Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos · Clonagem Produção de múltiplos organismos idênticos, derivados de um ancestral comum Em um organismo hospedeiro (como E. coli) podem ser

Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos

LaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..www.www.biocristalografiabiocristalografia..dfdf..ibilceibilce..unespunesp..brbr

DraDra. . FernandaFernanda CanduriCanduriLaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares..DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. UNESP. UNESPSãoSão José do Rio José do Rio PretoPreto -- SP.SP.

IntroduçãoIntrodução à à BioquímicaBioquímica

Tópicos

! Estrutura e função dos nucleotídeos

! Estrutura dos ácidos nucléicos

! Visão geral da função dos ácidos

nucléicos

! Sequenciamento dos ácidos nucléicos

! Tecnologia do DNA recombinante


Métodos para sequenciar ácidos nucléicos

• Sequenciamento manual

: 2´,3´-dideoxinucleosídeo-trifosfato – ddNTP

• Sequenciamento automático

: Marcadores fluorescentes


Sequenciamento pelo método de terminação de cadeia – seq. manual

Uso de marcadores fluorescentes -Sequenciamento automático

Tecnologia do DNA Tecnologia do DNA recombinanterecombinante


! Técnicas de clonagem

! Bibliotecas genômicas

! Amplificação de DNA por PCR

! Aplicações da Tecnologia do DNA

recombinante

Tecnologia do DNATecnologia do DNA recombinanterecombinante


Como genes são isolados dafita de DNA ??


As nucleases de restrição


A endonuclease cliva um ácido nucléico no interior de uma fita polinucleotídica

A exonuclease cliva um ácido nucléico por meio da remoção de um dos seus resíduos terminais

Técnicas de clonagem

" Amplificação de um segmento de DNA

1. Um fragmento de DNA de tamanho apropriado é produzido por meio de endonucleases de restrição, e isolado

2. O fragmento é incorporado em uma outra molécula de DNA (vetor), que contém as seqüências necessárias para dirigir a replicação do DNA

3. O vetor recombinado é introduzido em células, onde é replicado

4. As células que contém o DNA desejado são identificadas, ou selecionadas


Clonagem

Produção de múltiplos organismos idênticos, derivados de um ancestral comum

Em um organismo hospedeiro (como E. coli) podem ser produzidas grandes quantidades do

DNA


Uso da DNA-ligase naclonagem

! A DNA-ligase une fragmentos de DNA paraproduzir uma molécula de DNA-recombinante


Plasmídeos bacterianos podemser usados para clonar DNA

! Plasmídeo: DNA circular


Genes humanos são isolados pela clonagem de DNA

Plasmídeorecombinante

Vetor de clonagem -plasmídeo

+

fragmento de DNA

(inserto)

Os plasmídeos recombinantes são geralmente clonados em células

bacterianas

Processo denominado transformação



Bibliotecas genômicas

Bibliotecas de cDNArepresentam o RNAmproduzido por determinadotecido


A hibridização permite que mesmo genes poucorelacionados possam ser identificados – relação com a função de proteínas conhecidas


Amplificação de DNA por PCR

! A reação em cadeia da polimerase amplificasequências selecionadas de DNA

↓Iniciadores

! Proteínas celulares raras podem ser produzidas em grandes quantidades usandoDNA clonado


PCR

Aplicações da Tecnologia do DNA recombinante


Expressar a proteína quinase (CDK9), purificá-la, para então resolver sua estrutura cristalográfica a

alta resolução.

Usar as informações estruturais para desenhar drogas específicas.

Objetivos

Estudo estrutural da CDK9


Principal função das CDKs

O ciclo celular


Ciclo de divisão celular: processo básico da gênese de novas células

Mitose

O sistema controle do ciclo celular está baseado em duas famílias de proteínas que são chaves para o seu funcionamento:

1) quinases dependentes de ciclinas (“cyclin-dependent kinase” – CDKs),

2) ciclinas, denominadas proteínas ativadoras.

A regulação da divisão celular é crucial para o desenvolvimento normal de organismos multicelulares


Cada subunidade catalítica da CDK pode associar-se a diferentes ciclinas

Existem ao todo 13 CDKs (CDK1-CDK13).

CDKs1-8 estão envolvidas no controle do ciclo celular.CDKs 9 e 10 são importantes reguladores transcricionais.CDKs 11-13 – suas funções não estão bem claras

Ciclinas A - T

Existem 15 Existem 15 ciclinasciclinas::


CDKs e ciclinas

A formação, ativação e a separação dos complexosciclinas-CDKs são os eventos fundamentais que coordenam o ciclo celular


Proteínas regulatórias – envolvidas em neoplasias


Quinase dependente de ciclina 9

(CDK9)

CDK9 é uma subunidade catalítica da P-TEFb, um fator de transcrição que estimula a elongação da RNA polimerase II


Complexo de pré-iniciação para a transcrição da RNA polimerase II do HIV (Fackler et al., 2001).


Ex.: Replicação do vírus HIV

O estudo estrutural de proteínas envolvidas na sua replicação são importantes para o desenvolvimento de novos inibidores da sua transcrição.


Clonando o gene da CDK9


Sequenciamento

Transformação

Purificação do vetor

cDNA total + iniciadoresPCR

Reação com ligase

Amplificação do fragmento de cDNA

Extração e purificação do gene da CDK9

Inserção do gene da CDK9 no vetor pET23a

Clonagem do vetor em Escherichia coli (DH10B)

Clonagem e expressão em E. coli (BL21-DE3)

plasmídeo →→→→

Solubilização!!

Purificação da CDK9LaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..

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5´

3´

Mapa do vetor pET23a, mostrando os sítios de restrição no (MCS) sítio múltiplo de clonagem (flecha em preto).


Desenho dos primers

Primer S: 5´ CGC GAA TTC ATG GCA AAG CAG TAC GAC 3´Primer A: 5´ CCG GAA TTC TCA GAA GAC GCG CTC AAA C 3´

ssíítio da enzima de restritio da enzima de restriçãção Eco RIo Eco RI


pET23a + fragmento da CDK9

Vetor pET23a linearizado com enzima de restrição, mostrando a inserção do gene da CDK9 com T4 DNA ligase.


IntervenIntervençãção da atividade de o da atividade de CDKsCDKs


ConseqConseqüêüências da inibincias da inibiçãção deo de CDKsCDKs

Interrupção do ciclo celularApoptose DiferenciaçãoEfeitos transcricionais

Moduladores diretos de Moduladores diretos de CDKsCDKs

Flavopiridol UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)OlomoucinaRoscovitinaPurvanalol


Inibidores de Inibidores de CDKsCDKs

Ligam-se ao sítio de ligação do ATP, com o benzopirano ocupando a mesma região do anel de purina do ATP


Por estar envolvida na proliferação celular, apoptose, funções neuronais e transcrição, inibidores farmacológicos de CDKs são usados em múltiplas áreas terapêuticas.

Potenciais aplicações dos inibidores de CDKs


Elementos de estrutura secundária da CDK9 complexada com o inibidor flavopiridol, obtida por modelagem molecular por homologia (MODELLER).

Modelagem da CDK9 com flavopiridol


Situação atual do projeto

Purificar em grande quantidade e tentar cristalizar a CDK9 para resolver sua

estrutura cristalográfica


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