Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com …repositorio.ufop.br/bitstream/123456789/5707/1/TESE... · 3.2.1 Determinação do hematócrito ... 3.2.9 Atividade da

Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica

Ação do antioxidante tempol na hipertensão em

ratos com resistência à insulina induzida por frutose

e alimentados com dieta rica em sal

Waleska Claudia Dornas Amaral

Ouro Preto 2013

Waleska Claudia Dornas Amaral

Ação do antioxidante tempol na hipertensão em

ratos com resistência à insulina induzida por frutose

e alimentados com dieta rica em sal

Ouro Preto NUPEB-UFOP

2013

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do titulo de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica. Orientador Dr. Marcelo Eustáquio Silva Laboratório de Nutrição Experimental

Catalogação: [email protected]

A485a Amaral, Waleska Claudia Dornas. Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com resistência à

insulina induzida por frutose e alimentados com dieta rica em sal [manuscrito] / Waleska Claudia Dornas Amaral. - 2014.

118f.: il. color.; tabs.; quadro. Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

1. Frutose - Teses. 2. Resistência à insulina - Teses. 3. Reação de oxidação-reação - Teses. 4. Hipertensão - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.

CDU: 612.349.8

mailto:[email protected]

iv

v

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da

Universidade Federal de Ouro Preto, com o auxílio financeiro da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

vi

Dedicatória

A todas as pessoas que ajudaram e que se dedicaram para a realização deste trabalho.

vii

Agradecimentos

Ao meu orientador, Prof. Marcelo Eustáquio Silva, pela oportunidade e confiança.

Ao colaborador na pesquisa, Prof. Wanderson Geraldo de Lima.

Ao Prof. Rinaldo Cardoso dos Santos, pela ajuda constante.

Aos colegas do laboratório que foram imprescindíveis em vários momentos da pesquisa.

Ao Laboratório de Bioquímica Metabólica.

Ao Laboratório Piloto de Análises Clínicas da Escola de Farmácia.

À Profa. Andreia Carvalho Alzamora e Prof. Deoclécio Alves Chianca Júnior por gentilmente disponibilizarem aparelho para medida de pressão arterial durante o estudo.

Ao técnico do Laboratório de Nutrição Experimental, Jair Pastor Mota.

viii

Resumo Dornas WC. Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com resistência à insulina induzida por frutose e alimentados com dieta rica em sal. [tese]. Ouro Preto: Universidade Federal de Ouro Preto, 2013. A frutose é um açúcar altamente lipogênico que tem efeitos metabólicos drásticos no fígado e está associado a muitos componentes da síndrome metabólica. No entanto, não se sabe se a hiperinsulinemia desencadeada por frutose dietética, que sensibiliza a pressão sanguínea para a ingestão de sal, causa ou não hipertensão sustentada e se o estresse oxidativo contribui para a regulação da pressão arterial em tais condições. Assim, nesse estudo foi inicialmente avaliado o efeito da dieta com elevado teor de sal em ratos alimentados com suplementação de frutose na água e, em sequência, foi testado se radical superóxido contribui para a elevação da pressão sanguínea nesse modelo. Glicemia e trigliceridemia de jejum foram maiores em ratos alimentados com frutose do que em ratos controle, enquanto que o fígado também diferiu nesses animais, produzindo esteatose. Ratos alimentados com frutose sob dieta rica em sal, reduziram sensibilidade à insulina desenvolvendo hiperinsulinemia, o que levou a aumento dos níveis de sódio sérico. Somado a isso, observou-se peroxidação lipídica com diminuição do nível de defesas antioxidantes verificado pela menor atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase e diminuição da razão glutationa reduzida/oxidada no fígado. Especificamente, tratamento com frutose não causou uma direta ação hipertensiva, enquanto sobrecarga de sal elevou significativamente pressão arterial sistólica. A magnitude da hipertensão foi associada ao consumo de sal. Porém, ratos tratados associadamente com alto teor de frutose e de sal, mesmo consumindo menos sal que o grupo tratado apenas com sal, apresentaram níveis pressóricos semelhantes de aumento de pressão, podendo-se atribuir um papel contributivo para a frutose na elevação da pressão arterial. Por outro lado, administração do antioxidante tempol, um mimético da superóxido dismutase que é a maior enzima envolvida na remoção do radical superóxido, preveniu o progressivo aumento da resposta pressórica encontrada para ratos alimentados com alto teor de frutose e sal relacionado à melhora de desordem metabólica. Dessa forma, pode-se considerar que o estresse oxidativo contribuiu para as alterações na pressão arterial sistêmica, indicando a participação do radical livre de oxigênio, superóxido, na manutenção da pressão sanguínea no modelo desenvolvido. Palavras-chave: Frutose, resistência à insulina, estresse oxidativo, hipertensão, tempol.

ix

Abstract Dornas WC. Antioxidant action of tempol on hypertension in rats with insulin resistance induced by fructose and fed high-salt diet. [thesis]. Ouro Preto: Universidade Federal de Ouro Preto, 2013. Fructose is a highly lipogenic sugar that has profound metabolic effects in the liver and is associated with many of the components of metabolic syndrome. However, it is not known whether hyperinsulinemia triggered by dietary fructose, which sensitizes the blood pressure to salt intake, causes sustained hypertension and if oxidative stress contributes to the regulation of arterial pressure in such conditions. So, the current study initially evaluated the effect of a high-salt and fructose-enriched diet in rats, and in sequence whether superoxide radicals contribute to increased blood pressure in this model. Fasting glycemia and triglyceridemia were higher in fructose-fed rats than in control rats, whereas the liver also differed in these animals, generating steatosis. Fructose-fed rats with high-salt diet had reduced insulin sensitivity triggering hyperinsulinemia, which led to increased levels of serum sodium. In addition, lipid peroxidation and decreased antioxidant defenses as verified by the lower activity of superoxide dismutase, catalase, and a lower ratio of reduced/oxidized glutathione in the liver. Specifically, the fructose treatment did not cause a direct hypertensive action, while salt overload significantly elevated systolic blood pressure. The magnitude of hypertension was associated with salt intake. Despite consuming less salt, rats treated with fructose and salt showed a pattern of blood pressure rise similar to those consuming a high-salt diet, which indicates that fructose contributes to the rise in blood pressure. Moreover, administration of the antioxidant tempol, a mimetic of superoxide dismutase, the most commonly involved enzyme in the removal of superoxide radicals, prevented a progressive increase in the hypertensive response in high-fructose and salt-fed rats, associated with the improvement of metabolic disorder. Thus, it is possible that oxidative stress contributed to changes in systemic blood pressure, indicating the involvement of the oxygen free radical, superoxide, in the maintenance of blood pressure in the model developed.

Key words: Fructose, insulin resistance, oxidative stress, hypertension, tempol.

x

Sumário Introdução ......................................................................................................................................... 1

1- REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................................... 3

1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES ........................................................................................ 3

1.1.1 Hipertensão ............................................................................................................... 5

1.1.2 Síndrome Metabólica ................................................................................................ 5

1.2 FRUTOSE ............................................................................................................................. 6

1.2.1 Frutose na alimentação ............................................................................................. 6

1.2.2 Metabolismo da frutose ............................................................................................ 8

1.2.3 Frutose, lipogênese e resistência à insulina ........................................................... 11

1.2.4 Frutose e hiperuricemia .......................................................................................... 15

1.2.5 Frutose e hipertensão .............................................................................................. 18

1.2.6 Frutose e estresse oxidativo.................................................................................... 21

1.3 SÓDIO ............................................................................................................................... 24

1.3.1 Sódio na alimentação .............................................................................................. 24

1.3.2 Fisiologia do sódio ................................................................................................... 26

1.3.3 Sódio e homeostase hídrica .................................................................................... 27

1.3.4 Sódio e hipertensão ................................................................................................. 29

1.3.5 Sódio e estresse oxidativo ....................................................................................... 31

2- OBJETIVOS ................................................................................................................................ 34

2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 34

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 34

3- MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................... 35

3.1 ANIMAIS E TRATAMENTOS ............................................................................................. 35

3.1.1 Protocolo A: Avaliação e padronização do modelo experimental......................... 35

3.1.2 Protocolo B: Efeito do antioxidante tempol em animais alimentados com dieta

rica em frutose e sal ................................................................................................................ 36

3.1.3 Dieta ......................................................................................................................... 37

3.1.4 Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca por pletismografia ............ 37

3.1.5 Teste oral de tolerância à glicose ............................................................................ 38

3.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .................................................................................................. 38

3.2.1 Determinação do hematócrito ................................................................................ 38

3.2.2 Contagem diferencial de leucócitos ........................................................................ 39

xi

3.2.3 Atividade da paraoxonase-1 ................................................................................... 39

3.2.4 Concentração da insulina e leptina ......................................................................... 39

3.2.5 Determinação de sódio ........................................................................................... 40

3.2.6 Extração da gordura hepática ................................................................................. 40

3.2.7 Oxidação de lipídeos (peroxidação lipídica) pela dosagem das substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico .............................................................................................. 40

3.2.8 Atividade da superóxido dismutase........................................................................ 41

3.2.9 Atividade da catalase .............................................................................................. 42

3.2.10 Concentração de glutationa .................................................................................... 42

3.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ..................................................................................... 44

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................................... 44

4- RESULTADOS ............................................................................................................................ 45

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL ........................................................... 45

4.1.1 Peso corporal, da gordura abdominal e dos órgãos, ingestão alimentar,

indicadores de função hepática e parâmetros metabólicos .................................................. 45

4.1.2 Sódio sérico .............................................................................................................. 47

4.1.3 Células sanguíneas ................................................................................................... 48

4.1.4 Peroxidação lipídica e componentes dos sistemas antioxidantes ......................... 49

4.1.5 Histopatologia hepática .......................................................................................... 52

4.1.6 Pressão arterial sistólica e correlação com consumo de sal .................................. 54

4.2 AÇÃO DO ANTIOXIDANTE TEMPOL ................................................................................. 55

4.2.1 Ganho de peso, de gordura abdominal e ingestão alimentar ............................... 55

4.2.2 Hematócrito, proteínas e glicose plasmática ......................................................... 55

4.2.3 Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da paraoxonase-1 .......................... 56

4.2.4 Peso relativo do fígado e parâmetros de função hepática .................................... 57

4.2.5 Peso relativo dos rins e produtos de degradação metabólica ............................... 57

4.2.6 Resposta pressórica e relação com peroxidação lipídica ....................................... 58

4.2.7 Correlação entre pressão arterial média e parâmetros sanguíneos...................... 60

5- DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 61

6- CONCLUSÕES ............................................................................................................................ 77

Referências Bibliográficas ............................................................................................................... 78

Anexos ............................................................................................................................................ 102

xii

Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos

A ADH hormônio antidiurético AGL ácido graxo livre ALT alanina aminotransferase ALP fosfatase alcalina AMP monofosfato de adenosina ANG I angiotensina I ANG II angiotensina II ANP peptídeo natriurético atrial ATP trifosfato de adenosina APO-B apolipoproteína B AST aspartato aminotransferase AVE acidente vascular encefálico

B BH2 diidrobiopterina

BH4 tetrahidrobiopterina

C C controle CT controle + tempol CAT catalase CIS cisteína COX cicl ooxigenase

D DAHL-SS rato Dahl sensível ao sal

DAHL-SR rato Dahl resistente ao sal DAP doença arterial periférica DCV doença cardiovascular DCC doença cardíaca coronária DIC doença isquêmica do coração

EF ECA enzima conversora da angiotensina

ERO espécie reativa de oxigênio F frutose

FS10 frutose e sal 10 semanas FS20 frutose e sal 20 semanas FS20T frutose e sal 20 semanas + tempol

G GFR taxa de filtração glomerular

GLUT5 transportador de frutose GPx glutationa peroxidase GSH glutationa reduzida GSSG glutationa oxidada

H HAS hipertensão arterial sistêmica

HbA1c hemoglobina glicosilada HDL lipoproteína de alta densidade HFCS xarope de milho rico em frutose H2O2 peróxido de hidrogênio

xiii

HOMA modelo de avaliação da homeostase

IJK L LDL lipoproteína de baixa densidade

LDN lipogênese de novo

MN MDA malonildialdeído mRNA RNA mensageiro NaCl cloreto de sódio NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NAFLD doença hepática gordurosa não alcoólica Na+K+-ATPase bomba de sódio potássio NCEP/ATP III National Cholesterol Education Progran – NCEP Adult Treatment Panel III NO óxido nítrico NOS óxido nítrico sintase eNOS óxido nítrico sintase endotelial nNOS óxido nítrico sintase neuronal

O (O2•−) ânion superóxido

(OH•) radical hidroxil OMS Organização Mundial de Saúde (ONOO−) peroxinitrito oxLDL lipoproteína de baixa densidade oxidada

P PA pressão arterial

PAD pressão arterial diastólica PAM pressão arterial média PAS pressão arterial sistólica PAT-1 transportador de cloro PON1 paraoxonase-1

Q R RI resistência à insulina

S S sal

SHR ratos espontaneamente hipertensos SM síndrome metabólica SNC sistema nervoso central SNS sistema nervoso simpático SOD superóxido dismutase SRA sistema renina-angiotensina SRAA sistema renina-angiotensina aldosterona

T TBA ácido tiobarbitúrico

TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TEMPOL 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil TG triacilglicerol TOTG teste oral de tolerância à glicose

UV VLDL lipoproteína de muito baixa intensidade

XWYZ WKY Wistar-Kyoto

xiv

Lista de Ilustrações

Figura 1: Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares e suas diferentes causas no Brasil,

em 2007.............................................................................................................................................. 4

Figura 2: Formas isoméricas da frutose ............................................................................................. 8

Figura 3: Frutose e metabolismo da glicose nas células do fígado .................................................... 9

Figura 4: Efeitos do consumo crônico de frutose. ........................................................................... 11

Figura 5: Mecanismo proposto pelo qual frutose na dieta resulta em hipertensão ....................... 19

Figura 6: Formação de EROs a partir da redução de O2 ................................................................... 21

Figura 7: Função renal na homeostase de água e sal. ..................................................................... 28

Figura 8: Protocolo A ........................................................................................................................ 36

Figura 9: Protocolo B ........................................................................................................................ 36

Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose nos grupos experimentais ......................................... 47

Figura 11: Valores séricos de sódio para os grupos experimentais ................................................. 48

Figura 12: Concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no coração, no

fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais ..................................................................... 49

Figura 13: Atividade da enzima superóxido dismutase no coração, no fígado e no rim dos

diferentes grupos experimentais. .................................................................................................... 50

Figura 14: Atividade da enzima catalase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos

experimentais. .................................................................................................................................. 51

Figura 15: Concentração de glutationa total, reduzida, oxidada e relação de glutationa reduzida

para oxidada no fígado dos diferentes grupos experimentais......................................................... 52

Figura 16: Fotomicrografia representativa da coloração hematoxilina e eosina (H&E) de seções

hepáticas de ratos nos diferentes grupos experimentais ................................................................ 53

Figura 17: Correlação de Pearson entre valores de PAS final (mmHg) e consumo de sal (g/dia). .. 54

Figura 18: Comparação das mudanças ao longo dos tratamentos para pressão arterial sistólica

(PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC) dos diferentes grupos

experimentais ................................................................................................................................... 59

Figura 19: Correlação de Pearson entre valores de PAS (mmHg), PAD (mmHg) final e substâncias

reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmoles/mL). ................................................................... 59

Figura 20: Esquema dos efeitos gerais induzidos pelo modelo dietético utilizado e pelo tratamento

com tempol em ratos Fischer ........................................................................................................... 76

xv

Quadros

Quadro 1: Grupos de causas de óbito na população brasileira em 2007 .......................................... 4

Quadro 2: Critérios da NCEP/ATPIII ................................................................................................... 6

Quadro 3: Efeitos de diferentes rotas de administração de frutose em diferentes espécies por

variados períodos ............................................................................................................................. 14

Quadro 4: Quantidades equivalentes entre sódio e sal .................................................................. 25

Tabelas

Tabela 1: Composição das dietas dos grupos experimentais .......................................................... 37

Tabela 2: Características dos grupos experimentais ....................................................................... 46

Tabela 3: Contagem de leucócitos nos grupos experimentais ........................................................ 48

Tabela 4: Registro pressórico dos grupos experimentais ao longo do experimento ...................... 54

Tabela 5: Peso corporal, da gordura abdominal e ingestão alimentar nos grupos experimentais . 55

Tabela 6: Hematócrito, proteínas e glicose plasmática em animais experimentais ....................... 56

Tabela 7: Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da PON1 nos grupos experimentais ........ 56

Tabela 8: Peso relativo do fígado, atividade sérica de transaminases e fosfatase alcalina nos

grupos experimentais ....................................................................................................................... 57

Tabela 9: Peso relativo dos rins e produtos de degradação nos grupos experimentais ................. 58

Tabela 10: Correlação entre PAM final (mm/Hg) e parâmetros sanguíneos nos grupos

experimentais ................................................................................................................................... 60

Introdução

1

Introdução

A ocorrência generalizada de doenças crônicas como obesidade, diabetes,

hipertensão e dislipidemia, juntas conhecidas como síndrome metabólica (SM),

crescentemente causam morbidade e mortalidade em humanos (LAKKA et al., 2002;

GANG et al., 2004; GIRMAN et al., 2004). Entretanto, frente à complexa interação entre

susceptibilidade genética e fatores ambientais, o papel de cada um dos elementos

envolvidos nessa enfermidade é, muitas vezes, pouco compreendido devido a aspectos

éticos ou inerentes à própria doença e ao modo de investigação limitarem o estudo em

seres humanos. Esse fato levou os pesquisadores a utilizarem modelos animais tornando-

os extremamente úteis e vantajosos por fornecerem subsídios para a melhor

compreensão das causas e da progressão da doença, além de testarem potenciais

intervenções terapêuticas. Nesse sentido, uma grande variedade de modelos

experimentais geram dados que são ferramentas importantes para a investigação das

doenças cardiovasculares (DCVs).

Uma mudança no padrão dietético de ratos foi utilizada no presente estudo,

tentando mimetizar a dieta ocidental, uma vez que está bem estabelecido que o alto

consumo de produtos alimentícios industrializados, ricos em açúcar e em sal e que

promovem distúrbios à homeostase, potencializam a incidência de DCV. O aumento no

consumo alimentar de frutose coincide com a crescente prevalência de obesidade e SM

nas duas últimas décadas (JOHNSON et al., 2007) e dados observacionais e experimentais

indicam uma associação entre maior consumo de sal nos dias atuais e elevação da

pressão arterial (PA) (ELLIOTT & BROWN, 2006). Todavia, os mecanismos pelos quais

decorrem todas essas alterações promovidas por diferentes fatores, permanecem

parcialmente desconhecidos, o que evidencia a importância de maiores investigações.

Pesquisa em roedores demonstra que o aumento da ingestão dietética de frutose

estimula a absorção de sal no intestino delgado e nos túbulos renais, resultando em

estado de sobrecarga de sal, ajustando-se, assim, em movimento a uma cascata de

eventos que levam à hipertensão (SOLEIMANI & ALBORZI, 2011). Além disso, o excesso de

ingestão de sódio e alterações na manipulação do mineral, conduzindo à sua retenção,

Introdução

2

são conceitos fisiopatológicos básicos da hipertensão arterial. A insulina apresenta um

efeito antinatriurético, estimulando a reabsorção renal de sódio. Esse efeito é claramente

mantido, e, talvez aumentado, em indivíduos com resistência à insulina (RI),

representando também um papel importante no desenvolvimento da hipertensão arterial

(HORITA et al., 2011).

Por outro lado, há evidências de que o tratamento com antioxidantes, como a

vitamina E, melhora a RI em ratos alimentados com frutose (FAURE et al., 1997) e previne

hipertensão (VASDEV et al., 2002). Acredita-se que dano oxidativo causado pela dieta é

devido a defeito no mecanismo de defesa antioxidante e ao aumento da produção de

radicais livres que desempenham um papel fundamental nas alterações cardiovasculares

associadas à RI (DELBOSC et al., 2005). Alto conteúdo de sal na dieta de ratos obesos, por

sua vez, foi associado a estresse oxidativo e à mudanças renais (DOBRIAN et al., 2003)

com possibilidade de que a elevada produção de radical superóxido (O2•−) vascular

origina-se, principalmente, a partir de uma maior atividade de nicotinamida adenina

dinucleotídeo fosfato (NADPH)-oxidase.

Desse modo, o interesse no papel do estresse oxidativo em uma variedade de

doenças chama a atenção para substâncias que impedem a geração de espécies reativas

de oxigênio (EROs). Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil), um membro da

família nitróxido, tem sido estudado extensivamente em modelos animais de estresse

oxidativo aumentado e os seus efeitos, sobre a função endotelial e hipertensão, costuma

mostrar resultados diversos em função dos diferentes modelos usados (BANDAY et al.,

2005; PRETI et al., 2005; DeRICHELIEU et al., 2005; PIRES et al., 2010). A química do

tempol e seus efeitos sobre a regulação da PA foi revisada recentemente (WILCOX &

PEARLMAN, 2008) e, assim, de acordo com todos esses dados, o estudo propõe que, com

a retirada dos O2•−, através do uso de tempol, se avalie a hipótese de que estresse

oxidativo é mediador da resposta hipertensiva em ratos com RI, alimentados com frutose

e sal.

Revisão de Literatura

3

1- REVISÃO DE LITERATURA

1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES

O termo DCV é de natureza genérica e descreve um conjunto de enfermidades,

muitas vezes, relacionadas entre si. Essas podem incluir a doença cardíaca coronária

(DCC), afetando vasos sanguíneos que irrigam os músculos do coração, doença

cerebrovascular, que afeta os vasos sanguíneos que irrigam o cérebro e doença arterial

periférica (DAP), afetando vasos sanguíneos que irrigam os membros. Outras patologias

também incluem doença cardíaca congênita, malformação da estrutura do coração,

doença reumática do coração com danos ao músculo cardíaco e em válvulas por febre

reumática, além de hipertensão por elevação crônica da PA maior do que 140 mmHg para

pressão sistólica e 90 mmHg para pressão diastólica.

A mortalidade por DCV aumenta progressivamente com a elevação da PA de

forma linear, contínua e independente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde

(OMS), dentre as mortes cujas causas foram registradas em 2008, as DCVs foram

responsáveis por aproximadamente 17,3 milhões de mortes (48%), sendo que desses 7,3

milhões foram por doença isquêmica do coração (DIC) e 6,2 milhões por acidente vascular

encefálico (AVE), seguida por doenças como câncer e outras doenças não transmissíveis

(21%), doenças respiratórias (12%) e diabetes mellitus (3%) (WILLIAMS, 2010), ocorrendo

na maioria em países de baixo e médio desenvolvimento econômico e mais da metade

em indivíduos entre 45 e 69 anos.

Para análise das tendências de mortalidade no Brasil, dados do Ministério da

Saúde revelam que no Brasil, em 2007, as DCVs também foram responsáveis pelo maior

número de casos de morte, o qual correspondeu a 29% do total de óbitos ocorridos e

registrados (Figura e Quadro 1). Foram utilizadas, para cálculo das taxas, as informações

de população do IBGE e as projeções disponibilizadas pelo Datasus. A elevação dessa

incidência, principalmente nos países em desenvolvimento, se deve a fatores como o

aumento da expectativa de vida, à diminuição ou controle de doenças infecto-parasitárias

e ao aumento do poder socioeconômico, propiciando mudança no estilo de vida para pior


4

em relação aos fatores patogênicos da doença (GUS et al., 2002). Aproximadamente 75%

dos casos novos de DCV ocorridos nos países desenvolvidos, nas últimas décadas, poderiam

ser explicados por dieta e atividade física inadequada, níveis lipídicos desfavoráveis,

obesidade, elevação da PA e fumo, ressaltando, assim, a importância do reconhecimento de

tais fatores para uma conduta individual mais adequada (KANNEL & WILSON, 1997).

Figura 1: Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares e suas diferentes causas no Brasil, em 2007. Adaptado de MALTA et al. (2009). AVE (acidente vascular encefálico); DIC (doença isquêmica do coração);

HAS (hipertensão arterial sistêmica).

Quadro 1: Grupos de causas de óbito na população brasileira em 2007

Causas de mortalidade Masc % Fem % Total %

Doenças do aparelho circulatório 158435 26,7 144220 33,0 302682 29,4

Neoplasias (tumores) 83719 14,1 71998 16,5 155734 15,1

Causas externas de morbidade e mortalidade 107146 18,1 20996 4,8 128255 12,4

Doenças do aparelho respiratório 55490 9,4 47331 10,8 102834 10,0

Sintomas, sinais e achados anormais clínicos e laboratoriais 48596 8,2 36802 8,4 85469 8,3

Doenças endócrinas, nutricionais e metabólicas 26315 4,4 32543 7,4 58867 5,7

Doenças do aparelho digestivo 33250 5,6 18654 4,3 51910 5,0

Doenças infecciosas e parasitárias 27428 4,6 19051 4,4 46487 4,5

Algumas afecções originadas no período perinatal 16059 2,7 12167 2,8 28328 2,7

Doenças do sistema nervoso 9653 1,6 9503 2,2 19157 1,9

Doenças do aparelho geniturinário 9136 1,5 8282 1,9 17419 1,7

Malformação congênita e deformidades 5387 0,9 4906 1,1 10398 1,0

Transtornos mentais e comportamentais 7728 1,3 2518 0,6 10249 1,0

Doenças do sangue dos órgãos hematopoiéticos 2758 0,5 2734 0,6 5492 0,5

Doenças do sistema osteomuscular e tecido conjuntivo 1200 0,2 2394 0,5 3595 0,3

Doenças da pele e do tecido subcutâneo 1066 0,2 1397 0,3 2464 0,2

Gravidez, parto e puerpério 0 0,0 1637 0,4 1637 0,2

Doenças do ouvido e da apófise mastóide 79 0,0 65 0,0 144 0,1

Doenças do olho e anexos 13 0,0 15 0,0 28 0,0

Total 593458 100 437213 100 1031149 100 Fonte: SIM/DASIS/SVS/Ministério da Saúde

29

71 Doenças cardiovasculares

Outras causas AVE DIC HAS Outras causas

31,10% 31,00%

12,80%

25,10%


5

1.1.1 Hipertensão

Embora hipertensão seja reconhecida como o maior fator de risco para DCV (VASAN,

et al. 2001), os mecanismos pelos quais a HAS contribui para o desenvolvimento da doença

vascular são complexos e ainda pouco entendidos. Um aspecto fundamental da patogênese é

que, habitualmente, existem cofatores aterogênicos interagindo, com efeito multiplicativo ao

da eventual hipertensão arterial como a dislipidemia, a intolerância à glicose e a obesidade.

