Quim. Nova, Vol. 25, No. 6, 1003-1011, 2002 A QUIMILUMINESCNCIA
COMO FERRAMENTA ANALTICA: DO MECANISMO A APLICAES DA REAO DO
LUMINOL EM MTODOS CINTICOS DE ANLISE ErnestoCorrea Ferreira e
AdrianaVitorino Rossi* Instituto de Qumica, Universidade Estadual
de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP Recebido em 18/4/01;
aceito em 12/4/02
CHEMILUMINESCENCE AS AN ANALYTICAL TOOL: FROM THE MECHANISM TO
APPLICATIONS OF THE REACTION OF LUMINOL IN KINETIC BASED METHODS.
Relevant aspects of proposed mechanisms of the chemiluminescent
reaction of luminol are presented and commented to emphasize its
perspectives for kinetic analysis. A careful search for analytical
applications of this reaction is discussed in order to point out
new trends of the studies. Kinetic analysis using the luminol
reaction is proposed to be a very attractive due to the good
performance of the reaction in analytical applications and the
positive characteristics of kinetic analysis, such as low cost and
sensibility. It is pointed out that kinetic analysis using the
chemiluminescent reaction of luminol should be encouraged.
Keywords: luminol; chemiluminescence; kinetic analysis.
QUIMILUMINESCNCIA Breve histrico Desde a antiguidade, fenmenos
de emisso de luz, como a quimiluminescncia, eram descritos, mas,
por muito tempo foram associados a mitos ou fantasmas. Em 1669, o
mdico H. Brandt, a partir da destilao exaustiva de uria, produziu
fsforo que, devido a sua oxidao pelo O2 do ar, produzia
quimiluminescncia1. O primeiro composto orgnico sinttico
luminescente descrito foi a lofina, 2,4,5-trifenilimidazol, obtida
em 1887 por Radiziszewski2. A partir destes resultados, em 1888,
Wiedemann conseguiu distinguir a quimiluminescncia da
incandescncia, definindo-a como a emisso de luz que ocorre junto a
processos qumicos3. Desde esta poca, as reaes quimiluminescentes tm
sido objeto de estudos para elucidao dos mecanismos envolvidos e da
atuao de outras espcies que afetam a quimiluminescncia. Alm destes
compostos exemplificados, outras substncias como luminol,
lucigenina, isoluminol, etanodioato de bis(2,4,6-triclorofenila),
pirogalol e a luciferina tambm participam como substratos de reaes
quimiluminescentes e suas frmulas so apresentadas na Figura 14, 5.
QUIMILUMINESCNCIA E QUMICA ANALTICA A preciso e a sensibilidade das
anlises esto fortemente relacionadas com a tcnica de medida e o
sistema reacional empregados. H grandes esforos em otimizar
sistemas convencionais e encontrar novos sistemas, visando atender
s novas e crescentes necessidades do mercado. Neste contexto, a
quimiluminescncia destaca-se por apresentar caractersticas de
grande aplicabilidade analtica. Quimiluminescncia a produo de
radiao luminosa eletromagntica (inclusive ultravioleta ou
infravermelho) por uma reao qumica. Quando esta radiao emitida a
partir de um sistema qumico presente num organismo ou dele
derivado, acaba sendo conhecida como bioluminescncia4. O processo
qumico da quimiluminescncia envolve a absoro, pelos reagentes, de
energia suficiente para gerao de um complexo*e-mail:
[email protected] Figura 1. Exemplos de compostos que
participam como substratos de reaes quimiluminescentes: 1 lofina, 2
luminol, 3 lucigenina, 4 isoluminol, 5 etanodioato de
bis(2,4,6-triclorofenila), 6 pirogalol e 7 luciferina
ativado, o qual se transforma em um produto eletronicamente
excitado6. Se esta espcie excitada for emissiva, produz a radiao
diretamente, caso contrrio, pode ocorrer a transferncia de energia
do estado excitado formado para uma molcula aceptora apropriada,
resultando na emisso indireta da radiao6. Pesquisas sobre reaes
quimiluminescente so desenvolvidas em todas as reas tradicionais da
Qumica e, em geral, envolvem estudos sobre mecanismos, identificao
de reagentes, produtos e intermedirios, alm de medidas da eficincia
quntica e desenvolvimento de aplicao analtica7. As condies da reao
tm um efeito significativo na quimiluminescncia. Otempo de reao e a
durao da radiao emitida variam de perodos muito pequenos (menores
que 1s) at
Divulgao
1004
Ferreira e Rossi
Quim. Nova
muito longos (cerca de 1 dia). A mudana de parmetros
experimentais como forma de mistura dos reagentes, temperatura,
concentraes de espcies reacionais ou interferentes, pH, podem
modificar totalmente a emisso, podendo at mesmo extingui-la5. A
intensidade da emisso depende da velocidade de reao, da eficincia
na gerao de molculas em um estado excitado (expresso pelo
rendimento quntico) e do fluorforo, que pode ser considerado como a
substncia que produz a emisso1,8. A cor e a intensidade de emisso
tambm so influenciadas pela polaridade do solvente, pela
temperatura do sistema e por outros processos fsicos secundrios de
supresso da emisso da molcula no estado excitado5. Como exemplo,
pode-se citar que o comprimento de onda de emisso mxima da reao
quimiluminescente do luminol (lmax de emisso) varia entre 431 e 500
nm, de acordo com o solvente utilizado, conforme ilustra a Tabela
18. Tabela 1. lmax de emisso da oxidao do luminol em diferentes
solventes solvente gua Dimetilsulfxido Dimetilformamida
Acetonitrila Tetra-hidrofurano lmax de emisso (nm) 431 502 499 500
496
Uma reao quimiluminescente de grande importncia envolve a oxidao
da luciferina, um dos compostos responsveis pela luz do vagalume,
em presena de ATP e utilizada para a determinao de biomassa e da
presena de vida em corpos estrelares, alm de servir como forma de
deteco em vrios imunoensaios10. Outra reao, das mais aplicadas em
mtodos analticos, a famosa oxidao do luminol em meio alcalino13. A
REAO QUIMILUMINESCENTE DO LUMINOL Data de 1928, o trabalho pioneiro
sobre a reao do luminol, publicado por Albrecht14. A oxidao do
luminol por H2O2 em meio alcalino foi a primeira reao
quimiluminescente descrita e suas propriedades termodinmicas e
cinticas continuam sendo intensamente estudadas at os dias de hoje.
