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Relatórios das aulas práticas de Biologia Molecular do grupo 5 da turma prática 3Licenciatura em Bioquímica FCUP/ICBAS-UP2013
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FACULDADE DE CINCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO INSTITUTO DE CINCIAS BIOMDICAS ABEL SALAZAR UNIVERSIDADE DO PORTO
Relatrios das aulas prticas de Biologia Molecular
Licenciatura em Bioqumica
CATARINA CRUZ VAZ E PATRCIA FERREIRA DE CASTRO GRUPO 5 TURMA P3
Ano lectivo 2012/2013 2 semestre
Biologia Molecular Relatrios das aulas prticas
Licenciatura em Bioqumica Pgina 1 de 41 FCUP/ICBAS-UP 2012/2013
NDICE
Extraco do DNA genmico da Drosophila melanogaster ........................................................................ 3
Introduo ................................................................................................................................................ 3
Resultados obtidos ................................................................................................................................... 4
Discusso dos resultados e concluso ...................................................................................................... 6
Extraco do DNA plasmdico de Escherichia coli ....................................................................................... 8
Introduo ................................................................................................................................................ 8
Resultados experimentais ........................................................................................................................ 9
Discusso dos resultados e concluso .................................................................................................... 10
Anlise electrofortica de DNA digerido com enzimas de restrio ........................................................ 11
Introduo .............................................................................................................................................. 11
Resultados obtidos ................................................................................................................................. 12
Discusso dos resultados e concluso ...................................................................................................... 1
Bibliografia ................................................................................................................................................ 1
Elaborao de um mapa de restrio de um plasmdeo recombinante .................................................... 2
Introduo ................................................................................................................................................ 2
Resultados experimentais ........................................................................................................................ 4
Discusso de resultados e concluso ....................................................................................................... 7
Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................................................................... 8
Introduo ................................................................................................................................................ 8
Resultados experimentais ........................................................................................................................ 9
Discusso de resultados e concluso ..................................................................................................... 12
Transformao de Escherichia Coli com DNA plasmdico ......................................................................... 14
Introduo .............................................................................................................................................. 14
Resultados obtidos ................................................................................................................................. 16
Discusso dos resultados e concluso .................................................................................................... 17
Sequenciao de DNA ................................................................................................................................ 20
Introduo e Objectivo ........................................................................................................................... 20
Tratamento de dados e Resultados ........................................................................................................ 22
Discusso de resultados e Concluses ................................................................................................... 24
Biologia Molecular Relatrios das aulas prticas
Licenciatura em Bioqumica Pgina 2 de 41 FCUP/ICBAS-UP 2012/2013
Clonagem de cDNA -TUB.......................................................................................................................... 26
Introduo .............................................................................................................................................. 26
Procedimento adoptado......................................................................................................................... 27
Resultados experimentais ...................................................................................................................... 28
Discusso de resultados e concluso ..................................................................................................... 28
Biologia Molecular Relatrios das aulas prticas
Licenciatura em Bioqumica Pgina 3 de 41 FCUP/ICBAS-UP 2012/2013
EXTRACO DO DNA GENMICO DA DROSOPHILA MELANOGASTER
RELATRIO DA AULA PRTICA N1
CATARINA CRUZ VAZ E PATRCIA FERREIRA DE CASTRO GRUPO 5, TURMA P3
Data de realizao: 15 de Maro de 2013
INTRODUO
O objectivo deste trabalho consiste em extrair e isolar o DNA genmico da Drosophila melanogaster,
para posteriormente determinar a sua concentrao e grau de pureza por mtodos
espectrofotomtricos, e ainda verificar qual seria a consequncia da aco de alguns tratamentos fsicos
sobre a integridade do DNA.
Para conseguirmos fazer a extraco do DNA, foi necessria a libertao de todo o material celular por
utilizao de um tampo de lise celular e posterior purificao do DNA. Este ltimo processo baseia-se,
ento, na remoo dos resduos celulares e precipitao das protenas por centrifugao. A
desnaturao das protenas obtida atravs de um tratamento com fenol ou clorofrmio, e so
separadas aps centrifugao, permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior), contendo as
cidos nucleicos, e a fase orgnica (inferior). De seguida, tendo em conta a insolubilidade do DNA em
etanol, recorre-se a este princpio para o fazer precipitar e em soluo vo ficar resduos de
fenol/clorofrmio e solutos orgnicos, sendo recuperados os cidos nucleicos.
Para a determinao da concentrao do DNA recorremos ao mtodo espectrofotomtrico, que se
baseia na absoro de radiao UV por parte dos cidos nucleicos, sendo a quantidade destes
directamente proporcional concentrao de DNA na amostra, pelo que a leitura a um comprimento de
onda de 260 nm permite o clculo da concentrao dos cidos nucleicos na amostra. Para
determinarmos o grau de pureza, fizemos ainda a leitura das absorvncias a um comprimento de onda
de 280 nm, que sero proporcionais quantidade de protenas e fenol presentes na amostra. A relao
entre A260 e A280 fornece uma estimativa do grau de pureza dos cidos nucleicos. Solues puras de DNA
e RNA possuem valores de
entre 1,8 e 2,2, respectivamente. Se existe contaminao com fenol ou
protenas, a relao
ser muito menor, e a preciso nas quantidades de cidos nucleicos ser baixa.
Na segunda parte do trabalho, realizou-se uma electroforese para comparar os danos causados por
diferentes tratamentos fsicos ao DNA. Submetemos, ento, a amostra de DNA aos seguintes
tratamentos:
Vortexao
Biologia Molecular Relatrios das aulas prticas
Licenciatura em Bioqumica Pgina 4 de 41 FCUP/ICBAS-UP 2012/2013
Provocar variaes extremas de temperatura no meio envolvente (ebulio seguida de banho
de gelo)
Pipetagens sucessivas.
Guardamos ainda uma amostra de DNA sem qualquer tratamento para ento pudermos comparar
atravs de uma electroforese as diversas amostras e concluir sobre a aco dos tratamentos fsicos no
DNA genmico.
RESULTADOS OBTIDOS
Abs 260nm Abs280nm Abs 260nm/ Abs280nm
0,247 0,123 2,01
TABELA 1. REGISTO DOS VALORES DE ABSORVNCIA A 260 E A 280NM E A RESPECTIVA RAZO.
CONCE NTRA O DE DNA
Tendo em conta o factor de diluio, que 140, ento
GRAU DE PUREZA
Absorvncia/nm Equivalncia / g.mL-1
260 nm
50 dsDNA
37ssDNA
40 ssDNA
TABELA 2. PROPORCIONALIDADE ENTRE A QUANTIDADE DE CIDOS NUCLEICOS NA AMOSTRA E A ABSORVNCIA REGISTADA A 260NM.
Clculos:
[ ]
[ ]
[ ]
Abs260nm [dsDNA] g/mL [ssDNA] g/mL [ssRNA] g/mL
0,247 1729 1279,5 1383,2
TABELA 3. REGISTO DOS VALORES O BTIDOS PARA A CONCENTRAO DE CADA TIPO DE CIDO NUCLEICO PRESENTE NA AMOSTRA
ANALISADA.
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RESU LTAD OS OBTID OS NA ELE CTR OFORE SE
F IGURA 1. GEL DE AGAROSE RESULTANTE DA SEPARAO DO DNA GENMICO POR ELECTROFORESE DE CADA UMA DAS AMOSTRAS
SUJEITAS A UM TRATAMENTO FSICO DIFERENTE.
L E G E N D A ( D O L A D O D I R E I T O P A R A O E S Q U E R D O )
1. Marcadores de peso molecular (fago )
2. DNA plasmdico isolado (trabalho prtico 2)
3. DNA sem tratamento (controlo)
4. DNA sujeito a ebulio e de seguida sujeito a arrefecimento no gelo
5. DNA sujeito a vortexao
6. DNA sujeito a mltiplas passagens atravs da ponta de uma pipeta
Distncia migrada/cm Peso molecular/pb
2,40 10000
2,70 8000
3,05 6000
3,30 5000
3,65 4000
4,10 3000
4,45 2500
4,90 2000
5,65 1500
6,60 1000
7,10 800
7,75 600
8,60 400
9,65 200
TABELA 4. DISTNCIA MIGRADA PARA CADA MARCADOR DE PESO MOLECULAR NO GEL DE AGAROSE E RESPECTIVO PESO MOLECULAR EM
PB.
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F IGURA 2. REPRESENTAO GRFICA DA DISTNCIA MIGRADA PELOS PADRES DE PESO MOLECULAR EM FUNO DO PESO MOLECULAR
CORRESPONDENTE, EM BP
Tratamento Distncia migrada/cm Peso molecular/pb
Sem tratamento (controlo) 1,95 8926
Ebulio e posterior arrefecimento em gelo
--- ---
Vortexao 2,00 8802
Mltiplas passagens atravs da ponta de uma pipeta
1,95 8926
TABELA 5. DISTNCIA DE MIGRAO PARA AS AMOSTRAS SUJEITAS AOS DIFERENTES TRATAMENTOS FSICOS E RESPECTIVO PESO
MOLECULAR EM PB.
D ISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSO
Pela razo
, foi-nos possvel concluir que o DNA genmico isolado da Drosophila melanogaster
se encontrava relativamente puro, estando pouco contaminado com fenol e outras protenas com
cadeias laterais aromticas, pois obtivemos um valor para o grau de pureza de 2,01, que est entre 1,8 e
2,2. Como j foi dito, a razo entre as absorvncias permite-nos quantificar o grau de pureza do DNA,
sendo que a uma absorvncia de 260 nm se quantificam as protenas com cadeias laterais aromticas e
fenis e a 280nm se quantificam os cidos nucleicos.
Por espectrofotometria a 260nm determinou-se a concentrao de DNA genmico (dsDNA), presente na
amostra, obtendo-se um valor de 1729 g/mL. Este valor no corresponde ao valor real da concentrao
de DNA genmico, pois apesar de termos visto que o grau de pureza se encontrava dentro do esperado,
existem ainda outros compostos nucleicos presentes na amostra (por exemplo RNA) e que interferem,
pois absorvem a um mesmo comprimento de onda que o DNA.
Por isso, para termos uma estimativa mais correta da quantidade de dsDNA na amostra, do que aquela
obtida pelo mtodo espectrofotomtrico, podemos recorrer a uma electroforese em gel de agarose,
y = -0,1208x + 4,1862 R = 0,9803
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0 2 4 6 8 10 12 14 16
log(
MM
)
distncia migrada pelos padres de massa molecular/ cm
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que consiste na separao pelo tamanho dos vrios componentes que podem existir na amostra. Para a
visualizao do DNA aps a corrida no gel, utiliza-se um corante especfico do DNA (brometo de etdeo)
que tem a capacidade de se intercalar entre os pares de bases. Sob radiao ultravioleta, o brometo de
etdeo emite fluorescncia, surgindo corado apenas o DNA. A quantidade de dsDNA existente numa
amostra proporcional quantidade de fluorescncia emitida por essa amostra.
Pelos resultados obtidos na electroforese efectuada podemos verificar que o DNA genmico no se
encontrava totalmente puro, pois para alm da banda correspondente a este, foram observadas mais
duas bandas a pesos moleculares menores, que podem ento corresponder a uma contaminao por
RNA. Podemos ento concluir que o mtodo espectrofotomtrico no muito fivel para este tipo de
determinaes.
Por fim, analisando as amostras do DNA que foram submetidas a diferentes tratamentos fsicos, pde-se
verificar pela electroforese em gel de agarose, que apenas a amostra que foi exposta ao tratamento de
ebulio e posterior arrefecimento em gelo levou alterao da integridade do DNA, pois a banda
correspondente ao DNA genmico desapareceu, o que significa provavelmente que o DNA foi
desnaturado. Os restantes tratamentos fsicos no levaram a qualquer alterao na integridade do DNA
pois como podemos observar pelos resultados da electroforese nenhuma banda desapareceu nem
houve alterao na intensidade das bandas, pelo que o DNA se manteve estvel.
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EXTRACO DO DNA PLASMDICO DE ESCHERICHIA COLI
RELATRIO DA AULA PRTICA N2
Data de realizao: 22 de Maro de 2013
INTRODUO
Muitas bactrias possuem para alm do seu DNA genmico grandes quantidades de pequenas
molculas de DNA, os plasmdeos. Estes so molculas circulares de DNA em cadeia dupla capazes de se
reproduzirem independentemente do DNA cromossmico, ou seja, replicam-se de forma autnoma. Os
plasmdeos so muito frequentes na natureza e podem conter genes que desempenham um papel
importante na adaptao e evoluo bacteriana, constituindo uma vantagem selectiva, dado que podem
conferir-lhes resistncia a antibiticos, a metais pesados, entre muitos outros factores.
Apesar de a replicao ser independente da replicao do cromossoma bacteriano, depende de enzimas
e protenas que so codificadas pelo hospedeiro para a sua replicao.
Hoje em dia, estes plasmdeos j tm vrias aplicaes ao nvel de inmeras reas. A estes plasmdeos
podem ser feitas alteraes para melhorar a sua qualidade e para obter o que se quer especificamente
(por exemplo alter-los de forma a se obter um maior nmero de cpias e serem mais pequenos em
tamanho), assim sendo j se criaram os chamados vectores plasmdicos de clonagem e de expresso.
Neste trabalho tnhamos como objectivo a preparao do plasmdeo pSK-polo de E. coli.
Para realizarmos a extraco do DNA plasmdico, foi necessrio separar este da grande quantidade de
DNA cromossmico existente nas clulas bacterianas. Esta separao relativamente simples devido
sua dimenso e devido a conformaes especficas que este pode assumir, entre elas a denominada
cccDNA (covalently-closed-circular DNA), sendo que assim o DNA plasmdico pode ser facilmente
separado do DNA cromossmico.
Para a extraco do DNA plasmdico, pode-se recorrer lise bacteriana, sendo que a maioria do DNA
cromossmico fica sedimentado com os resduos celulares ficando o DNA plasmdico em soluo. Uma
alternativa a desnaturao do DNA cromossmico a pH bsico ou por uma fervura rpida. Sendo
assim, aps o arrefecimento a desnaturao do cccDNA facilmente revertida ao contrrio do DNA
cromossmico, permitindo ento uma fcil separao. Para uma purificao completa ainda
necessrio retirar as protenas da soluo.
No actual trabalho foi utilizado o procedimento da mini-preparao de DNA plasmdico por fervura
rpida (miniprep), com posterior averiguao do estado da amostra purificada por electroforese em gel
de agarose 1%.
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Licenciatura em Bioqumica Pgina 9 de 41 FCUP/ICBAS-UP 2012/2013
RESULTADOS EXPERIMENTAIS
IMAGEM1. GEL DE AGAROSE RESULTANTE DA SEPARAO POR ELECTROFORESE DE DNA PLASMDICO ISOLADO .
L E G E N D A ( D A D I R E I T A P A R A A E S Q U E R D A ) :
1. Marcadores de peso molecular (fago )
2. DNA plasmdico isolado
3. DNA genmico
As restantes amostram fazem parte do trabalho 1.
Distncia migrada/cm Peso molecular/pb
2,40 10000
2,70 8000
3,05 6000
3,30 5000
3,65 4000
4,10 3000
4,45 2500
4,90 2000
5,65 1500
6,60 1000
7,10 800
7,75 600
8,60 400
9,65 200
TABELA 1. DISTNCIA MIGRADA PARA CADA MARCADOR DE PESO MOLECULAR NO GEL DE AGAROSE E RESPECTIVO PESO MOLECULAR EM
PB.
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Amostra Distncia migrada / cm Pesos moleculares / pb
DNA plasmdico isolado 1,85 9177
3,30 6131
TABELA 2. DISTNCIA DE MIGRAO DAS DIVERSAS BANDAS VISUALIZADAS PARA A AMOSTRA DE DNA PLASMDICO ISOLADO E
RESPECTIVOS PESOS MOLECULARES EM PB.
Os valores dos pesos moleculares para o DNA plasmdico foram obtidos pela mesma recta de
calibrao usada para o trabalho 1, pois os padres de peso molecular so os mesmos.
D ISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSO
Pela anlise dos resultados obtidos por electroforese em gel, para o DNA plasmdico que isolamos
verificamos a existncia de apenas 2 bandas (e no muito visveis), o que no era esperado. Sendo
assim, podemos concluir que o processo de extraco do DNA plasmdico no ocorreu como estvamos
espera, pelo que no foi bem sucedido, provavelmente por alguma pipetagem mal efectuada, ou por
outro erro experimental.
O que seria de esperar seria a visualizao de 3 bandas bem definidas.
A conformao do DNA um dos parmetros importante a ter em conta quando se fala na sua migrao
no gel de electroforese.
As formas possveis que o DNA plasmdico pode adquirir e que vo afectar a forma como vai migrar no
gel so:
cccDNA (covalently-closed-circular DNA), de cadeia dupla, circular fechado. Caracteriza-se por
ser a forma mais compacta, portanto mais pequena, devido ao superenrolamento, pelo que vai
a sua migrao no gel maior, pois passa mais facilmente entre os poros, sendo assim este
DNA iria corresponder banda de menor peso molecular.
DNA circular com uma quebra numa ligao fosfodister entre nucletidos adjacentes de uma
cadeia. Assim o super enrolamento desaparece com a quebra da ligao fosfodister, o que vai
levar a que este tipo de DNA seja a forma que migra menos no gel, pois tem maior raio
hidrodinmico.
Por fim, temos ainda o DNA linear de cadeia dupla (dsDNA). Esta forma do DNA migra menos
do que a forma cccDNA, mas mais do que o DNA que tem uma quebra numa ligao
fosfodister.
O cccDNA migra mais rapidamente do que os fragmentos do mesmo tamanho de dsDNA porque a
conformao circular tem menor raio hidrodinmico devido aos super enrolamentos.
Pode-se ainda verificar que a amostra do DNA plasmdico se encontrava contaminada, pois observa-se
uma banda intensa de menor peso molecular, que pode corresponder a RNA que se encontrava
presente.