Contudo, parece claro que a HAS desempenha papel central nesse processo, uma vez que a

aterosclerose significativa, raramente, ocorre em segmentos do sistema circulatório com

baixo regime pressórico, tais como artérias pulmonares ou veias, a despeito da sua exposição

aos mesmos fatores circulantes aterogênicos. Portanto, o mecanismo pelo qual se desenvolve

o processo hipertensivo é de ordem multifatorial e diretamente ligado a alterações

metabólicas crônicas (GRUNDY et al., 2004). Entre hipertensos com SM, observa-se uma alta

prevalência de lesões em órgãos-alvo com impacto prognóstico adverso. Estudos recentes

indicam, dentre as lesões identificadas, elevada prevalência de hipertrofia de ventrículo

esquerdo, disfunção diastólica, aterosclerose de carótida, alterações na distensibilidade

aórtica, retinopatia hipertensiva e microalbuminúria, quando comparados portadores de

hipertensão arterial associada à SM com hipertensos sem outras manisfestações

características da síndrome (MULÈ et al., 2005).

1.1.2 Síndrome Metabólica

Inicialmente descrita por Reaven (1988), a SM foi caracterizada por uma constelação

de fatores de risco cardiovascular, incluindo dislipidemia aterogênica, intolerância à glicose,

hipertensão e obesidade visceral, condições que estão intimamente associadas a RI. Aliás, há

um consenso geral de que a RI/hiperinsulinemia são as características mais importantes da

SM e, na verdade, por vezes a SM é referida como um estado de RI. Isso pode ser devido à

associação da RI com outras manifestações da SM, especialmente com a hipertensão.

Entretanto, embora existam muitas definições para a SM como a National Cholesterol

Education Progran – NCEP Adult Treatment Panel III (NCEP/ATP III); International Diabetes

Federation (IDF), Organização Mundial de Saúde (OMS) e outras, a definição da NCEP/ATP III

é a mais amplamente usada, tanto na prática clínica como em estudos epidemiológicos.

Trata-se de um guia com foco no risco cardiovascular, que não usa como critério obrigatório a

evidência de anormalidades na insulina ou na glicemia. Apesar desse guia considerar a DCV


6

como desfecho primário da SM, muitos dos portadores dessa síndrome apresentam RI, o que

lhes confere um risco aumentado para o desenvolvimento da diabetes do tipo 2. Os critérios

da NCEP/ATP III encontram-se no quadro 2.

Quadro 2: Critérios da NCEP/ATPIII

Parâmetro Número de alterações > 3 de: Glicose > 100 mg/dL ou em tratamento para hiperglicemia Colesterol-HDL Homens: < 40 mg/dL ou em tratamento para HDL baixo

Mulheres: < 50 mg/dL ou em tratamento para HDL baixo Triacilglicerol TG > 150 mg/dL Obesidade Cintura > 102 cm para homens ou > 88 cm para mulheres Hipertensão PA >130 x 85 mmHg ou em tratamento medicamentoso para hipertensão Lipoproteína de alta densidade (HDL); Triacilglicerol (TG); Pressão Arterial (PA); National Cholesterol Education

Progran – NCEP Adult Treatment Panel III (NCEP/ATPIII/2001).

Vários estudos em animais e humanos sugerem que o consumo excessivo de frutose

pode contribuir para o aumento da prevalência da SM e seus componentes, incluindo a

hipertrigliceridemia, baixa concentração de lipoproteína de alta densidade (HDL), obesidade,

hipertensão arterial, hiperglicemia e hiperuricemia (HWANG et al., 1987; BEZERRA et al.,

2001; NAKAGAWA et al. 2006). Ao lado de modelos genéticos desenvolvidos para a pesquisa,

como rato Zucker obeso (CARLSON et al., 2000), a SM é induzida por vários protocolos

experimentais que incluem administração de sacarose e frutose na dieta. Ratos Wistar e

Sprague-Dawley alimentados com alto teor de frutose por várias semanas apresentam

aspectos característicos da SM, embora os resultados não sejam totalmente conclusivos.

Investigações envolvendo intervenções de longo prazo e nas quais sejam empregadas

quantidades de açúcares normalmente ingeridos são necessárias e podem preencher a lacuna

de informações sobre o tema.

1.2 FRUTOSE

1.2.1 Frutose na alimentação

Nos últimos anos, principalmente em países desenvolvidos, podemos considerar que

a ingestão de sacarose e frutose vem aumentando, acentuadamente, em decorrência do

maior consumo de produtos industrializados (BRAY et al., 2004). Enquanto por muito tempo o

consumo humano de frutose era entre 16 a 20 gramas/dia, em grande parte pelo consumo de

frutas frescas, a ocidentalização da alimentação resultou em aumento significativo na frutose


7

adicionada à dieta que pode atingir 60 a 100 gramas/dia e até 150 gramas/dia, se somada a

frutose proveniente da sacarose (PARK & YETLEY, 1993; BASCIANO et al., 2005).

Com avanços nas tecnologias de isomerização, de separação e de cristalização na

década de 1960, tornou-se possível a produção de frutose cristalina e de xarope de milho rico

em frutose (HFCS) (HANOVER & WHITE, 1993). Em particular, a introdução de HFCS, na

década de 1970, resultou em um consumo acelerado de adoçantes nos EUA, em parte devido

ao HFCS ser mais facilmente solubilizado em alimentos processados (BRAY et al., 2004).

Assim, a frutose foi incorporada em fórmulas envolvidas no preparo de frutas enlatadas,

geleias, doces em pasta, bolos, pudins, tabletes, pó para bebidas, refrigerantes etc., uma vez

que é 1,5 vezes mais doce do que a sacarose bem como seu custo vem sendo gradualmente

reduzido ao longo dos anos como resultado da melhoria nos processos envolvidos na

obtenção.

No Brasil, embora a ingestão de frutose não esteja bem estabelecida, estima-se um

consumo médio de aproximadamente 4 gramas/dia de frutose livre, originária de frutas,

doces, hortaliças e outros vegetais. Já a quantidade de frutose advinda da sacarose é de

aproximadamente 27,5 gramas/dia. Essa estimativa foi baseada em dados estatísticos de

consumo de produtos alimentares fornecidos pelo Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatística, utilizando-se como fonte as pesquisas sobre orçamentos familiares. Estudos

mostraram que a dieta do brasileiro vem sendo modificada com uma tendência para redução

do consumo de leguminosas, hortaliças, frutas e aumento do consumo de açúcares simples e,

consequentemente, de frutose, principalmente proveniente da sacarose (MONTEIRO et al.,

2000).

Analisando os dados da Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009, podemos

notar aumento considerável no consumo de refrigerantes (400%), se comparado ao consumo

na década de 70 (IBGE, 2010). A disponibilidade relativa dos macronutrientes evidencia

excesso do teor de açúcar para as famílias das cinco regiões geográficas (variando de 13,9%

das calorias totais na Região Norte a 17,4% na Região Sudeste). O limite máximo de 10% para

a proporção de calorias provenientes de açúcares é amplamente ultrapassado em todas as

regiões e classes de rendimentos. Cabe ressaltar que esse é um aspecto que comprova as

tendências na alteração dos hábitos alimentares, observados atualmente no Brasil e no

mundo, traduzidos pela frequente troca de alimentos naturais, mais saudáveis, por alimentos

industrializados.


8

1.2.2 Metabolismo da frutose

A frutose é um monossacarídeo (C6H12O6) composto por seis átomos de carbono

unidos em ligações covalentes simples, apresentando grupamentos hidroxila, formados por

hidrogênio e oxigênio e um grupamento carbonila, formado por ligação dupla entre o

carbono e o oxigênio. A posição desse grupamento é que determinará, após a hidrólise do

monossacarídeo, se ele dará origem à cetona ou ao aldeído. A frutose, contendo o

grupamento carbonila no final da cadeia, quando hidrolisada, fornecerá cetona, e será

denominada cetohexose. Em equilíbrio, a frutose pode ser encontrada na forma

frutopiranose (70%) e frutofuranose (30%)(Figura 2).

Figura 2: Formas isoméricas da frutose. PONTIS & FISCHER, 1963.

Absorvida no jejuno e transportada para o interior do enterócito através do

transportador específico GLUT5 (transportador de frutose), a ação da frutose não depende da

estimulação pela insulina. Após a absorção, a frutose atinge a veia porta até o fígado,

transportada pela GLUT2 (MAYES, 1993). No hepatócito, a frutose é rapidamente fosforilada

no carbono 1, em uma reação mediada pela frutoquinase, ou no carbono 6, pela

hexoquinase. A maior parte da frutose é fosforilada no carbono 1, pois a hexoquinase tem

maior afinidade com a glicose (HALLFRISCH, 1990). A frutose-1 fosfato, a qual se acumula

rapidamente no fígado é quebrada em duas trioses, diidroxiacetona e gliceraldeído-fosfato,


9

em uma reação mediada pela aldolase B. Essas duas trioses poderão seguir três caminhos

distintos, com finalidades diferentes: 1) participar da via glicolítica fornecendo piruvato, o

qual é convertido para ácido láctico sob condições anaeróbicas ou entrar no ciclo do ácido

cítrico como acetil coenzima A sob condições aeróbicas liberando energia; 2) a diidroxicetona

fosfato pode ser reduzida para glicerol-3-fosfato, necessário para a síntese de triacilglicerol

(TG), fosfolipídio e outros lipídios e, finalmente, 3) a diidroxicetona fosfato pode ser

condensadas até formar a frutose-1,6-bifosfato pela aldolase e formar glicose ou glicogênio.

Dessa forma, dará origem ao piruvato, ao lipídio e ao glicogênio (HALLFRISCH, 1990). Na

figura 3, estão apresentadas as vias metabólicas da frutose e da glicose.

O controle do metabolismo da glicose está relacionado a um derivado fosforilado da

frutose. Trata-se da frutose-2,6-bifosfato que está presente em todos os tecidos dos

mamíferos, exceto nos eritrócitos maduros, sendo o mais potente efetor da

fosfofrutoquinase (VAN SCHAFTINGEN, 1988). A frutose-2,6-bifosfato desempenha papel

Figura 3: Frutose e metabolismo da glicose nas células do fígado. Adaptado de HAVEL, 2005.

Gliceraldeido

sfato

Dihidroxicetona fosfato Gliceraldeido-3-fosfato

Frutoquinase G-6-fosfatase

Glicoquinase

Frutose Glicose

Glicose-6-fosfato

Frutose-1-fosfato

Frutose-6-fosfato Frutose e

metabolismo da glicose nas

células do fígado. Adaptado de

HAVEL, 2005.-fosfato

Frutose-1-6-bifosfato

Glicose

Fosfofrutoquinase ATP

-

-

Citrato

Citrato

Glicerol 3-P Piruvato Lactato

Acil-CoA Acetil-CoA Acil-glicerol

VLDL CO2 + ATP


10

importante na regulação da glicólise e, também, controla a gliconeogênese. O nível de

frutose-2,6-bifosfato parece afetar a atividade de duas importantes enzimas regulatórias

controlando o catabolismo e o anabolismo do carboidrato no fígado (fosfofrutoquinase e

frutose-1,6-bifosfatase). Altos níveis de trifosfato de adenosina (ATP) e de citrato exercem

inibição da fosfofrutoquinase, o que permite a regulação da reação de acordo com o estado

energético da célula (TORNHEIM & LOWENSTEIN, 1976); portanto, monofosfato de adenosina

(AMP) estimula a frutose-2,6-bifosfatase, a qual, então, forma frutose-6-fosfato, diminuindo o

nível de frutose-2,6-disfosfato. Esse nível diminuído de frutose-2,6-bisfosfato estimula a

frutose-1,6-bifosfatase, o qual favorece a conversão de frutose-1,6-bifosfato para frutose-6-

fosfato, um intermediário da gliconeogênese. Em contraste, aumento na frutose-2,6-bifosfato

estimula a 6-fosfofrutoquinase, a qual converte frutose-6-fosfato para frutose-1,6-bifosfato,

favorecendo a glicólise. Como o metabolismo da frutose não é afetado pelo passo regulador

da glicólise, fosforilações da frutose podem levar à depleção de ATP e ao aumento na síntese

de TG.

A ingestão de frutose resulta em menores excursões da glicemia pós-prandial em

comparação à glicose (GLINSMANN & BOWMAN, 1993). No entanto, quando quantidades

maiores de frutose são consumidas (por exemplo, em sacarose e HFCS), frutose continua a

entrar na via glicolítica e a produção de TG hepático é facilitada. A frutose pode fornecer

átomos de carbono, tanto para o glicerol quanto para as porções acil de moléculas de

acilglicerol (HALLFRISCH, 1990) e, assim, ao contrário do metabolismo da glicose, no qual a

absorção da glicose é negativamente regulada pela enzima fosfofrutoquinase, concentrações

elevadas de frutose podem servir como uma fonte relativamente desequilibrada de acetil-

CoA. De fato, os estudos em seres humanos mostraram que a ingestão de frutose resulta em

maiores taxas de lipogênese de novo (LDN) (LÊ et al., 2009). Dessa forma, frutose é mais

lipogênica do que a glicose, um efeito que pode ser exacerbado em doentes com

hiperlipidemia existente (JEPPESEN et al., 1995), ou com RI ou diabetes do tipo 2 (ABRAHA et

al., 1998). Além disso, a frutose não estimula a produção de insulina e leptina, que estão

envolvidas na regulação da homeostase energética. Portanto, a diminuição nas respostas de

insulina e a produção de leptina associadas ao consumo crônico de dietas ricas em frutose

podem ter efeitos nocivos a longo prazo sobre a regulação da ingestão de energia.


11

1.2.3 Frutose, lipogênese e resistência à insulina

Inicialmente, a frutose atraiu grande interesse como adoçante para pacientes com

diabetes mellitus, devido ao seu baixo índice glicêmico (UUSITUPA, 1994). Todavia, resultados

de vários estudos propõem que o consumo de frutose pode promover especificamente a

deposição de lipídios no tecido adiposo (BRAY et al., 2004; VASANKARI & VASANKARI, 2006;

STANHOPE & HAVEL, 2009), embora não aumente de forma aguda os níveis de glicose ou de

insulina no sangue, em contraste com a glicose. Curiosamente, o perfil de TG plasmáticos são

aumentados após o consumo de frutose com maior taxa de conversão da frutose em lipídios

no fígado e na taxa de secreção e de remoção de TG (BAR-ON & STEIN, 1968). Isso sugere que

a lipogênese pode ser o núcleo das alterações bioquímicas induzidas por frutose, apesar de

evidências emergentes demonstrarem que a estimulação simultânea de vias fisiológicas

alternativas também podem contribuir para os efeitos deletérios da frutose (Figura 4).

Figura 4: Efeitos do consumo crônico de frutose. Distúrbios ocorrem em vários tecidos, incluindo o fígado, o tecido

adiposo, o sistema gastrointestinal e o sistema nervoso central (SNC). GLP-1 (Peptídeo tipo I tipo glucagon); GLUT5 (Transportador de Frutose, tipo 5).


12

O aumento na taxa de frutose induzindo LDN gera ácidos graxos, que podem, então,

ser incorporados em TG ou em outras espécies lipídicas, e são associados ao aumento na

síntese de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). Esse aumento das VLDL-TG

desempenha importante papel na doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)

(OUYANG et al., 2008). A administração a longo prazo de frutose para ratos resulta em

macro-e microvesicular esteatose hepática, com aumento de aproximadamente 200% em

TGs hepáticos e 90% na concentração de colesterol hepático (ACKERMAN et al., 2005).

Entretanto, enquanto roedores tratados com frutose pode ser um modelo sustentável para

estudar vários aspectos da NAFLD humana (ANSTEE & GOLDIN, 2006; KAWASAKI et al., 2009;

CASTRO et al., 2011), a acumulação de gordura intra-hepática como consequência da

ingestão de frutose também tem sido menos documentada em humanos.

Assy et al. (2008) verificaram que pacientes que apresentam NAFLD sem fatores de

riscos clássicos consomem mais refrigerantes e sucos adoçados que controles. Os dados

demonstram correlação entre a gravidade da esteatose hepática e a quantidade de consumo

de refrigerantes e, como esperado, os níveis de RI foram maiores em pacientes com NAFLD

(ABDELMALEK et al., 2010). A retenção de lipídios nos hepatócitos é um pré-requisito para o

desenvolvimento da NAFLD. No tecido adiposo a RI acentua a lipólise de TG e inibe a

esterificação de ácidos graxos livres (AGLs), resultando em aumento dos níveis circulantes de

AGL que são captados pelo fígado. Adicionalmente nos hepatócitos, a hiperinsulinemia

aumenta a síntese de novo de ácidos graxos e inibe a sua β-oxidação. A consequência dessas

ações ocasionadas pela insulina é o acúmulo de AGL dentro dos hepatócitos. Além disso, a

síntese hepática de TG é guiada pelo aumento do conteúdo de AGL nos hepatócitos e

favorecida pela suprarregulação, mediada pela insulina. A RI hepática facilita a liberação de

EROs, bloqueia a secreção de TG dos hepatócitos pelo aumento da degradação intracelular de

VLDL e apolipoproteina B-100 (Apo-B100) e bloqueia a exocitose de vesículas contendo VLDL

(ANGULO, 2002; GRATTAGLIANO et al., 2008; PREISS & SATTAR, 2008). Dessa maneira é

possível observar que a entrada e síntese de novo de AGL no fígado ultrapassam sua oxidação

e secreção de TG, resultando em um efeito em cascata de acúmulo hepático de gordura,

podendo explicar o papel chave da RI no desenvolvimento da esteatose hepática.

Embora a frutose não aumente agudamente os níveis de insulina, a sua exposição

crônica parece causar indiretamente hiperinsulinemia. Em ratos alimentados com 66% de

frutose por 3 semanas, o mRNA do receptor de insulina e o números de receptores de


13

insulina no músculo esquelético foram significativamente diminuídos em comparação aos

ratos alimentados com uma dieta de ração padrão (CATENA et al., 2003). Em outro estudo,

descobriu-se que, após 28 dias de alimentação com frutose, não houve alterações na

concentração do receptor de insulina, mas a autofosforilação, um mecanismo necessário para

a sua ação, foi reduzida para 72% no fígado (UENO et al., 2000). Existem numerosos trabalhos

com roedores em que a frutose na dieta induz hiperlipidemia e é uma forma comum de

reproduzir características da SM (RUTLEDGE & ADELI, 2007). Dessa forma, animal alimentado

com frutose é um modelo experimental útil de RI e uma ferramenta para o estudo de vários

aspectos da SM (Quadro 1) devido mimetizarem diversas respostas fisiológicas humanas.

Ratos alimentados com dieta rica em frutose pode desenvolver hiperinsulinemia,

hipertrigliceridemia, RI e hipertensão. Thorburn et al. (1989) usaram ratos alimentados com

uma dieta contendo 35% de energia como frutose por 4 semanas e encontraram redução da

sensibilidade à insulina associada à prejudicada ação da insulina hepática e disponibilidade de

glicose. Blakely et al. (1981) mostraram aumentos nas concentrações de insulina e glicose de

jejum em ratos que consumiram 15% da energia como frutose por 15 meses, apesar de não

haver diferenças no peso corporal ou na ingestão de comida. Ao contrário de dietas ricas em

gordura, dietas ricas em sacarose causam RI na ausência de aumento da gordura visceral, mas

aumentam o conteúdo de TG no fígado e nos músculos, levando a um aumento de RI em

ratos machos (PAGLIASSOTTI et al., 1996). Em contrapartida, estudos demonstram que

fêmeas não desenvolvem hiperinsulinemia ou hipertensão com alimentação rica em sacarose

e frutose exceto após ovariectomia, sugerindo que os hormônios sexuais femininos podem

conferir uma proteção (HORTON et al., 1997; GALIPEAU et al., 2002). Porém, a ausência do

efeito de hormônios sexuais isoladamente (animais ovariectomizados) não causa mudança

significativa na PA, além de ovariectomia por si só também não afetar parâmetros

metabólicos (GALIPEAU et al., 2002). Apesar de nos animais não existir dúvida de que a

ingestão elevada de frutose causa RI, em humanos a evidência é menos clara. Um ensaio

clínico conduzido em 12 mulheres demonstrou que uma dieta isocalórica com elevados

teores de frutose resultou em redução na glicemia, insulinemia de jejum e leptina associado

ao aumento na concentração sérica de TG quando comparada a uma dieta com teor elevado

de glicose. O balanço controlado pelo sistema nervoso central (SNC) foi influenciado pela

insulina e leptina e, assim, dieta rica em frutose representa um fator de risco potencial para o

ganho de peso corporal (TEFF et al., 2004).


14

Quadro 3: Efeitos de diferentes rotas de administração de frutose em diferentes espécies por variados períodos

Método de administração

Espécie Qde Tempo de estudo Efeito Referência

Bebida Camundongo 10% 3 semanas Hipertensão, Hiperinsulinemia DAN et al., 2006

2 meses Hiperglicemia, Hiperinsulinemia, Hipertensão, Intolerância à glicose Hipertrigliceridemia

DeANGELIS et al., 2012

30% 8 semanas Esteatose KANURI et al., 2011 Ratos 4% 14 semanas Hipertensão VASDEV et al., 2002 10% 8 semanas Hiperglicemia, Hipertrigliceridemia, Intolerância à glicose JALAL et al., 2007 5 semanas Hipertensão, Resistência à insulina XU et al., 210 10 semanas Hipertrigliceridemia, Resistência à insulina, Hipertensão SUZUKI et al., 1997 2 e 5 semanas Resistência à insulina, Hipertrigliceridemia, Hipertensão ZHAO et al., 2009 20% 20 semanas Hipertrigliceridemia DORNAS et al., 2012 20% 30 dias Hipertrigliceridemia MOTOYAMA et al., 2010 Cobaia 10% 6-19 dias Hipertrigliceridemia BAR-ON & STEIN, 1968 10% 18 semanas Hiperglicemia FÉLÉTOU et al., 2003 Comida Camundongo 60% 8 semanas Intolerância à glicose, Dislipidemia, Hipertensão FARAH et al., 2006 Rato 56,8% 6 semanas Hipertrigliceridemia, Resistência à insulina FAURE et al., 1997 60% 10 semanas Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia, Hiperuricemia NAKAGAWA et al., 2006 60% 30 dias Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hipertrigliceridemia NANDHINI et al., 2005 60% 6 semanas Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia LIU et al., 2011 60% 35 dias Intolerância à glicose, Dislipidemia, Resistência à insulina EL MESALLAMY et al., 2010 65% 2 semanas Hiperglicemia, Dislipidemia, Hipertensão KIN et al., 2010 65% 4 semanas Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia BUSSEROLLES et al., 2003b 66% 4 semanas Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia, Hipertensão HWANG et al., 1987 66% 8 semanas Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia D’ANGELO et al., 2005 Hamster 60% 2 semanas Hipertensão, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia TAGHIBIGLOU et al., 2000 Cachorro 60% 20 a 28 dias Hipertensão, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia MARTINEZ et al., 1994 Humanos 15% 5 semanas Hiperinsulinemia, Hiperglicemia HALLFRISCH et al., 1983 20% 5 semanas Hipertrigliceridemia, Hiperuricemia REISER et al., 1989


15

Paralelamente, Shapiro et al. (2008) relataram aumento de leptina em ratos

alimentados com frutose, o que implica que, apesar do aumento nos níveis de leptina há uma

diminuição na capacidade de resposta à leptina ocasionando diminuição da saciedade. Essa

observação mostra o potencial para aumento da ingestão de alimentos com a frutose. Além

disso, a administração central da frutose pode causar aumento de apetite, bem como

alterações significativas na função neuronal. Doses suprafisiológicas de frutose administradas

diretamente no cérebro induzem aumento do consumo alimentar, enquanto que a glicose

provoca diminuição na ingestão de alimentos (MILLER et al., 2002). Isso verificou-se estar

associado com a indução diferencial de malonil-CoA entre os dois açúcares (CHA et al., 2008).

Indivíduos obesos (SCHOLZ et al., 1996) e camundongos obesos induzidos por dieta

(FREDERICH et al., 1995) demonstram resistência à leptina o que contribui para a deposição

de lipídios no fígado (LEE et al., 2002) e no músculo esquelético (STEINBERG et al., 2002).

Como o metabolismo de glicose mediado pela insulina tem demonstrado regular a liberação

de leptina (MUELLER et al., 1998), esse fenômeno pode provavelmente ser atribuído a uma

falta de resposta da insulina com o consumo de frutose. Notavelmente, 4 semanas de frutose

na dieta induz hiperleptinemia em humanos associado a diminuição da sensibilidade à

insulina, esteatose hepática e aumento na circulação de TG (LÊ et al., 2006). Ratos

alimentados com frutose também exibem hiperleptinemia (MOORADIAN et al., 2000;

ROGLANS et al., 2007; SHAPIRO et. al., 2008).

1.2.4 Frutose e hiperuricemia

Estudos prévios intervencionais realizados (FOX & KELLEY, 1972; EMMERSON, 1974;

MACDONALD et al., 1978; REISER et al., 1989) demonstraram que frutose experimentalmente

tem a propriedade de induzir hiperuricemia. Essa relação foi repetidamente revisada e

discutida por vários estudos, entre eles Gao et al. (2007), Choi et al., (2008) e Nguyen et al.,

(2009), que encontraram associação entre maior consumo de bebidas ricas em açúcar e

aumento de ácido úrico sérico. Porém, Turner et al., (1979), Crapo & Kolterman, (1984), Osei

& Bossetti, (1989), Sun et al. (2010) e Wang et al. (2012) não observaram que frutose tem

influencia sobre concentrações séricas de ácido úrico.