Vrias propostas mecansticas para a reao j foram apresentadas e
algumas etapas j esto quase completamente estabelecidas4,5,13.
Restam, ainda, aspectos no totalmente elucidados, envolvendo a
formao de estados eletronicamente excitados que, como na maioria
das reaes quimiluminescentes, ainda no esto bem esclarecidos e
continuam sendo objeto de pesquisas e polmicas recentes4,15. As
idias apresentadas na seqncia no tm a pretenso de esgotar o tema
nem cobrir todas as obras j publicadas sobre o assunto mas servem
para ilustrar alguns aspectos da reao. Vrios pesquisadores j
citaram alguns caminhos possveis para a reao do luminol com alguns
agentes oxidantes, como O 2 e H2O2. Tambm foram determinados alguns
possveis intermedirios. Alm disso, estudos realizados com outras
reaes quimiluminescentes (por exemplo, com dioxetanos) tm mostrado
novos caminhos e idias sobre o mecanismo de quimiluminescncia7. Uma
interessante proposta mecanstica foi apresentada por Albertin e
colaboradores4, sendo apresentada na Figura 2.
Como a intensidade de emisso dependente da velocidade da reao,
monitor-la pode fornecer dados para quantificar qualquer espcie
cuja concentrao afete esta velocidade5. As principais
caractersticas das reaes quimiluminescentes adequadas para aplicao
analtica so os excelentes limites de deteco que podem ser alcanados
e a simplicidade da instrumentao necessria para registrar o sinal
analtico5. Com reaes bioluminescentes, pode-se trabalhar em condies
de especificidade quando envolvem catlise enzimtica. A elevada
sensibilidade de mtodos analticos com reaes quimiluminescentes, que
sero identificados neste texto com tcnicas de quimiluminescncia,
est ligada a vrios fatores, como a ausncia da necessidade de uma
fonte de radiao, o que diminui ou elimina os espalhamentos Raman e
Rayleigh, e o rudo associado com este tipo de componente,
aumentando a razo sinal/rudo da medida. Limites de deteco na ordem
de fentomol (10-15 mol) no so incomuns nas tcnicas de
quimiluminescncia e em alguns sistemas enzimticos j foram
detectadas cerca de 120 molculas de analito5. As reaes
quimiluminescentes podem ocorrer tanto em fase gasosa como tambm
nas fases slidas e lquidas. As principais reaes em fase gasosa j
estudadas so aquelas que ocorrem entre o oznio e xidos de nitrognio
e so utilizadas para a determinao de oznio na atmosfera8. Em
cromatografia gasosa, vrios sistemas envolvendo reaes
quimiluminescentes j foram citados para a deteco de compostos
contendo N e S. Porm, segundo Worsfold10, a fase lquida apresenta
as maiores perspectivas para aplicao analtica da quimiluminescncia,
tanto em meio aquoso como no-aquoso. Em soluo, a quimiluminescncia
pode ser empregada em vrias aplicaes analticas para determinao de
ons metlicos, nions inorgnicos, biomolculas, substncias
carcinognicas e drogas em diferentes matrizes ambientais e
clnicas5,10. Dentre os diferentes tipos de espcies analisadas por
esta tcnica, o controle de compostos orgnicos no meio ambiente,
como pesticidas11 e compostos de S derivados do petrleo12, so
exemplos de destaque pela grande sensibilidade e simplicidade.
Figura 2. Proposta mecanstica de Albertin e colaboradores4 para
a reao quimiluminescente do luminol em meio alcalino e na presena
de um on de metal de transio (Mn+), utilizando o H2O2 como agente
oxidante
Nesta proposta, a etapa para a emisso da luminescncia est ligada
ao aparecimento da forma eletronicamente excitada do 3amino-ftalato
11. O aparecimento desta espcie est ligada s condi-
Vol. 25, No. 6
A Quimiluminescncia como Ferramenta Analtica
1005
es do meio reacional, como pH, concentrao dos reagentes e
composio do tampo. O produto final da reao 12 pode ser formado
diretamente sem luminescncia ou pela relaxao da espcie
eletronicamente excitada 11 com luminescncia. H importantes etapas
intermedirias, como a formao da diazoquinona 8 a partir do luminol
e a formao do nion de H2O2 9, que estabelecem relaes entre as
espcies envolvidas na formao do intermedirio endoperxido 10, cuja
decomposio produz ou no a quimiluminescncia. Com toda a
complexidade da reao, pertinente destacar algumas descobertas
significativas sobre os intermedirios e as etapas da reao
quimiluminescente do luminol. Detalhes mecansticos da reao do
luminol Na dcada de 80, Mernyi e colaboradores15-22 avanaram na
descoberta de algumas etapas do mecanismo da reao, utilizando a
tcnica de radilise e modelos computacionais. Foram verificados e
confirmados alguns intermedirios, como a diazoquinona 8 e a produo
da luminescncia pelo 3-aminoftalato excitado 11, a partir da reao
com o radical ClO2 formado pela radilise do dixido de cloro16. Alm
disso, estudos com radicais N3 e CO3- 17 indicaram novos possveis
intermedirios na formao e decomposio do endoperxido 10, como o
radical de luminol 13 e o a-hidroxihidroperxido 14, Figura 3.
Figura 4. Diagrama esquemtico dos orbitais moleculares do
sistema endoperxido 10 / 3-amino-ftalato 12
Figura 3. Estruturas de alguns intermedirios da reao
quimiluminescente do luminol: 8 diazoquinona, 10 endo-perxido, 12
dinion do cido ftlico, 13 radical do luminol e 14
hidro-perxido15-22
Figura 5. Diagrama esquemtico dos estados do endo-perxido 10 /
3aminoftalato 12, relacionando a energia do sistema com o
rompimento da ligao dos tomos de oxignio no intermedirio
eletronicamente excitado 11
Parmetros como constantes de velocidade, dependncia do pH
reacional e efeitos da participao de outras espcies (ctions
metlicos e nions como carbonato e brometo) no aumento da
luminescncia, tambm foram discutidos em propostas mecansticas18-20.
Alm disso, modelagem computacional foi empregada para investigao da
existncia e da decomposio do intermedirio endo-perxido do luminol
1021. A emisso de radiao pela reao de oxidao de luminol est ligada
formao do produto eletronicamente excitado 11, que formado a partir
da decomposio do endo-perxido 10. Segundo a proposta de Michl23, a
decomposio do endo-perxido 10 ocorre quando a ligao s entre os dois
tomos de oxignio se rompe, podendo ou no formar o produto excitado.
