2. Padroes citoquimicos

Histologia&Embriologia Padrões Citoquímicos

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Corantes: substâncias com a propriedade de associar selectivamente uma cor a elementos celulares

Padrões citoquímicos: modelos nos quais a um corante se faz corresponder a coloração de determinados elementos celulares.

Hemalúmen-Eosina

A hematoxilina é um corante indirecto, de acção progressiva, associado a um mordente, o alúmen de potassio. Desta associação resulta uma laca, o hemalúmen:

Cora estruturas carregadas negativamente (ácidas) de azul-arroxeado (ex.: DNA, RNA)

Comporta-se como um corante básico, corando o núcleo, o retículo endoplasmático rugoso e ribossomas (devido à elevada concentração em DNA e RNA, respectivamente) – coram organelos que apresentam basofilia A eosina:

É um corante directo mas de acção igualmente progressiva. Comporta-se como um corante ácido Cora estruturas carregadas positivamente (básicas) de

vermelho ou rosa (ex.: maioria das proteínas citoplasmáticas e algumas fibras da matriz extracelular)

Em termos gerais, a aplicação do hemalúmen-eosina em células animais cora os núcleos de azul e o citoplasma de rosa ou vermelho.

Azul de Toluidina

Corante básico, Em alguns casos produz uma coloração distinta da sua própria cor

(metacromasia) Cora moléculas carregadas negativamente como os

glicosaminoglicanos de vermelho-púrpura. Destacam-se metacromasias ao nível das granulações dos mastócitos

existentes no tecido conjuntivo do eixo das vilosidades intestinais e nos grânulos de secreção das células caliciformes.

Os núcleos são corados duma forma ortocromática, ou seja, num azul transmitido pelo próprio grupo cromóforo do corante.

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Azul ciano

É um corante da mucina. Certos tipos de mucina, mas não todos, são corados de azul por este

método (ex:cartilagem). Pode ser usado em conjugação com outros métodos de coloração como

H&E ou van Gieson. Qd esta técnica é combinada com a de van Gieson, a cor deste corante torna-se verde.

Ácido Periódico-Schiff (PAS)

O ácido periódico é um agente oxidante que quebra as ligações C-C dos grupos 1,2glicol, transformando-os em di-aldeídos.

Os aldeídos resultantes podem assim combinar-se com o reagente de Schiff.

Todas as substâncias que contêm estes grupos 1,2glicol, são PAS-positivas:

Polissacáridos (glicogénio, amido, celulose) Glicoconjugados (glicolípidos, glicoproteínas e glícidos

fosforilados). Estruturas PAS-positivas:

Prato estriado com o seu glicocálix Células caliciformes devido à existência de mucina Membrana basal pela presença da laminina

Feulgen

É uma técnica específica para o DNA que cora de roxo mais ou menos intenso, consoante o estado de condensação da cromatina.

A coloração pelo reagente de Schiff requer uma hidrólise moderada do DNA com ácido clorídrico (expondo grupos aldeído livres nas moléculas de desoxiribose).

Os grupos aldeído dos ácidos nucleicos, combinam-se então com o reagente de Schiff (composto por fucsina e ácido sulfuroso), originando-se uma côr púrpura arroxeada nos locais onde existe DNA.

Verde de Metilo-Pironina

Par de corantes de acção directa e progressiva, que apresentam uma grande afinidade para os ácidos nucleicos.

O verde de metilo é um corante básico, que apresenta especifidade para o DNA.

A pironina também é um corante básico, mas que cora o RNA de vermelho.

Assim, os núcleos das células coram de roxo (verde + vermelho), enquanto o citoplasma cora de vermelho.

Células com um grande conteúdo citoplasmático em RNA, como os plasmocitos situados no eixo conjuntivo das vilosidades e as células epiteliais das criptas de Lieberkuhn, são intensamente coradas pela pironina

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Tricrómios

Mistura de 3 corantes. Esta técnica é uma das chamadas técnicas para o tecido conjuntivo, já

que é usada para demonstrar elementos do tecido de sustenção, principalmente colagéneo.

P.ex., na cirrose hepática aumenta a quantidade de tecido conjuntivo fibroso, o que é facilmente observável com esta técnica.

Há dois grupos: Van Gieson : cora colagéneo de vermelho Masson/Mallony/Cajal : coram colagéneo de verde/azul

Tricrómio de massonAzul: núcleos e outras estruturas basófilasVerde/azul (dependendo de qual das variantes da técnica for utilizada): colagéneoVermelho brilhante: citoplasma, músculo, eritrócitos, ceratina.

Van Giesoncolagéneo corado de vermelhonúcleos corados de azuleritrócitos e citoplasma de amarelo

Quando usado em combinação com um corante para fibras elásticas (Weigert), a elastina cora de azul/preto, para além dos resultados acima decritos. Essa técnica de coloração é particularmente útil para vasos sanguíneos e pele.

Coloração para reticulina

Demonstra as fibras de reticulina do tecido de sustentação que se coram de azul/preto.

Os nucleos podem ser contracorados em azul pela hematoxilina ou de vermelho, pelo corante vermelho neutro.

