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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
EMILIANO RICARDO VASCONCELOS RIOS
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO ACETATO DE CITRONELILA:
ESTUDO DOS POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO
FORTALEZA
2014
EMILIANO RICARDO VASCONCELOS RIOS
EFEITOS ANTINOCICEPTIVOS DO ACETATO DE CITRONELILA:
EM MODELOS DE NOCICEPÇÃO AGUDA EM CAMUNDONGOS
Tese apresentada à Coordenação do programa de Pós-graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Orientadora: Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles
FORTALEZA
2014
EMILIANO RICARDO VASCONCELOS RIOS
EFEITO ANTINOCICEPTIVO DO ACETATO DE CITRONELILA:
ESTUDO DOS POSSÍVEIS MECANISMOS DE AÇÃO.
Tese apresentada a Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Farmacologia.
Aprovada em 18 / 03 / 2014
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Profa. Dra. Marta Maria de França Fonteles (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
___________________________________________
Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________
Prof. Dr. Roberto César Pereira Lima Junior
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________
Prof. Dr. Francisco Washington Araújo Barros Nepomuceno
Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira (UNILAB)
__________________________________________
Profa. Dra. Fernanda Regina de Castro Almeida
Universidade Federal do Piauí (UFPI)
AGRADECIMENTOS
Este ponto, para mim, parece ser o mais difícil de escrever de toda a tese. A
possibilidade de esquecer um nome pode me deixar constrangido. Agradecer a tudo e a todos,
com certeza seria um grande equívoco e demonstraria que todos tiveram igual participação no
desenrolar deste trabalho. Portanto, embora possa parecer que há alguma falta de consideração
por determinadas pessoas que foram ou são fundamentais na minha vida, os agradecimentos
descritos a seguir são destinados somente àqueles que tiveram efetiva participação na
elaboração deste trabalho ou que, de alguma forma colaboraram para que eu tivesse condições
de realizá-lo. Sendo assim, não seguirei qualquer ordem de importância aqui, e sim a ordem
que me vem à cabeça neste momento, a grandeza de cada agradecimento será perceptível aos
olhos dos atentos leitores desta página.
À minha família, meus pais, José Ricardo Rios e Maria Selma Vasconcelos Rios,
pelo esforço tremendo, muitas vezes não reconhecido, que fizeram para eu chagar até aqui.
Também à minha irmã, Amanda, e meu cunhado, David, a pequena Alice (a coisa mais fofa
desse planeta) e ao trio canino Tina, Pucca e Garu.
À minha esposa, Aline, eterna companheira. Por compartilhar todos os momentos
e sempre ter a frieza de achar soluções quando tudo parecia perdido, pelo menos para mim.
À minha 2ª família que me adotou com muito carinho como se fosse um filho: Seu
Eudemberg, Dona Magda, Careca (Alexandre) e o quarteto felino fantástico Pretinha, Bola,
Pequena e Botinha.
A minha orientadora, Profª. Drª. Marta Maria de França Fonteles, por todos esses
anos me ajudando e ensinando, por acreditar em mim e ter confiado no meu potencial, mesmo
diante das diversas mudanças nos planos.
À todas outras professoras do Laboratório de Neurofarmacologia, Profª. Drª.
Glauce Socorro de Barros Viana (nossa grande avó científica), Profª. Drª. Francisca Cléa
Florenço de Sousa (por ter cedido a substância em estudo e aceitado participar da minha banca
de Doutorado), Profª. Drª. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos (pelos momentos de
descontração e por ter disponibilizado uma cafeteira para o laboratório), Profª. Drª. Danielle
Macêdo Gaspar (pelos vários momentos de conversas, tirada de dúvidas e por ter participado
da minha banca de qualificação).
Aos professores doutores Roberto César Pereira Lima Júnior (por, também, ter
participado da minha banca de qualificação) e Francisco Washington Araújo Barros
Nepomuceno, os quais tenho profunda admiração científica, por estarem à disposição para
participar da banca de doutorado mesmo diante das diversas mudanças de data.
À Profª. Drª. Fernanda Regina de Castro Almeida por ter se deslocado até nossa
cidade para participar da banca de doutorado.
Aos demais professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC por
ajudarem na minha formação, principalmente, à Profª. Drª. Letícia Veras Costa-Lotufo, pelo
brilhante trabalho frente à coordenação do PPG em Farmacologia.
Tenho muito a agradecer ao fraterno e vitorioso grupo auto-intitulado “NeuroDor”.
Nayrton, grande pesquisador, pela “co-orientação” deste trabalho, pelos inúmeros bons
momentos que nossa amizade nos proporciona, e mesmo distante ela nunca vai deixar de existir.
Leonardo e Alyne Mara, casal forte e decidido, obrigado pela fundamental ajuda do desenrolar
deste trabalho e, principalmente, pela amizade, é muito ter vocês como amigos e vizinhos.
Marília , bela pesquisadora, esforçada, inteligente e acima de tudo amiga. E por último, mas
não menos importante, Laura , nossa IC sempre disponível, esforçada e trabalhadora. Ninguém
decidiu formar esse grupo, ele foi se moldando com o tempo. Parabéns a todos pelos resultados,
que são frutos do nosso trabalho, dedicação, compromisso e responsabilidade. Alguns, talvez
com inveja dessas virtudes, tentaram enfraquecê-lo, mas em nada fomos afetados. “Hoje somos
mais fortes do que ontem e mais fracos do que amanhã.”
Aos amigos do laboratório Edith, Giuliana, Mariana, Camila, Belzinha,
Thiciane, Fernando, Cerqueira, Rafaelly, Helvira, Danilo, Caca, Luciana, Taciana,
Vládia, Patrícia, Eduardo, Sarah, Valdécio e todos os estagiários, pela companhia e
cooperação.
Aos demais amigos da pós-graduação: Galera da Profª. Geanne, Claudênio,
Natália, Talita, Delvane, Natacha e todos os outros que não lembrei aqui.
Aos funcionários e amigos do laboratório Vilani, Lena e Arnaldo , sempre presente
e dispostos a ajudar.
Às secretarias e amigas Aura , Márcia e Célia, pela fundamental ajuda em diversos
problemas que nesses quatro anos foram aparecendo.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e farmacologia: Alana, Fernando,
Haroldo e Seu Adauto.
À CAPES (PROEX) e CNPq pelo apoio financeiro importantíssimo no
desenvolvimento deste trabalho.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho
Muito obrigado!
RESUMO
Esse trabalho, até onde se sabe, mostra pela primeira vez o efeito antinociceptivo
do acetato de citronelila (CAT) e teve como objetivo caracterizar o perfil do efeito e identificar
possíveis mecanismos antinociceptivos do CAT, em modelos de nocicepção aguda em
camundongos. O CAT foi testado em modelos animais padronizados de dor utilizando
camundongos Swiss (24-32g). O CAT foi administrado nas doses de 25, 50, 75, 100 ou 200
mg/kg, por via oral. Foram utilizados os testes de contorções abdominais induzidas por ácido
acético; placa quente; teste da formalina; nocicepção mecânica, hipernocicepção inflamatória
induzida pela carragenina; teste da nocicepção induzida por capsaicina, cinamaldeído, mentol,
salina ácida, PMA, 8-Br-cAMP, bradicinina ou glutamato, bem como em modelos
comportamentais (testes do campo aberto e rota Rod) que permitiram excluir a possibilidade de
uma atividade relaxante muscular ou induzir resultados falso-positivos nos modelos anteriores.
Os resultados mostraram que o CAT possui efeito antinociceptivo no modelo de nocicepção
visceral induzida por ácido acético (nas doses de 100 ou 200 mg/kg, com DE50 de 74,42 mg/kg),
esse efeito foi verificado após 30 minutos da aplicação e persistiu por até 240 minutos (200
mg/kg). O pré-tratamento com o CAT mostrou efeito antinociceptivo no modelo de lambedura
induzida pela aplicação intraplantar de formalina e no modelo de nocicepção térmica (placa
quente). O CAT mostrou diminuição da sensibilidade mecânica utilizando o filamento de von
Frey. Na investigação do mecanismo antinociceptivo, o CAT mostrou efeito relacionado com
os canais K+ATP, TRPV1, TRPM8, ASIC, receptores glutamatérgicos, receptores de bradicinina,
PKA e PKC. Na investigação das vias de neurotransmissão envolvidas no efeito antinociceptivo
do CAT, podemos sugerir o envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos, sistema
serotonérgico (receptores 5-HT1A, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos. Com
os resultados mostrados, podemos concluir que o CAT possui efeito antinociceptivo em
camundongos, e como possíveis mecanismos a modulação de mediadores intracelulares PKA
e/ou PKC, relacionados com os mecanismos moleculares dos canais K+ATP, TRPV1, TRPM8,
ASIC, receptores glutamatérgico, receptores de bradicinina, receptores α2-adrenérgico, sistema
serotonérgico (receptores 5-HT1, 5-HT2A/C), receptores muscarínicos e dopaminérgicos.
Palavras-chave: Acetato de Citronelila, Nocicepção, hipernocicepção inflamatória, PKC e
PKA.
ABSTRACT
This work shows for the first time the antinociceptive effect of the CAT and aimed
to characterize the profile of effect and identify possible antinociceptive mechanisms of the cat,
in models of acute nociception in mice. The CAT was testeed standardized animal models of
pain using mice Swiss (24-32g). The CAT was administered at doses of 25, 50, 75, 100 or 200
mg/kg, by gavage. Was used in the tests of abdominal writhings by acetic acid; hot plate;
formalin test; mechanic nociception; inflamatory hipernociception induced by carrageennan;
Nociception test induced by capsaicin, cinnamaldeide, menthol, acid saline, PMA, 8-Br-cAMP,
bradykinin or glutamate, as well as in behavioural models (open field and rota rod tests) that
allowed to exclude the possibility of a muscle relaxant action or to induce false-positive result
in the earlier models. The results showed that the CAT have antinociceptive effect in the
visceral nociception model induced by acetic acid (in the 100 or 200 mg/kg doses, with ED50
of 74.42 mg/kg), this effect was verified after 30 minutes of aplication and continued until 240
minutes (200 mg/kg). Pretreatment with CAT showed antinociceptive effect in licking model
induced by intraplantar formalin application and in the thermal nociception model (hot plate).
CAT showed the decreasing of mechanical sencibility using the von Frey hair. In the
antinociceptive mechanism investigation, CAT showed effect related with K+ATP channels,
TRPV1, TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, PKA and PKC. IN the
investigation of neurotramitters pathways involved in antinociceptive effect of CAT, we can
suggest the involvement of serotonergics system (5-HT1A, 5-HT2A/C receptors) and muscarinic,
dopaminergic and α2-adrenergics receptors. With the results showed, we can conclude the CAT
have antinociceptive effect in mice, and as possible mechanism the modulation of intracellular
mediators PKC and/or PKA, relacted with moleculars mechanisms of K+ATP channels, TRPV1,
TRPM8, ASIC, glutamatergics receptors, bradykinin receptors, serotonergics system (5-HT1,
5-HT2A/C receptors) and muscarinic, dopaminergic and α2-adrenergics receptors.
Keywords: Citronellyl acetate, Nociception, inflammatory hypernociception, PKC e PKA.
FIGURAS
1 Percepções sensitivas.......................................................................................... 23
2 Corno dorsal da medula no qual ocorre a primeira sinapse da via nociceptiva.. 25
3 Esquema ilustrando os neurônios envolvidos na teoria do “Portão”.................. 27
4 Principais vias ascendentes antero-laterais de transmissão da dor...................... 28
5 Vias ascendentes dorso-laterais de transmissão da dor. ..................................... 29
6 Vias descendentes analgésicas que regulam a atividade dos neurônios de transmissão nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal............................. 30
7 Estrutura química plana do acetato de citronelila............................................... 33
8 Efeito do CAT no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. ................................................................................................................ 49
9 Efeito do CAT no teste da placa quente.............................................................. 51
10 Efeito do CAT no teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção inflamatória.............................................................................. 52
11 Envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético........... 53
12 Envolvimento do sistema serotonérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 54
13 Quantificação de serotonina e seu metabólito no fluido peritoneal após modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 55
14 Envolvimento dos receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3) no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.................................................................................
56
15 Envolvimento do sistema colinérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 57
16 Envolvimento do sistema dopaminérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.................... 58
17 Envolvimento do sistema opióide no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.......................... 59
18 Envolvimento do sistema oxidonitrérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.................... 60
19 Envolvimento do sistema glutamatérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por glutamato.................................. 61
20 Envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético........................................................................................................ 62
21 Envolvimento dos TRPV1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por capsaicina........................................................ 63
22 Envolvimento dos TRPA1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por cinamaldeído................................................... 64
23 Envolvimento dos TRPM8 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por mentol.............................................................. 65
24 Envolvimento dos ASIC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por salina acidificada.............................................. 66
25 Envolvimento do PKA no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por PMA................................................................. 67
26 Envolvimento do PKC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por 8-Bromo-cAMP............................................... 68
27 Envolvimento da bradicinina no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida................................................................................ 69
28 Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do rota rod........... 70
29 Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do campo aberto. 71
30 Ilustração mostrando os possíveis canais e receptores, com alguns de seus segundos mensageiros, envolvidos, e discutidos até o momento, no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila.......................................... 87
LISTA DE TABELAS
1 Substâncias usadas no trablaho..................................................................... 36
2 Efeitos do CAT no modelo de lambedura da pata induzida por formalina... 50
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 18
1.1 Fisiopatologia da dor ................................................................................................................... 19
1.1.1 Estruturas de transdução da nocicepção (Nociceptores) ...................................................... 20
1.1.2 Neurobiologia da nocicepção ............................................................................................... 23
1.1.3 Modulação endógena da dor ................................................................................................ 30
1.2 Modelos animais de nocicepção e dor ........................................................................................ 32
1.3 Acetato de Citronelila.................................................................................................................. 33
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA .................................................................................... 35
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 36
3.1. Objetivo Geral ............................................................................................................................ 36
3.2. Objetivos específicos.................................................................................................................. 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 37
4.1 Animais ....................................................................................................................................... 37
4.2 Princípios éticos .......................................................................................................................... 37
4.3. Drogas e substâncias utilizadas .................................................................................................. 37
4.4. Atividade antinociceptiva ........................................................................................................... 39
4.4.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ............................................ 39
4.4.2. Teste da formalina ............................................................................................................... 40
4.4.3. Teste da placa quente .......................................................................................................... 40
4.4.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey) ........................................................................ 40
4.4.5 Hipernocicepção inflamatória .............................................................................................. 41
4.5. Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do CAT ................................................... 41
4.5.1. α2-adrenérgico ..................................................................................................................... 41
4.5.2 Serotonégico ......................................................................................................................... 42
4.5.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritônio .................................................................................................................................... 42
4.5.2.2 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2 e 5-HT3) ......................... 43
4.5.3. Colinérgico .......................................................................................................................... 43
4.5.4. Dopaminérgico .................................................................................................................... 43
4.5.5 Opióide ................................................................................................................................. 44
4.5.7 Oxidonitrérgico .................................................................................................................... 44
4.5.8 Glutamatérgico ..................................................................................................................... 44
4.6. Canais e mediadores envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT .......................................... 45
4.6.1 Canais de potássio dependentes de ATP .............................................................................. 45
4.6.2 TRPV1 .................................................................................................................................. 45
4.6.3 TRPA1 .................................................................................................................................. 45
4.6.4 TRPM8 ................................................................................................................................. 46
4.6.5 ASICs ................................................................................................................................... 46
4.6.6 PKC ...................................................................................................................................... 46
4.6.7 PKA ...................................................................................................................................... 46
4.6.8 Bradicinina ........................................................................................................................... 47
4.7 Avaliação da Atividade Locomotora ........................................................................................... 47
4.7.1 Teste do Rota rod ................................................................................................................. 47
4.7.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto) .................................................. 47
4.7 Análises estatísticas ..................................................................................................................... 48
5 RESULTADOS ..................................................................................................................... 49
5.1 Atividade antinociceptiva ............................................................................................................ 49
5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ........................................... 49
5.1.2. Teste da formalina ............................................................................................................... 51
5.1.3. Teste da placa quente .......................................................................................................... 52
5.1.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção mecânica .......................... 53
5.2 Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila ........................... 54
5.2.1. α2-adrenérgico ..................................................................................................................... 54
5.2.2. Serotonérgico ...................................................................................................................... 55
5.2.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritôneo .................................................................................................................................... 56
5.2.2.2. Receptores serotonérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3) ............................................... 57
5.2.3. Colinérgico .......................................................................................................................... 58
5.2.4. Dopaminérgico .................................................................................................................... 59
5.2.5. Opióide ................................................................................................................................ 60
5.2.6. Oxidonitrérgico ................................................................................................................... 61
5.2.7 Receptores glutamatérgicos .................................................................................................. 62
5.3 Canais envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT ................................................................. 63
5.3.1 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP .................................................... 63
5.3.2 Receptores TRPV1 ............................................................................................................... 64
5.3.3 Receptores TRPA1 ............................................................................................................... 65
5.3.4 Receptores TRPM8 .............................................................................................................. 66
5.3.5 ASICs ................................................................................................................................... 67
5.3.6 PKA ...................................................................................................................................... 68
5.3.7 PKC ...................................................................................................................................... 69
5.3.8 Bradicinina ........................................................................................................................... 70
5.4 Avaliação da atividade locomotora ............................................................................................. 71
5.4.1 Teste do rota-rod .................................................................................................................. 71
5.4.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto) .................................................. 72
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 73
7 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 99
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 100
ANEXO A – DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DESTE PROJETO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL - UFC ................................................. 113
ANEXO B – TRABALHO PUBLICADO EM PERIÓDICO COM ALGUNS RESULTADOS DESTA TESE ......................................................................................................................... 114
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
5-HT 5-hidroxitriptamina (serotonina)
ALE Atividade locomotora espontânea
ANOVA Análise de variância
ATP Adenosina trifosfato
ASICs Canais iônicos sensíveis ao ácido
ASIC 1 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 1
ASIC 4 Canais iônicos sensíveis ao ácido tipo 4
BK Bradicinina
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX Ciclooxigenase
DZP Diazepam
E.P.M. Erro Padrão da Média
GDNF Células gliais derivadas de fator neurotrófico
Il Interleucina
i.p. Intraperitonial
NGF Fator de crescimento neural
NK1 Neuroquinina 1
NMDA N-metil D-Aspartato
NMR Núcleo magno da rafe
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintase
P Nível de significância
P2X3 Receptor purinérgico 3
PAG Substância cinzenta periaquedutal
pCPA p-clorofenilalanina
PGs Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandina tipo E2
PGF2 Prostaglandina tipo F2
PKC Proteína quinase C
RPM Rotações por minuto
s.c. Subcutâneo
SP Substância P
SMT Trato espinomesencefálico
SNC Sistema nervoso central
SRT Trato espinoreticular
STT Trato espinotalâmico
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TRKA Receptor de Tirosina Quinase tipo A
TRPA Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina
TRPA 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Anquirina 1
TRPC Receptor de Potencial Transitório do tipo Canônico
TRPM Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina
TRPM 8 Receptor de Potencial Transitório do tipo Melastatina 8
TRPML Receptor de Potencial Transitório do tipo Mucolipina
TRPP Receptor de Potencial Transitório do tipo Policistina
TRPV Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide
TRPV 1 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 1
TRPV 2 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 2
TRPV 3 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 3
TRPV 4 Receptor de Potencial Transitório do tipo Vanilóide 4
VLF Funículo ventrolateral
v.o. Via oral
VR1 Receptor do tipo vanilóide 1
Vs. Versus
18
1. INTRODUÇÃO
A dor foi conceituada pela primeira vez em 1986, pela Associação Internacional
para o Estudo da Dor (IASP), como uma experiência sensorial e emocional desagradável que
está associada a lesões reais ou potenciais. Em 1994 os membros e colaboradores desta
associação reformularam esta definição para “uma experiência sensorial e emocional
desagradável associada a dano tecidual real ou potencial ou descrita em termos de tal dano”
(IASP, 1994). Em 2012, os membros desta associação mantiveram esta última como conceito
atual de dor. Em nota a IASP contempla também aspectos gerais mais íntimos à dor:
“A incapacidade de se comunicar verbalmente não nega a possibilidade de que um indivíduo está sentindo dor e está na necessidade de tratamento de alívio da dor adequado. A dor é sempre subjetiva. Cada indivíduo aprende a aplicação da palavra através de experiências relacionadas com a lesão no início da vida. Biólogos reconhecem que os estímulos que causam dor são susceptíveis a dano tecidual. Assim, a dor é aquela experiência que associamos com lesão tecidual real ou potencial. É, sem dúvida, uma sensação em uma parte ou partes do corpo, mas também é sempre desagradável e, portanto, também uma experiência emocional. Experiências que se assemelham a dor, mas não são desagradáveis, formigamento, por exemplo, não deve ser chamado de dor. Desagradáveis experiências anormais (disestesia) podem também ser dor, mas não são necessariamente assim porque, subjetivamente, eles podem não ter as qualidades habituais sensoriais da dor. Muitas pessoas relatam dor na ausência de danos nos tecidos ou qualquer outra causa fisiopatológico; geralmente isto acontece por razões psicológicas. Normalmente não há maneira de distinguir a uma experiência, devido à lesão tecidual, se tomarmos o relato subjetivo. Se eles consideram a sua experiência como dor, e se eles relatam que da mesma forma como a dor causada por lesão tecidual, ela deve ser aceita como dor. Esta definição evita a dor como subordinação ao estímulo. Atividade induzida nas vias nociceptoras por um estímulo nocivo não é dor, que é sempre um estado psicológico, apesar de bem podermos apreciar que a dor na maioria das vezes tem uma causa próxima física.”