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Licenciatura em Bioqumica Pgina 11 de 41 FCUP/ICBAS-UP 2012/2013
ANLISE ELECTROFORTICA DE DNA DIGERIDO COM ENZIMAS DE RESTRIO
RELATRIO DA AULA PRTICA N3
Data de realizao: 29 de Maro de 2013
INTRODUO
O isolamento de segmentos de DNA de sequncia conhecida com recurso a enzimas de restrio hoje
considerado um dos maiores avanos na Biotecnologia e na Gentica, sendo um processo que envolve
grande preciso e que garanta resultados semelhantes.
As enzimas de restrio so endonucleases que podem ser purificadas a partir de bactrias, e que
reconhecem sequncias especficas de DNA, nomeadamente sequncias palindrmicas, e que a
cortam as ligaes fosfodister no interior da cadeia dupla de DNA. Deste modo, estas enzimas
reconhecem determinadas sequencias nucleotdicas do DNA e fragmentam a molcula sempre que
identificam essa sequncia, produzindo extremidades coesivas (sticky ends) nas cadeias seccionadas,
que quando contactam com outras resultantes da aco da mesma enzima podem emparelhar por
complementaridade.
Juntamente com enzimas do tipo DNA ligase, as
enzimas de restrio permitem criar molculas de
DNA recombinante, que cortam a cadeia dupla de
DNA original para a inserir uma poro de DNA
exgeno, sendo este um processo que segue o
mecanismo esquematizado pela figura 1.
As enzimas de restrio podem ter mecanismos de
funcionamento diferentes, da surgir a necessidade
de as distribuir em 3 tipos de endonucleases - tipos I,
II e III. As enzimas do tipo I e III tm aco nuclesica,
ou seja, funcionam custa da degradao de ATP e
seccionam a cadeia aleatoriamente, nas
proximidades da sequncia de reconhecimento e
aco modificadora de metilao. As enzimas de
restrio tipo II, pelo contrrio actuam em locais
especficos dentro da sequncia de reconhecimento.
Neste trabalho prtico, o objectivo foi analisar por electroforese o gene recombinante pSK-POLO
digerido por duas enzimas de restrio: EcoR1 e HindIII. Estas enzimas cortam a molcula nas
F IGURA 1. MECANISMO DE PRODUO DE DNA
RECOMBINANTE COM RECURSO A ENZIMAS DE RESTRIO E
DNA LIGASE.
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extremidades do gene POLO, inserido no plasmdeo pSK a enzima EcoR1 reconhece a sequncia
GAATTC e HindIII reconhece a sequncia AAGCTT. Procedeu-se, ento, anlise do plasmdeo
recombinante, primeiro isoladamente, depois digerido com cada uma das enzimas de restrio
utilizadas em separado, e, por ltimo, com ambas as enzimas simultaneamente.
RESULTADOS OBTIDOS
F IGURA 3. BANDAS DE DNA PLASMDICO OBTIDAS EM ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE.
L E G E N D A D A S P I S T A S D E E L E C T R O F O R E S E E M G E L
Da esquerda para a direita, as pistas de electroforese reveladas correspondem a:
1. Marcador de pesos moleculares ()
2. DNA plasmdico (controlo)
3. DNA plasmdico cortado com HindIII
4. DNA plasmdico cortado com EcoRI
5. DNA plasmdico cortado com EcoRI e
com HindIII
Nota: Dada a ausncia de resultados obtidos pelo grupo, Adoptamos os resultados obtidos pelo grupo 4
da turma 3.
Foram utilizados os mesmos marcadores de peso molecular dos trabalhos anteriores, pelo que o peso
molecular correspondente a cada banda de DNA pode ser determinado a partir da mesma recta de
calibrao associada. Assim:
Amostra Distncia migrada / cm Pesos moleculares / pb
DNA plasmdico + HindIII 0,75 12462
DNA plasmdico + EcoRI 1,25 10844
2,90 6852
DNA plasmdico + EcoRI + HindIII
1,90 9050
2,75 7144
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TABELA 1. DISTNCIA DE MIGRAO DAS DIVERSAS BANDAS VISUALIZADAS PARA A AMOSTRA DE DNA PLASMDICO ISOLADO E
RESPECTIVOS PESOS MOLECULARES EM PB
D ISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSO
Neste trabalho prtico, recorde-se, o objectivo foi analisar por electroforese o gene recombinante pSK-
POLO digerido por duas enzimas de restrio (EcoRI e HindIII), que cortam a molcula nas extremidades
do gene POLO, inserido no plasmdeo pSK. Dado que estamos na presena de cadeias de DNA circular, o
corte do DNA apenas num local de restrio (no caso deste trabalho prtico, isto acontece com a enzima
HindIII) gerar uma nica molcula linear logo, uma nica banda no gel de electroforese. Pelo
contrrio, o corte com ambas as enzimas de restrio, neste caso do plasmdeo recombinante pSK-POLO
com EcoRI e HindIII, gerar dois fragmentos de DNA. Assim, prev-se a visualizao de duas bandas no
gel de electroforese para a anlise do DNA digerido com ambas as enzimas, a pesos moleculares
diferentes. O mesmo sucede com a enzima EcoRI, que corta o DNA plasmdico analisado em dois locais
distintos geram-se, portanto, dois fragmentos distintos.
Assim, analisando os resultados obtidos no presente trabalho prtico, verifica-se que os resultados
obtidos correspondem ao expectvel:
A observao de trs bandas na pista correspondente ao DNA plasmdico de controlo, apesar
de estarmos perante o plasmdeo sem qualquer enzima de restrio (serve tambm, portanto,
de pista de controlo), deve-se s diferentes conformaes que o DNA pode adoptar: circular
naturalmente relaxado, linear de cadeia dupla relaxado e superenrolado (supercoiled).
Dado que a enzima HindIII apenas corta o plasmdeo num nico local de restrio, o corte com
esta endonuclease apenas transforma o plasmdeo recombinante, anteriormente circular,
numa molcula linear. Deste modo, observa-se apenas numa banda no gel de electroforese.
A enzima EcoRI fragmenta o plasmdeo recombinante em dois locais de restrio, pelo que,
tratando-se de uma molcula circular, se observam duas bandas.
Finalmente, a digesto do DNA plasmdico com ambas as endonucleases resulta em duas
bandas visveis no gel de electroforese, dados os cortes anteriormente descritos efectuados por
cada enzima utilizada.
Atravs da anlise electrofortica, possvel determinar, atravs da recta de calibrao dos marcadores
de peso molecular como descrito anteriormente, o peso molecular do vector, do gene inserido e,
consequentemente, do plasmdeo recombinante no seu todo, e elaborar ainda o mapa de restrio do
plasmdeo analisado (processo descrito no relatrio da aula prtica 4). No entanto, os resultados obtidos
no gel de electroforese, por conterem bandas muito pouco visveis, no permitiram a determinao
desses valores.
B IBLI OG RA FIA
Moreira, C. (2012), WikiCincias, 3(01):0423
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ELABORAO DE UM MAPA DE RESTRIO DE UM PLASMDEO RECOMBINANTE
RELATRIO DA AULA PRTICA N4
Data de realizao: 05 de Abril de 2013
INTRODUO
As tcnicas de DNA recombinante tm grande impacto nas cincias da sade e da vida, pois a sua
descoberta constitui o primeiro passo na direco da produo de vacinas, medicamentos e tcnicas de
diagnstico, entre outros grandes avanos nestes domnios da Biologia, e ainda na engenharia qumica e
agronmica.
Em Biologia Molecular, clonagem significa a utilizao de vectores (nesta aula prtica, utilizaram-se os
mais simples os plasmdeos), onde, num local especfico, se insere um fragmento de DNA de interesse
com recurso a enzimas de restrio que cortem especificamente o DNA plasmdico no local de
insero pretendido. Desta forma, criam-se molculas de DNA recombinantes, que facilitam o estudo de
um fragmento de DNA exgeno de interesse atravs de tcnicas como o PCR (polymerase chain
reaction), transformao bacteriana, entre outras tcnicas de DNA recombinante.
Os plasmdeos so molculas de DNA circular presentes em bactrias caracterizam, por exemplo, a
resistncia a antibiticos que por vezes desenvolvem. Dado que so os vectores de clonagem mais
simples e de fcil obteno, logo, mais facilmente manipulveis, tornaram-se largamente utilizados
neste tipo de tcnicas laboratoriais. No entanto, os plasmdeos possuem naturalmente vrios locais de
restrio, pelo que, de modo a facilitar a insero de DNA exgeno, foram manipulados de modo a que
todos esses locais se localizassem consecutivamente na sequncia de DNA plasmdico essa regio
designada como polylinker ou multiple cloning site.
De modo a conhecer todos os locais de corte por endonucleases existentes num dado fragmento de
DNA seja plasmdico, exgeno ou recombinante elaborado um mapa de restrio, o que constitui
uma das etapas iniciais de anlise de DNA. Um mapa de restrio consiste na compilao de todos esses
locais de corte, reunindo o nmero, ordem e distncia entre cada um. Estes dados podem ser
determinados por electroforese em gel de agarose, dado que, por possurem tamanhos diferentes, os
fragmentos resultantes da digesto do DNA por endonucleases iro produzir diferentes distncias de
migrao no gel de agarose, pelo que o seu tamanho, distncia entre fragmentos e ordem na sequncia
(torna possvel ainda verificar a orientao da sequncia sense ou antisense) pode ser determinado
por comparao com um padro de pesos moleculares.
