária da
Universidade Federal de Viçosa UFV/ MG, diplomando-se em dezembro de 1997.
Em março de 1998, foi admitido no curso de Mestrado em Produção Animal,
na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos
Goytacazes, RJ, obtendo o título de Mestre em Produção Animal em fevereiro de
2000.
Foi admitido, em março de 2000, no curso de Pós-graduação em Produção
Animal, Doutorado, na área de Melhoramento Genético e Biotecnologia da
Reprodução, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos
dos Goytacazes, RJ, submetendo-se à defesa de tese para conclusão do curso em
fevereiro de 2004.
vi
CONTEÚDO
TABELA DE ABREVIATURAS ................................................................................vii RESUMO ....................................................................................................................ix ABSTRACT ................................................................................................................xi
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1 2. REVISÃO DE LITERATURA ..............................................................................3 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................20 4. TRABALHOS ....................................................................................................34
4.1 Preparo de oócito bovino para Injeção Intracitoplasmática de
Espermatozóide ...................................................................................35 4.2 Efeito do pré-tratamento espermático e da ativação oocitária no
desenvolvimento embrionário após a ICSI ..........................................59 4.3 Fertilização e desenvolvimento embrionário após a ICSI em oócitos
bovinos com piezo-manipulador ..........................................................84
5. CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................111
vii
TABELA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de variância
µg Micrograma
µl Microlitro
µm Micrômetro
µM Micromolar
ATAB Brometo de alquiltrimetilamônio
bAML Amelogenina bovina
bp Pares de base
BSA Albumina sérica bovina
CHX Ciclohexamida
CIV Cultivo in vitro
COC Complexo cumulus-oócito
CP Corpúsculo polar
CSF Fator citostático
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
FSH Hormônio folículo estimulante
g Grama
GV Vesícula germinativa
GVBD Ruptura da vesícula germinativa
h Hora
HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico
viii
ICSI Injeção intracitoplasmática de espermatozóide
IP3 Inositol trifosfato
kDa Quilodalton
l Litro
LH Hormônio luteinizante
MAPK Proteína quinase ativada por mitógeno
mg Miligrama
MI, MII Metáfase I, Metáfase II
min Minuto
MIV Maturação in vitro
ml Mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar
mPBS PBS modificado
MPF Fator promotor da meiose
MPM Meio de Parker modificado
ºC Graus Celsius
OCS Soro de vaca em estro
OPU Ovum Pick-up (aspiração folicular guiada por ultra-som)
p34cdc2 Subunidade catalítica do MPF de 34 kDa
PBS Tampão salina-fosfato
PCR Reação de polimerase em cadeia
PIV Produção in vitro
PK Proteinase K
PVP Polivinilpirrolidona
SDS Duodecilsulfonato de sódio
Seg. Segundos
SOF Fluido sintético de oviduto
TALP Tyrode Albumina-Lactato-Piruvato
TAMRA 6-Carboxitetrametilrodamina
TCM Meio de cultivo de tecido
xg Força gravitacional
6-DMAP 6-Dimetilaminopurina
ix
RESUMO
MATOS, Luis Fonseca. D. S., Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro; fevereiro de 2004; Produção in vitro de
embriões bovinos por meio da Injeção Intracitoplasmática de
Espermatozóide (ICSI); Orientadores: Prof. Reginaldo da Silva Fontes e
Dr. Horst-Dieter Reichenbach.
O desenvolvimento e a aplicação de novas biotecnologias da reprodução na
produção animal, com a finalidade de intensificar a propagação de animais
geneticamente superiores, é de grande interesse econômico para a pecuária
brasileira. O congelamento de sêmen e a inseminação artificial têm sido usados
mundialmente nas últimas décadas, devido à sua simplicidade e a ótimos resultados,
como uma forma para a disseminação do potencial genético de machos de alto
valor. A transferência de embriões (TE) e a aspiração folicular (OPU), associada à
produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, também têm sido utilizadas com
sucesso nos últimos anos para a comercialização e propagação do material genético
feminino. Uma técnica alternativa à fertilização in vitro (FIV) convencional é a
Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI), que consiste na injeção de
um único espermatozóide no interior do citoplasma do oócito com o auxílio de
micromanipuladores. A ICSI pode ser utilizada como uma importante ferramenta
para a produção de embriões quando poucos espermatozóides viáveis estão
x
disponíveis ou quando os espermatozóides apresentam baixa capacidade
fecundante, como por exemplo, no caso de sêmen pré-sexado. Outras aplicações da
ICSI incluem a reprodução de espécies em extinção e a produção de animais
transgênicos. Entretanto, diferentemente de humanos e de outras espécies de
mamíferos, não ocorre uma adequada ativação dos oócitos bovinos após a
microinjeção e poucos são os trabalhos que relatam o nascimento de bezerros após
a transferência de embriões bovinos obtidos por meio de ICSI. O presente estudo
teve por objetivo avaliar o efeito de diferentes metodologias de preparo de oócitos,
pré-tratamentos de espermatozóides, protocolos de ativação química de oócitos e
procedimentos de microinjeção no desenvolvimento embrionário após a ICSI em
oócitos bovinos. A taxa de formação de pronúcleos, clivagem e formação de
blastocistos de oócitos desnudados por diferentes protocolos foram comparadas
com aquelas obtidas por meio da FIV convencional. Os resultados do presente
estudo confirmam que, embora o desnudamento dos oócitos seja necessário para a
ICSI, este procedimento influencia negativamente a capacidade de desenvolvimento
dos embriões. Taxas aceitáveis de clivagem e de blastocistos podem ser obtidas
usando pré-tratamentos espermáticos combinados com diferentes protocolos de
ativação oocitária. Entretanto, os efeitos deletérios destes tratamentos no
desenvolvimento embrionário e fetal devem ser investigados em novos estudos. A
avaliação da fertilização por meio da sexagem e análise de microsatélites dos
embriões permitiu concluir que o uso do piezo-micromanipulador fornece taxas mais
altas de fertilização em relação à ICSI convencional, por garantir uma correta
microinjeção do espermatozóide. A viabilidade da produção in vitro de embriões
bovinos por ICSI-Piezo foi demonstrada no presente estudo. Contudo, mais estudos
são necessários para investigar os efeitos dos procedimentos envolvidos (maturação
in vitro, desnudamento e micromanipulação) nos eventos celulares que ocorrem
durante a fertilização, para melhorar os resultados em termos de gestações e
verificar a normalidade dos bezerros produzidos.
Palavras-chave: ativação oocitária, bovino, desnudamento, fertilização in vitro, ICSI,
Piezo-manipulador.
xi
ABSTRACT
The development and application of new biotechnologies of reproduction in
the animal production to improve the propagation of genetically valuable animals is of
great economic interest to Brazil’s cattle industry. Semen cryopreservation and
artificial insemination have been used worldwide in the last decades, due its
simplicity and excellent results, as a way to disseminate the genetic potential of
valuable male animals. Embryo transfer (ET) and ovum pick-up (OPU) associated to
the in vitro production technique (IVP), have been commercially applied with success
in the last years to the propagation of genetic material of superior females. An
alternative technique to the conventional “in vitro fertilization method” (IVF) is the
Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI). This technique consists of injecting only
one sperm inside the oocyte cytoplasm using micromanipulators. The ICSI can be
applied as an important tool to embryo production when only few viable sperms are
available or sperms shows low fertilization capacity, as for example, the ones derived
from sexed semen. Other applications include the dissemination of endangered
species and the production of transgenic animals. However, differently from human
beings and other mammals species, an adequate activation usually does not occur
following sperm microinjection into bovine oocytes, and there are only few reports of
calves born after transfer embryos obtained by ICSI. The aim of the present study
was to evaluate the influence of different methods of oocyte preparation, sperm
pretreatments, chemical activation protocols and microinjection procedures on
embryo development after ICSI into bovine oocytes. The pronuclei formation results
xii
and the cleavage and blastocyst rates with different denudation protocols were
compared to those of conventional IVF using denuded oocytes. The results of the
present study confirm that although the denudation is essential for ICSI, this
procedure negatively influences the embryo developmental capacity to blastocysts.
Acceptable cleavage and blastocyst rates could be obtained by sperm pretreatments
combined with different oocyte activation protocols. However, deleterious effects of
treatments on the embryonic and fetal development should be investigated in further
studies. The evaluation of the oocyte fertilization by embryo sexing or by
microsatellite analysis allowed us to conclude that the use of the piezo-
micromanipulator to the microinjection permits higher fertilization rates in comparison
to the conventional method, as a result of a correct sperm injection procedure. The
viability of in vitro production of bovine embryos by piezo-ICSI was showed in the
present study. However, further studies are necessary to investigate the effects of the
involved procedures (in vitro maturation, denuding and micromanipulation) on the
cellular events that occur during fertilization, in order to improve the results of
pregnancies and to verify the normality of produced calves.
Key words: bovine, denudation, ICSI, in vitro fertilization, oocyte activation, Piezo-
micromanipulator
1
1. INTRODUÇÃO
A fertilização in vitro (FIV) de oócitos bovinos é uma metodologia
estabelecida há alguns anos, com o nascimento do primeiro bezerro oriundo de FIV
em 1981, a partir de sêmem capacitado in vivo (Brackett et al., 1982). Já o
nascimento do primeiro bezerro a partir da maturação, fertilização e cultivo in vitro
(MIV, FIV e CIV) ocorreu em 1987 (Fukuda et al., 1990).
A produção de embriões in vitro (PIV) é uma biotecnologia que permite a
intensificação do uso de animais de alto valor genético. Alguns estudos têm
demonstrado a viabilidade do emprego da PIV em combinação com a aspiração
folicular guiada por ultra-som (OPU), com resultados comparáveis ou superiores
àqueles obtidos pela tecnologia tradicional de transferência de embriões (Kruip et
al., 1994, Troppmann, 2000; Merton et al., 2003). Contudo, as taxas médias de
blastocistos obtidos in vitro ainda não atingiram valores ideais para que esta
biotecnologia seja utilizada mais intensamente de forma comercial, devendo-se
levar em consideração que a qualidade e a viabilidade dos embriões obtidos por PIV
são inferiores a dos embriões obtidos in vivo (Reichenbach, 2003).
Uma técnica alternativa à FIV convencional é a Injeção Intracitoplasmática
de Espermatozóide (ICSI), que consiste na injeção de um único espermatozóide no
interior do citoplasma do oócito com auxílio de micromanipuladores, visando à sua
fertilização.
2
Em 1976, Uehara e Yanagimachi relataram que células espermáticas
humanas desenvolviam-se em pronúcleo masculino quando injetadas no citoplasma
de oócitos de hâmster. A partir de então, o nascimento de diversas espécies de
mamíferos por meio da ICSI tem sido relatado, incluindo coelhos (Hosoi et al.,
1988), camundongos (Kimura e Yanagimachi, 1995; Kuretake et al., 1996), suínos
(Martin, 2000; Probst et al., 2002), ovinos (Catt et al., 1996), eqüinos (Cochran et al.,
1998), primatas não-humanos (Hewitson, et al., 1999), humanos (Palermo et al.,
1992) e bovinos (Goto et al., 1990; Hamano et al., 1999; Horiuchi et al., 2002; Wei e
Fukui, 2002).
Uma vez que a ICSI permite o uso de espermatozóides imóveis, de baixa
capacidade fecundante ou disponíveis em número limitado (Heuwieser et al., 1992b),
esta técnica poderá ter grande aplicabilidade na reprodução da espécie bovina para
a FIV com espermatozóides pré-sexados (Hamano et al., 1999), na maximização do
uso de sêmen de alto valor (Oikawa et al., 2001) e para a produção de animais
transgênicos.
Devido à interdependência das diferentes etapas laboratoriais e da
variabilidade dos resultados da ICSI, o progresso desta tecnologia depende da
compreensão dos eventos celulares seguintes à introdução do espermatozóide,
como a ativação oocitária, a participação das estruturas espermáticas no processo
de fertilização e os fatores reguladores das divisões celulares iniciais, para que se
possa aumentar o número de embriões viáveis ao final do processo.
O presente estudo teve por objetivo identificar os métodos e tratamentos
mais adequados para a fertilização in vitro de oócitos bovinos por meio da ICSI,
visando a obter uma elevada taxa de embriões após o cultivo in vitro.
3
2. REVISÃO DE LITERATURA
Maturação oocitária
A maturação representa o estádio final da preparação do oócito para a
fecundação,no qual o oócito progride do estádio de Diplóteno a Metáfase II.
Mudanças estruturais e bioquímicas que ocorrem durante esse período são
necessárias para que o processo seja completo. O oócito completa a Meiose em
resposta ao pico pré-ovulatório de LH (Callesen et al., 1986) ou em decorrência de
sua remoção do folículo (Pincus e Enzmann, 1935).
A maturação oocitária pode ser dividida em maturação nuclear e maturação
citoplasmática, que devem ocorrer simultaneamente e que conferem aos oócitos a
capacidade de serem fecundados e ao mesmo tempo, realizarem o bloqueio da
polispermia durante a fertilização (Dode et al., 2000).
Os eventos nucleares iniciam-se com o rompimento do envoltório do núcleo
do oócito (quebra da vesícula germinativa – GVBD), quando o envelope nuclear e
sua porção interna, a rede fibrilar da lâmina, começam a se dissolver. Então, os
cromossomos condensam-se e os cinetócoros aparecem, com os microtúbulos
formando a placa metafásica da MI. A separação dos cromossomos homólogos e a
sua migrgação para os respectivos pólos ocorrem durante a Anáfase I. Durante a
telófase I, os cromossomos que se encontram em cada pólo são recobertos pela
membrana nuclear. A segunda divisão meiótica sem a replicação dos cromossomos
ocorre imediatamente e o oócito atinge a metáfase II (Kubelka et al., 1988).
4
Durante a maturação, também ocorrem importantes mudanças na
organização citoplasmática, tais como um contínuo desenvolvimento dos estoques
de lipídios, redução do aparelho de Golgi, aparecimento de vários ribossomos
adjacentes aos cromossomos, rearranjo das mitocôndrias e alinhamento dos
grânulos corticais próximos à membrana plasmática (Dieleman et al., 2002).
Fertilização e ativação oocitária
A ativação oocitária compreende a retomada da meiose desencadeada pela
fusão e penetração do espermatozóide durante a fertilização, resultando no
processo final da fertilização pela extrusão do segundo corpúsculo polar e formação
dos pronúcleos masculino e feminino (Rüsse e Sinowatz, 1991).
Durante a fertilização, o espermatozóide promove uma onda de
despolarização da membrana plasmática do oócito de mamíferos em MII, que leva a
uma alteração de sua permeabilidade com troca de Na+ extracelular por íons H+
intracelular. Estas mudanças estão relacionadas ao aumento intracelular dos íons de
cálcio livres (Ca+2), em uma série de picos, que têm um importante papel no
processo de ativação oocitária (Sun et al., 1992).
Duas hipóteses têm sido propostas para explicar o mecanismo pelo qual o
espermatozóide inicia a oscilação de Ca+2 (Whitaker e Swann, 1993). A primeira
hipótese sugere a presença de um receptor espermático na membrana plasmática
do oócito. Este receptor é postulado de ser um receptor G-proteína ou um receptor
tirosina-quinase acoplado a uma fosfoinositidase que, por sua vez, estimula a
produção de inositol-1,4,5-trisfosfato (IP3), um composto liberador de Ca+2. A
segunda hipótese propõe que o espermatozóide introduz no oócito, após a fusão
com a membrana, um fator solúvel que inicia as oscilações de Ca+2. Foi
demonstrado que a injeção de extrato de espermatozóide de várias espécies em
oócitos de mamíferos induz a ocorrência de repetidos picos de Ca+2, que são muito
próximos àqueles associados à fertilização (Swann, 1990, 1994; Wu et al., 1997).
Os eventos desencadeados pela ativação oocitária incluem a exocitose de
grânulos corticais, o decréscimo da atividade da histona H1-quinase, o reinício da
meiose, a extrusão do segundo corpúsculo polar, a formação de pronúcleos, a
síntese de DNA e a clivagem para o estádio de duas células (revisto por Mayes,
2002).
5
A mobilização de cálcio intracelular é seguida de um influxo do ambiente
extracelular. O cálcio promove modificacões das proteínas do oócito por estimulação
das vias de fosforilação, de desfosforilação ou por ativação de proteases. Cada
parte do ciclo celular é regulado pela ligação e subseqüente ativação de uma
proteína quinase, específica para uma ciclina complementar correspondente.
Os oócitos ovulados ou maturados in vitro encontram-se na sua maioria em
metáfase da segunda divisão meiótica (MII). Os oócitos são mantidos em MII pelo
MPF-Fator promotor da maturação (um dímero composto pela Ciclina B e pela
quinase p34cdc2) e por níveis elevados do CSF (Fator Citostático) (Motlik et al.,
1996). O fator citostático compreende diferentes componentes, entre eles a Proteína
c-mos ou a MAP-quinase (proteína associada a mitógeno). O aumento transitório de
cálcio intracelular, que ocorre seguindo a fertilização, promove a ativação da
calmodulina-quinase pela estimulação da calmodulina, resultando na destruição da
ciclina B e no decréscimo na atividade da quinase MPF, fazendo com que o oócito
saia da metáfase (Yang, 1994; Whitaker, 1996).
Descondensação espermática e formação de pronúcleos
Após a penetração do espermatozóide no citosplama do oócito, inicia-se a
descondensação do DNA e ocorre o aumento do volume da cabeça pela entrada de
líquido, desenvolvendo-se o pronúcleo masculino. Acredita-se que a
descondensação do espermatozóide esteja intimamente relacionada com o ciclo
celular do oócito e com o conteúdo de determinados fatores, sendo sugerida a
existência de um fator oocitário promotor da descondensação do núcleo do
espermatozóide (Sperm nuclear swelling factor - SNDF) (Ohsumi et al., 1986,
Dozotsev et al., 1997).
Após a extrusão do segundo corpúsculo polar, é formado, no oócito, o
pronúcleo feminino, com um conjunto haplóide de cromossomos. Possivelmente,
existem diferentes fatores para a formação do pronúcleo feminino e masculino
(Chian et al., 1992; Dorzotsev et al., 1995). Com a fusão dos dois pronúcleos e a
duplicação dos cromossomos maternos e paternos na placa equatorial, completa-se
o último processo da fertilização, dando início às divisões celulares para o
desenvolvimento embrionário inicial (Rüsse e Sinowatz, 1991).
6
Aplicações da ICSI
Reprodução assistida em medicina humana
Em humanos, a ICSI tem sido utilizada para o estudo básico dos eventos
celulares decorrente da interação de gametas durante a fertilização (Perreault et al.,
1988; Goto et al., 1990; Dorzotsev et al., 1997) e para pesquisas aplicadas, com
bons resultados no tratamento de subfertilidade masculina. Em 1992, Palermo et al.
obtiveram 5 gestações e o nascimento de 4 crianças após a transferência de
embriões produzidos por ICSI. Em média, taxas de fertilização em procedimentos de
rotina de ICSI em humanos situam-se em 70 %, aproximadamente (Payne et al.,
1995).
Intensificação do processo de produção de embriões in vitro
A ICSI pode ser empregada como uma importante ferramenta para a
produção in vitro de embriões de mamíferos. Uma grande vantagem da ICSI reside
na possibilidade de permitir o uso de espermatozóides que não seriam capazes de
fertilizar o oócito pela FIV convencional. A ICSI pode desta forma ser utilizada
quando um pequeno número de espermatozóides está disponível ou quando estes
se apresentam imóveis, sem cauda ou com lesões de membrana (Parrish et al.,
1986; Goto et al., 1991, 1993; Catt et al., 1996; Hamano et al., 1999).
A ICSI também torna possível a utilização de gametas masculinos em
estádios iniciais de desenvolvimento. O uso de espermátide ou núcleo de
espermátide para produção de blastocistos por meio da ICSI foi descrito em
algumas espécies de animais domésticos como camundongos (Kimura et al., 1998),
hâmster (Ogura e Yanagimachi, 1995), suínos (Kim et al., 1999) e bovinos (Goto et
al, 1996).
Associada à punção folicular (OPU) guiada por ultra-som para a produção in
vitro de embriões bovinos, a ICSI poderá ser utilizada como uma alternativa para que
sejam alcançadas altas taxas de desenvolvimento embrionário (Oikawa et al., 2001).
Além disso, a ICSI pode trazer aplicações promissoras no campo da reprodução de
animais em risco de extinção, onde a fertilização in vitro ainda não foi estabelecida
para a obtenção de bons resultados.
7
Contudo, na literatura, há relatos de que as taxas de clivagem e de
desenvolvimento embrionário de oócitos bovinos microinjetados são mais baixas que
as de outras espécies. Taxas de fertilização sem ativação química dos oócitos são
particularmente altas em humanos (40 a 70%) (Devroey et al., 1994; Lundin et al.,
1994), mas inferiores a 20% em alguns trabalhos realizados na espécie bovina
(Westhusin et al., 1984; Keefer et al., 1990; Goto, 1993). Assim, em contraste à
reprodução assistida em humanos, a ICSI em bovinos ainda não alcançou aplicação
prática, devido à baixa eficiência na produção de gestações e nascimentos por meio
desta técnica em relação à FIV convencional.
Produção de animais com sexo pré-determinado
Técnicas de separação espermática em frações enriquecidas em
espermatozóides X ou Y (Cran et al, 1995; Merton et al, 1997, Rens et al., 1998;
Johnson e Welch, 1999) vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos, porém os
resultados até então obtidos têm sido insuficientes para a rotina na inseminação
artificial ou na fertilização in vitro, uma vez que parte dos espermatozóides sofre
perda da capacidade fecundante durante o processo de separação.
A associação da ICSI com a sexagem de espermatozóides também tem sido
objeto de estudo em bovinos, podendo vir a ser uma alternativa promissora para a
produção in vitro de embriões sexados de animais domésticos (Medvedev et al.,
1997; Hamano et al., 1999; Seidel et al., 1999). O controle da razão de nascimento
entre machos e fêmeas, obtendo-se animais de sexo selecionado de acordo com as
necessidades produtivas de cada setor, contribuirá para a intensificação do processo
de melhoramento genético ou produção comercial.
Produção de animais transgênicos
A ICSI tem sido aplicada com sucesso na produção de animais transgênicos
como camundongos (Perry et al., 1999), sendo o espermatozóide utilizado como o
carreador de fragmentos de DNA exógeno. Neste caso, o espermatozóide é tratado
para permeabilização da membrana por meios físicos ou químicos, antes da
incubação com plasmídeos de DNA, sendo as cabeças isoladas de espermatozóides
microinjetadas junto com o DNA exógeno para a fertilização dos oócitos (revisto por
Gandolfi et al., 2000).
8
Situação atual da ICSI em bovinos
Diferentemente de outras espécies, a ICSI com espermatozóides bovinos
raramente leva à sua descondensação e formação de pronúcleo durante o
subseqüente cultivo in vitro (Westhusin et al., 1984; Perreault et al., 1988; Catt e
Rhodes, 1995). Atualmente, pouco se sabe sobre os eventos celulares que ocorrem
no processo de fertilização de oócitos bovinos para que ocorra o correto
desenvolvimento embrionário após a ICSI. Até o momento, conforme a literatura
disponível, somente quatro trabalhos relatam o nascimento de bezerros após a
transferência de embriões bovinos obtidos por meio de ICSI (Tabela 1).
Tabela 1. Nascimento de animais após a transferência de embriões obtidos por meio da ICSI em oócitos bovinos
Referência: Blastocisto/ oócito
injetados (%)
Embriões /
receptoras
Taxa de
gestação (%)
Nº animais
nascidos.