Fonte: http://www.iasp-pain.org/Content/NavigationMenu/GeneralResourceLinks/PainDefinitions/default.htm
A dor aguda ou fisiológica é um alerta fundamental para a preservação da
integridade dos tecidos em animais, evitando ou diminuindo a extensão da ocorrência de lesões,
a dor crônica não tem este valor biológico e é uma importante causa de incapacidade física
(TEIXEIRA, 1990). A dor visceral e a dor somática profunda são causadas por estímulos
inevitáveis e apresentam respostas adaptativas específicas, geralmente são subagudas e podem
19
vir acompanhadas de respostas autonômicas ou comportamentais específicas (KLAUMANN,
et al., 2008).
O excesso de estímulos nociceptivos, a diminuição do limiar de disparo sensitivo ou
a hipoatividade do sistema supressor podem gerar dor. Nas condições normais, o estímulo
sensorial é captado pelas estruturas do Sistema Nervoso Periférico (SNP) e transmitida para o
Sistema Nervoso Central (SNC), onde é decodificada e interpretada. Mecanismos modulatórios
sensibilizam ou suprimem a nocicepção em todas as etapas em que ela é processada.
O termo nocicepção está relacionado com o reconhecimento de sinais dolorosos pelo
sistema nervoso, que interpretam informações relacionadas à lesão. Baseado nestes conceitos,
o termo dor seria melhor aplicado a seres humanos do que aos animais, pelo fato deste termo
envolver um componente emocional. Mesmo assim tornou-se uma convenção o uso do termo
“dor” para pacientes humanos e animais (HELLEBREKERS, 2002).
1.1 Fisiopatologia da dor
Nocicepção consiste nos processos de transdução, transmissão e modulação de
sinais neurais gerados em resposta a um estímulo nocivo externo. De forma simplificada, pode
ser considerado como uma cadeia de três etapas, com o neurônio de primeira ordem originado
na periferia (transdução) e projetando-se para a medula espinhal, o neurônio de segunda ordem
ascende pela medula espinhal (transmissão) e o neurônio de terceira ordem projeta-se para o
córtex cerebral (modulação) (MESSLINGER, 1997; TRANQUILLI, 2004).
Descrevendo melhor, a nocicepção é o processo de percepção de estímulos nocivos
diversos (térmicos, mecânicos ou químicos). Estes estímulos são detectados por uma
subpopulação de fibras nervosas periféricas, chamadas nociceptores (BASBAUM et al., 2009).
Os nociceptores são extremamente heterogêneos diferindo quanto aos tipos de
neurotransmissores que contêm, receptores e canais iônicos que expressam, velocidade de
condução, propriedades de resposta ao estímulo nocivo e sua capacidade de serem
sensibilizados durante a inflamação, lesão e/ou doenças (STUCKY, GOLD, ZHANG, 2001).
20
Apesar das limitações dos trabalhos laboratoriais, evidenciaram-se, em condições
agudas, a participação de grande número de centros, vias nervosas e neurotransmissores nos
mecanismos centrais e periféricos relacionados com o processamento da nocicepção.
Há uma considerável integração entre os tecidos periféricos e o SNC no
processamento da dor. À medida que ascende no neuroeixo, por um estímulo capaz de deflagrar
um potencial de ação, a redundância anatômica das vias sensitivas aumenta de modo
significativo e a especificidade reduz-se (TEIXEIRA, 1999). A ação dos neurotransmissores
excitatórios liberados na medula espinal pelos aferentes primários nociceptivos sofre influência
de sistemas neuronais excitatórios e inibitórios em várias regiões do sistema nervoso. É
provável que, dependendo da modulação do impulso na medula espinhal, a informação
nociceptiva seja ou não transferida pelos neurônios de segunda ordem para os centros rostrais
do neuroeixo. O encéfalo não é passivo às mensagens coletadas no meio exterior e interior.
Sistemas neuronais supra-espinhais permitem ao organismo utilizar a experiência passada para
controlar a sensibilidade nas várias estruturas do neuroeixo e reagir de modo variado e
autodeterminado (BRUSCATTO, 2006).
Mas para que tudo isso ocorra, primeiro é preciso haver a transdução do estímulo
nociceptivo em potencial de ação. Para isso existem estruturas especializadas descritas abaixo.
1.1.1 Estruturas de transdução da nocicepção (Nociceptores)
Muitas estruturas de transdução da nocicepção foram identificadas nas últimas
décadas. Hoje se sabe que existem quatro classes de nociceptores: mecânicos, térmicos,
polimodais e silenciosos.
Os nociceptores mecânicos respondem a pressão intensa enquanto os térmicos
respondem às temperaturas extremas, quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C). Os nociceptores
polimodais respondem aos estímulos nocivos mecânicos, térmicos ou químicos e os silenciosos
são ativados por estímulos químicos, mecânicos, térmicos e mediadores inflamatórios somente
depois de serem ativados (JULIUS E BASBAUM, 2001).
O principal grupo de detectores de estímulos nocivos é a família dos receptores de
potencial transitório (TRP) (Baggio, 2010). Esses receptores participam na geração de
21
sensações dolorosas evocadas por estímulos químicos, térmicos e mecânicos (LEVINE,
ALESSANDRI-HABER, 2007). São receptores polimodais acoplados a canais iônicos
permeáveis a cátions.
Baseando-se na homologia, foram identificados numerosos membros da família do
TRP, nos vertebrados. Em mamíferos, os membros dessa família foram classificados em seis
subfamílias:
a) TRPC (canônico)
b) TRPV (vaniloide)
c) TRPA (anquirina)
d) TRPM (melastatina)
e) TRPP (policistina)
f) TRPML (mucolipina)
O receptor de potencial transitório vanilóide 1 (TRPV1), originalmente chamado de
receptor vanilóide 1 (VR1) e comumente referido como receptor da capsaicina, foi o primeiro
descrito como receptor polimodal ativado por três estímulos dolorosos; compostos vanilóides
(capsaicina, resiniferatoxina), calor nocivo (>43°C) e pH baixo (<5,9) (CATERINA et al.,
1997; TOMINAGA et al., 1998). Após a identificação do canal TRPV1 em nociceptores, uma
variedade de outros tipos de células, incluindo: os queratinócitos, as células β pancreáticas, as
células endoteliais, os linfócitos, os macrófagos e as células de diferentes regiões do cérebro,
também expressam o TRPV1. Sua presença, em todos esses tipos de células e em diferentes
partes do corpo, sugere que o TRPV1 é estimulado normalmente por um ligante endógeno –
um endovaniloide – e não apenas por estimulação térmica (FEIN, 2011).
Outro membro importante da grande família TRP que foi abordado neste estudo é o
TRPA1. De expressão heteróloga e ativados por compostos irritantes, como sementes de
mostarda, raiz-forte, canela, alho e gás lacrimogêneo, os quais despertam a sensação dolorosa
em queimação ou em picada. Interessantemente, os camundongos nocautes para NaV1.8 também
exibiram uma significativa redução na expressão para TRPA1 em neurônios do gânglio da raiz
dorsal (GRD) e a falta de uma resposta nociceptiva mediada ao TRPA1 para o teste da
formalina. O papel do TRPA1 como sensor de frio nocivo se mostrou controverso, porém são
22
ativados a temperaturas próximas de 17 °C, o que está perto do limiar ao frio nocivo de 15 °C
para seres humanos. Em contraste ao debate sobre o papel do canal de cátion do TRPA1 como
um sensor de frio nocivo, o papel na excitação do nociceptor evocado pela bradicinina (BK) e
hipersensibilidade à dor, não ficou controverso. As injeções de BK em camundongos nocautes
para TRPA1 foram muito menos dolorosas, que mostraram pouca ou nenhuma
hipersensibilidade térmica ou mecânica frente a esse mediador (JULIUS E BASBAUM, 2001).
O canal TRPM8 é ativado por agentes de esfriamento, como mentol ou temperaturas
abaixo de 26 °C. Os camundongos nocautes para TRPM8 ainda apresentam neurônios
sensibilizáveis, indicando que o TRPM8 não é o único receptor ativado pelo frio. A combinação
de nocautes para TRPA1 e TRPM8 pode ajudar a esclarecer a função relativa do TRPA1 e do
TRPM8 na detecção do frio (JULIUS E BASBAUM, 2001).
Outra família de canais importantes na transdução da nocicepção são os canais de
íons sensíveis ao ácido (ASICs). Eles são codificados por quatro genes, produzindo
subunidades designadas de ASIC1 a ASIC4, diversas variantes do ASIC também foram
descobertas. Os ASICs são trímeros de proteínas e podem ser compostos de diferentes
combinações de subunidades. Após a descoberta e clonagem, os ASICs tornaram-se os
principais candidatos a sensor de prótons extracelulares. Os ASICs são ativados por prótons
extracelulares e modulados pela PKC (KRISHTAL, PIDOPLICHKO, 1980; BARON et al.,
2002).
Ainda em relação aos receptores e canais envolvidos na nocicepção, foi
demonstrado que a glibenclamida – um hipoglicemiante oral – bloqueador dos canais de
potássio sensível ao ATP [K+ATP], antagoniza a analgesia induzida por morfina em
camundongos, sugerindo que a morfina atuaria ativando esses canais. Os canais K+ATP são
compostos por quatro subunidades regulatórias dos receptores para sulfonilureia e quatro poros
sensíveis ao ATP que geram as correntes de retificação internas do potássio. Os canais K+ATP
atuam como sensores metabólicos e quando os níveis do ATP intracelular são elevados, os
canais se fecham.
Após essa etapa de transformação da energia física ou química (estímulo nóxico)
em neuroquímica (potencial de ação) diversas estruturas atuam como ponte no caminho desse
impulso gerado. Essas estruturas determinam a velocidade e o local onde esse impulso vai
chegar, existindo, então, diferentes interpretações e resposta para os diferentes estímulos.
23
1.1.2 Neurobiologia da nocicepção
Todos os sistemas sensoriais devem converter estímulos ambientais em sinais
eletroquímicos. No caso da visão ou olfato, neurônios sensoriais primários precisam apenas
detectar um tipo de estímulo (luz ou substância odoríferas) e usando mecanismos bioquímicos
redundantes e convergentes alcançam esse objetivo (Figura 1a). No entanto, a nocicepção é
única porque os neurônios sensoriais primários da “via da dor” têm a capacidade notável para
detectar uma grande variedade de estímulos, incluindo os de natureza física e química (Figura
1b).
Figura 1. Percepções
sensitivas. (a) Ilustra o
mecanismo bioquímico
redundante e convergente
para a percepção sensitiva
luminosa e olfativa. (b)
Ilustra os diversos
estímulos envolvidos na
percepção do nociceptor.
Fonte: Adaptado de
JULIUS E BASBAUM
(2001).
Em comparação com neurônios sensoriais dos outros sistemas, os nociceptores
devem, portanto, ser amplamente equipados com dispositivos de transdução. Ao mesmo tempo,
os estímulos muito diferentes de um produto químico (de capsaicina e ácidos) ou físicos (calor)
podem excitar nociceptores por ativação de um único receptor, permitindo que a célula integre
a informação e responda a alterações complexas no ambiente fisiológico.
Segundo Pisera (2005) o primeiro processo da nocicepção é a decodificação de
sensações mecânica, térmica ou química em impulsos elétricos por terminais nervosos
24
especializados denominados nociceptores. Os nociceptores são terminações nervosas livres dos
neurônios de primeira ordem, cuja função é preservar a integridade tecidual, assinalando uma
injúria potencial ou real. As fibras nervosas responsáveis pela condução do sinal nociceptivo
da periferia ao SNC podem ser classificadas como (JULIUS & BASBAUM, 2001):
a) Fibras Aβ: bastante mielinizada, constituindo a fibra de mais rápida condução
nervosa (30 – 100 m/s) dentre as envolvidas com o processo nociceptivo, diâmetro grande
(10μm). Detectam estímulos inócuos aplicados à pele, músculos e articulações.
b) Fibras Aδ: pouca mielinização, tendo por isso uma condução nervosa mais lenta que
as fibras Aδ (1,2 – 30 m/s). Apresentam diâmetro intermediário (2 – 6 μm) e são ativadas através
de nocicepção mecânica e térmica. Existem duas principais subclasses de nociceptores Aδ;
ambas respondem a estímulos mecânicos intensos, mas podem ser diferenciadas pelas suas
responsividades ao calor intenso (tipo I são ativadas a ~ 53 °C; e tipo II ativadas a ~ 43°C)
(JULIUS, BASBAUM, 2001).
c) Fibras C: não apresenta mielinização, sendo dos três tipos, a fibra de condução mais
lenta (0,5 – 2 m/s). Apresentam o menor diâmetro (0,4 – 1,2 mm) e são ativadas por vários tipos
de estímulos (mecânica, térmica e química).