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ainda importante destacar que a elaborao de mapas de restrio permitiu grandes avanos na
caracterizao de DNA, mapeamento gentico e ainda o desenvolvimento de tcnicas de diagnstico de
doenas genticas.
Esta aula prtica tem, portanto, como objectivo a elaborao do mapa de restrio de um plasmdeo
recombinante, que consiste num fragmento inserido no plasmdeo pGEM-3, de 2867 pb, atravs da
anlise do peso molecular dos fragmentos obtidos aps digesto de cada plasmdeo recombinante com
as enzimas de restrio Sa1I, HindIII, PstI, XhoI, SacI e BamH1, e posterior anlise por electroforese em
gel de agarose, como esquematizado na figura abaixo representada.
F IGURA 1. PROCESSO DE ELABORAO DE UM MAPA DE RESTRIO.
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RESULTADOS EXPERIMENTAIS
PLASM DE O D O FRAGME NT O L
Distancia migrada/cm Peso molecular/pb
2,50 23130
3,00 9416
3,40 6557
3,90 4361
4,80 2322
5,00 2027
7,00 564
F IGURA 3. DISTNCIAS MIGRADAS E RESPECTIVOS PESOS MOLECULARES (MARCADOR DE PESOS MOLECULARES, ).
F IGURA 4. REPRESENTAO GRFICA DE LOG (PESOS MOLECULARES) = F(DISTNCIA MIGRADA), E RESPECTIVA RECTA DE CALIBRAO
PADRO DOS PESOS MOLECULARES.
As distncias migradas por cada banda electrofortica no gel, para cada enzima utilizada, foi calculada,
portanto, com base na recta de calibrao obtida.
Fig.4.3: Registo dos valores das distncias migradas, em cm, e dos respectivos pesos moleculares, em
pb, das diferentes bandas visveis no gel referente ao plasmdeo L.
Distncia migrada/cm Peso molecular/bp Total
2 BamHI
3,60 3523 3523
3
Sal1
3,45 4058 7751
3,55 3693
log PM = -0,4084d + 5,0176 R = 0,9657
2,5
2,7
2,9
3,1
3,3
3,5
3,7
3,9
4,1
4,3
4,5
2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
log
PM
Distancia migrada (cm)
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4
HindIII
3,25 4900 7433
3,95 2533
5
PstI
3,15 5384 7583
4,10 2199
6
XohI
2,95 6501 8238
4,35 1738
7
PvuII
3,5 3871 4382
5,65 510
8 SacI
2,75 7849 7849
9
XohI/SacI
3,4 4254
8089 4,15 2098
4,35 1738
A banda a cerca de 4000 bp na pista Sal1 corresponde ao gene Ampr
Plasmdeo vazio 3523
Plasmdeo recombinante 7500
Gene 7500 3500 = 4000
ELABOR A O D O MA PA D E RESTR I O
O processo de elaborao de um mapa de restrio envolve a digesto do DNA com enzimas de
restrio e a anlise dos fragmentos de DNA resultantes atravs de electroforese em gel de agarose. A
distncia entre os locais de restrio pode assim ser determinada por comparao do peso molecular,
em bp, dos fragmentos obtidos.
Neste trabalho prtico, elaborado o mapa de restrio do plasmdeo recombinante pGEM-3, de 2867
pb, onde foi inserido um fragmento Ampr, digerido pelas enzimas de restrio SaI1, HindIII, PstI, XhoI,
SacI e BamHI. So j conhecidos os locais de restrio para cada enzima no plasmdeo:
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A partir desta informao e aps anlise dos resultados obtidos em electroforese, possvel determinar
os locais de restrio do fragmento inserido.
O tamanho do plasmdeo mais correcta e facilmente determinado com o DNA na sua conformao
linear. Assim, o peso molecular da banda da pista 2, resultante do corte com a enzima de restrio
BamHI, corresponde ao tamanho do plasmdeo recombinante total. Deste modo, conclui-se que o
plasmdeo pGEM-3 tem 6000 bp.
Na pista do gel de electroforese relativo digesto do plasmdeo recombinante com a enzima de
restrio SalI, verifica-se o aparecimento de uma banda que resulta da sobreposio de duas bandas, o
que nos indica que o plasmdeo e o fragmento tm pesos moleculares bastante prximos. Ento, o
fragmento inserido no plasmdeo tem um peso molecular de 3818 pb. Caso o local de corte para
insero do gene corresponda ao local de corte da SalI, ser normal que se obtenham 2 bandas, pois,
com a insero do gene, passam a haver dois locais de corte para ambas as extremidades do gene
inserido.
Para a digesto com a enzima de restrio HIndIII, so observveis duas bandas no gel de electroforese
que correspondem a um fragmento menor (2372 pb) e a um fragmento maior (4782 pb). Como esta
enzima corta o pGEM-3 a 18 pb do local Sal I e origina duas bandas, ento ter de possuir um local de
corte no fragmento inserido, a 2500 bp de distncia do primeiro local de restrio:
A distncia entre os locais de corte da HIndIII e da SalI de 18 pb.
O fragmento mais pequeno resultante da digesto com HIndIII tem peso molecular de 232 pb.
Conclui-se, portanto, que o local de restrio da enzima HIndIII ser a 2354 pb (2372 pb 18 pb).
Na mesma linha de raciocnio, a enzima PstI tambm apresenta duas bandas (5168 pb e 2200 pb).
Sabendo que esta enzima corta o pGEM3 a 2 pb antes do local de insero do fragmento (a 2 pb do local
SalI) , originando dois fragmentos, o local de corte da PstI ser a 2198 pb do local onde se encontra a
SalI.
Foi possvel observar que a enzima SacI origina apenas uma banda no gel e sabe-se que corta o vector
31 pb depois do local SalI. Assim, no ter nenhum corte no fragmento inserido. Conclumos ento que
o seu peso molecular correspondente ao tamanho do plasmdeo recombinante (vector+ fragmento)
que 7619 pb.
A enzima Xho I no corta o vector pGEM-3 (no se conhecem locais de restrio no plasmdeo vazio),
pelo que se pode inferir que as duas bandas presentes no gel de electroforese correspondem a dois
locais de corte no fragmento inserido, sendo que a distancia que separa estes dois cortes 1094 pb.
Para conseguir determinar a sua localizao exacta, necessrio conjugar esta endonucleases com uma
que corte, efectivamente, o plasmdeo num local conhecido. Assim, ao conjugar as enzimas de restrio
Xho I e Sac I, sabendo a priori que esta ltima corta o plasmdeo recombinante em apenas um local,
ocorre o aparecimento de trs bandas no gel de electroforese, que correspondem a 1094 pb, 2036 pb e
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4099 pb. Tendo em conta que a SacI corta o pGEM3 31pb aps o local de insero, um dos locais de
corte da XhoI ser a 2005 pb (2036 pb-31 pb) do local onde se encontra a SalI final, ou seja, a 1813 pb
(3818 pb-2005 pb) do local da SalI inicial. O outro local de corte da XhoI ser a 719 pb (1813 pb-1094 pb)
do local da SalI inicial.
Por ltimo, verifica-se que a enzima de restrio Pvu II origina duas bandas no gel de electroforese (7050
pb e 466 pb), e sabe-se que tem um local de corte a 79 pb do local de insero do fragmento. Assim, o
local onde a PvuII corta o fragmento inserido ser a pb do local onde se encontra a SalI (3431 pb - (466
pb 79 pb)).
Deste modo, o mapa de restrio obtido ser o seguinte:
F IGURA 4. MAPA DE RESTRIO DETERMINADO PARA O PLAS MDEO PGEM-3.
D ISCUSSO DE RESULTADOS E CONCLUSO
A elaborao do mapa de restrio do fragmento foi dificultada por algumas incoerncias no clculo do
peso molecular das bandas obtidas em cada digesto, o que se pode dever medio pouco rigorosa
das distncias percorridas pelas bandas no gel de electroforese.
Tal como apresentado anteriormente, o mapa de restrio do fragmento em estudo foi determinado a
partir do mapa de restrio do plasmdeo (vector) sem o gene de interesse inserido. Deste modo, no
possvel avaliar concretamente os resultados obtidos, dado que no possumos qualquer informao
acerca do gene inserido.
SalI SalI XohI XohI HindIII
PstI BamHI
SacI
PstI
PvuII
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POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
RELATRIO DA AULA PRTICA N5
Data de realizao: 12 de Abril de 2013
INTRODUO
O objectivo desta aula prtica foi, a partir das sequncias de cDNA fornecidas pelo professor, desenhar
os primers destinados amplificao por PCR do gene POLO. Posteriormente, recorrendo ento
reaco de PCR a partir de DNA genmico e de cDNA, seria possvel ento concluir acerca da presena
de regies com intres na sequncia do gene.
A reaco em cadeia da polimerase (PCR) um mtodo de amplificao que permite amplificar um gene
de cpia nica em milhes de cpias, a partir de uma pequena quantidade do DNA original (DNA
molde), sem que para isso seja necessrio recorrer a um organismo vivo.