Em seres humanos e outros primatas, o ácido úrico é o produto final do metabolismo

das purinas e é excretado como tal, mas outros mamíferos possuem a enzima uricase, que

permite, ainda, oxidação do ácido úrico para a alantoina (substância muito mais solúvel). A

consequência da ausência da enzima uricase em seres humanos é a ocorrência de gota, a qual

está associada à hiperuricemia.


16

Muitas investigações tanto in vivo quanto in vitro foram realizadas e, embora a

designação precoce do ácido úrico como um antioxidante (AMES et al., 1981) estime que esse

possa ser responsável por aproximadamente 60% da capacidade antioxidante do plasma

(NIETO et al., 2000), o ácido úrico também é reconhecido por apresentar propriedades

prooxidativas (SAUTIN et al., 2007) e pode ter numerosas funções biológicas deletérias. Por

exemplo, o ácido úrico estimula a proliferação das células do músculo liso vascular e a

liberação de substâncias quimiotáticas inflamatórias (RAO et al., 1991), induz quimiotaxia de

monócitos (ZARE et al., 2006), inibe a proliferação e a migração de células endoteliais (KANG

et al., 2005; KHOSLA et al., 2005) e causa estresse oxidativo nos adipócitos, indiretamente,

através da ativação da NADPH-oxidase, diminuindo a concentração de óxido nítrico (NO) total

(SAUTIN et al., 2007). Esse último estudo mostrou que EROs produzida pela NADPH-oxidase

aumenta a peroxidação lipídica evidenciando a associação entre ácido úrico, estresse

oxidativo e inflamação levando à SM. Isso apoia à ideia de que a hiperuricemia pode ser

considerada um fator causal na progressão da SM, como mostrado por Choi & Ford (2007) e

níveis elevados de ácido úrico são observados em uma variedade de estados de doença

metabólicas (MASUO et al., 2003; NAKANISHI et al., 2003; MELLEN et al., 2006).

Em ratos, frutose induz hiperuricemia ocasionando, também, vários aspectos da SM, o

que inclui hipertrigliceridemia, hiperglicemia e hipertensão (NAKAGAWA et al., 2006;

SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007). Além disso, ratos alimentados com frutose, tratados com o

agente alopurinol (inibidor da xantina oxidase) exibem melhora na SM, já que se observa que

o tratamento com drogas redutoras de ácido úrico reduz os níveis plasmáticos de insulina,

melhora sensibilidade à insulina e diminui pressão sanguínea (NAKAGAWA et al., 2006;

SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2008).

Adicionalmente, observou-se participação do ácido úrico como um biomarcador de

fígado com gordura (MARCHESINI & BABINI, 2006; SARTORIO et al., 2007). Um estudo

recente da população da China (LI et al., 2009) relatou que a taxa de prevalência da NAFLD foi

significativamente maior em indivíduos com hiperuricemia do que naqueles sem

hiperuricemia (24,75 vs 9,54%, P <0,001) e a prevalência elevou-se progressivamente com

aumento nos níveis séricos de ácido úrico. Além disso, a análise de regressão múltipla

mostrou que a hiperuricemia foi associada a um risco aumentado de NAFLD (LI et al., 2009).

Existe também evidência experimental de que a hiperuricemia crônica pode ser capaz de

causar hipertrigliceridemia e esteatose em ratos. Nesses estudos, a hiperuricemia foi induzida

pela inibição da uricase (WEXLER, 1982) ou ácido oxônico (WEXLER & GREENBERG, 1977) e,

após 4 semanas, os animais desenvolveram concentrações elevadas de TG no soro e


17

esteatose. Entretanto, o mecanismo através do qual o ácido úrico pode ser capaz de induzir

esteatose ainda é desconhecido.

Considerando que doenças humanas, tais como obesidade, diabetes e DCVs são

complexas e apresentam origens multifatoriais, estudos sugerem que o ácido úrico é um fator

independente de risco para doença renal em humanos (HEINIG & JOHNSON, 2006). A fim de

verificar a hipótese de que a frutose dietética provoca diretamente disfunção renal, ratos

foram alimentados com 60% de frutose e desenvolveram hipertensão, hiperuricemia e

hipertrigliceridemia além de problemas renais, incluindo hipertrofia, hipertensão glomerular

e redução do fluxo glomerular (SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007). Um outro estudo (GERSCH et

al., 2007) mostrou que uma dieta com 60% de frutose acelerou a doença renal em ratos com

insuficiência renal crônica induzida cirurgicamente. Esse efeito pode ser mediado pela

hiperuricemia ou por outros componentes da SM, incluindo inflamação ou hiperinsulinemia.

Concentrações de ácido úrico são elevadas na grande maioria (89%) de adolescentes com

hipertensão (FEIG & JOHNSON, 2003) e um estudo prospectivo relatou que a redução de

concentrações de ácido úrico em pacientes com hiperuricemia e doença renal resulta em

progressão renal significativamente mais lenta e uma redução significativa da pressão arterial

sistólica (PAS) (SIU et al., 2006).

Assim, mais estudos clínicos são necessários e descobertas sugerem que o ácido úrico

pode contribuir para a epidemia da doença cardiorenal. Aproximadamente 25% a 50% dos

indivíduos hipertensos são relatados apresentarem níveis elevados de ácido úrico (CANNON

et al., 1966) e em animais, o efeito da concentração de ácido úrico é ainda mais pronunciado.

Ratos que desenvolvem hiperuricemia desenvolvem hipertensão devido à inibição da síntese

de óxido nítrico sintase (NOS) na mácula densa (MAZZALI et al., 2002). Ocorrem estímulo do

sistema renina intra-renal e inibição da função endotelial ao diminuir biodisponibilidade do

NO, o qual induz vasodilatação que é necessária para a insulina estimular a captação de

glicose nos tecidos. Quando a secreção de NO é prejudicada, a captação de glicose é reduzida

e mais insulina é segregada para compensar (HEINIG & JOHNSON, 2006). Perturbações na

dilatação dependente do NO costumam acompanhar a hiperuricemia e a extensão está

relacionada à magnitude da elevação do ácido úrico. Portanto, disfunção endotelial induzida

por ácido úrico com diminuição da produção de NO pode participar no desenvolvimento da RI

em ratos alimentados com frutose, e, a diminuição das concentrações de ácido úrico melhora

função do endotélio (BUTLER et al., 2000; DOEHNER et al., 2002; FARQUHARSON et al., 2002).

Assim, frutose e ácido úrico são susceptíveis de serem da maior importância no

desenvolvimento do fenótipo da SM.


18

1.2.5 Frutose e hipertensão

Semelhantemente a RI e à hiperlipidemia, muitos estudos demonstram que dieta com

teor alto de frutose pode induzir hipertensão. Entretanto, embora inúmeras investigações

com ratos alimentados com frutose são relacionadas a hipertensão (HWANG et al 1987;

VASDEV et al., 2002; 2007; ZHAO et al., 2009; KIM et al., 2010), há também outros relatos em

que não é observado aumento de PA nesse modelo (BRANDS et al., 1994; KOTCHEN et al.,

1997; BEZERRA et al., 2001; D’ANGELO et al., 2005). Esse conflito tem sido atribuido a

componentes dietéticos (ex: lipídios ou sódio) (SANTURÉ et al., 2002; NISHIMOTO et al., 2002;

SHAPIRO et al., 2008), diferentes linhagens e idade dos animais (KOTCHEN et al., 1997) ou a

diferentes técnicas usadas para medir PA (BRANDS et al., 1994; D’ANGELO et al., 2005).

Há, portanto, incertezas considerando o mecanismo pelo qual o consumo de frutose

pode produzir elevação da PA, mas numerosas possibilidades são propostas (Figura 5),

incluindo, principalmente, atenuação do baroreflexo e aumento da atividade do SNS

(DeANGELIS, 2012), elevação de catecolaminas circulantes (TRAN et al., 2009), elevação da

atividade do sistema renina-angiotensina (SRA) (KOBAYASHI et al., 1993), reabsorção de sódio

aumentada (BAUM, 1987), maior produção de ácido úrico (NAKAGAWA et al., 2006) e

disfunção endotelial (TAKAGAWA et al., 2002). Somado a isso, existe evidência de que

hiperinsulinemia, isoladamente, pode causar hipertensão, uma vez que administração de

insulina causa aumento da pressão sanguínea em ratos (BRANDS et al., 1991; 1992).

Tem-se observado que há associação entre RI e hipertensão em roedores bem como

em humanos (REAVEN & CHANG, 1991; BRANDS et al., 1991; DeFRONZO, 1992; ABE et al.,

1998) e intervenções que previnam RI também normalizam PA (REAVEN, 1991; VERMA et al.,

1994; LEE et al., 1994; SUZUKI et al., 1997). Comparados a indivíduos com PA normal, pessoas

com hipertensão são relativamente intolerantes à glicose (DeFRONZO, 1992), mas redução da

PA em indivíduos hipertensos não significa necessariamente reduzir o grau de intolerância à

glicose e hiperinsulinemia. Inibidor adrenérgico reduz PA mas não RI, como demonstrado por

Hwang et al. (1987), em ratos alimentados com frutose. Portanto, se frutose induz elevação

na atividade do SNS, então, essa mudança não é a causa da RI, da hiperinsulinemia e da

hipertrigliceridemia. Suzuki et al. (1997) demonstraram que tratamento com pioglitazona em

ratos com RI e hipertensos resultou em redução na glicemia, em normalização dos níveis de

insulina e da concentração de TG e também em redução da PAS, indicando que RI é

responsável pelo desenvolvimento de hipertensão em ratos com dieta rica em frutose.

Cronicamente, insulina ativa o SNS e provoca aumento no tônus vascular periférico

conduzindo a aumento na PA. A consequência é que essa ativação pode contribuir para a RI


19

fazendo com que vasoconstrição provoque diminuição do fluxo sanguíneo e, portanto, reduza

fornecimento de glicose aos tecidos (RATTIGAN et al., 1999). Sugere-se que, assim, há uma

relação causal entre a RI/hiperinsulinemia e hipertensão no modelo de dieta rica em frutose,

com o SNS potencialmente desempenhando um papel importante tanto no desenvolvimento

da hipertensão como também na RI.

A hipertensão arterial nesse modelo tem sido também associada intimamente à

retenção de sódio. Os primeiros estudos que apresentaram diminuição da excreção urinária

de cloreto de sódio (NaCl), durante infusão aguda de insulina (DeFRONZO et al., 1975; BAUM,

1987), levaram à hipótese de que a hiperinsulinemia poderia contribuir para a hipertensão

arterial na SM. Durante a RI, o efeito vasodilatador da insulina pode estar inibido e, portanto,

torna-se incapaz de compensar a diminuição da reabsorção de sódio no túbulo proximal, com

predisposição à retenção de sódio (STENVINKEL et al., 1995). Administração aguda de insulina

resulta em diminuição da excreção de sódio em animais (BAUM, 1987) e em humanos (ter

MAATEN et al., 1999), com taxa de filtração glomerular (GFR) e fluxo sanguíneo renal

Figura 5: Mecanismo proposto pelo qual frutose na dieta resulta em hipertensão. Sistema Nervoso

Simpático (SNS); Sistema Renina Angiotensina (SRA). ABDULLA et al., 2011.

↑ Vasoconstrição

↑ Retenção de Na+

Resistência à insulina

Hiperinsulinemia

↑ SRA

Frutose

↓ Baroreflexo Dislipidemia Estresse oxidativo

REsis

↑ Ácido úrico

↑ SNS

Disfunção endotelial

Hipertensão


20

inalterados. De acordo com o conceito de feedback de fluido renal, uma redução primária da

capacidade de excreção renal ocasiona aumento compensatório na pressão sanguínea que

serve para manter o equilíbrio de fluidos. As reduções na capacidade de excreção renal

podem ocorrer devido a várias alterações funcionais ou patológicas intrínsecas ao rim ou a

fatores neuro-humorais que influenciam a excreção renal. Assim, excreção de sódio pode ser

mantida e alteração na GFR ou na reabsorção tubular podem ser mascaradas pela PA elevada.

Entretanto, na hipertensão prolongada, com duração de meses ou anos, são observadas

alterações patológicas nos capilares glomerulares resultando em reduções na taxa de GFR

que necessitam de mais elevações da PA e inibição da reabsorção tubular para manter o

equilíbrio de sódio (HALL et al., 1990).

Catena e colaboradores (2003), por outro lado, demonstraram que o efeito

antinatriurético da hiperinsulinemia pode ser determinado por um mecanismo que depende

do número de receptores de insulina nos tecidos, e essa densidade é inversamente

relacionada com a ingestão de sal na dieta. Assim, o efeito antinatriurético da insulina é

significativamente diminuído pela dieta com elevado teor de sal, mas não em ratos

alimentados com frutose, sugerindo que o mecanismo de feedback que normalmente limita

reabsorção de sódio induzida pela insulina está ausente nesse modelo experimental.

Portanto, a longo prazo, o elevado consumo de sal, juntamente com a alimentação

rica em frutose, resultará em mecanismo prejudicado de controle para o equilíbrio de sódio,

contribuindo para a hipertensão. Singh e colaboradores (2008) demonstraram que frutose

aumenta a absorção de sódio no trato gastrointestinal e no rim, através do aumento da

atividade de GLUT5 (Slc2a5), transportador de frutose, e PAT-1 (Slc26a6), um transportador

de cloro. Ambos são expressos nas membranas apicais do intestino delgado e no túbulo

proximal renal, estabelecendo uma ligação direta entre o aumento no consumo de frutose e

maior absorção de sal no intestino e, assim, diminuindo a sua excreção pelos rins (SINGH et

al., 2008; BARONE et al., 2009). Esse aumento pode contribuir para o desenvolvimento de

hipertensão em ratos alimentados com frutose.

Apesar de muito trabalho estar centrado em frutose induzir RI e doença cardiorrenal,

nem todas as fontes de frutose podem causar o mesmo efeito. Frutas naturais também são

ricas em antioxidantes que podem ter efeitos benéficos (VASDEV et al., 2002). Com efeito,

Forman et al. (2009) relataram que a ingestão de frutose não se correlaciona com pressão

sanguínea elevada na população em que muita ingestão da frutose foi a partir de fruta,

contendo compostos como vitamina C, quercetina, resveratrol, que podem alterar os seus

efeitos metabólicos. Por outro lado, quando o teor de frutose, a partir de frutas naturais, foi


21

excluída Jalal e colaboradores (2010) encontraram uma forte associação da ingestão de

frutose, advinda de sacarose ou de frutose adicionada a produtos industrializados, com

aumento da PA.

Por fim, estresse oxidativo pode ser considerado um fator patogênico importante no

desenvolvimento da hipertensão (PARAVICINI & TOUYZ, 2006) com dano oxidativo em ratos

alimentados com frutose (BUSSEROLLES et al., 2002a). Estudos apoiam que o aumento da

inativação oxidativa de NO, por um excesso de O2•−, pode ser responsável pela diminuição da

disponibilidade de NO e disfunção endotelial, o que contribui para a elevação da PA.

Consequentemente, aumento da produção de O2•− em tecido vascular, mediado através de

NADPH-oxidase está sendo estudado. Unger & Patil (2009) demonstraram, em ratos

alimentados com frutose, que administração crônica de apocinina, um suposto inibidor da

NADPH-oxidase, previne o desenvolvimento da disfunção endotelial e hipertensão pela

inibição da produção exagerada de O2•−, aumentando a biodisponibilidade de NO.

1.2.6 Frutose e estresse oxidativo

Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existência

independente de conter um ou mais elétrons desemparelhados, sendo assim altamente

reativos e capazes de atacar qualquer biomolécula (DEL MAESTRO, 1980). Condições que

envolvem o aumento dos níveis de radicais livres podem ser referidas como estresse

oxidativo, o qual ocorre durante os processos de oxidação biológica através da ação de

enzimas da respiração celular acoplada à fosforilação oxidativa para a formação de ATP na

mitocôndria.

Há ainda outras fontes de radicais no organismo que podem ser enzimáticas ou não.

Os principais sistemas enzimáticos que catalisam a redução univalente de O2 (Figura 6) são as

ciclooxigenase (COX), lipoxigenase, xantina oxidase, aldeído oxigenase, flavina desidrogenase

e peroxidase. Já as reações não enzimáticas incluem reações de autoxidação como as que

ocorrem com catecolaminas, flavinas e ferridoxinas, além de reações catalisadas por ferro,

cobre e radiação ionizante (YU, 1994).

e- e- e- e-

O2 O2•- H2O2 OH• •H2O + O2

Figura 6: Formação de EROs a partir da redução de O2. Oxigênio (O2) é reduzido a água (H2O) recebendo quatro

elétrons de uma só vez pela citocromo oxidase gerando compostos intermediários altamente reativos.


22

Na SM, estresse oxidativo está relacionado à hiperglicemia, à hiperinsulinemia, à

hipertrigliceridemia e às defesas antioxidantes inadequadas. Como o estresse oxidativo,

através de EROs é considerado a causa subjacente no desenvolvimento de RI e intolerância à

glicose na diabetes tipo 2 (WRIGHT et al., 2006), não é surpreendente que alimentação rica

em frutose aumente o estresse oxidativo (BUSSEROLLES et al., 2002a) e está associada à SM

em roedores (MILLER & ADELI, 2008). Os efeitos prejudiciais da frutose são aumentados

quando as defesas antioxidantes são diminuídas ou quando há maior produção de radicais

livres (BUSSEROLLES et al., 2003a), enquanto que a suplementação de vitamina E melhora a

sensibilidade à insulina em ratos alimentados com dieta rica em frutose (FAURE et al., 1997).

O2•− é uma EROs relativamente abundante e é dismutada enzimaticamente pela

superóxido dismutase (SOD) para peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual pode ser

metabolizado em água e oxigênio pela catalase (CAT) ou pela glutationa peroxidase (GPx)

(FRIDOVICH, 1995). Das suas 3 isoformas, a SOD extracelular é a de maior importância em

nível vascular. A sua produção e secreção ocorre na célula muscular lisa, ligando-se

posteriormente aos glicosaminoglicanos da matriz extracelular, na superfície da célula

endotelial, desempenhando, dessa forma, um papel essencial na regulação do estado redox

no interstício vascular (FRIDOVICH, 1995). Nas células vasculares, a glutationa reduzida

desempenha um papel na regulação do estado redox intracelular, provendo equivalentes

redutores a várias vias bioquímicas (TOUYZ, 2003). Entre essas reações, é de se destacar

aquela em que a GPx reduz o H2O2 e os peróxidos lipídicos a água e álcoois lipídicos,

oxidando, para isso, a glutationa reduzida a dissulfido de glutationa (glutationa oxidada). A

CAT é, igualmente, uma enzima intracelular antioxidante, que se encontra

predominantemente nos peroxissomas, mas também, em alguma porcentagem, no

citoplasma das células. Caracteristicamente, é muito ativa quando existem níveis elevados de

estresse oxidativo dentro das células e, quando tal acontece, catalisa o H2O2 em água e

oxigênio molecular, protegendo assim, os elementos intracelulares dos efeitos nocivos do

H2O2 (CAI, 2005). Faure et al. (1999) demonstraram que ratos alimentados com alto conteúdo

de frutose conduz à RI e em estresse oxidativo. Além disso, evidenciaram que tratamento

com metformina, um sensibilizador da insulina, tem um efeito benéfico sobre alguns

componentes do sistema de defesa antioxidante. Assim, vários estudos demonstram que

dieta rica em frutose afeta negativamente equilíbrio entre a produção de radicais livres e de

defesa antioxidante em ratos, o que conduz a aumento da susceptibilidade à peroxidação

lipídica (BUSSEROLLES et al., 2002a, 2002b; 2003b). Com base nessas descobertas, foi

sugerido que a taurina, um aminoácido que contém enxofre, é capaz de diminuir o estresse


23

oxidativo e melhorar a sensibilidade à insulina em ratos alimentados com frutose (NANDHINI

et al., 2005; EL MESALLAMY et al., 2010). Esse aminoácido é um derivado da cisteína (Cis),

que é um precursor da glutationa reduzida (GSH) e está disponível em tecidos e células. Nos

seres humanos, a deficiência de Cis pode levar ao estresse oxidativo plasmático (JONES et al.,

2011), e, em roedores, insuficiência de aminoácidos de enxofre provoca estresse oxidativo no

plasma e tecido (NKABYO et al., 2006). Desse modo, suplementação de bebidas adoçadas

com frutose pode reduzir a ingestão dietética de aminoácidos de enxofre, sendo possível que

a diminuição desse consumo contribua para o estresse oxidativo observado em ratos

alimentados com frutose.

Degeneração neuronal na RI induzida por produção excessiva de EROs, peroxidação

lipídica, oxidação de proteína bem como diminuição da capacidade antioxidante no cérebro

de ratos alimentados com frutose na água, sugeriu acumulação de H2O2, induzindo

citotoxicidade no cérebro (YIN et al., 2013). O aumento na produção de EROs em ratos

alimentados com dieta rica em frutose pode reduzir biodisponibilidade de NO, o que explica

relaxamento vascular alterado. O excesso de O2•−, produzido na vasculatura de ratos com RI

pode degradar NO e aumentar a geração de outras EROs que são responsáveis pela

peroxidação de lipídios, ocasionando dano vascular dependente do endotélio (SHINOZAKI et

al., 1999; 2003). Então, a consequência mais importante do aumento do estresse oxidativo

sobre a função endotelial vascular é a diminuição da biodisponibilidade resultante da

inativação de NO por O2•− (PACHER et al., 2007). Fisiologicamente, a NOS converte a L-

arginina em NO ocasionando relaxamento da musculatura lisa do vaso. Essa reação ocorre na

presença de tetrahidrobiopterina (BH4) que se converte à diidrobiopterina (BH2) por meio da

redução de O2 a H2O. Em condições patológicas, como na deficiência de substrato (L-arginina)

ou de cofatores BH4, o O2 não é reduzido completamente a H2O. Tal redução incompleta gera

O2•− e, na RI, pode ser um fator patogênico para a disfunção endotelial através da ação

prejudicada da eNOS e aumento da degradação oxidativa de NO (SHINOZAKI et al., 2003). O

exagero da produção de O2•− estimula o desacoplamento da enzima eNOS o que leva a

contração do vaso. Tem sido também descrito que a geração exagerada de O2•− pode

aumentar devido à atividade da NADPH-oxidase, o que resulta em oxidação do BH4,

comprometendo sua função como cofator. NADPH-oxidase está associada à maioria da

geração de O2•− favorecendo a produção de EROs (ZALBA et al., 2001). Entretanto, a

produção excessiva de EROs pode também estar ligada a processos patológicos associados à

disfunção endotelial e remodelamento vascular, que são características da hipertensão.


24

Dietas ricas em frutose, por sua vez, podem alterar o metabolismo celular com

ativação do SRA (SHINOZAKI et al., 2004; ISHIBASHI, 2007). Angiotensina II (Ang II), além do

seu papel fundamental no desenvolvimento da hipertensão, na medida em que provoca a

retenção de sódio (via aldosterona), tem ainda capacidade de promover a inflamação e

estresse oxidativo renal e vascular. Na verdade, evidência crescente sugere que a formação

de EROs e a ativação das cascatas de oxidação-redução, mediadas pela NADPH-oxidase, estão

envolvidas de forma crítica na hipertensão induzida pela Ang II (CERIELLO, 2008).

Ang II atua através do receptor AT1, estimula a NADPH-oxidase, levando,

consequentemente, à acumulação dos radicais livres O2•−, H2O2 e peroxinitrito

(ONOO−)(TOUYZ et al., 2004). O tratamento de ratos alimentados com frutose com

bloqueador de AT1 (losartan) normaliza a atividade da NADPH-oxidase, melhorando função

endotelial e efetivamente prevenindo que Ang II resulte em resposta pressórica contrátil em

ratos com RI (CANNIZZO et al., 2012). Descobriu-se então que a dieta rica em frutose

aumenta estresse oxidativo caracterizado pela superprodução de EROs dependente da

ativação de NADPH-oxidase, porém, esse aumento é diminuído por tempol e losartan,

corroborando o papel da geração de O2•− em RI induzida pela frutose, o que sugere o

envolvimento do SRA no estresse oxidativo.

1.3 SÓDIO

1.3.1 Sódio na alimentação

Os termos sal e sódio são frequentemente utilizados como sinônimos, embora, numa

base de concentração, o sal compreende 40% de sódio e 60% de cloro; 1 g de sódio é

equivalente a 2,55 g de sal; 1 mmol de sódio é equivalente a 23 mg de sódio e 1 g de sal é

equivalente a 17 mmol de sódio. O quadro 4 apresenta uma visão geral das diferentes

unidades. A maior fonte de sódio na dieta é o sal (NaCl) e o seu alto consumo, atualmente, é

utilizado como preditor de DCV. Embora a American Heart Association recomende um

consumo de sódio de <2300 mg por dia (AHA, 2010), pesquisas mostram que a população

mundial consome muito mais do que isso, ingerindo até 13 g de sal por dia, com um consumo

diário médio de 8,7 g (CDC, 2011). Em países ocidentais seu consumo é ainda mais elevado

não só pelo seu uso na preparação como na conservação de alimentos, sendo extremamente

excessivo para as necessidades fisiológicas humanas. O processamento de alimentos, muitas

vezes, envolve a adição de sódio por uma grande variedade de razões relacionadas ao sabor

ou ao processamento. Por exemplo, grão de bico, milho e ervilha que têm, naturalmente,


25

muito baixo teor de sódio, apresentam 10 a 100 vezes mais sódio pós-processamento (WHO,

2007).