Na ausência de dano tecidual ou nervoso as fibras Aβ somente transmitem
informação referente a estímulos inócuos, como tato, vibração e pressão. Normalmente, a
informação nociceptiva é transmitida por fibras do tipo C e Aδ localizadas na pele, vísceras,
vasos sanguíneos, peritônio, pleura, periósteo, tendão, fáscia, cápsula articular e fibras do
músculo esquelético; sua distribuição depende da localização anatômica, podendo aparecer a
cada 2 a 10 mm² de área corporal (MESSLINGER, 1997; LAMONT e TRANQUILLI, 2000;
MUIR III et al., 2001). As fibras Aδ são responsáveis pela primeira fase da dor, rápida e forte,
do tipo picada ou ferroada e são sensíveis a estímulos mecânicos intensos (mecanorreceptores
de alto limiar). As fibras C produzem uma segunda fase de dor mais difusa e persistente e
apresentam, na periferia, receptores de alto limiar para estímulos térmicos e/ou mecânicos. As
fibras C polimodais respondem a estímulos mecânicos, térmicos e químicos. Os campos
receptivos destes neurônios oscilam entre 2 e 10 mm² de área corporal (TRANQUILLI, 2004;
PISERA, 2005; KLAUMANN, et al., 2008).
25
Todos os neurônios nociceptivos primários convergem e efetuam sinapses
excitatórias com neurônios de transmissão de segunda ordem situados no corno dorsal da
medula espinhal e no corno dorsal trigeminal bulbar. Os neurônios de segunda ordem podem
ser classificados em dois tipos fisiológicos: neurônio nociceptivo específico (NS), recebe
exclusivamente impulsos de aferentes nociceptivos primários dos tipos Aδ e C, respondendo
apenas a impulsos provenientes de estimulação somática e visceral de alta intensidade. O
segundo tipo, chamado de neurônio de ampla faixa dinâmica (WDR), pode efetuar sinapses
com os aferentes primários mecanorreceptivos de baixo limiar (fibras do tipo Aβ, relacionadas
com o tato) e com aferentes nociceptivos de alto limiar (fibras Aδ e C).
As fibras aferentes nociceptivas terminam na substância cinzenta da medula
espinhal, que possui estrutura morfofuncional heterogênea, sendo dividida em 12 lâminas e o
corno dorsal formado pelas seis primeiras.
Na lâmina marginal (lâmina I) existe uma alta proporção de neurônios nociceptivos
específicos (NS), enquanto os neurônios ampla faixa dinâmica (WDR) são encontrados
predominantemente na lâmina V, e se projetam ao tronco encefálico e certas regiões do tálamo.
A substância gelatinosa (lâmina II) é rica em interneurônios inibitórios e excitatórios que
possuem funções moduladoras na transmissão da informação nociceptiva (TRANQUILLI,
2004; PISERA, 2005; DREWES, 2006; KLAUMANN, et al., 2008). Tanto a lâmina I quanto a
II são ricamente inervadas por fibras Aδ e C. As lâminas III e IV possuem neurônios que se
conectam diretamente com as fibras Aβ e que respondem predominantemente a estímulos
inócuos. Os neurônios da lâmina VI estão conectados de forma monossináptica com aferentes
Aβ de músculos e articulações e respondem a estímulos inócuos. Outras lâminas, VII, VIII e
IX estão situadas no corno ventral da medula espinhal e abrigam neurônios com funções
principalmente motoras, enquanto que a lâmina X, situada ao redor do canal central, possui
neurônios envolvidos na transmissão nociceptiva. (PISERA, 2005; KLAUMANN, et al., 2008).
26
Figura 2. Corno dorsal da medula no qual ocorre a primeira sinapse da via nociceptiva. Fonte: MENESCAL-DE-
OLIVEIRA, 2008.
As fibras aferentes de primeira ordem formam conexões diretas ou indiretas com
uma das três populações de neurônios do corno dorsal da medula:
a) interneurônios excitatórios ou inibitórios;
b) neurônios proprioespinhais que estendem-se por múltiplos segmentos espinhais
e estão envolvidos com a atividade reflexa;
c) neurônios de projeção (WDR) que participam na transmissão rostral através da
medula espinhal até centros supraespinhais como o mesencéfalo e córtex.
Esses componentes são interativos e essenciais para o processamento da informação
nociceptiva, o que facilita a geração de uma resposta à dor apropriada e organizada (MILLAN,
1999; LAMONT e TRANQUILLI, 2000; DREWES, 2006; KLAUMANN, et al., 2008).
As principais vias ascendentes ântero-laterais de transmissão da dor têm origem nos
axônios dos neurônios de segunda ordem das lâminas I e V, principalmente, e ascendem pelo
27
funículo ântero-lateral para estruturas supra-espinhais. Este complexo sistema de vias diretas e
indiretas conduz a transmissão das informações nociceptivas para neurônios que se projetam
através de quatro vias ascendentes principais:
a) trato espinotalâmico: Têm origem nos neurônios de segunda ordem das lâminas
I e V que decussam dentro da medula espinhal e ascendem pelo funículo ântero-
lateral para estruturas supra-espinhais. Atualmente é dividido em Trato
Paleoespinotalâmico (medial), que transmitem a informação em baixa
velocidade (dor lenta), efetuando várias sinapses com estruturas bulbares e
mesencefálicas antes de alcançar estruturas talâmicas e daí projetar-se para o
córtex e insula, e Trato neoespinotalâmico (lateral), conduz a informação
nociceptiva em alta velocidade (dor rápida) e com poucas sinapses ao longo do
seu trajeto;
b) trato espinorreticular: Compreende axônios de neurônios das lâminas VII e
VIII que terminam na formação reticular (bulbar e pontina), para logo ascender
até o tálamo;
c) trato espinomesencefálico: É formado por axônios de neurônios de projeção das
lâminas I e IV que se projetam contralateralmente até a formação reticular
mesencefálica e a substância cinzenta periaquedutal até os núcleos
parabraquiais da formação reticular. Os neurônios parabraquiais projetam-se até
a amigdala, um dos principais componentes do sistema límbico, o que sugere
que o trato espinomesencefálico contribui com os componentes afetivos da dor;
d) trato espino-hipotalâmico: Compreende axônios principalmente provenientes
das lâminas I e V, que se projetam diretamente para núcleos do hipotálamo.
Essas conexões participam nas respostas neuroendócrinas e autonômicas
induzidas pela dor (LAMONT, TRANQUILLI, 2000; PISERA, 2005).
Existem outras vias de transmissão da dor que trafegam contralateralmente pelo
funículo dorsolateral da medula espinhal. São elas, trato espinoparabranquio-amigdalóide e
trato espinoparabranquio-hipotalâmico. Ambos originam-se nos neurônios nociceptivos
específicos da lâmina I, cujos axônios cruzam para o lado contralateral e ascendem pelo
funículo dorsolateral. Eles estão envolvidos nas respostas relativas ao componente afetivo-
28
motivacional da dor e na elaboração das respostas autonômicas e endócrinas que acompanham
o processo doloroso.
Teoria do “portão” de Paul Melzack e Patrick Wall
Essa teoria postula que colaterais de fibras Aβ, associadas à sensibilidade tátil, produzem, via interneurônios
inibitórios da lâmina II, um decréscimo na atividade dos neurônios de segunda ordem (lâmina V), que provoca a
diminuição da dor. Inversamente, quando a atividadedas fibras Aδ e C suplantam a das fibras Aβ, estes
interneurônios são inibidos, conseqüentemente há ativação dos neurônios de segunda ordem e, portanto, aumento
da dor. Assim, os interneurônios inibitórios localizados na substância gelatinosa atuam como um “portão”
modulando a informação nociceptiva. Uma aplicação para esta teoria é o ato de massagear uma área lesionada por
pancada, por exemplo, e assim reduzir a dor.
Figura 3. Esquema ilustrando os neurônios envolvidos na teoria do “Portão”. Interneurônio inibitório (Inb) e Substância gelatinosa (SB). Fonte: MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008.
29
Figura 4. Principais vias ascendentes antero-laterais de transmissão da dor. Funículo antero-lateral (FAL);
Substância cinzenta periaquedutal (SCP); Complexo ventral posteriordo tálamo (VPL/VPM); Córtex
somatossensorial primário (SI). Fonte: MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008.
As características fisiológicas e o destino das diferentes vias ascendentes de
transmissão da dor definem o processamento diferencial dos componentes e as respostas
relacionadas com a dor que incluem:
a) reflexo somático (medula espinhal);
b) resposta autonômica e neuroendócrina (conexões com núcleos parabraquial,
substância cinzenta periaquedutal e hipotálamo);
c) alerta (conexões espinorreticulares);
30
d) discriminação sensorial da intensidade, localização e qualidade associadas ao
estímulo evocado (conexões espinotalâmicas);
e) dimensões afetivo-motivacionais (conexões espinotalâmica, espino-
hipotalâmica, espinopontoamigdalóide, espinomesencefálica e suas subseqüentes
projeções mais rostrais).
Figura 5. Vias ascendentes dorso-laterais de transmissão da dor. Funículo dorso-lateral (FDL); Gânglio da raiz
dorsal (GRD); Núcleo parabraquial (NPB); Amígdala (AM); Hipotálamo (HT). Fonte: MENESCAL-DE-
OLIVEIRA, 2008.
1.1.3 Modulação endógena da dor
O sistema glutamatérgico, principalmente receptores NMDA (N-Metil-D-
Aspartato), distribuídos por toda extensão do sistema nervoso central, são muito importantes na
modulação da resposta nociceptiva. O sistema opióide também pode modular o sistema
31
glutamatérgico através dos receptores μ e δ, que podem inibir ou potencializar eventos
mediados pelos receptores NMDA, enquanto o receptor κ antagoniza a atividade mediada por
tais receptores (RIEDEL e NEECK, 2001).
Figura 6. Vias descendentes analgésicas que regulam a atividade dos neurônios de transmissão nociceptiva no corno dorsal da medula espinhal. Hipotálamo (HT); Amídala (AM); Substância cinzenta periaquedutal (SCP); Núcleo Magno da rafe (NMR); Fundículo dorso-lateral (FDL). Fonte: MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008.
Estruturas no tronco encefálico são muito importantes na modulação das
informações nociceptivas. Quando ativadas, enviam impulsos descendentes que inibem a
transmissão dos sinais de dor nos neurônios do corno dorsal da medula espinhal. As principais
estruturas envolvidas nesse sistema descendente inibitório são a substância cinzenta
32
periaquedutal (SCP), bulbo rostroventromedial (RVM), que inclui o núcleo magno da rafe
(NMR) e locus coeruleus (LC). A SCP, quando ativada, produz seu efeito por meio de projeções
excitatórias para o RVM ou o LC. Os axônios dos neurônios RVM têm projeção descendente,
via funículo dorsolateral, e terminam formando sinapses inibitórias com neurônios nociceptivos
de segunda ordem no corno dorsal da medula espinhal, causando uma inibição da informação
nociceptiva (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
As projeções provenientes do NMR liberam serotonina (5-HT) no corno dorsal da
medula espinhal, enquanto que as projeções provenientes do LC liberam noradrenalina, ambas
resultando em efeito analgésico endógeno. Existem evidências de que interneurônios
encefalinérgicos e GABAérgicos também participam na modulação nociceptiva, não tanto no
corno dorsal mas também em outros locais (MENESCAL-DE-OLIVEIRA, 2008).
Os conhecimentos dos processos envolvidos na dor são provenientes, em grande
parte, de estudos com animais. Diversos modelos de nocicepção são aplicados a diferentes
estruturas anatômicas dos animais e assim poder existir uma relação mais próxima da dor.
1.2 Modelos animais de nocicepção e dor
No campo da pesquisa em animais, a dor não pode ser medida diretamente e
dessa forma os efeitos da administração de drogas também não. Assim, os parâmetros
comportamentais utilizados para quantificar respostas a estímulos dolorosos em animais são
apenas indicativos e na realidade medem a resposta nociceptiva a um dado estímulo
(SCHOUENBORG, SJÖLUND, 1983; SANDKÜHLE, 2009).
Os modelos tradicionalmente utilizados para teste de substâncias com potencial
atividade antinociceptiva envolvem a observação comportamental de animais após a exposição
a um estímulo nóxico. O local da exposição e as propriedades químicas e físicas desses
estímulos geram modelos de estudo com características e aplicabilidades diferentes, e dessa
forma, fornecem possibilidades de estudo de vários ângulos do processo nociceptivo.
A literatura descreve vários modelos consagrados para a triagem de moléculas no
campo da dor, são exemplos: Teste de nocicepção visceral induzida por ácido acético, Teste da
nocicepção química induzida pela aplicação subcutânea de formalina na pata, teste de
33
nocicepção térmica (placa quente e retirada da cauda), teste de sensibilidade mecânica e
hipernocicepção inflamatória (teste do von Frey).
Hoje milhares de trabalhos são publicados anualmente utilizando alguns desses
métodos, destes, muitos investigam moléculas de origem natural quanto ao seus efeitos
antinociceptivos. Nosso grupo já contribuiu com algumas publicações nesse sentido com as
seguintes moléculas: Carvacrol (MELO et al, 2012), Bisabolol (ROCHA et al., 2011), Riparina
I (ARAÚJO et al., 2009), Riparina II (CARVALHO et al., 2013) e Acetato de Citronelila (RIOS
et al., 2013).
1.3 Acetato de Citronelila
Já foram identificadas mais de 730 espécies do gênero Eucalyptus, mas menos de
vinte espécies são exploradas comercialmente e clinicamente. Do ponto de vista da composição
química, qualitativa e quantitativamente, os óleos essenciais de Eucalyptus spp. são misturas
moderadamente complexas, e variam com as espécies. A estrutura gênica, tipo e idade da folha,
condições ambientais (clima, solo, luz, calor, umidade) e processo de extração, são variantes
fundamentais na composição dos óleos essenciais. Os constituintes mais importantes são os
álcoois, os aldeídos, os ésteres e os éteres. Dentre eles, destacam-se os álcoois porque
constituem uma das frações mais aromáticas, entre eles o citronelol. Brito et al, (2012)
mostraram que o citronelol é um efetivo analgésico em vários modelos de dor em animais,
atuando, provavelmente, via inibição de mediadores periféricos (como TNFα e síntese de NO)
bem como via mecanismo central (via receptores opióides).
Outro componente muito importante é o citronelal, um aldeído que, juntamente com
os álcoois, forma a fração mais perfumada das essências. Quintas-Junior et al., (2011)
mostraram que o citronelal possui propriedades antioxidantes e modulatórias na dor neuropática
e inflamatória em modelos de dor orofacial induzida por formalina através de mecanismos
envolvendo receptores opióides, TRPV1 e Glutamato.
O acetato de citronelila é um éster muito utilizado em perfumes e é conhecido pelo
agradável odor. Ele está presente, principalmente, no Eucalyptus citriodora, 1-3,8% no extrato
de folhas (BETTS, 2000) e 15,33% da fração oleosa do extrato das folhas (TIAN et al., 2005),
que Shen, et al., 2012 mostraram ser um potente agente antihepatoma devido a uma ação pró-
34
apoptótica em células HepG2 (hepatoma humano). Também a ele são atribuídas diversas outras
atividades biológicas, como: fungicida (RAMEZANI, 2006), larvicida (SINGH, et al., 2007),
bactericida (MULYANINGSIH, et al., 2011) e repelente/inseticida (PHASOMKUSOLSIL;
SOONWERA, 2011).
O acetato de citronelila também está presente, dessa vez em quantidade menos
significativas, no extrato volátil de pericarpo de frutos de Zanthoxylum schinifolium que Paik,
et al., 2005, demonstraram induzir apoptose em células HepG2 caspase-3 independente e que
também inibiu o crescimento do tumor Huh-7 (células de hepatoma humano) em camundongos.
Fang, et al., 1989 já tinham demonstrado uma atividade antitumoral para o acetato de citronelila.
Ham, et al., 2011, mostraram o potencial efeito acaricida do acetato de citronelila contra T.
urticae resistente a acaricidas.
Figura 7. Estruturas químicas plana e espacial do acetato de citronelila.
Fonte: http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
Até o presente momento não existem publicações de outros grupos de pesquisa que
relacionem o acetato de citronelila com atividade antinociceptiva ou, mesmo, anti-inflamatória.
35
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A dor constitui a principal causa de perda de trabalho, como também gera conseqüências
nocivas psicossociais e econômicas. Como consequência de tal processo, 50 a 60% dos que
sofrem qualquer tipo de dor ficam parcialmente ou totalmente incapacitados para exercer suas
atividades, de maneira transitória ou permanente, contribuindo negativamente para sua
qualidade de vida (SBED, 2005).
O manejo da dor é um aspecto essencial da medicina moderna e para a qualidade de
vida. No entanto as terapias atuais são frequentemente insuficientes devido a severos efeitos
indesejados ou eficácia limitada. Por essa razão, que o desenvolvimento de novas terapias para
o tratamento da dor é necessária, especialmente para tratar o grande número de pacientes que
não respondem aos analgésicos disponíveis (BRENNAN; CARR; COUSINS, 2005).
Então, tendo o conhecimento prévio que o acetato de citronelila possui algumas
atividades biológicas e que moléculas quimicamente semelhantes (citronelol e citronelal),
efeitos citados anteriormente, apresentaram uma boa atividade antinociceptiva em animais,
decidiu-se investigar a existência desse efeito com o acetato de citronelila em nossos
camundongos.
36
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Caracterizar o perfil do efeito e identificar possíveis mecanismos antinociceptivos do
CAT, em modelos de nocicepção aguda em camundongos.
