UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE

CIÊNCIAS DA SAÚDEPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM

CIÊNCIASFARMACÊUTICAS

SÍNTESE, COMPROVAÇÃO ESTRUTURAL,

MODELAGEMMOLECULAR E AVALIAÇÃO DA

ATIVIDADEANTIINFLAMATÓRIA DE NOVOS

DERIVADOSTIAZOLIDÍNICOS

CLEITON DINIZ BARROS

RECIFE – 2008

Cleiton Diniz Barros

SÍNTESE, COMPROVAÇÃO ESTRUTURAL,

MODELAGEMMOLECULAR E AVALIAÇÃO DA

ATIVIDADEANTIINFLAMATÓRIA DE NOVOS

DERIVADOSTIAZOLIDÍNICOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro

de Ciências da Saúde da Universidade Federal de

Pernambuco, para obtenção do título de mestre em

Ciências Farmacêuticas na área de Planejamento e

Síntese de Fármacos.

ORIENTADORA:Profa. Dra. Maria do Carmo Alves de Lima

CO-ORIENTADORA:Profa. Dra.Teresinha

Gonçalves da Silva

Barros, Cleiton Diniz Síntese, comprovação estrutural, modelagem molecular e avaliação da atividade

antiinflamatória de novos derivados tiazolidínicos / Cleiton Diniz Barros. – Recife : O Autor, 2008. xvii, 102 folhas. Il: fig., gráf., tab., esquemas Dissertação

(mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.

Inclui bibliografia e anexo.

1. Tiazolidínicos – Ação antiinflamatória. I. Título.

615.03 CDU (2. ed) UFPE 615.1 CDD (22.ed.) CCS2008-061

‘’Há que tornar a ungir os cavalos guerreiros e levar a luta até ao fim; porque quem nunca

descansa, quem com o coração e o sangue pensa em conseguir o impossível, esse triunfa’’

(I Ching)

DEDICATÓRIA

A Deus, por ser o sustentáculo de todas as horas, e por proporcionar todos os meus dias,

para que eu possa alcançar todos os meus objetivos.

Aos meus pais, Joaquim Cícero Diniz Barros e Clara Valgueiro Diniz Barros, por tudo o

que me proporcionaram: amor, formação intelectual, mas principalmente tudo de melhor

que o seio familiar pode proporcionar a minha formação como pessoa.

A Danielle Terto, minha namorada, pela sua compreensão, ajuda, incentivo e

companheirismo a cada novo desafio.

Aos meus avós, pelos exemplos de dignidade, simplicidade e sabedoria. AGRADECIMENTOS

À Professora Maria do Carmo Alves de Lima, do Laboratório de Planejamento e Síntese de

Fármacos do Departamento de Antibióticos – GPIT/UFPE, pela orientação, incentivo e

amizade em todos os momentos;

Ao Professor Ivan da Rocha Pitta, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos

do Departamento de Antibióticos – GPIT/UFPE, por seu exemplo de profissionalismo e

vida acadêmica empenhados no desenvolvimento do patrimônio científico nacional;

À Professora Suely Lins Galdino, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos

do Departamento de Antibióticos – GPIT/UFPE, pelo exemplo de patriotismo e

regionalidade, sempre buscando e incentivando a nossa região;

À Professora Terezinha Gonçalves da Silva, por sua contribuição como co-orientadora e na

realização dos testes para avaliação da atividade antiinflamatória dos produtos sintetizados;

À Professora Lúcia Fernanda Cavalcanti Costa, por suas contribuições na realização dos

estudos computacionais de “docking” com os compostos submetidos a avaliação da

atividade antiinflamatória;

A Ricardo de Oliveira e Eliete Barros, da Central Analítica do Departamento de Química

Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco, pela realização dos espectros de

infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio;

Aos colegas da pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, pelos momentos

compartilhados;

A todos os colegas do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos, pelo incentivo e

colaboração no desenvolvimento deste trabalho;

À minha família, pelo amor, apoio e compreensão essenciais em todas as etapas deste

trabalho.

A todos aqueles não mencionados, cuja colaboração mostrou-se essencial na realização

deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS x

LISTA DE TABELAS E ESQUEMAS xiii

LISTA DE

GRÁFICOS xiv

LISTA DE ABREVIATURAS xv

RESUMO xvi

ABSTRACT xvii

1.

INTRODUÇÃO 18

2. OBJETIVOS 21

2.1. Geral 22

2.2. Específicos 22

3. REVISÃO DA

LITERATURA 23

3.1. Processo inflamatório 24

3.2. Fármacos antiinflamatórios 28

3.2.1. Glicocorticóides (GC) 28

3.2.2. Antiinflamatórios não-esteroidais (AINES) 30

3.2.3. Receptores ativadores da proliferação dos peroxissomos (PPARs) 36

3.2.3.1. PPAR38

3.2.3.2. PPAR39

3.2.3.3. PPAR 39

3.3. O planejamento racional na obtenção de novos fármacos 40

3.4. Atividades biológicas reportadas ao núcleo tiazolidínico 46

4. ESTUDO QUÍMICO 51

4.1. A química das tiazolidina-2,4-dionas 52

4.2. Material e métodos 53

4.3. Mecanismos e rota sintética 55

4.3. Metodologias de síntese 57

4.3.1. Síntese da tiazolidina-2,4-diona 57

4.3.2. Síntese da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA e LPSF/GQ) 58

4.3.3. Síntese dos ésteres de Cope (LPSF/IP) 58

4.3.4. Síntese da 5-arilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA e 58 LPSF/GQ)

4.4. Resultados e discussão 59

4.4.1. Resultados espectroscópicos 59

4.4.1.1. 5-(5-Bromo-2-metoxi-benzilideno)-3-(3-

cloro-benzil)-tiazolidina-59 2,4-diona (LPSF/TA-01)

4.4.1.2. 3-(3-Cloro-benzil)-5-(4-metanosulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-60 diona

(LPSF/TA-02)

4.4.1.3. 5-Bifeni-4-il-metileno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona 60 (LPSF/TA-03)

4.4.1.4. 5-(3-Bromo-4-metoxi-benzilideno)-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-61 diona

(LPSF/TA-04)

4.4.1.5. 3-(3-Cloro-benzil)-5-(9H-fluoreno-2-il-metileno)-tiazolidina-2,4-62 diona

(LPSF/TA-05)

4.4.1.6. 3-(3-Cloro-benzil)-5-(4-metoxi-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona 62

(LPSF/TA-06)

4.4.1.7. 3-(2-Bromo-benzil)-5-(4-metanosulfonil-benzilideno)-tiazolidina-63 2,4-diona

(LPSF/GQ-58)

4.4.1.8. 3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(4-metil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-63 diona

(LPSF/GQ97)

4.4.1.9. 3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(2,4-dicloro-benzilideno)-tiazolidina-64 2,4-diona

(LPSF/GQ-100)

5. Estudo Biológico 65

5.1. Material e Métodos 66

5.1.1. Materiais 66

5.1.2. Derivados ATZDs testados 67

5.1.3. Animais 67

5.2. Metodologia 68

5.2.1. Air pouch 68

5.3. Resultados e discussão 70

6. Estudo de modelagem molecular 77

6.1. Metodologia 78

6.2. Resultados e discussão 79

7. CONCLUSÕES 84

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 87

9. ANEXOS 103

Lista de Figuras

Figura 1-A figura demonstra o processo de Diapedese, que consiste na migração celular do

25vaso para o interstício (LEY et al., 2007)Figura 2-Síntese dos derivados do acido

araquidônico, onde o (x) sobre as setas 27representam a sua inibição (DUBOIS et al., 1998)

Figura 3 – Glicocorticóides 29Figura 4 -Resumo do mecanismo genômico e não-genômico

da ação do glicocorticóide 30(GC): glicocorticóides são lipofílicos e atravessam a

membrana plasmática facilmente eligam ao cGCR, que mediam o mecanismo genômico (I)

e efeito não-genômico(II). Efeitosnão-genômicos sobre receptores de membrana (III) e

através de interações com membranascelulares (IV) (STAHN et al., 2007)Figura 5–

Diferenças entre os sítios de ligação das enzimas COX-1 e COX-2 (FLOWER,

332003)Figura 6 -Licofelone (ML3000) 35Figura 7 – Ativação de PPARS (MORAES et

al., 2006) 36Figura 8 – Ligantes naturais do PPAR 37Figura 9 – Efeitos dos ligantes sobre

os PPARs (ESTRAUS e GLASS, 2007) 40Figura 10 – Lei do deslocamento de hidrogênio

(LIMA e BARREIRO, 2005) 41

Figura 11 – Bioisosterismo de AINES 42Figura 12– Exemplo de bioisosterismo, com

moléculas inibidoras da COX-2 43Figura 13-Bioisosterismo entre anéis 44Figura 14 -

Tiazois, isotiazois, tiadiazois, imidazois, e derivados oxazolonicos (LEVAL et 44al.,

2000)Figura 15 – Em roxo derivado da 4-tiazolidinona em verde coxibi SC-558, dock na

COX-2 45(OTTANÀ et al., 2005)

Figura 16-Tiazolidina-2,4-diona 45

Figura 17-Bioisósteros das tiazolidinas 46Figura 18 – Derivados LPSF/CR e LPSF/RA com

ação antimicrobiana (ALBUQUERQUE 46et al., 1999)

Figura 19-Derivado tiazolill-tiazolidina-2,4-diona (BOZDAG-DUNDAR et al., 2007)

47Figura 20-TZDs hipoglicemiantes 47

Figura 21-Interações do derivado 5-(4-metóxi-arilideno)-3-(4-metil-

benzil)-tiazolidina-2,4-48 diona (LPSF/GQ-5) no PPAR (LEITE et

al., 2007) Figura 22-Derivado 5-(5-bromo-2-metoxi-benzilideno)-3-

(4-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-48 diona (LPSF/LYSO-4)

(SANTOS et al., 2005) Figura 23 – Derivado 5-(4-metil-sulfonil-

benzilideno)-3-(4-nitro-benzil)-tiazolidina-2,4-49 diona (LPSF/SF-

23) Figura 24-Composto LPSF/SF-13 (roxo) sobreposto a

roziglitazona (azul) no estudo de 49 “docking” Figura 25-Formação

da ligação de hidrogênio do composto LPSF/GQ-24 (azul) e o GW

50 409544 (verde) no sítio ativo do PPAR Figura 26 – Síntese da

tiazolidina (HEINTZ, 1865 apud ELDERFIELD, 1957) 52 Figura

27 – Síntese de BOHEN e JOULLIÉ (1973) 52 Figura 28 – Síntese

de MONFORT (1979) 53 Figura 29 – Síntese de SINGH (1981) 53

Figura 30 – Substituição na posição 5 do anel heterocílico 53 Figura

31 -Substituição na posição 5 do anel heterocílico com ésteres

cianocinâmicos( 53 DABOUN et al., 1982 apud MOURÃO et al.,

2005) Figura 32 – substituição na posição 3 do anel heterocílico 54

Figura 33-(A) Camundongo sem tratamento, (B 1-2) Administração

de ar estéril 69 intradérmica (air pouch), (C) Administração por via

oral dos compostos testados, e (E) Injeção da carragenina 1% no

bolsão de ar Figura 34 -(E) Lavagem do bolsão com EDTA 0,1% e

(F) Coleta do exsudato com seringa 70 estéril Figura 35-

Substituições no anel benzílico dos derivados LPSF/TA-02,

LPSF/TA-03, 72 LPSF/TA-05 e LPSF/GQ-58 Figura 36 -

Substituições no anel benzílico dos derivados LPSF/GQ-97 e

LPSF/GQ-100 73 Figura 37-Substituição no anel benzilidênico por

um grupamento fenil em posição para 74 Figura 38 -Substituição

no anel benzilidênico em posição para por um grupamento 4-75

SO2CH3 Figura 39 – Ligante BRL-49653 (Rosiglitazona)

interagindo com os aminoácidos no sítio 79 ativo Figura 40 –

Ligantes Rosiglitazona (cor verde) e LPSF/GQ-58 (cor cinza)

interagindo com 80 os aminoácidos no sítio ativo Figura 41 – Ligantes Rosiglitazona (cor verde) e LPSF/TA-2 (cor cinza) interagindo com os

80

aminoácidos no sítio ativo Figura 42 – Ligantes Rosiglitazona (cor verde) e LPSF/TA-1 (cor cinza) interagindo com os 81

aminoácidos no sítio ativo

Lista de Tabelas e Esquemas Lista de Gráficos

Tabela 1 – Inibidores não seletivos para as cicloxigenases 32 Tabela 2 – Atividade antiinflamatória apresentada pelos derivados das séries LPSF/TA e 71

LPSF/GQ com respectivas doses em mg/Kg de peso corpóreo do camundongo. Os valores

apresentados são significativos para o intervalo de confiança de 95% (ANOVA, teste de

Bonferrori)

Tabela 3 – Resultados de “docking” dos ligantes das séries LPSF/TA,

LPSF/GQ e 82

BRL49653 e calor de formação dos isômeros configuracionais Z e E

Esquema 1 – Rota sintética para obtenção dos novos derivados ATZDs 55

Esquema 2 -Mecanismo reacional da condensação de Knoevenagel para obtenção dos 56

ésteres cianocinâmicos

Esquema 3 -Mecanismo reacional de formação dos derivados 5-arilideno-3-benzil 57

tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA e LPSF/GQ) Gráfico 1-% de inibição da migração de leucócito polimorfonucleares (LPMN) para o teste

72

de air pouch dos derivados LPSF/TA-02, LPSF/TA-03, LPSF/TA-05 e LPSF/GQ-58 Gráfico 2-% de inibição da migração de leucócito polimorfonucleares (LPMN) para o teste 73

do bolsão de ar na dose de 3mg/kg, dos derivados LPSF/GQ-97 e LPSF/GQ-100

Gráfico 3-% de inibição da migração de leucócitos polimorfonucleares (LPMN) dos 74 derivados LPSF/TA-01, LPSF/TA-02, LPSF/TA-03 e LPSF/GQ-58, nas doses de 3 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,03 mg/kg

Gráfico 4-% de inibição da migração de leucócitos polimorfonucleares (LPMN) do 75

derivado LPSF/TA-03, nas doses de 3 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,03 mg/kg

Gráfico 5-% de inibição da migração de leucócitos polimorfonucleares (LPMN) do 76

derivado LPSF/GQ-58, nas doses de 3 mg/kg, 0,3 mg/kg e 0,03 mg/kg, em relação aos

padrões piroxicam e rosiglitasona Gráfico 6 -Resultados dos cálculos do Docking e a % de Inibição 82 LISTA DE ABREVIATURAS

ATZDs Arilidenos-tiazolidina-2,4-dionas 5-LOX 5-Lipoxigenase

AA Ácido araquidônico

COX Ciclooxigenase D Dubleto AINEs Droga antiinflamatória não-esteroidal

Dd Duplo dibleto DMSO-d6 Dimetilsulfóxido duterado

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

GPIT Grupo de Pesquisa em Inovação Terapêutica (GPIT) / UFPE

IFN γ Interferon γ IL Interleucina iNOS Óxido nítrico sintase induzida

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento LTs Leucotrienos LPSF Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos

M Multipleto PGs Prostaglandinas PLA2 Fosfolipase A2

P.M. Peso Molecular PMN Neutrófilos polimorfonucleares

PPARs Receptor proliferador-ativador de peroxissomos R.f. Razão de frente RMN’H Ressonância magnética nuclear

S Singleto Ser Serina T Tripleto

TXA2 Tromboxano A2

TZDs Tiazolidinadionas

RESUMO

Entre as patologias em que o processo inflamatório participa merecem realce a artrite

reumatóide, a pancreatite aguda e o câncer, onde este último pode ser originado por uma

inflamação crônica. Alguns mediadores inflamatórios se sobressaem nessas enfermidades,

como TNF-α, iNOS, e NF-kB que são devidamente modulados pelo PPARs (Receptores

ativadores da proliferação de peroxissomos). A necessidade de novos fármacos

antiinflamatórios com menos efeitos adversos direcionam estudiosos a intensificar as

pesquisas para a descoberta de novos compostos. Os dados encontrados na literatura

demonstram as tiazolidinadionas como ligantes sintéticos dos PPARs e, por esta razão

possuem atividade inibidora da inflamação. Com esse propósito, e dando continuidade aos

trabalhos realizados no Laboratório de Síntese e Planejamento de Fármacos

(LPSF/GPIT/UFPE), foram sintetizados novos compostos arilideno-tiazolidina-2,4-dionas