No caso do produto excitado, possivelmente, no h tempo suficiente
para os eltrons se distriburem entre os novos orbitais, deixando o
novo orbital LUMO ainda ocupado, como mostrado na Figura 4. Por
este raciocnio, podese supor que os caminhos de formao de produto
excitado e no excitado possuem, em algum momento, energias
semelhantes. Poderia haver um cruzamento entre esses caminhos,
levando formao do produto excitado, conforme o diagrama da Figura
5.
Porm, o intermedirio endo-perxido ainda no foi detectado. Isto
pode ser justificado por uma suposta elevadssima velocidade de
decomposio, que inviabilizaria sua deteco. Todos estes estudos
possibilitaram descobertas de alguns detalhes mecansticos que,
eventualmente, podero conduzir elucidao completa da reao. Nas
ltimas dcadas, Mernyi e colaboradores15 alcanaram grandes avanos na
resoluo deste problema mecanstico, sendo as concluses resumidos e
reinterpretadas em trabalho publicado no Journal of Bioluminescence
and Chemiluminescence15. Segundo estes autores, o processo de
oxidao pode ser dividido em duas etapas: (i) os caminhos que levam
ao intermedirio principal, identificado como a-hidroxi-hidroperxido
14; e (ii) a decomposio deste intermedirio (conforme ilustrado na
Figura 6). A primeira etapa significativamente dependente da
composio do meio reacional, como pH, as concentraes dos reagentes,
a natureza dos agentes oxidantes, a composio do tampo e a presena
de qualquer outra espcie que interfira nestas interaes. Por outro
lado, a decomposio do a-hidroxi-hidroperxido 14 parece depender
apenas do pH do meio15. A Figura 6 apresenta um esquema condensado
da proposta mecanstica da reao de oxidao de luminol15, onde as
1006
Ferreira e Rossi
Quim. Nova
Figura 6. Esquema simplificado do mecanismo de oxidao do
luminol. A representa espcies aceptoras de 1 eltron e B representa
nuclefilos. Os valores das constantes cinticas e de equilbrio das
diversas etapas esto apresentados na Tabela 2
setas alargadas foram usadas para destacar os caminhos que levam
formao do intermedirio a-hidroxi-hidroperxido 14, responsvel direto
pela produo da quimiluminescncia. de grande pertinncia aos
interessados na aplicao desta reao, alcanar condies que suprimam as
reaes laterais que no levam quimiluminescncia15. A Tabela 2 traz as
constantes cinticas e de equilbrio envolvidas. Pela proposta da
Figura 6, inicialmente, o mononion do luminol 15 oxidado por uma
espcie aceptora de um eltron, A, formando o radical do luminol 13
que estabelece um equilbrio com sua espcie desprotonada 16. O
aceptor A pode ser qualquer espcie que possa receber um eltron,
como os radicais do luminol 13 e 16, os radicais OH, O2- e O2, e
ctions de metais de transio e vrios de seus complexos, como
ftalocianinas e protenas. A velocidade de formao do radical de
luminol 13 depende da composio de A, variando para cada sistema
particular. Como esta etapa determina a velocidade da reao, sua
cintica pode ser determinada pelo decaimento da
quimiluminescncia15. O papel do radical de luminol Tabela 2.
Valores das constantes cinticas e de equilbrio da Figura 6
Constante koxid 2k1 (A=13) 2k2 (A=16) k2 (A=O2) k3 k4 k5 k6 knuc (B
= OH -) knuc (B = H2O) knuc (B = H2O2) knuc (B = 15) Ka Kb Valor
7,1x10 1,8x109 5,0x108 5,5x102 2,3x108 5,0x107 2,5x105 1,5x103
4,0x106 0,45 1,1x102 1,3x104 2x10-8 4x10-119
Unidade L mol s L mol-1 s-1 L mol-1 s-1 L mol-1 s-1 L mol-1 s-1
L mol-1 s-1 s-1 s-1 L mol-1 s-1 L mol-1 s-1 L mol-1 s-1 L mol-1 s-1
mol L-1 mol L-1-1 -1
Referncia 18,19 22 22 18 18 19 19 19 19 19 19 19 19 19
13 depende da concentrao do radical superperxido, O2, gerado
lentamente pela reao entre 13 e O2. Assim, no incio da reao, o meio
estaria na ausncia de O2 e os caminhos levariam formao de
diazoquinona 8, o que resultaria na formao destas duas espcies no
meio reacional15. A preferncia pelo caminho que formar o
a-hidroxi-hidroperxido 14 ser regida pela (i) concentrao de O2 no
meio, cuja presena favorece a formao do superperxido; ou (ii) pela
concentrao de H2O2 no meio, que aumenta a velocidade da reao entre
HO2- e a diazoquinona 8. Alm disso, a radiao emitida pelo caminho
do superperxido tem um timo em pH 9,2, decorrente da reao
diferenciada entre este radical e os radicais 13 e 16. Por outro
lado, a radiao emitida pelo caminho da diazoquinona 8 regida pela
concentrao de H2O2 em relao a outros nuclefilos presentes. Assim,
se a concentrao de H2O2 for suficientemente alta para competir com
superperxido, a diazoquinona 8 convertida quantitativamente no
a-hidroxi-hidroperxido 14 independente do pH do meio15. A maioria
das aplicaes desta reao para a anlise de ctions de metais de
transio (Ni(II), Th, Tl, As, Al(III), Sn(II), Pb(II), Bi(III),
Cr(III), Fe(II), Fe(III), Os(III), Co(II), Cu(II), Zn(II), Pd(II),
Ag(I), Au(III), Hg(II), Ce(IV), U(VI), Sb (III), Zr (IV), V(III),
Mn(II), e Cd(II))5 traz a idia de que estes ons apresentam ao
cataltica nesta reao, pelo efeito significativo que pequenas
concentraes destes ctions promovem na velocidade da reao, o que
caracteriza a elevada sensibilidade, tpica de mtodos cinticos
catalticos13,24,25. Contudo, dentre os pesquisadores do mecanismo
da reao ainda h controvrsias sobre real papel destes ctions no
mecanismo da reao. Xiao e colaboradores24 propuseram que estes
ctions metlicos poderiam tanto interagir com o luminol e seus
intermedirios quanto com o H2O2, cuja decomposio produziria o
radical OH. Assim, estes autores apresentam 3 propostas para o
efeito destes ctions: (i) a ativao da etapa de produo de radicais