Goto et al., 1990 9/ 115 (8) 2-4/ receptora 2/ 3 (67) 2
Hamano et al., 1999 63/ 909 (7) 48/ 48 10 / 48 (21) 10
Horiuchi et al., 2002 70/ 491 (14) 10/ 10 5/ 10 (50) 5
Wei e Fukui, 2002 54/ 238 (23) 8/ 7 4/ 7 (57) 5
Fatores que podem influenciar os resultados da ICSI
Inúmeros fatores podem afetar diretamente os resultados da ICSI, uma vez
que esta técnica envolve uma intensa manipulação dos oócitos, com constantes
mudanças de meio, deixando-os mais expostos a variações de pH e de temperatura.
Além disso, uma série de eventos que ocorrem durante a fertilização convencional,
necessários para a capacitação espermática, reação acrossomal, penetração do
espermatozóide e ativação dos oócitos bovinos, não ocorrem quando se realiza a
microinjeção do espermatozóide e, por isso, alguns procedimentos laboratoriais são
realizados na tentativa de simular tais eventos artificialmente.
9
Condições de maturação dos oócitos
Sabe-se que o tipo de maturação (in vivo vs in vitro) tem efeito direto na
competência dos oócitos para a FIV (Greve et al., 1987). Leibfried-Rutledge et al.
(1987) observaram que a formação de pronúcleo masculino foi significativamente
menor em oócitos maturados in vitro (69%) quando comparados com oócitos
maturados in vivo (88%). Da mesma forma, oócitos maturados in vivo são mais
facilmente ativados do que oócitos maturados in vitro, sem o uso de agentes
estimulantes, após a injeção de espermatozóides imobilizados (Heuwieser et al.,
1992a).
O aumento do tempo de maturação (de 18-22 h para 22-26 h) exerce um
efeito positivo nas taxas de ativação por agentes químicos ou de clivagem dos
oócitos fertilizados in vitro (Presicce e Yang; 1993; Shi et al., 1993). Esta maior
facilidade de ativação dos oócitos maturados por mais tempo estaria relacionada a
um “envelhecimento” do oócito, o que levaria a uma redução da atividade do MPF.
Contudo, com o aumento do período de maturação para 26 a 32 horas, podem
ocorrer danos ao citoesqueleto, que comprometem o posterior desenvolvimento
embrionário (Presicce e Yang, 1993; Chian et al., 1992).
A composição do meio utilizado para a maturação in vitro também é de
grande importância para que os oócitos venham adquirir competência para a
fertilização e desenvolvimento a blastocisto. Fatores químicos relacionados à
ativação oocitária e formação de pronúcleos são sintetizados no citoplasma do
oócito ou transferidos pelas células do cumulus durante a maturação (Mori et al.,
2000). Um exemplo dessas substâncias essenciais para os eventos celulares que
envolvem a maturação citoplasmática é a glutationa.
A glutationa é um tripeptídeo tiol, com importante papel de agente redutor,
que combate os danos oxidativos de radicais livres presentes no meio (De Matos e
Furnus, 2000). A concentração da glutationa citoplasmática varia de acordo com o
estádio do ciclo celular do oócito, ocorrendo um aumento de sua concentração
durante a maturação e um decréscimo algumas horas após a fertilização (Miyamura
et al., 1995). A concentração de glutationa do oócito pode ser aumentada através da
transferência direta pelas células do cumulus via junções Gap em oócitos de suínos
(Mori et al., 2000) ou pela transferência de compostos tiol como cistina, cisteína ou
beta-mercaptoetanol, que servem de precursores para síntese de glutationa
10
(Yoshida et al., 1993; Caamaño et al., 1996; Abeydeera et al., 1998; De Matos e
Furnus, 2000).
Embora a glutationa presente no interior do ovócito esteja supostamente
envolvida na formação do pronúcleo masculino pela redução de pontes dissulfídicas
do núcleo espermático durante a fertilização (Funahashi et al., 1994; Miyamura et al.,
1995; Sutovsky e Schatten, 1997), não se conhecem os efeitos da sua adição ao
meio de maturação de oócitos a serem submetidos à ICSI.
Preparo dos oócitos para a ICSI
Normalmente, as células do cumulus precisam ser retiradas dos oócitos
após a maturação para que os procedimentos de micromanipulação sejam
realizados de forma mais precisa. Contudo, sabe-se que a remoção das células do
cumulus antes da fertilização in vitro pode afetar negativamente a sua ocorrência
(Sirard, 1988; Hashimoto, 1998; Cox et al. 1993).
O efeito positivo da presença das células do cumulus durante as fases
iniciais de fertilização e de desenvolvimento embrionário in vitro pode ser decorrente
da ação direta no processo de capacitação espermática e reação acrossomal (Fukui,
1990) e da sua ação indireta de redução de radicais livres presentes no meio
(Hashimoto et al., 1998). Portanto, apesar de o processo de fertilização pela ICSI
não requerer a presença das células o cumulus para facilitar a penetração dos
espermatozóides, o método utilizado para o desnudamento pode ter efeitos
deletérios para o desenvolvimento embrionário, seja pela ação das enzimas
empregadas ou pela ação física utilizada para a remoção destas células.
Além do desnudamento, outro procedimento realizado para o preparo dos
oócitos para a micromanipulação é a centrifugação, que visa a tornar o citoplasma
mais claro, permitindo a observação da pipeta e do local de deposição do
espermatozóide durante a ICSI (Chung et al., 2001). Tem sido demonstrado que a
centrifugação tem pouco efeito deletério no desenvolvimento de zigotos (Wall et al.,
1985) podendo, porém, causar a ativação partenogenética dos oócitos quando
realizada a altas velocidades, acima de 10.000xg (Chung et al., 2001).
Os oócitos a serem submetidos à ICSI ou Transferência Nuclear (TN)
normalmente são previamente selecionados pela presença do primeiro corpúsculo
polar (CP) no espaço perivitelínico. A visualização do CP serve para a localização da
11
placa metafásica, seja para a introdução da pipeta para ICSI ou para a remoção do
material genético, no caso da TN (Palermo et al., 1996). A presença do primeiro CP
também serve de parâmetro para avaliação do sistema de maturação in vitro,
entretanto, esta seleção não é uma garantia de que os oócitos apresentam
competência para o desenvolvimento embrionário.
Pré-tramentos espermáticos
Os motivos exatos que levam às diferenças dos resultados na ICSI entre as
espécies não estão totalmente esclarecidos e supõe-se que estejam relacionados
com o grau de condensação dos espermatozóides e/ ou competência oocitária para
a descondensação destes.
Capacitação e reação acrossomal dos espermatozóides para ICSI
A capacitação e a reação acrossomal aparentemente não são processos
essenciais para o desenvolvimento de embriões após a ICSI (Hewieser et al., 1992).
Contudo a utilização de espermatozóides capacitados pode levar a taxas superiores
de fertilização (Westhusin et al., 1984). Componentes espermáticos que pela
fertilização normal não são introduzidos no ooplasma (enzimas acrossomais,
membrana plasmática do espermatozóide) podem prevenir a ativação completa do
oócito (Horiuchi et al., 2002).
Pré-tratamentos físicos de espermatozóides para ICSI
Em bovinos, a cromatina espermática encontra-se altamente condensada,
devido ao maior grau de substituição de histonas por protaminas, que apresentam
maior número de ligações dissulfídicas (Seligman et al., 1991, Katayose et al., 1999).
Foi descrito que o espermatozóide bovino descondensa-se com menor freqüência
quando submetido a agentes redutores em comparação ao espermatozóide de
outras espécies, necessitando de mais tempo para desenvolver-se em pronúcleo
masculino (Quian et al., 1996). A microinjeção em oócitos de hamster rapidamente
conduz à descondensação do núcleo de espermatozóides humanos, de
camundongo, chinchila e hamster, porém espermatozóides de rato e bovinos
descondensam-se mais dificilmente (Perreault et al, 1988).
12
Existem fortes evidências de que, em humanos e em outras espécies de
mamíferos, a ativação oocitária que ocorre nos oócitos microinjetados é mediada por
um fator espermático ativador do oócito (SAOAF), supostamente liberado após o
início da descondensação espermática (Tesarik et al., 1994, Rybouchkin et al., 1995;
Parrington et al., 1996).
A liberação do SAOAF estaria condicionada a danos da membrana
espermática que favoreceriam a sua liberação para o oócito, uma vez que não
ocorre na ICSI a fusão de membrana do espermatozóide e a membrana plasmática
do oócito (Swann et al., 1994). Acredita-se que o espermatozóide bovino tenha o
mesmo fator espermático (SAOAF) que os espermatozóides de outras espécies
(Parrington et al., 1996; Katayose et al., 1999), porém, é possível que a
concentração deeste fator varie entre as células ou que a sua liberação seja de
alguma forma comprometida em bovinos pela ICSI.
Dozortsev et al. (1997) propuseram, entretanto, a existência de um fator de
descondensação do núcleo espermático (SNDF), uma substância presente no oócito
com participação na descondensação do núcleo do espermatozóide após a sua
penetração. De forma semelhante ao mecanismo sugerido para a ação do SAOAF,
foi proposto que a membrana do espermatozóide deveria sofrer uma lesão parcial
antes da microinjeção, para o SNDF entrar em contato com o núcleo do
espermatozóide e, assim, ocorrer a liberação do SAOAF.
Um dos procedimentos mais utilizados para esta lesão é o toque ou a
quebra da cauda do espermatozóide com a pipeta de injeção. Acredita-se que o
espermatozóide móvel também possa causar o rompimento do fuso pela
movimentação da cauda. Devido à facilidade de descondensação dos
espermatozóides humanos e aos bons resultados obtidos por esta técnica, este tem
sido basicamente o tratamento dos espermatozóides mais utilizado quando se
realiza ICSI em oócitos humanos (Dorzotsev et al., 1995a,b).
Outros métodos mais agressivos para a lesão da membrana espermática
também vêm sendo realizados, obtendo-se bons resultados, incluindo a remoção
artificial do acrossoma e da cauda por sonicação (Keefer, 1989; Goto, 1993; Tateno
et al., 2000) e a lesão da membrana espermática por congelamento e
descongelamento antes da injeção (Parrish et al., 1986; Goto et al., 1990; Goto,
1993; Keefer et al., 1990).
13
Agentes químicos para pré-tratamentos de espermatozóides para ICSI
Além dos tratamentos físicos descritos anteriormente, tratamentos dos
espermatozóides com agentes químicos, tais como o ditiotreitol (DTT), também têm
resultado em melhoria das taxas de formação de pronúcleo e de clivagem dos
oócitos microinjetados (Rho et al., 1998a). Do mesmo modo, combinações do DTT
com substâncias de ação detergente, tais como o Triton X-100 ou o
alquiltrimetilamônio (ATAB), também têm sido testadas para aumentar o grau de
descondensação dos espermatozóides, porém com riscos de danos aos
cromossomos paternais (Hamano et al., 1999; Szcygiel e Ward, 2002).
Ativação oocitária
O sucesso da ICSI em bovinos é supostamente dependente da ativação
artificial apropriada do oócitos após a ICSI, uma vez que a microinjeção de
espermatozóide e a estimulação mecânica promovida pela introdução da pipeta de
injeção são insuficientes, em mais de 90 % dos casos, para levar à ativação dos
oócitos bovinos (Keefer et al., 1990).
A ativação de oócitos de mamíferos pode ser induzida por diversos
estímulos, incluindo corrente elétrica (Ware et al., 1989; Prochazka et al., 1993),
extratos espermáticos (Stice e Robl, 1990; Wu et al., 1998), ionóforos de cálcio
(Ware et al., 1989; Chen e Seidel, 1997; Katayose et al., 1999), etanol (Nagai, 1987;
Minamihashi et al., 1993; Horiuchi et al., 2002; Hamano et al., 1999), ionomicina
(Susko-Parrish et al., 1994), ciclohexamida (Yang et al., 1994; Presicce e Yang,
1994), 6-dimetil aminopurina (Fulka et al., 1991) e cloreto de estrôncio (Fraser, 1987;
Leal et al., 2000). Para ser considerado fisiológico, a estimulação do oócito deve
resultar na geração de Ca+2 e dar início a outros eventos associados à ativação.
Substâncias e agentes físicos empregados para a ativação oocitária
Pulsos elétricos
Por meio de pulsos elétricos ocorre uma alteração da permeabilidade da
membrana plasmática do oócito, que gera uma difusão de cálcio extracelular para o
interior do citoplasma. Ocorre, desta forma, um pico único de aumento do cálcio
intracelular, que promove o início da ativação (Zimmermann e Vienken, 1982).
14
Aparentemente, a concentração de cálcio extracelular tem uma grande
influência no aumento de cálcio intracelular induzido por pulsos elétricos, uma vez
que não apenas os parâmetros do campo elétrico, como também do meio
empregado, influenciam a amplitude do pico de cálcio (Fissore e Robl, 1992).
Entretanto, ao contrário de outras espécies animais, as células de bovinos
apresentam-se sensíveis aos pulsos elétricos, e um aumento dos parâmetros
elétricos pode facilmente causar danos ao fuso meiótico, levando a uma separação
anormal da cromatina, com a formação de vários pronúcleos (Soloy et al., 1997).
Etanol
O etanol induz a formação de um único pico de cálcio intracelular, de curta
duração, que promove a destruição do CSF, levando à ativação do oócito (Presicce
e Yang, 1994).
Taxas de ativação da ordem de 25% a 49% e clivagens de 31% foram
obtidas por Stojkovic et al. (1997) quando utilizaram etanol a 7% por 5 min para
ativação de oócitos bovinos. Um aumento da taxa de ativação para 99% foi obtido
por Yang et al. (1991), quando combinaram a ativação com etanol e a posterior
incubação dos oócitos com a ciclohexamida.
Ionóforos de cálcio
Ionóforos de cálcio são substâncias lipossolúveis que se ligam a certos íons,
transferindo-os através da membrana plasmática para o interior do oócito.
Ionóforo de cálcio Ca-I A23187
A molécula do Ca-I A23187 transporta ativamente 2 íons H+ do oócito para o
meio extracelular, gerando ao mesmo tempo uma corrente de íons Ca+2 para o
interior do oócito. Também é produzido um único pico de cálcio, que promove a
ativação de diversos processos proteolíticos dependentes de cálcio, causando a
degradação da ciclina B e a redução da atividade do MPF. Essa ação do Ca-I é
dependente do pH do meio utilizado, como também da concentração extracelular de
íons Ca+2 (Wang et al., 1998).
15
Normalmente, uma estimulação única do pico de cálcio não é suficiente em
oócitos jovens (maturados por 16-20 horas) para inibir uma nova síntese do MPF
(Yang et al., 1994; Wang et al., 1998) e melhores resutados de ativação são obtidos
quando o Ca-I é associado a outras substâncias que inibem a atividade do MPF
como a ciclohexamida (Suttner et al., 2000).
Ionomicina
A ionomicina é um ionóforo de cálcio que, de forma semelhante ao Ca-I,
promove a retomada da meiose. Porém, freqüentemente, a formação dos pronúcleos
e o desenvolvimento posterior são comprometidos por uma baixa estimulação
(Susko-Parrisch et al., 1994). O aumento do número de estimulações com
ionomicina em intervalos de 30 min promovem uma melhor ativação dos oócitos
(Rho et al., 1998a) e a combinação da ionomicina com a 6-DMAP promove altas
taxas de ativação e clivagem (Rho et al., 1998b).
Ciclohexamida
A ciclohexamida (CHX) é uma tetraciclina inibidora da síntese protéica de
células eucarióticas. Ela atua sobre a peptidiltransferase e interrompe a síntese
protéica pela inibição da elongação da cadeia peptídica do ribossomo 80S (Kubelka
et al., 1988; Sirard et al., 1998). Desta forma, uma nova síntese de CSF pelo oócito é
inibida e o MPF permanece inativado (Presicce et al., 1994). Contudo, uma ativação
inicial do oócito com substâncias que promovem a degradação prévia do CSF é
necessária antes da ação da CHX (Yang et al., 1994). A CHX é usada normalmente
por 3 a 5 horas para uma completa inativação do MPF e, aparentemente, a CHX não
inibe a extrusão do segundo corpúsculo polar como ocorre com a 6-
dimetilaminopurina (Soloy et al., 1997), sendo relatados nascimentos de bezerros
normais a partir de oócitos incubados com CHX durante a maturação in vitro (Saeki
et al., 1997)
6-dimetil-amino-purina
A 6-dimetil-amino-purina (6-DMAP) é um inibidor específico da fosforilação
protéica. O mecanismo pelo qual a 6-DMAP causaria a ativação seria pela
desfosforilação do MPF (fator promotor da meiose) ou de sua proteína relevante ou
16
ainda pela inibição da sua fosforilação (Liu e Wang, 1997).
Bons resultados de ativação de oócitos bovinos têm sido obtidos pela
combinação de ionóforo de cálcio ou ionomicina com 6-DMAP, sendo os efeitos
variáveis com o intervalo entre os tratamentos seqüenciais com estas substâncias
(Susko-Parrish et al., 1994; Rho et al., 1998a).
Entretanto, o uso de inibidores protéicos para a ativação oocitária pode
causar alterações do fuso meiótico, impedindo a extrusão do segundo corpúsculo
polar ou a singamia, acarretando alterações do cariótipo (King et al., 1988; Rho et
al., 1998b; Fukui et al., 1992; Winger et al., 1997).
Outras substâncias
Também é possível realizar a ativação dos oócitos com sais de estrôncio
(Sr+2). Em camundongos, Sr2+ induz respostas que são indistinguíveis daquelas
correspondentes às induzidas por Ca+2. O´Neill et al. (1991) também relataram que
meios de cultivo suplementados com Sr2+ têm boa capacidade de induzir a ativação
de oócitos ovulados de camundongos, com bom potencial de desenvolvimento dos
embriões partenogênicos. Leal et al. (2000) descreveram recentemente o uso de
estrôncio na ativação de oócitos bovinos associado a pulsos elétricos.
Outra alternativa de ativação exógena, mais próxima aos fenômenos
celulares fisiológicos, é a injeção de fatores espermáticos que induzem a ativação. A
injeção de preparados de espermatozóides dentro de oócitos de mamíferos mostrou
desencadear oscilações de cálcio, muito similares àquelas resultantes do processo
de fertilização. Wu et al. (1998) demonstraram que a injeção de frações
espermáticas também resulta em oscilações de cálcio capazes de iniciarem a
ativação oocitária normal.
Técnica de microinjeção
Um dos fatores mais importantes para o sucesso da ICSI é o método de
microinjeção do espermatozóide. O procedimento de microinjeção deve ser eficiente,
garantir uma alta taxa de sobrevivência dos oócitos injetados, com uma correta
deposição do epermatozóide no interior do oócito e ser de execução simplificada.
Diferentes meios de micromanipulação foram avaliados com relação aos
seus efeitos nos resultados da ICSI. Keefer et al (1990) não encontraram diferenças
17
quanto ao uso do meio TCM199-Hepes em relação ao meio Ham F10-bicarbonato.
A introdução de determinadas substâncias químicas, juntamente com o
espermatozóide no momento da ICSI, é outro ponto importante de discussão. A
polivinilpirrolidona (PVP) é uma substância comumente utilizada nos trabalhos de
ICSI para o preparo da suspensão de espermatozóides a serem microinjetados. A
PVP promove um aumento da viscosidade do meio, causando uma redução da
motilidade dos espermatozóides, para que estes possam ser aspirados ou
imobilizados pela pipeta. Além disso, a PVP reduz a aderência dos espermatozóides
nas paredes da pipeta, facilitando o procedimento de aspiração e deposição do
espermatozóide no oócito.
Acredita-se que a PVP não causa alterações celulares ou danos aos
cromossomos. Entretanto, foi comprovado que a PVP pode causar uma
estabilização da membrana do espermatozóide, o que afetaria a taxa de formação
de pronúcleo masculino ou ainda, quando injetada em maior quantidade, formar uma
gota ao redor do espermatozóide, isolando-o no interior do oócito e impedindo o seu
contato com substâncias do citoplasma do oócito, responsáveis pela sua
descondensação (Dorzotsev et al., 1995).
A temperatura na qual se realiza a micromanipulação também pode ter
efeitos significativos nos resultados da ICSI, principalmente com relação à taxa de
sobrevivência dos oócitos. Kimura e Yanagimachi (1995) concluíram que a redução
da temperatura do meio, que contém os oócitos durante a micromanipulação,
diminuiu a taxa de degeneração após a ICSI com um Piezo-micromanipulador em
oócitos de camundongos. Estes autores observaram que temperaturas de 25-37ºC
resultavam na formação de uma evaginação da membrana durante a retirada da
pipeta de injeção, o que causava a degeneração por perda de líquido e extrusão do
citoplasma. Temperaturas de 17-18ºC aumentavam a viscosidade do citoplasma do
oócitos, reduzindo a evaginação e permitindo um fechamento mais rápido do orifício
feito pela pipeta.
Na ICSI, é necessário posicionar o oócito com a pipeta de manutenção de
forma que o primeiro corpúsculo polar fique na posição “6 ou 12 horas”. Assim, evita-
se que a pipeta cause lesão à placa metafásica, uma vez que esta encontra-se na
maioria das vezes na região subjacente ao CP, o que causaria um distúrbio na
extrusão do segundo corpúsculo polar (Kimura e Yanagimachi , 1995; Payne, 1995).
18
Este é um procedimento corriqueiramente utilizado na maioria dos trabalhos de ICSI
(Payne et al., 1995).
Uma alternativa desse método descrita em humanos, quando se suspeita de
fragilidade da membrana plamática, é a fixação do oócito com o CP na posição de
9:00 h e a introdução da pipeta na posição 12:00 h, o que reduz a pressão para a
penetração da zona pelúcida. Posteriormente o oócito é girado, de forma que o CP
fique na posição de 12:00 h e a pipeta introduzida na membrana plasmática na
posição de 3:00 h.
O uso de diferentes equipamentos e materiais para a ICSI também tem
demonstrado diferenças nos resultados de sobrevivência e taxas de fertilização dos
oócitos. No método de microinjeção convencional, utiliza-se uma micropipeta de
vidro com um bisel em sua extremidade para facilitar a penetração na zona pelúcida.
Algumas pipetas também são confeccionadas com um afilamento na ponta do bisel,
em forma de “espinho”, para permitir uma maior capacidade de perfuração. Este
afilamento não é indispensável, porém, quando a pipeta não tem uma boa
capacidade de perfuração, os riscos de danos ao oócito são aumentados (Tocharus
et al., 1996). A escolha do diâmetro da extremidade da pipeta varia de acordo com o
diâmetro do espermatozóide da espécie em questão, mas a utilização de pipetas de
diâmetro reduzido proporcionam menores danos aos oócitos.
Para a penetração do citoplasma pela ICSI convencional, é realizada a
aspiração da membrana plasmática pela pipeta de injeção, visando a rompê-la e só
então a pipeta é introduzida mais profundamente para a liberação do
espermatozóide. Contudo, freqüentemente podem ocorrer erros neste procedimento,
causando lesões ao oócito ou uma deposição incorreta do espermatozóide no
espaço perivitelínico, pela falta de ruptura da membrana. Um equipamento
denominado atuador piezo-elétrico foi utilizado por Kimura e Yanagimachi (1995)
para ICSI, permitindo um aumento da taxa de sobrevivência de oócitos de
camundongos de 16% para 80% e da taxa de fertilização de 8% para 80%.
A ação deste equipamento baseia-se no efeito piezo-elétrico, que faz com
que a pipeta avance curtas distâncias (5µl) a uma alta velocidade. Estes pulsos
transmitidos à pipeta de injeção promovem um movimento pontual perfurando a zona
pelúcida e a membrana plasmática, com pouca distorção da célula (Kimura e
Yanagimachi, 1995). Posteriormente, esse equipamento foi empregado na ICSI em
19
humanos e bovinos, resultando em altas taxas de sobrevivência e formação de
pronúcleos, sem necessidade da aspiração do citoplasma para a deposição do
espermatozóide no interior do oócito (Huang et al., 1996; Yanagida et al., 1998;
Horiuchi et al., 2002).