Alcian Blue

Cora certos tipos de mucina de azul

Azan

Método para tecido conjuntivo, mas excelente para demonstração de detalhes citológicos finos, especialmente no epitélio:

Nucleos vermelho brihante Colagénio e membranas azul Musculos e eritrócitos laranja a vermelho.

Giemsa

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Método padrão para corar células sanguineas e outros esfregaços de células

Nucleos azul escuro a violeta Citoplasma azul palido Eritrócitos rosa palido

Hematoxilina férrica

É a principal substância utilizada no método de Bharadway-Love. É um corante indirecto, que recorre ao alúmen de ferro amoniacal em

solução aquosa como mordente. De acção regressiva, tem grande afinidade para proteínas, corando

com maior intensidade as mitocôndrias de cor negra. Num procedimento de elevada diferenciação, destaca sobretudo

lipoproteínas.

Metodo de Nissl e do azul de metileno

Utilizam a substância de Nissl para corar o reticulo endoplasmático rugoso encontrado nos neurónios.

Preto do Sudão e Tetróxido de ósmio

Evidenciam estruturas contendo lipidos, com a mielina, numa cor preto acastanhado.

Sais de prata

Cora o colagéneo tipo III Reticulina Este método demonstra as fibras de reticulina do tecido de sustentação,

que se coram de azul/preto por esta técnica. Os núcleos podem ser contracorados em azul pela hematoxilina ou em

vermelho pelo corante vermelho neutro.

Métodos da prata e do ouro

Hoje em dia são ocasionalmente usados para demonstrar estruturas finas como prolongamentos celulares, p.ex. em neurónios, placas motoras terminais e junções intercelulares.

Dependendo do método utilizado, o produto final é preto, marrom ou dourado.

Técnicas imuno-histoquimicas

Permite identificar qualquer substância (antigenio), desde que haja anticorpos disponiveis contra a mesma.

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Os anticorpos são produzidos através da injecção da substância humana que se pretende distinguir noutro animal. Esse animal reconhece-a como estranha e começa a produzir anticorpos contra o antigénio. Desse modo pode ser criada uma fonte inextinguivel, usando-se a tecnologia monoclonal.

Coloca-se um corte de tecido numa lâmina de vidro e uma solução de anticorpos é colocada sobre a preparação.

O anticorpo fixa-se ao antigénio e o excesso de anticorpos é lavado, de modo que apenas as células que têm o antigénio têm o anticorpo fixado a si.

Para demonstrar a posição do anticorpo na célula existem vários métodos:

Metodo imunofluorescência: os anticorpos são previamente marcados com uma substância fluorescente (fluoresceína) sendo indentificado posteriormente com um microscopio de fluorescência.

Método imunoperoxidase: os anticorpos são marcados com uma enzima, com a peroxidase) que converte um substrato incolor num produto colorido.

Citoquímica de Enzimas

Caracteriza-se por uma identificação enzimática selectiva, recorrendo-se habitualmente a cortes por congelação num crióstato para evitar a desnaturação proteica.

Fosfatase alcalina A actividade fosfatase alcalina apresenta-se associada a proteínas

secretadas, sendo ancorada no exterior da célula pelo glicocálix. Não existe, portanto, em lisossomas. A sua concentração aumenta ao longo da vilosidade intestinal desde a

sua porção basal até à porção apical onde a coloração castanho/cinzento-escuro, mais intensa, denota um papel na absorção intestinal.

Simultaneamente, demonstra a progressiva diferenciação que os enterocitos sofrem no seu trajecto de migração da base para o topo das vilosidades.

Fosfatase ácida A actividade fosfatase ácida apresenta-se predominantemente

associada a enzimas de degradação intracelular, embora possa encontrar-se associada ao glicocálix e, neste caso, com marcação do prato estriado.

Tal como acontece para a fosfatase alcalina, observa-se um progressivo aumento da actividade fosfatase alcalina no prato estriado da base para o topo das vilosidades.

Como esperado, o método determina a coloração dos lisossomas de castanho/laranja-escuro.

Autoradiografia

Permite identificar o percurso e o destino de substâncias radioactivas introduzidas na célula, por impressão de emulsões fotográficas pela radiação emitida.

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Utilizam-se para o efeito isótopos radioactivos previamente incorporados em precursores de moléculas biológicas.

Aplica-se habitualmente a técnica de pulso-caça, na qual após um período de administração do isótopo radioactivo (pulso - neste caso, timidina tritiada) este é substituído pela forma não radioactiva (caça - na qual se segue o trajecto do isótopo incorporado).

As imagens referem-se a material recolhido em epitélio intestinal de ratinho, ao fim dum período de 2 horas, 6 horas, 1 dia e 3 dias, onde é visível a migração centrípeta de grãos de autoradiografia da zona basal para a extremidade apical das vilosidades.

O facto observado deve-se à incorporação da timidina em células com actividade mitótica que, no caso das vilosidades intestinais, se encontram exclusivamente nas criptas de Lieberkuhn da sua extremidade basal.

A migração posterior dos grãos de autoradiografia resulta da deslocação de células já diferenciadas, por pressão de células recém-diferenciadas a partir das células estaminais da base da vilosidade.

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