do H2O226,27; (ii) a formao do a-hidroxi-hidroperxido 14 ; e/ou
(iii) a decomposio do ahidroxi-hidroperxido 1424. Embora suas
propostas estejam fundamentadas em resultados empricos, a
complexidade do mecanismo desta reao torna recomendvel mais
detalhamento experimental, o que pode ser encontrado nos trabalhos
de Mernyi e colaboradores15-22, focados na elucidao mecanstica e no
numa aplicao analtica, como no caso do grupo de Xiao. Na proposta
(i) de Xiao e colaboradores, os ctions dos metais e seus complexos
atuariam na decomposio cataltica do H2O2, produzindo o radical OH
que muito reativo com o luminol e seus intermedirios. Contudo,
cerca de 50 % destas reaes com OH produzem compostos que no levam
produo da espcie 1415, que seria o principal atuante na
quimiluminescncia. Porm, isto no considera que a decomposio do H2O2
forma outros radicais, como o superperxido, O2, cuja reao com o
radical luminol desprotonado 16 leva diretamente a formao de 14 e,
conseqentemente, quimiluminescncia. Na proposta (ii), a atuao dos
ctions levaria formao de 14 o que, pela proposta de Mernyi e
colaboradores, coerente, pois alguns ctions podem funcionar como um
receptor de 1 eltron do mononion do luminol 15 e do radical de
luminol 13, formando a diazoquinona 8 cuja reao com HO2- forma 14 e
leva quimiluminescncia. A proposta (iii), sugere que a decomposio
de 14 seria catalisada pelos ctions metlicos, que no concorda com a
proposta mecanstica elaborada por Mernyi e colaboradores15, que
limita esta etapa do mecanismo exclusivamente ao efeito do pH do
meio15. Neste contexto, a suposta ao cataltica dos ctions
possivelmente seria um equvoco, j que os mesmos atuam tanto na
produo de radicais do H2O2 quanto na produo dos intermedirios 13 e
8.
Vol. 25, No. 6
A Quimiluminescncia como Ferramenta Analtica
1007
Como uma pequena variao de concentrao dos ctions metlicos produz
variaes significativas na luminescncia produzida, pode-se supor que
este efeito tenha sido relacionado com a ao cataltica dos ctions
nos trabalhos de aplicao analtica da reao, como pode ser notado na
classificao de Motolla13. Contudo, a confirmao desta ao cataltica
ainda carece de estudos mais elaborados como, por exemplo, estudos
cinticos simultneos das atuaes das espcies presentes neste sistema
reacional. fato que a presena de ons CO32- e Br- na reao
proporciona o aumento da luminescncia observada, pois estas espcies
participam do mecanismo da reao. A interao entre os radicais OH e o
luminol pode gerar outros produtos, alm do radical do luminol 13.
Os radicais OH podem reagir com luminolem posies do anel aromtico e
no produzir o a-hidroxi-hidroperxido 14 nem a quimiluminescncia. Na
presena dos ons CO32- e Br-, os radicais OH so convertidos a
radicais CO3 ou Br, que reagem seletivamente com o luminol,
produzindo o radical do luminol 13 e favorecendo a produo de
luminescncia24. Efeitos anlogos foram observados em estudos de
aplicao da quimiluminescncia do luminol para determinao de cido
ascrbico, que um modificador da velocidade da reao28,29. Parece ser
consensual que, dependendo do sistema utilizado para o
monitoramento (forma de adio e mistura de reagentes e sistema de
deteco) e da procedncia e tempo de utilizao dos reagentes, os
resultados quantitativos e, s vezes qualitativos, podem variar24.
Geralmente, esta variao de resultados est ligada velocidade de
resposta do sistema de deteco e forma de preparao e mistura dos
reagentes, j que existem vrios fatores cinticos que modificam as
concentraes das espcies responsveis pela intensidade e durao da
quimiluminescncia. A despeito de alguma indefinio sobre detalhes do
mecanismo, a reao quimiluminescente do luminol apresenta grande
potencialidade para aplicaes analticas. Isto pode ser verificado
pelo grande nmero de trabalhos publicados nos ltimos anos, conforme
apresentado na seqncia. Aplicaes analticas da quimiluminescncia do
luminol As aplicaes da reao quimiluminescente do luminol em Qumica
Analtica podem ser divididas de acordo com a participao do analito
na reao. Em aplicaes diretas, o analito uma espcie que participa da
reao do luminol como reagente, catalisador ou modificador. J em
aplicaes indiretas, o analito envolve a gerao ou o consumo de
espcies que participam da reao de luminol, sendo esta utilizada
como a forma de deteco de outras reaes ou tcnicas, como em alguns
mtodos de separao e em imunoensaios. Dentre as aplicaes indiretas,
destaca-se a utilizao da reao na determinao de H2O2 produzido pela
oxidao da espcie de interesse por enzimas e os biossensores. Nestes
casos, alm de elevada sensibilidade, obtm-se seletividade,
empregando-se, geralmente, enzima imobilizada em fase slida. Com
estas tcnicas foram j analisados substratos de enzimas oxidases,
como amino-cidos 30, metanol31, acares e DNA32. Nas aplicaes
diretas, as determinaes cinticas (metais de transio) e as
determinaes de inibidores (compostos orgnicos e metais de transio)
destacam-se em aplicaes bastante precisas e com baixos limites de
deteco. Os metais de transio apresentam efeitos catalticos na reao
de oxidao do luminol, porm, em alguns casos, a mistura de alguns
ctions inibe a reao. Este comportamento j foi descrito em vrios
trabalhos5,7. Mais de 30 ons metlicos inibem ou catalisam esta
reao, sendo que o limite de deteco para alguns deles chega a 10-11
mol L-1. Compostos orgnicos que, em geral, atuam como
inibidores da luminescncia da reao, tm sido analisados em
estudos que caracterizam as propostas de aplicao mais promissoras.
A Tabela 3 traz informaes sobre alguns sistemas j estudados34-72.
