Testes utilizados em Imunologia Clínica – Reagentes não Marcados Profa Alessandra Xavier Pardini...

Testes utilizados em Imunologia Clínica –

Reagentes não Marcados

Profa Alessandra Xavier Pardini

Disciplina Imunologia Clínica

Resposta Imunológica Específica

- é mais elaboradareconhecimento - clonagem (multiplicação de células defesa) - ativação celular - processo complexo

- células: ly T e B atacam especificamente o antígeno- resposta imunológica

de memória

Anticorpos

Molécula de Ac Sítio de ligação do Ag símbolo

Sítio de ligação do AgSítio de ligação do Ag

antígeno Determinante antigênico (epítopo)

Cadeia leve

Cadeia pesada

Fab

Fc Região de dobradiça

Tempo (dias)

Primeira exposição ao

Ag

Segunda exposição ao

Ag

Resposta secundária

Resposta primária

Títu

lo d

e A

c no

sor

o

( u

nida

des)

Dinâmica de produção de Anticorpos durante a infecçãoDurante a infecção realiza-se pesquisa de IgM e IgG para diferenciar a fase em que se encontra a doença

Determinação de limiar de reatividade

A – Limiar de máxima sensibilidade - triagemB – Limiar com máximas sensibilidade e especificidade – estudos epidemiológicosC – Limiar de máxima especificidade – diagnóstico

Introdução- Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a

detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos

- Utilizam reagentes não marcados (precipitação aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos)

- Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica

- Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas

- Anticorpos monoclonais e Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento

(a) Ac monoclonais: produção, homogêneos, caracterizáveis(b) Ag recombinantes: caracterizáveis, produção em larga escala,

especificidade

Métodos:- aperfeiçoamento, consolidação do que já existe, tecnologias

emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação

- métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente

- Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso

- Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) = temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados

- As metas para o laboratório clínico devem melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados

Imunodiagnóstico

Designa o diagnóstico por técnicas imunológicas que revelam a presença de determinado antígeno (Ag) ou anticorpo (Ac) no organismo

•Ensaios ou Testes de Precipitação

•Fixação do Complemento

•Neutralização ou Imunoensaios

•Imunofluorescência

•Radioimunoensaio

•Imunoenzimáticos

•Imunofluorimétricos

•Quimiluminescência

Métodos de Imunoensaios

Reagentes não-marcados• Precipitação• Aglutinação• Ensaios Líticos

Reagentes marcados• Radioativos• Enzimáticos• Fluorescentes• Quimioluminescentes

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS:REAGENTES NÃO MARCADOS

Técnicas rápidas

Sistema homogêneo

Sensibilidade reduzida

Boa especificidade

Direta – detecção de Ag

Indireta – detecção de Ac

Baixo custo

Dificultam automação

Problemas com reprodutibilidade

Não permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vez

Precipitação

- quantificação de complexo Ag-Ac

- depende de [ ] relativas de Ag e Ac

- excesso - dissolução do precipitado

- zona de equilíbrio - precipitação máxima

Concentração de Ag

Excesso de Ag

Excesso de Ac

Equivalência

Imun

opre

cipi

taçã

o

Imunodifusão

- difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Ac

- simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo

- dupla: ambos movem-se = encontro – complexo

pode ser linear ou radial

Imunodifusão Radial Simples (Mancini)

- utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de anticorpos específicos

- perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag

- quantificação de [ ] em soro ou líquor

- sensibilidade de 1 a 3ug/mL de antígeno

uso: Ig séricas, proteína C reativa (PRC) e proteínas do sistema complemento (C3, C4)

- diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a concentração do antígeno

- construção de curva padrão permite determinar a conentração do antígeno

Imunodifusão dupla (Ouchterlony)

- precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas indica ausência de Ag ou Ac

- depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros do gel, temperatura, [ ] e pureza do ágar

- camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – aplicação da amostra

- desvantagens: lenta e baixa sensibilidade

Uso: vários sistemas antigênicos (artrite reumatóide, lupus, esclerose sistêmica, caxumba)

Nefelometria

- muito usada em laboratórios de análises clínicas

- Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz

- Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fases

- Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de antígenos muito concentrados