(ATZDs) das séries: 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ), 5-

benzilideno-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-

(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA). A síntese foi realizada partindo-se da

tiazolidina-2,4-diona. Os derivados ATZDs sintetizados foram obtidos por reações de N-

alquilação em posição 3 da tiazolidina-2,4-diona, e por reações de adição de Michael, em

posição 5. As estruturas químicas dos compostos ATZDs sintetizados foram devidamente

comprovadas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio,

infravermelho e espectrometria de massas. Também foi realizada a avaliação da atividade

antiinflamatória pelo método experimental in vivo do air pouch induzido por carragenina,

nas doses de 0,03, 0,3 e 3 mg/Kg. O estudo de docking realizado na proteína PPARγ,

utilizando o programa FlexX 7.2, sugere que os derivados ATZDs em estudo apresentam

ação agonista no PPARγ. Foi observado que os derivados 3-(2-bromo-benzil)-5-(4-

metilsulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-58) e 3-(3-cloro-benzil)-5-(4-

metilsulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-02), e 5-Bifeni-4-il-metileno-3-

(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-03), que apresentaram os melhores

resultados de inibição antiinflamatória, como também melhores resultados de docking no

PPARγ. Palavras-chave: Tiazolidinas; Antiinflamatório; Síntese orgânica

ABSTRACT

Among the pathology that the involved inflammatory process deserves the outstanding

rheumatoid arthritis, cancer and acute pancreatitis, where the latter can be originated by a

chronic inflammation. Some inflammatory mediators are observed from these diseases,

such as TNF-α, iNOS, and NF-kB that are properly modulated by PPARs (Peroxisome

proliferator-activated receptors). The need for new antiiflammatory drugs with lower

adverse effects directed researchers to intensify the research for the discovery of new

compounds. The datas found in the literature demostrated the TZDs as synthetics ligands of

PPARs and therefore, they have inhibitory activity of inflammation. With this purpose,

giving continuity to the work accomplished in the laboratory of Synthesis and Planning

Drugs (LPSF / GPIT / UFPE), we synthesized new compound arylidene-thiazolidine-2,4-

diones (ATZDs) of the series: 5-benzylidene-3-(2-bromo-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione

(LPSF/QG), 5-benzylidene-3-(3-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione (LPSF / TA). Based

on TZD, the derivatives synthetized were obtained by N-alkylation reactions in position 3

of TZD, and by Michael addition reaction in the position 5. The chemical structures of the

synthesized compounds were properly confirmed by the nuclear magnetic resonance

spectroscopy of hydrogen (NMR 1

H), infrared and mass spectrometry. Also, the

antiinflamatory activities were evaluated by the experimental method in vivo, air pouch

induced by carrageenan, at doses of 0.03,

0.3 and 3 mg / kg. The conformational structure of the representatives of the series LPSF /

TA and LPSF / GQ, was via "docking", and their interaction was observed in the

Peroxisome proliferator-activated receptors of the gama type (PPAR γ). We observed that

the derivatives 3-(2-bromo-benzyl)-5-(4-methylsulfonyl-benzylidene)-thiazolidine-2,4-

dione (LPSF/GQ-58), 3-(3-chloro-benzyl)-5-(4-methylsulfonyl-benzylidene)-thiazolidine-

2,4-dione (LPSF/TA-02) and 5-Bipheny-4-ylmethylene-3-(3-chloro-benzyl)-thiazolidine-

2,4-dione (LPSF/TA-03) that presenting the best antiinflamatory activity, present too the

best docking results in the PPARγ. Key-words: TZDs; Antiinflamatory; Organic synthesis

1. Introdução

Os antiinflamatórios não-esteróides (AINEs) integram o grupo dos fármacos mais

comumente prescritos em todo o mundo e estão entre os mais utilizados nas práticas de

automedicação. Nos Estados Unidos, respondem por mais de 70 milhões de prescrições e

mais de 30 bilhões de comprimidos de venda livre comercializados anualmente. No Brasil,

diferentes estudos de utilização de medicamentos situam os AINEs entre os mais utilizados

pela população (RIBEIRO et al., 2005).

A principal limitação dos fármacos antiinflamatórios não esteróides (AINEs)

clássicos reside na incidência de efeitos gastro-irritantes e, menos freqüentemente, nefro-

tóxicos, resultantes do mecanismo de ação desta classe de agentes terapêuticos que atuam

inibindo a biossíntese de prostaglandinas ao nível da enzima prostaglandina-endoperóxido

sintase (PGHS). O reconhecimento das diferenças morfofisiológicas entre as duas isoformas

de PGHS, sendo a forma constitutiva (PGHS-1) relacionada aos efeitos secundários dos

AINEs-clássicos e a segunda isoforma, mais recentemente descoberta (PGHS-2), a

induzida, permitiu se prever a possibilidade do desenvolvimento de inibidores seletivos da

PGHS-2, como estratégia para se obter efeito antiinflamatório desprovido de efeitos

colaterais indesejáveis (LAGES et al., 1998).

Recentemente, o papel fisiológico das tiazolidinas-2,4-dionas foi destacado em

estudos que mostraram a participação dos receptores ativadores da proliferação dos

peroxissomos (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPARs) no controle da

inflamação, especialmente na modulação da produção de mediadores inflamatórios

(BOKYUNG et al., 2006). Os dados encontrados na literatura revelaram as

tiazolidinadionas (TZDs) como ligantes sintéticos dos PPARs e, por esta razão possuem

atividade inibidora da inflamação. Todas as isoformas dos PPARs podem participar na

modulação da resposta inflamatória. Estes receptores nucleares de hormônio têm um papel

importante na intensidade, na duração e conseqüências de eventos inflamatórios, as suas

principais formas são PPARα e PPARγ. O PPARα pode controlar a resposta inflamatória

através da indução da expressão dos genes, produzindo proteínas que estão envolvidas no

catabolismo de mediadores lipídicos pro-inflamatórios. O PPARγ atua no controle da

inflamação, modulando a produção de mediadores inflamatórios, tais como

o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina-1b (IL-1b), IL-6 (MORAES et al.,

2006).

Outro fato importante foi a diversidade de atividades biológicas atribuídas aos

derivados da tiazolidina-2,4-diona (TZD), como por exemplo, os resultados animadores

obtidos no desenvolvimento de derivados tiazolidínicos candidatos a fármacos

antidiabéticos (MOURÃO, 2005), antimicrobianos (ALBUQUERQUE et al., 1999) e

antiinflamatórios (UCHOA, 2004; SANTOS et al., 2005; COUTO, 2006), fato que nos

motivou a utilizá-la como protótipo na obtenção de novas arilideno-tiazolidina-2,4-dionas

(ATZDs) das séries 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ), 5-

benzilideno-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-

(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA).

O presente trabalho teve como metas a descrição da síntese, a comprovação

estrutural dos novos derivados ATZDs, alem da modelagem molecular e avaliação da

atividade antiinflamatória através do protocolo experimental de air pouch induzida por

carraginina, onde foi possível analisar a contribuição dos substituintes bromo, cloro, fenil,

flúor, metóxi, metil e metilsulfonil nas novas ATZDs.

2 Objetivos

2.1 Geral

Contribuir na pesquisa de novos agentes antiinflamatórios através do planejamento

racional utilizando como protótipo a tiazolidina-2,4-diona, objetivando a síntese de

potenciais agentes terapêuticos com menor toxicidade.

2.2 Específicos

Obter novos derivados arilideno-tiazolidinônicos (ATZDs) das séries 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ), 5-benzilideno-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA), por meio de reações de N-alquilação e adição de Michael, utilizando haletos de benzila e ésteres cianocinâmicos substituídos; Comprovar estruturalmente as novas ATZDs sintetizadas pelos métodos espectroscópicos de infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas; Avaliar a ação antiinflamatória das novas ATZDs das séries 5-benzilideno-3-(2-

bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ), 5-benzilideno-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA) no modelo experimental air pouch induzido por carragenina; Analisar a estrutura conformacional dos representantes das novas ATZDs, pelo método AM1; e realizar o estudo de docking na proteína PPARγ, utilizando o programa FlexX 7.2.

3 Revisão da literatura

3.1. Processo inflamatório

O correto desempenho das funções dos tecidos como um todo é indispensável para o

bom funcionamento do organismo. Quando os tecidos são lesionados por dano físico ou são

infectados através de microorganismos exógenos, no local são ativadas respostas sistêmicas

com objetivos singulares de eliminar rapidamente os fatores causadores do estresse

tecidual. Estes restabelecem a integridade do tecido, e retêm informações sobre o agente

agressor. O resultado desta resposta é uma reação fisiológica do corpo para o dano e a

infecção, chamada inflamação.

Sendo assim, a inflamação é um processo complexo e dinâmico iniciado pelo corpo

em resposta ao ferimento ou à infecção do tecido. A via clássica prossegue através da

liberação seqüencial de mediadores. Isso conduz à vaso dilatação, aumento do fluxo

sanguíneo e da permeabilidade vascular, produzindo a acumulação de fluido (exudato) no

interstício. A ativação de neurossensores causa dor às fibras que resultam nos sinais

clássicos e agudos da inflamação: calor, rubor, edema e dor, levando a perda da função

(VANE e BOTTING, 1998).

A resposta inflamatória é composta de um grande número de mediadores químicos,

células e mudanças fisiológicas que permitem a migração de leucócitos para o tecido lesado

ou infectado. A migração efetiva de leucócitos, em particular os linfócitos, do sangue para o

tecido, chamada diapedese, é regulada pela síntese de mediadores, que proporcionam a

exudação de soro, proteínas e fatores de coagulação dos vasos sanguíneos. Um verdadeiro

complexo multifatorial com o propósito de remover tecido lesionado e microorganismos

através de fagocitose, que é o mecanismo central da inflamação (BANNENBERG et al.,

2007).

Em uma resposta inflamatória aguda típica, ocorre um aumento inicial na exudação

de proteínas, leucócitos polimorfonucleares, que acumulam-se no tecido. Este mecanismo

inicia-se com a adesão dos leucócitos às células do endotélio vascular e posterior migração

para os tecidos por diapedese. Nesse tipo de inflamação os fagócitos liberam substâncias

imunomoduladoras e mediadores de proteção ao tecido (Figura 1) (LEY et al., 2007).

Figura 1-A figura demonstra o processo de Diapedese, que consiste na migração celular do vaso para o

interstício (LEY et al., 2007)

Níveis elevados nos tecidos de TNFα, IL-1, IL-6, mediadores lipídicos e os

eicosanóides, tais como prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos, e lifocinas, estão

envolvidos em uma variedade de respostas fisiológicas. Geralmente, a inflamação aguda é

associada a níveis elevados de células polimorfonucleadas, particularmente neutrófilos,

visto que a inflamação crônica ou imune adaptável, tem níveis mais elevados de células

mononucleares, macrófagos, linfócitos T e B (MADDOX e SCHWARTZ, 2002).

O envolvimento de outros mediadores como AMPc, cujo catabolismo é governado

pelas fosfodiesterases (PDE's), pela citocina pró-inflamatória interleucina-1 e 10 (IL-1, IL-

10) e pela 5-lipoxigenase (5-LOX), outra enzima oxidativa da cascata do ácido

araquidônico, a qual compete com a PGHS para produzir os leucotrienos (LT's),

representam alvos adequados para o tratamento de quadros inflamatórios. Os leucotrienos,

por exemplo, apresentam propriedades quimiotáteis para neutrófilos e outras células

sanguíneas com atividade proteolítica, participam da fisiopatologia da inflamação e

representam alvos terapêuticos atraentes para o tratamento de doenças inflamatórias,

incluindo asma e alergia (BARREIRO et al., 2002).

Sabe-se que as prostaglandinas têm contribuição na dor, na inflamação, na doença

reumática, na citoproteção gastrintestinal, na manutenção do fluxo renal e do sangue,

garantindo a hemostasia, e é através da inibição de sua síntese que centraliza a ação dos

antiinflamatórios (Figura 2) (DUBOIS et al., 1998).

Figura 2-Síntese dos derivados do acido araquidônico, onde o (x) sobre as setas representam a sua inibição

(DUBOIS et al., 1998)

27

3.2. Fármacos antiinflamatórios

3.2.1. Glicocorticóides (GC)

Os glicocorticóides (GCs) são, com sucesso, usados no tratamento de uma extensa

gama de doenças inflamatórias e reumáticas. Clinicamente é observado seus efeitos

imunossupressores sobre células imunes primárias e secundárias, tecidos e órgãos, agindo

como antiinflamatório e antialérgico (STAHN et al., 2007).

A forma inativa do glicocorticóide cortisol, denominada cortisona, foi isolada nos

anos 1936–1940, e sintetizada por Reichstein em 1937/1938. Aproximadamente 10 anos

depois, foram introduzidos glicocorticóides na clínica médica e desde então foram usados

no tratamento de inúmeras doenças. Mas ao mesmo tempo, o potencial destas drogas veio

acompanhado por graves e, algumas vezes, irreversíveis efeitos colaterais, como diabetes

mellitus, úlcera péptica, síndrome de Cushing com supressão do eixo hipotálamo-hipófise-

adrenal, osteoporose, atrofia cutânea, psicose, glaucoma, entre outras. Desta forma, o uso

dos GCs ficou limitado por estes efeitos colaterais (SCHACKE et al., 2004).

Visando minimizar estes efeitos, foram sintetizados os novos agentes

glicocorticóides nas décadas de 1950 e 1960, como por exemplo Prednisona e

metilprednisona, que têm efeitos antiinflamatórios e imunossupressores mais fortes, e

menores efeitos colaterais. Outros exemplos para drogas sintéticas são a dexametasona e

betametasona (Figura 3). Outro avanço foi a via de administração destas drogas na

inflamação, como por exemplo a inalação no caso da asma, aplicação tópica para eczema e

no caso de doenças reumáticas de injeção intra-articular. Apesar dos glicocorticóides serem

drogas relativamente baratas, todo esforço para melhorar o tratamento com os

glicocorticóides são insuficientes, pois estas drogas levam a riscos significantes, podendo

causar aumento da suscetibilidade a infecções e resistência ao tratamento (ADCOCK e

LANE, 2003, WIKSTROM, 2003, SCHACKE et al., 2002).

Figura 3 – Glicocorticóides

Para aperfeiçoar a relação risco/beneficio, é importante entender melhor os

mecanismos subjacentes de ação dos glicocorticóides. Inúmeros estudos mostraram que as

atividades podem ser divididas em efeitos genômicos, mediados pelo receptor

glicocorticóide citosólico alfa (cGCR), e não-genômicos, com efeitos diferentes. As

atividades não-genômicas podem ser classificadas de três modos: efeitos não-genômicos

mediados por cGCR; efeito não especifico (por exemplo, interações físico-químicas com a

membrana em concentrações elevadas); e efeitos através de receptores de glicocorticóides

na membrana (Figura 4 ) (STAHN et al., 2007).

Figura 4 -Resumo do mecanismo genômico e não-genômico da ação do glicocorticóide (GC): glicocorticóides

são lipofílicos e atravessam a membrana plasmática facilmente e ligam ao cGCR, que mediam o mecanismo

genômico (I) e efeito não-genômico(II). Efeitos não-genômicos sobre receptores de membrana (III) e através

de interações com membranas celulares (IV) (STAHN et al., 2007).

3.2.2. Antiinflamatórios não-esteroidais (AINES)

Conhecidos pela humanidade há cerca de 100 anos, os compostos antiinflamatórios

não esteróides (AINES) estão entre os agentes farmacológicos mais utilizados na prática

médica. Estes agentes são amplamente utilizados no tratamento da inflamação. Contudo

possuem efeitos adversos como o dano à mucosa gástrica, prolongamento de hemorragias, e

falência renal. Apresenta um amplo espectro de indicações terapêuticas, como analgésico,

antiinflamatório, antipirético e profilaxia contra doenças cardiovasculares (ZIAKAS et al.,

2006).

Em 1844, foi isolado o ácido salicílico do óleo de gaultéria, por Cahours. Já em

1893, o químico alemão Felix Hoffman motivou a Bayer a produzir o ácido acetilsalicílico,

patenteado como a aspirina. Desde então os agentes antiinflamatórios não esteroidais

(AINE) passaram a ser os fármacos mais largamente prescritos e usados em todo o mundo

(DUBOIS et al., 1998).

Contudo, apesar do largo uso desses agentes, o seu mecanismo de ação somente foi

esclarecido em 1971, quando John Vane propôs que os antiinflamatórios semelhantes à

aspirina suprimem o processo inflamatório pela inibição da ciclooxigenase (COX),

impedindo assim a síntese de prostaglandinas (VANE, 1971).

Os mecanismos de ação dos fármacos não-esteroidais na inflamação é através da

inibição das ciclooxigenases (COXs), que estão envolvidas na formação das

prostaglandinas e dos tromboxanos derivados de ácido araquidônico (AA) nas membranas

celulares (VANE et. al., 1996, FURST, 1999). Entretanto, tem se observado que inibindo a

COX pode-se desviar o metabolismo do AA para a via da 5-lipoxigenase (5-LOX)

(ASAKO et. al., 1992), aumentando a formação de leucotrienos, induzindo aos efeitos

adversos dos antiinflamatórios, como é o caso da asma e dos danos gastrintestinais, que são

os efeitos colaterais de maior incômodo (SPANBROEK et. al., 2003).