Perspectivas da ICSI
Apesar das dificuldades encontradas para a realização da ICSI em bovinos,
quando em comparação com a ICSI em outras espécies, os resultados desta
tecnologia vêm melhorando nos últimos anos. Estudos básicos dos processos de
fertilização com comparação entre as espécies têm trazido respostas às questões
relacionadas com diferentes resultados obtidos para bovinos.
O processo atual de maturação in vitro dos oócitos a ser selecionados para a
microinjeção, certamente, precisa de modificações para permitir aos oócitos maior
competência para a fertilização e para o desenvolvimento embrionário. A realização
de tratamentos químicos e físicos dos espermatozóides para contornar deficiências
de formação do pronúcleo e a utilização de equipamentos mais eficientes para os
procedimentos de micromanipulação têm tornado os resultados mais satisfatórios.
Entretanto, devido ao grande número de etapas envolvidas, os gametas ainda
permanecem expostos a inúmeros agentes deletérios provenientes dos meios de
manipulação e de cultivo.
Danos moleculares como a fragmentação do DNA, que levariam a
alterações cromossomais e anomalias de compactação da cromatina espermática,
também podem estar relacionados com a baixa taxa de sucesso após a ICSI.
Técnicas capazes de avaliar a qualidade dos gametas, baseadas na integridade dos
espermatozóides e no estádio de maturação e competência dos oócitos, serão de
grande valor para o sucesso da ICSI.
Quando a metodologia da ICSI em bovinos estiver estabelecida, fornecendo
resultados satisfatórios como os da ICSI em humanos, conforme constatamos
atualmente, inúmeras linhas de pesquisa básica e aplicada da reprodução poderão
se beneficiar dessa tecnologia.
20
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34
4. TRABALHOS
4.1 Preparo de oócito bovino para microinjeção de espermatozóide ..............35
4.2 Efeito do pré-tratamento espermático e da ativação oocitária no
desenvolvimento embrionário após a ICSI .............................................59
4.3 Fertilização e desenvolvimento embrionário após a ICSI em oócitos
bovinos com piezo-manipulador ..............................................................84
35
PREPARO DE OÓCITOS BOVINOS PARA INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)
RESUMO
A remoção das células do cumulus dos complexos-cumulus-oócito (COCs) é
um procedimento necessário para a realização de algumas técnicas de
micromanipulação, tais como a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI)
e a Clonagem por Transferência Nuclear (TN). Contudo, este procedimento pode
comprometer os eventos celulares subseqüentes, necessários para o
desenvolvimento embrionário. O presente estudo teve por objetivo comparar os
efeitos de diferentes protocolos de desnudamento dos COCs e de outros
procedimentos empregados para a micromanipulação, tais como a centrifugação e a
seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar, nos resultados da
fertilização in vitro (FIV), visando-se a alcançar altas taxas de desenvolvimento
embrionário in vitro. Na tentativa de melhorar as taxas de formação do pronúcleo e
de blastocistos, os efeitos da adição nos meios de maturação e de fertilização de
substâncias com conhecida capacidade de promover a descondensação in vitro de
espermatozóide, como a glutationa e o ditiotreitol (DTT), também foram avaliados.
Outros procedimentos, como a centrifugação e a seleção dos oócitos apresentando
o primeiro corpúsculo polar, também foram comparados. COCs obtidos de ovários
de matadouro foram maturados in vitro por 18-20 h, com ou sem adição de
glutationa ao meio de maturação, e submetidos a diferentes combinações de
tratamentos enzimáticos e físicos, como o uso da hialuronidase ou tripsina associada
à remoção das células do cumulus com auxílio de uma pipeta ou do vórtex. Outros
procedimentos, como a centrifugação dos oócitos desnudados, a seleção dos
oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar e a incubação com ditiotreitol
(DTT) após a fertilização também foram comparados. Oócitos não-desnudados
serviram como grupo controle. Todos os oócitos foram fertilizados in vitro com
sêmen de um mesmo touro, separado por “Swim-up”, na concentração de 2 x106
espermatozóides/ ml. Os oócitos foram retirados do meio de fertilização 18 h após a
36
FIV e cultivados em fluido sintético de oviduto (SOF) por nove dias. As taxas de
clivagem e de formação de blastocisto foram avaliadas nos dias d3 e d7-d9
(d0=FIV), respectivamente. A avaliação das taxas de formação de dois pronúcleos
mostrou não ter havido diferenças entre os grupos trratados e o grupo controle, com
taxas variando de 49% a 58% (P>0,05). Entretanto, embora a presença das células
do cumulus não seja absolutamente necessária para a fertilização de oócitos
bovinos, o desnudamento dos oócitos reduziu as taxas de desenvolvimento a
blastocisto de 40% do grupo controle para 33% a 14% entre os grupos desnudados.
O protocolo de desnudamento, associando o uso da hialuronidase para a remoção
das células com uma pipeta, mostrou-se um método prático e eficiente em relação
aos demais, fornecendo bons resultados. A adição de glutationa ao meio de
maturação afetou negativamente o desenvolvimento embrionário. Os resultados do
presente estudo confirmam a importância das células do cumulus para se alcançar
bons resultados de produção in vitro de embriões bovinos. Mais estudos são
necessários para a obtenção de elevadas taxas de fertilização e de desenvolvimento
embrionário em sistemas de cultivo sem a presença das células do cumulus.
Palavras-chave: bovino, células do cumulus, desnudamento, fertilização in vitro,
micromanipulação
ABSTRACT
The removal of cumulus cells from cumulus-oocyte-complexes (COCs) is
required for some micromanipulation techniques, such as Intracytoplasmic Sperm
Injection (ICSI) and Cloning by Nuclear Transfer (NT). However, this procedure may
compromise the subsequent cellular events necessary for fertilization and early
embryo development. The aim of the present study was to evaluate the effects of
different COCs treatments and denudation protocols on in vitro fertilization (IVF)
results, in order to obtain higher rates of in vitro embryo development. With the
objective to improve the pronuclei and blastocyst formation rates, the addition to the
fertilization and maturation medium of substances known to promote in vitro sperm
37
decondensation, such as glutathione and dithiothreitol (DTT) were also evaluated.
COCs recovered from slaughterhouse-derived ovaries were in vitro matured (18-
20h), with or without the presence of glutathione, and subsequently submitted to
different combinations of enzymatic (hyaluronidase or trypsin) and physical
treatments (vortexing or pippeting) for cumulus cells removal. Other procedures like
centrifugation, selection of oocytes presenting the first polar body after denudation
and incubation of oocytes with DTT after fertilization were also compared. Non-
denuded oocytes served as control. All oocytes were in vitro fertilized by the standard
method with frozen-thawed swim-up separated sperm (2 x106 spermatozoa/ ml). A
group of selected oocytes were also incubated with DTT after FIV. The oocytes were
removed from the fertilization medium 18 h after FIV and cultured in synthetic oviduct
fluid (SOF) for 9 days. Cleavage and blastocysts rates were recorded on d3 and d7-
d9 (d0=IVF), respectively. Comparison of two pronuclei formation rates showed that
no significant difference occurred among the treated and control groups, with
percentages of 49% to 58% (P>0,05). However, although the presence of cumulus
cells was not absolutely necessary for fertilization, the denudation protocols reduced
the blastocyst formation rates of from 40% (control group) to 33% -14% of the
denuded groups. The denudation protocol involving the use of hyaluronidase
associated to the pippeting of oocytes showed to be more practical and efficient than
the others, providing satisfactory results. Other procedures such as centrifugation or
DTT incubation of oocytes, had no detrimental effects and some cases resulted in
higher developmental rates in comparison to non-treated denuded oocytes. The
addition of glutathione to the maturation medium had negative effects on embryo
development. The results of the present study confirm the importance of the
presence of cumulus cells to achieve high bovine embryo in vitro production results.
Further studies are necessary to obtain higher fertilization and early embryo
developmental rates in culture systems without cumulus cells.
Key words: bovine, cumulus cell, denudation, in vitro fertilization, micromanipulation,
38
INTRODUÇÃO
A partir do nascimento do primeiro bezerro de fertilização in vitro (Brackett,
1982), a tecnologia de produção in vitro de embriões bovinos vem se desenvolvendo
continuamente, abrindo novas perspectivas para aumentar a eficiência reprodutiva a
partir de oócitos obtidos por aspiração direta dos ovários de animais abatidos ou
pela aspiração folicular guiada por ultra-som in vivo (OPU).
O avanço das pesquisas para que gametas e zigotos de mamíferos
pudessem ser mantidos por longos períodos no ambiente extracorpóreo, permitiram
a aplicação de técnicas de manipulação, que visam a contornar deficiências
reprodutivas ou a produção de indivíduos com características pré-determinadas.
Para a realização de algumas técnicas de micromanipulação como a Injeção
Intracitoplasmática do Espermatozóide (ICSI), Transferência Nuclear (TN) e a
produção de animais transgênicos, os oócitos precisam ser submetidos a
procedimentos como o desnudamento, centrifugação e seleção pela presença do
primeiro corpúsculo polar, antes de serem utilizados. O efeito desses procedimentos
no desenvolvimento embrionário dos oócitos micromanipulados é de fundamental
importância para o aumento de eficiência destas técnicas.
Sabe-se que as células do cumulus apresentam importantes funções no
processo de maturação oocitária, seja diretamente pela síntese e transferência de
moléculas para o interior dos oócitos através das “Gap junctions”, da secreção de
fatores solúveis ou ainda pela ação indireta de redução de radicais livres presentes
no meio (Hashimoto et al., 1998). As células do cumulus estão, desta forma,
envolvidas com a maturação citoplasmática necessária para os eventos celulares
que ocorrem na fertilização, tal como a formação do pronúcleo masculino (Sirard,
1988; Hashimoto, 1998; Cox et al. 1993), sendo o processo de maturação in vitro
comprometido pela remoção destas células (Liu et al., 1995; Zhang et al., 1995).
As células do cumulus também têm uma importante participação durante o
processo de fertilização, sendo demonstrado que, in vitro, essas células têm uma
função de selecionar e “atrair” quimicamente os espermatozóides (Chian et al.,
1996), além de induzir a capacitação espermática e a reação acrossomal em
bovinos (Fukui, 1990).
39
O desnudamento dos oócitos é realizado, para que estes possam ser
selecionados, manipulados ou microinjetados, sem que as células do cumulus
dificultem a visualização das estruturas dos oócitos ou venham aderir às
micropipetas (Van Steirteghem et al., 1995). Apesar do processo de fertilização pela
ICSI não requerer a presença destas células para facilitar a penetração dos
espermatozóides, o método utilizado para o desnudamento pode ter efeitos
deletérios para o desenvolvimento embrionário, seja pela ação das enzimas
empregadas ou pela ação física utilizada para a remoção das células (Van de Velde
et al., 1997).
Após a maturação in vitro e o desnudamento, os oócitos a serem submetidos
às técnicas de micromanipulação normalmente também são selecionados pela
presença do primeiro corpúsculo polar (CP) no espaço perivitelínico. A presença do
CP serve como parâmetro da maturação in vitro e, no caso da ICSI, a visualização
do CP é necessária para o posicionamento do oócito, de forma que a pipeta de
injeção penetre no citoplasma sem atingir o fuso meiótico (Van Steirteghem et al.,
1994; Palermo et al., 1996a).
A centrifugação é outro procedimento algumas vezes também empregado
para a ICSI, pois os oócitos bovinos maturados contêm grandes quantidades de
vacúolos e gotas de lipídio que dificultam a visualização da micropipeta no interior do
citoplasma. A centrifugação desloca rapidamente as gotas de lipídio para um dos
lados do oócito, tornando o citoplasma translúcido (Wall et al., 1985; Tatham et al.,
1996, Chung et al., 2001). Tem sido demonstrado que a centrifugação possui pouco
efeito deletério no desenvolvimento de zigotos, uma vez que as gotas de lipídio
redistribuem-se pelo citoplasma logo após a penetração do espermatozóide (Chung
et al., 2001), sendo descritos nascimentos de animais transgênicos provenientes de
oócitos centrifugados (Wall et al., 1985). A centrifugação pode causar, entretanto, a
ativação partenogenética dos oócitos quando realizada a altas velocidades, acima
de 10.000 xg (Chung et al., 2001).
No oócito, o processo de descondensação dos espermatozóides para a
formação do pronúcleo masculino envolve a redução das pontes dissulfídicas das
protaminas por um agente redutor, possivelmente, a glutationa (Calvin et al., 1986;
Perreault et al., 1988). A adição da glutationa ou de seus precursores (cisteamina e
cisteína e cistina), ao meio de maturação ou de fertilização, tem sido objeto de
40
estudo de alguns pesquisadores, na tentativa de aumentar as taxas de formação de
pronúcleo e de fertilização. Contudo, os resultados descritos têm sido contraditórios,
sendo o benefício da presença destas substâncias dependente principalmente da
composição do meio de maturação e da espécie animal envolvida (Yoshida et al.,
1993; Myamura et al., 1995; Sutovsky e Schatten, 1997; Yamauchi e Nagai, 1999).
A adição dessas substâncias, ao meio de maturação de oócitos a serem
micromanipulados, visando um aumento da concentração da glutationa
intracitoplasmática, pode ser uma alternativa para compensar baixas taxas de
descondensação do espermatozóide microinjetado na ICSI.
In vitro, inúmeros agentes redutores também têm capacidade de promover a
descondensação dos espermatozóides, incluindo o ditiotreitol (DTT), protease,
heparina, glutationa, SDS e altas concentrações de sal (Jager et al., 1990). O pré-
tratamento dos espermatozóides para ICSI em oócitos bovinos com DTT tem
resultado em melhores taxas de formação de pronúcleo masculino e de fertilização
(Perreault et al., 1987, Rho et al., 1998; Suttner et al., 2000), apesar da possibilidade
de danos aos cromossomos do pronúcleo paternal (Szcygiel e Ward, 2002).
Uma vez que poucos estudos foram feitos sobre o preparo de oócitos
bovinos para a micromanipulação e o emprego de substâncias químicas para o
aumento da formação de pronúcleos, os efeitos destes tratamentos, na competência
dos oócitos para a fertilização e no cariótipo dos zigotos produzidos, precisam ser
investigados.
O presente estudo teve por objetivo identificar o tratamento mais adequado
de desnudamento e de preparo de oócitos bovinos para micromanipulação visando a
uma elevada taxa de clivagem e ao desenvolvimento embrionário após a fertilização
in vitro.
41
MATERIAL E MÉTODOS
Delineamento experimental
O estudo compreendeu três experimentos. No experimento 1, diferentes
tratamentos enzimáticos e físicos para a remoção das células do cumulus
(desnudamento) e a seleção de oócitos bovinos foram comparados para avaliar os
seus efeitos nas taxas de desenvolvimento embrionário após a fertilização in vitro.
No experimento 2, foram avaliados os efeitos da adição de glutationa ao
meio de maturação, da centrifugação dos oócitos desnudados, da seleção dos
oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar e da incubação dos oócitos com
DTT após a fertilização, com o objetivo de melhorar as taxas de formação de
pronúcleos e o desenvolvimento embrionário dos oócitos desnudados.
No experimento 3, os mesmos procedimentos usados no experimento 2
foram empregados, avaliando-se os efeitos dos tratamentos nas taxas de clivagem e
de desenvolvimento embrionário.
Coleta, seleção e maturação in vitro dos oócitos
Ovários bovinos obtidos de matadouro foram mantidos em uma garrafa
térmica, à temperatura de 30 ºC em solução tampão-fosfato, com pH ajustado 7,4;
contendo 100 UI/ ml de penicilina e 100 UI/ ml de estreptomicina, durante o
transporte até o laboratório. Os folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm, foram
aspirados com uma agulha descartável de 18G, acoplada a um tubo de centrífuga
de 50 ml, utilizando-se uma bomba de vácuo com pressão negativa de 120 mm Hg.
Após o repouso dos tubos por 10 minutos, o sedimento foi transferido para uma
placa de Petri para a recuperação e seleção dos complexos cumulus-oócitos
(COCs).
Foram selecionados COCs, com cumulus compacto, contendo pelo menos
três camadas celulares e com citoplasma de aparência homogênea segundo a
classificação de De Loos et al. (1989). Estes COCs foram lavados por três vezes em
meio de lavagem TCM199 -HEPES/ OCS (TCM-199 com 10% soro de vaca em
estro - OCS) e colocados (20 a 30 oócitos) em 400µl de meio MPM (modified
Parker´s medium), contendo 10% de OCS, 10 µg/ ml de FSH e antibióticos, em
42
placa de 4 poços, sendo o meio coberto com 400 µl de óleo mineral. A maturação foi
realizada em estufa de cultivo em atmosfera umidificada, com 5% de CO2 a 39ºC,
durante 18-20 horas.
Desnudamento e seleção dos oócitos
Após maturação in vitro, os COCs foram incubados em uma gota de 100 µl
de meio de desnudamento (TCM 199-HEPES com 1 mg/ ml de hialuronidase e 10%
de OCS) e passados por repetidas aspirações em uma pipeta de 100 µl para a
remoção das células do cumulus. Os oócitos desnudados foram lavados novamente
em meio de lavagem para remoção de todos os restos celulares e transferidos para
gotas de 20 µl de meio de micromanipulação (TCM199-HEPES acrescido de 4 mg
/ml de BSA), em uma tampa estéril de placa de Petri de 35 mm de diâmetro, sendo
adicionado óleo mineral para cobrir as gotas.
Os oócitos foram examinados sob microscópio óptico invertido, sob aumento
de 400x (Zeiss Axiovert 135). Aqueles oócitos de boa aparência, exibindo o primeiro
corpúsculo polar, foram selecionados utilizando uma micropipeta de vidro com
abertura interna da extremidade de cerca de 150 µm acoplada a um sistema de
micromanipulação (microinjetor CellTram Oil-Eppendorf AG e micromanipulador
TransferMan-Eppendorf AG, Alemanha).
Experimento 1
No primeiro experimento, diferentes métodos de desnudamento foram
avaliados, procurando-se encontrar um método simples e eficiente para a remoção
das células do cumulus. Após maturação in vitro, os oócitos foram submetidos ao
tratamento enzimático com hialuronidase (1 mg/ ml em meio TALP), ou tripsina (0,05
% em meio TALP), associado à remoção mecânica por pipetagem (passando-se os
oócitos por repetidas vezes pela ponteira de uma pipeta de 100µl sob controle
visual) ou com o uso do vórtex (velocidade máxima por 5 min. com MS1 Minishaker,
Fa. Ika Works, Wilmington, USA). Os oócitos desnudados foram lavados em meio
TCM199/ BSA (4 mg BSA/ ml) para remoção de todos os restos celulares e
fertilizados in vitro com ou sem a seleção posterior dos oócitos que apresentavam o
primeiro corpúsculo polar.
43
Para a seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar, os
oócitos foram transferidos para gotas de 15 µl de TCM 199/ BSA + 4mg/ ml, cobertas
com óleo mineral, em uma tampa estéril de placa de petri de 35 mm de diâmetro. Os
que apresentavam boa aparência e o primeiro corpúsculo polar foram selecionados
utilizando uma micropipeta com abertura interna da extremidade de cerca de 150µm
acoplada a um sistema de micromanipulação (TransferMan- Eppendorf AG,
Alemanha), sob microscópio invertido (Axiovert 135, Zeiss Alemanha) com aumento
de 400x. Oócitos não-desnudados foram fertilizados diretamente após a maturação,
servindo como grupo controle.
Experimento 2.
Após a seleção do método utilizando hialuronidase combinada com a
pipetagem dos oócitos para o desnudamento, outros procedimentos foram avaliados
para se tentar melhorar os resultados da produção de embriões in vitro a partir de
oócitos desnudados.
Para se verificar a influência da centrifugação, antes da fertilização, no
desenvolvimento embrionário, oócitos foram centrifugados por cinco minutos a 7.000
xg por 5 min. A centrifugação é um procedimento realizado com o objetivo de
permitir uma melhor visualização da pipeta no interior do citoplasma e também
garantir o local de deposição do espermatozóide no interior do oócito, quando se
realiza a ICSI.
Para se estudar se a adição de glutationa ao meio de maturação promoveria
uma maior taxa de formação de pronúcleo masculino nos oócitos desnudados e,
conseqüentemente, maior taxa de clivagem e desenvolvimento embrionário, um
grupo de oócitos foi maturado separadamente, com a adição de glutationa ao meio
de maturação, na concentração final de 1 mM. Após 18-20 h de maturação, os
oócitos foram desnudados e as etapas seguintes (FIV/ CIV) seguiram como nos
demais grupos.
Experimento 3.
No experimento 3, os mesmos procedimentos usados no experimento 2
foram empregados, avaliando-se entretanto, os seus efeitos nas taxas de clivagem
(dia 3) e de desenvolvimento embrionário (dias 7-9).
44
Preparo dos espermatozóides e fertilização in vitro
Palhetas de sêmen congelado de um touro comprovadamente fértil e com
bons resultados em FIV foram descongeladas em banho-maria a 39ºC, por 30
segundos. Os espermatozóides viáveis foram separados pela técnica de "Swim-up"
por 1 hora em estufa (39ºC) em meio Sp-TALP (Meio de Tyrode com albumina-
lactato-piruvato) acrescido de BSA livre de ácidos graxos (6 mg/ml), penicilamina
(20 µM), hipotaurina (10 µM) e epinefrina (2 µM). A parte superior (0,5 ml) do
sobrenadante foi retirada e depositada em um outro tubo, sendo, em seguida,
centrifugada a 600 xg por 10 min. O sobrenadante foi descartado e uma alíquota de
5µl retirada para determinação da concentração espermática.
Os oócitos maturados foram fertilizados in vitro, com uma concentração
espermática de 2 x 106 espermatozóides/ ml a partir da suspensão de
espermatozóides preparada inicialmente. A fertilização foi realizada em 400 µl de
meio de fertilização (Fert-TALP + 6 mg BSA/ ml), em placas de 4 poços por 18 h em
estufa de cultivo a 39ºC com 5% de CO2.
Incubação dos oócitos fertilizados com DTT
Ainda tentando encontrar um método que proporcionasse uma melhoria dos
resultados da FIV, oócitos foram desnudados, fertilizados e oito horas após o início
da FIV, incubados em TCM/ OCS com 10 mM DTT por 15 min. Após este período de
incubação, os oócitos foram lavados novamente e recolocados em cultivo em Fert-
TALP acrescido de 6mg/ ml de BSA por mais 10 h.
Cultivo dos embriões
Após 8 horas de fertilização, os oócitos fertilizados foram desnudados e
lavados em gotas de 50 µl de meio TCM199 Hepes/ OCS com o auxílio de uma
pipeta de 100 µl, para a remoção das células do cumulus, restos celulares e
espermatozóides que não penetraram. Os oócitos fertilizados foram cultivados por
nove dias, em grupos separados por tratamento, em meio SOF suplementado com
10% de OCS e antibióticos, a 39ºC em atmosfera de umidade saturada, com 5% de
CO2, 5% de O2 e 90% de N2.
45
Avaliação da formação de pronúcleos
Para a avaliação da formação de pronúcleos, os zigotos foram fixados sob
lamínula 18 horas após o início da FIV, utilizando uma solução 3:1 etanol-ácido
acético por 24 horas a 4°C e, posteriormente, corados com 1% de Lacmóide em
45% de ácido acético. Os pronúcleos foram observados sob microscópio de fase
com 400x de aumento e os oócitos classificados como NA (Não-avaliável) ou pela
presença de 1PN (1 pronúcleo), 2PN (2 pronúcleos), 3PN (3 pronúcleos), D-SP
(espermatozóide descondensado) e (ND-SP) espermatozóide não-descondensado.