Apesar de existirem poucas pesquisas sobre a mudança de padrões alimentares no

Brasil, o estudo de Barreto & Cyrillo em 2001 mostrou uma diminuição de 35% nos gastos

domésticos com hortaliças e frutas no orçamento familiar. Situação inversa foi encontrada

nos gastos com alimentos industrializados. Essa modificação não parece estar somente

relacionada aos preços do mercado, mas também ao marketing e à própria dinâmica de vida,

os quais exercem importante papel nas decisões de consumo. Uma alimentação mais pobre

em frutas e hortaliças é baseada em alimentos industrializados, mais rica em sal, o que parece

ser preditor de agravos à saúde. Assim, é nesse contexto que a relação sódio/potássio vem

sendo utilizada como marcador da qualidade na alimentação, visto que uma dieta mais

adequada em relação ao sódio e ao potássio pode estar relacionada ao maior consumo de

frutas e hortaliças e ao menor consumo de alimentos industrializados, como os embutidos e

enlatados. Kotchen & Kotchen em 1997 demonstram que essa relação é mais importante do

que a medida de sódio e potássio isoladamente. Outro estudo realizado por Kaufman et al.

(1996), na África, mostrou que essa relação estava associada à PAS e à pressão arterial

diastólica (PAD) e que o aumento da prevalência da hipertensão estava relacionado tanto às

mudanças econômicas quanto às dietéticas.

As iniciativas voltadas à redução no consumo de sódio se destacam entre as ações de

prevenção e de controle das doenças crônicas diretamente associadas à alimentação por uma

relação positiva entre custo e efetividade. Entre as principais estratégias encontram-se a

redução voluntária do conteúdo de sódio de alimentos processados e a realização de

campanhas de mídia para a promoção de hábitos alimentares saudáveis, que, segundo

estimativas da OMS, poderiam evitar 2,5 milhões de mortes e poupar bilhões de dólares aos

sistemas de saúde no mundo (WHO, 2010).

Quadro 4: Quantidades equivalentes entre sódio e sal

Sódio (mg) Sódio (mmol) Sal (g)

1200 51 3,0 2000 87 5,0 2400 104 6,0 4000 174 10,0

MOHAN & CAMPBELL, 2009


26

1.3.2 Fisiologia do sódio

No corpo de um homem pesando 70 kg há aproximadamente 3,5 mol de sódio.

Metade do sódio está dentro dos fluidos corporais (90% extracelular e 10% intracelular) e o

restante está presente no osso. O sódio é um elemento inorgânico e é um dos principais

eletrólitos, responsável pela osmolaridade e volume do fluido extracelular além de fazer

parte de diversas secreções do organismo, como a bile e os sucos pancreáticos. Seu equilíbrio

no corpo está intimamente ligado ao equilíbrio da água. Juntamente com potássio e cloro, o

sódio desempenha um papel na condução dos impulsos nervosos, excitação elétrica de

células musculares (incluindo o músculo cardíaco) e em combinação com o bicarbonato,

regula o pH corpóreo. Excesso ou deficiência pode ser a base de alterações no equilíbrio

ácido-base (ÉVORA et al., 1999).

Sódio e cloro são também vinculados ao transporte de muitas moléculas através das

membranas celulares. Bomba de sódio (também designada bomba de sódio-potássio), Na+K+-

ATPase, desempenha um papel fundamental no equilíbrio da água, na condução nervosa e no

transporte ativo. Para manter o potencial elétrico da célula, essa enzima precisa de uma baixa

concentração de íons de sódio e de uma elevada concentração de íons de potássio dentro da

célula. Fora das células existe uma alta concentração de sódio e uma baixa de potássio, pois

existe difusão desses componentes através de canais iônicos existentes na membrana celular

(KAPLAN, 2002). Para manter as concentrações ideais dos dois íons, a bomba de sódio libera

sódio para fora da célula e potássio para dentro. Nota-se que esse transporte é realizado

contra os gradientes de concentração desses dois íons, o que ocorre graças à energia liberada

com a clivagem de ATP. Os impulsos dos nervos ao longo de células, o transporte ativo de

nutrientes para os enterócitos e células musculares são todos dependentes da bomba Na+/K+-

ATPase (KAPLAN, 2002).

Em bom estado de saúde, a absorção de sódio no intestino é > 97%, transportado

para o rim, onde é filtrado e reabsorvido para a corrente sanguínea de forma a manter os

níveis normais no sangue. A quantidade de sódio absorvida é proporcional à quantidade de

sódio ingerida, e, por esse motivo, a excreção urinária (mais de 24 horas) é geralmente aceita

como a estimativa mais confiável de ingestão de sódio (ELLIOTT & BROWN, 2006), já que sua

excreção é realizada essencialmente através da urina (90 a 95%). O restante é eliminado pelas

fezes e pelo suor, sendo a sua excreção não mais que 2% pelas fezes e cerca de 2% pela pele,

durante a transpiração. Comunidades que vivem em climas tropicais mostram excreção mais

diluída para evitar a perda de excesso de sódio (GLEIBERMAN, 2009).


27

1.3.3 Sódio e homeostase hídrica

Dependendo da disponibilidade de água, o rim adulto saudável é capaz de excretar

muito ou pouco de sódio e de fluido (GUYTON, 1991). O plasma pode ser influenciado por

diversos mecanismos. Forças físicas, tais como pressão de perfusão e pressão coloidosmótica,

mecanismos neurais e comportamentais, como a sede e a fome de sal, a taxa de filtração

renal, bem como mecanismos endócrinos e hormonais, podem afetar a homeostase de Na+.

Assim, hormônios circulantes como a Ang II, a aldosterona, o fator natriurético atrial (ANF), a

atividade do nervo simpático renal têm uma influência importante sobre a relação pressão-

natriurese (CAMPESE & KARUBIAN, 1991; McMANUS et al., 1995; CHIOLERO et al., 2001;

ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; DIETZ, 2005; KOPKAN & CERVENKA, 2009).

Embora haja indícios fortes de que o rim é a via final comum no padrão a longo prazo

de alteração da pressão, a anormalidade inicial deste não pode ser intrínseca ao

desenvolvimento da hipertensão. Aumento da pressão sanguínea na aurícula direita do

coração provoca a secreção do ANF, que aumenta a excreção do sódio e, consequentemente,

a perda de água na forma de urina. Isso resulta em redução da pressão sanguínea com o

volume de sangue diminuindo devido à eliminação da água. O mecanismo funciona em

sentido inverso, com uma diminuição no ANF diminuindo a perda de água e aumentando

pressão sanguínea quando diminuição da PA é detectada dentro do átrio direito do coração

(De BOLD, 1985).

Outro mecanismo é o sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) que é um dos

principais componentes de regulação homeostática. O sistema SRAA atua principalmente

através da regulação de reabsorção renal de sódio e responde à diminuição da PA dentro das

arteríolas aferentes do rim. A renina é uma enzima proteolítica liberada a partir de células

especializadas do aparelho justaglomerular, em resposta à diminuição da PA, à atividade do

SNS e as diminuições de NaCl no túbulo distal. Assim, a renina ativa o SRA por clivagem do

angiotensinogênio, produzido pelo fígado, para produzir a angiotensina I (Ang I), que é ainda

convertida em Ang II pela enzima conversora de angiotensina (ECA), principalmente dentro

dos capilares dos pulmões. Em seguida, Ang II contrai os vasos sanguíneos, aumenta a

secreção de hormônio antidiurético (ADH) e aldosterona, além de estimular o hipotálamo,

ativando o reflexo da sede (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; COOPER et al., 2007; BADER &

GANTEN, 2008).

Reduções significativas na PA também provocam um aumento da secreção do ADH

com aumento da permeabilidade à água nas células dos ductos coletores renais, o que

permite que mais água seja reabsorvida a partir da urina para o sangue. Assim, a liberação de


28

ADH aumentando a reabsorção de água no interior do rim resultará em pequeno volume de

urina concentrada a ser produzido. Adicionalmente, elevação da PA será causada por

aumento no volume de sangue e diminuição da pressão osmótica do sangue (um efeito de

diluição), com resultante aumento do volume de sangue agindo de forma a restabelecer a PA.

ADH é considerado o regulador mais importante da osmolaridade do sangue

(McMANUS et al., 1995; ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004). Um aumento da osmolaridade

do sangue, como maior concentração de sódio, provoca secreção de ADH a partir da pituitária

posterior mediada por osmorreceptores. Isso resulta em ativação da reabsorção de água nos

rins, diluindo, assim, o sangue e restaurando a osmolaridade normal (Figura 7).

Angiotensina I

Angiotensinogênio

↑ excreção de sal 3

↑ ANF

↑Volume plasmático ↓Volume plasmático

Excesso de sal Déficit de sal Angiotensina II

↓ excreção de sal 4

1

↓ Volume de urina

Antidiurese 2

↑ Volume de urina

Diurese

↑ ANF Sede

VP

Déficit de água

Osmorreceptores

↑Osmolaridade

plasmática

↓Pressão

atrial

Excesso de água

Barorreceptores

↑Pressão

atrial

↓Osmolaridade

plasmática

Figura 7: Função renal na homeostase de água e sal. (1) Rim e resposta hipotalâmica para déficit de água; (2)

Rim e resposta hipotalâmica para excesso de água; (3) Rim e resposta adrenal para excesso de sal e (4) Rim e resposta adrenal para déficit de sal. Adaptado de Despopoulos & Silbergafl, 1986. Fator natriurético atrial (ANF).


29

A osmolaridade no sangue é, dessa forma, mantida através do controle exato da

concentração de íons extracelulares e, concomitantemente, pelo equilíbrio de fluidos

(McMANUS et al., 1995; ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004). Sugere-se também que a

excreção urinária de sódio e a pressão hidrostática intersticial renal estão sob a influência do

NO (KONE & BAYLIS, 1997; MAJID et al., 2001), e qualquer defeito desse sistema pode

resultar na geração de hipertensão (COWLEY et al., 1995; BARTON et al., 2000). Ocorre

diminuição significativa de nitratos no plasma em pacientes hipertensos, embora metabólicos

de NO, medidos no plasma ou urina, são apenas indicadores indiretos da produção de NO e

suas alterações não refletem necessariamente a disfunção endotelial (BRAGULAT et al.,

2001).

1.3.4 Sódio e hipertensão

Existe hoje uma infinidade de estudos sobre comunidades subdesenvolvidas que,

historicamente, têm um consumo muito baixo de sal (<1 g) e, predominantemente,

apresentam PA baixa sem hipertensão relacionada à idade, como visto nos países ocidentais.

Porém, a primeira implicação de que o sal pode ser um fator de aumento da PA foi relatada

com Ambar & Beaujard (1904) evidenciando uma relação positiva entre alto teor de sal na

alimentação e PA elevada. Já Kempner (1948) com o objetivo inicial de demonstrar a

eficiência no controle da hipertensão arterial e das complicações cardiovasculares utilizando

dieta com baixo teor proteico, em 500 pacientes acompanhados durante 4 anos, mudou os

rumos da pesquisa quando os resultados iniciais demonstraram que a simples restrição de sal

na dieta, por si só, era capaz de reduzir a PA.

Estudos clínicos e experimentais demonstram uma correlação positiva entre o sal

ingerido na dieta e valores de PA. Essa afirmativa tem como fundamento vários estudos que

avaliaram indivíduos normotensos, hipertensos, animais de laboratório, bem como pequenas

amostras e grandes populações (MASCIOLI et al., 1991; LAW et al., 1991; ELLIOTT et al., 1996;

VASDEV et al., 2003; KATORI & MAHIMA, 2006; STRAZZULLO et al., 2009). Ensaios clínicos e

em animais, por sua vez, mostram que reduzir a ingestão de sal diminui os níveis de PA em

grupos normotensos e hipertensos e podem prevenir a hipertensão. Uma pesquisa

envolvendo 3.000 indivíduos pré-hipertensos com idade entre 30-54, informou que a

diminuição da ingestão de sal reduz o risco de DCV em até 35% (COOK et al., 2007). Os

resultados confirmaram que os grupos restritos de sódio tinham menos probabilidade de

sofrer DCV e uma redução de risco de morte por qualquer outra causa. Outro estudo de

intervenção de longo prazo, avaliou PA e excreção urinária de sódio de 24 horas após redução


30

da ingestão de sal (> 50%) em uma população rural em Portugal. Uma diminuição progressiva

da pressão sanguínea foi observada quando comparada com o controle, além de correlações

significativas entre queda da PA e diminuição da relação sódio urinário e creatinina (FORTE et

al., 1989).

Uma das maiores pesquisas sobre consumo de sal (Intersalt) envolveu um estudo

controlado de 52 comunidades em 32 países ao redor do mundo, incluindo dados de mais de

10 mil adultos no total, todos com variáves nos níveis de ingestão de sal (0,5 g > 25 g/dia). A

investigação mostrou uma relação positiva entre a ingestão de sal e PA e uma inversa relação

para consumo de potássio e aumento da PA. Foi também estimado que um aumento de 6 g

por dia de sal, durante 30 anos levaria a uma elevação em 9 mmHg na PA (STAMLER et al.,

1996). Além desse estudo, uma meta-análise das bases Medline, Embase, Cochrane

Hypertension Group Specialised Register, Cochrane Central Register of Controlled Trials e

artigos relevantes envolvendo redução de consumo de sal e sua relação entre queda da PA

em indivíduos normotensos e hipertensos foi realizada por He & Mac Gregor (2000). A análise

constatou que sódio urinário estava significativamente associado à redução da PA. A

diminuição do consumo de sal ocasionou redução de -75 mmol/24h de sódio urinário e essa

queda resultou em mudança na PA (-4,18 mmHg para PAS e -2,06 mmHg para PAD) em 4

semanas. Essa intervenção para consumo menor de sal foi também relacionada a mudanças

na atividade de renina no plasma, concentração de aldosterona e noradrenalina e nenhuma

alteração nos níveis de lipídios. Levando em conta que a maioria dos estudos analisados

envolveu uma média de 2 g/dia de redução da ingestão de sal e as recomendações atuais são

para reduzi-lo por 5-7 g/dia, os autores argumentam que uma intervenção mais controlada e

maior do que 2 g/dia provavelmente ocasionaria maior redução na pressão sanguínea, à

semelhança das respostas dependentes da dose observada em estudos com animais.

Portanto, vários estudos têm sido realizados e, quase todos apoiam o conceito de que

o consumo de sal é um importante fator no aumento da PA da população. Entretanto, a

resposta da PA diante de modificações no consumo de sódio não costuma ser homogênea na

população. Existem indivíduos que apresentam “tendência” maior ou menor para queda ou

elevação da PA frente a reduções ou suplementações de sal, fenômeno explicado como

sensibilidade ao sal. Pacientes classificados como sensíveis ao sal mostram diminuição

significativa da excreção urinária de nitratos no final do período de elevado teor de sal em

contraste a hipertensos resistentes ao sal.

Modelos animais de hipertensão humana, incluindo ratos Dahl sensíveis ao sal (Dahl-

SS), Wistar-Kyoto (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) respondem à dieta com


31

baixo e alto teor de sal com alterações da PA semelhante aos humanos sensíveis ao sal

(OGIHARA et al., 2002). Porém, os mecanismos pelos quais os indivíduos normotensos ou

hipertensos variam sua PA em diferentes graus, em resposta à restrição ou sobrecarga salina,

ainda não são completamente conhecidos.

Gordon & Mark (1984) encontraram função anormal dos barorreceptores em ratos

Dahl-SS, mesmo antes dos animais se tornarem hipertensos. Esses autores preconizaram um

mecanismo neurogênico alterado, que seria responsável pela hipertensão arterial nessa cepa

de ratos. Mecanismos renais associados ao desenvolvimento de hipertensão arterial nos

modelos Dahl-SS também foram identificados. Ratos Dahl-SS apresentam defeito na resposta

vasodilatadora renal que normalmente acompanha a sobrecarga salina com diferença na

vasculatura renal em relação à observada nos ratos Dahl resistente ao sal (Dahl-SR) (FINK et

al., 1980). Rins de ratos Dahl-SS não têm capacidade de vasodilatar integralmente

apresentando defeito na resposta vasodilatadora renal, que normalmente acompanha a

sobrecarga salina, e não aumentando com dieta rica em sal. Dahl & Heine (1975) observaram

que o transplante de um rim de rato Dahl-SR para um rato Dahl-SS previne o aparecimento de

hipertensão arterial nesse último, quando submetido à sobrecarga salina, o que de fato

sugere que o rim possa ser o órgão responsável pela sensibilidade ao sal. Em adição, cepas de

ratos Dahl-SS e Dahl-SR têm sido intensamente estudadas por meio de técnicas de biologia

molecular. Rapp et al. (1989) identificaram aumento na expressão do gene da renina nas

cepas de ratos Dahl-SS, sugerindo que essa maior expressividade do gene poderia estar

relacionada ao aumento da PA nesses animais quando expostos a sobrecarga salina.

1.3.5 Sódio e estresse oxidativo

A literatura sugere que estresse oxidativo participa da patogênese da hipertensão

com estudos relacionando modelos de hipertensão sensível ao sal e aumento do estresse

oxidativo (MANNING et al., 2003; TIAN et al., 2007; BANDAY et al., 2007). Dieta rica em sal

leva à geração de EROs e esse aumento do estresse oxidativo sistêmico pode contribuir para

prejudicar função endotelial, diminuindo dilatação endotélio-dependente em ratos

normotensos (LENDA et al., 2000). O2•− pode, então, inativar rapidamente NO, e essa reação

ocorre numa taxa mais rápida do que a interação de O2•− com a SOD, sugerindo uma

interação preferencial entre O2•− e NO na parede vascular (HARRISON, 1997). Um mecanismo

sugerido, assim, é que dieta rica em sal aumenta produção de O2•− interagindo com NO,

formando ONOO−, o que reduz biodisponibilidade de NO (BRAGULAT et al., 2001) levando ao


32

comprometimento funcional do órgão. Outra possibilidade para a disfunção endotelial é a

diminuição na atividade da NOS (SATOH et al., 2005).

Assim sendo, em hipertensos com sobrecarga de sal foi observado diminuição nos

níveis plasmáticos e urinários de metabólitos de NO (FUJIWARA et al., 2000) com acumulação

significativa de O2•− no rim alterando regulação normal da função renal, e contribuindo para

o desenvolvimento da sensibilidade ao sal e hipertensão (CHEN et al., 1998). O estresse

oxidativo na hipertensão foi demonstrado pelo aumento da produção de marcadores, como

por exemplo, sobre a peroxidação lipídica com o produto isoprostano e malonildialdeído

(MDA) (SCHNACKENBERG & WILCOX, 1999; BELTOWSKI et al., 2005), e por efeitos de

diminuição da PA pelo uso de formas de células-permeáveis de SOD (LAURSEN et al., 1997) ou

de seus miméticos (SCHNACKENBERG & WILCOX, 1999). O2•− age como um vasoconstritor e

aumenta a reabsorção tubular de sódio (MAKINO et al., 2002) e NO exibe efeitos opostos ao

O2•−, de forma que também está envolvido na regulação da função renal. Além disso, os

efeitos do O2•− podem reduzir a expressão do sistema de defesa antioxidante (CHABRASHVILI

et al., 2003; WELCH et al., 2005) com o aumento da produção de EROs e sua degradação

reduzida podendo levar ao estresse oxidativo com ampla consequências fisiológicas e

fisiopatológicas.

O2•− é produzido em fagócitos ativados pela enzima NADPH-oxidase (BABIOR, 1999)

que também tem sido implicada na sinalização de O2•− na vasculatura (RAJAGOPALAN et al.,

1996), no córtex (CHABRASHVILI et al., 2002) e medula (ZOU et al., 2001) do rim. Ativação de

NADPH-oxidase leva à geração de O2•− induzida por Ang II (RAJAGOPALAN et al., 1996) e está

implicada na patogênese de vários modelos de hipertensão (GRIENDLING et al., 2000;

CHABRASHVILI et al., 2002). Normalmente, durante uma dieta rica em sal, o SRA está

suprimido. Como consequência dos baixos níveis circulantes de Ang II ocorre, nos vasos da

circulação renal, aumento na expressão dos receptores para Ang II (up regulation) e maior

reatividade local à Ang II (OIGMAN, 2000). Ou seja, quantidades pequenas de Ang II são

capazes de promover expressiva vasoconstricção. Na verdade, quando medido diretamente

em ratos com hipertensão sensível ao sal, o angiotensinogênio intrarenal se eleva,

acompanhado por um aumento da expressão do receptor AT1 da Ang II. Kitiyakara et al.

(2003) sugerem que o elevado teor de sal e Ang II regulam a expressão da NADPH-oxidase

uma vez que a essa enzima foi atribuído um papel importante na geração de EROs nos tecidos

vascular e cardíaco. Consequentemente, NADPH-oxidase pode desempenhar um papel crítico

na produção de EROs no rim com disfunção endotelial em animais hipertensos sensíveis ao

sal. Ocorre, dessa maneira, uma regulação positiva da NADPH-oxidase e aumento da


33

produção de EROs, o que leva a uma disparidade entre os mecanismos oxidativos e

antioxidantes nos tecidos, que estão envolvidos em muitos processos fisiopatológicos no

organismo.

Logo, nesse estudo considerou-se que ratos normotensos tratados com dieta rica em

sal podem ter a produção basal de O2•− aumentada e essa alteração poderia contribuir para o

desenvolvimento do estresse oxidativo, relacionado ao aumento da resistência vascular no

modelo estudado e possível regulação da perfusão tecidual. O consumo de sal, portanto,

induz mudanças na regulação da homeostase do sódio e do volume extracelular

principalmente pelos rins (GUYTON et al., 1972) com o SRA desempenhando um papel-chave

na regulação da função renal, no volume do fluido extracelular e na PA, além de induzir

estresse oxidativo (particularmente formação de O2•−). O desequilíbrio dessas interações está

ligado à fisiopatologia da hipertensão uma vez que a hemodinâmica renal na manutenção de

sódio e no volume de fluido extracelular são reguladas por esses sistemas. À medida que a

ativação de SRA, em particular o aumento de Ang II, pode induzir a geração de O2•−, sugere-

se, diante dessas questões, que as interações fisiológicas de SRA e O2•− podem proporcionar

uma regulação coordenada da função renal (KOPKAN & CERVENKA, 2009).

Objetivos

34

2- OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

O presente estudo teve como objetivo avaliar se dieta rica em sal pode induzir

hipertensão em ratos com hiperinsulinemia, desencadeada por frutose dietética, com o

estresse oxidativo contribuindo para a regulação da PA.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Padronizar o modelo de estudo com a dieta empregada para:

avaliar mudanças corpóreas e anatomopatológicas de órgãos-alvo;

averiguar padrão de consumo alimentar;

investigar a existência de aspectos característicos da SM;

examinar a presença de estresse oxidativo identificando dano celular e/ou alteração

de defesas antioxidantes;

verificar perfil de células sanguíneas e aspectos histológicos e funcionais hepáticos;

verificar se a administração de frutose pode estimular aumento na reabsorção de

sódio com a sobrecarga de sal;

avaliar uma provável interação entre sal e frutose, potencialmente, interferindo na

resposta pressórica.

Examinar a ação do antioxidante tempol no modelo estudado para:

avaliar desenvolvimento corpóreo;

averiguar padrão de consumo alimentar;

identificar dados relativos ao estado nutricional e à função hepática;

investigar perfil lipídico, índice aterogênico e resposta enzimática da PON;

determinar se ocorreu variação de produtos finais de degradação metabólica;

avaliar se O2•− pode estar envolvido na resposta pressórica encontrada;

observar uma possível relação entre PA, peroxidação lipídica e parâmetros sanguíneos

avaliados.

Materiais e Métodos

35

3- MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS E TRATAMENTOS

Para realizar esse estudo foram utilizados ratos machos Fischer, em idade adulta,

obtidos do Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da Universidade

Federal de Ouro Preto. Todos os procedimentos foram cuidadosamente realizados e

aprovados pelo comitê de ética no uso de animais de laboratório da Universidade Federal de

Ouro Preto (068/2011). Mantidos numa sala com temperatura e umidade controladas, num

ciclo claro-escuro 12:12, os animais foram acondicionados individualmente em gaiolas do tipo

galvanizadas de fundo aramado, com livre acesso à comida e à água. Para o início do

experimento, grupos de 11 a 12 animais foram selecionados de modo que a média de peso

corporal fosse semelhante e, a cada duas semanas, ganho de peso foi regularmente avaliado.

Para calcular o consumo alimentar de cada animal foi medida a quantidade de dieta

oferecida, não consumida e desperdiçada. Já a ingestão hídrica foi verificada através do

volume de água presente no recipiente de fornecimento hídrico, subtraindo desse volume a

quantidade restante vinte e quatro horas depois. Esses dados foram avaliados próximo ao

término do experimento, sendo os valores apresentados referentes à média da mensuração

de 10 dias. Após 20 semanas de tratamento, com jejum por 10 a 12 horas, animais foram

anestesiados com isoflurano e eutanasiados por enxanguinação, através de um corte sobre o

plexo braquial. Para análise coletaram-se sangue, órgãos (fígado, coração e rins) e gordura

abdominal. Gordura e órgãos foram pesados logo após remoção e fígado, coração e rins

foram estocados a -80oC para subsequentes análises.

3.1.1 Protocolo A: Avaliação e padronização do modelo experimental

Os animais foram divididos inicialmente em três grupos: 1) grupo controle (C), que

recebeu dieta padrão e água; 2) grupo com dieta rica em sal (S), que recebeu dieta padrão

modificada com acréscimo de sal (8% NaCl) e água e 3) grupo com dieta rica em frutose (F),

que recebeu dieta padrão e solução de frutose (20%) em vez de água. Após 10 semanas de

tratamento, animais do grupo F foram subdivididos em 2 grupos: um que continuou a receber

suplementação de frutose e outro que associou alto teor de frutose e de sal por mais 10

semanas (FS10), com a mesma concentração de frutose e de sal na dieta já descrita para os

grupos F e S, respectivamente. Estenderam, assim, todos os grupos para 20 semanas de

tratamento (Figura 8).