Exemplos dos principais AINES prescritos na clinica médica, inibidores da COX

são mostrados na (Tabela 1) (LAGES et al., 1998; FLOWER, 2003). Tabela 1 – Inibidores não seletivos para as cicloxigenases

Classe química Salicilatos Composto Ácido

acetilsalicílico

Derivados do p-aminofenol Paracetamol

Ácido indolacético Indometacina

Ácidos heteroaril acéticos Diclofenaco

Ácidos arilpropiônicos Ibuprofeno

Naproxeno

Ácidos enólicos Piroxicam

Meloxicam

Alcanonas Nabumetona Estrutura Química

CO OH

O

O

H N OH O

O CH2COH CH3O

CH3 N C Cl O

O HOCCH2 Cl

NH

Cl

CH3

CH3 CH

3CHCH

2 CHCOOH

CH3 CHCOOH CH3O

OO S N CH3

CONHOH N

OO S CH3

NH N S CH

3

C OH O N

O

CH 2CH2CCH3

CH 3O

A classificação da COX atualmente reconhece as enzimas COX-1, como

constitutiva, e COX-2, como forma induzida. A COX-1 é encontrada em plaquetas

sanguíneas, onde é essencial para síntese de tromboxano A2. A inibição pela ação dos

fármacos sintéticos da síntese de tromboxano conduz a uma diminuição da agregação

plaquetária. A ativação de COX-1 conduz à produção de prostaciclinas que quando

liberadas pelo endotélio são anti-trombogênica e quando liberadas pela mucosa gástrica são

citoprotetora. Esta citoproteção estende-se tanto para substâncias exógenas como para

endógenas, como o suco gástrico. A inibição de produção de prostaglandinas gástricas é

considerada a causa mais freqüente de efeitos colaterais dos AINES, que são: ulceração

gástrica, sangramentos e perfuração da mucosa (Figura 5) (LICHTENSTEIN et al., 1995).

No rim, as prostaglandinas influenciam em várias funções como o fluxo de sangue

renal total, incluindo a distribuição renal do fluxo sanguíneo, reabsorção de sódio e água e

secreção de renina. Estas funções, com a possível exceção de secreção de renina, são

dependentes da ativação da COX-1. Secreção de renina é dita como atividade da COX-2, os

efeitos renais não desejados do uso de AINES são reduções de taxa de filtração de

glomerular e excreção de sódio e água. Estes efeitos podem conduzir clinicamente a vários

problemas pertinentes em pacientes, incluindo-se insuficiência renal aguda e hipertensão

(FROLICH, 1997; SAKYA et. al., 2006).

A COX-2 é encontrada em pequenas quantidades nos pulmões e rins, e a maioria de

suas atividades é resultado da indução inflamatória. Enquanto a COX-1 pode mudar sua

expressão, isto é, sua atividade pode aumentar de 2 a 3 vezes, a COX-2 pode aumentar mais

de 20 vezes durante a reação inflamatória. Poderosas endotoxinas induzem a COX-2 em

monócitos e em macrófagos alveolares. A íntima ligação entre a resposta inflamatória e a

indução da COX-2 é evidente quando se usa citocinas pró-inflamatórias como o interferon

gama (INF-γ) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), que induzem a COX-2 em

macrófagos, enquanto citocinas antiinflamatórias como a interleucina 10 (IL-10) diminuem

a expressão da COX-2. IL-1a, IL-1b e TNF−α, induzem a COX-2 em células endoteliais.

Células sinoviais produzem IL-1a que também é induzida pela COX-2, este um importante

alvo no combate a doenças reumáticas (CROFFORD et al., 1994).

A expressão de uma terceira variante catalítica da COX (COX-3) foi demonstrada

em estudos in vitro com linhagens de macrófagos. A singularidade é que a expressão desta

variante não originaria prostaglandinas pró-inflamatórias, mas um membro da família das

ciclopentanonas, a 15 desoxe-∆PGJ2, agonista dos receptores ativadores de proliferação do

peroxissomo (PPARs), com atividade antiinflamatória (CARVALHO et. al., 2004).

Com a retirada do mercado do rofecoxib (Vioxx®) em 2004, devido a seus efeitos

colaterais sobre o sistema cardiovascular, despertou-se a atenção pública sobre a segurança

dos antiinflamatórios não esteroidais seletivos a COX-2. Contudo, o ácido araquidônico

também pode ser metabolizado por lipoxigenases (LOX), principalmente a 5-lipoxigenase

(5-LOX), outro mediador envolvido no processo inflamatório. Por vários anos vem se

pesquisando moléculas que inibam tanto a COX quanto a LOX, principalmente COX-2 e 5-

LOX. Dentre estes inibidores se destaca o licofelone (ML3000) (Figura 6), que se mostrou

eficaz em testes clínicos (NAVEAU, 2005).

O ácido araquidônico pode ser convertido em outro metabólito pelas enzimas

lipoxigenases das quais a mais importante é a 5-lipoxigenase (5-LOX). A 5-LOX é

encontrada em células envolvidas na resposta inflamatória, como neutrófilos, basófilos,

eosinófilos, mastócitos, monócitos, linfócitos B, sinoviócitos. Ela catalisa a conversão do 5-

hidroperoxieicosatetraenoato (5-HPETE), que é instável, em leucotrieno A-4. Este último é

hidrolisado pelo leucotrieno B-4 ou convertido por uma série de reações a cisteinil

leucotrienos LTC-4, LTD-4, e LTE-4 (BONNET et al., 1995).

O leucotrieno B-4 é importante na resposta inflamatória. Seus efeitos incluem

quimiotaxia de neutrófilos, monócitos e linfócitos; aumento da adesão de neutrófilos às

células do endotélio; degranulação de neutrófilos com liberação de enzimas lisossomais;

aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias por macrófagos e linfócitos. Cisteinil

leucotrienos causam espasmo de músculo liso e vaso constrição arteriolar. Inibidores da 5-

LOX podem prevenir o desenvolvimento de úlceras gástricas induzidas por AINES. Duas

enzimas, a 12-lipoxigenase (12-LOX) e a 15-lipoxigenase (15-LOX) asseguram a produção

de lipoxinas, das quais as mais importantes são as lipoxina A-4, lipoxina B-4 e 15-

epilipoxina. As lipoxinas diminuem a habilidade dos neutrófilos de responder a quimiotaxia

e aderir às células endoteliais. Este efeito antiinflamatório é contrário aos efeitos pró-

inflamatório dos leucotrienos (HARIBABU et al., 2000).

3.2.3. Receptores ativadores da proliferação dos peroxissomos (PPARs)

Outra importante via de inibição do processo inflamatório é a mediada pelos

receptores ativadores da proliferação dos peroxissomos (Peroxisome Proliferator-Activated

Receptor, PPARs). Todas as isoformas de PPARs podem participar na regulação das

respostas inflamatórias. Estes receptores nucleares de hormônio têm um papel na

modulação da intensidade, duração e conseqüências de eventos inflamatórios. As principais

isoformas são PPARα, PPARβ e PPARγ. Os PPARs foram descobertos na década de 1990

e são constituídos por cerca de 75 proteínas. As 3 diferentes isoformas de PPARα (NR1C1),

PPARβ (NR1C2), e PPARγ (NR1C3), formam heterodímero com o ácido 9-cis-retinóico,

Receptor X Retinóide (RXRs) (Figura 7) (MORAES et al., 2006).

Figura 7 – Ativação de PPARS (MORAES et al., 2006)

O PPARγ expressa duas variantes: PPARγ1 e PPARγ2. O PPARγ1 é expresso

amplamente, sendo encontrado em altos níveis em adipócitos, cólon, baço, retina, e células

hematopoieticas. O PPARγ2 é expresso em tecido adiposo, onde a principal diferença

estrutural é a adição de 28 aminoácidos na cadeia terminal (KERSTEN et al., 1999).

As principais funções fisiológicas dos PPARs podem ser explicadas pela atividade

como fator de transcrição, modulando a expressão de genes específicos (DESVERGNE e

WAHLI, 1999). O PPARα regula genes envolvidos na degradação oxidativa de ácidos

graxos (KELLER et al., 1993; GULICK et al., 1994). Já o PPARγ é primordial na

diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos e é importante no metabolismo da glicose

(KERSTEN et al., 1999; ROSEN et al., 1999). Os ligantes sintéticos do PPARγ, em

especial as tiazolidinas, são clinicamente usados como sensibilizadores de insulina na

diabete tipo 2. O PPARβ é expresso em praticamente todos os tecidos atuando na oxidação

de lipídeos, porém, nenhuma função ainda descreveu realmente o papel de sua grande

expressão (FREDENRICH e GRIMALDI, 2005).

Os PPARs podem ser ativados por uma larga variedade de ligantes endógenos. Os

ativadores do PPARα incluem uma variedade de ácidos graxos presentes no interior das

células, LTB4, ácidos hidroxieicosatetraenoicos (HETEs) como também medicamentos

usados na clínica médica para o tratamento de dislipidemias. Semelhantemente, PPARγ

pode ser ativado por vários ligantes, inclusive ácidos docosahexaenoicos, ácido linoleico,

tiazolidinas e vários lipídios, incluindo LDL oxidado, eicosanoides, como ácido 5,8,11,14-

eicosatetraenoico e os prostanoides PGA1, PGA2, PGD2 e seus produtos de desidratação

derivados das ciclopentanonas , tendo como exemplo o 15 desoxi-Δ12,14

-PGJ2 (Figura 8)

(BERGER et al., 2005; GERVOIS et

Já os ativadores do PPARβ incluem ácidos graxos e prostaciclinas. Diferente do

PPARα e do PPARγ, não há nenhuma droga sintética ligante do PPARβ em uso na clínica,

embora ligantes encontram-se na fase 2 dos testes clínicos para o tratamento de

dislipidemias (DUVAL et al., 2002; MARTENS et al., 2002; BISHOP-BAILEY e WRAY,

2003).

3.2.3.1. PPAR

O PPARα foi encontrado em células endoteliais da aorta, artéria carótida e células

das veias umbilicais (BISHOP-BAILEY e HLA, 1999; JACKSON et al., 1999; MARX et

al., 1999; LEE et al., 2000). Os ligantes inibem parcialmente a produção de citocinas,

ICAM-1, VCAM-1, endotelina-1(MARTIN-NIZARD et al., 2002), IL-6, e prostaglandinas

(STAELS et al., 1998; DELERIVE et al., 1999).

Embora a maioria dos estudos indicarem a ação antiinflamatória, os ligantes do

PPARα induzem um aumento da migração de neutrófilos, IL-8 e MCP-1 (LEE et al., 2000).

Em monócitos e macrófagos a ativação do PPARα inibe a expressão da enzima

óxido nítrico sintase (iNOS) (COLVILLE-NASH et al., 1998) e a produção de TNFα em

macrófagos (CHINETTI et al., 2000). Em células velhas de monócitos e macrófagos, os

ligantes do PPARα induzem apoptose (CHINETTI et al., 1998).

Nos linfócitos T, o PPARα é expresso em LTCD4+ e LTCD8+ (JONES et al.,

2002), onde os ligantes inibem a produção de IL-2 (CUNARD et al., 2002; MARX et al.,

2002). Experimentalmente, ligantes do PPARα também aumentam a produção de citocinas,

IL-4, enquanto diminuem a de IFNγ e diminui a proliferação de receptores de células T

presentes na membrana dos linfócitos T (LOVETT-RACKE et al., 2004).

Nas células musculares lisas dos vasos há a inibição da expressão de

prostaglandinas, IL-6, e a diminuição da expressão da COX-2 (HU et al., 2002).

3.2.3.2. PPAR

Em células endoteliais inibem a regulação da indução do TNFα, da expressão de

VCAM-1, MCP-1, e translocação de NFκB (RIVAL et al., 2002). Em macrófagos inibem a

produção de IL-1(LEE et al., 2003).

3.2.3.3. PPAR

Em células endoteliais, os ligantes do PPARγ induzem apoptose das mesmas,

diminuem o recrutamento de células inflamatórias inibindo as quimiocinas IL-8 e MCP-1

(MURAO et al., 1999; LEE al et., 2000; PASCERI et al., 2001), IL-10 (MARX et al.,

2000), e diminuição da expressão de ICAM-1 (CHEN e HAN, 2001). Semelhante ao

PPARα, os ligantes do PPARγ também reprimem a expressão de trombina e de endotelina-1

(DELERIVE et al., 1999; SATOH et al., 1999).

Em monócitos e macrófagos, os ligantes inibem a indução de óxido nítrico sintase

(iNOS), e a produção de TNF, IL-1, e IL-6 (JIANG et al.,1998). Além disso, a ativação de

PPARγ inibe a atividade transcricional de citocinas pró-inflamatórias NF-κB, e induzem a

apoptose de células velhas (RICOTE et al., 1998).

O PPARγ está presente nos mais baixos níveis nos linfócitos T, porém os ligantes do

PPARγ inibem sua proliferação, induzindo a redução da síntese de IFNγ e TNFα (YANG et

al., 2000). Já nos linfócitos B ocasiona um aumento da resposta imune específica

(SETOGUCHI et al., 2001).

Nas células dendríticas, o PPARγ influencia na maturação destas e regulam a

expressão de IL-12, CCL3, CCL5, e CD80, que são importantes para o desenvolvimento de

linfócitos T. O mecanismo pelo qual PPARγ pode mediar estes efeitos ainda não foi

elucidado, mas acredita-se ser derivado da inibição do NF-κB (FAVEEUW et al., 2000;

GOSSET et al., 2001). Por fim, em plaquetas inibem a agregação plaquetária (AKBIYIK et

al., 2004)

Os PPARs participam no controle da inflamação, especialmente modulando a produção de

mediadores inflamatórios (Figura 9).

Figura 9 – Efeitos dos ligantes sobre os PPARs (ESTRAUS e GLASS, 2007)

3.3. O planejamento racional na obtenção de novos fármacos

Com base no estudo prévio do arsenal terapêutico de antiinflamatórios, a química

medicinal lança mão de uma estratégia para síntese de novas moléculas com intuito de

melhorar a atividade farmacológica, ganhar seletividade em determinados receptores ou

enzimas, reduzir os efeitos adversos, ou mesmo otimizar a farmacocinética. Uma das

principais estratégias é o bioisosterismo usado na criação de novas moléculas candidatas a

fármacos e que utiliza estrutura básica onde serão feitas modificações. Esta estrutura básica

deve ter sua estrutura química definida e possuir mecanismo de ação conhecido, se possível

no nível de interação com receptores e seus grupos farmacofóricos. O sucesso desta

estratégia no desenvolvimento de novas substâncias que são terapeuticamente atraentes tem

conduzido a um crescimento significativo em várias categorias terapêuticas. É amplamente

utilizado pela indústria farmacêutica para descobrir novos análogos e inovações

terapêuticas comercialmente atraentes (THORNBER, 1979; CHEN e WANG, 2003).

Em 1919, Langmuir estudando o comportamento químico e reatividade de

determinadas substâncias que possuíam átomos ou grupos com o mesmo número de

elétrons de valência, isoeletrônicas, criou o conceito de isosterismo para definir átomos ou

moléculas orgânicas ou inorgânicas que possuem o mesmo número e/ou arranjo de elétrons

(BURGER, 1991).

Em 1925, Grimm formulou a lei do deslocamento de hidrogênio (Figura 10), uma

regra empírica, que afirma que a adição de um átomo de hidrogênio com um par de elétrons

(isto é, hidreto) a um átomo, produz um pseudo-átomo apresentando as mesmas

propriedades físicas. Isto mostra que qualquer átomo pertencente a grupos como 4A, 5A,

6A, 7A na tabela periódica, muda suas propriedades quando acrescido um hidreto,

tornando-se pseudo-átomos isoeletrônicos (LIMA e BARREIRO, 2005).

Em 1932, Erlenmeyer definiu que os isósteros como elementos ou moléculas íons

que apresentam o mesmo número de elétrons no nível de valência. Sua contribuição inclui a

proposição de que elementos de uma mesma coluna da tabela periódica são isósteros entre

si (por exemplo, C, Si, Ge), bem como a criação de um conceito de anéis eletronicamente

equivalentes (ERLENMEYER e LEO, 1932).

A criação do termo bioisosterismo remonta à década de 1950 com o pioneiro

trabalho de Friedman e Thornber. Friedman, reconhecendo a utilidade do conceito

isosterismo para conceber moléculas bioativas, definia bioisósteros como compostos que se

enquadram na definição de isósteros e que exerçam a sua atividade biológica no

bioreceptor, quer através de ações agonistas ou antagonistas. No entanto, Friedman

introduziu o termo bioisosterismo para descrever o fenômeno observado entre substâncias

estruturalmente relacionadas, que apresentam semelhantes ou diferentes propriedades

biológicas. Mais tarde, Thornber propôs um acréscimo na definição de bioisóstero,

definindo-os como subunidades, grupos ou moléculas que possuem propriedades físico-

químicas e efeitos biológicos semelhantes (FRIEDMAN, 1951).

Foram identificados muitos exemplos de isosterismo como o do ácido salicílico e o

antranílico, ácidos que originaram dois importantes AINES: o ácido acetilsalicílico e

o ácido mefenâmico respectivamente (Figura11) (LIMA e BARREIRO, 2005).