Alm disso, a anlise de misturas de metais ou de compostos orgnicos
por esta reao, com obteno de dados multidimensionais, considerada
uma ferramenta analtica verstil, precisa e sensvel73, que merece
ser mais estudada. Estatisticamente, pode-se verificar o
crescimento atual do nmero de aplicaes analticas do luminol, como
apresentado na Figura 7. As informaes apresentadas na seqncia foram
obtidas num levantamento bibliogrfico no banco de dados eletrnico
WEB OF SCIENCE 74, com as seguintes palavras chaves: luminol and
(determination or analysis).
Figura 7. Publicaes sobre a reao quimiluminescente do luminol
como aplicao analtica desde 1945
As primeiras publicaes de mtodos analticos com a reao do luminol
aparecem a partir de 1965, tendo como principais contribuintes no
seu desenvolvimento o Japo, os EUA, a China e a Espanha, com maior
nmero de trabalhos nesta linha de pesquisa. A deteco de intensidade
de quimiluminescncia vem sendo aplicada em vrias tcnicas analticas
consagradas. Avaliando-se as publicaes destacadas pela pesquisa
bibliogrfica realizada, verificou-se que as tcnicas que mais
utilizam a quimiluminescncia do luminol so os mtodos de anlise por
injeo em fluxo, inclusive com reagente imobilizado, os mtodos de
separao (cromatografia lquida de alta eficincia, cromatografia
lquida, cromatografia gasosa e eletroforese) e os mtodos de
imunoensaios. Dentre todos os trabalhos encontrados, deve ser
salientado que apenas 6% envolvem mtodos cinticos. Outras tcnicas
que podem ser destacadas so o monitoramento esttico de
quimiluminescncia, biossensores e eletroquimiluminescncia, como
apresentado na Figura 8. Vale destacar o tipo de matriz e analito
mais comumente analisados com mtodos que envolvem reaes
quimiluminescentes. A maioria dos trabalhos publicados aplica-se a
amostras de fludos biolgicos, como tecidos humanos e de animais,
alm de excrees (urina) e sangue (plasma e soro sanguneo), com nfase
em analitos orgnicos como glicose32, colesterol e cortisona59.
Neste contexto, verifica-se que a tcnica de deteco de intensidade
da quimiluminescncia da reao do luminol apresenta aplicabilidade
reconhecida para anlise de diversos compostos orgnicos, em vrios
tipos de amostras, principalmente de origem biol-
1008
Ferreira e Rossi
Quim. Nova
Tabela 3. Algumas aplicaes analticas com a reao
quimiluminescente do luminol Analitos Tipo I N O R G N I C O S
Espcie Co(II) Co(II) Co(II) Co(II), Cu(II) Cr(III), Cr(IV) Cr(III),
H2O2, ons Fe(II), Co(II), Cu(II) Zn(II), Cd(II) Br-
Limite de deteco * 1 pg 10 mol L-8 -1 -1
Amostra sinttica padres de cobre farinha de arroz FeCl3.6H2O gua
fresca sinttica sinttica sinttica sinttica guas sinttica sinttica
gua de rio DNA sinttica sucos de frutas sinttica blis e hop pellet
remdios sinttica sinttica sinttica solues sinttica medicamentos
medicamentos sinttica soro sinttica soro sangue vinho plasma soro
soro gema de ovo plasma
Referncia 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 72 47 48 49 50 51
52 53 37 54 55 56 57 58 59 60 59 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 52
71 72
10
-11
mol L
10-10 mol L-1 10-9 mol L-1 10 g L-6 -6 -1 -1
10 mol L 4 pg 7,5 ng mL fmol
10-7 mol L-1-1
ClO
H2 O 2 H2 O 2 NH 3 PO43-
10-6 mol L-1 210-4 mol L-1 0,5 nmol 2,710-7 mol L-1 110-12 mol
L-1 0,5 nmol L-1 910 mol L-9 -6 -1 -1
cido 3,4-hidroxibenzico cido ascrbico cido lctico cido tnico
cido tartrico cido rico cidos carboxlicos O R G N I C O S cidos
fenlicos cidos inorgnicos e haloacticos Alcanolaminas Captropil
Catecolaminas Cistena Colesterol Cortisona Creatinina D-Glicose
Glicerol Glicose Glicose, H2O2 Glicose, L-fenilalanina Hidroperxido
de fosfatila Hidroperxidos de fosfatilcolina Hidroperxidos de
fosfolipdeos Paracetamol Periodato Prometazina Sacarose e glicose *
Conforme definio nos artigos originais correspondentes
1,510 mol L 1,7 pmol 10-6 mol L-1 0,01 mol L 1 nmol 0,037 mol L
610 mol L-10 -1
HNO3 10-8 mol L-1-1
-1
0,6 nmol 10 mol L-8 -1
4 pmol 0,3 mmol L 12 mg L-1 nveis clnicos 10 mol L-7 -1 -1
10-4 mol L-1
~10-8 mol L-1 7 nmol 10 pmol escala de nmol L 2 g L-1 1,2 10-7
mol L-1 310 mol L-9 -1 -1
plasma medicamentos medicamentos medicamentos alimentos
~10 mol L-6
-1
Vol. 25, No. 6
A Quimiluminescncia como Ferramenta Analtica
1009
Figura 8. Aplicaes analticas da reao quimiluminescente do
luminol divididas pelas tcnicas utilizadas desde 1945
ltica de um nmero muito maior de reaes, tanto rpidas quanto
lentas, e o baixo custo. Apesar disso, inicialmente, houve certa
resistncia para disseminao dos mtodos cinticos de anlise, devido
consolidada confiana nos mtodos clssicos e relativa complexidade
para o tratamento dos dados experimentais. Atualmente, as tcnicas
instrumentais so populares e os mtodos cinticos expandem suas
possibilidades de aplicao, sendo que a popularizao dos computadores
superou qualquer aluso a eventuais dificuldades para tratamento dos
dados experimentais25. Convm destacar outros aspectos favorveis dos
mtodos cinticos, como a possibilidade de minimizar interferncias, o
menor tempo de anlise e a facilidade para automao. Alm disso, as
reaes catalisadas, incluindo as enzimticas, apresentam limites de
deteco to baixos quanto tcnicas mais sofisticadas e utilizadas
comercialmente, como cromatografia lquida de alta eficincia e
espectroscopia de absoro atmica. No se pode negar que os mtodos
cinticos de anlise apresentam aspectos problemticos. A
reprodutibilidade dos resultados envolve a necessidade do controle
das condies que afetam a velocidade das reaes como temperatura, pH,
fora inica, solventes e o processo de adio e mistura de
reagentes13. Porm, um balano geral de suas caractersticas apresenta
um saldo bastante favorvel que justifica estudos para desenvolver
aplicaes. Desenvolvimento de trabalhos e tendncias Nas ltimas
dcadas do sculo XX, o desenvolvimento e o aprimoramento de novas
tcnicas de aquisio e tratamento de dados analticos, conjuntamente
com a necessidade crescente de mtodos de anlise mais sensveis e
seletivos, abriram caminho para novas propostas analticas
destacando-se, dentre outras, os mtodos cinticos de anlise. Isto
pode ser verificado pelo aumento no nmero de publicaes com este
enfoque, identificadas em um levantamento bibliogrfico realizado
com o banco de dados WEB OF SCIENCE73, com as seguintes palavras
chave: (kinetic or kinetics) and (analysis or determination). Desde
1945, foram encontradas catalogadas cerca de 1500 publicaes
(artigos, notas e resumos de encontros) sobre aplicaes analticas da
cintica de reaes em obras de referncia deste site. Com a
popularizao do microcomputador, surgiram vrias anlises catalticas e
no-catalticas e, na dcada de 80, os mtodos cinticos representaram
expressiva parcela das publicaes cientficasem Qumica Analtica13. O
desenvolvimento das tcnicas dinmicas de anlise, como os mtodos de
injeo em fluxo, de fluxo contnuo e segmentado, decididamente
influenciou o crescimento das aplicaes dos mtodos cinticos em vrias
reas, como em anlises clnicas, nas ltimas dcadas do sculo XX25 .