3.2. Objetivos específicos
1) Mostrar o perfil do efeito antinociceptivo (início e duração do efeito) do CAT no modelo
animal de contorções abdominais induzidas por ácido acético;
2) Verificar o efeito antinociceptivo nos modelos da formalina, placa quente, hipernocicepção
inflamatória e sensibilidade mecânica em camundongos;
3) Pesquisar o envolvimento de receptores de potencial transitório (TRPV1, TRPM8 e TRP
A1), canais de potássio dependentes de ATP (K+ATP), Canais iônicos sensíveis a ácido
(ASIC), receptores de bradicinina, assim como, PKC e PKA, no efeito antinociceptivo do
CAT em modelos de nocicepção aguda;
4) Investigar o envolvimento dos sistemas serotonérgico, muscarínico, dopaminérgico, α-
adrenérgico, glutamatérgico, oxidonitrérgico e opióide no mecanismo de ação
antinociceptiva do CAT;
5) Avaliar os efeitos do CAT sobre a atividade motora e comportamental dos camundongos;
37
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss, machos
adultos, pesando entre 25-32 g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia e do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, mantidos em caixas de
propileno a 26 ± 2ºC, com ciclos claro/escuro de 12/12 horas, recebendo ração padrão (Purina
Chow) e água “ad libitum”. Os animais foram colocados em jejum de sólidos por 4 horas antes
da realização de cada experimento em que a via oral foi utilizada para a absorção do fármaco
(RIOS, et al., 2010; ROCHA, et al., 2011; MELO, et al., 2012).
4.2 Princípios éticos
Os experimentos foram realizados após a aprovação do projeto (Nº de protocolo:
31/2012, ANEXO A) pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal do
Ceará e foram realizadas em conformidade com as diretrizes atuais para o cuidado de animais
de laboratório e as normas éticas para investigações de dor experimental em animais
conscientes. (ZIMMERMANN, 1983)
4.3. Drogas e substâncias utilizadas
TABELA 1. Substâncias usadas no estudo.
Substância Origem Doses (mg/kg) Via
8-Br-cAMP Sigma-Aldrich® 10 nmol/pata i.pl.
Acetato de Citronelila Sigma-Aldrich® 25, 50, 75, 100,
200, 400, 2000 v.o.
38
Ácido acético Sigma-Aldrich® 0,6 % i.p.
Atropina Sigma-Aldrich® 1 i.p.
Bradicinina Sigma-Aldrich® 10 µg/pata i.pl.
Cânfora Sigma-Aldrich® 7,6 s.c.
Capsaicina Sigma-Aldrich® 2.2 μg/pata i.pl.
Capsazepina Sigma-Aldrich® 5 i.p.
Captopril Teuto® 5 i.p.
Carboximetilcelulose Vetec® 0,5 % (veículo) v.o.
Carragenina Sigma-Aldrich® 0,11 mg/kg i.pl.
Cinamaldeído Sigma-Aldrich® 10 nMol/pata i.pl.
Diazóxido Sigma-Aldrich® 3 i.p.
Formalina Vetec® 1 % i.pl.
Glibenclamida Sigma-Aldrich® 2 i.p.
Glutamato Sigma-Aldrich® 10 μMol/pata i.pl.
Haloperidol Sigma-Aldrich® 0.2 i.p.
Indometacina Sigma-Aldrich® 10 v.o.
L-arginina Sigma-Aldrich® 150 i.p.
L-NAME Sigma-Aldrich® 10 i.p.
Mentol Sigma-Aldrich® 1,2 μMol/pata i.pl.
MK-801 Sigma-Aldrich® 3 i.p.
Morfina Cristália® 7,5 e 5 i.p.
Naloxona Cristália® 1 i.p.
39
Nan-190 Sigma-Aldrich® 0.5 i.p.
Ondasentrona GlaxoSmithKline® 0,5 i.p.
pCPA Sigma-Aldrich® 4x100 i.p.
PMA Sigma-Aldrich® 500 pmol/pata i.pl.
Ritanserina Sigma-Aldrich® 1 i.p.
Tween 80 Sigma-Aldrich® 2 % (Veículo) v.o.
Vermelho de Rutênio Sigma-Aldrich® 3 i.p.
Ioimbina Sigma-Aldrich® 2,5 i.p.
4.4. Atividade antinociceptiva
4.4.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Os animais foram divididos em grupos de 8 animais cada, tratados com veículo (2%
Tween 80 em água destilada), Acetato de Citronelila (CAT - 25, 50, 75, 100 ou 200 mg/kg) ou
Indometacina (5 mg/kg), usada como droga analgésica padrão. Os tratamentos foram realizados
por via oral (v.o.). Após 60 minutos, os animais receberam uma injeção intraperitonial (i.p.) de
ácido acético 0,6% (10 mL/Kg). Decorridos 10 minutos da administração do ácido acético, o
número de contorções abdominais foi registrado durante 20 minutos, para cada animal. Uma
contorção foi identificada como uma extensão das patas traseiras, acompanhada de contração
do abdômen (KOSTER et al., 1959).
Foi realizado o curso de tempo do efeito antinociceptivo do CAT (200 mg/kg). Em
5 grupos de animais (n=8) foram induzidas contorções abdominais com ácido acético, conforme
descrito acima, após 30, 60, 120, 240 e 360 minutos da aplicação do CAT.
A curva dose x resposta foi construída com os dados acima e a DE50 estimada.
40
4.4.2. Teste da formalina
Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo), e tratados com
veículo (2% Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 ou 200 mg/kg; v.o.) ou
morfina (7,5 mg/kg; i.p.), que foi usada como droga padrão. Após 30 ou 60 minutos em relação
a estes tratamentos, os animais receberam uma injeção intraplantar de formalina 1% na pata
direita traseira (20 µL). O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, durante
duas fases: a primeira 0-5 min (logo após a aplicação), dando um intervalo na observação, e 20-
25 min (2a Fase) após a administração da formalina (HUNSKAAR, HOLE, 1987).
4.4.3. Teste da placa quente
Esse teste foi realizada duas vezes, tendo como a temperatura da placa o diferencial,
esta variando entre 51 ± 0,5ºC ou 55 ± 0,5ºC. Os animais foram divididos em 8 grupos (8
animais por grupo), sendo pré-selecionados pela passagem individual na placa quente mantida
nas duas temperaturas, de modo isolada 4 grupos para cada temperatura. Aqueles que
mostrarem tempo de reação superior a 35 (51ºC) ou 30 (55ºC) segundos, respectivamente, não
serão utilizados no experimento. O tempo de reação será registrado antes (tempo 0) e 30, 60,
90 e 120 minutos após a administração de acetato de citronelila (100 e 200 mg/Kg, v.o.),
morfina (7,5 mg/Kg; i.p.) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada, v.o.) (EDDY &
LEIMBACH, 1953).
4.4.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey)
Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e pré-tratados com
veículo (2% Tween 80 em água destilada), CAT (100 ou 200 mg/kg) ou morfina (7,5 mg/kg;
i.p.). As respostas comportamentais para o estímulo mecânico foram realizadas com o auxílio
do filamento de vonFrey (diâmetro de 0,8 mm) e foi feita antes (tempo 0) e 30 e 60 minutos
após o pré-tratamento. Os camundongos foram colocados em uma caixa elevada com uma trama
41
de arame no assoalho. Os filamentos de von Frey foram aplicados embaixo da superfície plantar
da pata direita traseira (em triplicata com menos de 1 minuto de intervalo) em ordem ascendente
de estímulo de força até um valor máximo de 50 g (para evitar lesão na pata). No limiar, o
camundongo retira a pata do filamento (FERREIRA et al 1978a, 1978b; 1988; CUNHA et al.,
1992).
4.4.5 Hipernocicepção inflamatória
Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e pré-tratados com
veículo (2% Tween 80 em água destilada), CAT (100 ou 200 mg/kg) ou indometacina (10
mg/kg, v.o.). Os animais foram submetidos ao filamento de von Frey, conforme descrito acima.
Todos os grupos de animais receberam 20 µL de carragenina 0,1 mg/kg na pata a ser testada
logo após a leitura do tempo zero e o restante do experimento se deu conforme descrito acima.
Nesse protocolo foi utilizada a indometacina como droga padrão anti-inflamatória. Nesse caso
os resultados são apresentados em termos de Variação (Δ) da Intensidade da Hipernocicepção,
ou seja, foram calculados pela diferença dos valores das leituras nos tempos (30, 60 e 180
minutos) pela leitura do tempo zero (antes da aplicação do indutor da hipernocicepção -
carragenina) (CUNHA et al., 1992).
4.5. Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do CAT
4.5.1. α2-adrenérgico
O papel dos receptores α2-adrenérgicos sobre o possível efeito antinociceptivo do
CAT foi determinado pela administração de ioimbina (2,5 mg/kg; i.p.) 15 minutos antes dos
animais receberem CAT na dose que apresentou melhor efeito analgésico (200 mg/kg) ou
veículo (2% de Tween 80 em água destilada). Outros dois grupos receberam clonidina (0,15
mg/kg, i.p.) e em um desses após 15 minutos recebeu ioimbina (2,5 mg/kg). Após 30 minutos
do último tratamento (CAT, ioimbina ou clonidina), os animais foram submetidos ao teste das
contorções abdominais induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).
42
4.5.2 Serotonégico
Os animais foram tratados durante 4 dias consecutivos com pCPA (4x100 mg/kg;
i.p.), afim de depletar as reservas de serotonina do animal. No 4º dia, 30 minutos após o
tratamento com pCPA, os animais receberam a dose de CAT que apresentou melhor efeito
analgésico (200mg/kg) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada). Após 30 minutos do
último tratamento, os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas
por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).
4.5.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritônio
Após o experimento anterior os animais foram eutanasiados por deslocamento
cervical e em seguida injetados 1 mL de solução salina estéril no peritônio, feita uma leve
massagem e depois a coleta do 0,5 mL do lavado para a investigação da serotonina (5-HT) e o
ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) seu metabólito.
A análise da serotonina e seu metabólito no lavado peritoneal foi realizada através
da utilização de HPLC (High Performance Liquid Chromatograph) com detecção
eletroquímica. O equipamento consiste de um detector eletroquímico com eletrodo de carbono
vitreado, bomba e injetor. Para a análise de monoaminas, uma coluna Shimadzu CLC-ODS (M)
foi utilizada. A fase móvel foi preparada com ácido cítrico (0.163 M), em um pH 3.0 contendo
0.02 mM EDTA, com 0.69 mM de ácido octanesulfônico sódio (SOS), como parte de reagentes
iônicos, 4 % v/v acetonitrila e 1,7 % v/v tetrahidrofurano. 5-HT e 5-HIAA são eletronicamente
detectados usando um detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A; Shimadzu Corp., Japan)
por oxidação do eletrodo de vidro de carbono de 0,85 V relativo para um eletrodo de referências
Ag-AgCl. Os cromatogramas são registrados e quantificados por um integrador. A quantidade
do neurotransmissor e seu metabólito são calculados por comparação da altura dos picos com
a média dos padrões injetados anteriormente.
43
4.5.2.2 Participação de receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3)
O papel dos receptores serotoninérgicos sobre o efeito antinociceptivo do acetato
de citronelila foi determinado pela administração de NAN-190, antagonista 5-HT1A, (1 mg/kg,
i.p.), Ritanserina, antagonista 5-HT2A/C, (1 mg/kg, i.p) e Ondansetrona, antagonista 5-HT3, (0,5
mg/kg, i.p.) 15 minutos antes dos animais receberem CAT na dose que apresentou melhor efeito
analgésico (200mg/kg, v.o.) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada). Após 30 minutos,
os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
como descrito anteriormente (HESS, 2006).
4.5.3. Colinérgico
Com o objetivo de evidenciar a participação do sistema colinérgico sobre a
atividade antinociceptiva do acetato de citronelila, os animais foram pré-tratados com o
antagonista colinérgico muscarínico não-seletivo atropina (1 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes da
administração do acetato de citronelila (200 mg/kg, v.o.). Após 30 minutos do tratamento, os
animais foram analisados no modelo de contorções induzidas por ácido acético como descrito
anteriormente (HESS, 2006).
4.5.4. Dopaminérgico
Para verificara participação dos receptores dopaminérgicos no efeito
antinociceptivo do acetato de citronelila, os camundongos foram pré-tratados com haloperidol
(0,2 mg/kg, i.p., antagonista não-seletivo dos receptores dopaminérgicos), e após 25 minutos,
receberam o acetato de citronelila (200 mg/kg) ou veículo. Após 30 minutos, os animais foram
analisados no modelo de contorções induzidas por ácido acético como descrito anteriormente
(HESS, 2006).
44
4.5.5 Opióide
Com o objetivo de avaliar a participação do sistema opióide sobre o efeito
antinociceptivo do acetato de citronelila, grupos distintos de animais foram pré-tratados com
naloxona (1 mg/kg, i.p., antagonista opióide não seletivo) 15 minutos antes da adiministração
do acetato de citronelila (200 mg/kg) ou morfina (5 mg/kg, i.p., agonista opióide). Após um
período de 30 minutos os animais foram analisados no modelo de contorções induzidas por
ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).
4.5.7 Oxidonitrérgico
O papel do NO sobre o possível efeito antinociceptivo do CAT foi determinado pela
administração de L-NAME (10 mg/kg; i.p.) e L-arginina (150 mg/kg; i.p.). Os animais
receberam L-NAME 15 minutos antes de receber L-arginina e foram submetidos ao teste após
mais 15 minutos. Outro grupo de animais recebeu acetato de citronelila na dose que apresentou
melhor efeito analgésico e após 30 min receberam L-arginina (150 mg/kg; i.p.). Após 30
minutos do tratamento os animais foram submetidos ao teste das contorções abdominais
induzidas por ácido acético como descrito anteriormente (HESS, 2006).
4.5.8 Glutamatérgico
Os animais foram tratados com acetato de citronelila nas doses de 100 e 200 mg/kg,
MK801 (3 mg/kg, i.p.) ou veículo (2 % de Tween 80 em água destilada). Após 30 ou 60 min,
os animais receberam por via intraplantar 20 µl de solução de glutamato (10 µmol/pata) -
preparada em solução salina com pH ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio - na pata
posterior direita. O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada,
considerado como resposta nociceptiva, foi cronometrado por um período de 15 min (BEIRITH
et al., 2002).
45
4.6. Canais e mediadores envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT
4.6.1 Canais de potássio dependentes de ATP
O papel dos canais de potássio dependentes de ATP sobre o possível efeito
antinociceptivo do CAT foi determinado com a administração de glibenclamida (2 mg/kg, i.p.)
15 minutos antes dos animais receberem CAT (200 mg/kg, v.o.), diazóxido (3 mg/kg, i.p.) ou
veículo (2 % de Tween 80 em água destilada). Após 30 ou 15 minutos do tratamento, os animais
foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético como descrito
anteriormente.
4.6.2 TRPV1
Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e tratados com
veículo (2% Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 ou 200 mg/kg, v.o.) ou
vermelho de rutênio (3 mg/kg, i.p.), como droga padrão. Após 30 ou 60 minutos, os animais
receberam uma injeção intraplantar de 20 µl da solução de capsaicina (2,2 μg/pata) na pata
direita traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e
considerado como um índice de nocicepção (SANTOS, CALIXTO, 1997).
4.6.3 TRPA1
Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e tratados com
veículo (2% Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 e 200 mg/kg) ou cânfora
(7,6 mg/kg, s.c.), essa como padrão positivo. Após 30 ou 60 minutos, os animais receberam
uma injeção intraplantar de 20 l da solução de cinamaldeído (10 nmol/pata) na pata direita
traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e considerado
como um índice de nocicepção (ANDRADE et al., 2008).
46
4.6.4 TRPM8
Os animais foram divididos em 4 grupos (8 animais por grupo) e tratados com
veículo (2 % Tween 80 em água destilada), acetato de citronelila (100 e 200 mg/kg) ou
vermelho de rutênio (3 mg/kg, i.p.), essa como droga padrão. Após 30 ou 60 minutos, os animais
receberam uma injeção intraplantar de 20 µl da solução de mentol (1,2 μmol/pata) na pata
direita traseira. O tempo de lambedura da pata foi registrado, em segundos, de 0-5 min, e
considerado como um índice de nocicepção (ANDRADE et al., 2008)
4.6.5 ASICs
Os animais foram tratados com CAT (100, 200 mg/kg, v.o.) ou veículo (2% de
Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20 μl de
solução de salina ácida (ácido acético 2 %, pH 1,98) na pata posterior direita. O tempo que o
animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada, considerado como resposta
nociceptiva, foi mensurado por um período de 20 min (MEOTTI, et al., 2010).
4.6.6 PKC
Os animais foram tratados por via oral com CAT na dose de 200 mg/kg ou veículo
(2% de Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar
20 μl de PMA (500 pmol/pata). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a
pata injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi mensurado no período de 15-45
minutos (FERREIRA et al., 2005).
4.6.7 PKA
Os animais foram tratados com CAT na dose de 200 mg/kg ou veículo (2 % de
Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar 20 μl de
47
8-Bromo-cAMP (10 nmol/pata). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a
pata injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi mensurado por um período de 30
minutos (PAVIN et al., 2011).