- Sensibilidade - 1ug/mL

Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormônios

Princípio

partículas em suspensão – desvio de luz incidida

dispersão de luz incidente quantificada por um detectorFonte de luz

Suspensão de Ac e Ag diluídos

Raios de luz focados

Raios de luz desviados e refletidos

Detector

Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio-neônio ou laser

concentração - curva padrão

Nefelômetro acoplado a computador

TurbidimetriaAg+Ac em suspensão – luz transmitidaDetector - espectrofotômetroVantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e

automatizadaDesvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvasUso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina

Fonte de luz branca

Espectrofotômetro de fibra óptica Absorção e espectro de

luz desviada e refletida

Técnicas de Aglutinação

Aglutinação

- complexo Ag-Ac - agregados visíveis

- semi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitação

- sensibilização de suporte – látex, hemácias

- vantagens: < custo, facilidade e rapidez

- desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidade

- vários tipos de sistemas

Fatores interferentes

- classe de Ac - IgM 750 vezes mais eficiente que IgG

- eletrólitos

- pH ( ideal entre 6,0 e 8,0)

- tempo

- temperatura

- estabilidade da ligação ao suporte (adsorção)

- concentração de Ag ou Ac (falso -)

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃOREAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO

Tipos de reaçõesTipos de reações

Aglutinação Direta

Inibição da aglutinação direta / hemaglutinação

Aglutinação Indireta ou Passiva

Hemaglutinação passiva

Inibição da aglutinação passiva / hemaglutinação

Reação de microflocução

Ag ou Ac adsorvido a partícula/célula

Facilita a visualização do imunocomplexo Ag-Ac

Aglutinação direta

- partículas antigênicas insolúveis íntegras ou fragmentadas

- Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos

- realizado em tubo ou lâmina

- Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose

- para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO)

AGLUTINAÇÃO DIRETAAGLUTINAÇÃO DIRETA

Ac do soro

Ag íntegro ou fragmentado

aglutinação

Resultado positivo

Resultado positivo

Ag eritrocitário

Ac Anti-eritrócito

Reagente de Coombs

A B AB O

Tipagem de Sangue – direto (pesquisa de antígeno)

Aglutinação indireta ou passiva

- Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes

- hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes

- outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose

- detecta IgG e IgM / tratamento com 2-ME

- lâmina ou microplaca em “V” ou “U”

Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide (FR), proteína C reativa (PRC), ASLO

Esquema de realização de testes de aglutinação em placa –

teste de Látex (testes rápidos)

Aglutinação indireta (passiva)

AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVAAGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVAAc do soro

Ag solúvel adsorvido ao suporte

aglutinação

Aglutinação Indireta

HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVAHEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA

Ac do soro

Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)

aglutinação

Hemaglutinação passiva

Ac do soro

Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia)

Aglutinação

Reação de microfloculação

- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)

- RPR (Rapid Plasm Reagin)

- suporte: cristais de colesterol

- Ag: cardiolipina

- placas escavadas

- Uso: pesquisa de reaginas

REAÇÃO DE MICROFLOCULAÇÃO

Ac da Amostra

Suspensão antigênica: cardiolipina, colesterol e lecitina

aglutinação

Reação Positiva=

Reação negativaReação negativa Reação positivaReação positiva

Resultado VDRL

Microscópio óptico 100x

Reação de fixação de complemento (RFC)

- 1901 – Boret e Gengou - qualitativo: sistema homogêneo de duas etapas

- 1948 – Mayer e cols. – quantitativo

- 1961 – Wassermanmn e Levine – micrométodo quantitativo

- 1a etapa: interação Ag-Ac na presença de complemento

- 2a etapa: adição do sistema indicador (Hc+hemolisina)

difícil execução: reagentes padronizados

- uso: doença de Chagas, sífilis, neurocisticercose

Soro com Ac

Soro sem Ac

Ag liga-se ao Ac

Ag não ligado

Complemento liga-se ao

complexo Ag-Ac

Complemento não ligado

Indicador - Hemácias

sensibilizadas com hemolisinas

Indicador - Hemácias

sensibilizadas com

hemolisinas

Hemácias íntegras no pellet

Não houve lise

Hemácias lisadas pelo complemento não ligado

Hemólise

Reativo Não reativo

REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO

Ag

Ac do soro

complemento

sistema indicador sem hemólise+

+

Agradecimentos

Profa Adriana de BritoProfa Paula KnoxPelo material gentilmente cedido

Referências BibiolgráficasFERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial das

Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes, 2001.

Obrigada, Profa Alessandra