Avaliando-se a mdia de publicaes anual sobre mtodos cinticos de
anlise, nota-se crescimento significativo a partir de 1945, com o
mximo em 1991, quando mais de 80 trabalhos foram publicados. Desde
os anos 70, cerca de 40 trabalhos sobre mtodos cinticos de anlise
so publicados por ano. interessante notar a distribuio por pas de
origem dos trabalhos sobre mtodos cinticos de anlise. Encontram-se
publicaes provenientes dos mais diversos pases. At 1980, Estados
Unidos, a ento Unio Sovitica, Espanha e Alemanha apresentaram o
maior nmero de publicaes. No final do sculo XX, destacou-se a
Espanha com o maior nmero de publicaes nessa linha, reforando a
reconhecida produtividade deste pas em Qumica Analtica. A partir de
1990, outros centros comearam a se destacar com a aplicao dos
mtodos cinticos, principalmente Japo, China e Ir. A diversificao da
origem dos trabalhos publicados pode ser relacionada com o baixo
custo das tcnicas de medida da anlise
gica e ambiental, empregando-se a maioria das tcnicas analticas
j consagradas. Por outro lado, nota-se um nmero reduzido de
trabalhos sobre a utilizao da reao quimiluminescente do luminol em
mtodos cinticos de anlise com pouca participao brasileira, embora,
por exemplo, estejam sendo desenvolvidos trabalhos nessa linha em
nosso laboratrio28,29,75-78. Considerando-se a versatilidade da
reao do ponto de vista analtico e as caractersticas positivas dos
mtodos cinticos de anlise, vislumbra-se uma linha de estudo com
elevada perspectiva de bons resultados, que merece ser desenvolvida
e pode inspirar pesquisadores interessados. Cabe aqui uma avaliao
do ritmo de desenvolvimento dos mtodos cinticos de anlise e os
trabalhos recentemente publicados para fundamentar tal premissa.
MTODOS CINTICOS DE ANLISE Conceito Diversas tcnicas e mtodos
analticos so baseados em medidas de mudanas fsicas, qumicas e
fsico-qumicas de um sistema envolvendo uma reao qumica, que se
inicia com uma dada velocidade e tende ao equilbrio. Num sistema
reacional, pode-se distinguir duas regies: a dinmica ou regio
cintica, na qual ocorre a variao na velocidade de reao, e a esttica
ou regio de equilbrio, na qual os processos envolvidos atingem o
equilbrio. Ambas as regies apresentam grande potencial para aplicao
analtica. Os mtodos clssicos de anlise, de equilbrio ou
termodinmicos, como gravimetria, volumetria e a maioria dos mtodos
instrumentais, so aplicados s reaes quando estas se completam ou
atingem o equilbrio. Nos mtodos cinticos, a aquisio do sinal
analtico feita em condies dinmicas, enquanto as concentraes dos
reagentes e produtos esto variando, antes que a reao atinja o
equilbrio25. Mtodos analticos que envolvem medidas da variao da
velocidade de uma reao qumica pela ao de ativadores ou inibidores
so tambm mtodos cinticos. As grandes vantagens dos mtodos cinticos
de anlise, em relao aos mtodos de equilbrio, so a possibilidade de
aplicao ana-
1010
Ferreira e Rossi
Quim. Nova
cintica, o que pode ter estimulado a disseminao do tema. Pases
como Brasil, ndia, Egito e muitos outros tambm passaram a
desenvolver pesquisas sobre mtodos cinticos, o que contribuiu para
a popularizao da tcnica internacionalmente. Esta distribuio pode
refletir a acessibilidade dos mtodos cinticos de anlise devido s
facilidades de execuo desses mtodos, o que favorece sua
popularizao. Atualmente, os mtodos cinticos de anlise destacam-se
como uma opo analtica extremamente sensvel e barata. Em comparao
aos mtodos de equilbrio, os mtodos cinticos de anlise vm se
tornando populares por sua simplicidade, preciso, menor tempo de
anlise, diminuio do nmero de interferentes e facilidade para a
automao25. Alm disso, quando estes mtodos so associados s tcnicas
quimiomtricas para tratamentos de dados, tornam-se ainda mais
versteis, simplificando at procedimentos de anlise simultnea de
misturas que so de crescente interesse79,80. Desde 1945, o
desenvolvimento das aplicaes dos mtodos cinticos de anlise vem
crescendo, acompanhando os avanos tecnolgicos. Desde a ltima dcada
do sculo XX, estes mtodos podem ser considerados uma rea da Qumica
Analtica reconhecidamente amadurecida por suas aplicaes e seu
desenvolvimento. A partir de novas perspectivas tecnolgicas, como a
robtica e tcnicas sofisticadas de tratamento de dados, Crouch81
indica tendncias para estudos com mtodos cinticos de anlise, que
podem ser assim resumidas: aumento do uso da automao inteligente,
ou seja, todas as condies de anlise controladas por computador;
crescimento da utilizao de dados multidimensionais; desenvolvimento
de tcnicas sofisticadas de tratamento de dados; progresso nos
mtodos de compensao de erros; inovaes dos procedimentos cinticos
com multicomponentes; expanso das aplicaes da determinao cintica e
aplicao das aproximaes cinticas para vrios tipos de respostas
dependentes do tempo. CONCLUSO A reao quimiluminescente do luminol
apresenta propriedades muito interessantes para o desenvolvimento
de aplicaes analticas e isso vem sendo explorado intensamente,
desde 1960. Porm, h poucos trabalhos empregando esta reao em mtodos
cinticos de anlise. Uma avaliao crtica das caractersticas desses
mtodos demonstra vrios aspectos positivos que estimulam estudos
para disseminar sua aplicao com novos sistemas, com a reao do
luminol. H detalhes desafiadores, intrnsecos desta reao que
demandam esforos para viabilizar sua aplicao favorvel em mtodos
cinticos de anlise, o que deve ser aproveitado em novos trabalhos,
com boas perspectivas de resultados satisfatrios. Neste contexto, o
desenvolvimento de mtodos cinticos de anlise com reaes
quimiluminescentes parece ser promissor, principalmente
considerando-se o aspecto de baixo custo da tcnica e a
sensibilidade da reao. Toda esta apresentao pretende servir para
encorajar estudos nesta linha, na qual a produo cientfica nacional
ainda incipiente. AGRADECIMENTOS Fundao de Amparo Pesquisa do
Estado de So Paulo, FAPESP, pelo apoio financeiro para este
trabalho (96/09175-0 e 99/ 00022-5). Ao Prof. Dr. A. P. Chagas pela
leitura do manuscrito e pelas valiosas sugestes.