36

Figura 8: Protocolo A. Ratos foram divididos em grupo controle (C), recebendo dieta padrão e água por 20

semanas; grupo com dieta rica em sal (S), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e água por 20 semanas; grupo com dieta rica em frutose (F) , recebendo dieta padrão e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e grupo com dieta rica em frutose e sal (FS10), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 10 semanas após tratamento prévio de dieta padrão e solução de 20% de frutose como água por 10 semanas.

3.1.2 Protocolo B: Efeito do antioxidante tempol em animais alimentados com dieta rica

em frutose e sal

Os animais foram divididos em dois grupos experimentais, um que recebeu dieta

padrão (C) e outro que recebeu dieta padrão modificada com acréscimo de sal (8% NaCl) e

solução de 20% de frutose em vez de água para beber (FS20). Da 13ª até a 20ª semana do

estudo, metade dos animais de cada um desses grupos foi tratado, uma vez ao dia com

veículo (água filtrada), ou com 10 mg/kg/dia de tempol (Sigma) em 2 mL/kg de peso por

gavagem, compondo os grupos (CT) e (FS20T) (Figura 9).

Figura 9: Protocolo B. Ratos foram divididos em grupo controle (C), recebendo dieta padrão e água por 20 semanas

e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com água; grupo controle e tempol (CT) recebendo dieta padrão e água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com tempol (10 mg/kg de peso); grupo com dieta rica em frutose e sal (FS20), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com água; grupo com dieta rica em frutose sal e tempol (FS20T), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com tempol (10 mg/kg de peso).

Grupo controle (C )

Grupo com dieta rica em sal (S)

Grupo com dieta rica em frutose (F)

Grupo com dieta rica em frutose e sal (FS10)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (semanas)

Dieta

Pro

toco

lo A

P

roto

colo

B

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (semanas)

Grupo controle (C )

Dieta

Grupo controle + tempol (C T)

Grupo com dieta rica em frutose e sal (FS20)

Grupo com dieta rica em frutose e sal + tempol (FS20T)

Administração de Tempol

Administração de Tempol


37

3.1.3 Dieta

No Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) da Escola de Nutrição da Ufop,

foram elaboradas duas rações, sendo a padrão confeccionada segundo a recomendação de

Reeves e colaboradores (1993), modelo AIN-93M, e a modificada com acréscimo de 8% de

NaCl. A composição das dietas semipurificadas referidas nos protocolos A e B está

apresentada na tabela 1.

Animais de grupos alimentados com acréscimo de sal e de frutose foram tratados com

os respectivos constituintes, isoladamente e em combinação, de modo que distintos aportes

energéticos foram oferecidos para os diferentes grupos estabelecidos ao longo do estudo.

Tabela 1: Composição das dietas dos grupos experimentais

Ingredientes

Composição (g/Kg dieta)

C S F3 FS

3

Amido de milho 622.5 542.5 622.5 542.5

Caseina 140.0 140.0 140.0 140.0

Sacarose 100.0 100.0 100.0 100.0

Sal - 80.0 - 80.0

Celulose 50.0 50.0 50.0 50.0

Óleo de soja 40.0 40.0 40.0 40.0

1Minerais 35.0 35.0 35.0 35.0

2Vitaminas 10.0 10.0 10.0 10.0

Colina 2.5 2.5 2.5 2.5

Energia (Kcal/Kg) 3810 3490 3810 3490

(C) dieta controle; (S) dieta rica em sal; (F) dieta rica em frutose; (FS) dieta rica em frutose e sal. 1Mistura mineral para

AIN-93M; 2Mistura vitamínica para AIN-93M; 3D-Frutose (Synth®Labsynth, São Paulo, Brasil)

3.1.4 Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca por pletismografia

Animais foram colocados em contenção em um tubo cilíndrico de acrílico, em que

somente a cauda foi mantida exteriorizada, próxima a uma lâmpada aquecida para promover

dilatação da artéria e facilitar a medida da PA. A aferição só foi registrada após um período de

adaptação dos animais ao sistema de medida, com valores pressóricos registrados no início,

na fase intermediária e no final do estudo. Um manguito de borracha foi adaptado à região

proximal da cauda e ligado a um esfingmomanômetro para insuflar e desinsuflar

automaticamente em intervalos fixos de tempo (segundos). Próximo ao manguito foi também


38

acoplado um transdutor de pulso (sensor) que captava sinais a serem enviados e registrados

em computador. No registro da pressão sanguínea por pletismografia de cauda, ocorrem a

perda e o retorno dos sinais de pulso e de FC durante o processo de insuflação e

desinsuflação do manguito, sendo considerado o valor da PA como o primeiro sinal de pulso

de retorno desse processo. Já para análise da FC foram selecionados intervalos de 10

segundos entre os ciclos de insuflar e de desinsuflar. O sinal era captado por um amplificador

de sinais e conectado a um conversor analógico digital.

3.1.5 Teste oral de tolerância à glicose

Antes do final do experimento, 8 animais de cada grupo foram utilizados para a

investigação da sensibilidade à insulina utilizando um teste oral de tolerância à glicose

(TOTG). Para realização do teste, os animais permaneceram 12 horas em jejum antes de

receberem uma solução de 2,5 g de glicose por kg de peso corporal, via gavagem, e a glicemia

foi determinada nos tempos zero (antes da sobrecarga), 30, 60 e 120 minutos após a

administração, utilizando-se glicosímetro automatizado e fitas para se medir glicemia.

3.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS

Amostras sanguíneas dos animais foram coletadas em tubos de polipropileno com ou

sem 15μL de anticoagulante para obtenção do plasma ou soro, respectivamente. Em seguida,

o sangue foi centrifugado a 10.000 g por 15 minutos e guardados sob refrigeração (-4oC).

Foram realizadas as seguintes dosagens bioquímicas utilizando-se kits comerciais: glicose, TG,

colesterol total, colesterol-HDL, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase

(AST), fosfatase alcalina (ALP), albumina, proteínas totais, ureia, creatinina e ácido úrico. Os

princípios dos métodos e seus respectivos protocolos estão descritos no anexo 2 desse

trabalho.

3.2.1 Determinação do hematócrito

A determinação do hematócrito foi realizada por meio da técnica de

microhematócrito, segundo Goldenfarb et al. (1971). Tubos capilares foram preenchidos,

vedados em uma das extremidades e levados à centrífuga. Na centrifugação, os eritrócitos

foram compactados na parte inferior do tubo e, para a leitura, foi utilizado como auxílio o

cartão padrão. O resultado foi apresentado em porcentagem de células.


39

3.2.2 Contagem diferencial de leucócitos

Para contagem diferencial de leucócitos, uma gota de sangue foi usada para preparar

o esfregaço sanguíneo. A lâmina foi corada pelo corante Panotic Fast, o qual usa

componentes da coloração de Romanowsky. Contagem de 100 leucócitos foi realizada e os

resultados foram expressos como subtipos identificados para células polimorfonucleares

(PMN), linfócitos ou monócitos.

3.2.3 Atividade da paraoxonase-1

A atividade enzimática da paraoxonase-1 (PON1) no soro foi determinada de acordo

com Beltowski e colaboradores (2002). A avaliação da atividade paraoxonásica, usando

paraoxon como substrato, teve como base a velocidade de hidrólise desse, com a liberação

do para-nitrofenol por minuto. Inicialmente preparou-se uma solução contendo 9 mL de

tampão glicina/NaOH 50 mM pH10,5, contendo CaCl2 0,9mM e 2 μL de paraoxon. Em um

tubo de polipropileno adicionou-se 780 μL dessa solução e 20 μL de soro. A solução foi

homogeneizada e a absorbância das amostras foi lida no espectrofotômetro em 412 nm,

exatamente a cada minuto, por 3 minutos. O branco (tubo com 780 μL da solução preparada

inicialmente e 20 μL de água) foi utilizado para zerar o aparelho.

Para cálculo da enzima, 1 U da enzima PON1 é equivalente à hidrólise de 1 nmol de

paroxon por minuto (usualmente a atividade dessa enzima é representada por 1 mL de soro).

A atividade paraoxonásica da enzima foi calculada segundo a lei Lamber Beer. A absorbância

utilizada nessa expressão é o delta (absorbância por minuto) obtido das absorbâncias lidas no

1º e 3º minutos, subtraindo a absorbância do terceiro minuto pela absorbância do primeiro

minuto e dividindo por 2, uma vez que são 2 minutos entre as duas absorbâncias.

3.2.4 Concentração da insulina e leptina

A concentração sérica dos hormônios insulina e leptina foi determinada pelo método

de ELISA utilizando-se kits específicos descritos no anexo 2. A leitura foi realizada com auxílio

de leitor de micro-placa. O índice de resistência à ação da insulina foi estimado através do

cálculo do Homeostasis Model Assessment {HOMA-IR= [insulina em jejum (mol/L) x glicose

plasmática em jejum (mmol/L)] / 22,5} de acordo com Matthews et al. (1985).


40

3.2.5 Determinação de sódio

Sódio sérico foi determinado em fotômetro de chama, devidamente calibrado com

solução padrão contendo 140 mEq/L de sódio, diluído em água destilada na proporção de

1:100. Cada amostra foi diluída igualmente a solução padrão, homogeneizada e aspirada no

fotômetro de chama para a leitura da concentração do sódio e expressa em mmol/L.

3.2.6 Extração da gordura hepática

A gordura hepática foi extraída usando uma mistura de clorofórmio e metanol (2:1,

v/v), conforme descrito por Folch et al. (1957). Inicialmente, 400 mg de fígado foram

homogeneizados com 8 mL da mistura clorofórmio-metanol (2:1v/v) e o homogenato vertido

em tubos de vidro pré-lavados com éter de petróleo. Os tubos foram centrifugados a 1000 g

por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e colocado em outro tubo de vidro previamente

pesado e identificado. Foram acrescentados 2 mL da solução de NaCl 0,73% e nova

centrifugação foi realizada e, em seguida, a fase superior foi desprezada. Posteriormente, a

parede interna do tubo de vidro foi lavada com 3 mL da solução de Folch -

clorofórmio/metanol/água (3:48:47). A fase superior foi desprezada e os tubos com os

extratos lipídicos foram secos em estufa semiaberta, a 40oC, para evaporação total do

solvente. Após a evaporação, os tubos foram resfriados no dessecador e pesados novamente.

A quantidade de gordura no fígado (mg) foi obtida, subtraindo-se o peso do tubo final (g) do

peso do tubo inicial (g) multiplicado por 1000.

3.2.7 Oxidação de lipídeos (peroxidação lipídica) pela dosagem das substâncias reativas

ao ácido tiobarbitúrico

Determinação da concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS) é fundamentada na capacidade do ácido tiobarbitúrico (TBA) se ligar a lipídios

oxidados, conforme descrito por Buege & Aust (1978).

Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram

homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato, pH 7,4 e, em seguida, centrifugados por 10

minutos a 10000 g a 4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.

Em um tubo foram adicionados 500 µL de homogeneizado, 250 µL de ácido

tricloroacético (TCA) 28% p/v dissolvido em HCl 0,25N, 250 µL de TBA 1% dissolvido em ácido

acético 1:1 e 125 µL de BHT 5 mM dissolvidos em etanol. Em seguida, o tubo foi levado ao


41

vórtex e colocado em banho-maria a 95oC por 15 minutos. Após serem resfriados em banho

de gelo, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10000 g e o sobrenadante retirado foi

lido no espectrofotômetro a 535 nm, zerado com água destilada.

A concentração de TBARS foi determinada utilizando o coeficiente de extinção molar

(ε = 1,56 x 105L x mol-1 x cm-1), segundo a lei de Lambert Beer. Essa concentração foi

representada em nmoles/mL.

3.2.8 Atividade da superóxido dismutase

Atividade da SOD foi medida nos tecidos de acordo com o método de Marklund &

Marklund (1974) que se baseia na capacidade da SOD em inibir a autooxidação do pirogalol.

Os reagentes de trabalho utilizados foram: KH2PO4, Na2HPO4, Pirogalol, MTT {brometo de

(3-[4,5-dimetiltiazol-2H]-2,5-difeniltetrazolio) e DMSO (dimetilsulfóxido)}.

Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram

homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato (50 mM), pH 7,0, e em seguida, centrifugados

por 10 minutos a 12000 g a 4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.

A confecção das dosagens nas amostras usando placa de Elisa seguiu a sequência de adições

de reagentes, conforme o quadro a seguir.

Poço Amostra Tampão MTT (1,25 mM)

Pirogalol (100µM)

Branco - 144 µL 6 µL -

Padrão - 129 µL 6 µL 15 µL

Amostra 30 µL 99 µL 6 µL 15 µL

As amostras foram incubadas por 5 minutos em estufa à 37oC. Logo após, 150 μL de

DMSO foram adicionados às mesmas para parar a reação. As absorbâncias foram lidas no

leitor de Elisa em um comprimento de onda de 570 nm. Considerando que uma unidade de

SOD (U) é responsável pela oxidação de 50% do piragolol, e que a absorbância da amostra

obtida em unidades de SOD, converteu-se a absorbância da amostra obtida em unidades de

SOD. Para cálculo da atividade de SOD, subtrai-se o resultado obtido da amostra pelo valor

encontrado do branco e, a seguir, divide-se esse valor pelo encontrado da subtração do

padrão pelo branco.


42

3.2.9 Atividade da catalase

A determinação da atividade da enzima CAT é baseada na sua capacidade de

converter H2O2 em água e oxigênio molecular, conforme descrito por Aebi (1984).

Para a preparação da amostra biológica 100 mg do tecido foram homogeneizados

com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2 e, em seguida, centrifugados por 10 minutos a

4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.

Em um tubo de polipropileno, adicionaram-se 50 µL de tampão fosfato pH 7,2; (0,1

mM) e 40 µL de água destilada. Em seguida, adicionaram-se 10 µL da amostra e 900 µL de

H2O2 (10 mM) e homogeneizou-se a solução. O espectrofotômetro foi zerado com H2O2 (5

mM) em 240 nm e determinaram-se as absorbâncias das amostras exatamente a cada

minuto, durante 2 minutos e 30 segundos.

1 U de CAT é equivalente à hidrólise de 1 µmol de H2O2 (ε = 39,4 L.mol-1.cm-1) por

minuto. Usualmente, a atividade dessa enzima é representada em Unidade por mL de

amostra. Calculou-se a atividade da CAT segundo a lei de Lambert Beer. A absorbância

utilizada nessa expressão é o delta obtido da primeira e da última absorbância lida

(absorbância final – absorbância inicial / 2).

3.2.10 Concentração de glutationa

Glutationa total foi determinada enzimaticamente de acordo com Akerboon & Sies

(1981). Esse ensaio utiliza um método cinético fundamentado na redução do 5,5’ ditio-bis-2-

ácido nitrobenzóico (DTNB). A glutation reduzida (GSH) presente na amostra reage com

DTNB, produzindo 5-tio-2-ácido nitrobenzóico (TNB) e glutationa oxidada (GSSG).

Para preparo dos reagentes de estoque foram usados: solução de ácido sulfosalicílico

(SSA) 5%; tampão fosfato 5x (500 mM), contendo 5 mM EDTA; solução padrão estoque de

glutationa (0,3 mg de glutationa reduzida em 0,1 mL de água destilada); solução de estoque

de DTNB (8 mg de DTNB foram diluídos em 5,33 mL de dimetil sulfosalicílico (DMSO)

resultando em uma solução com 1,5 mg/mL de concentração) e estoque de NADPH (solução

de 40 mg/mL).

A amostra biológica foi preparada com 100 mg do tecido homogeneizado em 1 mL de

ácido de sulfosalicílico 5% (SSA) e, em seguida, centrifugada a 10000 g, por 10 minutos a 4oC.

O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.


43

Os reagentes utilizados foram: solução de enzima diluída (diluir 15,2 μL de glutationa

redutase (100 unidades/mL) em 250 μL de tampão fosfato 1x); solução de NADPH de trabalho

(da solução de estoque de NADPH preparada são retirados 30 μL para 7,5 mL de tampão

fosfato 1x); mistura de trabalho (8 mL de tampão 1x, 228 μL da solução de enzimas diluída e

228 μL de DNPH solução de estoque); solução padrão de glutationa – preparar para a curva

padrão (diluir 10 μL de solução estoque de glutationa padrão com 2 mL de ácido SSA 5%).

Para a confecção da curva padrão e das dosagens nas amostras utilizou-se placa de Elisa

seguindo a sequência de adições de reagentes, conforme mostradas nos quadros a seguir.

CURVA PADRÃO:

Poço 1 2 3 4 5

[GSH] µM

50 25 12,5 6,25 3,125

Solução de GSH (µM)

50 25 (tubo 1) 25 (tubo 2) 25 (tubo 3) 25 (tubo 4)

SSA 5% (µL)

- 25 25 25 25

nmoles de GSH em 10 µL de amostra

0,5 0,25 0,125 0,062 0,0312

DOSAGEM:

Poço Volume da

amostra SSA 5%

Mistura de trabalho

NADPH (final)

Branco

- 10 µL 150 µL 50 µL

Curva padrão

10 µL - 150 µL 50 µL

Amostra

10 µL - 150 µL 50 µL

As amostras foram então incubadas, por 5 minutos à temperatura ambiente e, em

seguida, adicionou-se NADPH às mesmas com o cronômetro sendo disparado. As

absorbâncias foram lidas, durante 5 minutos a cada minuto, no leitor de Elisa a 412 nm. As

absorbâncias de diluições seriadas de uma solução padrão de glutationa reduzida foram

determinadas e GSSG, já presente na amostra, foi reduzida a GSH pela presença de GR e

NADPH (chamado de método enzimático), medido após derivação da glutationa total com

acréscimo de 2-vinilpiridina (2-VP). Após análise de regressão linear, foi determinada a

equação da reta [Concentração = a* (delta das absorbâncias) + b]. Essa equação foi utilizada

para determinar a concentração em nmoles de glutationa total em 10 μl de amostra, e esse


44

valor extrapolado para 1 mL de amostra. Índice de estresse oxidativo foi calculado pela razão

GSH/GSSG.

3.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA

Fígado foi removido e um lóbulo foi imediatamente fixado em 10% de formol

tamponado. Após fixação, o material foi desidratado em concentrações crescentes de álcool

(70, 80, 90 e 100%), diafanizados em xilol e embebidos e incluídos em parafina. Os blocos de

parafina foram submetidos à microtomia com obtenção de cortes histológicos de 4

micrômetros de espessura e montados em lâminas de microscopia. Os cortes foram

desparafinizados em duas trocas de xilol, hidratados em concentrações decrescentes de

álcool (100, 90, 80 e 70%) e, então, lavados em água corrente. Em seguida, foram corados

pela técnica histológica de rotina da Hematoxilina & Eosina e levados à estufa a 56% para

secagem e serem montados com lamínula e Entellan.

Análises foram realizadas usando método semi-quantitativo, como previamente

descrito por Brunt et al. (1999). Degenerações foram determinadas de acordo com a

porcentagem de gordura contida em hepatócitos. Grau de vesículas esteatóticas foi dividido

em 10 grades em que foram dados os valores de 0-4 graus de acordo com a presença de

esteatose envolvida no hepatócito da biópsia (0, nenhum; 1, 10%; 2, 10 a 33%; 3, 33 a 66% e

4, >66%). As imagens foram visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através de

microcâmera no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Ouro Preto.

3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão e com apoio instrumental

do programa de análise estatística GraphPad Prism 5. Para avaliar a normalidade dos dados

utilizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov. A significância de qualquer diferença em

proporções ou medianas foi testada pelo teste de Kruskal-Wallis e em médias pela ANOVA

one way, seguido por teste de Dunns ou Tukey, respectivamente. As correlações entre

diferentes variáveis foram realizadas pelo coeficiente de Pearson. Um p-valor ≤ 0,05 foi

considerado estatisticamente significativo.

Resultados

45

4- RESULTADOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL

4.1.1 Peso corporal, da gordura abdominal e dos órgãos, ingestão alimentar, indicadores

de função hepática e parâmetros metabólicos

Para realização do estudo, inicialmente, os animais foram selecionados de forma que

os diferentes grupos apresentassem o mesmo peso corporal. Os animais foram pesados ao

longo do experimento e não se observou diferença no peso corporal com o uso da frutose na

dieta (451,2 ± 29,5g em C versus 448,2 ± 36,9g em F). Em contraste, tratamento com dieta

rica em sal mostrou menor ganho de peso, apresentando o grupo FS10 menor

desenvolvimento ponderal (-10%) em relação aos animais dos grupos C e F. Da mesma forma

observou-se menor gordura abdominal para animais alimentados com alto conteúdo de sal.

Para os órgãos coração e rim, sal resultou em maior peso relativo desses para S e FS em

relação aos grupos sem sobrecarga de sal ao passo que o peso relativo do fígado foi maior

para os animais em uso de frutose na dieta, comparando-se aos ratos C e S (Tabela 2).

Consumo alimentar foi significativamente diferente entre todos os tratamentos. Em

relação ao grupo C, animais do grupo S, que receberam dieta com menor densidade

energética, obtiveram maior consumo de ração, e, inversamente, suplementação de frutose

conduziu para menor consumo devido seu conteúdo energético prover calorias extras nesses

grupos (F e FS10). Adicionalmente, ingestão de líquido foi aumentada (4,5 vezes) quando

acréscimo de sal foi incorporado à dieta padrão, comparada aos grupos C e F, estimulando a

sede devido ao aumento na osmolaridade plasmática sistêmica. Dessa forma, ingerir mais

frutose, devido ao sal na ração, fez FS10 consumir menos calorias da ração do que outros

grupos, enquanto que o acréscimo de sal ao tratamento com suplementação de frutose,

quando combinados, resultou em maior consumo de frutose para animais FS10. Calculando,

grupo FS10 ingeriu 3,5 vezes mais frutose do que grupo F (Tabela 2).

As determinações bioquímicas da concentração de albumina e atividade das

transaminases AST e ALT, além de ALP, constituem marcadores importantes da função

hepática. Observou-se que os animais do grupo FS10 diminuíram significativamente (-25%) os

níveis séricos de albumina em relação aos grupos C e S. Além disso, dados apresentados

mostraram que atividade de ALP foi aumentada para FS10 em relação aos animais C bem

Resultados

46

como ALT para o grupo F, enquanto AST não apresentou mudança com os tratamentos

(Tabela 2).

Resultados demonstraram que tratamento com frutose produziu hiperglicemia

(animais do grupo F e FS), com grupo FS10 aumentando, significativamente, níveis de insulina

sérica em relação aos grupos C e S. RI, indicada pelo maior valor de HOMA, foi também maior

para o grupo FS10 em relação aos outros grupos. Concentrações de leptina no grupo F foram

maiores do que as dos outros grupos. Ratos FS10 desenvolveram hipertriacilgliceridemia

como mostrado por elevação nos níveis de TG (1,5 vezes maior do que o C) com maior

conteúdo de gordura hepática para os grupos F e FS10, comparadamente aos animais dos

grupos C e S. Concentração de ácido úrico sérico aumentou 25% em ratos do grupo F em

relação ao grupo C (Tabela 2).

Tabela 2: Características dos grupos experimentais

Parâmetros Tratamentos

C S F FS10 Peso corporal inicial (g) 295 ± 21,5 295,1 ± 23,1 295,1 ± 22,2 294,4 ± 28,5 Peso corporal final (g) 451,2 ± 29,5

a 428,2 ± 28,2

ab 448,2 ± 36,9

a 412 ± 17,2

b

Gordura abdominal (g) 14,3 ± 2,3a

10,4 ± 1,5b

14,2 ± 2,7a

10,8 ± 2,0b

Peso relativo coração (mg/g) 2,4 ± 0,1b

2,5 ± 0,2a

2,3 ± 0,1b

2,6 ± 0,1a

Peso relativo fígado (mg/g) 27,8 ± 3,0b 27,4 ± 2,6b

30,6 ± 2,4a

31,0 ± 2,1a

Peso relativo rim (mg/g) 5,1 ± 0,2b

5,6 ± 0,3a

5,2 ± 0,2b

5,8 ± 0,2a

Consumo de ração (g/dia) 17,9 ± 0,8b

19,9 ± 1,8a

15,9 ± 1,1c 12,5 ± 1,6

d

Ingestão de líquido (ml/dia) 12,0 ± 2,1c 54,0 ± 7,4

a 9,2 ± 1,4

c 32,7 ± 5,2

b

Albumina (g/dL) 2,8 ± 0,2a

2,8 ± 0,3a

2,5 ± 0,5ab

2,1 ± 0,4b

AST (U/L) 56,8 ± 17,3 56,8 ± 16,3 58,3 ± 17,3 57,1 ± 16,0 ALT (U/L) 16,0 ± 5,4

b 25,2 ± 11,2

ab 28,7 ± 11,6

a 24,8 ± 7,2

ab

ALP (U/L) 50,7 ± 11,2b

60,0 ± 11,2ab

59,6 ± 16,3 ab

70,7 ± 13,1a

Glicose plasmática (mmol/L) 8,0 ± 0,9b

8,7 ± 1,1b

11,9 ± 1,8a

12,7 ± 1,6a

Insulina (μmoles/L) 20,9 ± 13,1b

27,7 ± 14,2b

34,0 ± 19,4b

45,1 ± 25,8a

HOMA (índice) 7,6 ± 5,4b

11,0 ± 7,0b

17,4 ± 11,1b

23,2 ± 16,4a

Leptina (ng/mL) 6,76 ± 2,5b

4,50 ± 1,2b

10,1 ± 3,3a

5,8 ± 2,4b

Triacilglicerol (mmol/L) 1,42 ± 0,3b

1,67 ± 0,5 ab

2,07 ± 0,6ab

2,22 ± 0,6a

Gordura hepática (mg/g de fígado) 53,3 ± 6,0b

42,5 ± 4,4b

73,4 ± 17,3a

72,6 ± 12,6a

Ácido úrico (mg/dL) 1,37 ± 0,28b

1,29 ± 0,25b

1,72 ± 0,26a

1,57 ± 0,37ab

Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (dieta rica em sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS10 (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas após tratamento prévio por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Aspartato Aminotransferase (AST); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP) e Modelo de avaliação da homeostase (HOMA).

