Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos · Clonagem Produção de múltiplos organismos idênticos,...

Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos

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DraDra. . FernandaFernanda CanduriCanduriLaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares..DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. UNESP. UNESPSãoSão José do Rio José do Rio PretoPreto -- SP.SP.

IntroduçãoIntrodução à à BioquímicaBioquímica

Tópicos

! Estrutura e função dos nucleotídeos

! Estrutura dos ácidos nucléicos

! Visão geral da função dos ácidos

nucléicos

! Sequenciamento dos ácidos nucléicos

! Tecnologia do DNA recombinante

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Métodos para sequenciar ácidos nucléicos

• Sequenciamento manual

: 2´,3´-dideoxinucleosídeo-trifosfato – ddNTP

• Sequenciamento automático

: Marcadores fluorescentes

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Sequenciamento pelo método de terminação de cadeia – seq. manual

Uso de marcadores fluorescentes -Sequenciamento automático

Tecnologia do DNA Tecnologia do DNA recombinanterecombinante

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! Técnicas de clonagem

! Bibliotecas genômicas

! Amplificação de DNA por PCR

! Aplicações da Tecnologia do DNA

recombinante

Tecnologia do DNATecnologia do DNA recombinanterecombinante

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Como genes são isolados dafita de DNA ??

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As nucleases de restrição

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A endonuclease cliva um ácido nucléico no interior de uma fita polinucleotídica

A exonuclease cliva um ácido nucléico por meio da remoção de um dos seus resíduos terminais

Técnicas de clonagem

" Amplificação de um segmento de DNA

1. Um fragmento de DNA de tamanho apropriado é produzido por meio de endonucleases de restrição, e isolado

2. O fragmento é incorporado em uma outra molécula de DNA (vetor), que contém as seqüências necessárias para dirigir a replicação do DNA

3. O vetor recombinado é introduzido em células, onde é replicado

4. As células que contém o DNA desejado são identificadas, ou selecionadas

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Clonagem

Produção de múltiplos organismos idênticos, derivados de um ancestral comum

Em um organismo hospedeiro (como E. coli) podem ser produzidas grandes quantidades do

DNA

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Uso da DNA-ligase naclonagem

! A DNA-ligase une fragmentos de DNA paraproduzir uma molécula de DNA-recombinante

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Plasmídeos bacterianos podemser usados para clonar DNA

! Plasmídeo: DNA circular

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Genes humanos são isolados pela clonagem de DNA

Plasmídeorecombinante

Vetor de clonagem -plasmídeo

+

fragmento de DNA

(inserto)

Os plasmídeos recombinantes são geralmente clonados em células

bacterianas

Processo denominado transformação

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Bibliotecas genômicas

Bibliotecas de cDNArepresentam o RNAmproduzido por determinadotecido

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A hibridização permite que mesmo genes poucorelacionados possam ser identificados – relação com a função de proteínas conhecidas

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Amplificação de DNA por PCR

! A reação em cadeia da polimerase amplificasequências selecionadas de DNA

↓Iniciadores

! Proteínas celulares raras podem ser produzidas em grandes quantidades usandoDNA clonado

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PCR

Aplicações da Tecnologia do DNA recombinante

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Expressar a proteína quinase (CDK9), purificá-la, para então resolver sua estrutura cristalográfica a

alta resolução.

Usar as informações estruturais para desenhar drogas específicas.

Objetivos

Estudo estrutural da CDK9

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Principal função das CDKs

O ciclo celular

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Ciclo de divisão celular: processo básico da gênese de novas células

Mitose

O sistema controle do ciclo celular está baseado em duas famílias de proteínas que são chaves para o seu funcionamento:

1) quinases dependentes de ciclinas (“cyclin-dependent kinase” – CDKs),

2) ciclinas, denominadas proteínas ativadoras.

A regulação da divisão celular é crucial para o desenvolvimento normal de organismos multicelulares

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Cada subunidade catalítica da CDK pode associar-se a diferentes ciclinas

Existem ao todo 13 CDKs (CDK1-CDK13).

CDKs1-8 estão envolvidas no controle do ciclo celular.CDKs 9 e 10 são importantes reguladores transcricionais.CDKs 11-13 – suas funções não estão bem claras

Ciclinas A - T

Existem 15 Existem 15 ciclinasciclinas::

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CDKs e ciclinas

A formação, ativação e a separação dos complexosciclinas-CDKs são os eventos fundamentais que coordenam o ciclo celular

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Proteínas regulatórias – envolvidas em neoplasias

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Quinase dependente de ciclina 9

(CDK9)

CDK9 é uma subunidade catalítica da P-TEFb, um fator de transcrição que estimula a elongação da RNA polimerase II

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Complexo de pré-iniciação para a transcrição da RNA polimerase II do HIV (Fackler et al., 2001).

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Ex.: Replicação do vírus HIV

O estudo estrutural de proteínas envolvidas na sua replicação são importantes para o desenvolvimento de novos inibidores da sua transcrição.

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Clonando o gene da CDK9

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Sequenciamento

Transformação

Purificação do vetor

cDNA total + iniciadoresPCR

Reação com ligase

Amplificação do fragmento de cDNA

Extração e purificação do gene da CDK9

Inserção do gene da CDK9 no vetor pET23a

Clonagem do vetor em Escherichia coli (DH10B)

Clonagem e expressão em E. coli (BL21-DE3)

plasmídeo →→→→

Solubilização!!

Purificação da CDK9LaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..

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5´

3´

Mapa do vetor pET23a, mostrando os sítios de restrição no (MCS) sítio múltiplo de clonagem (flecha em preto).

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Desenho dos primers

Primer S: 5´ CGC GAA TTC ATG GCA AAG CAG TAC GAC 3´Primer A: 5´ CCG GAA TTC TCA GAA GAC GCG CTC AAA C 3´

ssíítio da enzima de restritio da enzima de restriçãção Eco RIo Eco RI

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pET23a + fragmento da CDK9

Vetor pET23a linearizado com enzima de restrição, mostrando a inserção do gene da CDK9 com T4 DNA ligase.

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IntervenIntervençãção da atividade de o da atividade de CDKsCDKs

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ConseqConseqüêüências da inibincias da inibiçãção deo de CDKsCDKs

Interrupção do ciclo celularApoptose DiferenciaçãoEfeitos transcricionais

Moduladores diretos de Moduladores diretos de CDKsCDKs

Flavopiridol UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)OlomoucinaRoscovitinaPurvanalol

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Inibidores de Inibidores de CDKsCDKs

Ligam-se ao sítio de ligação do ATP, com o benzopirano ocupando a mesma região do anel de purina do ATP

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Por estar envolvida na proliferação celular, apoptose, funções neuronais e transcrição, inibidores farmacológicos de CDKs são usados em múltiplas áreas terapêuticas.

Potenciais aplicações dos inibidores de CDKs

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Elementos de estrutura secundária da CDK9 complexada com o inibidor flavopiridol, obtida por modelagem molecular por homologia (MODELLER).

Modelagem da CDK9 com flavopiridol

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Situação atual do projeto

Purificar em grande quantidade e tentar cristalizar a CDK9 para resolver sua

estrutura cristalográfica

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