REFERNCIAS1. Campbell, A. K.; Chemiluminescence: Principles and
Applications in Biology and Medicine, Ellis Horwood Ltd.:
Chichester, 1988. 2. Radziszewski, B.; Ber. Chem. Ges. 1877, 10,
70. 3. Wiedemann, E.; Ann. Physik & Chemie 1888, 34, 446. 4.
Albertin, R.; Arribas, M. A. G.; Bastos, E. L.; Rpke, E.; Sakai, P.
N.; Sanches, A. M. M.; Stevani, C. V.; Umezu, I. S.; Yu, J.;
Baader, W. J.; Quim. Nova 1998, 21, 772. 5. Robards, K.; Worsfold,
P. J.; Anal. Chim. Acta 1992, 266, 147. 6. Nery, A. L. P.; Baader,
W. J.; Quim. Nova 2001, 24, 626. 7. Lee, J.; Cormier, M. J.;
Hercules, D. M. Em Chemiluminescence and Bioluminescence; Cormier,
M. J.; Hercules, D. M.; Lee, J., eds.; Plenum Press: New York,
1973, p. 1. 8. Gundermann, K. D.; Mccapra, F.; Chemiluminescence in
Organic Chemistry, Springer-Verlag: Berlin, 1987. 9. Kellner, R.;
Mermet, J.-M.; Otto, M.; Widmer, H. M.; Analytical Chemistry: the
approved text to the FECS curriculum analytical chemistry,
Wiley-VCH Verlag GmbH: Weinheim, 1998. 10. Worsfold, P. J.; Anal.
Chim. Acta 1992, 266, 145. 11. Jimnez, A. M.; Navas, M. J.; Crit.
Rev. Anal. Chem. 1997, 27, 291. 12. Navas, M. J.; Jimnez, A. M.;
Crit. Rev. Anal. Chem. 2000, 30, 153. 13. Mottola, H. A.; Kinetics
Aspects of Analytical Chemistry, John Wiley & Sons: New York,
1988. 14. Albrecht,H. O.; Z. Phys. Chem. 1928, 10, 70. 15. Mernyi,
G.; Lind, J.; Eriksen, T. E.; J. Biolum. Chemilum. 1990, 5, 53. 16.
Eriksen, T. E.; Lind, J.; Mernyi, G.; J. Chem. Soc. Faraday Trans.
1 1981, 77, 2125. 17. Ljunggren, S.; Mernyi, G.; Lind, J.; J. Am.
Chem. Soc. 1983, 105, 7662. 18. Mernyi, G.; Lind, J.; Eriksen, T.
E.; J. Phys. Chem. 1984, 88, 2320. 19. Mernyi, G.; Lind, J.;
Eriksen, T. E.; J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 7716. 20. Mernyi, G.;
Lind, J.; Eriksen, T. E.; J. Phys. Chem. 1990, 94, 748. 21. Lind,
J.; Mernyi, G.; Eriksen, T. E.; J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 7655.
22. Mernyi, G.; Lind, J.; 5thSymphosium on Radiation Chemistry,
Budapeste, Hungria, 1983. 23. Michl, J.; Photochem. Photobiol.
1977, 25, 141. 24. Xiao, C. B.; King, D. W.; Palmer, D. A.;
Wesolowski, D. J.; Anal. Chim. Acta 2000, 415, 209. 25.
Perez-Bendito, D.; Silva, M.; Kinetic Methods in Analytical
Chemistry, Ellis Horwood Ltd: Chichester, 1988. 26. Salem, A.;
Salem, M. A.; Gemeay, A. H.; J. Mol. Catal. 1993, 84, 67. 27. Zhou,
H.; Shen, Y. F.; Wang, J. Y.; Chen, X.; OYoung C.-L.; Suib, S. L.;
J. Catal. 1998, 176, 321. 28. Ferreira, E. C.; Rossi, A. V.;
Resumos da 23a Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Poos
de Caldas, Brasil, 2000. 29. Ferreira, E. C.; Dissertao de
Mestrado, Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 2001. 30.
Preuschoff, F.; Spohn, U.; Weber, E.; Unverhau, K.; Mohr, K. H.;
Anal. Chim. Acta 1993, 280, 185. 31. Sekine, Y.; Suzuki, M.;
Takeuchi, T.; Tamiya, E.; Karube, I.; Anal. Chim. Acta 1993, 280,
179. 32. Ci, Y.-X.; Zheng, Y.-G.; Tie, J.-K.; Chang, W.-B.; Anal.