4.6.8 Bradicinina
Os animais foram pré-tratados com captopril (5 mg/kg, i.p.), para diminuir a
degradação da bradicinina, e após 30 min receberam CAT na dose de 200 mg/kg ou veículo
(2% de Tween 80 em água destilada). Após 60 min, os animais receberam por via intraplantar
20 μl de Bradicinina (10 µg/pata). O tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo
a pata injetada, considerado como resposta nociceptiva, foi mensurado por um período 15
minutos (FERREIRA et al., 2004).
4.7 Avaliação da Atividade Locomotora
4.7.1 Teste do Rota rod
O teste do rota rod mede o efeito do relaxamento muscular ou incoordenação
motora produzidos por drogas nos animais (CARLINI, BURGOS, 1979). Para este teste, os
camundongos foram divididos em 3 grupos (8 animais por grupo), em que foram administrados
acetato de citronelila (100 ou 200 mg/kg, v.o.) ou veículo (2% de Tween 80 em água destilada)
e 60 minutos depois foram colocados com as quatro patas sobre uma barra de 2,5cm de
diâmetro, elevada a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm, por um período de 1 minuto.
Foi registrado o tempo de permanência na barra giratória, em segundos (s), e o número de
quedas, com três reconduções, no máximo (DUNHAM, MIYA, 1957).
4.7.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto)
Um campo aberto feito em acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x
48
15 cm) dividido em nove quadrantes iguais, foi usado para avaliar a atividade exploratória do
animal (Archer, 1973). Após cada período de tratamento da administração do acetato de
citronelila (100 ou 200 mg/kg, v.o.) ou veículo, cada animal foi colocado no centro do campo
e o parâmetro observado foi o número de cruzamentos com as quatro patas (movimentação
espontânea) registrados durante 5 minutos.
4.7 Análises estatísticas
Para os testes com mais de três grupos foi feita a análise estatística empregando o
teste de análise de variância (ANOVA). Para verificar se houve diferença significativa entre os
grupos, foi realizado o teste de comparações múltiplas de Student-Newman-Keuls ou
Bonferroni. Para a análise dos testes com apenas dois grupos, foi utilizado o teste não
paramétrico de Mann-Whitney (t test). Foi realizada a regressão não-linear para a determinação
da DE50 na curva dose x resposta. Os resultados foram expressos como média ± E.P.M
(variáveis com distribuição normal) ou mediana com máximo e mínimo, sendo as diferenças
consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.
49
5 RESULTADOS
5.1 Atividade antinociceptiva
5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
Apenas os grupos pré-tratados com doses mais elevadas do CAT (100 ou 200
mg/kg) ou indometacina exibiram uma significante diminuição do número de contorções
abdominais quando comparado com os animais tratados apenas com o veículo (Figura 8).
De acordo com a curva dose x resposta, uma DE50 estimada em 74,42 mg/kg (67,65
– 81,88 mg/kg, p<0,05) foi necessária para conseguir a resposta antinociceptiva no teste de
contorções induzidas por ácido acético, sendo esses resultados após 60 minutos da
administração do CAT. (Figura 8)
Na curva de tempo o CAT 200 mg/kg apresentou efeito antinociceptivo logo após
30 minutos da administração e esse efeito se manteve por até 4 horas após a aplicação. Não
sendo mais significativo após 6 horas da administração do CAT (Figura 8).
50
0
20
40
60
Linha controle47.88
30 60 120 240 360
Con
torç
ões
******
***
Tempo (min)
FIGURA 8. Efeito do CAT no modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. A. Efeito antinociceptivo do CAT. B. Curva Log [dose] x resposta do CAT. C. Curva de tempo do efeito antinociceptivo do CAT 200mg/kg. Os valores representam a média ± E.P.M. ou Mediana com máximo e mínimo do número de contorções. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls ou Bonferroni, post hoc). Regressão não-linear foi utilizada para estimar a DE50 com intervalo de confiança de 95%.
Veículo 25 50 75 100 200 Indo0
10
20
30
40
CAT, mg/kg, p.o.
*Con
torç
ões
1.3 1.6 1.9 2.2 2.50
20
40
60
80
100
DE50=74,42 mg/kg (67.65 - 81.88)
log[dose]
Res
post
a an
tinoc
icep
tiva
(%)
A
B
C
51
5.1.2. Teste da formalina
Os pré-tratamentos com as duas doses de CAT (100 ou 200 mg/kg) foram capazes de
reduzir o tempo de lambedura da pata, comportamento sugestivo de nocicepção, durante ambas as fases
do teste, quando comparados com o grupo pré-tratado apenas com veículo. Similarmente, a morfina foi
efetiva em reduzir esse comportamento em ambas fases, também quando comparado com o veículo.
TABELA 2. Efeitos do CAT no modelo de lambedura da pata induzida por formalina.
*Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. *p<0,05 vs Veículo (ANOVA e
Student-Newman-Keuls, post hoc).
Grupos de Tratamentos Tempo de lambedura da pata
1ª Fase 2ª Fase
Veículo 62,50 ± 3,723 26,88 ± 4,933
CAT 100 44,63 ± 4,910 * 11,63 ± 2,976 *
CAT 200 44,38 ± 3,836 * 9,875 ± 2,083 *
Morfina 28,57 ± 1,152 * 1,0 ± 0,7237 *
52
5.1.3. Teste da placa quente
Quando o teste foi realizado à temperatura de 51ºC, apenas após o pré-tratamento com a dose
de 200 mg/kg o CAT mostrou efeito antinociceptivo significante nos tempos 30-90 minutos, quando
comparado com o grupo controle. Já quando o teste foi realizado à temperatura de 55ºC, ambas as doses
(100 ou 200 mg/kg) foram efetivas após 60 minutos da aplicação, mas apenas a dose maior foi efetiva,
também, após 90 minutos da administração do CAT (Figura 9).
0 30 60 90 12010
15
20
25
30
35
Veículo
CAT 100
CAT 200
Morfina 7,5
**** *
*** *** *** ***
51ºC
Tempo (min)
Tem
po d
e re
tirad
a (s
)
0 30 60 90 1205
10
15
20
25
30
CAT 100
CAT 200
Veículo
Morfina 7,5***
******
***
*
****
55ºC
Tempo (min)
Tem
po d
e re
tirad
a (s
)
FIGURA 9. Efeito do CAT no teste da placa quente. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de retirada. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
53
5.1.4. Teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção mecânica
No protocolo com hipernocicepção, o CAT mostrou efeito antihipernociceptivo logo após
30 minutos de aplicação com a dose de 200 mg/kg, e nos tempos seguintes, ambas as doses apresentaram
efeito. De forma semelhante, o grupo que recebeu indometacina apresentou efeito no intervalo 60-180
minutos após a aplicação (Figura 10, A).
No protocolo de sensibilidade mecânica, os grupos que receberam as duas doses testadas
do CAT apresentaram efeito antinociceptivo após 60 minutos da aplicação da droga. Efeito similar,
porém mais intenso, foi observado no grupo que recebeu morfina, que apresentou esse efeito nos tempos
30-60 minutos após a aplicação (Figura 10).
FIGURA 10. Efeito do CAT no teste de sensibilidade mecânica (von Frey) e hipernocicepção inflamatória. A. Mostra o efeito do CAT quando os animais foram hipersensibilizados com carragenina. B. Mostra o efeito do CAT sem a carragenina. Os pontos representam a média ± E.P.M. da variação da intensidade do estímulo (A) ou intensidade do estímulo (B). *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
-5
0
5
10
15
Veículo
CAT 200
CAT 100
Indo
30 60 180
****
**
Tempo (min)
* **
Inte
nsid
ade
da h
iper
noci
cepç
ão(∆
lim
iar
de r
etira
da, g
)
0 30 603
4
5
6
7
8
9
10
Veículo
CAT 100CAT 200
a Morfina***
***
***
***
Tempo (min)
Est
ímul
o m
ecân
ico
(g)
A
B
54
5.2 Sistemas envolvidos no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila
5.2.1. α2-adrenérgico
O bloqueio dos receptores α2-adrenérgico após o pré-tratamento com ioimbina não alterou
o efeito antinociceptivo do CAT. De forma contrária a ioimbina diminuiu significativamente o efeito
antinociceptivo da clonidina (Figura 11).
FIGURA 11. Envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs clonidina (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo Veículo 200 2000
10
20
30
40
50
Ioim 2,5 mg/kg, p.o.
CAT, mg/kg, p.o. Clonidina 0,15 mg/kg, p.o.
Ioim 2,5 mg/kg, p.o.
a
b
a
Con
torç
ões
55
5.2.2. Serotonérgico
A diminuição da síntese de serotonina após as aplicações de pCPA não alterou
significativamente o padrão de contorções quando comparado com o grupo que não recebeu pCPA. Por
outro lado, o tratamento com pCPA foi capaz de reverter parcialmente o efeito antinociceptivo do CAT
(Figura 12).
Vehicle Vehicle 200 2000
10
20
30
40
pCPA, 4x100mg/kg, i.p.
CAT, mg/kg, p.o.
a
a,b
Con
torç
ões
FIGURA 12 Envolvimento do sistema serotonérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT + pCPA (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
56
5.2.2.1 Determinação por HPLC das quantidades de serotonina e ácido 5-hidroxindolacético no peritônio
Os resultados foram extrapolados para lavado coletado. A análise do fluido peritoneal
mostrou que a administração de ácido acético aumentou as quantidades de serotonina quando comparado
com o grupo que não recebeu o ácido acético. O tratamento com pCPA reduziu o nível de serotonina e
nos animais tratados com pCPA que receberam CAT foi observado uma diminuição ainda maior na
quantidade de serotonina, quando comparado com os animais tratados com pCPA e veículo. O 5-HIAA
não foi detectado em nenhum dos grupos (Figura 13).
FIGURA 13. Quantificação de serotonina e seu metabólito no fluido peritoneal após modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. das quantidades em nmol/grama de tecido. ap<0,05 vs Veículo, bp<0,05 vs pCPA e cp<0,05 vs sadio (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc). Sadio é o grupo que não recebeu nenhum tratamento e Controle é o grupo que recebeu apenas o ácido acético e não recebeu pCPA nem CAT.
0
1
2
3
150
200
250
Ácido acético 0,6 %
pCPA
CAT 200 CAT 200
Serotonina 5-HIAA
Controle Controle
nmol
/mL
de la
vado
57
5.2.2.2. Receptores serotonérgicos (5-HT1A, 5-HT2A/C e 5-HT3)
Os grupos que receberam ritanserina ou NAN-190 promoveram a reversão do efeito
antinociceptivo do CAT. Porém, esse efeito não foi visualizado no grupo que recebeu ondansentrona
(Figura 14).
FIGURA 14. Envolvimento dos receptores serotoninérgicos (5-HT1A, 5-HT2 e 5-HT3) no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
58
5.2.3. Colinérgico
O pré-tratamento dos animais com atropina foi capaz de reverter parcialmente o efeito
antinociceptivo do CAT, quando comparado com o grupo que recebeu apenas CAT. A atropina sozinha
não foi capaz de alterar o padrão de contorções quando comparada com o grupo que recebeu apenas
veículo (Figura 15).
Veículo Veículo 200 2000
10
20
30
40
b
a
CAT, mg/kg, p.o.
Atropina, 1 mg/kg, i.p.
Con
torç
ões
FIGURA 15. Envolvimento do sistema colinérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
59
5.2.4. Dopaminérgico
O pré-tratamento dos animais com haloperidol foi capaz de reverter parcialmente o efeito
antinociceptivo do CAT, quando comparado com o grupo que recebeu apenas CAT. O haloperidol
sozinho não foi capaz de alterar o padrão de contorções quando comparado com o grupo que recebeu
apenas veículo (Figura 16).
Veículo Veículo 200 2000
10
20
30
40
CAT, mg/kg, p.o.
Haloperidol, 0.2 mg/kg, i.p.
b
a
Con
torç
ões
FIGURA 16. Envolvimento do sistema dopaminérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
60
5.2.5. Opióide
O pré-tratamento dos animais com naloxona não foi capaz de alterar o efeito
antinociceptivo do CAT, quando comparado com o controle. A naloxona sozinha não interferiu no
padrão das contorções quando comparado com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura 17).
FIGURA 17. Envolvimento do sistema opióide no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
0
5
10
15
20
Veículo Naloxone 1mg/kg
CAT, 200 mg/kg
a aCon
torç
ões
61
5.2.6. Oxidonitrérgico
O pré-tratamento com L-arginina não mostrou diferença significativa na quantidade de
contorções, quando comparado com o veículo e, também, não alterou o efeito antinociceptivo do CAT.
Por outro lado, o pré-tratamento com L-arginina reverteu o efeito antinociceptivo do L-NAME. (Figura
18)
FIGURA 18. Envolvimento do sistema oxidonitrérgico no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs L-NAME (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo 10 10 200 2000
10
20
30
40
50
CAT, mg/kg, p.o.
L-Arginina 150 mg/kg, i.p.
L-NAME,mg/kg, i.p.
aa
a
b
Con
torç
ões
62
5.2.7 Receptores glutamatérgicos
Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição do tempo de
lambedura após receberem glutamato na pata. O mesmo efeito foi observado em outro grupo de animais
quando estes receberam MK-801 e depois glutamato na pata. (Figura 19).
FIGURA 19. Envolvimento dos receptores glutamatérgicos no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por glutamato. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo 100 200 30
10
20
30
40
50
a
CAT., mg/kg, p.o.
Glutamato 10µmol/paw, i.pl.
a
a
MK 801,mg/kg,i.p.
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
63
5.3 Canais envolvidos no efeito antinociceptivo do CAT
5.3.1 Participação dos canais de potássio dependentes de ATP
O pré-tratamento com glibenclamida no grupo que recebeu CAT promoveu a reversão
parcial do efeito antinociceptivo do CAT, quando comparado com o grupo que recebeu apenas CAT. O
mesmo efeito foi observado quando foi administrado glibenclamida no grupo que recebeu diazóxido,
quando comparado com o grupo que recebeu apenas diazóxido (Figura 20).
Veículo Diaz. Diaz.0
10
20
30
40
Glibenclamida, 2 mg/kg, i.p.
b
a
a
a,c
CAT, mg/kg, p.o.
Con
torç
ões
FIGURA 20. Envolvimento dos canais de potássio dependentes de ATP no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de contorções. ap<0,05 vs Veículo, bp<0,05 vs DIAZ e cp<0,05 vs CAT (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc). Diaz = Diazóxido 3 mg/kg, i.p.
64
5.3.2 Receptores TRPV1
Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição dose dependente
do tempo de lambedura após receberem capsaicina na pata. O mesmo efeito foi observado em outro
grupo de animais quando estes receberam vermelho de rutênio e depois capsaicina na pata (Figura 21).
FIGURA 21. Envolvimento dos TRPV1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por capsaicina. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo 100 200 Verm Rut.0
15
30
45
60
Capsaicina 2.2 µg/pata, i.pl.
CAT, mg/kg, p.o.
a
a
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
65
5.3.3 Receptores TRPA1
Os grupos tratados com ambas as doses do CAT não mostraram alterações no tempo de
lambedura após receberem cinamaldeído na pata. De forma contrária, o grupo que recebeu cânfora antes
da cinamaldeído na pata mostrou diminuição significativa no tempo de lambedura da pata (Figura 22).
Veículo 100 200 Cânfora0
15
30
45
60
75
CAT, mg/kg, p.o.
Cinamaldeído, 10nmol/pata, i.pl.
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
FIGURA 22. Envolvimento dos TRPA1 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por cinamaldeído. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
66
5.3.4 Receptores TRPM8
Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição do tempo de
lambedura após receberem mentol na pata. O mesmo efeito foi observado em outro grupo de animais
quando estes receberam vermelho de rutênio e depois mentol na pata (Figura 23)..
FIGURA 23. Envolvimento dos TRPM8 no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por mentol. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo 100 200 Verm Rut.0
20
40
60
80
CAT, mg/kg, p.o.
Mentol, 1.2 µmol/pata, i.pl.
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
67
5.3.5 ASICs
Os grupos tratados com ambas as doses do CAT mostraram diminuição dose dependente
do tempo de lambedura após receberem a salina ácida na pata. O mesmo efeito foi observado quando
houve o bloqueio dos receptores TRPV1 (capsazepina), pois estes também podem ser ativados pela
salina ácida (Figura 24).
FIGURA 24. Envolvimento dos ASIC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por salina acidificada. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo e bp<0,05 vs CAT + capsazepina (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo 100 200 2000
50
100
150
200
CAT, mg/kg, p.o.
Ácido acético 2%, pH 2.04, 20µL/pata
a
Capsazepina, 5mg/kg, i.p.
b
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
68
5.3.6 PKA
O grupo tratado com a dose de 200 mg/kg do CAT mostrou diminuição do tempo de
lambedura após receber PMA na pata em relação ao grupo que não recebeu CAT (Figura 25).
FIGURA 25. Envolvimento do PKC no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por PMA. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo CAT 2000
5
10
15
20
25
PMA, 500 pmol/pata
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
69
5.3.7 PKC
O grupo tratado com a dose de 200 mg/kg do CAT mostrou diminuição do tempo de
lambedura após receber 8-Bromo-cAMP na pata em relação ao grupo que não recebeu CAT (Figura 26).
FIGURA 26. Envolvimento do PKA no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida por 8-Bromo-cAMP. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo CAT 2000
5
10
15
20
25
8-Bromo-cAMP (10nmol/pata)
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
70
5.3.8 Bradicinina
O grupo tratado com a dose de 200 mg/kg do CAT mostrou diminuição do tempo de
lambedura após receber bradicinina na pata em relação ao grupo que recebeu apenas o veículo (Figura
27).
