Reações de Nitrosilação Marcelo G. de Oliveira Prof. Associado – Instituto de Química –...

Reações de

Nitrosilação

Marcelo G. de Oliveira

Prof. Associado – Instituto de Química – UNICAMP

(e de Nitrosação

também)

Células endoteliais

Hemácias

Células

musculares

lisas

Vaso sanguíneo

vasodilatação

Vasoconstrição

agregaçãoantiagregação

Fat. trombogênicos

Fat. anticoagulantesFat. mitogênicos

Inib. crescimento

Vasodilatação produzida pelo NO endógeno

1987 - Ignarro et al. - Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 9265 EDRF = NO

1998 - Furchgot, Ignarro and Murad – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

Ach +

CaCa2+

e-NOS

O2

+

L-Arginina

NO

+

L-Citrulina

NO

GC

GTP cGMP

Relaxamento

Células endoteliais Células musculares lisas

SISTEMA DIGESTIVO

Promove a dilatação estomacalAtiva os movimentos peristálticos

NO

SISTEMA NERVOSO

NeurotransmissorInibição da contração da musculatura lisa

Plasticidade neuronalMemória de longo prazo

SISTEMA MUSCULAR

Regula o tônus muscularVasodilatação localizada

SISTEMA IMUNOLÓGICO

Agente bactericidaInibe a replicação de vírus

Destoi células tumorais

SISTEMA CIRCULATÓRIO

Vasodilatação de veias e artérias Controle da pressão sanguínea Liberação de O2 a partir da HbO2

Controle do fluxo sanguíneo nos rins

Funções bioquímicas do NO

Oxido Nítrico

2 p

2 s

2 pzb

*z

bx y

*z y

2 s

s *

sb

N a t o m i c o r b i t a l O a t o m i c o r b i t a l

N O N O

Diagrama de Orbitais Moleculares do NO

By: Steven Hunt, June 18, 1997

You've just cut your finger on the edge of a piece of paper. In a flash, you stick your finger in your mouth, thinking that will make it better. Well…your hunch is not that far off. In fact, licking your wounds is one of those instinctive things most people don't think about much, but according to researchers in Britain, it's not only instinctive. It has healing properties to boot.In the same way that dogs and other animals are often seen licking their wounds, humans too, it's been found, can do better by licking their injuries than by leaving them alone. Dr. Nigel Benjamin, a clinical pharmacologist with St. Bartholomew's and the London School of Medicine and Dentistry, has discovered that it all comes down to how saliva reacts with skin."We'd been looking at nitrite in saliva for some time," Benjamin states, "mainly because we'd been interested in nitric oxide and its effects in disease processes." That's because nitric oxide - the compound that results when saliva interacts with the skin - has for several years been known to play a role in the body's fight against germs. But Benjamin and his London colleagues were interested in finding out whether licking your wounds had any real effect on the healing process."We looked at the comparison of what happens when you use saliva to wet your skin compared to just normal saline," Benjamin explains. "And we found that the saliva produces loads of nitric oxide." With nearly 10 times the amount of nitric oxide on licked skin compared to non-licked skin, Benjamin says, "there is a definite function for this nitric oxide in order to protect us when we wound ourselves from contamination by unwanted bacteria."

Scientists discover a reason to lick your wounds

By: Steven Hunt, June 18, 1997

Ações do NO no Sistema Imunológico

Macrófagos Neutrófilos

2NO + O2 = 2 NO2 = N2O3

N2O3 + H2O = 2 HNO2 = 2 NO2-- + 2 H+

NO3-

NO em excesso choque séptico

AÇÃO CITOTÓXICA DO NO CONTRA BACTÉRIAS VÍRUS E CÉLULAS TUMORAIS

Inativação de enzimas:-do ciclo de Krebs-da síntese de DNA

-de funções mitocondriais

APOPTOSE NECROSE

NO

Reação com:

-Centros Fe-S (Fe4S4)

- RSH

- R-tirosila

Desaminação

do DNA

Oxidação de

membranas

Fe - NO NO + Fe(II) ou Fe(III) (NITROSILAÇÃO)

R-SNOO2/Cu2+/O2

.-

NO + R-SH

(NITROSAÇÃO)

NO + R-NH2

O2/Cu2+/O2.-

R-NNO

NO = ligante nitrosila

CO = ligante carbonila

-SNO = NITROSOTIOL

-NNO = NITROSAMINA

NO, Superóxido e Peroxinitrito

NO + O2.- ONOO-

NO O2.-

Oh NO !!

ONOO- em excesso choque séptico

ONOO- + H+ NO2. + OH.