Avaliação das taxas de clivagem e do desenvolvimento embrionário
Os embriões foram examinados no terceiro dia de cultivo (d3) para o registro
da taxa de clivagem e entre o sétimo e nono dias de cultivo (d7-d9), para o registro
da taxa de formação de blastocisto por grupo.
A
B
Figura 1. Oócitos bovinos desnudados com um pronúcleo (A) e dois pronúcleos (B), após a fertilização in vitro (aumento de 400 x).
46
Análise estatística
Análises preliminares foram realizadas para cada uma das variáveis
estudadas incluindo o efeito de tratamento no modelo estatístico. Quando o
coeficiente de variação (CV) resultante da análise de variância foi alto (CV > 35%),
os dados foram transformados em raiz quadrada e testados novamente.
No modelo da análise final, as diferenças entre os resultados, em
porcentagem do número inicial de oócitos, foram analisadas pelo procedimento
ANOVA, SAS (1998), sendo as comparações entre as médias dos tratamentos
realizadas pelo teste de Duncan. Diferenças foram consideradas significativas
quando P<0,05.
O modelo estatístico empregado para a avaliação do efeito dos tratamentos
na Análise de Variância foi:
Y ijk = µµµµ + αααα i + eijk
Onde:
Y ijk = valor observado para a variável em estudo
µ = média geral
α i = efeito do i-ésimo nível do tratamento no valor observado Y ijk
eijk = erro associado a observação Y ijk
RESULTADOS
O primeiro experimento foi realizado para a avaliação do efeito de diferentes
tratamentos enzimáticos e físicos para a remoção das células do cumulus
(desnudamento) e do efeito da seleção de oócitos nas taxas de desenvolvimento
embrionário após a fertilização in vitro.
Foi observado que a taxa de formação de blastocistos foi significativamente
maior para o grupo controle 47% (P< 0,05), em relação a todos os grupos de oócitos
desnudados, confirmando a importância da presença das células do cumulus no
processo de fertilização.
47
Tabela 1. Efeito do protocolo de desnudamento e da seleção dos oócitos no
desenvolvimento in vitro de embriões bovinos
Tratamento Rep COC (n)
Clivagem d3 (%)
Blastocistos
d7-d9 (%)
Controle 9 228 178 (78)a 107 (47)a
Hialuronidase + vórtex 6 137 84 (62)b,c 28 (21)b
Hialuronidase + pipetagem 6 142 96 (68)a,b 37 (26)b
Hialuronidase + pipetagem + seleção CP 4 111 74 (66)a,b 27 (25)b
Tripsina + vórtex 6 140 84 (60)b,c 25 (17)b
Tripsina + pipetagem + seleção CP 4 92 45 (49)c 19 (21)b
Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05).
Contudo, não houve diferença significativa quanto ao uso do vórtex ou da
pipeta para remoção das células do cumulus, quando os oócitos foram incubados
com hialuronidase em relação à taxa de clivagem (62% vs 68%) ou à taxa de
blastocisto (21% vs 26%), respectivamente (P>0,05). Também não foi observada
diferença nas taxas de blastocistos entre incubação com hialuronidase ou tripsina,
quando as células do cumulus foram retiradas com o vórtex (21% vs 17%,
respectivamente) (P> 0,05).
A seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar não resultou
no aumento das maiores taxas de formação de blastocistos em relação aos demais
grupos, com taxas de blastocisto de 25%, para oócitos desnudados com
hialuronidase + pipetagem e de 21% para o desnudamento com tripsina +
pipetagem.
Apesar de não ter sido encontrada nenhuma diferença significativa entre os
métodos de desnudamento quanto às taxas de formação de blastocistos, os
protocolos envolvendo o uso da hialuronidase + pipetagem resultaram nas maiores
taxas de blastocisto em números absolutos e, devido à sua praticidade de execução,
foi o método escolhido para o desnudamento nos experimentos seguintes.
48
No segundo experimento, os efeitos de alguns procedimentos foram
avaliados na tentativa de melhorar os índices de desenvolvimento embrionário a
partir dos oócitos desnudados e verificar se os procedimentos empregados para a
micromanipulação, tais como a centrifugação e seleção do primeiro corpúsculo polar,
afetariam a fertilização.
Não foram observadas diferenças significativas nas porcentagens de oócitos
apresentando um pronúcleo (7% a 11%) ou de oócitos corretamente fertilizados,
apresentando 2PN (49% a 58%) entre os grupos de oócitos desnudados e o grupo
controle (P>0,05).
Estes resultados indicam que o desnudamento dos oócitos previamente à
fertilização e à centrifugação não tiveram efeitos negativos na taxa de penetração
dos oócitos e na formação do pronúcleo masculino. Entretanto, é interessante notar
que a maturação dos oócitos em presença de glutationa, a incubação em DTT ou a
seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar não elevaram as
taxas de formação de pronúcleos em relação aos demais grupos (P<0,05).
Tabela 2. Efeito dos diferentes métodos de preparo de oócitos para micromanipulação e da adição de substâncias redutoras ao meio de maturação e fertilização nas taxas de formação de pronúcleo (PN) em oócitos bovinos após a FIV
Grupo / tratamento Rep. COC (n)
SA1
(%)
1 PN
(%)
2 PN
(%)
3PN
(%)
DSP2
(%)
NDSP3
(%)
FIV-controle 6 74 22 (30)a,b 7 (8)a 42 (57)a 3 (4)a,b 0 (0)b 0 (0)
Desn. + FIV 5 70 24 (33)a,b 5 (7)a 34 (49)a 4 (6)a 1 (1)b 2 (3)
Desn. + Cent. + FIV 5 68 12 (16)b 8 (12)a 38 (57)a 1 (1)a,b 7 (11)a 2 (3)
Desn. + FIV + DTT 5 73 22 (30)a,b 3 (4)a 40 (55)a 2 (3)a,b 5 (7)a,b 1 (1)
Glu + Desn. + FIV 5 72 19 (26)a,b 8 (11)a 42 (58)a 2 (3)a,b 2 (3)a,b 0 (0)
Desn+ CP+ Cent+ FIV+ DTT 5 73 28 (38)a 7 (9)a 37 (51)a 0 (0)b 0 (0)b 1 (1)
Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05). 1SA: sem alteração (não-fertilizado), 2DSP: espermatozóide descondensado, 3NDSP: espermatozóide não-descondensado. Desn = desnudamento; Cent. = centrifugação; Glu = presença de glutationa no meio de maturação, CP = seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar; DTT = incubação com DTT.
49
A porcentagem de oócitos em que foram encontrados espermatozóides não
descondensados foi inferior a 3% entre os grupos e a taxa de oócitos com
espermatozóides descondensados não ultrapassou a 10% entre os grupos
estudados (Tabela 2).
No experimento 3, os efeitos dos procedimentos realizados anteriormente no
experimento 2 (desnudamento, centrifugação, presença de glutationa no meio de
maturação, seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar e
incubação com DTT) foram avaliados em relação à taxa de clivagem e de formação
de blastocistos.
Não houve diferença significativa nas taxas de clivagem ou de formação de
blastocisto dos oócitos desnudados não-centrifugados (47% e 24%) em comparação
aos oócitos que foram desnudados e centrifugados (47% e 28%) (P<0,05).
A maturação com glutationa, que anteriormente havia resultado na maior
taxa de formação de pronúcleo, resultou, neste experimento, em menores taxas de
clivagem e de formação de blastocisto (40% e 14%), indicando um efeito negativo no
desenvolvimento embrionário, nas condições utilizadas.
Tabela 3. Efeito dos diferentes métodos de preparo de oócitos para micromanipulação e da adição de substâncias redutoras ao meio de maturação e fertilização nas taxas de clivagem e de formação de blastocistos após a FIV
Grupo / tratamento Rep. COC (n)
Clivagem
d3 (%)
Blastocistos
d7-d9 (%)
Controle FIV- não desn. 5 75 59 (79)a 30 (40)a
Desn. + FIV 5 71 33 (47)c,d 17 (24)a,b
Desn. + Cent. + FIV 5 75 36 (47)b,c,d 20 (28)a
Desn. + FIV + DTT 5 81 48 (60)b,c 26 (33)a
Glu + Desn. + FIV 5 79 32 (41)d 11 (14)b
Desn. + CP + Cent + FIV + DTT 5 75 49 (65)a,b 23 (31)a
Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05).
Desn = desnudamento; Cent. = centrifugação; Glu = presença de glutationa no meio de maturação, CP = seleção dos oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar; DTT = incubação com DTT
50
A incubação dos oócitos com DTT, oito horas após o início da FIV, resultou
em altas taxas de clivagem e de formação de blastocisto para os dois grupos: Desn.
+ FIV + DTT (60% e 33%) e Desn. + CP + Cent + FIV + DTT (65% e 31%).
O grupo no qual foram feitos todos os procedimentos para o preparo dos
oócitos (Desn. + CP + Cent + FIV + DTT) resultou na maior taxa de clivagem entre
os grupos de oócitos desnudados (65%; P<0,05), entretanto não foi observado
aumento da taxa de formação de blastocisto em relação ao grupo Desn. + FIV + DTT
(sem seleção dos oócitos) (31 vs 33%, respectivamente, P>0,05).
Apesar de não haver diferenças significativas entre os resultados da FIV de
oócitos do grupo controle (não-desnudados) e alguns grupos de oócitos
desnudados, em número absolutos, os resultados da FIV do grupo controle (79% de
clivagem e 40% de formação de blastocisto) foram superiores a todos os grupos de
oócitos desnudados (Tabela 3).
DISCUSSÃO
A maturação e a fertilização de oócitos desnudados resultam em baixas
taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário (Fukui et al., 1990; Zhang et
al., 1995; Kim et al., 1996; Landin-Alvarenga et al., 1999). Em bovinos, os resultados
quanto à participação das células do cumulus na fertilização são contraditórios.
Embora considere-se que in vivo, as células do cumulus sejam liberadas dos oócitos
dentro de 3 h no oviduto da fêmea bovina (Lorton e First, 1979), elas normalmente
são mantidas durante a maturação e fertilização in vitro nos protocolos
convencionais de produção de embriões in vitro. Cox et al. (1993) relataram que as
células do cumulus aumentam as taxas de fertilização somente quando estão
associadas com os oócitos e Lenz et al. (1982) demonstraram que, em bovinos,
alguns componentes do cumulus facilitam a reação acrossomal.
Os resultados do presente trabalho demonstraram claramente a importância
da presença das células do cumulus durante o processo de fertilização in vitro de
oócitos bovinos. Os oócitos desnudados após a maturação in vitro apresentaram
51
menores taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário que os oócitos do
grupo controle.
Behalova e Greve (1993) sugeriram que a presença das células do cumulus
protege contra a poliespermia, enquanto Hunter e Nichol (1988) relataram que a
condição do oócito e não a presença das células do cumulus, é que importa para a
fertilização monoespérmica.
A variação dos resultados quanto às taxas de poliespermia pode estar
relacionada às condições em que a FIV é realizada, principalmente com relação à
concentração espermática e ao tempo em que os espermatozóides permanecem em
contato com os oócitos (Chian et al., 1995). A taxa de formação de três pronúcleos
não foi superior a 6% para nenhum dos grupos, indicando que a taxa de
poliespermia ou da falta da extrusão do segundo corpúsculo polar aparentemente
não foi aumentada pelos procedimentos empregados.
Diferentemente de oócitos de camundongos, que podem apresentar um
endurecimento espontâneo da zona pelúcida (zona hardening), quando são
desnudados e cultivados reduzindo as taxa de fertilização (De Felici e Saracusa,
1982; Gianfortoni e Gulyas, 1985), os oócitos de bovinos paracem sofrer pouco ou
nenhum efeito de endurecimento da zona pelúcida, quando as células do cumulus
são removidas usando hialuronidase e o pipetagem (Chian et al., 1994; Chian et al.,
1995).
Embora não tenha sido encontrada diferença significativa quanto à taxa de
blastocisto no uso da hialuronidase em relação à tripsina, a hialuronidase permitiu o
desnudamento mais rápido e prático quando se fez a pipetagem, reduzindo
rapidamente a viscosidade do cumulus expandido.
A remoção das células do cumulus pela pipetagem apresentou resultado
melhor que o uso do vórtex, possivelmente por uma ação física menos agressiva
sobre os oócitos, uma vez que a pipetagem é controlada manualmente, com os
oócitos sob observação. A localização da placa metafásica pode ser alterada pelos
procedimentos de desnudamento, como no caso do uso do vórtex, e o corpúsculo
polar não servir desta forma como referência para a introdução da pipeta (Palermo et
al., 1996). Esta seria uma hipótese de como uma ação mecânica causada durante o
desnudamento poderia afetar negativamente o desenvolvimento embrionário.
Em humanos, normalmente o número de oócitos disponíveis para ICSI é
52
bem reduzido, portanto o desnudamento é feito individualmente. Diferentes
concentrações de hialuronidase foram testadas (80 a 760 UI/ ml) com pipetas de
diferentes diâmetros (250 a 1000µm) para redução das taxas de degeneração e
ativação partenogenética causada pela enzima (Van de Velde et al., 1997).
Neste trabalho, optou-se pelo uso de uma pipeta de 100µl, que permite o
desnudamento de um grande número de oócitos (até mais de 200) em uma gota de
50 µl de meio com hialuronidase, de forma simples, rápida e eficiente, com
observação dos oócitos sob uma lupa estereoscópia normalmente utilizada para a
manipulação de embriões.
Não foram encontradas diferenças significativas entre o uso do vórtex e da
pipeta para o desnudamento, porém o uso da pipeta sob controle visual permitiu a
observação da remoção das células, reduzindo o tempo de exposição dos oócitos à
hialuronidase ou tripsina e o acompanhamento individual dos oócitos, garantindo
que todos fossem desnudados.
Apesar da seleção dos oócitos desnudados apresentando o primeiro
corpúsculo polar não ter resultado em taxas de blastocistos mais elevadas em
relação aos grupos de oócitos não selecionados, este processo de seleção é
importante para experimentos que envolvem a micromanipulação, usando-se um
menor número de oócitos, de melhor qualidade, que sofreram o processo de
maturação.
Diferentemente de outros trabalhos que encontraram efeitos positivos da
adição da glutationa ou de seus precursores ao meio de maturação e cultivo
(Grupen et al., 1995; Luvoni et al., 1996), a adição de glutationa no meio de
maturação não promoveu o aumento esperado nas taxas de formação de
pronúcleos. Ao contrário, a adição da glutationa afetou negativamente o
desenvolvimento embrionário no presente trabalho. Estes resultados poderiam ser
explicados pela diferença de composição dos meios, uma vez que a ação da
glutationa seria mais significativa em meios sem soro ou livres de proteína, que
apresentam deficiência nos precursores de glutationa (cisteína e cistina). Kim et al.
(1999) demonstraram que a adição de glutationa ao meio de fertilização apresentou
efeitos que variaram de acordo com o touro utilizado na fertilização e também
conforme a concentração empregada (0,1; 1 e 10mM).
Pelos resultados encontrados neste trabalho, a centrifugação a 7000xg por 5
53
min não afetou a formação de pronúcleos ou o desenvolvimento embrionário após a
FIV. Entretanto, a centrifugação pode causar ativação partenogenética dos oócitos
quando realizada a altas velocidades, acima de 10.000xg (Chung et al., 2001), e
poucos estudos foram feitos sobre os efeitos da centrifugação no cariótipo dos
zigotos produzidos.
A incubação dos oócitos oito horas após a fertilização em 10 mM de DTT
não alterou significativamente as taxas de formação de pronúcleos. Contudo, houve
um aumento em números absolutos das taxas de clivagem e da formação de
blastocistos em relação aos grupos desnudados e não incubados com DTT.
Apesar de não ter sido estatisticamente significante, essa maior taxa de
formação de blastocistos, após a incubação com DTT, pode ser conseqüência de um
efeito redutor do DTT no meio, neutralizando agentes oxidantes e radicais livres
responsáveis por danos às estruturas celulares do oócito. Outras substâncias
redutoras, como o β-mercaptoetanol, também têm sido empregadas em diferentes
ocasiões (MIV, FIV CIV ou transporte) visando à redução de danos oxidativos nos
sistemas de cultivo in vitro, melhorando as taxas de desenvolvimento embrionário,
as taxas de eclosão e a qualidade dos embriões (Takahashi et al., 1996).
CONCLUSÕES
Os procedimentos de preparo dos oócitos bovinos para micromanipulação
como o desnudamento, centrifugação e seleção pela presença do corpúsculo polar
aparentemente não interferiram na penetração do espermatozóide e na formação
dos pronúcleos. Contudo, a clivagem e o desenvolvimento a blastocisto foram
afetadas negativamente, mostrando que, embora a presença das células do cumulus
não seja absolutamente necessária para a fertilização, o desnudamento resulta em
baixas taxas de desenvolvimento embrionário.
O protocolo de desnudamento, envolvendo o uso da hialuronidase associada
à remoção das células com uma pipeta, apresentou-se como um método simples e
eficiente em relação aos demais métodos. A adição de glutationa ao meio de
54
maturação e a incubação dos oócitos em DTT após a fertilização não melhoraram os
resultados da fertilização dos oócitos desnudados. Mais estudos são necessários
sobre como o benefício da presença das células do cumulus pode ser substituído
quando se utiliza oócitos desnudados.
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59
EFEITO DO PRÉ-TRATAMENTO ESPERMÁTICO E DA ATIVAÇÃO DE OÓCITOS
BOVINOS NO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO APÓS A INJEÇÃO
INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI)
RESUMO
A injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) é uma técnica
alternativa para o método de fertilização in vitro (FIV) convencional quando poucos
espermatozóides estão disponíveis ou quando estes apresentam baixa capacidade
de fertilização. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos de diferentes
tratamentos espermáticos e os protocolos de ativação oocitária visando a melhorar a
eficiência da ICSI em oócitos bovinos. Oócitos maturados in vitro e desnudados
foram microinjetados com espermatozóides não-tratados ou pré-tratados. Os pré-
tratamentos consistiram da incubação com DTT, associado ou não com brometo de
alquiltrimetilamônio (ATAB), Triton X-100 ou após a lesão da membrana plasmática
pelo congelamento/ descongelamento sem crioprotetor. Os protocolos de ativação
oocitária envolveram o uso de etanol 7% ou cálcio ionóforo (Ca-I A23187) +
ciclohexamida (CHX) ou ionomicina (Ionom.) + 6-dimetilaminopurina (6-DMAP). As
taxas de formação de pronúcleo, de clivagem e de formação de blastocisto foram
registradas para a comparação dos tratamentos. Para verificar a correta fertilização
dos oócitos injetados, os embriões foram sexados utilizando a técnica de Reação de
Polimerase em Cadeia (PCR). Oócitos fertilizados pela FIV convencional e oócitos
ativados sem a microinjeção serviram de grupo controle. Entre os grupos de oócitos
não-ativados, baixas taxas de clivagem (3% - 5%) e de formação de blastocisto (0% -
1%) foram obtidas, sem efeitos positivos dos pré-tratamentos espermáticos (P>0,05).
A ativação química dos oócitos após a ICSI resultou em maiores taxas de clivagem
(33% - 58%) em relação aos grupos não-ativados (P<0,05), com o protocolo de
ativação com ionomicina + 6-DMAP fornecendo uma maior taxa de formação de
blastocisto em relação aos protocolos com etanol ou Ca-I + CHX (13% vs 3% vs 4%,
respectivamente)(P<0,05). Quando diferentes pré-tratamentos de espermatozóide
foram combinados com a ativação usando ionomicina + 6-DMAP, altas taxas de
60
clivagem foram obtidas (51% - 75%). Entretanto, não foram observadas diferenças
significativas na formação de blastocistos (P>0,05) entre os grupos de oócitos
ativados (não-injetado), injetados com espermatozóide controle e injetados com
espermatozóides pré-tratados, com taxas variando de 9% a 15% (P>0,05). Apesar da
produção bem-sucedida de blastocistos e blastocistos eclodidos por meio da ICSI no
presente estudo, nenhum dos embriões produzidos foi sexado como macho,
sugerindo a ocorrência de uma alta taxa de desenvolvimento partenogenético.
Palavras-chave: ativação oocitária, bovino, fertilização in vitro, ICSI, tratamento
espermático
ABSTRACT
Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) is an alternative technique to the
conventional in vitro fertilization method (IVF), particularly when few sperm cells are
available or when sperm fertilization capacity is low. The present study was carried
out to investigate the effects of sperm pretreatments and oocyte activation protocols
in order to improve the results of ICSI into bovine oocytes. In vitro matured and
denuded oocytes were injected with non-treated (control) or pretreated sperm. Sperm
pretreatments consisted of incubation with dithiotreitol (DTT), alone or associated to
alkyltrimethylammonium bromide (ATAB), Triton X-100 or after membrane damage by
freezing/ thawing without cryoprotector. Chemical activation protocols involved the
incubation with ethanol 7%, calcium ionophor (Ca-I A23187) plus cyclohexamide
(CHX) or ionomycin plus 6-dimethylaminopurine. Pronuclei formation, cleavage and
blastocyst rates were registered to compare the treatments. To verify the correct
fertilization of the injected oocytes, embryos were sexed using the Polymerase Chain
Reaction technique (PCR). In vitro fertilized (conventional IVF) and non-injected
activated oocytes served as control groups. Among the non-activated groups, low
cleavage (3% - 5%) and blastocyst rates (0% - 1%) were obtained, with no positive
effect of the sperm pretreatments (P>0.05). Chemical activation of oocytes after ICSI
allowed higher cleavage rates (33% - 58%) in comparison to the non activated groups
61
(P<0.05), with the activation protocol using ionomicyn + 6-DMAP resulting the higher
blastocyst rate in comparison to the ethanol or CA-I + CHX protocols (13% vs 3% vs
4%, respectively)(P<0.05). When different sperm pretreatments were combined with
activation using ionomycin + 6-DMAP, high rates of cleavage were obtained (51% -
75%). However, no significant difference of blastocyst rate was observed among
activated (non-injected), control sperm and sperm pretreated injected groups, with
rates ranging from 9% to 15% (P>0.05). Despite the successfully production of
blastocysts and hatched blastocysts by ICSI in the present study, none of the
produced embryos was sexed as male, suggesting a high rate of parthenogenetic
development.
Key words: bovine, ICSI, in vitro fertilization, oocyte activation, sperm pretreatment
INTRODUÇÃO
Desde a primeira publicação sobre a Injeção intracitoplasmática (ICSI) em
oócitos de mamíferos por Uehara e Yanagimachi em 1976, a ICSI tem se
desenvolvido como uma técnica de grande interesse em diversos campos da
reprodução.
O nascimento de animais de diversas espécies de mamíferos por meio da
ICSI foi relatado por diversos autores, incluindo coelhos (Hosoi et al., 1988),
camundongos (Kimura e Yanagimachi, 1995; Kuretake et al., 1996), suínos (Martin,
2000; Probst et al., 2002), ovelhas (Catt et al., 1995), cavalos (Cochran et al., 1998),
(Hewitson, et al., 1999), humanos (Palermo et al., 1992) e bovinos (Goto et al., 1990;
Hamano et al., 1999; Horiuchi et al., 2002; Wei e Fukui, 2002).
Taxas de fertilização por meio da ICSI, sem ativação química dos oócitos,
são particularmente altas em humanos (40 a 60%, Devroey et al., 1994; Lundin et al.,
1994) mas, em bovines, foram descritas baixas taxas de ativação e de formação de
pronúcleo (menores que 20%), quando se realizou apenas a injeção de
espermatozóide sem tratamentos adicionais (Westhusin et al., 1984; Younis et al.,
1989; Goto et al., 1990; Keefer et al., 1990; Goto, 1993; Chen e Seidel , 1997; Rho et
al., 1998b, Li et al., 1999; Chung et al., 2000; Horiuchi et al, 2002).