O processo de amplificao tem em conta a actividade cataltica de uma DNA polimerase e envolve dois
primers, que flanqueiam o fragmento de DNA que pretendemos que seja amplificado. Cada ciclo da
reaco envolve desnaturao de DNA de cadeia dupla (que se promove atravs do aquecimento),
hibridao dos primers s sequncias complementares e extenso destes com a referida DNA
polimerase.
Assim sendo, neste trabalho prtico usa-se uma enzima que aguenta uma temperatura necessria para
que o DNA se desnature (a Taq polimerase) e que, atravs das pequenas sequncias conhecidas nas
extremidades, executa duplicaes repetidas, numa variao exponencial da fraco de DNA entre estas
sequncias conhecidas. Essas sequncias so usadas para construir os chamados primers.
Assim, o trabalho consistiu em colocar em tubos de PCR, DNA genmico, os 4 nucletidos que que
compes a cadeia de DNA (dNTPs), a DNA polimerase j referida em cima (Taq polimerase), os primers,
a soluo tampo que permite as condies necessrias de pH e salinidade para que a sntese seja
possvel e MgCl2 que um cofactor da Taq polimerase.
O tubo ento colocado no termociclador, onde submetido primeiramente a uma temperatura de
94C, temperatura essa que suficientemente alta para permitir que se d a desnaturao da cadeia
dupla de DNA mas que no desnature a Taq polimerase. Em seguida, diminui-se a temperatura para
50C, o que vai permitir que ocorra a hibridao entre os primers e as respetivas sequncias
complementares de DNA genmico (se a temperatura baixasse para alm dos 50C os primers iriam
ligar-se inespecificamente). Por fim, a temperatura aumentada para 72C, temperatura esta que a
temperatura ptima para que a Taq polimerase actue, dirigindo a sntese de novas cadeias de DNA.
Repetindo estes trs passos (desnaturao, hibridao e extenso) durante vrios ciclos, vai permitir a
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produo de milhes de cpias de uma sequncia especfica de DNA em cadeia dupla, sendo que esta
produo se d de forma exponencial.
Um parmetro extremamente importante a escolha correta dos primers a utilizar, pois estes vo ditar
o sucesso ou o insucesso do processo de amplificao. Sendo assim, existem algumas regras que
permitem ter uma ideia dos primers corretos a utilizar em cada caso, para permitir uma correta
hibridao destes. Essas regras so:
A sequncia do primer deve complementar correctamente a sequncia de bases da cadeia
molde.
A sequncia do primer deve incluir na extremidade 3 um resduo de guanina ou citosina, pois a
ligao tripla G-C que se forma ajuda a uma correta hibridao na terminao 3, devido forte
interaco entre esses dois pares de bases que se deve formao de pontes de hidrognio.
No entanto deve-se ter em conta que no podem estar presentes mais de 3 C ou G seguidos
nessa terminao.
Os primers devem ser desenhados sem qualquer homologia entre eles, para que no haja
possibilidade de emparelhamento entra ambos. A autocomplementaridade entre as sequncias
no aconselhvel, pois pode levar formao de estruturas secundrias no primer.
Sendo assim, como se pode verificar, a composio do primer muito importante. De um modo geral,
estes devero ser constitudos por um nmero de nucletidos que se encontre no intervalo de 17 a 25, e
devem ter um contedo em G/C que se encontre entre 45% e 55%. ainda importante que os primers
possuam temperaturas de hibridao semelhantes.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS
DESENHO DOS PRIME RS
Para o primer sense consideramos a seguinte sequncia:
5 AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCAGCTGAACGTG 3
Sendo assim, para o primer 1 escolhemos a sequncia que se encontra colorida.
Para o primer antisense consideramos a sequncia sense fornecida no protocolo, fazendo a sequncia
antisense correspondente para obter o segundo primer:
5 TCTAATTCCAAGCCAATTGCCAAAAAGGAACCG 3 sense
3 AGATTAAGGTTCGGTTAACGGTTTTTCCTTGGC 5 antisense
Agora, convm verificar se obedecemos s regras acima descritas:
Tendo em conta o primer sense, este tem 17 nucletidos possuindo uma % em G/C de 47,06%,
e a sua temperatura de hibridao pode ser calculada a partir de:
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Tm = (n G+C 4C) + (n A+T 2C) = (8 4) + (9 2) = 50C
No existe autocomplementaridade entre sequncias contguas. Comea e termina numa
citosina. Nenhuma das extremidades tem mais de 3 C ou G.
Tendo em conta o primer antisense, este tem igualmente 17 nucletidos, possuindo uma % em
G/C de 47,06 % e uma Tm = (8 4) + (9 2) = 50C, e no existe complementaridade suficiente
entre a sequncia para formar estruturas secundrias.
Pelo que podemos observar, ambos os primers obedecem s regras anteriormente referidas, pois
apresentam temperaturas de melting semelhantes (neste caso at coincidentes), tm uma percentagem
em G/C entre os 45 e 55% e no apresentam complementaridade suficiente para ocorrer
emparelhamento dentro da prpria sequncia, sendo assim podamos usar estes dois primers para a
amplificao por PCR do gene POLO.
Comparando agora as sequncias dos dois primers (sense e antisense):
GCTATGCTATGCTATGC (sense)
CGGTTAACGGTTTTTCC (antisense)
Como podemos verificar existem poucos pares de bases complementares, sendo que no mximo
existem dois pares de bases complementares seguidos.
ELECT ROFORE SE EM GEL DE AGAR OSE
Usamos a electroforese da turma P2 grupo 6, pois a nossa no foi bem-sucedida, sendo que no nos foi
possvel visualizar nenhuma das bandas que seriam supostas de ver.
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F IGURA 1. RESULTADOS OBTIDOS ATRAVS DE ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1% COM AMOSTRAS DE DNA GENMICO, DNA
COMPLEMENTAR E O RESPECTIVO PADRO DE PESOS MOLECULARES.
L E G E N D A ( D A E S Q U E R D A P A R A A D I R E I T A )
1. Marcador de pesos moleculares
2. cDNA
3. gDNA
Pesos moleculares/pb Distncia migrada no gel/cm
10000 2,40
8000 2,70
6000 3,05
5000 3,30
4000 3,65
3000 4,10
2500 4,45
2000 4,90
1500 5,65
1000 6,60
800 7,10
600 7,75
400 8,60
200 9,65
TABELA 1. PESOS MOLECULARES EM PB E RESPECTIVA DISTNCIA MIGRADA POR CADA BANDA EM CM.
GRFICO 1. REPRESENTAO GRFICA DO LOG (MM) EM FUNO DA DISTNCIA MIGRADA PELOS PESOS MOLECULARES EM CM.
log(MM) = -0,2188d + 4,435 R = 0,9911
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
0 2 4 6 8 10 12
log(
MM
)
Distncia migrada / cm
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Assim, pela recta de calibrao obtida, possvel calcular o peso molecular do DNA genmico e do DNA
complementar, sabendo as distncias migradas por estes no gel de electroforese.
cDNA
Log (MM) = -0,2188 6,65 + 4,435 = 2,98
MM = 10 2,98
= 955 pb
gDNA
Log (MM) = -0,2188 6,35 + 4,435 = 3,05
MM = 10 3,05
= 1122 pb
Amostra Distncia migrada/cm Peso molecular/ pb
gDNA 6,35 1122
cDNA 6,65 955
TABELA 2. DISTNCIAS MIGRADAS EM CM PELO DNA GENMICO E PELO DNA COMPLEMENTAR E RESPECTIVOS PESOS MOLECULARES
EM PB.
O DNA complementar no tem intres, o que facilita a identificao e a caracterizao dos genes.
Apenas representa os genes que esto a ser activamente utilizados pela clula, pois a RNA polimerase
apenas transcreve genes activados. O DNA genmico contm todo a informao gentica armazenada
num organismo.
O DNA complementar j no apresenta intres no seu contedo, pois o RNA mensageiro j passou pelo
processo de splicing, sendo esta uma reaco catalisada pela enzima transcriptase reversa.
Assim sendo, podemos concluir acerca do contedo de intres no DNA genmico fazendo a diferena de
pares de bases entre o DNA genmico e o complementar.
D ISCUSSO DE RESULTADOS E CONCLUSO
Na primeira parte do trabalho prtico era-nos pedido o desenho dos primers para a amplificao do
gene POLO a partir de primers sense fornecidos no protocolo. Tendo em conta as regras que tm de ser
obedecidas para a escolha dos primers, chegamos concluso e como j explicamos nos resultados que
os primers escolhidos poderiam ser:
GCTATGCTATGCTATGC (sense)
CGGTTAACGGTTTTTCC (antisense)
A partir da electroforese efectuada podemos ver que o DNA complementar contm um menor nmero
de pares de bases na sua constituio, o que nos indica que de facto h uma diferena entre este e o
DNA genmico. Pois como sabemos o cDNA j no possui intres, apenas as regies codificantes, pois j
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sofreu o processo de splicing. Ao contrrio, o DNA genmico tem na sua constituio toda a informao
gentica de um indivduo, ou seja, intres, exes e regies controladoras de expresso de genes.
Assim, obtivemos valores esperados de pares de bases para o cDNA e para o gDNA, sendo o primeiro
constitudo por 955pb e o segundo tem um nmero de pb maior de 1122, o que j seria de esperar,
como referimos em cima.