Ativação da Guanilato Ciclase solúvel:Uma reação de NITROSILAÇÃO

ATEROSCLEROSE

DISFUNÇÃO

ENDOTELIAL

DISFUNÇÃO

ENDOTELIAL

Hipertensão

Oclusão arterialVasoespasmo

Falha na regulação da produção endógena de Óxido Nítrico (NO)

Nitratos de

Isosorbida

[Fe(CN)5NO]2-

GC

GTP cGMP

Células Endoteliais Células musculares lisas

GTP cGMP

Relaxamento

Relaxamento

NO

NO

CH CH2

O

NO2

CH2

O

NO2

NO2

O

GC

NO

Doadores exógenos de NO

Nitroprussiato de sódio

Shishido, SM, de Oliveira MG, Prog. React. Kinetic Mech. 26, 239, 2001

II

+

e-

NO NPS red

NO NPSCN NPS

CN NPS red 2089

[FeII(CN)5H2O]3-

2038

52

56

60

64

68

72

% T

rans

mitâ

ncia

2200 2150 2100 2050 2000 1950 1900 1850

Número de onda / cm-1-1

NPS + cisteina (pH 7.4)

Variação espectral no IV

[FeII (CN)5NO+]2- + RS-

[FeII (CN)5H2O]3- + NO + 1/2 RSSR

(Aquoferrocianeto)

2038 cm-1

[FeI (CN)5NO+]3- + 1/2 RSSR

(NPS reduzido)

2089 cm-1

300

0,1

0,2

0,3

Abs

orbâ

ncia

400 500 600 700 800

Comprimento de onda / nm

Espécie transiente

521

[FeII(CN)5H2O]3-

338

NPS + cisteina (pH 10)

Variação espectral (UV/VIS)

N

Fe

CN

NC CN

CNNC

OSR

N

Fe

CN

NC CN

CNNC

O

SR

3

ADUTO INTERMEDIÁRIO NO

ATAQUE NUCLEOFÍLICO

DO ÂNION TIOLATO AO NO DO NPS

MODELO ANIMAL

RATOS WISTAR: - Normotensos - Agudamente hipertensos (L-NAME)

Pressão arterial Média (MAP) (Artéria femural)Infusões intravenosas de:

NACNPS

+

QUEDA DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (MAP)

APÓS A INFUSÃO DE NPS e (NPS + NAC)

-45

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0 SNP SNP +NAC SNP SNP+NAC

*

M

AP

(m

mH

g)

Normotensive rats Hypertensive rats

Normotensos

hipertensos

Ricardo, KF, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biology and Chemistry: 7, 57, 2002

-S- H+

NO

------------ H2O-S•

S-NITROSOTIOIS(RSNOs)

S-nitroso-L-cisteina

CS N

O

181 Å3

Sintetizando S-nitrosotiois

NOgás Solução de tiól

ÃO ACONTECE NADA!!!N

Oxido Nítrico

2 p

2 s

2 pzb

*z

bx y

*z y

2 s

s *

sb

N a t o m i c o r b i t a l O a t o m i c o r b i t a l

N O N O

Diagrama de Orbitais Moleculares do NO

NO + RSH RSNO + H+ + e-

2 NO + O2 2 NO2 N2O4

NO

N2O3

O2N-NO O2N

- NO+

   O2N

- NO+ + RS- H+ RS-NO + H+ NO2

-

S-NITROSAÇÃO DE TIOIS

HO-••• NO+ + RS-•••H+

S-NITROSAÇÃO DE TIOISEM SOLUÇÃO AQUOSA

4NO + O2 + 4 RSH 4RSNO + 2 H2O

N2O3 + H2O 2 HNO2 2 HO- ••• N O+ 2H+ + 2NO2

-

RS-NO + H2O

Sistema de nitrosação

PATENTE REQUERIDA (INPI, 2001)

S-nitrosotiois: Transições eletrônicasC

S NO

nO (s)

nO* (a)nN* (a)

nN (s)

N atomic orbitals O atomic orbitals

nN*

(Anti)

nN*

(Syn)

*

250 300 350 400 450

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Ab

sorb

an

ce

Wavelength (nm)

500 550 6000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Wavelength (nm)

Ab

sorb

an

ce

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Ab

sorb

ân

cia

300 400 500 600

Comprimento de onda / nm

0.0

0.5

1.0

Ab

s.

em

=

545 n

m

0 50 100Tempo/ s

Controle da síntese de S-nitrosotiois por borbulhamento

Estruturas dos S-nitrosotiois sintetizados

S-nitrosocisteina

(CisNO)