Os numerosos exemplos usados como estratégia de bioisosterismo para projetar

novas substâncias terapêuticas devem ser rigorosamente precedidos por análise cuidadosa

dos seguintes parâmetros (BARREIRO, 1991): Tamanho, volume e distribuição eletrônica dos átomos ou as condições de hibridação, e polarizabilidade; Propriedades como logP e pKa; Reatividade química dos grupos funcionais ou substituintes estruturais bioisostéricos, principalmente para predizer alterações significativas nos processos de

biotransformação, incluindo uma eventual alteração do perfil de toxicidade relativa para os principais metabólitos; Fator conformacional e interações de hidrogênio intra ou inter-moleculares.

Na procura de antiinflamatórios mais seletivos a COX-2, Penning e colaboradores

no ano de 1997 investigaram o efeito de modificações isostéricas na estrutura do composto

SC-58125, visando melhorar suas propriedades farmacocinéticas. Os autores sugeriram

duas substituições bioisostéricas clássicas: substituir o grupo metil (CH3) pelo grupo amino

(NH2) e trocar o flúor (F) com o grupo metil (CH3). Ambas as substituições isostéricas

sugeridas permitem introduzir na estrutura do bioisóstero modificações que tiram proveito

do efeito de primeira passagem. Este novo bioisóstero, aperfeiçoado do SC-58125, é o

celecoxibe, com meia-vida de 8-12 horas. Ele foi introduzido no mercado brasileiro em

1999 para tratar artrite reumática e outras condições inflamatórias, sendo o primeiro

antiinflamatório não esteroidal seletivo na COX-2, sem os efeitos gástricos irritantes típicos

da primeira geração AINEs (Figura 12) (LAINE, 2003).

Figura 12– Exemplo de bioisosterismo, com moléculas inibidoras da COX-2

Ottanà e colaboradores, em 2005, sintetizaram inibidores da COX-2 derivados do

núcleo tiazolidínico (TZDs), os quais apresentaram seletividade na sua ação

antiinflamatória e uma boa atividade analgésica, mostrando-se também com um bom perfil

de segurança. As moléculas sintetizadas foram derivadas do intermediário 3,3’-(1,2-

etanedil)–bis(2-aril-4-tiazolidinona). Foram observados os efeitos dos grupos Cl, OCH3,

SCH3, e SO2CH3, este último encontrado nos Coxbis, sobre o anel arílico (Figura 15).

Todas TZDs compartilham um núcleo base comum à tiazolidina-2,4-diona (TZD-

2,4), estrutura que é responsável pela maioria dos efeitos farmacológicos destes fármacos

(Figura 16) (SUNG et al., 2006).

Figura 16-Tiazolidina-2,4-diona

3.4. Atividades biológicas reportadas ao núcleo tiazolidínico

As tiazolidinadionas são bioisósteros da imidazolidinadiona e da oxazolidinadiona

(Figura 17) que pertencem a um grupo importante de heterocíclicos com grupo carbonil nas

posições 2, 4, ou 5 do anel pentamérico. A este grupo são reportadas atividades biológicas

diversas como bactericida, pesticida, fungicida, inseticida, anticonvulsivante,

tuberculostático, antiinflamatório, antitiroidal, entre outras

Figura 17-Bioisósteros das tiazolidinas

Referente à ação fungicida do núcleo TZD foi observada, em estudos realizados por

Siddiqui e colaboradores, sua atividade contra os microorganismos Fusarium oxysporium e

Penicillium citrinum em uma concentração 1000 ppm, apresentando atividade semelhante

ao padrão Ditane M-45 (SIDDIQUI et al., 2003).

Nos últimos anos, vários análogos da série 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-

diona tem sido investigados quanto a sua ação antimicrobiana. Os compostos 5-(2-cloro-

benzilideno)-3-(4-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/CR) e 5-(4-flúor-

benzilideno)-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/RA) apresentaram CMI > 128 g/mL

frente aos microorganismos Mycobacterium flavus ea Bacillus cereus (Figura 18)

(ALBUQUERQUE et al., 1999).

Em estudo realizado por Bozdag-Dundar, foi realizada a síntese de novos derivados

da série tiazolil-tiazolidina-2,4-diona, onde se observou sua atividade contra bactérias e

fungos, apresentando uma relevante atividade inibitória frente a estes microorganismos

(Figura 19) (BOZDAG-DUNDAR et al., 2007).

Atualmente, o papel fisiológico das TZD vem sendo destacado sobre os PPARs

(BOKYUNG et. al., 2006). As TZDs ativam PPARγ e são usadas como antidiabético no

tratamento do diabetes tipo 2 ( PLUTZKY, 2003). As TZDs, tais como rosiglitazona e a

pioglitazona, são moléculas sintéticas que se ligam com alta afinidade ao PPARγ (Figura

20).

Figura 20-TZDs hipoglicemiantes

Há mais de 30 anos os pesquisadores do Laboratório de Planejamento e Síntese de

Fármacos (LPSF) e atualmente o Grupo de Pesquisa em Inovação Terapêutica (GPIT) da

Universidade Federal de Pernambuco, vêm juntar esforços no planejamento, síntese e

avaliação das propriedades farmacológicas de novas ATZDs, destacando as atividades

hipoglicemiante (Pitta et al., Br, IP-0300997-1, 2003; MOURÃO et al., 2005),

antimicrobianas (ALBUQUERQUE et al., 1999) e antiinflamatórias (UCHOA, 2004;

SANTOS et al, 2005; COUTO, 2006; PEREIRA, 2007; MAGALHÃES, 2007).

Dando continuidade às pesquisas desenvolvidas por estes Grupos, novos derivados

ATZDs foram idealizados, sintetizados e avaliados quanto a sua atividade hipoglicemiante

e hipolipidêmica. Observou-se uma redução de 50% no nível de glicose e triglicerídeos

plasmáticos com o derivado 5-(4-metóxi-arilideno)-3-(4-metil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/GQ-5) em modelos experimentais de camundongos diabéticos induzidos por aloxano

(Figura 21) (LEITE et al., 2007).

Figura 21-Interações do derivado 5-(4-metóxi-arilideno)-3-(4-metil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-

5) no PPARα (LEITE et al., 2007)

Nos últimos anos intensificou-se o estudo do potencial antiinflamatório dos

derivados ATZDs, tendo o derivado 5-(5-bromo-2-metoxi-benzilideno)-3-(4-cloro-benzil)-

tiazolidina-2,4-diona (LPSF/LYSO-4) (Figura 22), cuja ação antiinflamatória avaliada no

teste do edema de pata induzida por carragenina, revelado após 6 horas um decréscimo de

60% no edema, usando como padrão a indometacina cuja inibição foi 57% (SANTOS et al.,

2005).

Figura 22-Derivado 5-(5-bromo-2-metoxi-benzilideno)-3-(4-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/LYSO-4) (SANTOS et al., 2005)

Compostos da série 5-benzilideno-3-(4-nitro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/SF) foram sintetizados e avaliados biologicamente exibindo significativa ação

antiinflamatória. Nesta série se destacou o derivado 5-(4-metil-sulfonil-benzilideno)-3-(4-

nitro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/SF-23), exibindo uma inibição de 60% na

migração de leucócitos polimorfonucleares no teste antiinflamatório no modelo

(LPSF/SF-23)

Recentemente realizou-se a síntese, a avaliação da atividade biológica e o estudo de

“docking” de derivados da série 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/SF)

utilizando como alvo a estrutura do PPAR-γ. Como resultado, observou-se que o derivado

5-(2-bromo-benzilideno)-3-(4-nitro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/SF-13), apresentou

uma inibição na migração de leucócitos de 68%,

e se

encontra em conformação semelhante à rosiglitazona, formando

ligações com os

aminoácidos His449, Gln286 e Tyr473 (Figura 24) (PEREIRA, 2007).

Figura 24-Composto LPSF/SF-13 (roxo) sobreposto a roziglitazona (azul) no estudo de “docking”

Uma investigação semelhante através de “docking” foi realizada com o derivado 5-

(4-cloro-benzilideno)-3-(4-fenil-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-24) que

demonstrou formação da ligação de hidrogênio no sítio ativo do PPAR (Figura 25). O

mesmo composto foi avaliado pelo protocolo experimental de air-pouch demonstrando

consideráveis resultados na inibição da diapedese de leucócitos (MAGALHÃES, 2007).

Figura 25-Formação da ligação de hidrogênio do composto LPSF/GQ-24 (azul) e o GW 409544 (verde) no

sítio ativo do PPAR

Com base neste estudo bibliográfico foi realizado este trabalho, planejando e

sintetizando novas ATZDs, que posteriormente foram avaliadas quanto a sua atividade

biológica frente a um processo inflamatório, corroborando com o estudo de docking no

receptor PPARγ.

4 Estudo químico

4.1. A química das tiazolidina-2,4-dionas

A tiazolidina-2,4-diona foi obtida primeiramente a partir de uma reação de

ciclização utilizando ácido monocloroacético e a tiouréia, em meio aquoso. Nesta reação

ocorre um processo de ciclização que forma a tiazolidina-2,4-diona (Figura 26)

(LIBERMAN, 1948 apud LIMA, 1998; HEINTZ, 1865 apud ELDERFIELD, 1957).

Sendo posteriormente obtida em 1973 por Bohen e Joull, a partir da reação entre

isocianatos com dióxido de tio-ceteno. Ambos radicais, aril e alquil isocianatos,

demonstraram baixa reatividade, porém o p-tolilsulfonil demonstrou-se altamente reativo

resultando na formação da TZD (Figura 27).

Em 1979, Monforte e colaboradores sintetizaram a tiazolidina-2,4-diona através de

uma reação de ciclização, reagindo carbodiimidas com o ácido α-mercaptopropionico, cuja

rota de síntese encontra-se descrita abaixo (Figura 28).

Figura 28 – Síntese de MONFORT (1979)

Já em 1981 uma nova metodologia foi empregada por Singh e colaboradores, onde

descrevem a reação da dimetil acetilenodicarboxilato (DMAD) com metilamônio e N-

metiltiocarbamato, usando como solvente o metanol à temperatura ambiente, reação que

levou a formação do derivado da tiazolidina-2,4-diona (Figura 29).

Um método de obtenção de derivados TZDs condensados em posição 5 consiste em

reagir a tiazolidina-2,4-diona com aldeídos aromáticos substituídos, usando ácido acético e

acetato de sódio fundido (Figura 30) (JOHNSON e SCOTT, 1915; LO, 1953).

Já outro método para obtenção da tiazolidina-2,4-diona condensada na posição 5

utiliza ésteres cianocinâmicos em etanol e piperidina (Figura 31) ( DABOUN et al., 1982

apud MOURÃO et al., 2005).

Derivados da 3-fenacil-tiazolidina-2,4-diona foram obtidos a partir da reação da

TZD com haletos de fenacil substituídos, em hidróxido de potássio e metanol (Figura 32)

(LIMA et al., 1994).

4.2. Material e métodos

Os reagentes utilizados foram: ácido monocloroacético, tioúreia, acetato de etila;

benzeno; cianoacetato de etila; etanol; n-hexano; piperidina; brometos de benzila

subtituidos, benzaldeídos substituídos; hidróxido de potássio. Os reagentes e solventes

utilizados na síntese dos compostos e suas análises pertencem às marcas Sigma, Aldrich,

Acros, Merck, Vetec ou Quimis.

Na cromatografia em camada delgada foi utilizada placa de sílica gel 60 Merck F254,

de 0,25 mm de espessura, reveladas em luz ultravioleta (254 ou 366 nm) ou através de

vapores de iodo.

A caracterização estrutural foi realizada através de espectrofotometria de absorção

no infravermelho (IV), em espectrofotômetro FTIR Bruker, Modelo IFS 66, pastilhas de

KBr. Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN1

H) foram

efetuados em espectrofotômetro Varian, Modelo Plus 300 MHz e utilizando como solvente

o DMSO-d6. As multiplicidades dos sinais são indicadas pelas abreviações: singleto (s),

dubleto (d), duplo dubleto (dd), tripleto (t), quadrupleto (q), multipleto (m). Os

deslocamentos químicos (δ) foram expressos em ppm e os acoplamentos em Hz. Os

espectros de massas foram registrados sobre impacto eletrônico a 70 eV em espectrômetro

R1010C Delsi-Nermag, acoplado a CPG HP5890. Para determinação dos pontos de fusão

foi utilizado aparelho Quimis, Modelo 340.27.

4.3. Mecanismos e rota sintética

Para obtenção dos novos derivados ATZDs das séries 5-benzilideno-3-(3-cloro-

benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA) e 5-benzilideno-3-(2-cloro-6-flúor-benzil)-

tiazolidina-2,4-diona e 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ)

foi utilizada a seguinte rota sintetica (Esquema 1).

Esquema 1 – Rota sintética para obtenção dos novos derivados ATZDs

Iniciam-se com a síntese da tiazolidina-2,4-diona, que foi realizada através da

reação do ácido monocloroacético como a tiouréia, em meio aquoso. Nesta reação ocorre

um processo de ciclização que forma a tiazolidina-2,4-diona (LIBERMAN, 1948 apud

LIMA, 1998).

Em uma segunda etapa temos a síntese dos derivados 3-benzil-tiazolidina-2,4-

dionas, através de reações de N-alquilação da TZD com haletos de alquila substituídos, na

presença de uma base e em meio etanólico, que levou inicialmente a formação de um sal, e

posterior adição do haleto de alquila. Tal metodologia é consolidada na literatura por

diversos autores, tendo como diferença o sal básico utilizado (DAVIS e DAINS, 1935; LO,

SHROPSHIRE, CROXALL, 1953).

Em paralelo foi realizado a síntese dos ésteres cianocinâmicos, que se processou a

partir da reação de condensação de Knoevenagel com aldeídos aromáticos substituídos e

cianoacetato de etila, em tolueno e na presença de piperidina. Estes intermediários foram

utilizados para obtenção dos substituintes benzilidênicos, na posição cinco da TZD

(Esquema 2).

CN H2C C O O CH2CH3 N H

C O O CH2CH3 HC CN H

R2

H C O

OH CH CN CH2CH3

OH CH CN

R2

C

CO O

R2 H C

CO O

CH2CH3

Esquema 2 -Mecanismo

de Knoevenagel

N H

reacional da condensação R2 CH CH CN C O O CH2CH3

para obtenção dos ésteres

cianocinâmicos

A formação da dupla exocíclica na posição cinco da TZD ocorreu devido a retirada

de um hidrogennio pela ação da piperidina, que conduz a formação de um carbânion, que

leva a um ataque ao carbono β do éster cianocinâmico, conduzindo aos novos derivados

ATZDs das séries 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA e LPSF/GQ)

(Esquema 3) (PITTA et al., 2003; SANTOS et al., 2005; MOURÃO et al., 2005)

Esquema 3 -Mecanismo reacional de formação dos derivados 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/TA e LPSF/GQ)

4.3. Metodologias de síntese

4.3.1. Síntese da tiazolidina-2,4-diona

Em um balão de fundo redondo adicionou-se tiouréia (5 g – 0,0658 mols) e ácido

monocloroacético (6,35 g – 0,0673 mols) previamente dissolvido em água. Aqueceu-se a

mistura a uma temperatura de 96°C por 18 horas. Em seguida, deixou-se

o produto obtido em repouso por 24 horas na geladeira. Formaram-se cristais brancos

correspondentes a tiazolidina-2,4-diona, cuja purificação foi realizada através de

cristalizações sucessivas em água destilada.

A tiazolidina-2,4-diona, de fórmula molecular C3H3NO2S (MM = 117), após

purificação, apresenta-se na forma de cristais brancos. Este composto foi obtido com

rendimento de 84 %, apresentando uma faixa de fusão 121-122 ºC [ponto de fusão na

literatura 122 ºC (KOCHKANYAN; ISRAELYAN; ZARITOUSKII, 1978)] e Rf = 0,51,

em sistema de eluição CHCl3/CH3OH 96:4. RMN1

H (δ, ppm) -DMSO – d6: 4,11 ppm (CH2,

s, 2H); 12,00 ppm (NH, s, 1H) IV (cm-1

) – KBr: 3115 (NH); 1670 e 1735 (C=O ).

4.3.2. Síntese da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA e LPSF/GQ)

Em um balão de fundo redondo foram adicionados 1,136 g – 0,0097 mols da

tiazolidina-2,4-diona. Na mesma razão molar foram adicionados o haleto de benzila e o

hidróxido de sódio, em presença de metanol. A mistura reacional foi aquecida a 65 o

C, por 8

horas, levando à formação da 3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-34), 3-(2-

cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-52) e 3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-

2,4-diona (LPSF/GQ-54). Estes intermediários foram purificados através de cromatografia

em coluna sob pressão.