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TRANSFORMAO DE ESCHERICHIA COLI COM DNA PLASMDICO
RELATRIO DA AULA PRTICA N6
Data de realizao: 19 de Abril de 2013
INTRODUO
A transformao o mecanismo pelo qual as bactrias absorvem o DNA externo, que pode ou no ser
integrado no seu genoma. Assim sendo, a transformao de bactrias com plasmdeos recombinantes
tornou-se uma tcnica bastante usada para a amplificao de fragmentos de DNA especficos. As
bactrias capazes de incorporar DNA denominam-se clulas competentes, e para isso acontecer pode
recorre-se a variadas tcnicas, como por exemplo, deixar as clulas em crescimento, retirando-as na
fase de crescimento exponencial, trata-las com uma soluo de CaCl2 a baixas temperaturas
seguidamente de um choque trmico. Os ies de metal e as mudanas bruscas de temperatura alteram
a permeabilidade da parede celular, fazendo com que estas clulas permitam a entrada de DNA
exgeno atravs da membrana plasmtica. Assim molculas de plasmdeos recombinantes contendo
DNA exgeno podem ser introduzidas na bactria, onde se replicam normalmente. A eficincia da
transformao calculada em funo do nmero de transformantes por micrograma de DNA. O
tratamento utilizado neste trabalho prtico foi ento o cultivo das clulas at meio da fase exponencial,
seguido da lavagem com uma soluo de cloreto de clcio. O DNA foi posteriormente adicionado
suspenso e as clulas foram sujeitas a um choque trmico (ou seja so expostas a gelo e depois a uma
temperatura de 42C).
Aps uma breve incubao num meio no selectivo (em que neste perodo so expressos os genes do
plasmdeo, incluindo os genes de resistncia a antibiticos, assegurando que as bactrias sintetizem
protenas suficientes quando posteriormente foram transferidas para um meio com antibitico), as
clulas so espalhadas em placas com um meio selectivo.
Por exemplo, quando temos bactrias resistentes ampicilina no meio selectivo, o gene plasmdico que
confere resistncia codifica a enzima -lactamase, que responsvel pela degradao do antibitico.
Neste trabalho usamos a plasmdeos diferentes: pEMBL9 e pBR322.
a) O plasmdeo pBR322 representado na figura ao lado, contm uma regio de replicao, o gene
ampR, que codifica a protena de resistncia a ampicilina e o gene tet
R, que codifica a protena
de resistncia tetraciclina. A partir deste plasmdeo originou-se um outro modificado, o
pBR322-CAT, ao qual foi inserido o gene CAT no local do gene que codifica a resistncia
tetraciclina (pelo que assim h inactivao da resistncia tetraciclina). O gene CAT codifica a
enzina cloranfenicol acetil transferase.
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O segundo plasmdeo usado foi o pEMBL9, em que a insero dos fragmentos de DNA se d num
polylinker (que uma sequncia de DNA curta que contm vrios locais de reconhecimento de enzimas
de restrio estando contida nos vectores de clonagem) localizado na extremidade 5 que codifica a
enzima -galactosidase, que quando expostas lactose a degradam (sendo esta o indutor natural da
expresso da enzima). Assim sendo, o plasmdeo contm tambm os elementos do promotor que so
necessrios expresso da enzima -galactosidase. Este plasmdeo foi tambm modificado de forma a
obtermos um outro, o pEMBL9-CAT. O gene CAT foi inserido nos locais BamHI e HInd III do polylinker.
Isto permite observar a expresso do gene CAT em resposta presena de lactose no meio, sendo que
as bactrias portadoras deste gene so resistentes ao cloranfenicol quando crescidas num meio com
lactose.
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Os meios de cultura usados foram os seguintes: Mac/Lac/Amp, LA/Amp e LA/Amp/Tet.
Um dos meios usados foi o MasConkey agar que contm um indicador de pH (neutral red) e lactose.
Assim, se por exemplo as bactrias de uma determinada colnia metabolizam a lactose, h produo de
substncias acdicas que vo alterar o pH do meio, havendo a produo de colnias vermelhas. Se a
colnia de bactrias no possuir actividade -galactosidase, ento as colnias tero uma cor
branca/amarela.
O objectivo deste trabalho laboratorial foi ento calcular a eficincia de transformao (atravs do
nmero de colnias crescidas em cada placa) para cada plasmdeo usado, observando as diferenas
obtidas em cada meio de cultura e tirar concluses acerca disso. A partir dos resultados obtidos
tnhamos tambm como objectivo verificar se houve ou no expresso do gene CAT no meio com
lactose.
RESULTADOS OBTIDOS
Plasmdeo Meio de cultura N de colnias Cor Eficincia de
transformao
pLEMB9 Mac+Lac+Amp 61 Vermelhas 1,22 10
4
LA+Amp 524 Brancas/amarelas 1,048 105
pLEMB9-
CAT
Mac+Lac+Amp 105 Brancas/amarelas 2,1104
LA+Amp 1 Brancas/amarelas 2 102
pBR322 LA+Amp+Tet 2 Brancas/amarelas 4 102
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LA+Amp 15 Brancas/amarelas 3 103
pBR322-
CAT
LA+Amp+Tet 0 ---- ----
LA+Amp 6 Brancas/amarelas 1,2 103
Controlo LA+Amp 0 ---- ---
TABELA 1. REGISTO DOS DADOS OBTIDOS NA TRANSFORMAO DE E. COLI NA PRESENA DOS DIFERENTES PLASMDEOS (PLEMB9,
PLEMB9-CAT, PBR322 E PBR322-CAT), OU SEJA REGISTO DO NMERO DE COLNIAS OBSERVADAS E DA COR DESTAS, E AINDA O
CLCULO DA EFICINCI A DE TRANSFORMAO .
A eficincia de transformao calculada pela seguinte expresso:
E.T (eficincia de transformao) =
Deve ser tido em conta o factor de diluio, ou seja, como cada um dos tubos contendo um plasmdeo
diferente tem uma quantidade de DNA de 10ng em 250 mL de volume total no tubo, como cada placa
foi plaqueada com 125mL de cada um desses tubos, cada placa vai conter ento 5ng de DNA (ou seja 5
10-3
g de DNA).
Plasmdeo Meio inicial Novo meio Crescimento
pLEMB9
LA+Amp Mac+Lac+Clo
no
pLEMB9-CAT sim
pBR322-CAT sim
TABELA2. RESULTADOS OBTIDOS PARA O CRESCIMENTO DAS COLNIAS NOS DIFERENTES MEIOS, TRANSFERIDAS DE UM M EIO INICIAL
(LA+AMP) PARA UM NOVO MEIO (MAC+LAC+CLO).
D ISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSO
A eficincia de transformao foi calculada para todos os plasmdeos com excepo para aqueles em
que no houve crescimento de colnias, como o caso da placa controlo, que no possui plasmdeo.
Neste tipo de transformao em que o mtodo que se usa o do cloreto de clcio so esperadas
eficincias de 106-10
7 transformantes/g de DNA. Como se pode observar pelos nossos resultados isso
no aconteceu, tendo-se obtido eficincias de transformao bastante inferiores. Isto pode dever-se a
vrios factores, como por exemplo, uma m preparao das clulas competentes, a colheita das clulas
no ter sido efectuada na fase de crescimento exponencial, o contacto das clulas com o cloreto de
clcio no ter sido efectuada durante tempo suficiente e ainda os reagentes no serem totalmente
puro.
Agora analisando os resultados obtidos com cada plasmdeo em diferentes meios de cultura podemos
tirar vrias concluses.
Usando o plasmdeo pEMBL9, num meio de cultura contendo ampicilina, lactose e o indicador
MacConkey, verificou-se o crescimento de colnias de cor vermelha. Assim sendo, podemos concluir
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que estas clulas expressam o gene que codifica a enzima -galactosidase, pois como vimos o indicador
neutral red identifica uma mudana no pH junto das colnias proveniente da metabolizao da lactose
que origina substncias cidas. Ou seja, como se formaram colnias vermelhas, isso significa que estas
possuam a enzima (em que a sue expresso foi induzida pela presena de lactose no meio) que
degradou a lactose presente no meio originando colnias de cor vermelha. Para o meio contendo
apenas lactose e ampicilina, seria de esperar o crescimento de colnias, tal como se verificou, pois o
plasmdeo pEMBL9 tem genes que lhe conferem resistncia ampicilina, a cor das colnias obtidas foi
amarelo/branco pois no havia indicador de pH (MacConkey) no meio.
Para o plasmdeo modificado, pEMBL9-CAT, as clulas transformadas com este no so capazes de
fermentar a lactose, pois no possuem actividade -gal, pelo que a colorao das colnias
amarela/branca. Estes no possuem actividade -gal pois as colnias de bactrias tm plasmdeos que
contm um fragmento exgeno inserido no polylinker que no vo permitir a degradao da lactose,
pois h uma alterao no quadro de leitura o que leva a que no haja a expresso da protena, pelo que
a enzima tambm no atua.