FIGURA 27. Envolvimento da bradicinina no efeito antinociceptivo do CAT em modelo de lambedura da pata induzida. Os valores representam a média ± E.P.M. do tempo de lambedura. ap<0,05 vs Veículo (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Vehicle CAT 2000
10
20
30
40
50
Bradicinina (10µg/pata)
a
Tem
po d
e La
mbe
dura
(s)
71
5.4 Avaliação da atividade locomotora
5.4.1 Teste do rota-rod
Nesse teste o tratamento com CAT não alterou o tempo de permanência na barra giratória
e nem o número de quedas desta, quando comparado com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura
28).
veículo CAT 100 CAT 2000
20
40
60
80
Tem
po d
e P
erm
anên
cia
(s)
FIGURA 28. Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do rota rod. A. Tempo de permanência. B. Número de quedas. Os valores representam a média ± E.P.M. (ANOVA e Student-Newman-Keuls ou bonferroni, post hoc).
Veículo CAT 100 CAT 2000
1
2
3
4
Núm
ero
de q
ueda
s
A
B
72
5.4.2 Teste de atividade locomotora espontânea (campo aberto)
Nesse teste o tratamento com CAT não alterou a atividade locomotora, verificada através
do número de cruzamentos, quando comparado com o grupo que recebeu apenas veículo (Figura 29).
FIGURA 29. Alterações comportamentais promovidas pelo CAT no teste do campo aberto. Os valores representam a média ± E.P.M. do número de cruzamentos. (ANOVA e Student-Newman-Keuls, post hoc).
Veículo CAT 100 CAT 2000
10
20
30
40
50
Núm
ero
de tr
aves
sias
73
6 DISCUSSÃO
O alívio da dor é um direito humano básico, não sendo apenas uma questão clínica,
mas também algo ético que envolve todos os profissionais de saúde (COUSINS, 2000). Uma
série de avanços foram alcançados no que se refere ao controle da dor, porém apesar do
desenvolvimento de numerosos medicamentos analgésicos, muitos pacientes medicados ainda
vivenciam episódios de dores severas (YATES et al., 1998). Dessa forma, estudos com objetivo
de apresentar novas moléculas com potencial analgésico são fundamentais no incremento de
novos recursos terapêuticos que auxiliem no manejo desta enfermidade.
Diante disto e levando em consideração que vários efeitos biológicos são atribuídos
ao CAT como fungicida, larvicida, bactericida, acaricida, repelente/inseticida e antitumoral,
este trabalho foi desenvolvido com objetivo de caracterizar o perfil do efeito e identificar
possíveis mecanismos antinociceptivos do CAT, em modelos de nocicepção aguda em
camundongos, ou seja, modelos em que uma única aplicação do estímulo é capaz de
desenvolver um comportamento nociceptivo.
Até o que se sabe este presente trabalho mostra pela primeira vez a relação do CAT
com efeito antinociceptivo.
A princípio, quando se trabalha com modelos comportamentais, a observação dos
efeitos da molécula em estudo no organismo do animal é importante para a interpretação e
aceitação dos resultados posteriores. Nesse contexto, foi relatado que várias drogas analgésicas
com ação depressora sobre o sistema nervoso central e muscular podem reduzir a coordenação
motora em animais bem como a expressão de comportamentos nociceptivos (SOJA et al.,
2002). Logo, sabendo disso, foram realizados ensaios comportamentais pré-tratando os animais
74
com o CAT e nenhuma alteração de atividade locomotora, coordenação motora e/ou força
muscular foi observada. Com isso, nos resultados discutidos a seguir, provavelmente os efeitos
observados foram exclusivamente do CAT atuando em seus sítios de ação.
No estudo da atividade antinociceptiva do CAT, o primeiro teste realizado foi a
indução de contorções abdominais por ácido acético. Este é um modelo amplamente utilizado
e aceito como modelo de nocicepção visceral e também muito empregado na pesquisa de novas
moléculas antinociceptivas, principalmente de origem natural. O mecanismo da gênese dessas
contorções envolve a liberação de diversos mediadores, como, por exemplo, as prostaglandinas
E2 e F2 (BERKENKOPF, WEICHMAN, 1988) histamina, bradicinina, serotonina (GUO et al.,
2008) e interleucinas 1β e 8 (RIBEIRO et al., 2000). Além disso, a nocicepção promovida pelo
ácido acético também pode ser mediada pela dissociação dos prótons presentes no ácido acético,
que estimulam os canais TRPV1 e ASIC localizados nos neurônios aferentes primários
(RIBEIRO et al., 2000). Algumas substâncias, como por exemplo, drogas anti-inflamatórias
não esteroidais, narcóticos, agonistas simpaticomiméticos como a clonidina e produtos naturais
são capazes, via diferentes mecanismos, de inibir as contorções induzidas pelo ácido acético
(ROCHA et al., 2011).
Os benefícios da utilização do modelo de contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético se devem pelo fato deste envolver diferentes vias de mediação assim como
condições dolorosas inflamatórias clinicamente importantes similares às encontradas na
osteoartrite, artrite reumatoide ou mucosite induzida por quimioterápico (RAAP et al., 2000,
LOGAN et al., 2009; SOARES et al., 2011). Diante disto, o bloqueio de um dos mediadores
envolvidos nas patologias supracitadas por uma determinada substância, por exemplo, interfere
também no teste de contorções abdominais, diminuindo em alguma extensão o número de
contorções, podendo, assim, ser detectado um possível efeito. Desse ponto de vista, o teste de
75
contorções constitui-se em um teste sensível e, apesar da sua primeira descrição ter sido feita
em 1968 (COLLIER, 1968), até os dias atuais é bastante utilizado em estudos de nocicepção e
faz-se referências desse método em revistas de alta qualidade na área (ROCHA et al., 2013).
Os primeiros resultados desse trabalho mostraram que o CAT, nas maiores doses
testadas (100 ou 200 mg/kg), reduziu o número de contorções abdominais induzidas por ácido
acético, com uma DE50 de 74,4 mg/kg. Esse fato nos levou a acreditar no potencial efeito
antinociceptivo desta molécula.
Na ocasião acima, o efeito em ambas as doses foi similar ao encontrado para o
grupo pré-tratado com indometacina, anti-inflamatórios não-esteroidais que foi amplamente
utilizado para fins analgésicos de diversas origens, mas que hoje está entrando em desuso
devido a seus fortes efeitos adversos. Quando o CAT foi testado novamente, mas agora só na
dose de 200 mg/kg, o efeito antinociceptivo foi observado logo após 30 minutos da
administração e se manteve por até 240 minutos.
A fim de aumentar o conhecimento sobre a ação antinociceptiva do CAT, foi
realizado o ensaio de nocicepção induzida pela aplicação intraplantar de formalina. O teste da
formalina é constituído por duas fases distintas. A nocicepção neurogênica (fase inicial) resulta
do efeito irritante direto sobre os nociceptores ativando as fibras aferentes primárias,
acarretando na liberação de neuropeptídeos, como SP e CGRP, em terminais periféricos e
centrais. Por fim, a nocicepção inflamatória (fase tardia) que é mediada pela combinação de
estímulos periféricos e sensibilização da medula espinhal (HUNSKAAR, HOLE, 1987). Vários
trabalhos têm demonstrado que a injeção de formalina libera diferentes mediadores, como
PGE2, NO, glutamato, cininas, entre outros peptídeos, sendo que foi relatado que a formalina
também ativa os canais TRPA1 (HUNSKAAR, HOLE, 1987; SANTOS, CALIXTO, 1997;
MCNAMARA et al., 2007). Também há trabalhos que correlacionam o efeito de inibidores
76
inespecíficos de PKC com a atenuação da nocicepção na fase tardia deste teste (YASHPAL et
al., 1995). Os resultados mostraram que o CAT foi capaz de promover a redução do tempo de
lambedura da pata, parâmetro utilizado como sinal de dor, nas duas doses testadas (100 ou 200
mg/kg) em ambas as fases, sem distinção de diferença de potência de efeito entre os
tratamentos. De forma similar a morfina testada, também, foi capaz de promover esse efeito.
Esses dados aumentam os indícios de que o CAT possui uma ação antinociceptiva. A
modulação de terminais periféricos ou centrais, assim como, a liberação de mediadores
inflamatórios podem estar envolvidos nessa atividade.
Seguindo na investigação do efeito antinociceptivo do CAT, a nocicepção térmica
foi avaliada utilizando-se o teste da placa quente. Historicamente, o teste da placa quente é
descrito como ‘selecionador’ para drogas analgésicas, ou candidatas a analgésicas, de ação
central, tanto em nível espinhal como supra-espinhal. Assim, morfina, codeína, dentre outras
como a dexmedetomidina e citalopram são efetivas nesse teste (GUNELI et al., 2007;
PRAVETONI et al., 2012). Um estímulo térmico ativa os nociceptores que transmitem a
informação nociceptiva aguda a regiões específicas do SNC, produzindo uma resposta
nociceptiva organizada (HESS, 2006; HESS et al., 2010). Nesse teste, o CAT foi capaz de
promover com que animal suportasse por mais tempo o estímulo térmico nóxico. Considerando
que o CAT diminuiu o comportamento sugestivo de dor na primeira fase do teste da formalina
e que nesta fase o envolvimento de estruturas centrais é importante, os resultados do teste da
placa quente nos levam a acreditar no envolvimento central no mecanismo antinociceptivo do
CAT. Esse efeito central pode estar relacionado com a modulação de alguma via de
neurotransmissão.
Os nociceptores também podem ser ativados por estímulos mecânicos resultantes
de pressão direta, deformação do tecido ou mudanças na osmolaridade, possibilitando a
77
detecção do toque, pressão profunda, distensão de órgão visceral, destruição de ossos ou
inchaço.
A pele sem pêlos possui várias classes de receptores somestésicos especializados,
que transduzem informações do meio ambiente mesmo sem termos consciência da maioria
destas. Eles estão ligados a fibras nervosas mielinizadas de grande calibre que são dendritos de
neurônios situados nos gânglios somestésicos, com diferentes sensibilidades a estímulos
mecânicos (MENESCAL DE OLIVEIRA, 2008).
Como os receptores somestésicos são diversos em sua forma de estimulação, é de
se esperar que os mecanismos de transdução sejam igualmente diversos. Os canais iônicos da
família TRP estão envolvidos em uma série de mecanismos celulares de transdução, incluindo
a somestesia. Eles podem funcionar diretamente como a molécula transdutora, sobre a qual o
estímulo sensorial incide, ou podem atuar em um dos passos da transdução, como a molécula
efetora. Por outro lado, pouco se conhece sobre a diversidade e a identidade das moléculas que
realizam a mecanotransdução nos receptores somestésicos (MENESCAL DE OLIVEIRA,
2008).
A modulação genética de organismos como vermes e moscas tem incrementado o
conhecimento da transdução mecanosensorial em mamíferos. Um canal iônico da família da
degenerina (MDEG/ENaC), alternativamente do canal iônico sensível a ácido 2 – ASIC2, tem
chamado particular interesse no campo da dor, pois seu RNA mensageiro é expresso no
neurônio sensorial primário. Respostas de fibras sensoriais primárias de camundongos
deficientes de ASIC2 para uma faixa de estímulos mecânicos identificaram uma classe
específica de mecanorreceptores que mostrou redução da sensitividade do movimento do
cabelo. Outro tipo de aferente, incluindo fibras C, mostraram respostas normais nesses
camundongos mutantes, indicando que o ASIC2 está envolvido em alguns aspectos da sensação
78
inócua (toque), mas não na detecção de estímulos mecânicos nóxicos (MENESCAL DE
OLIVEIRA, 2008).
No teste de mecanocepção, no qual foi utilizado um transdutor de pressão,
conhecido com teste de von Frey, o CAT foi capaz de aumentar o limiar de mecanocepção dos
animais, ou seja, foi preciso uma pressão maior para os animais tratados com CAT retirarem a
pata do filamento. Esse efeito foi similar ao observado nos animais que receberam morfina,
porém com menor intensidade. Com esses dados podemos sugerir que a participação dos
receptores TRP ou ASIC, ou a transmissão da mensagem mecanosensitiva no mecanismo de
ação antinociceptiva do CAT.
A suposição de que o CAT é uma substância analgésica com ação sobre a
nocicepção de origem inflamatória tornou-se mais clara quando foi realizado o teste de
hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina, que, quando comparado ao teste de
nocicepção induzida por agentes químicos, apresenta uma importante vantagem, pois permite
uma dissociação entre a sensibilização dos nociceptores (pela injeção de um flogógeno ou de
um mediador inflamatório específico, como uma citocina) induzida por um estímulo químico
(LE BARS et al., 2001).
O evento inflamatório subseqüente à aplicação intraplantar de carragenina tem pico
edematogênico máximo ao redor de 3h, e parece ser mais bem caracterizado em três fases de
acordo com Di Rosa et al., (1971), onde a primeira fase seria mediada principalmente pela
liberação local de histamina e serotonina (1 - 90 minutos após a aplicação de carragenina). A
segunda estaria relacionada à liberação de bradicinina, que parece não apenas ativar
nociceptores e induzir respostas nociceptivas. Ferreira et al., (1993) sugeriram que a bradicinina
é o mediador inicial pró-nociceptivo que leva a liberação de TNF-α e então IL-1β, IL-6, IL-8,
o que pode levar à produção/liberação de prostanóides ou aminas simpatomiméticas. Esta
79
última ação configura como a terceira fase deste teste (2,5 – 6 horas após a aplicação de
carragenina) estaria relacionada às ações das prostaglandinas. Além desses mediadores, existe
importante participação de substância P, óxido nítrico, infiltração de neutrófilos e produção de
radicais livres como hidroxil e superóxido, estando todos ligados à formação de edema pela
carragenina (DAWSON et al., 1991; GILLIGAN et al., 1994; SALVEMINI et al., 1996).
Dessa forma, a aplicação intraplantar de carragenina é o agente central utilizado em
modelo de inflamação e nocicepção empregado em “screening” de moléculas com ação anti-
inflamatória e analgésica (CUNHA et al., 2005). Empregamos, então, a carragenina como
agente indutor de hiperalgesia inflamatória para testar o tratamento dos animais com o CAT, e
nossos resultados mostraram que ambas as doses inibiram a hipernocicepção induzida por
carragenina. Esse efeito anti-hiperalgésico pode ocorrer devido ao bloqueio da produção de
citocinas e corrobora com os resultados do teste de contorções induzidas por ácido acético,
reforçando uma ação antinociceptiva periférica.
Diante dos resultados mostrados, podemos sugerir que o CAT proporciona
atividade antinociceptiva em camundongos. Sabendo disso, prosseguimos a investigação
pelo(s) possível(is) mecanismo(s) envolvido(s) nesse efeito. Inicialmente foi avaliado como o
CAT atua perifericamente.
A ação antinociceptiva ou antihipernociceptiva pode ocorrer em diversos pontos da
cascata de produção/liberação dos mediadores pró-inflamatórios ou ainda sobre receptores de
mediadores plasmáticos ou neurotransmissores, como é o caso do glutamato (principal
neurotransmissor excitatório envolvido na transmissão do sinal nociceptivo) (BEIRITH et al.,
2002). O glutamato induz uma resposta nociceptiva através da sua atuação em receptores
glutamatérgicos que estão presentes em sítios de ação periférica, espinhal e supra-espinhal
(BEIRITH et al., 2002).
80
Diversos estudos de moléculas com ação antinociceptiva, tanto central como
periférica, sugerem o envolvimento dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos ou
metabotrópicos como mecanismo antinociceptivo (BATISTA et al., 2008; FREITAS et al.,
2009; MELO et al., 2012), indicando a participação de vários receptores glutamatérgicos no
processo nociceptivo. O estudo de Fisher e Coderre (1996) sugere uma interação dos receptores
metabotrópicos com os NMDA na nocicepção induzida pela formalina. A injeção intraplantar
de glutamato libera aminoácidos excitatórios, PGE2, NO, cininas, prótons, glutamato e SP no
corno dorsal (MILLAN, 1999; BEIRITH et al.,2002; SAKURADA et al., 2003).
Nossos resultados demonstram que o CAT é capaz de reduzir o comportamento
sugestivo de dor provocado pela aplicação intraplantar de glutamato. Esse mesmo efeito, mas
de forma mais acentuada, foi encontrado quando outro grupo de animais foi tratado com MK-
801, antagonista de receptores NMDA.
Tomando esses resultados com as observações de Zanh e Breenan (1998) e Zanh et
al., (1998), que demonstraram que a administração de antagonistas NMDA é capaz de bloquear
a hiperalgesia induzida por carragenina, e que não é observado com o bloqueio dos receptores
AMPA/cainato. Podemos sugerir que o CAT atue em algum nível da resposta desencadeada
pela ativação do receptor NMDA. Na verdade, os receptores NMDA estão envolvidos em
respostas sinápticas relativamente lentas, enquanto que os receptores AMPA/cainato
contribuem substancialmente para a neurotransmissão e o processamento medular
somatossensorial de estímulos cutâneos inócuos e nocivos (KING & LOPEZ-GARCIA, 1993;
RUSCHEWEYH & SANDKÜHLER, 2002).