4.3.3. Síntese dos ésteres de Cope (LPSF/IP)

Em um balão de fundo redondo foram adicionados o aldeído aromático substituído e

cianoacetato de etila em quantidades equimolares, na presença de piperidina como

catalisador e benzeno como solvente. A mistura reacional foi aquecida a uma temperatura

de 110 ºC, durante 4 horas. O produto foi mantido na geladeira por 12 horas. Os 2-ciano-3-

fenil-acrilatos de etilas (LPSF/IP) foram purificados através de cristalizações sucessivas em

etanol absoluto (WANG et al., 2001; KIM et al., 1997; COUTO, 2006).

4.3.4. Síntese da 5-benzilideno-3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA e LPSF/GQ)

Quantidades equimolares da 3-benzil-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ e LPSF/TA)

e dos derivados 2-ciano-3-fenil-acrilatos de etila (LPSF/IP) substituídos dissolvidos em

etanol, na presença de 350 L piperidina como catalisador, foram aquecidas sob refluxo

durante 4 horas. Após resfriamento, ocorreu a cristalização dos novos derivados ATZDs das

séries 5-benzilideno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA) e 5-benzilideno-3-

(2-cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(2-bromo-

benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ), que foram purificados através de lavagens

sucessivas com água destilada e álcool etílico absoluto.

4.4. Resultados e discussão

Devido à presença da dupla exocíclica nos derivados ATZDs duas conformações Z

e/ou E podem ser formadas. Contudo, em trabalhos anteriores e com o auxílio da

cristalografia de raio-X e RMN 13

C foi possível mostrar a prevalência da configuração Z nos

derivados 5-benzilideno-tiazolidina-2,4-diona (GUARDA et al., 2003; ALBUQUERQUE et

al., 1999).

A análise dos resultados obtidos na síntese dos novos derivados ATZDs das séries

5-benzilideno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA) e 5-benzilideno-3-(2-

cloro-6-flúor-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ) e 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-

tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ), nos permite afirmar que a metodologia utilizada

apresenta-se como uma boa rota sintética, com rendimento global variando entre 62% e

79%.

4.4.1. Resultados espectroscópicos

4.4.1.1. 5-(5-Bromo-2-metoxi-benzilideno)-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/TA-01)

C18H13BrClNO3S. Rdt = 99%. P. F. 139-140ºC. Rf = 0.68 (n-hexano:acetato de etila, 7:3).

IR (KBr, cm-1

) 1336, 1382, 1479, 1598, 1691, 1744. RMN1

H 300 MHz (δppm, DMSOd6)

3.9 (s, 3H, OCH3), 4.83 (s, 2H, CH2), 7.24-7.29 (m, 1H, pos. 5 benzil), 7.39

(1H, pos. 2 benzil), 7.39 (dd, 2H, pos. 4,6 benzil, J=4,5 e 1,2 Hz), 7.15 (d, 1H, pos. 3

benzilideno, J=9.3 Hz), 7.55 (d, 1H, pos. 6 benzilideno, J=2.4 Hz), 7.67 (dd, 1H, pos. 4

benzilideno, J=8.7 e 2.4 Hz), 7.97 (s, 1H, etileno). MS, ESI+, m/z 438 [M+H]+, 440

[M+H+2]+, 460 [M+Na]+, 462 [M+Na+2]+, 268, 122.

4.4.1.2. 3-(3-Cloro-benzil)-5-(4-metanosulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/TA-02)

C18H14ClNO4S2. Rdt = 79%. P. F. 196-197ºC. Rf = 0.66 (n-hexano:acetato de etila 6:4). IR

(KBr, cm-1

) 1151, 1383, 1607, 1697, 1762. RMN1

H 300 MHz (δppm, DMSOd6)

3.28 (s, 3H, SO2CH3), 4.86 (s, 2H, CH2), 7.27-7.31 (m, 1H, pos. 5 benzil), 7.38 (d, H, pos. 2

benzil, J=1,5 Hz), 7.39-7.42 (m, 2H, pos. 4,6 benzil), 7.89 (d, 2H, pos. 2,6 benzilideno,

J=8.7 Hz), 8.07 (d, 2H, pos. 3,5 benzilideno, J=8.4 Hz), 8.06 (s, 1H, etileno). MS, ESI+,

m/z 408 [M+H]+, 410, 425 [M+NH4]+, 427 [M+H+2]+, 430 [M+Na]+, 432 [M+Na+2]+,

446 [M+K]+, 448 [M+K+2]+, 268, 154, 122.

4.1.7.

4.4.1.3. 5-Bifeni-4-il-metileno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-03)

C23H16ClNO2S. Rdt = 73%. P. F. 169-170ºC. Rf 0.77 (n-hexano/acetato de etila; 7:3). IR

(KBr, cm-1

) 1148, 1383, 1481, 1595, 1670, 1740. RMN1

H 300 MHz (δppm, DMSOd6) 4.86

(s, 2H, CH2), 7.27-7.31 (m, 1H, pos. 5 benzil), 7.39-7.42 (m, 2H, pos. 4,6 benzil), 7.39 (d,

H, pos. 2 benzil, J=1,2 Hz), 7.44 (t, 1H, pos. 4 fenil, J=1.2 Hz), 7.51 (t, 2H, pos. 3 fenil,

J=7,5 Hz), 7.77 (dd, 2H, pos. 2 fenil, J=6,3 e 1,8 Hz), 7,74 (d, 2H, pos. 2 benzilideno, J=8.4

Hz), 7.88 (d, 2H, pos. 3 benzilideno, J=8.4 Hz), 8.03 (s, 1H, etileno). MS, ESI+, m/z 406

[M+H]+, 408 [M+H+2]+, 428 [M+Na]+, 430 [M+Na+2]+, 268, 122.

4.4.1.4. 5-(3-Bromo-4-metoxi-benzilideno)-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/TA-04)

C18H13BrClNO3S. Rdt = 71%. P. F. 153-154ºC. Rf = 0.83 (n-hexano/acetato de etila, 6:4).

IR (KBr, cm-1

) 1268, 1327, 1376, 1495, 1587, 1684, 1742. RMN1

H 300 MHz (δppm,

DMSOd6): 3.93 (s, 3H, OCH3), 4.84 (s, 2H, CH2), 7.24-7.28 (m, 1H, pos. 5 benzil), 7.38

(dd, 2H, pos. 4,6 benzil J=4.8 e 1.2 Hz), 7.39 (1H, pos. 2 benzil), 7.30 (d, 1H, pos. 3

benzilideno, J=9 Hz), 7.64 (dd, 1H, pos. 2 benzilideno, J=9 e 2.4 Hz), 7.91 (d, 1H, pos. 2

benzilidene, J=2.4 Hz), 7.93 (s, 1H, etileno). MS, ESI+, m/z 438 [M+H]+, 440 [M+H+2]+,

460 [M+Na]+, 462 [M+Na+2]+, 309, 268, 122.

4.4.1.5. 3-(3-Cloro-benzil)-5-(9H-fluoreno-2-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/TA-05)

C24H16ClNO2S. Rdt = 81%. P. F. 185-186ºC. Rf = 0.74 (n-hexano:acetato de etila, 7:3). IR

(KBr, cm-1

) 1331, 1380, 1595, 1683, 1733. RMN1

H 300 MHz (δppm, DMSOd6)

4.03 (s, 2H, CH2), 4.86 (s, 2H, NCH2), 7.27-7.31 (m, 1H, pos. 5 benzil), 7.39 (d, H, pos. 2

benzil, J=1.2 Hz), 7.4 (dd, 2H, pos. 4,6 benzil, J=7.5 and 1.8 Hz), 7.39-7.45 (m, 2H, pos.

6,7 fluorenilideno), 7.64 (d, 1H, pos. 3 fluorenilideno, J=6.9 Hz), 7.69 (d, 1H, pos. 5

fluorenilideno, J=7.8 Hz), 7.86 (s, 1H, pos. 1 fluorenilideno), 7.99 (d, 1H, pos. 8

fluorenilideno, J=7.5 Hz), 8.08 (d, 1H, pos. 4 fluorenilideno, J=8.1 Hz), 8.06 (s, 1H,

etileno). MS, ESI+, m/z 418[M+H]+, 420 [M+H+2]+, 440 [M+Na]+, 442 [M+Na+2]+,

304, 282, 168.

4.4.1.6. 3-(3-Cloro-benzil)-5-(4-metoxi-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/TA-06)

C18H14ClNO3S. Rdt = 72%. P. F. 125-126ºC. Rf = 0.8 (n-hexano:acetato de etila, 7:3).IR

(KBr, cm-1

) 1258, 1325, 1374, 1509, 1590, 1673, 1733. RMN1

H 300 MHz (δppm,

DMSOd6) 3.84 (s, 3H, OCH3), 4.84 (s, 2H, CH2), 7.24-7.3 (m, 1H, pos. 5 benzil), 7.39 (d,

1H, pos. 2 benzil, J=1.8 Hz), 7.39 (dd, 2H, pos. 4,6 benzil, J=5,1 e 1.2 Hz), 7.12 (d, 2H,

pos. 3,5 benzilideno, J=8.7 Hz), 7,61 (d, 2H, pos. 2,6 benzilideno, J=8.7 Hz), 7.93 (s, 1H,

etileno). MS, ESI+, m/z 360 [M+H]+, 362 [M+H+2]+, 382 [M+Na]+, 384 [M+Na+2]+,

332, 282.

4.4.1.7. 3-(2-Bromo-benzil)-5-(4-metanosulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/GQ-58)

C18H14BrNO4S2. Rdt = 56%. P. F. 59-60ºC. Rf = 0.69 (n-hexano:acetato de etila, 1:1). R

(KBr, cm-1

) 1149, 1306, 1383, 1603, 1678, 1748. RMN1

H 300 MHz (δppm, DMSOd6) 3.25

(s, 3H, CH3), 4.87 (s, 2H, CH2), 7.24 (dd, 1H, pos. 6 benzil, J=7.8 e 1.2 Hz), 7.27 (dt, 1H,

pos. 4 benzil, J=7.8 e 1.2 Hz), 7.36 (dt, 1H, pos. 5 benzil, J=7.5 and 1.2 Hz), 1 (dd, 1H, pos. 3 benzil, J=7.8 e 1.2 Hz), 7.91 (d, 2H, pos.2,6 benzilideno, J=8.1 Hz), 2 (d, 2H, pos. 3,5 benzilideno, J=8.4 Hz), 8.08 (s, 1H etileno). MS, ESI+, m/z 452 [M+H]+, 409, 382, 296, 169.

4.4.1.8. 3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(4-metil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona

C18H13ClFNO2S. Rdt = 49%. P. F. 149-150ºC. Rf = 0.77 (n-hexano:acetato de etila; 7:3). IR

(KBr, cm-1

) 1339, 1379, 1603, 1687, 1742. RMN1

H 300 MHz (δppm, DMSOd6) 2.36 (s, 3H

CH3), 4.98 (s, 2H CH2), 7.21-7.28 (dt, 1H pos. 5 benzil, J=9,1 e

1.5 Hz ), 7.33-7.38 (m, 1H pos. 4 benzil), 7.39-7.45 (m, 1H pos. 3 benzil), 7.36 (d, 2H, pos.

3,5 benzilideno, J=8.1 Hz), 7.51 (d, 2H, pos. 2,6 benzilideno, J=8.4 Hz), 7.89 (s, 1H,

etileno). MS, ESI+, m/z 362 [M+H]+, 364 [M+H+2]+, 384 [M+Na]+, 386 [M+Na+2]+.

4.4.1.9. 3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(2,4-dicloro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/GQ-100)

C17H9Cl3FNO2S. Rdt = 76%. P. F. 169-170ºC. Rf = 0.8 (n-hexano:acetato de etila, 7:3). IR

(KBr, cm-1

) 1335, 1377, 1601, 1689, 1742. RMN1

H MHz (δppm, DMSOd6) 4.99 (s, 2H,

CH2), 7.23-7.29 (m, 1H pos. 5 benzil), 7.33-7.38 (m, 1H pos. 4 benzil), 7.39-7.47 (m, 1H

pos. 3 benzil), 7.6 (d, 1H, pos. 5 benzilideno, J=8.7 Hz), 7.63 (d, 1H, pos. 6 benzilideno,

J=8.7 Hz), 7.86-7.88 (m, 1H pos. 3 benzilideno), 7.95 (s, 1H, etileno). MS, ESI+, m/z 416

[M+H]+, 418 [M+H+2]+, 438 [M+Na]+, 440 [M+Na+2]+, 302, 268.

Para se avaliar as propriedades farmacológicas de determinada substância no

organismo, são utilizados protocolos experimentais que permitem estabelecer os efeitos

biológicos. Sendo assim, se faz necessária uma avaliação biológica das moléculas em

estudo, e para estes protocolos experimentais damos o nome de bioensaios (RANG et al,

2003). Vários protocolos experimentais são utilizados e descritos na literatura para avaliar a

atividade antiinflamatória de uma substância. Dentre estes podemos citar edema de pata,

pleurisia, peritonite e air pouch, que podem utilizar inúmeros agentes indutores do processo

inflamatório, como proteínas de bactérias, látex, zimosan, croton oil, serotina e carragenina

(CASTELUCCI et al., 2007; GOULART et al., 2007; GAMBERO et al., 2003; RECIO et

al., 1995).

Desta forma, foi escolhido para a avaliação da atividade antiinflamatória o protocolo

experimental de air pouch induzido por carragenina. Modelo empregado em roedores no

intuito de avaliar a atividade de drogas antiinflamatórias (EDWARDS et al., 1981;

GILROY et al., 1998; SEDGWICK et al., 1985; SEIBERT et al., 1994; PASSOS et al.,

2007). Este modelo tem sido usado por se assemelhar histologicamente com a membrana da

cavidade sinovial (EDWARDS et al,, 1981), e quando induzida a inflamação por uma

injeção de carragenina a reação é semelhante à observada em uma inflamação sinovial

crônica, artrite reumática (WALLACE et al., 1999). O indutor inflamatório, carragenina, é

responsável por induzir a produção de citocinas pro-inflamatórias tais como bradicinina,

histamina, substancia P, NO, prostaglandinas e PAF (CAMPOS et al., 1996).

5.1. Material e Métodos

5.1.1. Materiais

Foram utilizados para realização da avaliação antiinflamatória:

� Carragenina (SIGMA-ALDRICH); � Éter dietílico (VETEC); � Solução salina a 0,9 % de NaCl; � Tween 80 (MERK), 5.1.2. Derivados ATZDs testados

� 5-(5-Bromo-2-metoxi-benzilideno)-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-01) � 3-(3-Cloro-benzil)-5-(4-metanosulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-02) � 5-Bifenil-4-il-metileno-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-03) � 5-(3-Bromo-4-metoxi-benzilideno)-3-(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-04) � 3-(3-Cloro-benzil)-5-(9H-fluoreno-2-il-metileno)-tiazolidina-2,4-diona(LPSF/TA-05) � 3-(3-Cloro-benzil)-5-(4-metoxi-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA-06) � 3-(2-Bromo-benzil)-5-(4-metanosulfonil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-58) � 3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(4-metil-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona(LPSF/GQ97) � 3-(2-Cloro-6-flúor-benzil)-5-(2,4-dicloro-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/GQ-100)

5.1.3. Animais

Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) de ambos os sexos,

pesando entre 25-35 g, provenientes do biotério do Departamento de Antibióticos/UFPE.

Os animais foram divididos em grupos de seis, mantidos em gaiolas de polipropileno

acondicionadas em estantes com ventilação e ar renovado através de exaustores com filtro,

sendo o ambiente aclimatado a uma temperatura de 25°C ± 3°C, fotoperíodo de 12/12

horas, ração e água ad libitum. Os experimentos foram executados segundo as diretrizes

aprovadas pela Comissão de Ética para Experimentos com Animais/UFPE (Processo Nº

002131/2007-28).

5.2. Metodologia

A toxicidade aguda faz referência a trabalhos realizados previamente por Santos e

colaboradores (2005) com análogos tiazolidínicos. Objetivando determinar a toxicidade

aguda, estes estudos demonstraram um baixo risco de toxicidade, nenhuma alteração

comportamental e fisiológica significativa, ou efeito letal na dose de 1000 mg/kg (UCHOA,

2004; SANTOS et al., 2005).

5.2.1. Air pouch (bolsão de ar)

Todos os animais foram submetidos a jejum, com a retirada da ração cerca de 12

horas antes do início do experimento. Durante o experimento os animais tiveram livre

acesso à ingestão de água. Inicialmente foram produzidos bolsões de ar por injeção de 2,5

mL de ar estéril (filtro EPA, capela de fluxo laminar horizontal) no dorso do animal (dia -

0). Decorridas 72 horas, foram injetados mais 2,5 mL de ar estéril na cavidade, a fim de

mantê-la formada (dia -3). Na execução desse procedimento os animais foram mantidos sob

leve anestesia com éter dietílico. Decorrido um novo intervalo de 72 horas (dia-6), os

animais receberam, por via oral, as substâncias testes (LPSF/TA e LPSF/GQ) nas doses de

0,03, 0,3 e 3 mg/Kg, o controle (veículo) e os padrões, piroxicam e roseglitazona, na dose

de 3 mg/Kg. Os compostos testados e o padrão, piroxicam e rozeglitazona, foram

previamente dissolvidos na solução de Tween 80/soro fisiológico (2% v/v) considerada

como o veículo. Uma hora após a administração oral das substâncias testes, os animais

receberam, diretamente na cavidade previamente formada, uma injeção de 1 mL de solução

de carragenina 1% p/v, com o objetivo de induzir a resposta inflamatória (Figura 33) (SIN

et al., 1986; KIM et al., 2006).