O pBR322, como j for referido na introduo, apresenta genes que lhe conferem resistncia tanto
ampicilina como tetraciclina. Pelo que como era esperado houve crescimento de colnias nos meios
com ambos os antibiticos. Para o plasmdeo pBR322-CAT num meio de cultura com tetraciclina no se
observou o crescimento de colnias o que tambm era de esperar visto que as clulas que so
portadoras do gene CAT, e este inactiva a resistncia tetraciclina, sendo que de facto no se verificou o
crescimento de colnias neste caso, pois as clulas com este gene ficam susceptveis ao antibitico. Para
as clulas com o plasmdeo pBR322-CAT num meio LA+Amp, sem tetraciclina, o crescimento das
colnias ocorreu porque apesar de no terem resistncia tetraciclina, tambm no precisavam de a ter
neste caso pois o meio no possui Tet.
No controlo no se verificou o crescimento de colnias num meio com LA+Amp, o que era de fato
esperado, pois o controlo no possua DNA plasmdico.
Para verificar se houve ou no induo da expresso do gene CAT no meio com lactose e testar a
resistncia das clulas ao cloranfenicol, transferiram-se 10 colnias de um meio inicial (LA+Amp) para
um novo meio (Mac+Lac+Clo).
Assim sendo, podemos concluir que os resultados foram de acordo com o esperado. Para o caso das
clulas com o plasmdeo pEMBL9 no se verificou crescimento de colnias no novo meio de cultura
(Mac/Lac/Clo), isto verifica-se pois este plasmdeo no possui o gene CAT (codifica para a enzima
cloranfenicol acetil transferase, conferindo resistncia ao cloranfenicol), pelo que as clulas no so
resistentes ao cloranfenicol quando crescidas na presena de lactose e assim no se observa o
crescimento.
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No caso de clulas contendo o plasmdeo pEMBL9-CAT, h expresso do gene CAT (que confere
resistncia ao cloranfenicol) pois este foi inserido entre o opero da lactose e a extremidade 5 do gene
que codifica para a -galactosidase. A expresso do gene CAT assim induzida pelo opero da lactose
que, por sua vez, induzido pela lactose.
Por fim, para o plasmdeo pBR322-CAT, este tem o gene CAT inserido no local do gene que codifica para
a resistncia tetraciclina, pelo que se contm o gene CAT, codifica para a enzima cloranfenicol acetil
transferase e assim as clulas com este gene so resistentes ao cloranfenicol e da ocorrer o crescimento
de colnias no meio com cloranfenicol e lactose.
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SEQUENCIAO DE DNA
RELATRIO DA AULA PRTICA N7
Data de realizao: 17 de Maio de 2013
INTRODUO E OBJECTIVO
O objectivo deste trabalho prtico foi a aplicao da tcnica de sequenciao de Sanger assim como a
utilizao do PCR (polymerase chain reaction) para a clonagem do cDNA.
Isolou-se uma protena e determinou-se a sequncia dos primeiros 10 aminocidos da regio N-
terminal. Assim, com base nesta sequncia, foram desenhados os primers degenerados para a
amplificao do correspondente DNA complementar por PCR, a partir de uma biblioteca da cDNA
orientada. Os produtos obtidos por PCR foram clonados atravs da utilizao de um plasmdeo
(orientao 5 EcoRI 3HindIII).
Aps isolamento, procedeu-se sequenciao de 3 clones independentes para verificar qual dos trs
codifica para a protena que se pretende clonar.
A sequenciao nucleotdica de um gene de grande importncia, pois esta representa a caracterizao
da sua estrutura gentica. Um ponto importante a destacar que para a realizao da sequenciao
necessrio obter fragmentos definidos de DNA e como a clonagem possibilita a obteno de um grande
nmero desses fragmentos, estas duas tcnicas esto altamente interrelacionadas.
A sequenciao pode ser realizada por vrias tcnicas, duas delas so as chamadas degradao qumica
de Maxam e Gilbert e o mtodo enzimtico de Sanger. Ambos os mtodos geram uma grande
quantidade de nucletidos que comeam num ponto especfico e terminam num resduo particular.
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F IGURA 2. REPRESENTAO GERAL DO MTODO DE SANGER, EM QUE SO USADAS QUATRO REACES (ACTUALMENTE J S SE
REALIZA UMA REACO).
No mtodo de Sanger para alm dos dNTP so incorporados ddNTP (terminadores) marcados
fluorimetricamente, onde na posio 3 da desoxirribose um grupo OH substitudo por um H. Isto leva
impossibilidade da formao de uma ligao fosfodister e continuao da reaco de polimerizao
que termina cada vez que incorporado um ddNTP marcado.
F IGURA3.DIFERENA ENTRE OS DIDESOXINUCLOTIDOS QUE VARIAM DOS NUCLETIDOS NORMAIS DEVIDO AUSNCIA DE UM
GRUPO HIDROXILO (-OH) NO CARBONO 3 DA PENTOSE.
Quatro tipos de populaes de fragmentos podem ser obtidas, ou seja podemos obter populaes que
terminam no nucletido A,C,G ou T. Neste mtodo o primer indica a regio de incio do
sequenciamento.
O primer ou nucletidos podem estar radioactivamente marcados (sequenciamento manual) ou ddNTPs
podem estar marcados com molculas fluorescentes (sequenciamento automtico). Basta a realizao
de apenas uma reaco de sequenciao, sendo que os produtos desta so corridos em gis existentes
no interior de capilares muito finos e visualizados com detectores lasers (mtodo mais recente).
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F IGURA 4. ELECTROFORESE USANDO MARCADORES RADIOACTIVOS PARA CADA DIDESOXINUCLOTIDO.
Mtodo de Gilbert (em desuso) baseia-se na marcao radioactiva de um dos extremos do fragmento
de DNA e a sua posterior degradao parcial atravs de reaces especficas para as bases do DNA.
Assim, medindo a distncia entre o ponto de degradao e a extremidade radioactiva visualizada por
autoradiografia possvel determinar a posio de cada base na cadeia de DNA.
TRATAMENTO DE DADOS E RESULTADOS
a) Determinao da sequncia de cada clone (A,B e C);
b) Identificao dos locais de clonagem (EcoRI e HIndIII);
c) Identificao do primer degenerado de cada clone utilizado para a reao de PCR;
d) Identificar qual dos clones codifica para a protena que se quer clonar.
Sequncia que codifica para a EcoRI 5 GAATTC 3
Sequncia que codifica para a HindIII 5 AAGCTT 3
Clone A
Cadeia no codificante
3ATCGCTTAAGTGGTCCAAGGCTTGTAGCGGTAAGGTCCCTTGAGTAACTCAGATCGGATTGATTGCTGGGTACA
GCGGGGCACTTTTCGAAGCGGAT 5
Cadeia complementar (codificante)
5TAG CGA ATT CAC CAG GTT CCG AAC ATC GCC ATT CCA GGG AAC TCA TTG AGT AGC CTA ACT AAC TAA
CGA CCC ATG TCG CCC CGT GAA AAGCTTCGCCTA 3
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Primer degenerado
3 GGG TAC AGC GGG GCA 5
5 CCC ATG TCG CCC CGT 3
(PRO-MET-SER-PRO-ARG)
Clone B
Cadeia no codificante
3ATCGCTTAAGTAATAGGGCTAGATCATTGCGTAGGAGATTGATCGCACTTAATACAGTATAACGGACGGGTACA
GGGGCGCACGCTTCGAAGCGGAT 5
Cadeia complementar (codificante)
5TAGCGAATTCATTATCCCGATCTAGTAACGCATCCTCTAACTAGCGTGAATTATG TCA TAT TGC CTG CCC ATG
TCC CCG CGT GCG AAGCTTCGCCTA 3
Primer degenerado
3 GGG TAC AGG GGC GCA 5
5CCC ATG TCC CCG CGT 3
(PRO-MET-SER-PRO-ARG)
Clone C
Cadeia no codificante
3ATCGCTTAAGTTAGCTGGGTCCAGTGTTGGAAGGCCGAGTTCGGATTGGATCAATTCTGGGATACAGAGGGGC
TCGATTCGAAGCGGAT 5
Cadeia complementar (codificante)
5TAGCGAATTCAATCGACCCAGGTCACAACCTTCCGGCTCAAGCCTAACCTAGTTAAGACCCATG TCT CCC CGA
GCT AAGCTTGCGGAT 3
Primer degenerado
3 GGA TAC AGA GGG GCA 5
5 CCT ATG TCT CCC CGT 3
(PRO-MET-SER-PRO-ARG)
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F IGURA 5. TABELA DO CDIGO GENTICO.
Assim, podemos concluir que o clone B que codifica para a protena que se pretende clonar, pois
este que apresenta a sequncia de aminocidos pretendida:
N-terminal Ser Tyr Cys Leu Pro Met Ser Pro Arg Ala C terminal
Clone B Sequncia
Cadeia no codificante do clone B 3TAC AGT ATA ACG GAC GGG TAC AGG GGC GCA CGC 5
Cadeia codificante do clone B 5ATG TCA TAT TGC CTG CCC ATG TCC CCG CGT GCG3
RNAm 5 UAC AGU AUA ACG GAC GGG UAC AGG GGC GCA CGC3
RNAt 5 AUG UCA UAU UGC CUG CCC AUG UCC CCC CGU GCG 3
Sequncia de aminocidos na protena N-terminal Ser Tyr Cys Leu Pro Met Ser Pro
Arg Ala C terminal
TABELA 1. SEQUNCIA NUCLEOTDICA DA CADEIA NO CODIFICANTE E CODIFICANTE DO CLONE B, DO RNA MENSAGEIRO, RNA
TRANSFERNCIA E RESP ETIVA SEQUNCIA DE AMINOCIDOS DA PROTENA PRETENDIDA.