Os membros da família dos canais iônicos TRP são moléculas fundamentais na
detecção de estímulos nóxicos, e são capazes de transduzir respostas a estímulos mecânicos e
químicos (STUCKY et al., 2009). Estes receptores estão localizados heterogeneamente em uma
81
população de fibras aferentes primárias de pequeno calibre, e em terminais de fibras aferentes
que se projetam para as lâminas superficiais do corno dorsal, principalmente I e II (CATERINA
et al., 1997; FEIN 2011).
Vários estudos têm estabelecido a importância dos receptores TRPV1 sobre a
hipernocicepção térmica (CATERINA et al., 2000; AMAYA et al., 2004), incluindo a ação de
antagonistas desses receptores em fortalecer a antinocicepção induzida por morfina no teste da
placa quente (NGUYEN et al., 2010). Durante muito tempo se pensou que os H+ eram ligantes
endógenos dos TRPV1. Entretanto, parece que o estímulo específico para esses receptores são
temperaturas maiores de 43ºC. Notavelmente, a resposta de TRPV1 à temperatura ou à
capsaicina (8-metil-N-vanillil-6-nonenamida - ingrediente ativo da pimenta e ativador mais
conhecido desses receptores) é facilitada pelos H+, mas não ativada por eles (PREMKUMAR,
2001). O aumento da concentração de íons H+, também, ativa canais catiônicos (permeáveis a
Na+, K+ e Ca++) que induzem despolarização prolongada na membrana celular. As principais
fontes de H+ são os exsudatos, os leucócitos, o músculo isquêmico, os hematomas e o tecido
que rodeia os tumores.
Estudos tem mostrado que a ativação dos TRPV1, pela capsaicina, no neurônio
sensitivo primário leva ao influxo de cálcio e sódio. Por sua vez, esses aferentes ativados
liberam glutamato, substância P, neurocinina A, peptídio relacionado ao gene da calcitonina,
óxido nítrico e mediadores pró-inflamatórios nos nervos periféricos e que esta informação
nociceptiva é transmitida para o corno dorsal da medula espinhal (SORKIN et al., 1992;
SAKURADA et al., 1996; SANTOS, CALIXTO, 1997; SZALLASI, BLUMBERG, 1999). A
ativação do TRPV1 pode ser potencializada por agentes pró-inflamatórios (activina, ATP,
bradicinina, glutamato, histamina, PAR2, serotonina, tripsina) ou fatores tróficos (fator de
82
crescimento de nervos, fator neurotrófico derivado de células da glia) (PREMKUMAR,
ABOOJ, 2012).
Nosso trabalho mostra que o pré-tretamento com CAT em ambas as doses diminuiu
o comportamento sugestivo de dor após a aplicação da capsaicina. Esse resultado nos oferece
uma suspeita do possível envolvimento do TRPV1 no efeito antinociceptivo do CAT, embora,
apenas este teste, não seja suficiente para confirmar esse efeito.
Su et al., (2011), relataram que a ativação dos TRPM8 pode provocar uma
hipersensibilidade aos estímulos frios pois exibe um limiar de ativação na faixa de 22 a 27 °C
(PEIER et al, 2002; MCKEMY et al., 2005), corroborando com os achados de Proudfoot, et al.,
(2006), de que o mentol, um agonista desses receptores, pode apresentar propriedades pró-
nociceptivas quando administrado em altas doses.
O TRPM8 é ativado por várias substancias sintéticas responsáveis por sensações de
frio moderado ou “frescor”, como por exemplo icilina e eucaliptol (PEIER et al., 2002;
BEHRENDT et al., 2004; MCKEMY et al., 2005), e parece ser inibida pelo ácido, etanol e
ativação de PKC (BEHRENDT et al., 2004; WEIL et al., 2005; PREMKUMAR et al., 2005).
Esse canal é fundamental na analgesia experimentada por pequenas doses de compostos
refrescantes (PROUDFOOT et al., 2006; DHAKA et al., 2007).
Outro receptor responsável pela detecção de estímulos de frio é o TRPA1. Na
alodínia fria e hiperalgesia mecânica têm sido demonstrado seu envolvimento usando modelos
comportamentais (BAUTISTA et al., 2007). No entanto, seu papel no frio nóxico e sensações
mecânicas ainda é controverso (PREMKUMAR, ABOOJ, 2013). Um estudo mostrou que a
formalina age no neurônio sensorial primário através de ativação específica e direta dos TRPA1,
que são altamente expressos no nociceptor em um subconjunto de fibras C positivas para
TRPV1 (MCNAMARA et al. 2005). Em nossa pesquisa, encontramos que o TRPA1 não exerce
83
um papel importante no mecanismo antinociceptivo do CAT. Isso indica que embora o CAT
tenha efeito antinociceptivo no teste da formalina, esse efeito não está relacionado com TRPA1,
mas sim com outras moléculas disparadas na cascata da formalina, como PGE2, NO, glutamato
ou cininas.
Os resultados obtidos nesse trabalho demonstram que o tratamento oral com CAT
em ambas as doses foi capaz de reduzir a ação nociceptiva provocada pela aplicação de mentol
nas patas dos animais, porém não de cinamaldeído – agonista dos receptores TRPA1. Dessa
forma, a droga em estudo apresenta uma atividade antinociceptiva relacionada aos receptores
TRPM8, mas não aos TRPA1.
Alguns estudos tem demonstrado que a expressão de ASIC é aumentada por
mediadores pró-inflamatórios (MAMET et al., 2002; DEVAL et al., 2010). Eles são ativados
por prótons extracelulares e modulados pelo PKC (BARON et al., 2002). Em nível periférico,
ASIC3 é importante na dor inflamatória. Sua expressão e atividade é potencializada por
diversos mediadores presentes na “sopa inflamatória” (DEVAL et al., 2010). Algumas
evidências sugerem que ASIC e TRPV1 têm papeis complementares na detecção de prótons no
neurônio sensitivo (BAGGIO et al., 2012). Nesse teste, foi feito o bloqueio do TRPV1 com a
capsazepina para se excluir os efeitos dos H+ nesse receptor e mostrar de forma mais clara o
efeito antinociceptivo do CAT (melhor dose) frente a um estímulo nóxico ácido. Dessa forma,
os resultados mostram que o CAT reduz o comportamento sugestivo de dor quando o único
estímulo doloroso era a ativação dos ASIC por íons H+.
TRPV1 e TRPM8 são modulados por PIP2, mas de maneiras opostas. A depleção
de PIP2 causada pela ativação de PLC diminui a atividade do TRPM8 (BENEDIKT et al.,
2007), enquanto que o aumento de PIP2 bloqueia TRPV1, aumentando a atividade do TRPM8
(CHUANG et al., 2001). Quando comparados aos receptores TRPA1, os TRPM8 apresentam
84
uma temperatura de ativação significativamente maior, resposta mais rápida ao frio e menor
sensibilidade, em geral, à capsaicina (KARASHIMA et al., 2009). Tem sido mostrado que o
TRPM8 é expresso no conjunto de fibras C e Aδ negativas para o TRPV1, enquanto que o
TRPA1 é expresso em fibras C positivas para o TRPV1 de camundongos e gânglio da raiz
dorsal (GRD) de ratos (STORY et al., 2003; KOBAYASHI et al., 2005). Alguns estudos
demonstraram que uma proporção apreciável dos neurônios sensoriais do GRD que expressam
canais ASIC e todos aqueles que expressam TRPM8 não expressam canais TRPV1 (e também
TRPA1) (MAMET et al., 2002). Logo, o CAT deve estar interferindo em processos
intracelulares, ou mesmo diretamente no canal, após ativação dos receptores em fibras positivas
para TRPV1, TRPM8 ou ASIC.
A ativação de PKC por ésteres de forbol é capaz de despolarizar e sensibilizar
profundamente a resposta mediada por calor no neurônio sensorial (DRAY et al., 1988 e 1992),
que pode ser mimetizada por bradicinina ou atenuada por inibidores de PKC (PREMKUMAR
et al., 2005; PREMKUMAR, ABBOOJ, 2013). O limiar de temperatura para ativação do
TRPV1 é reduzido para a temperatura corporal quando o receptor está em estado fosforilado
(SIKAND, PREMKUMAR, 2007). O PKC exerce um papel importante na patologia da dor
somática, suas fosforilações não apenas sensibilizam o TRPV1, mas, também, promove a
translocação do citosol para a membrana plasmática (MORENILLA-PALAO et al., 2004; VAN
BUREN et al., 2005).
A ativação de PKC tanto potencia como prolonga a resposta mediada por TRPV1
quando comparada com a ativação por PKA, que apenas potencia a resposta transientemente.
No entanto, a estimulação de PKC resulta em infraregulação do TRPM8 (PREMKUMAR et
al., 2005). Há muitas evidências de que o AMPc e PKA sensibilizam o TRP, indicando que os
AINES aliviam a dor bloqueando a COX e reduzindo a produção de prostaglandinas com
85
consequente redução de AMPc e com isso reduzindo a ativação de TRP (PREMKUMAR,
ABOOJ, 2013). Com isso PKC, PKA e outras kinases podem modular os canais TRP.
No presente trabalho, observou-se que o CAT efetivamente diminuiu a resposta
nociceptiva da injeção intraplantar de PMA ou 8-bromo-cAMP. Dadas evidências da
implicação do PKC e PKA na sinalização do mecanismo que leva a nocicepção e hiperalgesia
(SOUZA et al., 2002), e como no trabalho de Baggio et al., (2012) com os mesmos métodos
concluiram sugerindo o envolvimento do PKC e PKA no efeito antinocieptivo da molécula
estudada, nós hipotetizamos que esses poderiam constituir os principais alvos da ação
antinociceptiva do CAT. Como essas cinases são moléculas sinalizadoras/efetoras de vários
mecanismos diferentes, a amplitude dos mecanismos observados referentes ao CAT, pode ser
devido ao envolvimento desses mediadores intracelulares.
Durante a inflamação, PG são liberadas dentro da corrente sanguínea e aumentam
os níveis intracelulares de AMPc no neurônio sensorial (HINGTGEN et al., 1995). Esse efeito
pode ser mimetizado pela adição de análogos de AMPc permeáveis a membrana (TODOROKI
et al., 1995). DAINEs e opióides diminuem o nível de AMPc. Há evidências substanciais que
a presença de AMPc e PKA sensibilizam os canais TRP, sugerindo que esses analgésicos
trabalhem reduzirem a sensibilização de TRP. DAINEs aliviam a dor por bloquearem a
cicloxigenase e reduzindo a produção de prostaglandinas. PGE2 e Forskolin aumentam o fluxo
causado pela capsaicina (LOPSHIRE, NICOL, 1998; VOILLEY et al., 2001)
A injeção subcutânea de NO em humanos induz sensação dolorosa (Ignarro, 2002),
devido à alta concentração local do gás. Experimentos em animais tem sugerido que a geração
de NO e subsequente aumento dos níveis de GMPc estão envolvidos no mecanismo de
nocicepção periférica, particularmente em tecidos inflamados (TORIYABE et al., 2004). Um
estudo realizado por Kawabata et al. (1994) demonstrou que a L-arginina, substrato da enzima
86
óxido nítrico sintase (NOS), aumenta significativamente o comportamento nociceptivo
induzido pela formalina, sugerindo que o NO possui uma atividade pró-nociceptiva, visto que
o mesmo é o produto final da interação entre L-arginina e a enzima NOS. Outros autores
provaram que a ação de inibidores da NOS é capaz de produzir um comportamento
antinociceptivo em modelos animais, corroborando com a hipótese de que o NO desempenha
um papel na nocicepção (MOORE et al., 1991; 1993).
É bem estabelecido que o aumento na produção de NO leva a um aumento na
síntese/liberação de vários mediadores pró-inflamatórios que resulta na promoção da reação
inflamatória e desenvolvimento de nocicepção, bem como hiperalgesia (RIVOT et al., 2002;
JESSE et al., 2009).
Assim, a administração de um precursor metabólico do NO, L-arginina, nos foi útil
para avaliar o envolvimento desta via no mecanismo antinociceptivo do CAT. Com o bloqueio
da NOS pelo L-NAME foi possível observar o efeito antinocieptivo, e a reversão desse efeito
quando a L-Arginina foi administrada primeiro. Esse efeito não foi observado quando foram
feitos os tratamentos com o CAT. Nossos resultados não sugerem que o CAT atue na síntese
de NO, pois nenhuma alteração no padrão de comportamento sugestivo de dor, no caso as
contorções induzidas por ácido acético, foi observada após os tratamentos (L-arginina + CAT).
Os canais de potássio ATP-dependentes estão distribuídos em uma variedade de
tipos de tecidos e células, onde acoplam alterações metabólicas intracelulares com a atividade
elétrica da membrana plasmática, desempenhando assim um papel importante tanto nas células
normais quanto em processos patológicos (AGUILAR-BRYAN et al, 1998). Estudos
demonstraram que o efeito de alguns receptores, como os α2-adrenérgicos, μ e δ opióides e os
receptores 5-HT1A,está envolvido com os canais de potássio ATP-dependentes, e que a abertura
desses canais está relacionada com o efeito antinociceptivo dos agonistas daqueles receptores
87
(OCAÑA, BAEYENS, 1993; ROBLES et al., 1996; GALEOTTI et al., 1999; RODRIGUES,
DUARTE, 2000).
Destaca-se, ainda, a relação entre os canais de potássio ATP-dependentes e a via do
óxido nítrico, como proposto por Soares et al. (2000). Segundo esses autores, a liberação do
óxido nítrico pode promover a abertura dos canais de potássio no terminal nociceptivo,
induzindo a hiperpolarização da membrana celular, que resulta na diminuição da excitabilidade
celular, dessa forma, promovendo analgesia (LAZARO-IBANEZ et al., 2001; ORTIZ, et al.,
2006).
Então, seguiu-se a investigação pré-tratando os animais com glibenclamida, um
bloqueador de K+ATP. Esse pré-tratamento parcialmente reverteu o efeito antinociceptivo do
CAT no teste das contorções induzidas por ácido acético, sugerindo o possível envolvimento
desses canais no mecanismo antinociceptivo do CAT.
88
FIGURA 30. Ilustração mostrando os possíveis canais e receptores, com alguns de seus segundos mensageiros, envolvidos, e discutidos até o momento, no mecanismo antinociceptivo do acetato de citronelila. DAG: Diacilglicerol; IP3: Trifosfato d e inositol; PLC: Fosfolipase C; cGMP: guanosil monofosfato cíclico; sGC: guanilciclase solúvel; cAMP: adenosina monofosfato cíclica; ATP: adenosina trifosfato
Outra parte do nosso estudo foi avaliar o possível envolvimento de algumas vias de
neurotransmissão no mecanismo antinociceptivo do CAT. Várias moléculas induzem
antinocicepção por interferirem com vias neuronais na recepção ou transmissão da informação
nociceptiva da periferia para SNC (FURST, 1999). Como o CAT mostrou bons resultados na
primeira fase do teste da formalina e no teste da placa quente, assim como, no teste da
nocicepção mecânica, nós avaliamos a possibilidade do envolvimento de vias de
neurotransmissão no seu mecanismo antinociceptivo. Levando em consideração que possam
89
haver componentes antinociceptivos centrais nesse mecanismo, além dos periféricos já
discutidos.
Embora a serotonina (5-HT) seja conhecida por desempenhar um papel importante
na nocicepção, existe apenas uma avaliação limitada dos subtipos do receptor da 5-HT
envolvidos no processo e que ainda interagem entre si e com outros mediadores químicos da
nocicepção. Segundo Millan (1999), a 5-HT pode exercer tanto ações anti- quanto pró-
nociceptiva, dependendo do tipo de receptor ativado.
No SNC a 5-HT está associada com o processamento e a modulação da dor. Sua
ação analgésica se dá quando liberada no corno dorsal da medula espinhal por estimulação da
PAG (substância cinzenta periaquedutal), por meio da excitação dos interneurônios inibitórios
resultando na inibição dos neurônios do corno dorsal (SOMMER, 2004). As ações periféricas
da 5-HT são distintas das ações centrais. Na periferia, a 5-HT é considerada um mediador
inflamatório e é liberada por plaquetas e mastócitos. Seus níveis periféricos aumentam após a
injúria de um nervo e em pacientes com alodínia. A injeção intraplantar de 5-HT em ratos reduz
significativamente a latência de retirada da pata à estimulação ao calor radiante.
Os dados reportados aqui mostram que o perfil antinociceptivo do CAT parece estar
relacionado com a via serotoninérgica. Essa hipótese está claramente suportada pelo fato de que
a supressão da síntese de serotonina, com a inibição da triptofano hidroxilase pelo pCPA,
diminuiu o poder antinociceptivo do CAT. Esse resultado sugere que parte do efeito
antinociceptivo do CAT depende da presença da serotonina, no terminal nociceptivo ou em
nível de SNC.