Figura 33-(A) Camundongo sem tratamento, (B 1-2) Administração de ar estéril intradérmica (air pouch), (C) Administração por via oral dos compostos testados, e (E) Injeção da carragenina 1% no bolsão de ar

Seis horas após, os animais foram eutanasiados através de deslocamento cervical. O

bolsão foi completamente lavado com 3 mL de uma solução de soro fisiológico contendo

EDTA (0,1% v/v). Em seguida, uma pequena incisão foi feita na parede do bolsão, e o

exsudato foi cuidadosamente removido por meio de uma seringa estéril (Figura 34). A

contagem diferencial do número total de leucócitos (PMN) foi executada

microscopicamente, após diluição de uma amostra do exsudato (50 L) em solução de Turk

(250L), utilizando-se uma câmara de Newbauer. Os dados foram analisados

estatisticamente através de análise de variância (ANOVA) e teste de Bonferroni com

intervalo de confiança de 95%, utilizando-se o software Microsoft Office Excel 2003

(KHANUM, SHASHIKANTH, DEEPAK, 2004).

EF

Figura 34 -(E) Lavagem do bolsão com EDTA 0,1% e (F) Coleta do exsudato com seringa estéril

O percentual de inibição da migração celular dos compostos testados foi calculado

de acordo com a equação abaixo (PALASKA et al., 2002).

Atividade antiinflamatória % = (m-m’/m) x 100

Onde, m e m’ representam a média do número de células nos grupos controle

(veículo) e tratados, respectivamente. A contagem diferencial do número total de células do

grupo controle (veículo) corresponde a 100 % de inflamação. Tomando-se por referência o

valor do grupo controle (veículo), calculou-se o percentual de inibição da inflamação dos

demais compostos. Todos os valores descritos nas figuras e textos foram expressos como

média ± erro padrão da média (EPM) para o número de animais estudados (n = 6).

5.3. Resultados e discussão

Os derivados ATZDs das séries LPSF/TA e LPSF/GQ apresentaram como

resultados nas doses de 3mg/kg, 0,3mg/kg e 0,03mg/kg uma inibição da migração de

leucócitos polimorfonucleares (LPMN) variando entre 31% e 73,3 % (Tabela 2). Tabela 2 – Atividade antiinflamatória apresentada pelos derivados das séries LPSF/TA e LPSF/GQ

com respectivas doses em mg/Kg de peso corpóreo do camundongo. Os valores apresentados são

significativos para o intervalo de confiança de 95% (ANOVA, teste de Bonferrori)

Dose Contagem de % de inibição da

COMPOSTOS R1 R2 (mg/kg) LPMN (105/mL)

infiltração (LPMN)

3 20,15±2,7 47,4

LPSF/TA-01 3-Cl 5-Br, 2-OCH3 0,3 24,90±3,1 35

0,03 26,43±2,1 31

3 13,83±1,8 63,9

LPSF/TA-02 3-Cl 4-SO2CH3 0,3 13,41±1,1 65

0,03 26,43±2,5 31

3 12,64±0,7 67

LPSF/TA-03 3-Cl 4-C6H5 0,3 11,11±1,2 71

0,03 21,83±1,7 43

LPSF/TA-04 3-Cl 3-Br, 4-OCH3 3 18,58±1,2 51,5

LPSF/TA-05 3-Cl 2-Fluoreno 3 13,33±1,8 65,2

LPSF/TA-06 3-Cl 4-OCH3 3 22,21±1,3 42

LPSF/GQ-97 2-Cl, 6-F 4-CH3 3 19,38±1,7 49,4

LPSF/GQ-100 2-Cl, 6-F 2,4-Cl2 3 22,37±1,8 41,6

3 10,23±1,7 73,3

LPSF/GQ-58 2-Br 4-SO2CH3 0,3 10,72±2,6 72

0,03 10,34±1,0 73

Piroxicam - - 3 14,94±1,91 61

controle - - - 38,3 ± 2,1 -

Rosiglitazona - - 3 10,72±2,0 72 LPMN = Leucócitos polimorfonucleares. Camundongos tratados oralmente com os novos derivados tiazolidínicos nas doses mencionadas. Cada valor representa a média ± erro padrão de n = 6 animais. O percentual de inibição foi calculado de acordo com a equação: Atividade antiinflamatória % = (m-m’/m) x

Foi observado que os compostos LPSF/TA-02, LPSF/TA-03 e LPSF/TA-05 que

possuem o substituinte cloro em posição meta do anel benzílico e o derivado LPSF/GQ-58

que apresenta como substituinte o átomo de bromo em posição orto (Figura 35), mostraram,

na dose de 3mg/kg, excelentes resultados na inibição do processo inflamatório, variando

entre 63,9 % e 73 % (Gráfico 1) quando comparados ao piroxicam (61%), além de

resultados semelhantes ao da rosiglitazona (72%). Estes resultados também foram

observados por Michaux e colaboradores quando demonstraram em análogos pirimidínicos

a influência destes grupos (MICHAUX et al., 2005).

Figura 35-Substituições no anel benzílico dos derivados LPSF/TA-02, LPSF/TA-03, LPSF/TA-05 e

LPSF/GQ-58

Gráfico 1-% de inibição da migração de leucócito polimorfonucleares (LPMN) para o teste de air pouch dos

derivados LPSF/TA-02, LPSF/TA-03, LPSF/TA-05 e LPSF/GQ-58

Já os derivados LPSF/GQ-97 e LPSF/GQ-100 apresentam uma dupla substituição

em posição orto e para do anel benzilico pelos átomos de cloro e flúor (Figura 36). Nestes

casos a resposta biológica na dose de 3 mg/kg foi moderada de 49 % e 42 %,

respectivamente (Gráfico 2).

Gráfico 2-% de inibição da migração de leucócito polimorfonucleares (LPMN) para o teste do bolsão de ar na

dose de 3mg/kg, dos derivados LPSF/GQ-97 e LPSF/GQ-100

Os resultados obtidos para os derivados LPSF/TA-02, LPSF/TA-03, LPSF/TA-05 e

LPSF/GQ-58 nos motivou a testar doses menores, 0,3 e 0,03 mg/kg (Gráfico 3).

Gráfico 3-% de inibição da migração de leucócitos polimorfonucleares (LPMN) dos derivados LPSF/TA-01,

LPSF/TA-02, LPSF/TA-03 e LPSF/GQ-58, nas doses de 3 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,03 mg/kg

É interessante notar que o derivado LPSF/TA-03 (Figura 37) que possui um

grupamento fenila substituído em posição para do anel benzilidênico, apresentou resposta

antiinflamatória satisfatória nas baixas doses de 0,3 e 0,03 mg/kg (Gráfico 4).

Figura 37-Substituição no anel benzilidênico por um grupamento fenil em posição para

Gráfico 4-% de inibição da migração de leucócitos polimorfonucleares (LPMN) do derivado LPSF/TA-03,

nas doses de 3 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,03 mg/kg

É importante observar que os derivados LPSF/TA-02 e o LPSF/GQ-58 (Figura 38),

que apresentam inibição de 64% e 73% respectivamente, na dose de 3 mg/kg, são

substituídos em posição para do anel benzilidênico pelo grupamento metilsulfonil. Tal

substituinte é encontrado nos coxibs, medicamentos de escolha no mercado, como

inibidores seletivos da Cicloxigenase tipo 2 (COX-2) (LAGES et al., 1998; FLOWER,

2003). Rassalta-se também a influência do átomo bromo em relação aos outros substituintes

do grupamento benzil, cloro e flúor, que apresentou nas três doses testadas resultados

significativos (Gráfico 5).

Gráfico 5-% de inibição da migração de leucócitos polimorfonucleares (LPMN) do derivado LPSF/GQ-58,

nas doses de 3 mg/kg, 0,3 mg/kg e 0,03 mg/kg, em relação aos padrões piroxicam e rosiglitasona

6. Estudo de modelagem molecular

6.1. Metodologia

A estrutura e a otimização dos ATZDs, compostos LPSF/TA-01, LPSF/TA-02,

LPSF/TA-03, LPSF/TA-04, LPSF/TA-05, LPSF/TA-06, LPSF/GQ-97, LPSF/GQ-100 e

LPSF/GQ-58 foram obtidas utilizando o método AM1 (DEWAR et al., 1985), do programa

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os valores de default para critério de convergência. Os resultados obtidos neste cálculo

estão de acordo com os estudos realizados anteriormente por Leite e colaboradores (2007) e

confirmam o isômero configuracional Z como sendo o mais estável.

A atividade antiinflamatória desses compostos foi analisada através de estudo

“docking” usando como alvo o complexo enzimático Peroxisome Proliferator Activated

Receptor Gamma complexado com a Rosiglitazone (-5-[[4-[2-(metil-piridin-2-il-

amino)etoxi]fenil]metil]-1,3-tiazolidina-2,4-diona) (PPARγ/BRL-49653). As simulações

computacionais foram realizadas para explorar o modo ligante desta nova classe de

compostos antiinflamatórios. O programa usado para esses cálculos foi o FlexX, um

programa de “docking” que considera a flexibilidade do ligante. (RAREY et al., 1996).

A PPARγ está disponibilizada no banco de dados do RCSB Protein Data Bank

(http://www.rcsb.org/pdb) (2PRG código – PDB). A conformação e a orientação espacial

do ligante BRL-49653 do complexo cristalográfico inibidor-enzima foi usada como modelo

para a avaliação dos derivados 3,5-tiazolidinadionas disubstituídos no sítio ativo da enzima.

O sítio ativo foi definido como sendo os átomos a uma distância de raio de 6,5Å do ligante

co-cristalizado. O modelo de interação proposto para os ligantes no sítio ativo da 2PRG foi

determinado como sendo a conformação de maior estabilidade (melhor docking) dentre as

30 conformações geradas no modelo ligante de acordo com a função score do program

FlexX, ou seja, a estrutura que apresenta a energia de ligação mais favorável (energia de

binding). As geometrias dos derivados heterocíclicos foram, subseqüentemente, otimizadas

usando o campo de força Tripos com cargas Gasteiger-Hückel (Sybyl version 7.2, Tripos

Associates Inc., St. Louis, Missouri, USA).

6.2. Resultados e discussão

A fim de validar o protocolo de “docking”, o ligante conformacional BRL-49653

(Rosiglitazona) foi retirado da estrutura cristalográfica do complexo PPARγ/ligante e em

seguida realizado o “docking” no sítio ativo. A análise estrutural do complexo BRL-

49653/PPARγ indicou que o inibidor seletivo interagiu com os aminoácidos GLN286,

HIS449, TYR473, HIS323, SER289 e SER342 e as respectivas distâncias das ligações de

hidrogênio entre os aminoácidos citados e o ligante (Figura 39).

Os compostos LPSF/GQ-58 e LPSF/TA-02 apresentaram a menor energia de

ligação – total score (-23.45kJ/mol e -22.83kJ/mol), respectivamente, ou seja, conformação

estrutural com a menor energia de docking (Figura 40 e Figura 41). O modo de ligação do

composto LPSF/GQ-58 e LPSF/TA-02 com o sítio ativo da PPARγ ocorre através de

ligações de hidrogênio entre o átomo de oxigênio do anel heterocíclico com o aminoácido

Arg288, e entre o substituinte 4-SO2CH3 do grupamento benzilidênico com os aminoácidos

His323, Tyr473, Tyr327 e Ser289. A figura 40 mostra o sítio ativo com os compostos

Rosiglitazona e LPSF/GQ-58 e a figura 41 o sítio ativo com os compostos Rosiglitazona e

LPSF/TA-02, bem como as distâncias das ligações de hidrogênio formadas entre os

aminoácidos do sítio ativo e os ligantes.

O modo de ligação do composto LPSF/TA-01 (Figura 42) ocorre através dos

aminoácidos Arg288, Glu343 e Ser342, apresentando o mais alto valor de docking (total

score -9,90 kJ/mol), talvez por não formar ligação de hidrogênio com os demais

aminoácidos da Rosiglitazona e estar ancorado próximo ao local da Rosiglitazona (figura

33), enquanto que os compostos LPSF/GQ-58 e LPSF/TA-02 aportam no mesmo local do

ligante co-cristalizado (Rosiglitazona). As distâncias das ligações de hidrogênio formadas

entre os aminoácidos do sítio ativo e os ligantes estão mostradas também nesta figura.

Na tabela 3 estão expressos os resultados de “docking” para os ATZDs estudados,

conforme modelo de interação proposto para os ligantes no sítio ativo da PPARγ, de acordo

com a função “score” do programa FlexX. No gráfico 6 estão relacionados os resultados do

docking e a % de inibição, onde foi observado que os compostos LPSF/GQ-58 e LPSF/TA-

02 são o mais estáveis da série, apresentando melhores resultado de docking e maior

potencial de inibição antiinflamatória.

Gráfico 6 -Resultados dos cálculos do Docking e a % de Inibição

Na tabela 3 estão listados os resultados de “docking” dos ligantes das séries

LPSF/TA, LPSF/GQ e BRL49653 (PPARγ), e o calor de formação dos isômeros

configuracionais Z e E.

Tabela 3 – Resultados de “docking” dos ligantes das séries LPSF/TA, LPSF/GQ e BRL49653 e calor de

formação dos isômeros configuracionais Z e E

Docking Configuração Código PPARg Z E LPSF/TA-01 -9.99 -24,745 -18,888 LPSF/TA-02 -22.83 -52,941 -49,039 LPSF/TA-03 -19.72 34,534 36,793 LPSF/TA-04 -16.70 -22,947 -16,084 LPSF/TA-05 -18.54 39,333 43,576 LPSF/TA-06 -18.82 -31,545 -27,078 LPSF/GQ-97 -15.23 -40,82 -35,288 LPSF/GQ-100 -13.98 -44,052 -39,694 LPSF/GQ-58 -23.45 -37,23 -33,46 Rosi -34.03

A análise do modo de ligação no sítio ativo da PPARγ dos compostos em estudo, em

relação à Rosiglitazona, mostra que estes ligantes estão ancorados na mesma região do sítio

ativo. Este fato pode indicar uma ação antiinflamatória via PPARγ para estes ATZDs da

série LPSF/TA e LPSF/GQ em estudo.

7. Conclusões

Foram sintetizadose nove novos derivados ATZDs das das séries 5-benzilideno-3-

(3-cloro-benzil)-tiazolidina-2,4-diona (LPSF/TA) e 5-benzilideno-3-(2-cloro-6-flúor-

benzil)-tiazolidina-2,4-diona e 5-benzilideno-3-(2-bromo-benzil)-tiazolidina-2,4-diona

(LPSF/GQ). Todos compostos sintetizados tiveram as suas estruturas químicas

comprovadas através de espectroscopia de infravermelho, ressonância magnética nuclear de

hidrogênio e espectrometria de massas.

Tais derivados foram testados quanto a sua atividade antiinflamatória no modelo de

inflamação do bolsão de ar (air pouch) induzido por carragenina em camundongos. Os

derivados tiazolidínicos testados demonstraram uma atividade antiinflamatória, nas doses

de 3mg/kg, 0,3mg/kg e 0,03mg/kg, apresentando resultados de inibição da migração de

leucócitos polimorfo nucleares (LPMN), variando entre 30,6% e 73,4%, sendo estes

comparados com o piroxicam (61%), antiinflamatório de escolha no mercado, e a

rosiglitazona (72%), derivado tiazolidínico. Dentre estes derivados, os que mais se

destacaram foram o LPSF/TA-02 e o LPSF/GQ-58, que apresentaram resultados

promissores tanto na atividade antiinflamatória in vivo, quanto os de dock.

Algumas características estruturais dos compostos sintetizados contribuíram muito

para o planejamento de novas moléculas candidatas a fármacos antiinflamatórios, sendo

observado o potencial do átomo de bromo e do substituinte metilsulfonil quanto à atividade

proposta. Deste modo, estes substituintes conduziram à potencialização da inibição da

migração de leucócitos polimorfonucleares para o local da inflamação.

Os resultados obtidos com os representantes das séries LPSF/TA e LPSF/GQ no

modelo de inflamação do bolsão de ar induzido por carragenina são importantes e

comprovam o potencial dos derivados tiazolidínicos como candidatos a agentes

antiinflamatórios.

Adicionalmente, os resultados obtidos nos estudos de modelagem molecular com os

representantes das séries LPSF/TA e LPSF/GQ sugerem um provável

mecanismo antiinflamatório, atuando como agonistas dos PPARs, em especial o PPARγ,

que foi objeto deste estudo.