D ISCUSSO DE RESULTADOS E CONCLUSES
Pela anlise das sequncias no codificantes resultantes de cada um dos clones (A,B e C) por PCR, foi
possvel obter as respectivas cadeias codificantes de DNA, assim como o primer degenerado utilizado
para a reaco de PCR em cada clone. Foi possvel ainda localizar os locais de clonagem EcoRI e HIndIII.
Assim, pela anlise realizada no tratamento de dados foi possvel identificar o clone que codifica para a
protena de interesse:
N-terminal Ser Tyr Cys Leu Pro Met Ser Pro Arg Ala C terminal.
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Para identificar o primer degenerado, tivemos que olhar para os trs clones e identificar uma sequncia
de aminocidos comum nos trs (para identificar os aminocidos pela tabela do cdigo gentico olhou-
se para a cadeia codificante).
Assim sendo, para o clone A identificamos o primer 3 GGG TAC AGC GGG GCA 5.
A sequncia de aminocidos obtida no corresponde sequncia de aminocidos da protena que se
pretende clonar, pois este clone codifica para a protena com a seguinte sequncia de aminocidos:
Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Asn-Ser-Leu-Ser-Ser-Leu-Thr-Asn STOP
Para o clone B identificamos o primer com a seguinte sequncia 3 GGG TAC AGG GGC GCA 5.
A sequncia de aminocidos que se obteve corresponde sequncia de aminocidos da protena que se
pretende clonar:
Ser Tyr Cys Leu Pro Met Ser Pro Arg Ala
Por fim para o clone C, o primer consiste na seguinte sequncia de nucletidos: 3 GGA TAC AGA GGG
GCA 5 .
A sequncia de aminocidos obtida diferente da protena de interesse, sendo assim o clone C no
codifica para a protena que se quer clonar.
Met-Ser-Pro-Arg-Ala
Conseguimos portanto, pela aplicao do mtodo de Sanger, encontrar uma sequncia exacta que
codifica uma determinada sequncia de aminocidos e por comparao com a sequncia N-terminal da
protena isolada neste estudo, conclui-se que o clone B que a codifica.
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CLONAGEM DE CDNA -TUB
RELATRIO DA AULA PRTICA N8
Data de realizao: 24 de Maio de 2013
INTRODUO
As tcnicas de DNA recombinante tm grande
impacto nas cincias da sade e da vida, pois a
sua descoberta constitui o primeiro passo na
direco da produo de vacinas, medicamentos
e tcnicas de diagnstico, entre outros grandes
avanos nestes domnios da Biologia, e ainda na
engenharia qumica e agronmica.
Em Biologia Molecular, clonagem significa a
utilizao de vectores (nesta aula prtica,
utilizaram-se os mais simples os plasmdeos),
onde, num local especfico, se insere um
fragmento de DNA de interesse (neste trabalho
prtico, trata-se do gene TUB) com recurso a
enzimas de restrio que cortem
especificamente o DNA plasmdico no local de
insero pretendido, para, posteriormente,
criarem-se grandes quantidades de molculas de
DNA recombinantes, que facilitam o estudo de
um fragmento de DNA exgeno de interesse
atravs de tcnicas como o PCR (polymerase
chain reaction), transformao bacteriana, entre
outras tcnicas de DNA recombinante.
Desta forma, e em sntese, aps a obteno do
gene de interesse, necessrio inseri-lo num
vector (neste caso, o plasmdeo pSK) com recurso
DNA ligase e enzimas de restrio (e,
eventualmente, de modificao) para criar uma
molcula de DNA recombinante. A produo de
grandes quantidades desta molcula para F IGURA 1. ESQUEMA REPRESENTATIVO DO PROCEDIMENTO GLOBAL
DE CLONAGEM.
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investigao posterior efectuar-se- por insero da molcula num sistema bacteriano (neste trabalho
prtico, uma vez mais, foi utilizada a bactria E. coli para este efeito), onde o gene de interesse ser
ento replicado e expresso em meio de ampicilina (a presena de um gene de resistncia a este
antibitico no vector de expresso Ampr permitir assim seleccionar apenas as bactrias resistentes
para conter o gene de interesse). A este ltimo procedimento d-se o nome de transformao, que
resulta na absoro do DNA pela bactria, que pode ou no ser integrado no seu genoma deste modo,
medida que as bactrias se multiplicam, o gene de interesse tambm se replica.
F IGURA 2. PROCEDIMENTO RELATIVO TRANSFORMAO BACTERIANA.
A replicao das clulas bacterianas resultar na criao de colnias transformadas. No entanto, estas
podem caracterizar-se por:
a) No possurem, de todo, o vector (estas clulas morrem por, ao no incorporarem o plasmdeo,
no incorporarem a resistncia ao antibitico presente no meio de cultura)
b) Possurem o vector, mas no o gene de interesse.
c) Possurem ambos os fragmentos.
Assim, de modo a seleccionar as colnias que, de facto, contm o gene de interesse, necessrio
adoptar mais um mecanismo de seleco. Ao utilizar um vector que contenha o gene lacZ, que codifica a
-galactosidase (-gal), a enzima que degrada a lactose (includa no meio de cultura) em cido frmico,
possvel distinguir as colnias que contm o gene e as que no o contm, dado que adquirem
coloraes diferentes, consoante a -gal funcional (-gal+) nessas colnias ou no (-gal
-).
PROCEDIMENTO ADOPTADO informao constante no caderno de aulas prticas da unidade curricular, acresce a composio dos
tubos Eppendorf usados para transformao das bactrias E. coli:
A B C D
Vector pSK/L 5 5 5
cDNA TUB/L 10 10 10
Tampo de ligao/L 4 4 4 4
T4-Ligase/L 1 1 1
TABELA 4. COMPOSIO DOS TUBOS USADOS PARA INCUBAO E TRANSFORMAO.
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RESULTADOS EXPERIMENTAIS
Apresentam-se abaixo as colnias obtidas em cada um dos meios preparados:
F IGURA 5. COLNIAS DESENVOLVIDAS APS TRANSFORMAO E INCUBAO, E LEGENDA DO RESPECTIVO MEIO DE CULTURA.
Nota: fo ram adoptados os resul tados obt idos pe lo grupo 6 da turma P2.
Verificou-se o crescimento de colnias vermelhas e brancas, apesar de estas ltimas se revelarem quase
imperceptveis, na placa A, as placas B e C no possuem colnias desenvolvidas e a placa D apenas
desenvolveu colnias vermelhas, em quantidade semelhante placa A.
D ISCUSSO DE RESULTADOS E CONCLUSO
A transformao da E. coli por introduo do plasmdeo recombinante pET3a-TUB, seguida de
incubao, resultou em colnias de diferentes cores e graus de crescimento, como demonstram os
resultados acima apresentados.
De facto, os resultados obtidos vo de encontro ao que seria esperado da parte de cada placa, cujas
bactrias foram incubadas em diferentes condies:
s bactrias da placa A, foi inicialmente adicionado o vector pET3a, o fragmento de DNA de
interesse TUB, o tampo de ligao e a T4-DNA ligase todos os componentes necessrios,
portanto, a uma transformao com sucesso. No entanto, nem todas as colnias incorporam o
fragmento de interesse. Verificam-se ento, tal como esperado, colnias vermelhas e incolores.
A B
C D
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A presena de colnias vermelhas indica que no houve incorporao do fragmento TUB,
dado que nestas o gene lacZ expressa a -gal+ (-galactosidase funcional), que degrada a
lactose, alterando o pH do meio as colnias sero vermelhas.
Pelo contrrio, a presena de colnias brancas indica que as colnias incorporaram, de facto o
fragmento de interesse a presena e expresso do gene de interesse causa a expresso por
parte do gene lacZ da -gal- (-galactosidase no funcional), pelo que o pH permanece
inalterado e as colnias sero, portanto, incolores.
As placas B e C no apresentam desenvolvimento de colnias, dado que a placa B no contm a
enzima T4-DNA ligase, indispensvel na unio das extremidades (split ends) do vector,
nomeadamente ao gene a clonar. Nestas condies, as bactrias no se desenvolvem, visto
que, tratando-se de uma bactria, cujo DNA circular, o vector pET3a no adquire essa
conformao, pelo que no expressa a resistncia ao antibitico presente no meio de cultura
(ampicilina). A ausncia de vector, e, portanto, do gene Ampr, levar, portanto, a um efeito
semelhante.
Na ausncia de fragmento, que ocorre na placa D, como explicitado anteriormente, o gene lacZ
expressa a -gal+, originando colnias vermelhas.
Conclui-se, portanto, que este se trata de um processo simples, que envolve sistemas procariotas de uso
comum e que permite reconhecer de forma exacta e imediata, aps incubao, as colnias onde
ocorreu incorporao e expresso do gene de interesse, do qual se conseguem obter elevadas
quantidades com grande fiabilidade.
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