Chim. Acta 1993, 282, 695. 33. Kamidate, T.; Ishikawa, A.;
Watanabe, H.; Abe, S.; Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993, 66, 655. 34.
Burguera, J. L.; Towsend, A.; Greenfield, S.; Anal. Chim. Acta
1980, 114, 219. 35. Sakai, H.; Fujiwara, T.; Yamamoto, M.;
Kumamamru, T.; Anal. Chim. Acta 1989, 221, 249. 36. Jones, P.;
Williams, T.; Ebdon, L.; Anal. Chim. Acta 1989, 217, 157. 37. Yan,
B.; Lewis, S. W.; Worsfold, P. J.; Lancaster, J.S.; Gachanja, A.;
Anal. Chim. Acta 1991, 250, 145. 38. Williams, T.; Jones, P.;
Ebdon, L.; J. Chromatogr. 1989, 482, 361. 39. Yan, B.; Worsfold, P.
J.; Robards, K.; Analyst 1991, 116, 1227. 40. Klopf, L. L.; Nieman,
T. A.; Anal. Chem. 1983, 55, 1080. 41. Burguera, J. L.; Burguera,
M.;Towsend, A.; Anal. Chim. Acta 1981, 127, 199. 42. Shakir, I. M.
A.; Faizullah, A. T.; Analyst 1989, 114, 951. 43. Gonzales-Robledo,
D.; Silva, M.; Perez-Bendito, D.; Anal. Chim. Acta 1990, 228, 123.
44. Nabi, A.; Worsfold, P. J.; J. Chem. Soc. Pak. 1987, 9, 575. 45.
Eremim, S. A.; Vlasenko, S. B.; Osipov, A. P.; Eremina; I. D.;
Egerov, A. M.; Anal. Lett. 1989, 22, 2037. 46. Kraus, P. R.;
Crouch, S. R.; Anal. Lett. 1987, 20, 183. 47. Kawasaki, H.; Sato,
K.; Ogawa, J.; Hasegawa, Y.; Yuki, H.; Anal. Biochem. 1989, 182,
336.
Vol. 25, No. 6
A Quimiluminescncia como Ferramenta Analtica66. 67. 68. 69. 70.
71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81.
1011
48. Cui, H.; Jiang, H.; Meng, R.; He, C.; Zhao, H.; Spectrosc.
Spect. Anal. 1999, 19, 377. 49. Alwarthan, A. A.; Analyst 1993,
118, 639. 50. Busch, M.; Polster, J.; Trends Anal. Chem. 1992, 11,
230. 51. Cui, H.; Li, Q.; Meng, R.; Zhao, H.; He, C.; Anal. Chim.
Acta 1998, 362, 151. 52. Gaikwad, A.; Silva, M.; Perez-Bendito, D.;
Analyst 1994, 119, 1819. 53. Feng, M. L.; Huang, Y. W.; Zhang, Z.
J.; Acta Chim. Sinica 1997, 55, 806. 54. Diaz, A. N.; Garcia, J. A.
G.; Anal. Chem. 1994, 66, 988. 55. Shakir, I. M. A.; Faizullah, A.
T.; Analyst 1990, 115, 69. 56. Worsfold, P. J.; Yan, B.; Anal.
Chim. Acta 1991, 246, 447. 57. Xinrong, Z.; Baeyens, W. R. G.;
VanderWeken, G.; Calokerinos, A. C.; Nakashima, K.; J. Pharm.
Biomed. Anal. 1995, 13, 425. 58. Zhang, C. X.; Huang, J. C.; Zhang,
Z. J.; Aizawa, M.S.; Anal. Chim. Acta 1998, 374, 105. 59. Kubo, H.;
Toriba, A.; Anal. Chim. Acta 1997, 353, 345. 60. Blum, L. J.;
Plaza, J. M.; Coulet, P. R.; Anal. Lett. 1987, 20, 317. 61.
Petersson, B. A.; Hansen, E. H.; Ruzicka, J.; Anal. Lett. 1986, 19,
649. 62. Petersson, B. A.; Anal. Lett. 1989, 22, 83. 63. Puchades,
R.; Lemieux, L.; Simard, R. E.; J. Food Sci. 1991, 56, 1097. 64.
Worsfold, P. J.; Farrely, J.; Matharu, M. S.; Anal. Chim. Acta
1984, 164, 103. 65. Abdel-Latif, M. S.; Guibault, G. G.; Anal.
Chim. Acta 1989, 221, 11.
Igarashi, S.; Hinze, W. L.; Anal. Chim. Acta 1989, 225, 147.
Miyazawa, T.; Yasuda, K.; Fujimoto, K.; Anal. Lett. 1987, 20, 915.
Miyazawa, T.; Saeki, R.; Inaba, H.; J. Biolumin. Chemilumin. 1989,
4, 475. Miyazawa, T.; Fujimoto, K.; Oikawa, S.; Biomed. Chromatogr.
1990, 4, 131. Alapont, A. G.; Zamora, L. L.; Calatayud, J. M.; J.
Pharm. Biomed. Anal. 1999, 21, 311. Alwarthan, A. A.; Al-Tamrah, S.
A.; Akel, A. A.; Anal. Chim. Acta 1993, 282, 169. Koerner, C. A.;
Nieman, T. A.; Anal. Chem. 1986, 58, 116. Kamidate, T.; Kuniya, I.;
Watanabe, H.; Chem. Lett. 1993, 12, 2049.
http://webofscience.fapesp.br, acessada em Outubro 2001. Lebedeva,
O. V.; Ugarova, N. N.; J. Anal. Chem. 1995, 50, 1017. Ferreira, E.
C.; Rossi, A. V.; Resumos da 24a Reunio Anual da Sociedade
Brasileira de Qumica, Poos de Caldas, Brasil, 2001. Ferreira, E.
C.; Rossi, A. V.; Rohwedder, J. J. R.; Resumos da 24a Reunio Anual
da Sociedade Brasileira de Qumica, Poos de Caldas, Brasil, 2001.
Ferreira, E. C.; Rossi, A. V.; trabalho no publicado. Xie, Y.;
Baeza-Baeza, J. J.; Ramis-Ramos, G. A; Anal. Chim. Acta 1996, 321,
75. Cueva, J. M. D.; Rossi, A. V.; Poppi, R. J.; Chem. Intell. Lab.
Sys. 2001, 55, 125. Crouch, S. R.; Anal. Chim. Acta 1993, 283,
453.