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Synthesis, molecular modeling and anti inflammatory activity of new arylidene-thiazolidine

2,4-diones as potential PPARγ agonists

Cleiton Diniz Barrosa

, Tiago Bento de Oliveiraa

, Anekécia Lauro da Silvaa

, Teresinha

Gonçalves da Silvaa

, Lúcia Fernanda Cavalcanti da Costa Leiteb

, Elisa Soares Leitec

,

Marcelo Zaldini Hernandesc

, Maria do Carmo Alves de Limaa

, Suely Lins Galdinoa

, Ivan da

Rocha Pittaa

*

a

Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos – LPSF, Grupo de Pesquisa em

Inovação Terapêutica – GPIT, Universidade Federal de Pernambuco, Avenida Moraes Rego

1235, Cidade Universitária, CEP 50670-901 Recife, Pernambuco, Brasil,

http://www.ufpe.br/gpit

b

Departamento de Química, Universidade Católica de Pernambuco, Brasil

c

Laboratório de Química Teórica Medicinal -LQTM, Departamento de Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil

*Corresponding author: Prof. Dr. Ivan da Rocha Pitta. Phone/Fax: (+55) 81 2126 8347, e-mail: irpitta@gmail.com

Abstract – Nine new 5-arylidene-3-benzyl-thiazolidine-2,4-diones having halide groups on

their benzyl rings were synthesized and assayed in vivo to investigate their anti-

inflammatory activities. These compounds showed a considerably biological efficacy when

compared to the rosiglitazone, a potent and well-known agonist of the PPARγ target, treated

as the reference drug. This suggests that the substituted 5-arylidene and the 3-benzylidene

parts play an important role in the anti-inflammatory properties of this class of compounds.

The docking studies of the compounds indicated that they exhibit substantial specific

interactions with key residues located in the active site of the PPARγ structure, which

corroborates with the hypothesis of these molecules

being potential agonists of PPARγ. An important trend was observed between the docking

scores and the anti-inflammatory activities of this set of molecules. Key-words: Arylidene

thiazolidinedione; Anti-inflammatory activity; PPARγ; Docking 1. Introduction

The correct function of the tissues is indispensable for the proper function of the

body. When tissues are injured through physical damage or are infected by exogenous

microbial organisms, local and systemic responses are activated with the singular goal of

eliminate the offending factors as fast as possible, restore the tissue integrity, and retain

information about the offending agent in order to facilitate the recognition and elimination

on a future encounter. The outcome of these responses is a rapid physiological reaction of

the body towards damage and infection, that is, inflammation1

.

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are members of the nuclear

hormone receptor super family and are ligand-activated transcription factors. So far, three

PPAR isotypes have been reported and are commonly designated as PPARα,

PPARβ, and PPARγ. Originally, the PPAR activity was thought to be limited to lipid

metabolism and glucose homeostasis. Later studies showed that PPAR activation can

regulate inflammatory responses, cell proliferation and differentiation, as well as

apoptosis2,3

. An involvement of PPARγ in inflammatory processes was first suggested by

the antagonism between the activities of proinflammatory cytokines and PPARγ.

Additionally, macrophage activation is inhibited by several PPARγ agonists4

. Thus, this

receptor is an attractive target for the development of anti-inflammatory agents due to the

key role it plays at various stages in the inflammatory process.

Thiazolidine-2,4-diones activates PPARγ and is used as an antidiabetic drug in the

treatment of type 2 diabetes5,6

. Thiazolidines such as rosiglitazone and pioglitazone (Figure

1) are synthetic compounds that bind and active PPARγ with a high affinity7

. The two

thiazolidines share a common thiazolidine-2,4-dione structure that is the

starting material responsible for the majority of pharmacological actions, among them the

anti-inflammatory action8

.

Insert Figure 1 here

Recently, arylidene-thiazolidinediones were evaluated in the alloxan-induced

hyperglycemia mice model, where the biomolecular target considered as been responsible

for the process was the nuclear PPARγ9

. The present work describes the synthesis, anti-

inflammatory activity and structural characteristics of some compounds derived from the

thiazolidine-2,4-diones substituted by an arylidene and a benzyl group, as can be seen in

Scheme 1. The arylidene was included at the position 5 with the substituents Br, Cl, OCH3,

CH3, SO2CH3 and C6H5 and the benzyl was included at the position 3 with the substituents

Cl, F and Br. These selected substituents have been the main subject of previous SAR

investigations on thiazolidinones, based upon the structural similarity between these

molecules and the Coxib derivatives10, 11

. The effect of these substitutions in the biological

response were analyzed and the docking studies were carried out in order to investigate the

binding pattern with the PPARγ structure, as a tool to support the hypothesis of these

compounds as anti-inflammatory agents, acting as PPARγ agonists. According to our

knowledge, the docking of a set of thiazolidines in

the PPARγ receptor and the relation between the docking results and the anti-inflammatory

activities (measured as the percent of inhibition using PMNL count – see Table 1) has

never been reported.

Insert Scheme 1 here

2. Results and Discussion The arylidene thiazolidinediones 5 to 13 (Scheme 1)

were tested for anti-inflammatory activity in an air-pouche assay with the

evaluated for its ability to inhibit the leucocytes migration from blood

circulation, as illustrated in Table 1. The arylidene thiazolidinediones 6, 7, 9

and 11 were the most active anti-inflammatory agents, with a special emphasis

to ligand 11 (anti-inflammatory activity of 73.3%), which shows a better

activity when compared with the rosiglitazone ligand (72.0%). It should be

remarked that the 6, 7 and 9 contain a chlorine atom at the position 3 of the

benzyl ring and the compound 11 contains a bromine atom in the position 2 of

the benzyl ring. On the other hand, the compounds 5 and 8, that have two

substituents in the benzyl ring, only showed moderate activity when compared

to the rosiglitazone drug. After the optimization of the arylidene

thiazolidinadiones using the AM1 method12

, it was observed an agreement with

the previous results obtained by Leite and collaborators (2007)9

, confirming that

the Z isomer as the most stable one, for all the compounds. The theoretical

binding profile proposed for these ligands was determined as the highest (most

negative) scored among 30 possible solutions generated according

to the FlexX13

scoring function and protocol. Therefore, the docking results presented here

are concerning just this highest score for each molecule studied.

Insert Table 1 here

The docking solutions (positions) of the arylidene thiazolidinadiones compounds in

the PPARγ structure were compared to the position of the rosiglitazone docked in this

receptor, as one can see in Figure 2. It is possible to see that the docking solutions for the

nine ligands were obtained within the well-known active site of the PPARγ structure. A

closer look at the interactions of these ligands with PPARγ structure in the active site shows

that some key residues are involved in important polar intermolecular interactions

(hydrogen bonds) with the arylidene thiazolidinadiones and with the rosiglitazone. This can

be seen in Figure 3, where the best result obtained with docking, for compound 11 (-23.45

kJ.mol-1

), was superposed with the rosiglitazone also docked in the active site of the PPARγ

receptor. In a opposite way, ligand 5 presented the worst docking result (-9.99 kJ.mol-1

) and

the molecular reasons for this difference can be found in Table 2, where is listed the

comparison of the polar interactions obtained with the docking calculations for the ligands

5, 11 and rosiglitazone, with respect to the key residues of the PPARγ active site. The

hydrogen bonds with the co-crystallized rosiglitazone were also included, in order to certify

the docking model chosen for this study. One can see in Table 2 that it was found only 4

hydrogen bonds for ligand 5, what is related with the lower stability (lower score) of its

complex with PPARγ, in comparison with ligand 11, where 7 hydrogen bonds were found

by in silico approach.

Insert Table 2, Figure 2 and Figure 3 here

In Figure 4 the anti-inflammatory activity, measured as the percent of inhibition

(using PMNL count) and the docking scores were plotted together, exhibiting an important

trend. This means that the greater stability of the complex between the ligands and the

PPARγ receptor is related with the greater anti-inflammatory activity or the percent of

inhibition of the PMNL count. This important result corroborates with the hypothesis of

these molecules being potential agonists of PPARγ.

Insert Figure 4 here 3. Conclusion

In summary, arylidene thiazolidinediones were synthesized and tested for their anti-

inflammatory activities and one of the compounds showed higher activity then the

rosiglitazone reference drug. The binding patterns observed for the docked compounds

strongly support the idea that they are possible agonists of the PPARγ receptor.

Additionally, an important trend between the docking scores and the anti-inflammatory

activities was found, showing the careful choice of the docking model used for this study.

The comparison between the polar interactions (hydrogen bonds) observed in the docking

results for the molecules 5, 11 and rosiglitazone revealed the intermolecular reasons for the

higher anti-inflammatory activity of the ligand 3-(2-bromo-benzyl)-5-(4-methanesulfonyl-

benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione 11.

4. Methods

4.1. Synthesis

Thiazolidine-2,4-dione (1) was N-(3)-alkylated in the presence of sodium hydroxide,

which enables the thiazolidine sodium salt, to react with benzyl halide in a hot ethanol

medium, affording the intermediates 2, 3 and 4 as described in the Scheme

1. The 5-arylidene-3-benzyl-thiazolidine-2,4-diones were prepared by an nucleophilic

Michael addition of the 3-benzyl-thiazolidine-2,4-dione (2, 3 or 4) and the respective aryl-

substituted ethyl-(2-cyano-3-phenyl)-acrylates15

, for obtain the arylidene-thiazolidine-2,4-

diones 5 to 13 (Scheme 1). After cooling, precipitates were purified by column

chromatography or crystallized in suitable solvents. The ethyl-(2-cyano-3-phenyl)-acrylates

were prepared by Knoevenagel condensation of ethyl cyanoacetic ester and substituted

benzaldehydes with added piperidine. The arylidene-thiazolidine-2,4-diones were isolated

in a single isomer form, as verified in TLC and NMR analysis. X-ray crystallographic

studies and 13

C NMR have demonstrated the preferred Z configuration for 5-arylidenethiazolidinones16-18

(GUARDA et al., 2003;

TAN et al., 1986; ALBUQUERQUE et al., 1995).

4.1.1. General Procedures

3-benzyl-thiazolidine-2,4-diones (2 to 4) general procedure: An equimolar solution

of sodium hydroxide in ethanol : water mixture (6 : 4) was added dropwise under stirring to

a suspension of thiazolidine-2,4-dione, in the same ethanol : water mixture. A few times

later, the substituted benzyl chloride was added and the mixture was stirred for some

minutes before to be refluxed for 24 h. After cooling at room temperature, the expected

compound wass precipitated by addition of crushed ice before to be purified by flash

chromatography on silica with chloroform : methanol (92 : 8) as eluent. The published

chemical data on 3-chloro-benzyl-thiazolidine-2,4-dione19

2 and 2-bromo-benzyl-

thiazolidine-2,4-dione20

are not reported here.

Ethyl-(2-cyano-3-phenyl)-acrylates general procedure: Equimolar (23mMol)

mixture of aldehyde and ethyl cyanacetate, added with piperidine (3 drops) and benzene

(20mL) was heated at 110-120°C for 8-10h. After cooling, the mixture was caught in mass.

The solid phase was recrystallized from an ethanol-water mixture. The published chemical

data on ethyl-3-(5-bromo-2-methoxi-phenyl)-2-cyanoacrylate, ethyl-3-biphenyl-4-yl-2-

cyanoacrylate, ethyl-3-(3-bromo-4-methoxi-phenyl)-2-cyanoacrylate, ethyl-3-(4-methoxi-

phenyl)-2-cyanoacrylate21

, ethyl-3-(4-methyl-phenyl)-2cyanoacrylate22

, and ethyl-3-(2,4-dichloro-phenyl)-2-

cyanoacrylate23

are not reported here.

5-Arylidene-3-benzyl-thiazolidine-2,4-diones (5 to 13) general procedure: An

equimolar (0.83mMol) mixture of 3-benzyl-thiazolidine-2,4-dione 2-4 and (2-cyano-3-

phenyl)-ethyl acrylates dissolved in ethanol (10mL) with piperidine (250µL) was heated at

50°C for 2-3h. After cooling, the precipitated product was recrystallized from an ethanol-

water mixture or purified by flash column chromatography. Melting points were measured

in a capillary tube on Buchi (or Quimis) apparatus. Thin layer chromatography was

performed on silica gel plates Merck 60F254. Infrared spectra of 1% KBr pellets were

recorded on a Bruker IFS66 spectrometer. 1

H NMR spectra were recorded on a Bruker AC

300 P spectrophotometer in DMSO-d6 as solvent, with tetramethylsilane as internal

standard. Mass spectra were recorded on HCTultra Bruker Daltonics spectrometer on ESI

positive ion polarity.

4.1.2. 3-(2-Chloro-6-fluoro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione; 4 C10H7ClFNO2S. Yield: 27%.

Mp 90ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate, 9:1) Rf 0.4. IR (KBr, cm-1

) 1755, 1685, 1600, 1341,

971, 784. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6)

4.22 (s, 2H, CH2), 4.81 (s, 2H, NCH2), 7.19-7.26 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.3-7.34 (m, 1H,

pos. 4 benzyl), 7.35-7.43 (m, 1H, pos. 3 benzyl). MS, ESI+

, m/z 260 [M+H]+

, 262

[M+H+2]+

, 277 [M+NH4]+

, 279 [M+NH4+2]+

, 282 [M+Na]+

, 284 [M+Na+2]+

, 298 [M+K]+

,

300 [M+K+2]+

, 219, 143, 113.

4.1.3. Ethyl-3-(4-methanesulfonyl-phenyl)-2-cyanoacrylate C13H13NO4S. Yield: 70%.

Mp 125-126ºC. TLC (benzene:ethyl acetate, 1:1) Rf 0.76. IR (KBr, cm-1

) 2222, 1728, 1607, 1301,

1264, 1197, 766. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6) 1.32 (t, 3H, CH3 ester, J=6.9Hz), 4.35

(q, 2H, CH2 ester, J=6.9Hz), 3,3 (s, 3H, SO2CH3), 8.12 (d, 2H, pos. 2,6 phenyl, J=8.7 Hz),

8.23 (d, 2H, pos. 3,5 phenyl),

8.53 (s, 1H, ethylene).

4.1.4. Ethyl-3-(9H-fluoren-2-yl)-2-cyanoacrylate C19H15NO2. Yield: 98%. Mp 145-146ºC.

TLC (n-hexane:ethyl acetate, 7:3) Rf 0.65. IR (KBr, cm-1

) 2217, 1717, 1598, 1268, 1241,

1214, 1119. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6) 1.32 (t, 3H, CH3 ester, J=7.2Hz), 4.06 (s,

2H, CH2 fluorene), 4.33 (q, 2H, CH2 ester, J=6.9Hz), 7.4-7.5 (m, 2H, pos. 6,7

fluorenylidene), 7.64-7.69 (m, 1H, pos. 3 fluorenylidene), 8.03-8.07 (m, 1H, pos. 4

fluorenylidene), 8.1-8,17 (m, 2H, pos. 1,8 fluorenylidene), 8.32-8.35 (m, 1H, pos. 5

fluorenylidene), 8.47 (s, 1H, ethylene).

4.1.5. 5-(5-Bromo-2-methoxy-benzylidene)-3-(3-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione; 5

C18H13BrClNO3S. Yield: 99%. Mp 139-140ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate, 7:3) Rf

0.68. IR (KBr, cm-1

) 1336, 1382, 1479, 1598, 1691, 1744. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm,

DMSOd6) 3.9 (s, 3H, OCH3), 4.83 (s, 2H, CH2), 7.24-7.29 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.39 (1H,

pos. 2 benzyl), 7.39 (dd, 2H, pos. 4,6 benzyl, J=4,5 and 1,2 Hz), 7.15 (d, 1H, pos. 3

benzylidene, J=9.3 Hz), 7.55 (d, 1H, pos. 6 benzylidene, J=2.4 Hz), 7.67 (dd, 1H, pos. 4

benzylidene, J=8.7 and 2.4 Hz), 7.97 (s, 1H, ethylene). MS, ESI+

, m/z 438 [M+H]+

, 440

[M+H+2]+

, 460 [M+Na]+

, 462 [M+Na+2]+

, 268, 122.

4.1.6. 3-(3-chloro-benzyl)-5-(4-methanesulfonyl-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione; 6

C18H14ClNO4S2. Yield 79%. Mp 196-197ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate 6:4) Rf 0.66. IR

(KBr, cm-1

) 1151, 1383, 1607, 1697, 1762. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6)

3.28 (s, 3H, SO2CH3), 4.86 (s, 2H, CH2), 7.27-7.31 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.38 (d, H, pos.

2 benzyl, J=1,5 Hz), 7.39-7.42 (m, 2H, pos. 4,6 benzyl), 7.89 (d, 2H, pos. 2,6 benzylidene,

J=8.7 Hz), 8.07 (d, 2H, pos. 3,5 benzylidene, J=8.4 Hz), 8.06 (s, 1H, ethylene). MS, ESI+

,

m/z 408 [M+H]+

, 410, 425 [M+NH4]+

, 427 [M+H+2]+

, 430 [M+Na]+

, 432 [M+Na+2]+

, 446

[M+K]+

, 448 [M+K+2]+

, 268, 154, 122.