62
Diversos fatores têm sido sugeridos para estas baixas taxas de formação de
pronúcleo e de ativação, incluindo a alta condensação dos espermatozóides bovinos
pelo maior número de pontes dissulfídicas (Seligman et al., 1991, Katayose et al.,
1999), as condições e tempo de maturação in vitro dos oócitos e possíveis erros da
técnica de microinjeção, devido à alta elasticidade da membrana plasmática do
oócito bovino (Katayose et al., 1999, Horiuchi et al., 2002).
Para compensar a baixa taxa de descondensação espermática, o efeito de
diferentes pré-tratamentos dos espermatozóides vem sendo estudado, incluindo
tratamentos químicos e físicos que visam à permeabilização da membrana do
espermatozóide, à indução da reação acrossomal e à descondensação do núcleo do
espermatozóide (Chen e Seidel, 1997; Rho et al., 1998b; Li et al., 1999; Suttner et
al., 2000). Sugere-se que a imobilização do espermatozóide e a permeabilização da
sua membrana sejam requisitos necessários para o acesso de um possível fator
oocitário de descondensação do espermatozóide injetado. (Swann et al., 1994).
A permeabilização da membrana do espermatozóide por meios físicos tem
resultado em um aumento das taxas de formação de pronúcleo masculino após a
ICSI em oócitos humanos (Dozortsev et al., 1995; Palermo et al., 1996). Danos à
membrana plasmática podem ser feitos por meio da imobilização física do
espermatozóide com a pipeta de injeção (Horiuchi et al., 2002), pelo congelamento e
descongelamento sem crioprotetores (Perreault et al., 1988; Catt e Rhodes, 1995;
Horiuchi et al., 2002), pelo corte da cauda com uma lanceta de vidro (Wei e Fukui,
2002), ou pela separação da cauda por sonicação (Hamano et al., 1999)
Além do pré-tratamento dos espermatozóides, diferentes protocolos de
ativação oocitária também têm sido utilizados em conjunto com a ICSI, na tentativa
de aumentar as taxas de fertilização após a ICSI em bovinos, incluindo o etanol
(Nagai, 1987; Hamano et al., 1999; Horiuchi et al., 2002), ionóforos de cálcio Ca-I
A23187 e ionomicina, sozinhos ou combinados com outras substâncias, inibidoras da
síntese protéica como a 6-dimetil aminopurina (Chen e Seidel, 1997; Katayose et al.,
1999), e a ciclohexamida (Suttner et al., 2000).
O presente trabalho teve por objetivo estudar os efeitos do pré-tratamento
espermático e da ativação química, na fertilização de oócitos bovinos por meio da
ICSI.
63
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta, seleção e maturação in vitro dos oócitos
Ovários bovinos obtidos de matadouro foram mantidos em uma garrafa
térmica, à temperatura de 30ºC em solução tampão-fosfato, com pH ajustado 7,4;
contendo 100 UI/ ml de penicilina e 100 UI/ ml de estreptomicina, durante o
transporte até o laboratório. Os folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm foram
aspirados com uma agulha descartável de 18G, acoplada a um tubo de centrífuga
de 50 ml, utilizando-se uma bomba de vácuo com pressão negativa de 120 mm Hg.
Após o repouso dos tubos por 10 min, o sedimento foi transferido para uma placa de
Petri, para a recuperação e para a seleção dos complexos cumulus-oócitos (COCs).
Foram selecionados COCs, com cumulus compacto, contendo pelo menos
três camadas celulares e com citoplasma de aparência homogênea segundo a
classificação de De Loos et al. (1989). Esses COCs foram lavados por três vezes em
meio de lavagem TCM199 -HEPES/ OCS (TCM-199 com 10% soro de vaca em
estro - OCS) e colocados (20 a 30 oócitos) em 400µl de meio MPM (modified
Parker´s medium), contendo 10% de OCS, 10 µg/ ml de FSH e antibióticos, em
placa de 4 poços, sendo o meio coberto com 400 µl de óleo mineral. A maturação foi
realizada em estufa de cultivo em atmosfera umidificada, com 5% de CO2 a 39ºC,
durante 18-20 horas.
Desnudamento e seleção dos oócitos
Após maturação in vitro, os COCs foram incubados em uma gota de 100 µl
de meio de desnudamento (TCM 199-HEPES com 1 mg/ ml de hialuronidase e 10%
de OCS) e passados por repetidas aspirações em uma pipeta de 100 µl para a
remoção das células do cumulus. Os oócitos desnudados foram lavados novamente
em meio de lavagem para remoção de todos os restos celulares e transferidos para
gotas de 20 µl de meio de micromanipulação (TCM199-HEPES acrescido de 4 mg
/ml de BSA), em uma tampa estéril de placa de Petri de 35 mm de diâmetro, sendo
adicionado óleo mineral para cobrir as gotas.
Os oócitos foram examinados sob microscópio óptico invertido, sob aumento
de 400x (Zeiss Axiovert 135). Aqueles oócitos de boa aparência, exibindo o primeiro
corpúsculo polar, foram selecionados utilizando-se uma micropipeta de vidro com
64
abertura interna da extremidade de cerca de 150 µm, acoplada a um sistema de
micromanipulação (microinjetor CellTram Oil-Eppendorf AG e micromanipulador
TransferMan-Eppendorf AG, Alemanha).
Preparo dos espermatozóides
Palhetas de sêmen congelado de um touro comprovadamente fértil e com
bons resultados em FIV foram descongeladas em banho-maria a 39ºC, por 30
segundos. Os espermatozóides viáveis foram separados pela técnica de "Swim-up"
por 1 hora em estufa (39ºC) em meio Sp-TALP (Meio de Tyrode com albumina-
lactato-piruvato) acrescido de BSA livre de ácidos graxos (6 mg/ml), penicilamina
(20 µM), hipotaurina (10 µM) e epinefrina (2 µM). A parte superior (0,5 ml) do
sobrenadante foi retirada e depositada em um outro tubo, sendo, em seguida,
centrifugada a 600 xg por 10 min. O sobrenadante foi descartado e uma alíquota de
5µl retirada para determinação da concentração espermática.
Tratamento dos espermatozóides para ICSI
Espermatozóides não tratados - controle
Para o preparo dos espermatozóides para ICSI, 20 µl do sedimento de
espermatozóides purificados anteriormente pelo método de “Swim-up” foram
transferidos para um tubo de centrífuga de 1 ml e 40 µl da solução de
polivinilpirrolidona (10% de PVP em solução salina 0,9%) foram adicionados para a
diluição dos espermatozóides. A concentração foi conferida a partir de uma pequena
gota sob microscópio de fase e, quando necessário, adicionava-se mais solução de
PVP, de forma que não houvesse excesso de espermatozóides. Estes
espermatozóides foram mantidos em estufa até o momento da ICSI, servindo como
controle.
Espermatozóides tratados com DTT.
O tratamento com ditiotreitol (DTT) consistiu na adição de 20 µl do
sedimento de espermatozóides a 1 ml de solução Sp-Talp contendo 5 mM de DTT,
seguida pela incubação à temperatura ambiente por 30 min. Após este período, os
espermatozóides foram lavados por duas vezes com Sp-Talp, centrifugados a 3.400
65
rpm por 10 min e, após a última lavagem, foi adicionada solução de PVP ao
sedimento, conforme descrito anteriormente.
Espermatozóides congelados/ descongelados e tratados com DTT
Os espermatozóides foram tratados como no procedimento anterior, porém,
para induzir a ruptura da membrana plasmática, foram previamente congelados e
descongelados em Sp-TALP sem crioprotetor em criotubos, por imersão direta em
nitrogênio líquido por 10 min e descongelados em banho-maria a 39ºC.
Espermatozóides tratados com ATAB + DTT
Os espermatozóides foram ressuspendidos em 1 ml de solução Sp-TALP
contendo 0,1% de alquiltrimetilamônio (ATAB) + 2 mM de DTT e mantidos por 30
min sob agitação leve. Em seguida, foram realizadas duas lavagens com Sp-Talp e,
após a última lavagem, foi adicionada solução de PVP, conforme descrito
previamente.
Espermatozóides tratados com Triton + DTT
Os espermatozóides foram ressuspendidos em 1 ml de solução Sp-TALP
contendo 0,1% de Triton X-100 + 2 mM de DTT e mantidos por 30 min. sob agitação
leve. Em seguida, foram realizadas duas lavagens com Sp-Talp e, após a última
lavagem, foi adicionada solução de PVP, conforme descrito previamente.
Técnica de Injeção intracitoplasmática de espermatozóide
Para injeção intracitoplasmática de espermatozóide, três gotas de 15µl de
meio de micromanipulação (TCM 199+ 4 mg BSA/ ml) foram feitas na tampa de uma
placa de Petri de 35 mm (Nunc., Naperville, IL). Próximo às duas primeiras, outras
duas gotas de 5 µl da suspensão de espermatozóides com PVP eram feitas. De sete
a oito oócitos foram colocados em duas gotas do meio, sendo a terceira gota de
meio utilizada para a lavagem ocasional da pipeta. Todas as gotas foram cobertas
com óleo mineral para evitar perda de líquido.
O equipamento de microinjeção consistiu de microinjetores CellTram Oil
(Eppendorf AG, Alemanha) para a manutenção do oócito e CellTram Vario
(Eppendorf AG, Alemanha) para microinjeção, micromanipuladores TransferMan
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(Eppendorf AG, Alemanha) acoplados a um microscópio Zeiss Axiovert 135.
As pipetas de manutenção foram confeccionadas a partir de capilares
estéreis de borossilicato (1,0 mm de diâmetro externo e 0,75 mm de diâmetro
interno) esticados (25A, escala 4,5) em um estirador de pipetas (Bachoffer-
Alemanha) e cortadas com diâmetro externo de cerca de 120 mm e polidas em uma
microforja. As pipetas de microinjeção para ICSI (TransferTip Eppendorf nº
5175112.008) foram adquiridas prontas (Eppendorf AG, Alemanha), possuindo o
diâmetro interno de 7 µm e diâmetro externo de 9 µm.
O movimento do espermatozóide foi reduzido pela própria solução de PVP e
a imobilização realizada pela quebra da cauda do espermatozóide com a
micropipeta de injeção. O espermatozóide foi aspirado pela cauda e mantido na
extremidade da pipeta de injeção. Para o tratamento que utilizou espermatozóide
com a cauda cortada, uma lanceta de vidro foi confeccionada com o mesmo material
da pipeta de manutenção e, por meio de manipuladores, a lanceta foi pressionada
ou arrastada sobre a região final da peça intermediária da cauda do espermatozóide,
deixando uma porção de aproximadamente 5 µm junto à cabeça do espermatozóide.
A pipeta de injeção contendo o espermatozóide foi então transferida para a
gota onde estavam os oócitos a serem injetados e um oócito foi mantido pela pipeta
de manutenção por um dos lados, de forma que o corpúsculo polar ficasse na
posição de 6 ou 12 h.
Uma vez o oócito colocado na posição desejada e mantido por sucção, a
micropipeta de injeção foi introduzida pela zona pelúcida até quase o outro lado do
citoplasma e uma pequena quantidade de citoplasma foi aspirada para o interior da
pipeta, para causar a ruptura da membrana. O espermatozóide foi então
microinjetado, procurando-se injetar a menor quantidade possível de meio, sendo a
pipeta de injeção removida cuidadosamente e o oócito liberado da micropipeta.
O procedimento de microinjeção foi feito à temperatura ambiente (25°C).
Após a microinjeção, os oócitos foram lavados em TCM/ BSA e submetidos aos
diferentes métodos de ativação (Fig. 1).
67
A
B
Figura 1. ICSI em oócito bovino desnudado. (A) Penetração da micropipeta pela zona pelúcida. (B) Aspiração da membrana plasmática seguida da deposição do espermatozóide no interior do citoplasma (aumento de 400x). Corpúsculo polar encontra-se na posição 6 h.
Ativação dos oócitos após a microinjeção
Para a ativação dos oócitos foram realizados 3 protocolos:
1. Etanol 7%
Após a ICSI, os oócitos foram colocados em uma gota de 50 µl de TCM/
OCS contendo 7% de etanol por 5 min e, posteriormente, lavados por 3 vezes em
gotas de TCM/ BSA para remoção do etanol, seguindo-se então o cultivo em Fert-
TALP/ BSA por 18h.
2. Ionóforo de cálcio (CaI A23187) e ciclohexamida (CHX)
Os oócitos microinjetados foram incubados por 5 min em meio TCM/ OCS
contendo 5 µM de CaI A23187, lavados novamente em TCM/ OCS e cultivados por 4
h em meio SOF/ OCS para permitir a extrusão do segundo corpúsculo polar. Após
este período, os oócitos foram transferidos para 400µl de SOF/ OCS, contendo 5 µM
de CHX e mantidos em estufa por mais 3 h. Após este período, os oócitos foram
novamente lavados em TCM/ OCS, seguindo-se então o cultivo em em Fert-TALP/
BSA por 11 h.
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3. Ionomicina e 6-DMAP
Os oócitos foram incubados em uma gota de 100 µl com 5 µM de ionomicina
em TCM/ BSA (4 mg/ ml) por 5 min e então 100 µl de TCM/ BSA (30 mg/ml) foram
adicionados a esta gota e deixados por 5 min, para cessar o processo de ativação.
Os oócitos foram então lavados em TCM/ OCS e cultivados por 4 h em meio TCM/
BSA para permitir a extrusão do segundo corpúsculo polar. Após este período, os
oócitos foram transferidos para uma gota de TCM/ BSA, com 1,9 mM DMAP e
mantidos em estufa por mais 3 h. Posteriormente, os oócitos foram novamente
lavados em TCM/ OCS, seguindo-se então o cultivo em Fert-TALP/ BSA por 11 h.
Fertilização in vitro
Parte dos oócitos maturados foram fertilizados in vitro, servindo como grupo
controle, com uma concentração espermática de 2 x 106 espermatozóides/ ml a
partir da suspensão de espermatozóides preparada inicialmente. A fertilização foi
realizada em 400 µl de meio de fertilização (Fert-TALP + 6 mg BSA/ ml), em placas
de 4 poços por 18 h em estufa de cultivo a 39ºC com 5% de CO2.
Cultivo dos embriões
Após o período de fertilização, ativação ou ICSI, os oócitos foram lavados
em meio SOF + 10% de OCS para remoção de restos celulares e cultivados por
nove dias, em 400 µl de SOF + 10% de OCS e antibióticos, a 39ºC com 5% de CO2,
5% de O2 e 90% de N2. As taxas de clivagem e de formação de blastocisto foram
registradas nos dias, d3 e d7-d9, respectivamente.
Congelamento dos embriões
Os embriões foram lavados três vezes em tampão Kawasaki (20 mM Tris-
HCl pH 8,3; 1,5 mM MgCl2; 25 mM KCl, 0,5% (v/v) Tween 20; 0,1% PVP) e
transferidos para tubos de PCR com 5 µl do mesmo tampão. Os tubos foram
identificados e armazenados a –80°C até a sexagem.
69
Sexagem dos embriões produzidos por ICSI
Com o objetivo de se avaliar a fertilização dos embriões produzidos por meio
da ICSI, parte destes foi sexada pela técnica da reação de Polimerase em Cadeia
(PCR), utilizando um par de primers que amplifica a seqüência do gene da
amelogenina bovina (bAML), bAML-sense (5´AAA TTC TCT CAC AGT CCA AG´3) e
bAML-antisense (5´CAA CAG GTA ATT TTC CTT TAG´3), resultando em produtos
de diferentes comprimentos (Chen et al., 1999).
Embriões produzidos por FIV convencional foram utilizados como controle
para validação da técnica. Embriões apresentando a banda Y de 341bp,
apresentando ou não a banda de 467 bp, foram considerados machos e portanto
fertilizados. Embriões apresentando somente a banda de 467 bp foram considerados
não-machos, podendo ser fêmeas fertilizadas ou embriões não-fertilizados
(desenvolvimento partenogenético decorrente da ativação química).
Os embriões armazenados nos tubos de PCR foram descongelados à
temperatura ambiente por 5 min e, posteriormente, mantidos em gelo. Em seguida,
10 µl de solução de proteinase K (2 mg/ ml Proteinase-K em tampão Kawasaki)
foram adicionados a cada tubo para a dissolução da zona pelúcida e das
membranas celulares. Os tubos foram incubados a 60°C por 60 min e, em seguida,
a 95°C por 15 min, para a inativação da Proteinase-K. Após este período, os tubos
foram novamente recolocados em gelo.
Para amplificação do DNA, foi preparada uma mistura de PCR composta de
(volume por amostra) tampão PCR 10x (2,5 µl), mistura de desoxirribonucleotídeos-
trifosfato (dNTP´s) (2,5 µl), par de primers bAML (1,25 µl de cada), H2O (2,25 µl),
Taq-Polimerase HotStar (0,25 µl), embrião em tampão Kawasaki (15 µl), totalizando
um volume de 25 µl.
Antes do início da reação, a tampa do termociclador foi pré-aquecida a
105°C. O programa para a amplificação consistiu o programa das seguintes etapas :
(1) aquecimento a 94ºC por 15 min, para a desnaturação inicial, (2) 50 sega 94ºC
(desnaturação), (3) 1 min a 54ºC (anelamento), (4) 1 min a 72ºC (extensão)
resfriamanto a 4ºC. As etapas de 2 a 4 consistiam um ciclo e foram repetidas 38
vezes, seguindo então as etapas 8 a 9.
70
Após a realização da PCR, 7 µl de cada amostra foram misturados com 3 µl
de tampão de gel e depositados nos poços do gel de agarose (2,5% agarose com 3
µl/ 100 ml de brometo de etídio). Como padrão de peso molecular, foram utilizados
4µl de pUC19/ MspI (MBI Fermentas). A corrida foi realizada por 30 min sob campo
elétrico de 120V e as bandas de DNA visualizadas e fotografadas sob luz
ultravioleta.
Análise estatística
Análises preliminares foram realizadas para cada uma das variáveis
estudadas incluindo o efeito de tratamento no modelo estatístico. Quando o
coeficiente de variação (CV) resultante da análise de variância foi alto (CV > 35%),
os dados foram transformados para raiz quadrada e testados novamente.
No modelo da análise final, as diferenças entre os resultados, em
porcentagem do número inicial de oócitos, foram analisadas pelo procedimento
ANOVA, SAS (1998), sendo as comparações entre as médias dos tratamentos
realizadas pelo teste de Duncan. Diferenças foram consideradas significativas
quando P<0,05.
O modelo estatístico empregado para a avaliação do efeito dos tratamentos na
Análise de Variância foi:
Y ijk = µµµµ + αααα i + eijk
Onde:
Y ijk = valor observado para a variável em estudo
µ = média geral
α i = efeito do i-ésimo nível do tratamento no valor observado Y ijk
eijk = erro associado a observação Y ijk
71
RESULTADOS
Após a maturação in vitro e o desnudamento, aproximadamente 80% dos
oócitos apresentavam o primeiro corpúsculo polar, com uma grande variedade da
aparência do citoplasma. Para a seleção, descartaram-se os oócitos de aparência
muito claro e uniforme, com poucas granulações ou aqueles de citoplasma muito
heterogêneo com grânulos muito escuros.
Durante a microinjeção, 5-10% dos oócitos foram lesionados e descartados,
e o restante submetido aos protocolos de ativação e cultivado para a avaliação dos
tratamentos. No momento de transferência dos embriões para o meio de cultivo (18h
após a ICSI), os oócitos que se apresentavam degenerados (desidratados ou com
citoplasma extruído) foram descartados, mas computados no número total de oócitos
microinjetados.
Experimento 1
No primeiro experimento, foram estudados isoladamente os efeitos dos pré-
tratamentos espermáticos e dos protocolos de ativação dos oócitos microinjetados
estudou-se isoladamente nas taxas de clivagem e de formação de blastocistos após
ICSI.
O grupo controle de ICSI (sem pré-tratamento espermático e sem ativação
oocitária) apresentou uma baixa taxa de clivagem (4%) e não foi obtido nenhum
blastocisto. Também foram obtidas baixas taxas de clivagem (3% a 5%) e de
formação de blastocistos (0% a 1%) para os grupos onde não foi realizada ativaçao
oocitária, não havendo efeito positivo dos pré-tratamentos espermáticos (DTT, DTT
+ ATAB ou DTT + Triton-X100) em relação ao grupo não-tratado (P>0,05).
Quando oócitos foram ativados após a ICSI com os espermatozóides não-
tratados, foram obtidas maiores taxas de clivagem e de formação de blastocisto em
relação ao grupo controle. As menores taxas de clivagem e de formação de
blastocistos, após a ICSI, foram obtidas com os métodos de ativação com CaI +
CHX (36% e 4%) e com etanol 7% (33% e 3%).
72
Tabela 1. Efeito do pré-tratamento dos espermatozóides e da ativação oocitária nas
taxas de clivagem e formação de blastocistos após ICSI e FIV com oócitos desnudados
Pré-tratamento espermático
Fertilização Protocolo de
ativação Oócitos
injetados Repetições
Clivagem d3 (%)
Blastocistos d7-d9 (%)
- ICSI - 101 7 4 (4)a 0 (0)
DTT ICSI - 75 5 2 (3)a 0 (0)
DTT + ATAB ICSI - 76 5 2 (3)a 0 (0)
DTT+ Triton ICSI - 76 5 4 (5)a 1 (1)a
- ICSI CaI + CHX 104 7 37 (36)b 4 (4)a
- ICSI Etanol 7% 98 7 32 (33)b 3 (3)a
- ICSI Ion+ 6-Dmap 105 7 61 (58)c 14 (13)b
- FIV-D - 165 11 118 (71)d 51 (31)c
Valores na mesma coluna com letras diferentes diferem significativamente (P<0,05).
O protocolo de ativação que forneceu os melhores resultados de clivagem e
de formação de blastocistos foi com ionomicina + 6-DMAP (58% e 13%, P<0,05),
contudo estes resultados foram significativamente menores que os obtidos para a
FIV convencional de oócitos desnudados (71% e 31; P<0,05) (Tabela 1).
Experimento 2
De acordo com os resultados obtidos no primeiro experimento, o protocolo
de ativação com ionomicina + 6-DMAP forneceu os melhores resultados de clivagem
e de formação de blastocistos e, portanto, foi escolhido para a realização do
segundo experimento, no qual foi combinado com diferentes protocolos de pré-
tratamento espermático.
Quando foram realizadas as combinações de pré-tratamento espermático
com a ativação de ionomicina + 6-DMAP, as taxas de clivagens obtidas foram
superiores a 50% em todos os grupos, sendo que o grupo onde o espermatozóide
foi congelado e descongelado, seguindo a incubação com DTT antes da
microinjeção, resultou em baixas taxas de clivagem e de formação de blastocistos
(51% e 9%, respectivamente (Tabela 2).
73
Não houve diferenças significativas entre as taxas de formação de
blastocistos entre os grupos de oócitos microinjetados com espermatozóide não-
tratado (15%), espermatozóides incubados com DTT (15%), espermatozóides
congelados/ descongelados (C/D) e incubados com DTT (9%), espermatozóides
incubados com DTT + Triton X-100 (14%) e oócitos não-injetados ativados (13%). A
taxa de formação de blastocistos de FIV convencional de oócitos desnudados foi
significativamente superior à taxa dos demais grupos (42%, P<0,05).
Tabela 2. Efeito do pré-tratamento espermático em combinação com ativação
oocitária nas taxas de clivagem e de formação de blastocistos após ICSI
e FIV com oócitos desnudados
Pré-tratamento espermático Fertilização Ionom.