Resultados

47

Sensibilidade à insulina Para o TOTG realizado para avaliar sensibilidade à insulina, observou-se que a

concentração de glicose basal não foi diferente entre os grupos experimentais (variando de

96,2 ± 14,1 mg/dL para 105,1 ± 10,8 mg/dL). Porém, ao longo do teste, em comparação aos

outros grupos, o grupo F apresentou maior valor de glicemia após 30 minutos do teste,

alcançando 180,1 ± 12,5 mg/dL. Em sequência, aos 120 minutos, grupos tratados com frutose

e sal, isoladamente e em combinação, não foram capazes de retornarem glicemia para

valores semelhantes aos apresentados no tempo zero. Esse dado indica que, tanto o sal

quanto a frutose podem ter respostas atenuadas para utilização da glicose, caracterizando

uma menor ação da insulina do que o grupo controle (Figura 10).

Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose nos grupos experimentais. Valores são expressos como

média ± desvio padrão de 8 animais/grupo. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

4.1.2 Sódio sérico

A concentração sérica de sódio nos diferentes grupos foi avaliada e notou-se que o

nível de sódio no soro foi significativamente menor no grupo S (127,6 ± 4,5 mmol/L) do que

nos tratamentos para os grupos C, F e FS10, respectivamente (142,9 ± 5,3 mmol/L; 140,8 ±

8,1 mmol/L e 135,8 ± 4,5 mmol/L). Entretanto, embora dieta rica em sal possa levar a uma

Resultados

48

alteração na excreção de sódio para equilíbrio da osmolaridade sanguínea, pôde-se constatar

que a associação de frutose e sal conduziu para mudança desse padrão resultando em

aumento da concentração sérica de sódio em relação ao tratamento com sal isoladamente

(Figura 11).

C S F FS10110

120

130

140

150

160a

a

a

b

Só

dio

se

ric

o

(mm

ol/

L)

Figura 11: Valores séricos de sódio para os grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20

semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

4.1.3 Células sanguíneas

Contagem diferencial de leucócitos no sangue dos ratos, sob o tratamento de frutose,

mostrou diminuição significativa no perfil de linfócitos em relação ao grupo controle, mas

manteve-se sem alteração a porcentagem de células PMNs. Em contrapartida, o perfil de

monócitos foi aumentado significativamente em ratos tratados com frutose na dieta, quando

comparados aos animais do grupo C (Tabela 3).

Tabela 3: Contagem de leucócitos nos grupos experimentais

C S F FS10

Células PMN (%) 11 (5-15) 13 (0-28) 8 (1-27) 17 (7-23) Linfócitos (%) 42 (19-58) 47 (8-62) 14 (4-33)

* 11 (7-20)

***

Monócitos (%) 47 (27-61) 39 (16-80) 74 (36-85)**

72 (60-83)*

Dados são apresentados em mediana e, entre parênteses, valores indicam menores e maiores porcentagens de células contadas para

os grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle +

solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de

água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 versus C pelo teste

de Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunns. Células Polimorfonucleares (PMN).

Resultados

49

4.1.4 Peroxidação lipídica e componentes dos sistemas antioxidantes

A peroxidação lipídica tecidual, que reflete dano celular, foi avaliada por TBARS para

os órgãos coração, fígado e rim. Os níveis de TBARS no fígado demonstraram, para ratos

tratados com frutose e sal, maior média do que no grupo controle, o qual reflete que os

tratamentos promoveram estresse oxidativo hepático. Como consequência do processo de

lipoperoxidação, mudanças na permeabilidade seletiva das membranas alterando os fluxos

iônico e de outras substâncias resultam na perda da seletividade para entrada e/ou saída de

nutrientes e de substâncias tóxicas à célula com comprometimento dos componentes da

matriz extracelular. Os outros órgãos analisados, coração e rim, se mostraram menos

sensíveis ao estresse oxidativo, podendo esses serem mais protegidos ao ataque das EROs,

uma vez que não foi observada nenhuma mudança com os tratamentos (Figura 12).

C S F FS100

5

10

15

Coração

nm

ol/

mL

C S F FS10

0

2

4

6

8

10

Fígado

a a ab

nm

ol/

mL

Rim

C S F FS100

5

10

15

nm

ol/

mL

Figura 12: Concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta

enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

Resultados

50

Entre as principais enzimas responsáveis pela defesa antioxidante do organismo

destacam-se a SOD e a CAT, que constituem a primeira defesa endógena de neutralização das

EROs. A atividade da SOD apresentou-se significativamente diminuída no coração dos grupos

tratados com frutose e sal isoladamente em relação ao grupo C, porém, elevada para o grupo

FS10. Já no fígado, foi observada uma diminuição significativa da atividade de SOD apenas

para o grupo FS10, comparadamente aos animais do grupo controle. No rim, foi encontrado

aumento significativo da atividade de SOD para os diferentes tratamentos em relação aos

animais controles (Figura 13). A atividade da CAT no coração e no fígado foi acentuadamente

diminuída para o grupo FS10 em relação aos grupos F e C, respectivamente. No rim não se

observou diferença significativa entre os grupos para atividade de CAT. Os resultados estão

apresentados na figura 14.

C S F FS100.0

0.5

1.0

1.5

ab

c

c

Coração

taxa d

e i

nib

ição

(%

)

C S F FS10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5a

ab bab

Fígado

taxa d

e i

nib

ição

(%

)

C S F FS100.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

a a aab

Rim

taxa d

e i

nib

ição

(%

)

Figura 13: Atividade da enzima superóxido dismutase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e

água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de fruto se 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

Resultados

51

C S F FS100

50

100

150

200

Coração

abab

a

b

U/m

L

C S F FS100

10

20

30

40

50

Rim

(U/m

L)

Figura 14: Atividade da enzima catalase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F

(dieta controle + solução de frutose 20% em ve z de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

Como a atividade da GPx é regulada pela peroxidação lipídica, a fim de buscar o

controle e a redução na taxa de lipoperoxidação, ocorre aumento na sua atividade com

velocidade de oxidação de GSH por H2O2, catalisada por GPx. Nesse estudo, avaliou-se o

status da glutationa e observou-se que, comparados ao grupo controle, níveis hepáticos de

glutationa total e GSH foram diminuídos significativamente no grupo FS10, embora nenhuma

mudança significativa tenha sido observada nos níveis de GSSG, como mostrado na figura 15.

O índice de estresse oxidativo foi calculado pela razão GSH/GSSG, a qual foi demonstrada ser

menor em ratos FS10 do que nos outros três grupos, razão essa que sugere que EROs foram

geradas em quantidades acima dos valores basais.

C S F FS100

50

100

150

200

Fígado

b

a

ab

b

U/m

L

Resultados

52

Glutationa total

C S F FS100.0

0.5

1.0

1.5

2.0

aa

a

b

nm

ol/

mL

C S F FS10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

aa

a

b

GSH

nm

ol/

mL

C S F FS100.00

0.05

0.10

0.15

GSSG

nm

ol/

mL

GSH/GSSG

C S F FS100

5

10

15

20

a

a

a

b

Figura 15: Concentração de glutationa total, reduzida, oxidada e relação de glutationa reduzida para oxidada no fígado dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S

(8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. GSH (Glutationa reduzida); GSSG (Glutationa oxidada).

4.1.5 Histopatologia hepática

Fotomicrografias hepáticas coradas com H&E são mostradas na figura 16 (A, B, C e D)

e os resultados dos escores das variáveis histológicas são apresentados na figura 16 (E).

Ausência ou suave esteatose hepática ocorreram em ratos do grupo controle. Em ratos

tratados apenas com dieta rica em sal, predominantemente, não houve esteatose, mas vasos

hiperêmicos foram observados. Como esperado, frutose ocasionou acumulação de lipídios

em hepatócitos, evidenciados nos grupos F e FS10. Deposição de gordura no grupo F foi

classificada como macrovesicular, enquanto fígado de ratos do grupo FS10 mostrou,

principalmente, vesículas esteatóticas microvesiculares, com menor grau de acumulação do

que em ratos F. Um maior escore para esteatose foi encontrado no fígado de ratos F quando

comparado ao grupo C (p < 0,05).

Resultados

53

Figura 16: (A-D) Fotomicrografia representativa da coloração hematoxilina e eosina (H&E) de seções hepáticas de ratos nos diferentes grupos experimentais. Anormalidades nos hepatócitos não

foram observadas no grupo C (A); Vasos hiperêmicos (cabeça de seta) e parênquima com aparência normal no grupo S (B); Aspecto de esteatose macrovesicular no grupo F (C). Note hepatócitos com núcleos deslocados para a periferia da célula (seta branca); Aspecto de esteatose microvesicular no grupo FS10 (D). Note células com vacúolos citoplasmáticos sem delocamento de núcleo (seta preta) magnificação ×440. Grau de esteatose hepática de ratos nos diferentes grupos experimentais (E). Valores (n = 8-11). Grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). *p<0,05 pelo teste de Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunns.

*

Resultados

54

4.1.6 Pressão arterial sistólica e correlação com consumo de sal

Os valores médios da PAS ± desvio padrão, apresentados ao longo do tempo do

estudo, demonstraram que dieta rica em sal aumentou significativamente PAS (30mmHg) em

relação ao grupo controle no final do período experimental. Para o tratamento com frutose,

não foi observado modificação pressórica, apesar de leve tendência para aumento de PAS. A

mudança não foi suficientemente sustentada até o final do estudo, não alterando

significativamente os valores pressóricos. Acrescentando sal à dieta do grupo suplementado

com frutose, notou-se aumento da PAS com FS10 mostrando níveis pressóricos no final do

estudo superior ao do grupo C (Tabela 4). Adicionalmente, foi avaliada associação entre

consumo de sal e PAS (r=0,44; p<0,003). Quanto maior o consumo de sal maior PAS foi

observada. Ressalta-se que animais do grupo FS10 consumiram menos sal em relação ao

grupo S (além de menor tempo de tratamento, menor quantidade foi ingerida em g/dia, uma

vez que F na água ocasionou menor consumo de dieta sólida) (Figura 17).

Tabela 4: Registro pressórico dos grupos experimentais ao longo do experimento

Semana Pressão Arterial Sistólica (mmHg)

C S F FS10 0 127,0 ± 6,1

b - - -

9 124,2 ± 12,6b 136,1 ±

30,7

ab 142,3 ± 19,9

ab -

18 125,8 ± 12,1b 155,7 ±

20,9

a 136,8 ± 17,0

ab 150,3 ±

18,7

a

Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (dieta rica em sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS10 (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas após tratamento prévio por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

0 2 4 60

50

100

150

200

r = 0.44p < 0.003

Consumo de sal (g/dia)

PA

S (

mm

Hg

)

Figura 17: Correlação de Pearson entre valores de PAS final (mmHg) e consumo de sal (g/dia).

Resultados

55

4.2 AÇÃO DO ANTIOXIDANTE TEMPOL

4.2.1 Ganho de peso, de gordura abdominal e ingestão alimentar

Os dados demonstram que a combinação de sal e de frutose na dieta por 20 semanas

não ocasionou alteração no ganho de peso e de gordura abdominal nos animais no protocolo

B. Para os valores médios de ingestão de alimentos, observou-se que o fato da frutose, em

água, fornecer calorias extras para além das fornecidas pela dieta controle, resultou como

previsto em menor consumo de ração para os grupos FS20 e FS20T em relação aos grupos C e

CT. Como constatado no protocolo A, grupos tratados com dieta rica em sal aumentaram a

ingestão de líquido em comparação às dietas dos grupos que consumiram uma quantidade

normal de sal. Portanto, apesar dessa diferença no consumo de alimentos, não houve

diferença no ganho de peso corpóreo final e na gordura abdominal. Além do mais,

tratamento com tempol não ocasionou mudanças corporais e alteração no consumo

alimentar desses animais, independentemente do tipo de dieta (Tabela 5).

Tabela 5: Peso corporal, da gordura abdominal e ingestão alimentar nos grupos experimentais


C CT FS20 FS20T Peso corporal inicial (g) 296,7 ± 18,2 296,4 ± 26,8 297,0 ± 25,1 299,1 ± 27,3 Peso corporal final (g) 386,4 ± 23,3 394,1 ±

24,1

395,8 ± 28,2 400,9 ±

28,5

Peso de gordura abdominal (g) 11,4 ± 2,3 12,8 ± 1,3 12,0 ± 2,2 11,9 ±

1,8

Consumo de ração (g/dia) 14,4 ± 0,9a 14,9 ± 0,9

a 10,2 ± 1,8

b 9,8 ± 1,1

b

Ingestão de líquido (ml/dia) 16,2 ± 1,8b 15,2 ± 1,1

b 40,6 ± 4,7

a 40,7 ± 6,9

a

Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.

4.2.2 Hematócrito, proteínas e glicose plasmática

Dosagem de hematócrito sugeriu hemoconcentração nos grupos FS20 e FS20T em

relação ao grupo C. Em relação às proteínas totais e à albumina, não se observou variação

entre os diferentes grupos estudados, ao passo que concentração de glicose foi

significativamente aumentada para os animais do grupo FS20, quando comparados aos

grupos C e CT. Entretanto, nenhuma dessas variáveis foi alterada com tempol, embora média

do grupo FS20T reduziu em 12% glicemia, atenuando glicose plasmática do grupo FS20

(Tabela 6).

Resultados

56

Tabela 6: Hematócrito, proteínas e glicose plasmática em animais experimentais


C CT FS20 FS20T Hematócrito (%) 26,7 ± 9,3

b 31,0 ± 6,5

ab 37,1 ± 8,3

a 38,5 ± 4,0

a

Proteína total (g/dL) 8,5 ± 1,3 8,3 ± 1,4

9,0 ± 0,8 9,0 ±

1,1

Albumina (g/dL) 3,3 ± 0,3 3,3 ± ,0,2 3,6 ± 0,2 3,4 ±

0,1

Glicose (mmol/L) 7,5 ± 0,8bc

6,7 ± 0,6c 9,9 ± 2,1

a 8,8 ± 2,1

ab


4.2.3 Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da paraoxonase-1

Trigliceridemia foi elevada em ratos FS20 comparando-se a animais do grupo C, mas,

tratamento com tempol reduziu esse aumento em 25%. Colesterol total e colesterol-HDL

apresentaram menores concentrações em ratos FS20 do que nos grupos C e CT. Tratamento

com tempol, novamente, restabeleceu os valores embora não igualando a mesma

concentração observada no grupo C. O índice aterogênico do grupo FS20 foi aumentado em

55% quando comparado aos animais do grupo C enquanto que tempol reduziu

acentuadamente esse aumento. Já a atividade sérica da PON1 sobre o substrato paraoxon

apresentou-se 8% menor no grupo FS20 do que o observado no grupo controle, e

interessantemente, tempol aumentou 1,4 vezes a atividade de PON1 dos ratos tratados com

frutose e sal, alcançando níveis maiores do que o mostrado pelos animais controle (Tabela 7).

Tabela 7: Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da PON1 nos grupos experimentais


C CT FS20 FS20T Triacilglicerol (mmol/L) 1,8 ± 0,7

b 1,8 ± 0,2

b 3,1 ± 0,8

a 2,3 ± 0,5

b

Colesterol total (mmol/L) 2,8 ± 0,2b 3,2 ±

0,1

a 1,7 ± 0,2

d 2,1 ±

0,4

c

Colesterol-HDL (mmol/L) 2,1 ± 0,2a 2,2 ±

0,3

a 1,1 ± 0,1

c 1,6 ±

0,3

b

Índice aterogênico 0,3 ± 0,1b 0,4 ± 0,1

ab 0,5 ± 0,1

a 0,3 ± 0,1

b

PON1 paraoxon (U/mL) 190,2 ± 19,8b 203,5 ± 52,4

ab 173,9 ± 41,4

b 246,0 ± 49,0

a

Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). O índice aterogênico foi calculado: colesterol total – colesterol-HDL/colesterol-HDL. Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Paraoxonase 1 (PON1).

Resultados

57

4.2.4 Peso relativo do fígado e parâmetros de função hepática

Em relação aos animais do grupo controle, verificou-se que peso relativo do fígado foi

significativamente maior dos animais tratados com a dieta FS e com o uso de tempol. Ratos

FS20 mostraram aumento na atividade de AST, ALT e ALP quando comparadas ao grupo C,

mas, tempol reverteu valor de ALT e ALP, melhorando função hepática, já que elevações

desses valores demonstram algum nível de comprometimento hepático. Curiosamente, o

tratamento com tempol aumentou atividade de ALP em animais recebendo dieta controle

(Tabela 8).

Tabela 8: Peso relativo do fígado, atividade sérica de transaminases e fosfatase alcalina nos grupos experimentais


C CT FS20 FS20T Peso relativo fígado (mg/g) 25,1 ± 1,5

b 28,8 ± 3,6

a 30,8 ± 1,3

a 31,3 ± 2,6

a

AST (U/L) 43,6 ± 12,7b 49,1 ±

17,5

ab 59,3 ± 11,9

a 50,6 ±

13,6

ab

ALT (U/L) 19,2 ± 5,0b 21,6 ±

8,9

ab 28,9 ± 8,9

a 18,0 ±

6,8

b

ALP (U/L) 67,4 ± 10,4b 80,0 ± 8,7

a 85,8 ± 11,6

a 66,8 ± 11,4

b

Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Aspartato Aminotransferase (ASP); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP).

4.2.5 Peso relativo dos rins e produtos de degradação metabólica

Evidenciou-se aumento significativo do peso relativo dos rins para o grupo FS20 em

relação ao grupo CT. Níveis séricos de ureia, de creatinina e de ácido úrico foram

acentuadamente maiores em ratos FS20 do que em ratos C. Contudo, tempol mostrou efeitos

benéficos, prevenindo aumento de ácido úrico e de ureia em ratos FS20. No caso da ureia, é

válido salientar que esse é um dos principais catabólitos dos aminoácidos produzidos no

fígado. Já a creatinina, produzida pela utilização da fosfocreatina muscular, quando no

momento da atividade muscular ocorre defosforilação das moléculas de fosfocreatina para a

obtenção de energia, sofre ciclização não enzimática e transforma-se em creatinina. De

maneira semelhante à ureia, a creatinina, em situações de normalidade do funcionamento

muscular é constantemente produzida e lançada ao sangue, sofrendo filtração renal (Tabela

9).

Resultados

58

Tabela 9: Peso relativo dos rins e produtos de degradação nos grupos experimentais


C CT FS20 FS20T Peso relativo rim (mg/g) 5,4 ± 0,3

ab 5,2 ± 0,8

b 5,9 ± 0,3

a 5,8 ± 0,4

ab

Ureia (mg/dL) 36,9 ± 3,7b 35,2 ±

3,3

b 43,9 ± 2,6

a 38,2 ±

7,3

b

Creatinina (mg/dL) 0,9 ± 0,1b 1,0 ±

0,2

ab 1,3 ± 0,3

a 1,0 ±

0,2

ab

Ácido úrico (mg/dL) 1,5 ± 0,4b 1,4 ± 0,6

b 2,3 ± 0,8

a 1,6 ± 0,4

b


4.2.6 Resposta pressórica e relação com peroxidação lipídica

Para testar se O2•− contribui ou não para alteração pressórica encontrada no modelo

estudado, avaliaram-se PAS e PAD ao longo do estudo e sua relação com peroxidação lipídica.

A figura 18 mostra resultados semelhantes de valores pressóricos e de FC para os

diferentes grupos antes do início do estudo. Porém, na fase intermediária da pesquisa, foram

encontrados maiores valores de PAS e PAD para os animais do grupo FS20 comparados aos

dos ratos C. Esse aumento pressórico se manteve até o final do estudo para o grupo FS20;

todavia, adição de tempol ao tratamento reduziu significativamente PAS (175,2 ± 26,9 mmHg

em FS20 vs. 146,8 ± 19,3 mmHg em FS20T). Para valores de PAD, ao final do estudo, FS20T

não foi diferente dos animais do grupo FS20, mas apresentou valores semelhantes aos

apresentados pelos grupos C e CT. Para FC não se observou variação com FS bem como, após

adição de tempol, para os grupos C e FS20.

Adicionalmente, foi encontrada uma relação direta, utilizando o coeficiente de

correlação linear de Pearson, entre valores de PAS e PAD final com peroxidação lipídica no

fígado, medida através de TBARS (Figura 19). Quando plotados os dados de resposta

pressórica versus TBARS mostraram uma correlação positiva (r=0,578; p<0.0001 para PAS e

r=0,58; p<0,0001 para PAD), indicando que quanto maior a PAS e PAD, mais elevados são os

valores de TBARS no fígado.

Resultados

59

Figura 18: Comparação das mudanças ao longo dos tratamentos para pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC) dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); CT (dieta controle e água + tempol da 13 a 20ª semana de

tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento).Valores são apresentados em média ± desvio padrão. *p<0,05; **p<0,01 vs C e CT;

#p<0,05 vs grupo FS20.

0 2 4 60

50

100

150

200

250

r = 0,578p < 0,0001

TBARS (nmoles/mL)

PA

S f

inal

(mm

Hg

)

0 5 10 15 20 250

50

100

150

200

r = 0,58p < 0,0001

TBARS (nmoles/mL)

PA

D f

inal

(mm

Hg

)

Figura 19: Correlação de Pearson entre valores de PAS (mmHg), PAD (mmHg) final e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmoles/mL).

Resultados

60

4.2.7 Correlação entre pressão arterial média e parâmetros sanguíneos

Nesse estudo foi realizado análise de correlação entre valores de pressão arterial

média (PAM) aferida ao final do estudo e parâmetros estudados para os grupos

experimentais. Os resultados apresentados mostram que mudanças na PAM foram

associadas positivamente e significativamente a alterações nos níveis de glicose (r=0,411;

p<0,01), de triacilglicerol (r=0,38; p<0,01), de proteína total (r=0,367; p<0,02), de albumina

(r=0,372; p<0,002), de ALT (r =0,431; p<0,006), de ácido úrico (r=0,514; p<0,001), de ureia

(r=0,504; p<0,0008) e de creatinina (r=0,476; p<0,002). As correlações entre PAM e colesterol

total (r=-0,439; p<0,003) e colesterol-HDL (r=-0,401; p<0,009) foram negativas. Essas relações

negativas são achados que apontam para o observado na literatura. Rato transporta TG

predominantemente pelo colesterol-HDL, e, a dislipidemia encontrada no estudo para o

tratamento com FS diminui acentuadamente colesterol total e HDL, enquanto PAM

aumentou correspondentemente. Correlações entre PAM e PON1, AST e ALP não foram

observadas (Tabela 10).

Tabela 10: Correlação entre PAM final (mm/Hg) e parâmetros sanguíneos nos grupos experimentais

Variável r p Glicose (mmol/L) 0,411 0,01 Triacilglicerol (mmol/L) 0,380 0,01 Colesterol total (mmol/L) –0,439 0,003 Colesterol-HDL (mmol/L) –0,401 0,009 PON1 (U/mL) –0,373 0,227 Proteína total (g/dL) 0,367 0,023 Albumina (g/dL) 0,372 0,002 AST (U/L) 0,270 0,086 ALT (U/L) 0,431 0,006 ALP (U/L) 0,245 0,136 Ácido úrico (mg/dL) 0,514 0,001 Ureia (mg/dL) 0,504 0,0008 Creatinina (mg/dL) 0,476 0,002

Pressão arterial média (PAM); Lipoproteína de alta densidade (HDL); Paraoxonase-1 (PON1); Aspartato Aminotransferase (AST); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP).

Discussão

61

5- DISCUSSÃO

Muitos modelos experimentais indicam que o estresse oxidativo está envolvido na

patogênese da hipertensão arterial com aumento na produção de O2•− (DOBRIAN et al., 2001;

ZALBA et al., 2001; KAWADA et al., 2002; MENG et al., 2003; HATTORI et al., 2005;

PATTERSON et al., 2005; KOJSOVÁ et al., 2006; OHASHI et al., 2009). Os resultados

encontrados no presente estudo demonstram que ratos com RI, devido à suplementação

crônica de frutose, aumentam estresse oxidativo e PA quando mantidos sob uma dieta rica

em sal, e tratamento com tempol reverte hipertensão. Assim, embora o mecanismo do efeito

protetor do tempol não tenha sido determinado, os dados sugerem que SOD pode inibir o

desenvolvimento de hipertensão no modelo usado, com efeitos benéficos sobre desordem

metabólica encontrada.

Para melhor compreender o papel de cada elemento envolvido na fisiopatologia da

SM, pesquisadores utilizam modelos experimentais que podem determinar de maneira

controlada o papel da RI e da hipertensão. A insulina tem sido reconhecida por desempenhar

importante papel na ativação do SNS. Esse efeito pode ser mediado por um mecanismo

barorreflexo (ANDERSON et al. 1991) ou através de um efeito direto da insulina sobre a

liberação de noradrenalina a partir de terminações nervosas simpáticas (BHAGAT et al.,

1981). Por outro lado, há evidências de que o aumento da atividade simpática resulte em RI

devido ativação α1-adrenérgica causar redução no fluxo sanguíneo e, então, ocorrer

diminuição no fornecimento de glicose para o músculo esquelético (RATTIGAN et al., 1999). O

resultado é estimulação contínua do SNS devido à hiperinsulinemia compensatória em

resposta a RI. Nesse estudo, alto consumo de frutose dietética contribuiu para o

desenvolvimento e para a progressão da RI nos animais experimentais, ocasionando

hipertrigliceridemia, intolerância à glicose, hiperuricemia e estado pró-inflamatório, tal como

indicado em estudos prévios com ratos (THORBURN et al., 1989; LEE et al., 1994; KELLEY et

al., 2004 e KANNAPPAN et al., 2006). Os mecanismos de desenvolvimento de RI indicam que

o desenvolvimento de resistência à ação da insulina celular subtende o hiperinsulinismo

observado nos ratos do grupo FS, estando esse fator associado a um perfil lipídico

aterogênico.