4.1.7. 5-Bipheny-4-ylmethylene-3-(3-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione; 7

C23H16ClNO2S. Yield 73%. Mp 169-170ºC. TLC (n-hexane/ethyl acetate; 7:3) Rf 0.77. IR

(KBr, cm-1

) 1148, 1383, 1481, 1595, 1670, 1740. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6) 4.86

(s, 2H, CH2), 7.27-7.31 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.39-7.42 (m, 2H, pos. 4,6 benzyl), 7.39 (d,

H, pos. 2 benzyl, J=1,2 Hz), 7.44 (t, 1H, pos. 4 phenyl, J=1.2 Hz), 1 (t, 2H, pos. 3 phenyl, J=7,5 Hz), 7.77 (dd, 2H, pos. 2 phenyl, J=6,3 and 1,8 Hz), 7,74 (d, 2H, pos. 2 benzylidene, J=8.4 Hz),.7.88 (d, 2H, pos. 3 benzylidene, J=8.4 Hz), 2 (s, 1H, ethylene). MS, ESI

+

, m/z 406 [M+H]+

, 408 [M+H+2]+

, 428 [M+Na]+

, 430 [M+Na+2]

+

, 268, 122.

4.1.8. 5-(3-Bromo-4-methoxy-benzylidene)-3-(3-chloro-benzyl)-thiazolidine-2,4-dione; 8

C18H13BrClNO3S. Yield 71%. Mp 153-154ºC. TLC (n-hexane/ethyl acetate, 6:4) Rf

0.83. IR (KBr, cm-1

) 1268, 1327, 1376, 1495, 1587, 1684, 1742. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6):

3.93 (s, 3H, OCH3), 4.84 (s, 2H, CH2), 7.24-7.28 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.38 (dd, 2H, pos.

4,6 benzyl J=4.8 and 1.2 Hz), 7.39 (1H, hidden, pos. 2 benzyl), 7.30 (d, 1H, pos. 3

benzylidene, J=9 Hz), 7.64 (dd, 1H, pos. 2 benzylidene, J=9 and 2.4 Hz), 7.91 (d, 1H, pos. 2

benzylidene, J=2.4 Hz), 7.93 (s, 1H, ethylene). MS, ESI+

, m/z 438 [M+H]+

, 440 [M+H+2]+

, 460 [M+Na]+

,

462 [M+Na+2]+

, 309, 268, 122.

4.1.9. 3-(3-chloro-benzyl)-5-(9H-fluoren-2-yl-methylene)-thiazolidine-2,4-dione; 9

C24H16ClNO2S. Yield 81%. Mp 185-186ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate, 7:3) Rf 0.74. IR

(KBr, cm-1

) 1331, 1380, 1595, 1683, 1733. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6)

4.03 (s, 2H, CH2), 4.86 (s, 2H, NCH2), 7.27-7.31 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.39 (d, H, pos. 2

benzyl, J=1.2 Hz), 7.4 (dd, 2H, pos. 4,6 benzyl, J=7.5 and 1.8 Hz), 7.39-7.45 (m, 2H, pos.

6,7 fluorenylidene), 7.64 (d, 1H, pos. 3 fluorenylidene, J=6.9 Hz), 7.69 (d, 1H, pos. 5

fluorenylidene, J=7.8 Hz), 7.86 (s, 1H, pos. 1 fluorenylidene), 7.99 (d, 1H, pos. 8

fluorenylidene, J=7.5 Hz), 8.08 (d, 1H, pos. 4 fluorenylidene, J=8.1 Hz), 8.06 (s, 1H,

ethylene). MS, ESI+

, m/z 418[M+H]+

, 420 [M+H+2]+

, 440 [M+Na]+

, 442 [M+Na+2]+

, 304,

282, 168.

4.1.10. 3-(3-chloro-benzyl)-5-(4-methoxy-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione; 10

C18H14ClNO3S. Yield 72%. Mp 125-126ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate, 7:3) Rf 0.8. IR

(KBr, cm-1

) 1258, 1325, 1374, 1509, 1590, 1673, 1733. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm,

DMSOd6) 3.84 (s, 3H, OCH3), 4.84 (s, 2H, CH2), 7.24-7.3 (m, 1H, pos. 5 benzyl), 7.39 (d,

1H, pos. 2 benzyl, J=1.8 Hz), 7.39 (dd, 2H, pos. 4,6 benzyl, J=5,1 and 1.2 Hz), 7.12 (d, 2H,

pos. 3,5 benzylidene, J=8.7 Hz), 7,61 (d, 2H, pos. 2,6 benzylidene, J=8.7 Hz),

7.93 (s, 1H, ethylene). MS, ESI+

, m/z 360 [M+H]+

, 362 [M+H+2]+

, 382 [M+Na]+

, 384

[M+Na+2]+

, 332, 282.

4.1.11. 3-(2-bromo-benzyl)-5-(4-methanesulfonyl-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione;

C18H14BrNO4S2. Yield 56%. Mp 59-60ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate, 1:1) Rf 0.69. IR

(KBr, cm-1

) 1149, 1306, 1383, 1603, 1678, 1748. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6)

3.25 (s, 3H, CH3), 4.87 (s, 2H, CH2), 7.24 (dd, 1H, pos. 6 benzyl, J=7.8 and 1.2 Hz),

7.27 (dt, 1H, pos. 4 benzyl, J=7.8 and 1.2 Hz), 7.36 (dt, 1H, pos. 5 benzyl, J=7.5 and 1.2

Hz), 7.67 (dd, 1H, pos. 3 benzyl, J=7.8 and 1.2 Hz), 7.91 (d, 2H, pos.2,6 benzylidene, J=8.1

Hz), 8.09 (d, 2H, pos. 3,5 benzylidene, J=8.4 Hz), 8.08 (s, 1H ethylene). MS, ESI+

, m/z 452

[M+H]+

, 409, 382, 296, 169.

4.1.12. 3-(2-chloro-6-fluoro-benzyl)-5-(4-methyl-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione;

C18H13ClFNO2S. Yield 49%. Mp 149-150ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate; 7:3) Rf 0.77. IR

(KBr, cm-1

) 1339, 1379, 1603, 1687, 1742. 1

H NMR 300 MHz (δ ppm, DMSOd6)

2.36 (s, 3H CH3), 4.98 (s, 2H CH2), 7.21-7.28 (dt, 1H pos. 5 benzyl, J=9,1 and 1.5 Hz ),

7.33-7.38 (m, 1H pos. 4 benzyl), 7.39-7.45 (m, 1H pos. 3 benzyl), 7.36 (d, 2H, pos. 3,5

benzylidene, J=8.1 Hz), 7.51 (d, 2H, pos. 2,6 benzylidene, J=8.4 Hz), 7.89 (s, 1H,

ethylene). MS, ESI+

, m/z 362 [M+H]+

, 364 [M+H+2]+

, 384 [M+Na]+

, 386 [M+Na+2]+

.

4.1.13. 3-(2-chloro-6-fluoro-benzyl)-5-(2,4-dichloro-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione;

13 C17H9Cl3FNO2S. Yield 76%. Mp 169-170ºC. TLC (n-hexane:ethyl acetate, 7:3) Rf 0.8.

IR (KBr, cm-1

) 1335, 1377, 1601, 1689, 1742. 1

H NMR MHz (δ ppm, DMSOd6) 4.99 (s, 2H,

CH2), 7.23-7.29 (m, 1H pos. 5 benzyl), 7.33-7.38 (m, 1H pos. 4 benzyl), 7.39-

7.47 (m, 1H pos. 3 benzyl), 7.6 (d, 1H, pos. 5 benzylidene, J=8.7 Hz), 7.63 (d, 1H, pos. 6

benzylidene, J=8.7 Hz), 7.86-7.88 (m, 1H pos. 3 benzylidene), 7.95 (s, 1H, ethylene). MS,

ESI+

, m/z 416 [M+H]+

, 418 [M+H+2]+

, 438 [M+Na]+

, 440 [M+Na+2]+

, 302, 268. 4.2. Biological Tests

The anti-inflammatory effect was tested by the production of air-pouches on the

dorsal cervical region of mices of 25 to 30 g by a subcutaneous injection of 2.5 ml of sterile

air tree on day zero, followed by a second injection of 2.5 ml of sterile air tree days later. In

the sixth day, the 1ml of a carrageenan solution 1% (w/v) was injected into the cavity. The

arylidene thiazolidinediones compounds (5 to 13) and the reference drug rosiglitazone,

were administered orally 1 hour before the injection of carrageenan. After 6 hours, the

mices were sacrificed by ether exposure, the pouches were washed with 3 ml of saline

solution containing 3 µM of EDTA, and the number of migrated neutrophils were

determined by staining with Turk’s solution (0,01% crystal violet in 3% acetic acid)

followed by the counting using a Neubauer haemocytometer .

4.3. Docking

The structural optimization of the arylidene-thiazolidinediones 5 to 13 showed in

Scheme 1 were initially obtained using the AM1 method12

implemented at the

BioMedCache program24

, using default values for the convergence criteria. Before the

docking calculation, the geometries of the arylidene-thiazolidinediones 5 to 13 were

subsequently optimized using the Tripos force field available in the Sybyl package13

.

The potential affinity of those compounds with respect to the PPARγ structure was

carried out through docking studies using the enzyme Peroxisome Proliferator Activated

Receptor Gamma (PPARγ) co-crystallized with the 5-[4-[2-(methyl-pyridin-2-yl-amino)-

ethoxy]-phenyl]-methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione (rosiglitazone -BRL) as target. This

complex was taken from the RCSB Protein Data Bank25

under the 2PRG PDB code. The FlexX 7.2. Program13

was used for these computations, because it takes into account the ligand flexibility (main torsions) during

the calculations26

. The structure of the ‘‘A’’ monomer of the homodimer was chosen as the

target for docking studies. The active site was defined as all atoms within a radius of 6.5Å

from the co-crystallized rosiglitazone ligand. Additionally, the rosiglitazone ligand was re-

docked in order to test the program protocol.

Acknowledgments

We would like to thank the Brazilian National Research Council (CNPq) and the

Brazilian Foundation Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior

(CAPES) for financial support.

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[13] Sybyl version 7.2, Tripos Associates Inc., St. Louis, Missouri, USES., http://www.tripos.com.

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� [15] Mourão, R. H.; Silva, T. G.; Soares, A. L. M.; Vieira, E. S.; Santos, J. N.; Lima, M. � C. A.; Lima, V. L. M.; Galdino, S. L.; Barbe J.; Pitta, I. R. Eur. J. Med. Chem. 2005, 40, 1129-1133. � [16] Guarda, V. L. M.; Pereira, M. A.; De Simone, C. A.; Albuquerque, J. C.; Galdino, � S. L.; Chantegrel, J.; Perrissin, M.; Beney, C.; Thomasson, F.; Pitta, I. R.; Luu-Duc, C. Sulfur Lett. 2003, 26, 17-27. [17] Tan. S. F.; Ang, K. P.; Fong, Y. F. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1986,2, 1941-1944.

� [18] Albuquerque, J. F. C.; Albuquerque, A.; Azevedo, C. C.; Thomasson, F.; Galdino, � S. L.; Chantegrel, J.; Catanho, M. T. J.; Pitta, I. R.; Luu-Duc, C. Pharmazie 1995, 50 387-389. [19] Muto, S.; Kubo, A.; Itai, A.; Sotome, T.; Yamaguchi, Y. PCT Int. Appl. 2005, WO 2005026127.

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� [21] Santos, L. C.; Uchôa, F. T.; Cañas, A. R. P. A.; Sousa, I. A.; Moura, R. O.; Lima, � M. C. A.; Galdino, S. L.; Pitta, I. R.; Barbe, J. Heterocyclic Communications, 2005, 11, 121-128. [22] Brandão, S. S. F.; Andrade, A. M. C.; Pereira, D. T. M.; Barbosa Filho, J. M.; Lima, M. C. A.; Galdino, S. L.; Pitta, I. R.; Barbe, J. Heterocyclic Communications 2004, 10, 9-14.

[23] Silva, T. G.; Barbosa, F. S. V.; Brandão, S. S. F.; Lima, M. C. A.; Galdino, S. L.; Pitta, I. R.; Barbe, J. Heterocyclic Communications, 2001, 7, 523-528.

[24] BioMedCache version 6.1, Copyright© 2000-2003 Fujitsu Limited, Copyright© 1989-2000, Oxford Molecular Ltd., http:///www.CACheSoftware.com.

[25] RCSB Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb.

[26] Rarey, M.; Kramer, B.; Lengauer, T.; Kléber, G. J. Mol. Biol. 1996, 261, 470-489.

Tables: Table 1. Oral anti-inflammatory activity of the nine arylidene thiazolidinediones using the air pouch model and respective docking scores.

Dose PMNL count

% Inhibition

Docking Score

Compound R1 R2 (mg/kg) (105/mL)a (PMNL)b (kJ mol-1)

5 3-Cl 5-Br, 2-OCH3C6H3

3 20.1±2.7 47.4 -9.99

6 3-Cl 4-SO2CH3C6H4 3 13.8±1.8 63.9 -22.83

7 3-Cl 4-C6H5C6H4 3 12.6±0.7 67.0 -19.72

8 3-Cl 3-Br, 4-OCH3C6H3

3 18.6±1.2 51.5 -16.70

9 3-Cl 2-Fluorene 3 13.3±1.8 65.2 -18.54

10 3-Cl 4-OCH3C6H4 3 22.2±1.3 42.0 -18.82

11 2-Br 4-SO2CH3C6H4 3 10.2±1.7 73.3 -23.45

12 2-Cl, 6-F 4-CH3C6H4 3 19.4±1.7 49.4 -15.23

13 2-Cl, 6-F 2,4-Cl2C6H3 3 22.4±1.8 41.6 -13.98

rosiglitazone 3 10.7±2.0 72.0 -34.03 control 38.3 ± 2.1

a

PMNL is the cell infiltration by polymorphonuclear leucocytes. Data points represent the

mean PMNL count number per animal group with the corresponding standard error. The

presented values are significant for the 95% interval of trust (ANOVA, test of Bonferrori). b

The inhibition was determined compared to a control group (untreated).

Table 2. Comparison of the polar interactions obtained with the docking calculations for

the ligands 5, 11 and rosiglitazone, with respect to the residues of the PPARγ structure. The

hydrogen bonds with the co-crystallized rosiglitazone were also included. Each value

represents the distance, in Å, between the donor and the acceptor atoms involved in the

hydrogen bond.

Residues Ligand 5 Ligand 11 Rosiglitazone Rosiglitazone

(PPARγ) docking co-crystallized

ARG288 3.02 and 3.25 2.94

GLN286 3.05 2.69

GLU343 3.15

HIS323 2.65 and 2.92 2.87 2.78

HIS449 2.74 3.11

SER289 3.10 2.72 2.80

SER342 3.03 2.98

TYR327 2.61

TYR473 3.23 and 2.57 2.83 3.00

# HB* 4 7 6 5

* Total number of hydrogen bonds in each case.

Figures:

HO

HO

N N

N N

OS O

OS

rosiglitazone -TDZ1

pioglitazone -TDZ2

Figure 1. Rosiglitazone and pioglitazone structures that bind the PPARγwith a high

affinity.

Figure 2. Superposition of the docking positions for the nine arylidene thiazolidinediones

(5 to 13 – Scheme 1) (line models in several colors) and the rosiglitazone (stick model in

red) for the PPARγreceptor (cartoon model). The co-crystallized rosiglitazone was also

represented (stick model in blue). (a) General view and (b) detailed view. Figures 2 and 3

were generated using PyMOL v0.9914

.

Figure 3. Docking result for 3-(2-bromo-benzyl)-5-(4-methanesulfonyl-benzylidene)-

thiazolidine-2,4-dione (11) (in blue) and rosiglitazone (in yellow) interacting with the

residues of the active site of the PPARγreceptor. The most important residues that

participate on the polar interactions (hydrogen bonds) are shown in green.

% Anti-inflammatory activity

Figure 4. Trend between the docking results of the nine arylidene thiazolidinediones (5 to 13 –

Scheme 1) and the rosiglitazone ligands in the PPARγreceptor and the anti-inflammatory activity

measured as the percent of inhibition in respect with the PMNL count.

Schemes:

1 2,3or4 5to13

Compound R1 R2 5 3-Cl 5-Br, 2-OCH3C6H3 6 3-Cl 4-SO2CH3C6H4 7 3-Cl 4-

C6H5C6H4 8 3-Cl 3-Br, 4-OCH3C6H3 9 3-Cl 2-Fluorene

10 3-Cl 4-OCH3C6H4 11 2-Br 4-SO2CH3C6H4 12 2-Cl, 6-F 4-CH3C6H4 13

2-Cl, 6-F 2,4-Cl2C6H3

Scheme 1. Synthetic route for 5-arylidene-3-benzyl-thiazolidine-2,4-diones.