+ 6-DMAP Oócitos
injetados Repetições Clivagem d3 (%)
Blastocisto d7-d9 (%)
Controle ICSI + 73 5 50 (68)ab 11 (15)b
DTT ICSI + 72 5 46 (64)ab 11 (15)b
C/ D + DTT ICSI + 76 5 39 (51)b 7 (9)b
DTT + Triton ICSI + 72 5 54 (75)a 17 (14)b
- - + 76 5 55 (75)a 10 (13)b
- FIV - 133 9 105 (79)a 55 (42)a
Valores na mesma coluna com letras diferentes diferem significativamente (P<0,05).
A avaliação da fertilização dos embriões produzidos por ICSI foi realizada por
sexagem pelo método da PCR, a fim de se determinar a porcentagem de embriões
machos e comprovar desta forma, a ocorrência da fertilização.
O protocolo de amplificação por PCR da seqüência da amelogenina dos
embriões produzidos por FIV demonstrou-se eficiente para a sexagem dos embriões,
resultando em bandas nítidas e definidas de fragmentos do cromossomo X (467bp) e
Y (341 bp).
74
Os embriões de FIV sexados como machos apresentaram duas bandas,
sendo uma do cromossomo X (467bp) e a outra do cromossomo Y (341 bp),
embriões com apenas uma banda (467bp) foram classificados como não-machos
(Fig. 2).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 2. Fotografia de gel de agarose mostrando bandas X (467bp) e Y (341 bp), da seqüência da amelogenina bovina (bAML) de embriões de FIV, coradas com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. Amostra 1= padrão de peso molecular (pUC19). Embriões nº 3, 6, 9 e 10: não-machos; embriões nº 2, 4, 5, 7, 8: machos.
Os embriões provenientes de ativação partenogenética deveriam apresentar
apenas a banda correspondente ao cromossomo “X” pela ausência de
espermatozóide. Os embriões de ICSI deveriam apresentar duas bandas quando
fertilizados por um espermatozóide Y e com uma banda quando fertilizados por
espermatozóide X ou provenientes de ativação partenogenética. Entretanto, nenhum
embrião de ICSI foi sexado como macho. (Fig. 3).
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 3 . Fotografia de gel de agarose mostrando banda X (467bp), da seqüência da amelogenina bovina (bAML), coradas com brometo de etídio, sob luz ultravioleta. Amostra 11: padrão de peso molecular (pUC19). Embriões de ICSI: 12, 13, 14, 17, 18, 19 e 20. Embriões de ativação: 15 e 16.
467 bp
341bp
467 bp
75
Para embriões de FIV de oócitos não-desnudados, foi obtida uma
porcentagem de machos de 50% (8/16) e para os embriões de FIV de oócitos
desnudados de 33% (4/12). Dos 7 embriões partenogenéticos analisados, 7 (100%)
foram classificados como não-machos, indicando a ausência do cromossomo Y por
não terem sido fertilizados.
Todos os embriões produzidos por ICSI analisados também foram
classificados como não-machos 11/11 (100%), indicando que possivelmente nenhum
deles tenha sido fertilizado corretamente. Contudo, a ocorrência de embriões
fertilizados por ICSI com um espermatozóide X não pode ser descartada. Os
resultados de sexagem dos embriões por grupo de tratamento encontram-se
resumidos na Tabela 3.
Tabela 3. Sexagem dos embriões produzidos in vitro por FIV, ativação
partenogenética ou ICSI
Método de fertilização Método de ativação
Blastocistos examinados
Machos (%)
Não-macho (%)
FIV/ controle - 16 8 (50) 8 (50)
FIV/ oócitos desnudados - 12 4 (33) 8 (67)
- Ion. + 6-DMAP 7 0 (0) 7 (100)
ICSI Ion. + 6-DMAP 11 0 (0) 11 (100)
DISCUSSÃO
Para compensar a baixa taxa de descondensação espermática em bovinos,
vários trabalhos foram realizados avaliando-se o pré-tratamento dos
espermatozóides antes da ICSI, com agentes químicos redutores, visando à redução
das pontes dissulfídicas do núcleo do espermatozóide (Chen e Seidel, 1997; Rho et
al., 1998b; Li et al., 1999; Suttner et al., 2000). Desta forma, estes autores obtiveram
uma maior taxa de formação de pronúcleo e de clivagem dos oócitos microinjetados.
Os pré-tratamentos espermáticos realizados visando a danos à membrana
do espermatozóide utilizados no presente experimento (imobilização, congelamento/
76
descongelamento e corte da cauda) não resultaram em melhorias nos índices de
clivagem após a ICSI, mesmo com a incubação com DTT e, aparentemente, o
procedimento de congelamento/ descongelamento afetou negativamente o
desenvolvimento embrionário.
Apesar do tratamento com DTT promover descondensação dos
espermatozóides in vitro e resultar em maiores taxas de formação de pronúcleo após
a ICSI, o seu uso é discutível, uma vez que esse agente químico também pode inibir
a capacitação espermática por reduzir a fosforilação de proteínas espermáticas (De
Lamirande e Gagnon, 1998) e desestabilizar a cromatina espermática, o que levaria
a danos do genoma paternal (Suttner et al., 2000; Szcygiel e Ward, 2002).
Quando os oócitos microinjetados não foram submetidos à ativação química,
baixas taxas de clivagem foram obtidas, conforme relatado por outros pesquisadores
(Keefer et al., 1990; Goto, 1993, Katayose et al., 1999).
O tratamento com etanol a 7% pode promover a ativação de um maior
número de oócitos, porém os resultados têm sido contraditórios. Chen e Seidel
(1997) não obtiveram aumento do número de blastocistos formados a partir de
oócitos tratados com etanol 7%, em relação ao grupo não-ativado. Entretanto, o
nascimento de bezerros por esse método de ativação após a ICSI foi obtido por
Hamano et al. (1999) e por Horiuchi et al. (2002).
A ativação com CaI A23187 associada à CHX também tem resultado em
boas taxas de ativação, sem alterações marcantes do cariótipo dos embriões
produzidos. Suttner et al. (2000) observaram que 90% dos embriões produzidos por
ICSI utilizando ativação com CaI A23187 associada à CHX apresentavam um
cariótipo diplóide normal. A utilização desta combinação no presente trabalho não
resultou em uma satisfatória taxa de clivagem.
As maiores taxas de blastocistos produzidos por ativação oocitária após a
ICSI foram encontradas com a associação Ionomicina + 6-DMAP, estando de acordo
com os resultados de Rho et al., (1998b) e Suttner et al. (2000).
Entretanto, sabe-se que a 6-DMAP atua como um potente inibidor de
kinases, bloqueando a fosforilação protéica de forma irreversível. A 6-DMAP pode
causar alterações da placa metafásica, impedindo a extrusão do segundo corpúsculo
polar quando usada diretamente após a ativação com ionomicina (Rho et al., 1998a),
gerando embriões de cariótipo anormal em maior porcentagem que as taxas obtidas
77
com embriões de FIV convencional. Apesar da incubação por 4 h antes do uso da 6-
DMAP no presente experimento, para que a extrusão do segundo CP não fosse
bloqueada, os efeitos dessa substância nos eventos seguintes são desconhecidos.
Outras formas de ativação oocitária para o aumento da eficiência da ICSI
devem ser encontradas para que os riscos de alterações genéticas dos embriões
sejam reduzidos. A identificação e utilização de fatores espermáticos, visando a
promover a ativação oocitária de forma mais próxima à que ocorre fisiologicamente,
permitirá um grande avanço para o sucesso da ICSI. Wu et al. (1998) demonstraram
que a injeção de frações espermáticas de suínos em oócitos de camundongos
resultou em oscilações de cálcio muito similares àquelas resultantes do processo de
fertilização, capazes de iniciar a ativação oocitária normal.
Uma vez que a ativação química pode resultar na produção de embriões
partenogenéticos, sem a participação do espermatozóide microinjetado, a sexagem
dos embriões é uma alternativa para verificar a ocorrência de fertilização. Embriões
classificados como machos pela presença de fragmentos específicos do
cromossomo Y na amostra confirmam a fertilização dos embriões. Entretanto, para
embriões classificados como fêmeas não se pode afirmar se ocorreu ou não a
fertilização, e pressupõe-se que o número de fêmeas seria próximo ao número de
machos, pela relação de 50% das populações de espermatozóides X e Y.
Apesar do desenvolvimento a blastocisto e a obtenção de alguns blastocistos
eclodidos provenientes de ICSI, nenhum dos embriões de ICSI analisados foi
classificado como macho, sugerindo que, provavelmente, a maior parte dos embriões
foi proveniente de desenvolvimento partenogenético e de uma falha da fertilização.
Rho et al. (1998b) e Suttner et al. (2000) usaram esse método para determinar a
porcentagem de embriões bovinos fertilizados por ICSI e encontraram resultados de
33 e 57% de machos, respectivamente, para oócitos tratados com DTT e tratados
com o protocolo Ionomicina + 6-DMAP.
A falha de fertilização na ICSI pode ser devida a erros na técnica de
microinjeção, com a deposição do espermatozóide no espaço perivitelínico, à
expulsão do mesmo pelo oócito algumas horas após a microinjeção ou pela falta de
descondensação do espermatozóide para promover a formação do pronúcleo
masculino.
78
Recentemente, foi relatado o nascimento de bezerros a partir de embriões de
ICSI sem ativação química (Wei e Fukui, 2002). Estes autores utilizaram oócitos
maturados in vitro por um tempo mais prolongado (24-25h) e a microinjeção foi
realizada com o auxílio de um piezo-atuador, que garante uma deposição mais
precisa do espermatozóide, obtendo altas taxas de fertilização e nascimento de
bezerros de ICSI sem a ativação oocitária. Apesar desses autores terem
demonstrado a possibilidade da produção de embriões bovinos por ICSI de forma
mais segura e simplificada, abrindo novas perspectivas para o seu uso, os resultados
em termos de embriões produzidos por oócito injetado (22,7%) ainda precisam ser
melhorados.
CONCLUSÕES
A ativação com ionomicina + 6-DMAP resultou em taxas de clivagem
satisfatórias, mas o desenvolvimento embrionário após a ICSI foi aparentemente
afetado pelo procedimento de microinjeção ou devido à ausência de certas estruturas
espermáticas (no caso de apenas ativação). Além disso, não foi constatado nenhum
efeito positivo do pré-tratamento espermático em relação à microinjeção de
espermatozóides não tratados.
Apesar do desenvolvimento a blastocisto e da obtenção de alguns
blastocistos eclodidos provenientes de ICSI, nenhum dos embriões de ICSI
analisados foi classificado como macho, sugerindo que, provavelmente, a maior
parte dos embriões foi proveniente de desenvolvimento partenogenético, decorrente
da ativação química. Mais estudos sobre os eventos celulares do processo de
fertilização e da técnica de microinjeção são necessários para aumentar a eficiência
da ICSI em bovinos.
79
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84
FERTILIZAÇÃO E DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO APÓS INJEÇÃO
INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI) EM OÓCITOS BOVINOS
USANDO PIEZO-MICROMANIPULADOR
RESUMO
Nascimentos de bezerros provenientes da transferência de embriões
produzidos pela Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide (ICSI) têm sido
descritos nos últimos anos, porém os resultados da produção in vitro de embriões
bovinos por esta técnica ainda são baixos, quando comparados à fertilização in vitro
convencional. Enquanto a ICSI tem sido aplicada com sucesso em humanos, em
bovinos, os resultados obtidos são baixos, com altas taxas de oócitos não
fertilizados. Recentemente, foi descrito o uso de um equipamento denominado Piezo-
micromanipulador para a ICSI em bovinos, com resultados animadores. Este
equipamento tem se mostrado eficaz por facilitar a penetração da micropipeta na
zona pelúcida e na membrana plasmática do oócito, permitindo a obtenção de altas
taxas de fertilização dos oócitos. O presente trabalho teve por objetivo avaliar as
taxas de fertilização e o desenvolvimento embrionário após a ICSI em oócitos
bovinos, utilizando um Piezo-micromanipulador, com diferentes combinações de pré-
tratamento espermático e ativação química do oócito. Complexos cumulus-oócito
(COCs) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro (18-20h) e
desnudados, passando-os por uma pipeta na presença de hialuronidase. Os oócitos
com boa aparência, apresentando o primeiro corpúsculo polar foram selecionados e
centrifugados para o clareamnto do citoplasma, sendo então microinjetados com
espermatozóides sem pré-tratamento ou pré-tratados com ditiotreitol (DTT), com o
auxílio de um Piezo-micromanipulador (PiezoDrill, Burleigh). Após a microinjeção,
os oócitos foram ativados quimicamente com ionomicina e 6-dimetilaminopurina (6-
DMAP), visando a um aumento das taxas de clivagem. A eficiência do método de
microinjeção e os efeitos dos pré-tratamentos espermáticos e da ativação oocitária
foram avaliadas pelas taxas de formação de pronúcleos, sobrevivência, clivagem e
formação de blastocistos. A comprovação da fertilização dos embriões foi realizada
85
por comparação entre os microssatélites dos embriões obtidos e do sêmen utilizado.
O uso do Piezo-micromanipulador para a microinjeção permitiu a obtenção de altas
taxas de formação de 2 pronúcleos (49% - 64%). Contudo, quando realizada a
ativação oocitária após a ICSI, obteve-se uma alta taxa de formação de 3 pronúcleos
(25%), significativamente maior (P<0,05) que as taxas obtidas para os grupos de
oócitos microinjetados com espermatozóides do grupo controle ou tratados com DTT,
ou ainda, com o grupo de oócitos apenas ativados (6%, 4% e 0%, respectivamente).
A metodologia que resultou na maior taxa de formação de blastocistos após a ICSI
com o Piezo-micromanipulador foi a utilização do pré-tratamento espermático
combinado com a ativação oocitária (16%, P<0,05), enquanto as demais
metodologias, sem pré-tratamento espermático ou sem ativação oocitária, resultaram
em baixas taxas de clivagem (0% - 49%) e de formação de blastocistos (0% - 5%). A
análise de microssatélites dos embriões obtidos por ICSI revelou que a maior parte
dos embriões (mínimo de 84%) havia sido fertilizada pelo espermatozóide injetado.
Cinco embriões obtidos por ICSI foram transferidos para duas receptoras e uma
delas foi diagnosticada prenhe aos 45 dias de gestação, por palpação retal.
Entretanto esse animal abortou aproximadamente aos 60 dias. Tais resultados
mostram que o oócito bovino pode ser eficientemente fertilizado por meio da ICSI-
Piezo, porém mais estudos são necessários para aumentar a eficiência dessa
metodologia e investigar a viabilidade dos embriões produzidos.
Palavras-chave: embriões bovinos, ICSI, injeção intracitoplasmática de
espermatozóide, Piezo-micromanipulador.
ABSTRACT
Birth of calves by transfer of embryos produced by Intracytoplasmic Sperm
Injection have been reported in the last years. However, the results of in vitro
production of bovine embryos by this technique remain lower than those from
convencional in vitro fertilization (IVF). While this technique has been succesfully
applied in the assisted human reproduction, the results of ICSI to the in vitro
production of bovine embryos remain unsatisfactory, with high rates of unfertilizes
86
oocytes. The use of an equipment called Piezo-micromanipulator to the ICSI into
bovine oocytes was recently described with good perpectives. This equipment was
dedscribed to be efficient to facilitate the penetration of the micropippete into the
Zona Pelucida and into the plasmatic membrane, allowiing high fertilization rates. The
objective of the present study was to investigate the effects of different sperm
pretreatments associated to chemical oocyte activation and the use of a Piezo-
micromanipulator to the microinjection procedure, in order to improve the cleavage
and blastocyts rates after ICSI into bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes
(COCs) from slaughterhouse-derived ovaries were in vitro matured (18-20h) and
denuded passing then throught a pipette in presence of hyaluronidase. Oocytes with
good appearance, showing the first polar body, were selected and centrifuged to
clarify the cytoplasm. These oocytes were microinjected with non-treated (control) ou
dithiothreitol (DTT) pretreated sperms using a Piezo-micromanipulator (PiezoDrill,
Burleigh) in combination with chemical activation using ionomycin and 6-
dimethylaminopurine (6-DMAP), in order to improve the cleavage rates. The
efficiency of the microinjection method, the effects of sperm pretreatments and oocyte
activation were evaluated by the pronuclei formation, survival, cleavage and
blastocyst formation rates. To prove the fertilization of the ICSI produced embryos, a
comparative study was carried out using the amplification of microsatellite sequences
from embryos and sperm cells of the semen used for ICSI. The use of a Piezo-
micromanipulator resulted in high percentages of 2 pronucleus formation (48,6% to
64,0%). However, the chemical activation after ICSI resulted in a significant higher
porcentage of 3 pronuclei formation (P<0.05) in comparison to the groups of ICSI of
control sperm, ICSI of DTT-treated sperm or activation without ICSI (6%, 4% and 0%,
respectively). The method that resulted in the higher blastocyst rate after ICSI was
using sperm pre-treatment with DTT and exogenous activation (16%, P<0.05). The
other methods, with no sperm pretreatment or no chemical activation, resulted in
lower cleavage (0%-49%) and lower blastocyst rates (0%-5%). DNA analysis of ICSI-
produced embryos in comparison to the used semen revelead that most embryos (at
least 84%) were fertilized by the microinjected spermatozoa. Five embryos obtained
by the ICSI method using DTT-pretreated sperm plus oocyte activation were
transferred to two recipients heifers and one of them was diagnosed pregnant at day
45 by rectal palpation. However this recipient aborted around day 60. These results
87
confirm that bovine oocytes can be efficiently fertilized by Piezo-ICSI, however,
further studies involving the birth of live calves are needed about the viability of
embryos produced by DTT-treated sperm and activated oocytes.
Key words: bovine embryos, ICSI, intracytoplasmic sperm injection, in vitro
fertilization.
INTRODUÇÃO
O nascimento de bezerros provenientes da transferência de embriões
produzidos por ICSI tem sido descrito na literatura (Goto et al., 1990; Hamano et al.,
1999; Horiuchi et al., 2002; Wei e Fukui, 2002), porém os resultados da produção in
vitro de embriões bovinos por esta técnica ainda são baixos quando comparados à
fertilização in vitro convencional.
Esses resultados são, em sua maioria, conseqüência de inúmeros fatores
como a qualidade e técnica de preparo dos espermatozóides para a microinjeção, a
maturação oocitária e o emprego de ativação química dos oócitos.
Tratamentos químicos usando agentes redutores das pontes dissulfídicas,
como DTT, associados ou não a substâncias com ação detergente, também têm
resultado em maiores taxas de formação de pronúcleo e de desenvolvimento
embrionário após a ICSI, por promoverem a descondensação espermática (Rho et al,
1998b; Suttner et al., 2000).
A ativação dos oócitos de diferentes espécies pode ocorrer
espontaneamente durante as diferentes etapas laboratoriais para a ICSI, incluindo o
desnudamento, a centrifugação e a estimulação mecânica com a própria pipeta de
injeção (Keefer et al., 1990; Chung et al., 2001). Contudo, em bovinos esses
estímulos e o próprio espermatozóide injetado são, na maioria das vezes,
insuficientes, resultando em uma baixa ativação dos oócitos após a ICSI (Westhusin
et al., 1984; Perreault et al., 1988; Catt e Rhodes, 1995).
O uso de substâncias químicas como a ionomicina e a 6-Dimetilamipopurina
(6-DMAP) para a ativação do oócito microinjetado tem sido estudado, com a
obtenção de bons resultados em relação às taxas de clivagem e de formação de
88
blastocitos (Susko-Parrish et al., 1994; Rho et al., 1998a,b; Suttner et al., 2000).
Os procedimentos empregados para a técnica de microinjeção também
podem determinar o sucesso da produção de embriões, incluindo o tipo de
equipamento utilizado (como microscópios e manipuladores), o diâmetro e a forma
das micropipetas (Dozortsev et al., 1996; Tocharus et al., 1996), a habilidade do
operador (Gordts et al., 1995) e a forma de ruptura da membrana oocitária (Palermo
et al., 1996; Katayose et al., 1999).
Outro fator diretamente relacionado ao sucesso da ICSI é a correta
deposição do espermatozóide, sem que o processo de micromanipulação cause uma
alta taxa de degeneração dos oócitos. O método convencional de ICSI requer que
uma porção do citoplasma seja aspirada para o interior da pipeta, para que a
membrana seja rompida. A membrana de oócitos bovinos é elástica e, muitas vezes,
a aspiração pode não ser suficiente para a sua ruptura, incorrendo na deposição do
espermatozóide no espaço perivitelínico (Horiuchi et al., 2002).
Recentemente, o benefício da utilização do Piezo micromanipulador foi
descrito para ICSI em bovinos (Katayose et al., 1999; Horiuchi et al, 2002), com uma
eficácia bem superior ao método convencional de ICSI. O piezo micromanipulador
permite a abertura de um orifício na zona pelúcida de forma precisa e relativamente
segura. Penetrando com a pipeta por este orifício, a membrana plasmática é forçada
até quase o outro lado do oócito e, com alguns pulsos do piezo, um orifício também é
feito na membrana e esta retorna sobre a pipeta à sua posição original. Tal
procedimento garante a penetração da pipeta no interior do oócito para a deposição
do espermatozóide, com reduzidos danos à estrutura do gameta feminino.
O uso de equipamentos como o atuador piezo elétrico, acoplado ao sistema
de microinjeção, tem resultado em maiores taxas de sobrevivência (oócitos não
degenerados após a microinjeção) e de fertilização após a ICSI. Ao contrário do
método convencional de ICSI, no qual uma porção do citoplasma precisa ser
aspirada para o interior da pipeta para que a membrana seja rompida, o Piezo-
micromanipulador permite a penetração da pipeta pela membrana plasmática de
forma precisa e rápida, sem alterações significativas do citoplasma (Kimura e
Yanagimachi, 1995; Huang et al., 1996; Yanagida et al., 1998; Horiuchi et al., 2002).
O presente estudo teve por objetivo estudar os efeitos de diferentes
tratamentos espermáticos em combinação com ativação oocitária e da utilização de
89
um Piezo-micromanipulador para o procedimento de microinjeção, visando a
melhorar as taxas de clivagem e de formação de blastocistos após a ICSI em oócitos
bovinos.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo compreendeu dois experimentos. No experimento 1, os efeitos da
combinação do pré-tratamento dos espermatozóides com DTT e da ativação
oocitária com ionomicina e 6-DMAP foram comparados quanto às taxas de formação
de pronúcleos em oócitos microinjetados com o auxílio de um piezo-
micromanipulador, ou em oócitos que foram submetidos apenas à ativação.
No experimento 2, os oócitos foram microinjetados, utilizando-se diferentes
combinações de pré-tratamento espermático e de ativação oocitária e cultivados por
nove dias para avaliação das taxas de sobrevivência, clivagem e de formação de
blastocisto. A análise de DNA dos embriões produzidos nesse experimento foi
comparada à análise do sêmen utilizado, para a confirmação da fertilização.
Coleta, seleção e maturação in vitro dos oócitos
Ovários bovinos obtidos de matadouro foram mantidos em uma garrafa
térmica, à temperatura de 30ºC em solução tampão-fosfato, com pH ajustado 7,4;
contendo 100 UI/ ml de penicilina e 100 UI/ ml de estreptomicina, durante o
transporte até o laboratório. Os folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm foram
aspirados com uma agulha descartável de 18G, acoplada a um tubo de centrífuga
de 50 ml, utilizando-se uma bomba de vácuo com pressão negativa de 120 mm Hg.
Após o repouso dos tubos por 10 min, o sedimento foi transferido para uma placa de
Petri para recuperação e seleção dos complexos-cumulus-oócitos (COCs).