Estudos realizados por Ouyang et al. (2008) associam a hiperuricemia à esteatose

hepática, com aumento do consumo de frutose, dados consistentes com o fato da elevação

Discussão

62

de ácido úrico ter um papel participativo na esteatose hepática no metabolismo da frutose.

Como a frutose pode acelerar o metabolismo das purinas, o aumento da concentração de

ácido úrico no soro para os animais do grupo F corrobora com o quadro de esteatose

macrovesicular observada nesse grupo, onde NAFLD é a característica mais representativa do

fígado na SM. O excesso de frutose é um componente lipogênico, o qual promove o

desenvolvimento de um perfil aterogênico lipídico. Assim, para refletir sobre as condições

alimentares modernas, o modelo experimental usado baseou-se na administração de uma

dieta indutora de RI com alto teor de frutose que se assemelha ao chamado 'fast food', que é

muito popular hoje em dia. Este tipo de dieta constitui tipicamente em estilo de vida

ocidentalizado, que inclui o consumo de alimentos processados que são ricos tanto em açúcar

quanto em sal. Nesse contexto, frutose tem sido largamente utilizada em estudos

metabólicos, embora não haja dados relativos a anormalidades do fígado associados a

regimes com sobrecarga de sal dietético associado.

A RI parece ser uma síndrome que está relacionada a agrupamento de desordens

metabólicas (DeFRONZO, 1992) sendo o termo lipotoxicidade utilizado para se referir à

condição que envolve a acumulação de TG em tecidos sensíveis à insulina, com

comprometimento de sua ação. Aumento da entrega do TG para os tecidos interfere na

utilização da glicose resultando em hiperglicemia, como mostrado nos resultados obtidos, em

que acumulação de TG nos animais pode ter contribuído para a insensibilidade à insulina

observada. O grau de RI mostrou-se mais elevado em ratos FS, como indicado por um maior

HOMA. Comparado ao índice HOMA, com base em medições de glicose e insulina basal, o

TOTG proporciona uma aproximação razoável da sensibilidade à insulina levando em

consideração tanto a sensibilidade à insulina no estado basal e após a ingestão de uma carga

de glicose. O grau de RI foi maior nos ratos alimentados com frutose e com sal, tal como

demonstrado pelos valores elevados de HOMA, bem como apresentaram menor tolerância à

glicose após o teste de glicose oral em relação ao grupo C. Outro fator encontrado em

animais alimentados com teor elevado de frutose é que estes exibem estresse hepático como

resultado da carga do metabolismo de frutose. Frutose induz dislipidemia, baixo grau de

inflamação hepática e ativação de vias sensíveis ao estresse, com evidência para

lipotoxicidade como demonstrado por Kannapan et al., (2006) e aumento do fígado em

função dos depósitos de gordura (ROSS et al., 2009). Dessa forma, geralmente o fígado pode

ser considerado o local mais comum de agressão tóxica por receber cerca de 80% do

Discussão

63

suprimento sanguíneo, através da veia porta, além de possuir enzimas com capacidade de

biotransformação de várias substâncias endógenas e exógenas para eliminação. Conforme

Fox & Campbell (2000), ALT e AST podem ser consideradas nos exames de bioquímica

sanguínea e sua elevação em conjunto pode indicar lesão hepática significativa. Evidenciou-se

em grupos tratados com frutose, aumento da atividade das ALT e ALP, indicando alteração da

função hepática que reflete dano hepatocelular. A AST ou transaminase glutâmico-

oxalacética (TGO) não é uma enzima específica para o fígado, pois pode originar-se tanto em

músculos como no tecido hepático. Já o citoplasma do hepatócito é rico em ALT, sendo que

um insulto à membrana hepatocelular resulta em aumento da ALT sérica e é, muitas vezes,

considerada um marcador de esteatose (ANGULO, 2002). Ainda em relação à doença

hepática, aumento da atividade da ALP é o resultado de maior síntese dessa enzima pelas

células que revestem os canalículos biliares, geralmente em resposta à colestase. Os maiores

aumentos de ácido graxo estão associados a desordens colestáticas difusas ou focais. Notou-

se, desse modo, com o tratamento empregado, dano hepático e, adicionalmente,

concentrações de albumina foram reduzidas em ratos FS10, provavelmente devido à menor

capacidade de síntese proteica hepática, como observado recentemente por Shinn & Moon,

(2010).

O consumo prolongado de dietas ricas em frutose pode levar ao aumento da ingestão

calórica e à contribuição para o ganho de peso e de gordura corporal com consequente

obesidade. Todavia, ingestão dietética de frutose não resultou em aumento de peso em

animais do estudo, o que possibilitou questionar a relação entre as alterações metabólicas e

o desenvolvimento da hipertensão sem as influências da confusão de obesidade ou

predisposições genéticas no modelo utilizado. Embora a ausência de ganho de peso corporal

foi relatada em vários estudos usando ratos (FAURE et al., 1997; BEZERRA et al., 2001;

D’ANGELO et al., 2005; VASDEV et al., 2007; JALAL et al., 2007; SHAPIRO et al., 2008), há

alguns poucos relatos de ganho de peso em roedores (EL MESALLAMY et al., 2010; KIM et al.,

2010). Consumo de bebidas adoçadas com frutose está ligado ao alto consumo de energia.

Estudos em ratos (SHAPIRO et al., 2008) e humanos (LÊ et al., 2006) mostram que a ingestão

crônica de frutose está correlacionada ao aumento nos níveis de leptina no plasma, e alguns

estudos mostraram que esse aumento precede a obesidade (MOORADIAN et al., 2000;

ROGLANS et al., 2007). O hormônio leptina tem um papel fundamental no equilíbrio

energético e na regulação do peso corporal, ativando núcleos do hipotálamo para reduzir a

Discussão

64

ingestão de alimentos, o que resulta em aumento do gasto de energia (FRIEDMAN & HALAAS,

1998). Tal resposta reduzida ou sua falta aos efeitos metabólicos da leptina é descrita como

resistência à leptina e é característico de seres humanos e roedores obesos (WIDDOWSON et

al., 1997; HEYMSFIELD et al., 1999). Curiosamente, essa resistência à leptina pode ser

sugerida no estudo, na ausência de qualquer variação no aumento de peso corporal, nos

animais sob alimentação rica em frutose (grupo F), comparadamente aos ratos controle. A

presença de resistência à leptina poderia, potencialmente, vir a ser um mecanismo

importante para a indução de obesidade apenas no grupo F, sem associação de sal à dieta.

Resultados demonstraram que ratos do grupo FS10 consumiram mais frutose do que ratos F,

mas apresentaram menor grau de desenvolvimento de peso devido dieta rica em sal, como

em outros estudos, mostrarem atenuação do ganho de peso em ratos (VASDEV et al., 2003;

HASEGAWA et al., 2006; CHO et al., 2007). Adicionalmente, Prada et al. (2000) encontraram

maior ganho de peso e de gordura na carcaça de ratos tratados com baixo teor de sal na dieta

do que conteúdo normal ou alto, do desmame até a fase adulta, com possibilidade de que o

gasto de energia diminui durante a restrição de sal a longo prazo. Isso leva a sugerir que o

contrário, alto consumo de sal, possa ocasionar maior consumo de energia. Apesar do

presente estudo não ter avaliado os mecanismos envolvidos nessa variação encontrada para

o peso, é possível, também, que a diminuição modesta (não significativa) de leptina no grupo

S tenha algum significado nesse menor ganho ponderal ao longo do estudo, uma vez que

leptina circula em níveis proporcionais à gordura corporal e é um sinal aferente chave ligando

nível de adiposidade corporal e estado nutricional.

Por outro lado, a ingestão de bebidas adoçadas com frutose está associada à

diminuição da ingestão de alimentos sólidos e proteína. Jurgens et al. (2005) mostraram que

a ingestão de alimento sólido por ratos alimentados com frutose na água foi diminuída, mas o

consumo de energia total era o mesmo do que dos animais controles. No presente estudo, os

dados são consistentes com essas informações prévias que mostraram que o consumo de

líquido adoçado com frutose está relacionado à diminuição do consumo de ração levando,

talvez, à menor ingestão de alguns nutrientes, dentre estes os aminoácidos sulfurados.

Deficiência de metionina, um aminoácido essencial, tem sido implicada na doença alcoólica

do fígado e cirrose hepática (KIRSCH et al., 2006), secundária ao seu importante papel como

um precursor da GSH. No entanto, o papel potencial da metionina na patogênese da

esteatose hepática não parece ter sido previamente estudada. Estudos usando bebida

Discussão

65

adoçada com frutose e estudos com esteatose usam produtos de peroxidação lipídica como

marcadores de estresse oxidativo e poucas pesquisas têm avaliado os sistemas antioxidantes

enzimáticos. Kunde et al. (2011) demonstraram que a diminuição da ingestão de aminoácidos

sulfurados, como ocorre nos modelos usados para estudar frutose-induzindo esteatose, não é

uma causa de estresse oxidativo hepático no modelo e não fornece uma explicação para a

acumulação de lipídios através do uso da frutose.

Estudos prévios (WU et al., 2000; EBENEZER et al., 2009) relatam que a insulina

plasmática é de 5 a 10 vezes superior em ratos Zucker obesos, um modelo animal que

desenvolve hipertensão moderada. Utilizando telemetria, método que facilita avaliação

precisa da PA por não se confundir ao estresse da medida ou limitar o tempo de amostragem

na aferição (CARLSON et al., 2000), há indicação de que, anormalidades metabólicas

encontradas no presente estudo e em outros são leves em comparação aos efeitos

observados no rato Zucker obeso, uma vez que esse animal apresenta aumento significativo

na PA basal. Logo, é possível que a RI mais grave pode causar hipertensão. Por outro lado,

cães alimentados com uma dieta rica em gordura desenvolvem hipertensão somente à

medida que ganham peso corporal, mas, no modelo de estudo, não houve tal ganho, nem o

peso corporal se correlacionou com PA. Isso sugere que os mecanismos envolvidos no

desenvolvimento da RI e hipertensão na pesquisa apresentada são provavelmente diferentes

dos modelos de obesidade. Na verdade, sabe-se que os indivíduos obesos apresentam

deficiência geral da sensibilidade à insulina provocada por diminuição da densidade de seus

receptores nas membranas celulares dos tecidos alvo, e, apenas uma minoria desses

indivíduos mostram um defeito em pós-receptores específicos para a captação estimulada

por insulina de glicose, semelhante ao defeito encontrado em pacientes com hipertensão

essencial (MARTINEZ et al., 1994).

Em sequência, a RI/hiperinsulinemia em ratos alimentados com frutose prejudica a

função endotelial e pode ou não contribuir para a elevação da PA. Em adição aos seus efeitos

sobre o metabolismo da glicose, a insulina tem mostrado induzir vasodilatação na vasculatura

do músculo esquelético em diabéticos sensíveis à insulina, mas não em indivíduos com RI

(BARON et al., 1993). O NO derivado do endotélio tem sido apontado como o mediador

possível do efeito vasodilatador da insulina no músculo esquelético (STEINBERG et al., 1994).

Sugere-se que esse efeito vascular desempenhe um papel fundamental na diminuição da

disponibilidade da glicose pela ação da insulina (BARON et al., 1993), já que o sistema

Discussão

66

vascular é importante para o fornecimento de nutrientes e de hormônios aos tecidos e,

então, qualquer deterioração na capacidade de resposta vascular poderia contribuir para a RI.

A disfunção vascular devido a uma dieta rica em frutose é observada em rato (TAKAGAWA et

al., 2002) e reconhece-se que a disfunção vascular na SM está associada à aumentada

sensibilidade de vasoconstrição (SHINOZAKI et al., 2004) e de produção de O2•− vascular

(DELBOSC et al., 2005). Além disso, ingestão de frutose crônica em ratos ocasiona deficiente

relaxamento endotélio-dependente (SHINOZAKI et al., 1999; 2000), com evidências de que a

insulina modula a expressão da enzima eNOS e estimula a vasodilatação causada pela

produção de NO (SCHERRER et al., 1994). Porém, em estados de RI, os efeitos sobre eNOS são

abolidos, resultando em deficiente relaxamento endotélio-dependente (KUBOKI et al., 2000).

Assim, é possível que essa ação vascular da insulina possa contribuir para exacerbar o

desenvolvimento de RI observada no estudo.

Embora resistência hormonal desperte grande atenção, tanto na pesquisa clínica,

quanto na básica, em função de sua associação com a doença cardiovascular (DeFRONZO,

1992), os mecanismos que ligam a sensibilidade à insulina à hipertensão arterial e ao

desenvolvimento e à progressão de desordens associadas, ainda não são completamente

conhecidos, apesar dos progressos alcançados. Nenhuma evidência definitiva mostra que a RI

e o hiperinsulinismo causem aumento de PA, embora também não existam dados suficientes

que mostrem que a RI não é uma consequência secundária da hipertensão. Entretanto, a

adição de clonidina (agonista adrenérgico utilizado como antihipertensivo) a água potável,

em ratos alimentados com frutose, impede o desenvolvimento de hipertensão, mas não da

RI, da hiperinsulinemia e da hipertrigliceridemia (HWANG et al., 1987). No presente estudo,

observou-se que uma dieta rica em frutose não produz isoladamente alteração na PAS,

apesar da PA aferida por pletismografia de cauda em vários estudos ser significativamente

maior em ratos tratados com frutose do que em animais controles (STORLIEN et al., 1993;

NAGAI et al., 2002; SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007; 2008).

Uma explicação para a dissociação aparente entre a RI e a PA pode ser aqui relatada

quanto ao grau de disfunção metabólica em ratos F que não foi suficiente para se obter um

efeito sobre a PA. Entretanto, um problema potencial que tem sido demonstrado com os

estudos em ratos relatando hipertensão é que a PA é medida, normalmente com a técnica,

não invasiva, de pletismografia de cauda. Dado que dietas com alto teor de açúcar estimulam

o SNS, uma possível consequência da dieta poderia ser uma leitura hipertensiva,

Discussão

67

especialmente uma vez que as medições são realizadas em condições diferentes daquelas em

que o rato permanece a maior parte do tempo e, assim, ter-se-ia o estresse inerente da

mudança da condição adaptada. Uma possível sugestão para esses resultados,

aparentemente contraditórios, é que a alta ingestão de açúcares simples produz somente um

modesto aumento na atividade do SNS. Esse aumento da atividade simpática não é suficiente

para elevar a PA cronicamente, mas pode aumentar labilidade da PA, eis que qualquer

estresse conduziria a um aumento agudo da FC e da PA (D’ANGELO et al., 2005). Resultados

desse estudo indicam que uma dieta com alto teor de frutose embora eleve modestamente

PA (não significativamente), não causa hipertensão. Assim, a alimentação com dieta rica em

frutose pode prejudicar a disponibilidade de glicose mediada pela insulina e aumentar a

labilidade, mas não parece causar diretamente hipertensão. No entanto, o potencial de

outros fatores tais como a linhagem do rato e o tipo de tratamento para explicar as diferentes

respostas a dietas devem ser exploradas. Dobrian et al. (2003) observaram que sobrecarga de

sal em ratos obesos induzidos por dieta rica em gordura acelera o desenvolvimento, mas, não

aumenta a gravidade da hipertensão.

Paralelamente, Rocchini et al. (1989) relataram que adolescentes obesos que

apresentavam PA elevada eram sensíveis ao sal e hiperinsulinêmicos em relação ao grupo

controle. Contudo, redução no peso desses indivíduos diminuíram concentrações plasmáticas

de insulina e eliminaram sensibilidade ao sal. Embora outros fatores, como aldosterona e

ativação simpática, possam ter influenciado o efeito do consumo do sal sobre pressão

sanguínea nesses indivíduos, esses resultados indicam que mudanças na concentração de

insulina correlacionam significativamente a sensibilidade ao sal. No presente estudo, os

dados sugerem que a resposta da PA à hiperinsulinemia em ratos FS10 pôde ser dependente

da retenção de sódio. A hipótese de que RI e hiperinsulinemia estão ligadas à elevação da PA

é sugerida pelos resultados desse estudo, uma vez que ratos FS10 apresentaram elevação

significativa da PAS similar ao grupo S, mesmo consumindo menos sal; animais do grupo FS10

receberam 10 semanas a menos de tratamento com sobrecarga de sal em relação ao grupo S,

além da frutose associada ao sal ter conduzido a uma menor ingestão de ração e,

consequentemente, menor consumo diário de sal na dieta. Comparadamente, observou-se

que a pressão para o grupo S não foi suficientemente diferente do grupo C na fase

intermediária do estudo (protocolo A), o que indica que apenas 10 semanas de tratamento

Discussão

68

com sal para o grupo FS10 é sugestivo de não aumentar significativamente PAS em relação ao

grupo controle se não houvesse o efeito adicional da frutose.

Pesquisas anteriores sugerem que indivíduos sensíveis ao sal, normotensos e

hipertensos, são hiperinsulinêmicos e apresentam RI em comparação a indivíduos resistentes

ao sal (SHARMA et al., 1993; ZAVARONI et al., 1995; FUENMAYOR et al., 1998) e sensibilidade

ao sal se relaciona a reabsorção tubular de sódio com a insulina estimulando retenção de

sódio como mostrado por Facchini et al. (1999). No presente estudo, a excreção urinária de

sódio pode ter diminuído no grupo FS, sugerido pela maior concentração de sódio sérico de

FS10 do que o encontrado no grupo S. Nesse sentido, pressão natriurese normalmente atua

para estabilizar PA, sendo que anormalidades na hemodinâmica renal ou na reabsorção

tubular podem alterar o ponto de ajuste em que a PA e a excreção de sódio são controladas.

O mecanismo da natriurese tem sido postulado como sendo um componente principal de um

sistema de realimentação para regulação a longo prazo da PA e do volume do fluido corporal.

Sob a maioria das condições, esse mecanismo atua para estabilizar a PA bem como os

volumes dos fluidos corporais (GUYTON et al., 1972). Por exemplo, a formação excessiva de

hormônios antinatriuréticos ou doenças que reduzem a capacidade de excreção renal podem

deslocar a curva de natriurese da pressão a maiores valores pressóricos e tendem a causar

retenção de sódio e aumento do volume de fluido extracelular, se a ingestão permanecer

constante. Acúmulo de líquido continuaria até que a PA aumentasse o suficiente para

restaurar excreção renal ao normal através de natriurese e no estado de equilíbrio, a

excreção renal seria mantida igual ao consumo, mas à custa de hipertensão.

Deve-se reconhecer, no entanto, que outros mecanismos como regulação anormal de

receptores de insulina renais por sal podem ter contribuído para a diminuição natriurética em

FS10, incluindo mudanças no SRA, nos peptídeos natriuréticos atriais (ANP), na produção de

NO e na hemodinâmica intra-renal. Ang II ou aldosterona regulam a reabsorção de sódio e

alto consumo de sal exacerba hipertensão (HALL et al., 1990). Contudo, embora indivíduos

com rins normais possam ser capazes de excretar aumentados conteúdos de sódio sem

alterar PA, é evidente que indivíduos que desenvolvem hipertensão essencial têm um relativo

defeito na sua habilidade para excretarem sódio (GUYTON et al., 1972). Ratos do grupo S

beberam mais liquido para diluir a ingestão de NaCl juntamente com alguma atenuação da

natriurese, resultando em expansão do volume plasmático e aumento da PA. Com isso,

elevação da pressão sanguínea em resposta ao aumento do consumo de sódio na dieta é

Discussão

69

considerada um fator de contribuição importante na patogênese da hipertensão, em

particular em seres humanos ou em animais com predisposição para sensibilidade ao sal,

mas, retenção de sódio pode ter indicado alteração da função renal com capacidade

excretória de sódio renal diminuída, produzindo aumentada reabsorção de sódio tubular para

ratos do grupo FS10. Além do mais, maior filtração glomerular determinada pela sobrecarga

salina poderia ser responsável pelo aumento da massa renal, acompanhando de aumento da

creatinina e ureia sérica como observado no estudo e por Kodama et al. (1997) em ratos

Dahl-SS submetidos à sobrecarga de sal por 19 semanas, indicando injúria renal atribuída ao

sal.

Adicionalmente, uma grande quantidade de estudos experimentais e clínicos tem

enfatizado a função crucial do sódio na regulação da pressão sanguínea e nas implicações de

um balanço anormal no desenvolvimento da hipertensão em modelos experimentais. Por

exemplo, as perturbações que elevam a PA, sem prejudicarem a capacidade de excreção

renal, também tendem a aumentar a excreção de sódio e à de água por meio da natriurese e

diurese reduzindo, assim, o volume de fluido extracelular e retornando para a pressão

sanguínea normal. Hipertensão causada pelo aumento do débito cardíaco ou da resistência

periférica total não pode ser sustentada se natriurese é inalterada porque excreção de sódio

permaneceria acima da ingestão de sódio até que a PA retornasse ao normal. Da mesma

forma, reduções na PA tendem a diminuir a excreção de sódio e a aumentar o volume de

líquido extracelular até que a PA retorne ao normal. Um aspecto importante do presente

sistema de equilíbrio é que existem muitos sistemas neuro-humorais que atuam para

amplificar a sua eficácia. Por exemplo, aumento na pressão sanguínea não só tende a elevar a

excreção renal diretamente através de efeitos hidroeletrolíticos sobre o rim, mas também

inibem a formação de Ang II e aldosterona, o que eleva ainda mais a excreção renal e diminui

o volume do fluido extracelular, promovendo mais rápida recuperação da PA (HALL et al.,

1986).

Diferenças na escolha do modelo animal, níveis de açúcar e de sal utilizados, assim

como desenho experimental tornam difícil a comparação entre os resultados desse estudo

com os outros relatados. Embora concentração elevada de sal dietético (8% de NaCl)

provoque hipertensão em ratos (VASDEV et al., 2003), avaliando associação entre frutose e

sal, Vasdev et al. (2007) sugeriram que tratamento de frutose propicia um ambiente que

permite que sal na dieta comprometa integridade da membrana celular produzindo mudança

Discussão

70

vascular e sustentada hipertensão. Demonstrou-se que altos níveis de sódio intracelular

aumentam o cálcio livre citosólico e contratilidade em células vasculares do músculo liso

(MATLIB, 1991). Consequentemente, altos níveis de cálcio intracelular também podem

aumentar o estresse oxidativo (GORDEEVA et al., 2003) modificando lipídios e proteínas,

componentes das membranas que comprometem a sua integridade (GRIENDLING et al.,

2000). Além do mais, aumento no catabolismo da frutose pode resultar em depleção de

energia nas células, tornando-as mais susceptíveis à peroxidação (GIARDINO et al., 1994).

Aumento da lipoperoxidação hepática em ratos FS pode estar associado à elevação da glicose

na circulação, o que aumenta a produção de radicais livres a partir de auto- oxidação de

glicose e de glicação das proteínas.

Em ratos, ao contrário de seres humanos e coelhos, o TG e o colesterol no plasma são

transportados predominantemente pelo colesterol-HDL (BELTOWSKI et al., 2002). HDL tem

sido atribuído a um independente preditor negativo para o desenvolvimento de eventos

cardiovasculares devido à sua capacidade para promover o efluxo de colesterol celular a

partir de células periféricas e entregá-lo para o fígado para excreção, um processo conhecido

como transporte reverso de colesterol (MERTENS & HOLVOET, 2001). Além disso, HDL

também atrai atenção especial devido ao seu potencial antioxidante. Nesse estudo,

observou-se diminuição acentuada de HDL para o grupo FS20. Somado a isso, PON-1, uma

enzima antioxidante sérica presente no colesterol-HDL que combate a peroxidação lipídica de

LDL, teve sua atividade diminuída. Segundo Rosenblat et al. (2006), PON-1 protege contra

aterosclerose por sua habilidade em reduzir formação de célula espumosa via redução de

estresse oxidativo e estimulação de macrófagos. Pode-se, assim, sugerir que as LDL oxidadas

venham a prejudicar a função endotelial, estimulando a resposta inflamatória de

monócitos/macrófagos, ativando a migração e a proliferação de células do músculo liso

vascular, induzindo uma resposta imune, tal como mostrado pelo aumento do perfil de

monócitos em animais tratados com frutose nesse estudo (Tabela 3). Por conseguinte,

inativação de PON1 em ratos FS pode reduzir a capacidade de HDL para inibir a modificação

de LDL, e também diminui a capacidade de HDL para inibir as interações endoteliais

monocíticas. Ambas as condições parecem ser importantes na resposta inflamatória nas

células das paredes arteriais, como demonstrado pela mudança no perfil de linfócitos em

relação ao grupo C, uma vez que esse é um achado comum durante a resposta inflamatória

sistêmica. Estudos clínicos e em animais sugerem que a baixa contagem de linfócitos tem um

Discussão

71

suposto papel na inflamação crônica (NÚÑEZ et al., 2011). Mostrou-se também que baixa

atividade de PON1 está relacionada no modelo estudado à diminuição dos níveis de HDL

contribuindo para o fato de que PON1 esteja envolvida na preservação da HDL (DORNAS et

al., 2012). Já que PON1 exerce um efeito protetor contra o estresse oxidativo, é possível

encontrar uma associação entre essa enzima e insuficiência hepática. Assim, atividade de

PON1 diminuiu enquanto a peroxidação lipídica aumentou em ratos FS, o que confirma que

essa enzima pode estar envolvida na defesa contra a produção de radicais livres no fígado.

Ratos tratados com frutose exibem estresse oxidativo, disfunção endotelial e

hipertensão (TAKAGAWA et al., 2002; NANDHINI et al., 2005; EL MESALLAMY et al., 2010) e o

tratamento com inibidor de NADPH-oxidase foi mostrado reduzir PA (UNGER & PATIL, 2009).