Em seguida, para acrescentar informações sobre o efeito periférico do CAT, foi
realizada a coleta do líquido de lavagem do peritônio dos animais e quantificado a serotonina,
90
por HPLC. Na periferia, a serotonina é um mediador pró-inflamatório (CARVALHO et al.,
2013)
Os resultados mostraram que o tratamento com pCPA antes do ácido acético
reduziu o nível de serotonina (como esperado). Nos animais que receberam pCPA e CAT foi
observado a diminuição ainda maior na quantidade de serotonina. Com esses resultados
podemos destacar a importância da serotonina no mecanismo antinociceptivo do CAT e que o
CAT aumentou a degradação desta durante esse processo, assim como, esse resultado corrobora
com a suspeita de efeito anti-inflamatório levantado com os resultados do modelo de
hipernocicepção inflamatória. Nossos resultados são semelhantes aos de Hess et al., (2010), que
sugeriram que a modulação da dor pela molécula em estudo parece ser mediada, em parte, pela
indução da liberação de serotonina. Mas, no nosso caso, esse possível aumento na indução da
liberação da serotonina está acompanhado de uma diminuição na disponibilidade da serotonina,
ou por uma ligação mais forte com seus receptores ou por degradação metabólica.
É sabido que a inibição da transmissão dolorosa pela 5-HT no corno dorsal da
medula é mediada pelos receptores 5-HT2, embora o efeito, também, seja atribuído aos
receptores 5-HT1. Além disso, o pré-tratamento com cetanserina – um antagonista do receptor
5-HT2A – atenua a resposta comportamental à dor após a injeção da 5-HT. Estes resultados
sugerem que o receptor 5-HT2A está envolvido na hiperalgesia induzida pela 5-HT em
ferimentos agudos ou na inflamação. A injeção local de cetanserina produziu inibição dose
dependente da hiperalgesia evocada pela carragenina. Juntos estes resultados sugerem que a 5-
HT tem um papel importante na hiperalgesia resultante do ferimento tecidual, por ativação dos
receptores 5-HT2A nos terminais nervosos do nociceptor (SAWYNOK, REID, 1996).
Outro receptor serotoninérgico envolvido no processamento da dor são os 5-HT3.
No SNC, os 5-HT3 estão localizados principalmente na área postrema, nucleus accumbens,
91
amigdala, hipocampo e nos gânglios do corno dorsal, modulando a liberação de
neurotransmissores e neuropeptídios como a dopamina, acetilcolina, GABA e a substância P.
Os terminais periféricos de fibras C e Aδ expressam receptores ionotrópicos 5-HT3, cuja
ativação medeia uma despolarização rápida desses neurônios (FABER et al., 2004).
Vários trabalhos têm mostrado diferentes efeitos para antagonistas 5-HT1A, não
alterando (CRISP et al., 1991) ou produzindo bloqueio dose-dependente (XU et al., 1994) da
antinocicepção induzida por 5-HT no teste do “tail-flick”. A administração intratecal de
agonistas 5-HT1A facilitam (ALHAIDER, WILCOX, 1993), inibem (XU et al., 1994) ou não
modificam a reação de dor (MILLAN, 1994). Grau similar de controvérsia existe sobre o
possível papel exercido pelos receptores 5-HT2 e 5-HT3. A ativação de receptores 5-HT2 foi
reportado facilitar (EIDE et al., 1990) ou inibir (SOLOMON, GEBHART, 1988) a transmissão
do impulso nociceptivo.
O CAT parece exercer seu efeito antinociceptivo, em parte, modulando a ligação
da serotonina nos receptores 5-HT1 e 5-HT2, mas não interferindo com a ligação no 5-HT3.
Essa hipótese é claramente suportada pelo fato de que o pré-tratamento dos animais com NAN-
190 ou Ritanserina diminuiu o efeito antinociceptivo do CAT, no caso do NAN-190, esse efeito
foi abolido. Esses achados estão de acordo com trabalhos anteriores, em que, o envolvimento
da via serotonérgica parece estar relacionada com a antinocicepção induzida por várias drogas
(DE WITTE et al., 2001; ALLOUI et al., 2002).
A via noradrenérgica é ativada pela noradrenalina liberada das projeções bulbo-
espinhais para os neurônios do corno dorsal da medula espinhal (NICHOLSON et al., 2005) e,
uma vez liberada, modula a excitabilidade desses neurônios através da ativação dos α1 e α2-
adrenoceptores.
92
Butelman et al. (1998) demonstraram que a aplicação sistêmica dos agonistas α1
(fenilefrina) ou α2 (clonidina) causa efeitos analgésicos em diversos modelos animais de dor e
que são antagonizados pela prazosina e ioimbina, respectivamente. Imbelloni (2001) reporta a
utilização da fenilefrina em anestesia raquidiana sugerindo aumento do efeito analgésico,
vasoconstrição no local da administração e diminuição dos efeitos tóxicos sistêmicos do
anestésico. Agonistas α2-adrenérgicos possuem efeito potencializador da analgesia
subaracnóide através da liberação de β-endorfinas, porém acentuam o quadro hipotensivo
provocado pelo anestésico local espinhal. A clonidina aumenta a liberação de noradrenalina em
resposta à estimulação neural (UMEDA et al., 1996) e potencializa o seu efeito inibitório sobre
as fibras Aδ e C, responsáveis pela condução do estímulo doloroso (KAWASAKI et al, 2003).
Um dos mais significativos papéis dos neurônios noradrenérgicos na modulação da
dor é observado em pacientes durante a retirada do tratamento com opióides. A interrupção
abrupta da administração de opióides ou a aplicação aguda de antagonistas opióides induzem
uma série de respostas aversivas e sintomas que incluem um aumento anormal da hiperalgesia
A retirada dos opióides pode causar hiperatividade dos neurônios noradrenérgicos centrais e
aumento dos níveis de noradrenalina no cérebro. Assim, o aumento das sinapses
noradrenérgicas no Núcleo Magno da Rafe (NRM) pode mediar a hiperalgesia observada como
efeito da abstinência opióides (HEISHMAN et al., 1989; McNALLY, AKIL, 2002;
RAGHAVENDRA, RUTKOWSKI, 2002).
Os resultados do presente trabalho indicam que o efeito antinociceptivo do CAT
provavelmente não é mediado pelo sistema α2-adrenérgico. O tratamento com ioimbina não
alterou o comportamento antinociceptivo mediado pelo CAT frente à aplicação intraperitoneal
de ácido acético. Umeda et al., (1997), demonstraram que a liberação não-sináptica de
norepinefrina para medula espinhal é modulada via auto-receptor α2-adrenérgico. Foi
93
observado que o agonista α2-adrenérgico, clonidina, inibe essa via, enquanto que a ioimbina
aumenta a liberação de norepinefrina em resposta à estimulação neural (VIZI et al., 1986). É
possível que a clonidina exerça efeito antinociceptivo, pelo menos parcialmente, através da
modulação pré-sináptica das fibras aferentes primárias que transmitem a mensagem nociceptiva
para a medula.
Vários estudos têm demonstrado a participação da via colinérgica nos mecanismos
de antinocicepção (HERZ, 1993; ABELSON et al., 2004; HABERBERGER et al., 2004). A
acetilcolina praticamente não tem aplicações terapêuticas por causa de sua ação difusa e
hidrólise rápida pela acetilcolinesterase sináptica e butirilcolinesterase plasmática. Os níveis
endógenos de acetilcolina podem ser mediados por diversas substâncias envolvidas na
transmissão do processo doloroso (TAGUCHI et al., 1999; ABELSON, et al., 2004; OBATA
et al. 2004). Sua liberação é aumentada nos neurônios do SNC a partir da ativação de receptores
opióides pré-sinápticos pela morfina, causando potencialização do efeito antinociceptivo. Esse
trabalho também demonstrou que a antinocicepção induzida pela administração sistêmica de
morfina pode ser antagonizada pela administração intratecal de antagonistas muscarínicos,
reforçando a idéia de sinergismo entre os sistemas opióide e colinérgico (TAGUCHI et al.,
1999).
O aumento dos níveis de acetilcolina intraespinhal durante a analgesia induzida por
AINEs, como a aspirina, também é conhecido (ABELSON et al., 2004). Na interação das vias
α-adrenérgica e colinérgica na modulação do processo doloroso, é reportado que a clonidina
(agonista adrenérgico) é capaz de aumentar a liberação de acetilcolina na medula espinhal
(OBATA et al. 2004). A via colinérgica também participa do controle exercido pela medula
rostral ventrolateral (RVLM) sobre as funções fisiológicas cardiovasculares e mecanismos
antinociceptivos (TAGUCHI et al., 1999).
94
Os resultados após o pré-tratamento com atropina fundamentam a hipótese da
efetiva participação da acetilcolina neste processo de analgesia. Pois o bloqueio muscarínico
reverteu parcialmente o efeito antinociceptivo do CAT.
Paradoxalmente, existem também evidências de que se pode esperar um efeito
antinociceptivo quando o sistema colinérgico é bloqueado pelo antagonista atropina em doses
muito pequenas, entre 1 e 100µg/kg, através do bloqueio seletivo dos receptores muscarínicos
pré-sinápticos, o que induz um aumento dos níveis de acetilcolina extracelular (BANNON et
al., 1998).
A dopamina é uma catecolamina sintetizada nos terminais dos neurônios
dopaminérgicos a partir da tirosina. Os receptores dopaminérgicos encontram-se amplamente
distribuídos no SNC e estão envolvidos nos controles da atividade motora, do comportamento
emocional e em circuitos neuroendrócrinos. Os circuitos dopaminérgicos do mesencéfalo (área
tegmental ventral, sistema mesolímbico) por sua vez, estão envolvidos no processo de adição a
certos fármacos e de substâncias como o álcool, a cocaína e os opióides formando a chamada
zona de recompensa (BLACK et al., 2002).
Mecanismos Dopaminérgicos parecem estar envolvidos na modulação da
nocicepção (ROBERTSON et al., 1981; TRICKLEBANK et al., 1984), como na mediação da
analgesia no teste da formalina (MORGAN, FRANKLIN, 1991). Vários trabalhos indicam que
ambos agonistas D2 e estimulantes indiretos de receptor dopaminérgico produzem analgesia
em diferentes modelos animais de dor (KOSTRZEWA et al., 1991; MORGAN, FRANKLIN,
1991; FRUSSA-FILHO et al., 1996). Outro estudo confirma o envolvimento da dopamina na
nocicepção e sugere o envolvimento do receptor D2, mas não o D1, no estriato dorso-lateral na
modulação da percepção nociceptiva (MAGNUSSON, FISHER, 2000). Antagonistas
95
preferenciais para receptor D2 atenuam os efeitos antinociceptivos do mazindol e cocaína no
teste da formalina (BITTENCOURT, TAKAHASHI, 1997).
Mansikka et al. (2005) demonstraram, que animais “knock-out” para receptor
dopaminérgico D2 apresentam maior sensibilidade à dor produzida por estímulos mecânicos do
que animais que possuem o receptor, reportando assim a participação modulatória da dopamina
no processo de nocicepção. A presença de receptores D2 em áreas do corno dorsal da medula
espinhal, especialmente nas lâminas I, II e VI também evidenciam atuação dopaminérgica no
controle da dor (VAN DIJKEN et al., 1996).
O efeito antinociceptivo do CAT foi testado em animais pré-tratados com
haloperidol, um antagonista dopaminérgico não-seletivo, para a verificação da participação da
via dopaminérgica na ação antinociceptiva do composto. Os resultados sugerem a possível
participação desta via no mecanismo do CAT.
Slaoui et al. (2007) mostraram que a levodopa aumenta o limiar para a dor por calor
ou frio e a tolerância à dor por calor em pacientes com Parkinson. Isso sugere que drogas que
atuem na via dopaminérgica poderiam ter efeito analgésico na dor relacionada com Parkinson.
Um dos sistemas mais estudados quando pesquisa-se o efeito antinociceptivo e/ou
analgésico de fármacos é a via opióide. Continua a ser um dos principais objetivos para quem
estuda a dor chegar a um fármaco com as propriedades terapêuticas do grupo, porém sem os
seus efeitos colaterais, principalmente aqueles observados no uso da droga em processos
dolorosos crônicos, ou seja, a dependência e a tolerância.
O termo opióide é mais abrangente, aplicado a todos os agonistas e antagonistas
com atividade morfino-símile, bem como aos peptídeos opióides naturais e sintéticos
(FILIZOLA et al., 2001). Os ligantes opióides possuem uma variedade de atividades
96
fisiológicas e têm sido extensamente utilizados na medicina, predominantemente no tratamento
da dor. Entretanto, mesmo em doses terapêuticas, os agonistas totais ou parciais dos receptores
opióides podem induzir diversos efeitos adversos como depressão respiratória e o
desenvolvimento de tolerância e dependência (GHARAGOZLOU et al., 2003).
Os principais receptores têm sido rebatizados com as seguintes siglas: OP1 (δ), OP2
(κ) e OP3 (µ), todos pertencentes à família de receptores acoplados à proteína G (STEFANO et
al., 2005). A ativação desses receptores produz diminuição nos níveis de AMPc, aumento da
condutividade do K+, diminuição da condutividade do Ca2+ e inibição da liberação de
neurotransmissores. O principal efeito da ativação dos receptores opióides pela ligação de
drogas agonistas nas lâminas II e V do corno dorsal da medula é a diminuição da liberação dos
neurotransmissores excitatórios (acetilcolina e substância P). A ocupação dos receptores
opióides por um agonista determina alterações na bioquímica intracelular do neurônio, levando
a uma hiperpolarização da membrana com aumento da condutância ao potássio e a inativação
dos canais de cálcio, determinando a diminuição dos neurotransmissores excitatórios
(IMBELLONI, 2001).
As ações antinociceptivas dos agonistas opióides são exercidas tanto no corno
dorsal da medula quanto no tronco encefálico. Na medula espinhal esses peptídeos inibem a
liberação de taquicininas e glutamato nos terminais centrais de aferentes nociceptivos
primários, enquanto que no tronco encefálico estimulam as vias descendentes modulatórias
(noradrenérgicas e serotoninérgicas) na substância cinzenta periaquedutal, pela inibição de
neurônios GABAérgicos inibitórios (ZAKI, BILSKY, 1996).
A morfina, protótipo das drogas opióides, é um agonista µ puro com moderada ação
sobre os receptores κ e δ. O seu uso crônico pode ser acompanhado de vários efeitos adversos,
entre eles, náuseas, vômitos, retenção urinária, miose. Essas manifestações se relacionam com
97
um aumento da atividade catecolaminérgica central e são reduzidas quando seu uso é associado
com antagonistas dopaminérgicos e agonistas α2-pré-sinápticos. Já a naloxona é um potente
antagonista µ, δ e κ. É utilizada principalmente para reverter o efeito tanto de agonistas puros
quanto de agonistas-antagonistas (BARNHART; HUBBEL; MUIR, 2000).
No entanto, ainda não foi encontrado um agente terapêutico que tenha efeitos
parecidos com a morfina, mas que possua menos efeitos adversos. Em nossos resultados
podemos ver que a ativação da via opióide sensível à naloxona provavelmente não está
envolvida na antinocicepção produzida pelo CAT, pois o pré-tratamento com o antagonista não
alterou o padrão comportamental do CAT em modelo de contorções por ácido acético.
Com estes últimos resultados podemos inferir que o CAT além de atuar na via
aferente da nocicepção, provavelmente no terminal nervoso sensitivo, também modula a
informação dolorosa em nível central, através das vias serotonérgica, colinérgica e/ou
dopaminérgica, possivelmente na modulação de mediadores intracelulares (PKC e/ou PKA) em
comum.
Algumas limitações existiram nesse trabalho. Como o tempo de ação da droga, que
é relativamente curto (com efeito até por 4 horas após a aplicação), isso aumentaria o número
de administrações diárias em um tratamento prolongado. E outra limitação foi o fato do
conteúdo gástrico dos animais poderem estar interferindo na absorção da droga. Sabe-se que
entre 12-14 horas de jejum são necessárias para o completo esvaziamento gástrico. Porém, para
evitar estresse excessivo, que poderia interferir no comportamento dos animais, decidiu-se dar
um jejum de apenas 3-4 horas.
Por fim, de acordo com os resultados discutidos, podemos considerar que a melhor
dose para o uso antinociceptivo em camundongos fica na faixa entre 100 e 200 mg/kg, esse
efeito parece ser suficientemente potente para uma administração sozinha diante de um estímulo
98
nociceptivo agudo. Mas não descartamos o efeito benéfico da associação do CAT com outra
drogas antinociceptivas, com a finalidade da diminuição da dose destas.
99
7 CONCLUSÃO
O Acetato de Citronelila foi testado em relação a sua atividade farmacológica em
modelos de nocicepção aguda. Os resultados obtidos neste estudo nos permitem levantar as
seguintes considerações:
• O Acetato de Citronelila possui uma ótima atividade antinociceptiva com
curto período de latência e tempo de ação intermediário, sem interferências
comportamentais nesse efeito;
• É improvável que o Acetato de citronelila atue diretamente sobre TRPV1,
TRPM8, ASIC, K+ATP ou receptores da Bradicinina, provavelmente ele atue
em alguma etapa, a nível intracelular, comum entre eles, possivelmente
através de PKC e PKA;
• O efeito antinociceptivo do Acetato de Citronelila a nível central é
dependente de serotonina, possivelmente na transmissão ou modulação do
impulso nóxico, através de receptores 5-HT1a, 5-HT2, possivelmente na via
modulatória nociceptiva;
• Também, foi apresentado que o Acetato de Citronelila pode agir interferindo
nas vias de neurotransmissão muscarínica ou dopaminérgica;
• O Acetato de Citronelila pode atuar interferindo na cascata inflamatória,
possivelmente diminuindo a sensibilização do nociceptor.
100
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ANEXO A – DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DESTE PROJETO DE PESQUISA PELA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISA ANIMAL - UFC
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