Foram selecionados COCs, com cumulus compacto, contendo pelo menos
três camadas celulares e com citoplasma de aparência homogênea, segundo a
classificação de De Loos et al. (1989). Estes COCs foram lavados por três vezes em
meio de lavagem TCM199 -HEPES/ OCS (TCM-199 com 10% soro de vaca em
estro - OCS) e colocados (20 a 30 oócitos) em 400µl de meio MPM (modified
90
Parker´s medium), contendo 10% de OCS, 10 µg/ ml de FSH e antibióticos, em
placa de quatro poços, sendo o meio coberto com 400 µl de óleo mineral. A
maturação foi realizada em estufa de cultivo em atmosfera umidificada, com 5% de
CO2 a 39ºC, durante 18-20 h.
Desnudamento e seleção dos oócitos
Após maturação in vitro, os COCs foram incubados em uma gota de 100 µl
de meio de desnudamento (TCM 199-HEPES com 1 mg/ ml de hialuronidase e 10%
de OCS) e passados por repetidas aspirações em uma pipeta de 100 µl para a
remoção das células do cumulus. Os oócitos desnudados foram lavados novamente
em meio de lavagem para remoção de todos os restos celulares e transferidos para
gotas de 20 µl de meio de micromanipulação (TCM199-HEPES acrescido de 4 mg/
ml de BSA), em uma tampa estéril de placa de Petri de 35 mm de diâmetro, sendo
adicionado óleo mineral para cobrir as gotas.
Os oócitos foram examinados sob microscópio óptico invertido, sob aumento
de 400x (Zeiss Axiovert 135). Aqueles oócitos de boa aparência, exibindo o primeiro
corpúsculo polar, foram selecionados, utilizando-se uma micropipeta de vidro com
abertura interna da extremidade de cerca de 150 µm, acoplada a um sistema de
micromanipulação (microinjetor CellTram Oil-Eppendorf AG e micromanipulador
TransferMan-Eppendorf AG, Alemanha).
Preparo dos espermatozóides
Palhetas de sêmen congelado de um touro comprovadamente fértil e com
bons resultados em FIV foram descongeladas em banho-maria a 39ºC, por 30 seg.
Os espermatozóides viáveis foram separados pela técnica de "Swim-up" por 1 h em
estufa (39ºC) em meio Sp-TALP (meio de Tyrode com albumina-lactato-piruvato)
acrescido de BSA livre de ácidos graxos (6 mg/ ml), penicilamina (20 µM),
hipotaurina (10 µM) e epinefrina (2 µM). A parte superior (0,5 ml) do sobrenadante
foi retirada e depositada em outro tubo, sendo, em seguida, centrifugada a 600 xg
por 10 min. O sobrenadante foi descartado e uma alíquota de 5µl retirada para
determinação da concentração espermática.
91
Sistema de microinjeção
As pipetas de manutenção foram confeccionadas a partir de capilares
estéreis de borossilicato (1,0 mm diâmetro externo e 0,75 m diâmetro interno)
esticados (25A, escala 4,5) em um estirador de pipetas (Bachoffer-Alemanha) e
cortadas com diâmetro externo de cerca de 120 µm. A extremidade dessas pipetas
foi polida com calor em uma microforja para arredondamento da extremidade e,
posteriormente, uma dobra com ângulo de cerca de 35º foi feita a cerca de 1 mm da
extremidade, para permitir a utilização no sistema de micromanipulação.
As pipetas de microinjeção para ICSI foram estiradas da mesma forma
descrita anteriormente e a extremidade cortada com uma microforja em ângulo reto,
de forma a possuir o diâmetro interno de 7 µm e o diâmetro externo de 9 µm. A
ponta dessas pipetas não precisou ser esmerilhada para formar um bisel, uma vez
que os orifícios na zona pelúcida e na membrana oocitária são feitos com a
extremidade romba da micropipeta ao se utilizar o Piezo-manipulador, em
conseqüência dos pulsos de piezo produzidos.
A pipeta de microinjeção foi preenchida inicialmente com uma pequena
quantidade de Fluorinert (1-2 µl), seguida de uma quantidade mínima de mercúrio
com uma seringa de 1 ml (cerca de 1-2µ). A pipeta foi em seguida encaixada no
sistema de injeção, previamente preenchido com óleo mineral. Antes das injeções,
uma pequena quantidade do meio de micromanipulação foi aspirado para dentro das
pipetas de manutenção e de injeção e todo o sistema foi mantido em repouso por
alguns minutos para estabilização da pressão.
O sistema de micromanipulação foi composto de microinjetores CellTram Oil
(Eppendorf AG, Alemanha) para manutenção e CellTram Vario (Eppendorf AG,
Alemanha) para microinjeção, preenchidos com óleo mineral. Micromanipuladores
TransferMan (Eppendorf AG, Alemanha) e um piezo-manipulador (PiezoDrill,
Burgleigh) foram acoplados a um microscópio Axiovert 135 (Zeiss, Alemanha) para o
trabalho de microinjeção.
Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide - ICSI
Para cada repetição, grupos de 14 a 16 oócitos foram manipulados por
tratamento. Três gotas de 15 µl de meio de micromanipulação TCM199-HEPES
acrescido de 4 mg BSA/ ml foram feitas na tampa de uma placa de Petri de 35 mm
92
(Nunc., Naperville, IL). De 7 a 8 oócitos foram colocados em duas gotas de meio,
sendo a terceira utilizada para a lavagem da pipeta. Ao lado de cada uma destas
gotas, foram feitas outras três gotas de 5 µl da suspensão de espermatozóides
misturada à solução de polivinilpirrolidona 10% em solução salina a 0,9%. Óleo
mineral foi acrescentado de forma a cobrir completamente todas as gotas.
Um espermatozóide foi aspirado lateralmente pela pipeta de injeção de
forma que ficasse na extremidade externa da pipeta e alguns pulsos de piezo foram
dados para causar a sua imobilização. O espermatozóide foi então aspirado pela
cauda para dentro da pipeta e mantido na extremidade, sendo transferido para a
gota onde estavam os oócitos. Um oócito foi mantido pela pipeta de manutenção de
forma que o corpúsculo polar ficasse na posição de 6 ou 12 h.
A pipeta de injeção foi colocada em contato com a zona pelúcida e um
orifício era feito aplicando-se de 3 a 4 pulsos de piezo. O fragmento cortado da zona
pelúcida foi expulso da pipeta e o espermatozóide trazido para a extremidade. A
pipeta foi introduzida pelo orifício feito na zona pelúcida até próximo ao outro lado do
oócito e, através de mais um pulso de piezo, a membrana plasmática foi rompida e o
espermatozóide liberado no interior do citoplasma, procurando-se injetar a menor
quantidade possível de meio. Logo após a microinjeção, os oócitos foram lavados
novamente para remoção de restos celulares, seguindo-se a incubação ou ativação
(Fig.1).
A
B
Figura 1. ICSI-Piezo em oócito bovino centrifugado. Penetração da pipeta de injeção
pela zona pelúcida (A). Deposição do espermatozóide após perfuração da
membrana plasmática pela aplicação de pulsos de piezo (B).
93
Ativação dos oócitos
Os oócitos foram ativados em uma gota de 100µl de meio de
micromanipulação acrescido de 5 µM de ionomicina por 5 min e então foram
adicionados a esta gota 100µl de TCM/ BSA (30 mg/ ml), sendo os oócitos mantidos
em repouso por 5 min para interromper o processo de ativação. Os oócitos ativados
foram em seguida lavados em Fert-TALP (6 mg BSA/ ml) e incubados a 39ºC nesse
mesmo meio por 4 h para permitir a extrusão do segundo corpúsculo polar. Após
este período, os oócitos foram transferidos para uma gota de Fert-TALP, com 1,9
mM de 6-DMAP, e mantidos em estufa por mais 3 h. Após este período, os oócitos
foram novamente lavados e incubados em Fert-TALP, sob óleo mineral, por mais 10
h a 39ºC em estufa de CO2.
Fertilização in vitro
Parte dos oócitos maturados foram fertilizados in vitro, servindo como grupo
controle, com uma concentração espermática de 2 x 106 espermatozóides/ ml a
partir da suspensão de espermatozóides preparada inicialmente. A fertilização foi
realizada em 400 µl de meio de fertilização (Fert-TALP + 6 mg BSA/ ml), em placas
de 4 poços por 18 h em estufa de cultivo a 39ºC com 5% de CO2.
Avaliação da formação de pronúcleos e corpúsculos polares
Para a avaliação da formação de pronúcleos, oócitos que não se
apresentavam degenerados 18 h após a ICSI ou a ativação oocitária foram
colocados entre lâmina e lamínula e fixados com uma solução de etanol-ácido
acético (3:1), por 24 h a 4°C. Posteriormente, os oócitos foram corados com 1% de
lacmóide em 45% de ácido acético. Os pronúcleos foram observados sob
microscópio de contraste de fase sob aumento de 400x e classificados como NA
(nada observado), 1PN (1 pronúcleo), 2PN (2 pronúcleos), 3PN (3 pronúcleos), D-
SP (espermatozóide descondensado) e (ND-SP) espermatozóide não-
descondensado.(Fig.2).
94
A
B
Figura 2. Oócitos microinjetados com espermatozóides incubados em DTT,
apresentando 2 pronúcleos (A) e 3 pronúcleos (B), 18 h após a
ativação com ionomicina e 6-DMAP.
Cultivo dos embriões
Para a produção de embriões, os oócitos fertilizados foram retirados do meio
de fertilização 8 h após o início da FIV ou da ICSI e lavados em meio SOF/ OCS
para remoção de restos celulares. O cultivo foi realizado por 9 dias, em 400 µl de
SOF suplementado com 10% de OCS e antibióticos, sob óleo mineral, a 39 ºC em
atmosfera de alta umidade, com 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2.
Avaliação das taxas de sobrevivência, de clivagem e de desenvolvimento
embrionário
Foram considerados sobreviventes os oócitos que, 18 h após a
micromanipulação, não apresentavam sinais de degeneração, tais como a extrusão
de citoplasma, o aumento significativo do espaço perivitelínico devido à desidratação
ou a expansão da zona pelúcida em decorrência de excesso de meio microinjetado.
As taxas de sobrevivência, de clivagem e de formação de blastocisto foram
registradas nos dias d1, d3 e d7-d9, respectivamente.
Armazenamento dos embriões
Os embriões que se desenvolveram a blastocisto até o dia 9 foram lavados
três vezes em tampão Kawasaki (20 mM Tris-HCl pH 8,3; 1,5 mM MgCl2; 25 mM
95
KCl, 0,5% (v/ v) Tween 20; 0,1% PVP) e transferidos para tubos de PCR com 5 µl do
mesmo tampão e armazenados a –80°C para posterior análise de DNA.
Análise de microssatélites dos embriões produzidos por ICSI
A fim de se determinar se os embriões produzidos por ICSI foram realmente
provenientes da correta fertilização pelo espermatozóide microinjetado, foi
desenvolvido um estudo comparativo pela ampliação de seqüências de
microssatélites do DNA pela técnica da PCR dos embriões e do sêmen utilizado.
Como todos os embriões de ICSI e FIV foram fertilizados com o sêmen do mesmo
touro, os embriões de FIV convencional serviram de controle positivo para
fertilização, e os embriões produzidos pela ativação oocitária serviram de controle do
desenvolvimento partenogenético.
Preparo dos espermatozóides para análise de microssatélites
Uma palheta de sêmen congelado do mesmo touro utilizado para as
fertilizações in vitro e ICSI foi descongelada a 30ºC, por 30 seg, e o conteúdo
transferido para um tudo de 1,5 ml. Os espermatozóides foram lavados duas vezes
com 1ml de solução tampão TE (10 mMTris, 1 mM Na2EDTA; pH 7,5-8,0) por meio
de centrifugação (5.000 rpm, 10 min). Em seguida, foram adicionados ao tubo 180 µl
de solução tampão de proteinase K (20 mM Tris, 10 mM Na2EDTA, 10 mM NaCl), 5
µl de solução estoque de DTT (DTT 1M), 8 µl de solução estoque de proteinase K
(20 ng/ µl), 20 µl de SDS e incubados a 56ºC por 12 h. O DNA foi purificado com
DNA Mini Kit Qiajen e a concentração do DNA medida em um fotômetro
(BioPhotometer Eppendorf-Netheler-Hinz GmBH, Alemanha), para garantir que a
concentração da amostra não fosse inferior a 10 µg/ µl.
Preparo dos embriões para análise de microssatélites:
Os embriões foram descongelados a 30°C e lavados duas vezes em tampão
Kawasaki (Tris-HCl pH 8,3, 242 mg; MgCl2, 30 mg; KCl, 186 mg; Tween 20, 500 µl;
PVP, 100 mg; água deionizada q.s.p. 100 ml) + 0,1% PVP. Os embriões foram
então transferidos individualmente para tubos de PCR com 5 µl do mesmo tampão.
Para a dissolução da zona pelúcida e das membranas celulares, 10 µl de solução
PK (2 mg/ ml Proteinase-K em tampão Kawasaki) foram adicionados a cada tubo,
96
mantidos em gelo. Em seguida, os tubos foram incubados a 60°C por 60 min e
posteriormente, a 95°C/ 15 min, para inativação da Proteinase-K. Após esse
período, os tubos foram novamente recolocados em gelo.
Amplificação do DNA
A amplificação do DNA das amostras foi realizada em duas etapas,
consistindo de uma pré-amplificação seguida de uma reamplificação, utilizando os
primers (BM1824, BMS2113, ETH225 e TGLA227 - Metabion GmBH, Alemanha)
descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Primers utilizados para a amplificação pelo método de PCR de
microssatélites de embriões produzidos in vitro e do sêmen utilizado para a
fertilização
Primer Cromossomo Seqüência do Primer (5' - 3') Referência
BM1824
(D1S34) 1
GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC
CATTCTCCAACTGCTTCCTTG Bishop et al.,1994
ETH225
(D9S1) 9
GATCACCTTGCCACTATTTCCT
ACATGACAGCCAGCTGCTACT Steffen et al., 1993
BM2113
(D2S26) 2
GCTGCCTTCTACCAAATACCC
CTTCCTGAGAGAAGCAACACC Bishop et al., 1994
TGLA227
(D18S1) 18
CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT
ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA Georges e Massey, 1992
Pré-amplificação
Para a pré-amplificação, foi preparada uma mistura de PCR composta de
tampão PCR 10x (2µl), mistura de desoxirribonucleotídeos-trifosfato (dNTP´s) (1 µl),
mistura de primers (4 µl), H2O (1,3 µl), Taq-Polimerase HotStar (0,2 µl), Solução Q (3
µl), MgCL2 (1µl), amostra de DNA (7,5 µl), totalizando um volume de 20 µl. A mistura
de primers foi composta de 0,5 µl de cada primer. O programa para a pré-
97
amplificação das amostras consistiu das seguintes etapas: (1) aquecimento a 95ºC
por 15 min para a desnaturação inicial, (2) 30 seg a 94ºC (desnaturação), (3) 1 min.
a 55ºC (anelamento) e (4) 1min e 20 seg a 74ºC (extensão). As etapas 2 a 4
consistiam um ciclo e foram repetidas 29 vezes. Ao final da pré-amplificação, a
temperatura foi reduzida para 4ºC.
Reamplificação:
Para a reamplificação, foram preparados 8µl por amostra de uma segunda
mistura de PCR composta de (volume por amostra) tampão PCR 10x (1 µl), mistura
de desoxirribonucleotídeos-trifosfato (dNTP´s) (0,5 µl), mistura de primers (1,4 µl),
H2O (3,1 µl), Taq-Polimerase HotStar (0,1 µl), Solução Q (1,5 µl), MgCL2 (0,5 µl).
Estes 8µl de mistura foram adicionados a 2 µl de cada amostra de DNA pré-
amplificada, totalizando um volume de 10µl. A mistura de primers foi composta de
0,2 µl de TGLA 227, 0,2 µl de BM 2113, 0,15 µl de ETH 225 e 0,15 µl de BM1824
(de cada primer corado e não-corado). O programa para a reamplificação das
amostras consistiu das seguintes etapas: (1) aquecimento a 95ºC por 15 min, para a
desnaturação inicial, (2) 30 seg a 94ºC (desnaturação), (3) 1 min a 50ºC
(anelamento) e (4) 1min 20 seg a 74ºC (extensão) e (5) 10 min a 74ºC (extensão
final dos produtos). Etapas de 2 a 4 consistiam um ciclo e foram repetidas 35 vezes.
Ao final da reamplificação, a temperatura foi reduzida para 4ºC, para a conservação
dos produtos.
Análise das seqüências amplificadas
Após a reamplificação, 3 µl de cada amostra foram diluídos com 15 µl de
água e 3 µl desta diluição foram misturados com 12 µl de TAMRA/ formamida (24 µl
de TAMRA + 760µl de formamida) e as amostras processadas por um analisador
genético (ABI Prisma 310 Genetic Analyser, UK) para comparação das seqüências
de microssatélites pelo programa GeneScanTT-35. Um ou dois picos foram
registrados para cada um dos primers, para as amostras de embriões,
correspondendo aos alelos amplificados, sendo a fertilização confirmada por
comparação com os alelos dos espermatozóides.
98
Transferência de embriões para receptoras
Cinco embriões obtidos por ICSI, usando-se a metodologia de pré-tratamento
espermático em combinação com ativação, foram transferidos para duas receptoras
e avaliadas por palpação retal aos 45 e 60 dias de gestação.
Análise estatística
Análises preliminares foram realizadas para cada uma das variáveis
estudadas incluindo o efeito de tratamento no modelo estatístico. Quando o
coeficiente de variação (CV) resultante da análise de variância foi alto (CV > 35%),
os dados foram transformados em raiz quadrada e testados novamente.
No modelo da análise final, as diferenças entre os resultados, em
porcentagem do número inicial de oócitos, foram analisadas pelo procedimento
ANOVA, SAS (1998), sendo as comparações entre as médias dos tratamentos
realizadas pelo teste de Duncan. Diferenças foram consideradas significativas
quando P<0,05.
O modelo estatístico empregado para a avaliação do efeito dos tratamentos
na Análise de Variância foi:
Y ijk = µµµµ + αααα i + eijk
Onde:
Y ijk = valor observado para a variável em estudo
µ = média geral
α i = efeito do i-ésimo nível do tratamento no valor observado Y ijk
eijk = erro associado a observação Y ijk
RESULTADOS
O experimento 1 avaliou os efeitos da combinação do pré-tratamento dos
espermatozóides com DTT em combinação com ativação oocitária, usando
ionomicina e 6-DMAP, nas taxas de formação de pronúcleos em oócitos
microinjetados ou nos que foram submetidos apenas à ativação.
99
A taxa de formação de um pronúcleo (1PN) entre todos os tratamentos de
oócitos microinjetados não foi maior que 6%, porém foi significativamente maior para
os oócitos não injetados que foram ativados (38%, P<0,05). Não houve diferenças
significativas das taxas de formação de 2 pronúcleos (2PN), entre os grupos de
oócitos microinjetados com espermatozóides não-tratados, espermatozóides tratados
com DTT e espermatozóides tratados + ativação (64% vs 49% vs 62%,
respectivamente). Contudo estas taxas foram superiores àquela obtida para oócitos
ativados (20%).
A taxa de formação de três pronúcleos foi significativamente maior no grupo
de oócitos microinjetados com espermatozóides tratados e ativados (25%, P<0,05)
em relação aos demais grupos. Baixas porcentagens de espermatozóides não
injetados, não-descondensados ou descondensados foram obtidas para todos os
grupos. Apesar de não ter sido feita a identificação dos pronúcleos masculinos, tais
resultados mostram uma alta porcentagem de oócitos microinjetados fertilizados,
havendo contudo, uma deficiência da extrusão do segundo corpúsculo polar em uma
parte significativa dos oócitos microinjetados e ativados (Tabela 2).
Tabela 2. Taxas de formação de pronúcleos (PN) e de descondensação do
espermatozóide após a ICSI por meio de piezo-micromanipulador,
usando diferentes combinações de pré-tratamentos do espermatozóide
e/ ou ativação oocitária
Tratamento Rep. COC (n)
SA1 (%)
1 PN (%)
2PN (%)
3PN (%)
SPND2 (%)
SPD3 (%)
SPNI4 (%)
ICSI SP-controle 6 66 11 (17)a 4 (5)a 43 (64)a 4 (6)a 2 (3) 1 (1) 1 (1)
ICSI SP-DTT 5 66 20 (29)a,b 4 (6)a 31 (49)a 3 (4)a 2 (3) 2 (3) 4 (6)
ICSI SP-DTT + ativação 5 43 1 (3)c 3 (6)a 27 (62)a 10 (25)b 2 (5) 0 (0) 0 (0)
Somente ativação 4 64 26 (41)b 25 (38) b 13 (20)b 0 (0)a 0 (0) 0 (0) 0 (0)
Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05). 1SA: sem alteração, 2SPND: espermatozóide não-descondensado, 3SPD: espermatozóide
descondensado, 4SPNI: espermatozóide não-injetado
100
No segundo experimento, os oócitos foram submetidos a diferentes
protocolos de ICSI, com ou sem pré-tratamento espermático, em combinação com a
ativação química. Depois do cultivo dos oócitos por 9 dias, foi realizada a avaliação
das taxas de sobrevivência, de clivagem e de formação de blastocistos (Tabela 3).
Oócitos não-microinjetados e ativados serviram como grupo controle dos
resultados de ativação. Foram obtidas taxas de sobrevivência satisfatórias após a
ICSI, utilizando o Piezo-manipulador (67% a 89%). A ativação dos oócitos (sem a
microinjeção) resultou nas maiores taxas de clivagem e de formação de blastocisto
(83% e 23%, respectivamente).
Quando os oócitos foram microinjetados com espermatozóides não-tratados,
sem a realização da ativação química após a ICSI, não foi ocorreu a clivagem de
nenhum oócito e, conseqüentemente, nenhum blastocisto foi obtido. Os tratamentos
nos quais a ICSI foi realizada, apenas com pré-tratamento espermático ou com
ativação oocitária, também resultaram em baixas taxas de blastocistos (1% a 4%),
mesmo com a adição de DTT ao meio.
Tabela 3. Taxas de sobrevivência, de clivagem e de formação de blastocisto após a
ICSI, por meio de piezo-micromanipulador, usando diferentes
combinações de pré-tratamentos do espermatozóide com ou sem
ativação oocitária
Tratamento Rep. Oócitos
injetados (n)
Oócitos sobreviventes
(%)
Embriões clivados d3 (%)
Blastocistos d7-d9 (%)
Ativação 5 75 75 (100)a 62 (83)a 17 (23)a
ICSI Sp controle/ sem ativação 5 76 63 (83)abc 0 (0)b 0 (0)b
ICSI Sp controle/ com ativação 5 75 55 (73)bc 9 (12)bc 1 (1)b
ICSI Sp-DTT / sem ativação 5 75 67 (89)ab 42 (56)d 3 (4)b
ICSI Sp-DTT / com ativação 5 75 50 (67)c 39 (52)d 12 (16)a
ICSI Sp-DTT / + corte/ com ativação 5 75 62 (83)abc 37( 49)d 4 (5)b
ICSI Sp-controle/ com ativação + incub. DTT 5 75 51 (68)c 18 (24)c 3 (4)b
Valores na mesma coluna com letras diferentes variam significativamente ANOVA (P<0,05).
101
A combinação do pré-tratamento espermático com DTT e a ativação química
após a ICSI resultou na maior taxa de formação de blastocisto entre os grupos de
oócitos microinjetados (16%, P<0,05). O procedimento de corte da cauda do
espermatozóide afetou negativamente o desenvolvimento embrionário (P<0,05),
mesmo associando-se o pré-tratamento espermático com DTT e ativação química,
resultando em uma taxa de apenas 5% de blastocisto.
