LASSBio-1632: Novo protótipo inibidor de PDE4

Compostos PDE4A PDE4B PDE4C PDE4D

LASSBio-1632 90,4±0,2 22,7±2,4 5,9±2,3 8,8±0,6 LASSBio-448 11,8±1,13 0,9±0,9 21,3±1,3 33,1±1,1 Rolipram 91,0±0,4 52,6±1,2 9,3±1,3 72,9±1,2 Cilomilaste 105,4±5,6 101,1±2,9 116,3±0,0 121±4,1

1 3 5 7

-50

0

50

100

150

Rolipram

LASSBio-1632

LASSBio-448

PDE4A1A

Cilomilast

Compostos (log[nM])%

Ati

vid

ade

de

PD

E4A

1A

Figura 2. Curvas concentração resposta de LASSBio-1632, LASSBio-448 e dos

padrões rolipram e cilomilaste frente a PDE4A.

Figura 3. Estabilidade química de LASSBio-448 e LASSBio-1632. A) em pH

2; B) em pH 7.4.

Tabela 2 – Solubilidade aquosa determinada de

LASSBio-1632, LASSBio-448 e dos padrões rolipram e

cilomilaste.

0 30 60 90 120 150 180 210 2400

20

40

60

80

100

120LASSBio-448

LASSBio1632

Tempo (min)

% d

e R

ecu

per

ação

em

pH

2

0 30 60 90 120 150 180 210 2400

20

40

60

80

100 LASSBio-448

LASSBio-1632

Tempo (min)

% d

e R

ecu

per

ação

em

pH

7.4

CI 50 PDE4A Rolipram = 357,6 nM CI 50 PDE4A Cilomilaste = 2,7 µM CI 50 PDE4A LASSBio-1632 = 477,2 nM

A série de derivados sulfonilidrazônicos funcionalizados foi

planejada a partir da aplicação da estratégia de restrição

conformacional seguida de bioisosterismo não clássico e

simplificação molecular sobre a estrutura do protótipo

antiasmático LASSBio-448 (Figura 1). Os 10 derivados foram

sintetizados em rota linear com bons rendimentos globais (>

50%).

LASSBio-448 O

CH3

OHN

S

CH3

O O

O

O

CH3

Restrição Conformacional

Simplificação MolecularHomologação

O

CH3

ON

NS

CH3

O O

W3

W2 W1R

LASSBio-1632 e análogos

Figura 1. Gênese dos novos candidatos a protótipos de fármacos inibidores

seletivos de PDE-4.

Os 10 derivados foram ensaiados quanto a sua capacidade

de inibir as quatro isoformas da enzima PDE4 (A, B, C e B)

mostrando percentual de inibição variando de 31,5-90,4% a

10μM. LASSBio-1632 apresentou um percentual de inibição

comparável aqueles encontrados para os padrões rolipram e o

fármaco cilomilaste (Tabela 1), destacando-se como o derivado

mais promissor de LASSBio-448 apresentando potência

inibitória de 477,2 nM frente à enzima PDE4A (Figura 2).

Tabela 1 – Percentual de inibição de LASSBio-1632 (10

µM) e LASSBio-448 (10 µM) sobre as isoformas de PDE4

(A, B, C e D).

Composto t 1/2 (min) t 1/2 (h)

LASSBio-448 2310 38,5

LASSBio-1632 419,0 7,0

Tabela 3 – Meia vida (t ½) plasmática de LASSBio-448 e

LASSBio-1632.

Os estudos de estabilidade plasmática foram realizados

utilizando-se plasma de ratos Wistar. O cálculo do tempo de

meia vida foi realizado utilizando-se a expressão: t1/2 =

0,693/a, sendo a inclinação da reta do logaritmo neperiano

da [amostra] vs. o tempo de incubação.

* A solubilidade experimental foi determinada por ultravioleta-UV. Amostras

em tampão aquoso pH 7.4 a 37 ºC por 4h.

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50mAU

306nm4nm (1.00)

1/2

.403

2/5

.685

LASSBio-1632

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

mAU

306nm,4nm (1.00)

1/2

.405

2/3

.137

3/3

.449

4/4

.520

5/5

.689

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min

0

10

20

30

40

50

60

mAU

306nm4nm (1.00)

1/2

.414

2/5

.695

A B C

M2

M1

1632

1632

0 min 120 min 120 min (s/ cofatores)

Tabela 4 – Meia vida (t ½)* microssomal de LASSBio-448

e LASSBio-1632.

Figura 4. Metabolismo microssomal hepático de ratos Wistar machos. A)

tempo 0min na presença de cofatores; B) tempo 120min na presença de

cofatores; C) tempo 120min. Na ausência de cofatores. Aparelho: Shimadzu

– LC20AD; Coluna: Kromasil 100-5 C18 250-4,6 mm; Fase móvel: 70%

ACN, 30% água, 0,1% TFA; Fluxo: 1mL/min; Detector:SPD-M20A (Diode

Array); Comprimento de onda: 306 nm .

* O cálculo do tempo de meia vida foi realizado utilizando-se a expressão:

t1/2 = 0,693/a, sendo a inclinação da reta do logaritmo neperiano da

[amostra] vs. o tempo de incubação.

0 3 9 270

2

4

6

8

Metacolina [mg/mL]

+

+

+ +

* **

*

* **

*

*

Res

istê

ncia

(cm

H2O

.s)/

mL

0 3 9 270

50

100

150

200

250

Metacolina [mg/mL]

+

+

++

* **

**

*

* *

**

* *

**

*

Ela

stân

cia

(cm

H2O

/mL

)

Salina

LPS (25 µg/25 µL)

+ LASSBio-1632 (25 mol/kg)

+ LASSBio-1632 (50 mol/kg)

+ LASSBio-1632 (100mol/kg)

+ Rolipram (100 mol/kg)

Figura 5. Efeito de LASSBio-1632 sobre a função pulmonar de

camundongos desafiados com LPS. (A) resistência das vias aéreas e (B)

elastância pulmonar. Os animais foram tratados 1h antes da instilação com o

LASSBio-1632 por via oral. Os resultados representam média erro padrão

da média (n= 7). +P<0,05 comparado ao grupo salina. *P<0,05 comparado

ao grupo LPS.

Descoberta de um novo protótipo inibidor de PDE4A, de

estrutura química original, ativo por via oral;

O novo protótipo possui estabilidade química em pH 2 e pH

7.4 e estabilidade em plasma de ratos.

1 Soderling, S. H. & Beavo, J. A. Curr. Opin. Cell Biol. 2000, 12: 174-179.

2 Sutherland, E. W. & Rall, T. W. J. Biol. Chem. 1958, 232: 1077-1091.

3 Francis, S. H. et al. Phys. Rev. 2011, 91: 651-690.

4 Undewood, D. C. et al. Pharmacol. Esp. Ther. 1998, 284-420.

5 Madan, A. et al. Xenobiótica. 2007, 37, 736.

A

B

Compostos Solubilidade* (g/L)

Experimental LASSBio-1632 0,2.10-3

LASSBio-448 9,5.10-3

Rolipram 4,4.10-3

Cilomilaste 5,8.10-3 LASSBio-448 LASSBio-1632

t1/2 Microssomal 15,9 min 24 min

Metabol. CYP450 sim sim

A B