S-nitroso-N-acetilcisteina

(SNAC)

S-nitrosoglutationa

(GSNO)

-60

-50

-40

-30

-20

-10

02.8 11 26 34 43 51 107 214 428 571 714 854

Dose (x10-2 mol/kg body wt)

M

AP

(m

mH

g)

Normotensive rats

-60

-50

-40

-30

-20

-10

02.8 11 26 51 107 214 428

Dose (x10-2 mol/kg body wt)

M

AP

(m

mH

g)

Hypertensive rats

Dose-resposta da PAM na administração de

SNAC em ratos

NORMOTENSOSAGUDAMENTE

HIPERTENSOS (L-NAME)

POTÊNCIA E DURAÇÃO DO EFEITO HIPOTENSOR DA SNAC E DO NPS EM

RATOS WISTAR NORMOTENSOS

Ricardo, K F, Shishido SM, de Oliveira, MG, Krieger, MH, Nitric Oxide Biol.and Chem. 7, 57 (2002)

10

8

6

4

2

0

(B)

SNP SNAC SNP SNAC

Tim

e (m

in)

MA

P (

mm

Hg)

SNP SNAC

-10

-20

-30*

(A)

PBS infusion PBS+MB infusion Azul de Met.

Potência

Duração do efeito

Proteína

S- H+

NO

RS-NO

SNO

R-S H

S

Ratos Wistar

- Diabéticos (ob/ob)

- Nocaute iNOS (C57BL/6)

(controle + Dieta hipercolesterolêmica –24 semanas)

MODELO ANIMAL Efeito da administração de GSNO na nitrosação

do receptor de insulina

(Modelo de Resistência à Insulina)

ATEROSCLEROSE

RESISTÊNCIA

À iNSULINA

RESISTÊNCIA

À iNSULINA

DIABETES TIPO 2

DISLIPIDEMIAHIPERTENSÃO

AUMENTO NA PRODUÇÃO DE iNOs

Ligação da Insulina ao Receptor de insulina trans-membrana

Receptor de insulina

Membrana plasmática

Insulina

Autofosforilação dos resíduos de tirosina do receptor de Insulina

Membrana plasmática

                           Cadeia A da Insulina Cadeia B da Insulina

Monômero da Insulina

Nitrosação da subunidade do Receptor de Insulina

RS-NO

-RSH -RS-NO

RS-H

S S

Detecção da nitrosação do receptor de insulina pelo

Método fluorimétrico DAN/NAT

2 (Receptor - S-NO) (Receptor- S – S - Receptor) + 2 NO

2 NO + O2 2 NO2- + H2O 2 HNO2

HgCl2

NH2

NH2

NO

NO2-

H2O

+

NH2

N

H

NO

NH2

N N OH2+

2,3 Diaminonaftaleno (DAN) - H2O

NN

NH2

+N

N

NH

2,3 naftotriazola (NAT) Intermediário I

HNO2

2,3 naftotriazol (NAT)

pH 1-2

30 min, 37C

pH 11-12

H+

excit = 375 nm

Espectro de emissão do Naftotriazol

e curva de calibração com NO2-

Limite de detecção: < 5 nmol L-1

400 440 480 5200

100

200

300

400(B)(A)

In

tens

idad

e de

flu

ores

cênc

ia

Comprimento de onda / nm

0 100 200 300 400

0

200

400

600

800

[NaNO2] / nmolL

-1

Intensidade de fluorescência em = 407 nm

420 480 5400

20

40

60

80

100

Ctr

HC

Adiposo

In

tens

idad

e de

flu

ores

cênc

ia

Comprimento de onda / nm420 480 540

HC

CtrCtr

Hepático

420 480 540

HC

Muscular

Detecção da nitrosação dos substratos de receptores de

Insulina (IRS1) em imunoprecipitados (ratos ob/ob)

Carvalho-Filho, M.A., Ueno, M., Seabra, A.B., Carvalheira, B.C., de Oliveira, M.G., Veloso, L.ª, Curi, R., Saad, M.J.ª, J. Biol Chem. 2004 - Submetido

Efeitos da GSNO na: atividade da tirosina-quinase,

captação de glicose e síntese de glicogênio

COLABORAÇÕES

FCM/UNICAMP IB/UNICAMP

Prof. Mário Saad Profa. Marta H. Krieger

Prof. Francisco R.M. Laurindo

INCOR/USP

ICB/USP

Profa. Sílvia R.B.Uliana

UNIV. EDINBURGOProf. Richard Weller

FM/USPProfa. Claudia P.M.S de Oliveira