Todos os embriões analisados por FIV foram classificados como fertilizados
(100%) por apresentarem pelo menos um dos dois alelos igual ao do touro e não
serem homozigotos para os 4 primers.
Os embriões de partenogênese apresentaram-se homozigotos para os
quatro primers, podendo ou não os alelos serem idênticos ao do touro, sendo
classificados como não-fertilizados (100%). Contudo, entre estes embriões
partenogenéticos analisados, 3 deles apresentaram 2 alelos diferentes amplificados
para o Primer TGLA 227, mas todos foram homozigotos para os outros 3 primers.
Tabela 4. Exemplos de resultados da análise de microssatélites de embriões produzidos por FIV, ativação oocitária ou ICSI, em relação aos alelos amplificados dos espermatozóides empregados para fertilização
Primer/ Pico
BM 1824 BM 2113 ETH 225 TGLA 227 Amostra Tratamento
1 2 1 2 1 2 1 2 Obs
Espermatozóides 180 182 132 134 134 144 85 87
FIV-01 FIV 180 182 134 136 142 144 85 87 1F
ATIV-03 ATIVAÇÃO 178 178 132 132 134 134 91 91 2P
ICSI-09 ICSI + ATIV + incub. DTT 180 188 132 132 134 142 75 87 1F
ICSI-08 ICSI + SP-DTT + ATIV 180 180 128 128 134 134 75 75 3NF
1F = Fertilizado; 2P = partenogenético; 3NF = não-fertilizado (ICSI-partenogenético)
A análise do DNA dos embriões obtidos por ICSI, em comparação com o
sêmen utilizado, revelou que a maior parte dos embriões de ICSI (mínimo de 84,2%)
havia sido fertilizada pelo espermatozóide injetado. Um dos embriões de ICSI não
102
pôde ser classificado pela falta de amplificação para dois dos quatro primers, sendo
considerado como duvidoso.
Dois embriões de ICSI não apresentaram um dos alelos do touro para um
dos primers, porém foram considerados fertilizados por serem heterozigotos e
apresentarem um dos alelos do touro para os outros 3 primers. Outros dois embriões
de ICSI apresentaram-se homozigotos para ao 4 primers e foram classificados como
não-fertilizados (partenogenéticos) (Tabelas 4 e 5).
Tabela 5. Porcentagens de embriões classificados como fertilizados ou partenogenéticos após a FIV, ativação química e ICSI-Piezo pela análise de microssatélites
Grupo de tratamento-embrião analisado Blastocistos examinados
Fertilizados/ total (%)
Partenogenético ou duvidoso/ total (%)
FIV (controle) 18 18 (100) 0 (0)
Ativação química 17 0 (0) 17 (100)
ICSI (SP controle + ativação) 3 2 (67) 1 (33)
ICSI (Sp-DTT/ sem ativação) 2 2 (100) 0 (0)
ICSI (Sp-DTT Swim-up + ativação) 11 10 (91) 1 (9)
ICSI (Sp-DTT Swim-up + corte + ativação) 2 1 (50) 1 (50)
ICSI (Sp-controle + incub. DTT + ativação) 1 1 (100) 0 (0)
Total de embriões de ICSI 19 16 (84) 3 (16)
Transferência dos embriões
Cinco embriões obtidos por ICSI, usando-se a metodologia de pré-tratamento
espermático em combinação com ativação, foram transferidos por via transcervical
para duas receptoras sincronizadas sendo uma delas diagnosticada prenhe aos 45
dias de gestação, por palpação retal. Entretanto, um segundo exame deste animal
indicou a gestação havia sido interrompida, em decorrência de aborto,
aproximadamente aos 60 dias.
103
DISCUSSÃO
Tem sido descrito que a injeção intracitoplasmática de espermatózoide na
espécie bovina resulta em baixas taxas de fertilização e de desenvolvimento
embrionário.
Neste trabalho, não foi observado o aumento da taxas de formação de um ou
de 2 pronúcleos, quando foi realizado o pré-tratamento dos espermatozóides com
DTT, porém foram obtidas maiores taxas de clivagem e de formação de blastocisto.
Este fato pode estar relacionado à maior facilidade de liberação de um suposto
agente espermático promotor da ativação oocitária (SAOAF) (Tesarik et al., 1994) ou
ao aumento da permeabilidade do espermatozóide a um fator descondensador do
núcleo espermático (SNDF) (Ohsumi et al., 1996).
Não se conhece os efeitos do uso do DTT no desenvolvimento embrionário,
mas a sua combinação com substâncias detergentes como Triton X-100 ou brometo
de alquiltrimetilamônio (ATAB), pode causar alterações da integridade dos
cromossomos do espermatozóide (Szcygiel e Ward, 2002; Ward et al., 1999). A
degradação do DNA espermático também pode ocorrer quando o tempo após a
lesão da membrana até a injeção é muito prolongado. Substâncias adicionadas ao
meio de manipulação (EDTA, EGTA) poderiam manter a integridade do núcleo
espermático por horas, evitando a degradação por endonucleases (Tateno et al.,
2000; Szcygiel e Ward, 2002).
Diferentemente de Wei e Fukui (2002) que obtiveram bons resultados com o
corte da cauda do espermatozóide antes da microinjeção, nas nossas condições do
presente experimento, esse procedimento resultou em uma baixa taxa de formação
de blastocistos. Na prática, esse procedimento facilita a deposição do
espermatozóide no interior do oócitos, pois um menor volume de líquido é injetado
para a liberação do espermatozóide e, no momento de retirada da pipeta, o
espermatozóide permanece no local depositado sem que seja trazido juntamente
com a pipeta. Contudo, sabe-se que a ICSI de cabeças isoladas de espermatozóides
resulta em menores taxas de nascimento do que a injeção de espermatozóides
inteiros (Hamano et al., 1999).
104
Recentes estudos descreveram a importância das estruturas espermáticas
no processo de ativação dos oócitos e nos eventos intracelulares, nas fases iniciais
de desenvolvimento embrionário de mamíferos, seguindo à fertilização (Navara et al.,
1995; Sutovsky e Schatten, 1998; Hewitson, et al., 2000) e, possivelmente, a
remoção da cauda do espermatozóide pode levar a um comprometimento do
desenvovimento embrionário.
Na tentativa de contornar a baixa taxa de ativação oocitária em oócitos
bovinos após a ICSI, diferentes protocolos de ativação oocitária empregando
substâncias químicas também vêm sendo testados para que a eficiência da técnica
seja melhorada. O protocolo empregado no presente estudo, com o uso da
ionomicina e 6-DMAP, resultou em altas taxas de clivagem dos oócitos não
microinjetados e, quando em associação com o pré-tratamento espermático com
DTT, forneceu o melhor resultado de formação de blastocistos após a ICSI.
Os resultados obtidos neste trabalho foram semelhantes aos encontrados por
outros autores que compararam a ativação com ionomicina + 6-DMAP com outros
protocolos, envolvendo substância como etanol, Ionóforo de cálcio (Ca-I A23187),
sozinho ou associado à ciclohexamida, em diferentes tempos de exposição (Rho et
al., 1998a; Suttner et al., 2000). Contudo, os efeitos de tais substâncias no potencial
de desenvolvimento embrionário não são completamente conhecidos. A maioria dos
bezerros nascidos de ICSI foi obtida pela ativação dos oócitos microinjetados com
Ca-I A23187 (Goto et al., 1990) ou etanol a 7% (Hamano et al., 1999; Horiuchi et al.,
2002).
Sabe-se que a 6-DMAP pode causar alterações da placa metafásica,
impedindo a extrusão do segundo corpúsculo polar e, conseqüentemente, resultar
em anomalia de ploidia dos embriões. Rho et al. (1998a) avaliaram diferentes
regimes de ativação com ionomicina combinada com 6-DMAP e propuseram que um
intervalo de 3 h seria suficiente para a extrusão do segundo corpúsculo polar (>80%).
Apesar do intervalo de 4 h entre a incubação com ionomicina e a incubação com 6-
DMAP, para liberação do segundo corpúsculo polar, observou-se que mais de 25%
dos oócitos microinjetados e submetidos a este procedimento apresentavam três
corpúsculos polares.
Durante os experimentos, foi observado que algumas vezes ocorria uma
evaginação da membrana plasmática no momento de retirada da pipeta, que
105
resultava em permanência da abertura feita pela pipeta e degeneração posterior dos
oócitos. Nestes casos, a aspiração de uma pequena parte da membrana e o seu
estiramento passaram a ser suficientes para o fechamento desta abertura,
garantindo maior sobrevivência dos oócitos injetados. Em camundongos, Kimura e
Yanagimachi (1995) sugeriram o uso de temperaturas mais baixas de trabalho (17-
18ºC em vez de 27-37ºC), para evitar esta reversão da membrana.
Além dos fatores citados anteriormente, substâncias químicas utilizadas para
o procedimento de ICSI no presente trabalho como o PVP e o mercúrio também
podem influenciar negativamente os resultados de ICSI, porém seus efeitos são
discutíveis, dentro das condições de uso. É possível que a PVP presente na solução
de preparo do espermatozóide impeça o acesso de substâncias do oócitos isolando
o espermatozóide do resto do citoplasma, quando uma grande quantidade é injetada,
formando uma espécie de gota ao redor do espermatozóide.
Sabe-se que o mercúrio possui uma alta toxidade para as células de
mamíferos, podendo causar inúmeras alterações moleculares, contudo, da forma
como é utilizado na pipeta de injeção, possivelmente, não entra em contato com o
meio de manipulação e a contaminação é praticamente nula, quando o procedimento
é executado corretamente. Yanagida et al. (1998) relataram que uma concentração
de 0,6 µg/ l foi determinada na gota de injeção para ICSI quando usaram mercúrio
para prenchimento da pipeta de injeção, valor este muitas vezes inferior à
concentração de mercúrio presente no muco cervical de mulheres (220 µg/ l) e no
plasma seminal do homem (52,4 µg/ l).
Algumas pequenas falhas foram encontradas na realização da análise de
microssatélites, porém sem comprometimento para a interpretação dos resultados. A
causa exata desses erros não é determinada, podendo ser decorrente da
contaminação do material com DNA do meio ambiente, de fragmentos de DNA
provenientes do primeiro corpúsculo polar ou de células somáticas aderidas à zona
pelúcida e mesmo pela possível ocorrência de um alelo ectópico. Essa análise
possibilitou comparar seqüências de DNA amplificadas de embriões de ICSI com o
sêmen utilizado, com uma boa discriminação dos resultados. A associação dessa
metodologia com a biópsia de embriões poderá facilitar os estudos sobre os
processos de fertilização, além de permitir a caracterização genética e a avaliação
da normalidade dos embriões antes da sua transferência para as receptoras.
106
CONCLUSÕES
A utilização do Piezo-manipulador em combinação com o pré-tratamento do
espermatozóide com DTT e a ativação com ionomicina e 6-DMAP forneceu altas
taxas de formação de pronúcleos e de clivagem. Apesar de fornecer taxas razoáveis
de blastocistos, uma melhoria da técnica é necessária para se obter uma maior
eficiência do método.
A análise genética dos embriões por microssatélites mostrou-se adequada
para a avaliação da fertilização pelo método de ICSI usando o Piezo-
micromanipulador. Por meio desta análise, foi possível confirmar que a maior parte
dos embriões de ICSI foi realmente fertilizada pelos espermatozóides injetados
usando o Piezo-micromanipulador. Contudo, mais pesquisas sobre a viabilidade dos
embriões produzidos precisam ser realizadas, uma vez que as substâncias utilizadas
podem causar alterações do cariótipo ou da estrutura dos cromossomos.
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111
5. CONCLUSÕES GERAIS
O presente estudo demonstrou que a microinjeção de espermatozóide é
uma técnica possível de ser utilizada para a produção de embriões bovinos in vitro,
obtendo-se no presente trabalho a taxa máxima de blastocistos após a ICSI de 16%.
Entretanto, os resultados obtidos no presente trabalho e na literatura (0 a 20%) são
insatisfatórios quando comparados com a fertilização in vitro convencional, por meio
da qual tem-se alcançado taxas de blastocistos em torno de 40%.
A produção in vitro de embriões por ICSI está ainda mais sujeita que a FIV a
fatores que podem afetar negativamente o desenvolvimento embrionário. Os
procedimentos de preparo dos oócitos para a micromanipulação, as condições de
maturação e cultivo, os tratamentos físicos e químicos dos gametas e o método de
microinjeção podem causar danos às estruturas e aos componentes celulares,
comprometendo os resultados da ICSI.
Mais estudos são necessários sobre os efeitos dos processos laboratoriais
envolvidos (maturação in vitro, desnudamento, ativação, micromanipulação e cultivo
embrionário) nos eventos celulares durante a fertilização e o desenvolvimento
embrionário, para que a ICSI torne-se uma técnica eficiente para a produção de
embriões de bovinos.
112
APÊNDICES
113
Tabela 1A: Lista dos reagentes usados
Produto Código Firma
Ác Acético A-6283 Sigma Aldrich, Alemanha
Ac citrico C- 0759 Sigma Aldrich, Alemanha
Ácido lático L-4388 Sigma Aldrich, Alemanha
Ácido pirúvico P-4562 Sigma Aldrich, Alemanha
Aminoácidos essenciais (MEM) 11140-035 (100 x) Gibco
Aminoácidos não-essenciais (BME) 11130-036 (50 x) Gibco
ATAB (Brometo de alquiltrimetilamônio) M-7635 Sigma Aldrich, Alemanha
Brometo de Etídio E-8751 Sigma Aldrich, Alemanha
BSA A-3311 Sigma Aldrich, Alemanha
BSA livre de ácidos graxos (lag) A-8806 Sigma Aldrich, Alemanha
CaCl2 . H2O C-7902 Sigma Aldrich, Alemanha
Ciclohexamida C-7698 Sigma Aldrich, Alemanha
Citrato de Sódio S-4146 Sigma Aldrich, Alemanha
Desoxiribonucleotídeos trifosfato (dNTP´s) 1969064 Roche, Alemanha
Ditiotreitol (DTT) D-9779 Sigma Aldrich, Alemanha
DMSO D-8418 Sigma Aldrich, Alemanha
D-Penicillamine P-4875 Sigma Aldrich, Alemanha
Epinefrina E-4875 Sigma Aldrich, Alemanha
Fluorinerte F-4758 FC-77 Sigma Aldrich, Alemanha
FSH - Ovagen (20 UI NIH-FSH-S1) Immunochemical Products, NZ
Giemsa G-4507 Sigma Aldrich, Alemanha
Glutaraldeído G-7776 Sigma Aldrich, Alemanha
Glutationa G-4251 Sigma Aldrich, Alemanha
HCl 1.09057.1000 Merck, Alemanha
Heparin a H-3149 Sigma Aldrich, Alemanha
Hepes H-6147 Sigma Aldrich, Alemanha
Hialuronidase H-3506 Sigma Aldrich, Alemanha
Hipotaurina H-1384 Sigma Aldrich, Alemanha
Ionóforo de cálcio Ca-I A-23187 C 7522 Sigma Aldrich, Alemanha
Ionomicina I- 0634 Sigma Aldrich, Alemanha
KCl P-5405 Sigma Aldrich, Alemanha
KH2PO4 P-5655 Sigma Aldrich, Alemanha
Lactato de sódio (60%) L-4263 Sigma Aldrich, Alemanha
L-Glutamina G-6392 Sigma Aldrich, Alemanha
114
Mercúrio 21545-7 Aldrich Chem. Co.
Metanol 1.06009.1000 Merck, Alemanha
MgCl2 .H2O M-2393 Sigma Aldrich, Alemanha
Na2HPO4 S-5136 Sigma Aldrich, Alemanha
Na2HPO4 x 7H2O S-9390 Sigma Aldrich, Alemanha
NaCl S-5886 Sigma Aldrich, Alemanha
NaH2PO4 x H2O S-9638 Sigma Aldrich, Alemanha
NaHCO3 S-5761 Sigma Aldrich, Alemanha
OCS (soro de vaca em estro) Coletado in vivo
Óleo mineral M-3516 Sigma Aldrich, Alemanha
Orceína O-7505 Sigma Aldrich, Alemanha
PBS em pó D-5652 Sigma Aldrich, Alemanha
Penicilamina P-5125 Sigma Aldrich, Alemanha
Penicilina P-4687 Sigma Aldrich, Alemanha
PMSF P-7626 Sigma Aldrich, Alemanha
Primers - Metabion, Alemanha
Protease P-8811 Sigma Aldrich, Alemanha
Proteinase K P-8044 Sigma Aldrich, Alemanha
PUC 19 DNA / MspI (HpaII) - MBI Fermentas, Alemanha
PVP-Polivinilpirrolidona PM 40.000 P-0930 Sigma Aldrich, Alemanha
Solução Q Quiagen, Alemanha
Streptomycin S-1277 Sigma Aldrich, Alemanha
Sulfato de gentamicina G-3632 Sigma Aldrich, Alemanha
Tampão PCR 10 x 27-0799 Amersham Pharmacia, Alemanha
Tamra-dUTP 401766 Applied Biosystem, Alemanha
Taq Polimerase 201205 Qiagen, Alemanha
TCM 199 F0615 Biochrom, Alemanha
Triton X-100 T-8787 Sigma Aldrich, Alemanha
Vermelho de fenol P-4633 Sigma Aldrich, Alemanha
6-DMAP (6-Dimetilaminopurina) D-2629 Sigma Aldrich, Alemanha
115
Tabela 2A: Composição das soluções de uso
Nome da solução Componentes Quantidades
Aceto-orceína
Ácido acético ....................................................... Etanol .................................................................. Orceína................................................................. Citrato de sódio....................................................
5 ml 5 ml 500 mg 50 mg
Cal A23187 (5 µM)
Ca-I A23187 estoque........................................... TCM 199-HEPES + 4 mg BSA/ ml......................
997,5 µl 1 ml
Ciclohexamida (10 µg/ ml)
CHX estoque ....................................................... Fert-TALP.............................................................
2,0 µl 0,5 ml
Fert-Talp - Meio de fertilização
Fert-Talp estoque................................................. BSA...................................................................... Piruvato estoque 1............................................... Heparina estoque.................................................
9,5 ml 60 mg 100 µl 250 µl
Hialuronidase (sol. desnudamento)
TCM 199-HEPES + 4 mg/ ml BSA ...................... Hialuronidase estoque………...............................
900 µl 100 µl
Ionomicina (5 µM)
Ionomicina estoque.............................................. TCM 199-HEPES + 4 mg/ ml de BSA .................
1 µl 1 ml
Meio de interrupção da ativação TCM 199-HEPES...........……............................... BSA .....................................................................
3 ml 90 mg
mPBS PBS...................................................................... BSA......................................................................
10 ml 40 mg
MPM (meio de maturação)
MPM..................................................................... OCS...................................................................... FSH estoque........................................................ Piruvato estoque 2…..………………….................
9 ml 1 ml 100 µl 100 µl
Solução de PVP 10% (Polivinilpirrolidona)
PVP............................................... ...................... Sol. NaCl 0,9% ....................................................
1 g 10 ml
116
SOF/ OCS (Meio de cultivo)
SOF estoque........................................................ OCS...................................................................... MEM..................................................................... BME...................................................................... Piruvato estoque 2...............................................
9 ml 1 ml 100 µl 200 µl 150 µl
Sp-TALP (Meio para Swim-up)
Sp-TALP estoque................................................. Piruvato estoque 1............................................... BSA...................................................................... Gentamicina estoque........................................... PHE estoque……………………………................ pH 7,35 - 7,4
9,5 ml 500 µl 60 mg 10 µl 10 µl
Coleta de oócitos TCM –199 HEPES
TCM 199-Hepes.................…............................. OCS.....................................................................
9 ml 1 ml
Etanol/ ác.acético (3:1)
Etanol................................................................... Ác. acético............................................................
30 ml 10 ml
6-DMAP 1,9 mM
Fert-Talp + 4 mg BSA/ ml ……............................ 6-DMAP estoque.....…....………………................
1 ml 10µl
Tabela 3A: Composição das soluções estoque
Nome do meio Componente Quantidade
6-DMAP estoque
6-DMAP........................................................... DMSO.............................................................
3,1 mg 100 µl
Ca-l A23187 estoque DMSO……...................................................... Ca-I A23187....................................................
475 µl 1 mg
Ciclohexamida estoque (2,5µg/ µl)
Etanol absoluto (99%) …………..................... Ciclohexamida………………………................
1 ml 25 mg
DTT estoque
Água Milli-Q ..……….....…………................... DTT .........................…………….....................
250 µl 35 mg
FSH estoque
FSH (Ovagen 20 U NIH-FSH-S1)……............ NaCl 0,9%……………..............………............
10 mg 10 ml
Gentamicina estoque
Gentamicina ……………………...................... NaCl 0,9% .…….......……...…….....................
250 mg 5 ml
117
Heparina estoque (200 µg/ ml) Heparina.......................................................... Fert-Talp Estoque...........................................
1 mg 5 ml
Ionomicina estoque (5 mM) DMSO……………………………......................
Ionomicina………………….............................. 268 µl 1 mg
MPM estoque (modified Parker`s Medium)
Ác lático........................................................... Água Milli-Q..................................................... TCM 199......................................................... L-Glutamina..................................................... NaHCO3.......................................................... Hepes.............................................................. Piruvato estoque 2.......................................... Gentamicina estoque...................................... (Osmolaridade. 280-300 mOsm)
300,0 mg 50,0 ml 500 ml 50 ,0 400 mg 700 mg 100 µl 550 µl
PHE-Estoque 10 µl em 10 ml Fert-talp ou Sp-Talp resultam em: Penicilamina (20 µM) Hipotaurina (10 µM) Epinefrina (2 µM)
Penicilamina..........……………………….....…. Hipotaurina estoque(10mg + 1000 ml H20)..... Epinefrina estoque(3,7 mg + 1000 ml H20)..... Água Milli-Q………........……………................
3 mg 100 µl 100 µl 800µl
Piruvato estoque 1 (para Sp-TALP e Fert-TALP)
Na-Piruvato..................................................... 0,9% NaCl.......................................................
11 mg 5 ml
Piruvato estoque 2 (para MPM e SOF)
Na-Piruvato ................................................... 0,9% NaCl.......................................................
230 mg 10 ml
SOF estoque
Água-Milli-Q.................................................... NaCl………………........................................... KCl………………............................................. KH2PO4………………...................................... CaCl2 x 2H2O………………............................. MgCl2 6H2O………………............................... NaHCO3………………..................................... Vermelho de fenol........................................... Glutamina estoque (200 mmol) ...................... Na-Lactato 60 % ............................................ pH 7,2 – 7,3 270–280 mOsmol
500 ml 3146 mg 267 mg 81 mg
123,9 mg 48,3 mg 1053 mg 0,7 mg 2,5 ml 235,3 µl
[LFM1] Comentário: l
118
Sp-TALP estoque
Aqua - Milli-q……...................………......... KCl………………........................................ NaHCO3………………................................ NaH2PO4 x H2O……......………….............. Hepes ……………..................................... Vermelho de fenol....…………...........……. Na-Lactato (60%).........................………… MgCl2 x 6 H2O………….............................. CaCl2 x H2O……..........……....................... 280 mOsmol
500 ml 115 mg 1045 mg 20 mg 1190 mg 5 mg 1,84 ml 155 mg 191,9 mg
Streptomicina estoque
Penicilina..................……………................ Streptomicina..................………................
250 mg 150,4 mg
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 014/2004
Matos, Luis Fonseca
Produção in vitro de embriões bovinos por meio da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) / Luis Fonseca Matos. – 2004. 118 f. : il.
Orientador: Reginaldo da Silva Fontes Tese (Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias
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