Peroxidação lipídica hepática significativamente aumentou para o grupo FS, que se

manifestou pelo aumento dos níveis de TBARS, o qual é bem relatado em ratos alimentados

com frutose (LEVI & WERMAN, 1998; BUSSEROLLES et al., 2003b; KELLEY et al., 2004). O

desenvolvimento de estresse oxidativo está relacionado a RI, e notou-se um possível

desequilíbrio entre o estado pró-e antioxidante em animais do estudo. Uma diminuição de

antioxidantes enzimáticos foi mostrada no fígado e no coração de ratos tratados com frutose

e sal, uma vez que a exposição prolongada à condição dietética imposta reduziu a atividade

de enzimas antioxidantes. Inativação de CuZn-SOD por glicação de resíduos de lisina

específicos foi avaliada por ODA et al. (1994) e EROS podem também reduzir a atividade das

enzimas antioxidantes CAT e GPx (DATTA et al., 2000). Essa diminuição é sugestiva de

reduzida capacidade potencial de eliminação de radicais livres em ratos com RI participando,

desse modo, na vulnerabilidade tecidual ao estresse oxidativo.

A diminuição da atividade de GSH-Px ou CAT pode resultar em aumento na produção

de radicais hidroxil (OH•) (GUTTERIDGE, 1994). Os OH• podem danificar as membranas das

células em que a função coordenada de enzimas e receptores que eles contêm é perdida.

Como GSH é o cofator de GSH-Px, é importante notar que concentração de GSH foi diminuída

no fígado dos ratos FS10 em comparação aos outros grupos. Em particular, o tratamento de

frutose e de sal associados diminuíram substancialmente GSH/GSSG. Apesar da importância

biológica da GSH/GSSG ser muito debatida, isso confirma que o tratamento empregado

aumenta estresse oxidativo devido à oxidação de GSH ocorrer durante o processo de redução

do H2O2 (JOHNSON et al., 2012). A queda no nível de glutationa é frequentemente observada

em pacientes com diabetes e agravada quando existem complicações associadas

Discussão

72

(THORNALLEY et al., 1996). Sua redução em ratos FS10 pode ter prejudicado a proteção das

membranas celulares contra os danos por radicais livres, o que também contribui para

diminuição da sensibilidade à insulina. O conteúdo de glutationa reduzida em eritrócitos de

indivíduos diabéticos mostra correlação negativa com o controle metabólico da diabetes,

avaliada pelos níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1) (PAOLISSO & GIARGLIANO, 1996),

sugerindo um papel importante na atividade da insulina. Por outro lado, a glutationa poderia

favorecer a transcrição do receptor da insulina. De fato, o nível GSH das células aumenta a

atividade de alguns fatores de transcrição, tais como Sp1, que está envolvido na transcrição

do receptor de insulina (ARAKI et al., 1991).

Mecanismos regulatórios de feedback de enzimas antioxidantes previnem a sua

restauração para um nível normal, protegendo a célula contra efeitos de EROs. CAT previne

dano pela rápida conversão de H2O2 à água (TOUYZ, 2004). De fato, há possíveis vias pelo qual

metabolismo celular nesse modelo pode ter sido alterado, que por sua vez pode ter acelerado

o estresse oxidativo em ratos do grupo FS; uma vez que o aumento do estresse oxidativo

pode ser devido à geração de EROs e/ou à diminuição da proteção de antioxidantes não

enzimáticos ou enzimáticos (HALLIWELL, 1996). A produção de radicais livres e H2O2

resultantes da atividade de SOD pode ter gerado radicais OH• através de reação de Fenton, e

então EROs pode reduzir a atividade das enzimas antioxidantes (DATTA et al., 2000).

Observou-se redução de CAT em fígado e coração de ratos tratados com frutose e sal e,

portanto, uma diminuição dessa atividade é sugestiva de menor capacidade de eliminação de

EROs. No entanto, no rim observou-se aumento da atividade de SOD, o qual pode ter

ocorrido em resposta ao aumento da geração de O2•−, já que atividade aumentada de

enzimas antioxidantes é relatada como um mecanismo adaptativo para proteger as células

contra a toxicidade dos radicais livres (EREJUWA et al., 2011). Uma vez que SOD converte

O2•− a H2O2, maior atividade da SOD pode levar ao turnover de H2O2, e, em caso de aumento

da geração de H2O2, a CAT pode ser incapaz de eliminar, suficientemente, os níveis elevados

de H2O2. CAT é relatada ser altamente susceptível ao aumento de O2•− (KONO & FRIDOVICH,

1982) e pode, assim, tornar-se inibida. Dessa forma, a ocorrência da atividade dessas enzimas

antioxidantes descoordenadamente nos rins de ratos com RI pode implicar que esses animais

podem não estar protegidos contra o estresse oxidativo.

Vários ensaios têm sido realizados para determinar se o tratamento com

antioxidantes pode ou não reduzir PA, embora os resultados sejam conflitantes (KIM et al.,

Discussão

73

2002; VASDEV et al., 2002; WARD et al., 2007). Como O2•− atua tanto no meio extracelular e

intracelular, onde pode ter efeitos prejudiciais, incluindo peroxidação lipídica, agregação de

proteínas e destruição do DNA (MAXWELL, 1995), investigações prévias com mecanismos que

elevam o potencial de proteção contribuem para a destoxificação do organismo ao eliminar

O2•− e reduzir inflamação e aterosclerose (HENSON & JOHNSTON, 1987). SOD desempenha

um papel fundamental em mecanismos de defesa antioxidante, particularmente em estados

hiperglicêmicos ou de RI. Normalmente, a SOD abundante e outros antioxidantes no corpo

reagem com O2•− mantendo-os a níveis muito baixos. Sempre que a produção de O2•− é

aumentada ou há uma deficiência nos sistemas antioxidantes, a repartição de NO pela O2•−

também aumenta; no rim, reabsorção de sódio elevada contribui para a progressão da

hipertensão em ratos alimentados com sobrecarga de sal. Atividade de SOD foi diminuída no

fígado de ratos FS10 e correlação negativa entre a sua atividade e a glicose no sangue em

ratos tratados com um mimético de SOD deve ser estabelecida. Dessa forma, a administração

de enzimas antioxidantes, como a SOD, pode prevenir ou tratar dano cardiovascular (BAKER

et al., 1985; JOLLY et al., 1999), embora os benefícios potenciais da administração sistêmica

de SOD sejam limitadas, porque essa não pode permear membranas biológicas e é, portanto,

incapaz de remover O2•− produzido intracelularmente. SOD nativa tem limitada

permeabilidade de membrana e provou ser decepcionante na prevenção de efeitos adversos

de O2•− ou na redução da PA. Assim, agentes alternativos com atividade semelhante à SOD

são investigados.

Miméticos da SOD melhoram função vascular em alguns estudos, mas não

significativamente em todos os casos (SCHNACKENBERG et al., 1998; ROBERTS et al., 2009;

ROSÓN et al., 2010). Alguns miméticos da SOD, tais como CuZn-SOD, são dependentes de

metais e podem se tornar ineficazes no meio intracelular devido à dissociação do metal-

ligante. Consequentemente, são preferidos compostos com atividade de SOD que tenham

baixo peso molecular, estabilidade biológica, nenhuma toxicidade e permeabilidade da

membrana para utilização in vivo. Mitchell et al. (1990) demonstraram que tempol tem um

peso molecular baixo, é independente de metal e é permeável à membrana celular. Tempol

não age como um mimético da CAT, não altera concentração de H2O2 e não liga a NO

(SAMUNI et al., 1991), sendo então específico para O2•−. No presente estudo, foi observado

que a administração de tempol pode ter inibido o aumento da geração O2•−, o que pode ter

aumentado a biodisponibilidade do NO, impedindo o desenvolvimento de disfunção

Discussão

74

endotelial. Essas observações podem apoiar a ideia de que a produção de O2•− desempenha

um papel crítico no desenvolvimento da disfunção endotelial, resultando em hipertensão.

Tempol aumenta a biodisponibilidade de NO mantendo a regulação da pressão sanguínea

normal (WILCOX & WELCH, 1999).

Permeável à membrana, tempol demonstra atenuar a hipertensão (WILCOX &

PEARLMAN, 2008). Durante a hipertensão arterial, o efeito vasodilatador endógeno de NO é

prevenido devido à sua interação com EROs, especificamente O2•−, que transforma NO em

peroxinitrito e diminui a sua biodisponibilidade, o que resulta em aumento da resistência

vascular (WILCOX & WELCH, 1999). Portanto, pode-se especular que tempol exerceu seus

efeitos benéficos restaurando os níveis de NO podendo atuar no controle direto do tônus

vascular. Schnackenberg & Wilcox (2001) relataram que tempol restaura prejudicada

dilatação mediada por NO de arteríolas aferentes renais em coelhos diabéticos. Limitação de

disponibilidade de NO pode atenuar o seu efeito sobre o tônus vascular renal e transporte de

Na+ (ORTIZ & GARVIN, 2002). Há evidências de que o NO e O2•− têm ações antagônicas que

controlam o transporte de NaCl na alça de Henle e mácula densa, (ORTIZ & GARVIN, 2002) o

que sugere que O2•− poderia promover vasoconstrição renal através do aumento do feedback

tubuloglomerular, já que há uma interação específica entre O2•− e NO (KOMERS et al., 2000;

REN et al., 2002). Assim, o balanço de NO/O2•−, que é um regulador chave da função

endotelial e níveis de O2•−, sendo elevado em muitas formas de DCV, pode ter se acumulado

no rim (indiretamente observado pelo aumento da atividade de SOD na figura 13) e ter

alterado a regulação normal da função renal, contribuindo para o desenvolvimento da

hipertensão nos animais S e FS (KOPKAN & CERVENKA, 2009).

Resumidamente, níveis aumentados de O2•− pela associação de frutose e sal na dieta

podem aumentar significativamente a PA, tal qual observado nos animais FS20. Nesse estudo,

hipotetizou-se que diminuir níveis de O2•− teria potenciais implicações no modelo estudado,

uma vez que vários estudos mostram que baixos níveis de SOD estão presentes na RI e na

hipertensão em humanos e animais experimentais (BUCZYNSKI et al. 1993; YELINOVA et al.

1999; NANDHINI et al., 2005). De fato, tempol reduziu PA em ratos FS20 em acordo com

observações de outros pesquisadores. PAS e PAD foram aumentadas, significativamente, em

ratos FS20, em comparação com os ratos C, e a principal conclusão é que a hipertensão

causada pelo aparecimento de um provável ineficiente sistema antioxidante funcionando é

bloqueado pela administração crônica de tempol. Os valores pressóricos finais, atenuados

Discussão

75

pelo tratamento com tempol, foram associados à variação glicêmica, ao perfil lipídico

aterogênico e à hiperuricemia. Além disso, o desenvolvimento de RI foi marcado por uma

menor resposta antioxidante por PON1 e administração de tempol, marcadamente, restaurou

sua ação. A figura 20 resume os efeitos da administração dietética crônica da suplementação

de frutose associada à sobrecarga de sal e pelo tratamento com tempol.

Em contraste, apesar de às vezes ser mencionada, a relação entre o estresse oxidativo

e a ação da insulina tem sido negligenciada. À luz dos resultados encontrados, podemos

traçar um paralelo entre capacidade antioxidante e mecanismo de ação sobre a hipertensão

em ratos RI alimentados com frutose sob dieta rica em sal. Alterações observadas na defesa

anti-radicalar por tempol em ratos FS20 podem influenciar a atividade de insulina e melhorar

concentrações sérica de parâmetros lipídicos e de diferentes proteínas. Já em 1997, Faure &

colaboradores demonstravam melhoria na sensibilidade à insulina em ratos alimentados com

alto teor de frutose com o uso de vitamina E, ao passo que, níveis de TBARS

significativamente aumentados no fígado em ratos FS do estudo demonstraram associação

positiva com PAS e PAD. Isso indica uma relação entre estresse oxidativo e aumento de PA,

resultando em hipertensão e anomalidades metabólicas. Adicionalmente, o fígado pode ser o

alvo e o contribuinte para alterações sistêmicas com uma condição resultante de um

aumento descontrolado de radicais livres de oxigênio ou disfunção do sistema antioxidante.

Nesse sentido, os resultados confirmam que RI pode promover danos teciduais com

sobrecarga de sal conduzindo à retenção de sódio, hipertensão e ao maior estresse oxidativo.

A geração e a ação de substâncias oxidantes e antioxidantes dependem do sistema de óxido-

redução, o que demonstra que o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e a

capacidade de o organismo lidar com esses compostos reativos pode prevenir ou não os

efeitos adversos advindos dessas alterações. Tempol e outros eliminadores de O2•− reduzem

significativamente PA em diferentes modelos de hipertensão, como no presente estudo,

impedindo a progressão da elevação da PA. Contudo, estudos adicionais são necessários para

explorarem a participação de EROs nas DCVs, uma vez que inúmeros mecanismos estão

envolvidos com imensa variação em relação aos modelos e protocolos de pesquisas

utilizados.

Discussão

76

Figura 20: Esquema dos efeitos gerais induzidos pelo modelo dietético utilizado e pelo tratamento com tempol em ratos Fischer. Inicialmente, frutose na água é potencialmente disponibilizada pelo consumo

associado de sal e metabolizada aumentando a oxidação de lipídios que é, por si só, um potente produtor de EROs. Frutose conduz à hipertrigliceridemia e à esteatose, resultando em RI, hiperinsulinemia, peroxidação lipídica com aumento do estresse oxidativo estimulado, principalmente pela maior atividade de NADPH-oxidase produzindo O2•−. Dieta rica em sal também aumenta atividade de NADPH-oxidase por Ang II. Hiperinsulinemia ocasiona retenção de sódio potencializando estresse oxidativo quando frutose e sal estão associados na dieta. Consequentemente, há diminuição das defesas antioxidantes, com menor concentração de GSH hepática, diminuição da atividade de SOD e CAT no fígado e no coração e aumento da atividade de SOD no rim. Por outro lado, dieta rica em sal aumenta volume extracelular e eleva PA. Por fim, administração de tempol, um eliminador de O2•−, diminui PA, melhora perfil lipídico e dano hepático, aumenta atividade de PON1 e reduz ácido úrico, ureia associando-se à melhora da resposta pressórica. Angiotensina II (Ang II); Fosfatase alcalina (ALP); Alanina aminotransferase (ALT); Catalase (CAT); Espécies reativas de oxigênio (EROs); Glutationa reduzida/oxidada (GSH/GSSG); Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH); Ânion superóxido (O2•−); Pressão arterial (PA); Paraoxonase 1 (PON1); Resistência à insulina (RI); Superóxido dismutase (SOD); Triacilglicerol (TG).

FÍGADO COM ESTEATOSE

Tempol

Melhora do perfil lipídico e da glicemia, ↑

atividade da PON1, ↓do ácido úrico, da ureia

sérica e da atividade de ALP e ALT

↓PA

↑ingestão de água

Expansão do volume

plasmático com

retenção hídrica

↑PA ↑ O2•−

CORAÇÃO

↓ atividade SOD e

CATALASE

↑SOD

↑reabsorção e

retenção de Na+

↑atividade

NADPH-

oxidase

↑ Ang II

↑Trigliceridemia

RI/Hiperinsulinemia

RIM

Rato macho Fischer

Dieta rica em

sal

Dieta rica em

frutose ↑ consumo de frutose

na água

↑Estresse oxidativo

Βeta-oxidação

Gordura

Peroxidação lipídica

↓GSH, GSH/GSSG,

SOD, CATALASE

Conclusões

77

6- CONCLUSÕES

Em conclusão, esse estudo fornece evidências de que modelo experimental de

hipertensão com ratos tratados com alto teor de frutose associado à sobrecarga de sal na

dieta exibe RI/hiperinsulinemia resultando em retenção de sal. Isso foi consistente com dados

da literatura que discutem o papel chave da insulina na regulação do metabolismo do sódio e

na pressão sanguínea. Coletivamente os dados também indicam aumento do estresse

oxidativo na desordem metabólica encontrada em combinação à elevação da PA, enquanto

tempol administrado cronicamente exerce efeito antihipertensivo, demonstrando, assim,

participação crucial de radicais O2•− na patogênese do estresse oxidativo com alteração dos

valores pressóricos nos animais do estudo. O modelo usado recapitula muitos dos efeitos

bioquímicos e fisiológicos que marcam tendências dietéticas atuais. A implicação é que a

exposição contínua a esses refinados, dietas de baixa qualidade, tem o potencial de resultar

em efeitos adversos para a saúde que podem, em parte, explicar o aumento exponencial dos

fatores de risco para as DCVs. Os resultados também denotam a importância de uma dieta

nutricionalmente equilibrada e confirmam a associação do estresse oxidativo nos vários

fatores envolvidos no desenvolvimento da RI com a presença de hipertensão. Assim, o estudo

oferece um paradigma nutricional em que aspectos estudados podem ser úteis e

cuidadosamente explorados para iniciativas de reduzirem tanto a quantidade de sal quanto

de frutose (provinda de sacarose ou de bebidas adoçadas com HFCS) como atualmente está

sendo vastamente consumida. Uma compreensão mais completa de como essa dieta

empregada afeta os mecanismos que causam insulto cardiovascular pode auxiliar na

prevenção de doenças com novas estratégias terapêuticas para combaterem a progressão

dessas condições.

Referências Bibliográficas

78


Abdelmalek, M.F.; Suzuki, A.; Guy, C.; Unalp-Arida, A.; Colvin, R.; Johnson, R.J.; Diehl, A.M. Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network. Increased fructose consumption is associated with fibrosis severity in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51:1961-71, 2010. Abdulla, M.H.; Sattar, M.A.; Johns, E.J. The relation between fructose-induced metabolic syndrome and altered renal haemodynamic and excretory function in the rat. Int J Nephrol. 2011:934659, 2011. Abe, H.; Yamada, N.; Kamata, K.; Kuwaki, T.; Shimada, M.; Osuga, J.; Shionoiri, F.; Yahagi, N.; Kadowaki, T.; Tamemoto, H.; Ishibashi, S.; Yazaki, Y.; Makuuchi, M. Hypertension, hypertriglyceridemia, and impaired endothelium-dependent vascular relaxation in mice lacking insulin receptor substrate- 1. J Clin Invest. 101:1784-1788, 1998. Abraha, A.; Humphreys, S.M.; Clark, M.L.; Matthews, D.R.; Frayn, K.N. Acute effect of fructose on postprandial lipaemia in diabetic and nondiabetic subjects. Br J Nutr. 80:169-75, 1998. Ackerman, Z.; Oron-Herman, M.; Rosenthal, M.G.T.; Pappo, O.; Link, G.; Sela, B-A. Fructose-induced fatty liver disease: hepatic effects of blood pressure and plasma triglyceride reduction. Hypertension. 45:1012-1018, 2005. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105:121-106, 1984. Akerboom, T.; Sies, H. Assay of glutathione disulfide and glutathione mixed disulfides in biological samples. Meth enzymol. 77:373-382, 1981. AHA. American Heart Association. Shake your salt habit. 2010. Available from http://www.americanheart.org/presenter.jhtml Ambard, L., Beaujard, E. Causes de l’hypertension arterielle. Arch gen Med. 54:486-488, 1904. Ames, B.N.; Cathcart, R.; Schwiers, E.; Hochstein, P. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 78:6858-62, 1981. Anderson, E.A.; Hoffman, R.P.; Balon, T.W.; Sinkey, C.A.; Mark, A.L. Hyperinsulinemia produces both sympathetic neural activation and vasodilatation in normal humans. J Clin Invest. 87:2246-2252, 1991. Angulo, P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med. 346:1221-31, 2002. Anstee, Q.M.; Goldin, R.D. Mouse models in non-alcoholic fatty liver disease and steatohepatitis research. Int J Exp Path. 87:1-16, 2006.


79

Antunes-Rodrigues, J.; de Castro, M.; Elias, L.L.; Valença, M.M.; McCann, S.M. Neuroendocrine control of body fluid metabolism. Physiol Rev. 84:169-208, 2004. Araki, E.; Murakimi, T.; Shirotani, T.; Kanai, F.; Shinohara, Y.; Shimada, F.; Mori, M.; Shichiri, M.; Ebina, Y. A cluster of four Sp1 binding sites required for efficient expression of the human insulin receptor gene. J Biol Chem. 6:3944-3948, 1991. Assy, N.; Nasser, G.; Kamayse, I.; Nseir, W.; Beniashvili, Z.; Djibre, A.; Grosovski, M. Soft drink consumption linked with fatty liver in the absence of traditional risk factors. Can J Gastroenterol. 22:811-6, 2008. Bader, M.; Ganten, D. Update on tissue rennin-angiotens systems. J Mol Med. 86:615-621, 2008. Banday, A.A.; Marwaha, A.; Tallam, L.S.; Lokhandwala, M.F. Tempol reduces oxidative stress, improves insulin sensitivity, decreases renal dopamine D1 receptor hyperphosphorylation, and restores D1 receptor-G-protein coupling and function in obese Zucker rats. Diabetes. 54:2219-2226, 2005. Banday, A.A.; Muhammad, A.B.; Fazili, F.R.; Lokhandwala, M. Mechanisms of oxidative stress–induced increase in salt sensitivity and development of hypertension in Sprague–Dawley Rats. Hypertension. 49:664-671, 2007. Barton, M.; Vos, I.; Shaw, S.; Boer, P.; D'Uscio, L.V.; Gröne, H.J.; Rabelink, T.J.; Lattmann, T.; Moreau, P.; Lüscher, T.F. Dysfunctional renal nitric oxide synthase as a determinant of salt-sensitive hypertension: mechanisms of renal artery endothelial dysfunction and role of endothelin for vascular hypertrophy and glomerulosclerosis. J Am Soc Nephrol. 11:835-846, 2000. Baker, G.L.; Corry, R.J.; Autor, A.P. Oxygen free radical induced damage in kidneys subjected to warm ischemia and reperfusion: protective effect of superoxide dismutase. Ann Surg. 202:628-641, 1985. Babior, B.M. NADPH oxidase: An update Blood. 93:1464-1476, 1999. Barretto, S.A.J.; Cyrillo, D.C. Análise da composição dos gastos com alimentação no Município de São Paulo (Brasil) na década de 1990. Rev Saúde Pública 35:52-9, 2001. Barone, S.; Fussell, S.L.; Singh, A.K.; Lucas, F.; Xu, J.; Kim, C.; Wu, X.; Yu, Y.; Amlal, H.; Seidler, U.; Zuo, J.; Soleimani, M. Slc2a5 (Glut5) is essential for the absorption of fructose in the intestine and generation of fructose-induced hypertension. J Biol Chem. 284:5056-5066, 2009. Bar-On, H.; Stein, Y. Effect of glucose and fructose administration on lipid metabolism in the rat. J Nutr. 94:95-105, 1968. Baron, A.D.; Brechtel-Hook, G.; Johnson, A.; Hardin, D. Skeletal muscle blood flow. A possible link between insulin resistance and blood pressure. Hypertension. 21:129-135, 1993. Basciano, H.; Federico, L.; Adeli, K. Fructose, insulin resistance, and metabolic dyslipidemia. Nutr Metab. (Lond), 2:5, 2005. Baum, M. Insulin stimulates volume absorption in the rabbit proximal convoluted tubule. J Clin Invest. 79:1104-1109, 1987.


80

Beltowski, J.; Wojcicka, G.; Jamroz, A. Differential effect of 3-hydroxy-3- -methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on plasma paraoxonase 1 activity in the rat. Pol J Pharmacol. 54:661-71, 2002. Beltowski, J.; Wójcicka, G.; Jamroz-Wiśniewska, A.; Borkowska, E.; Marciniak, A. Antioxidant treatment normalizes nitric oxide production, renal sodium handling and blood pressure in experimental hyperleptinemia. Life Sci. 26:1855-68, 2005. Bezerra, R.M., Ueno, M., Silva, M.S., Tavares, D.Q., Carvalho, C.R., Saad, M.J., Gontijo, J.A. A high-fructose diet induces insulin resistance but not blood pressure changes in normotensive rats. Braz J Med Biol Res. 34:1155-1160, 2001. Bhagat, B.; Burke, W.J.; Dhalla, N.S. Insulin-induced enhancement of uptake of noradrenaline in atrial strips. Br J Pharmacol. 74:325-332, 1981. Bragulat, E.; de la Sierra, A.; Antonio, M.T; Coca, A. Endothelial dysfunction in salt-sensitive essential hypertension. Hypertension. 37:444-448, 2001. Blakely, S.R.; Hallfrisch, J.; Reiser, S.; Prather, E.S. Long-term effects of moderate fructose feeding on glucose tolerance parameters in rats. J Nutr. 111:307-14, 1981. Brands, M.W.; Hildebrandt, D.A.; Mizelle, H.L.; Hall, J.E. Sustained hyperinsulinemia increases arterial pressure in conscious rats. Am J Physiol. 260:R764-R768, 1991. Brands, M.H.; Hildebrandt, D.A.; Mizelle, H.L.; Hall, J.E. Hypertension during chronic hyperinsulinemia in rats is not salt-sensitive. Hypertension. 19:183-189, 1992. Brands, M.W.; Garrity, C.A.; Holman, M.G.; Keen, H.L.; Alonso-Galicia, M.; Hall, J.E. High-fructose diet does not raise 24-hour mean arterial pressure in rats. Am J Hypertens. 7:104-9, 1994. Bray, G.A.; Nielsen, S.J.; Popkin, B.M. Consumption of high-fructose corn syrup in beverages may play a role in the epidemic of obesity. Am J Clin Nutr. 79: 537-543, 2004. Brunt, E.M.; Janney, C.G.; Di Bisceglie, A.M.; Neuschwander-Tetri, B.A.; Bacon, B.R. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol. 94:2467-2474, 1999. Buczynski, A.; Wachowicz, B.; Kedziora-Kornatowska, K.; Tkaczewski, W.; Kedziora, J. Changes in antioxidant enzymes activities, aggregability and malonyldialdehyde concentration in blood platelets from patients with coronary heart disease. Atherosclerosis. 100:223-228, 1993. Buege, J.A.; Aust, S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 52:302-310, 1978. Busserolles, J.; Rock, E.; Gueux, E.; Mazur, A.; Grolier, P.; Rayssiguier, Y. Short-term consumption of a high-sucrose diet has a pro-oxidant effect in rats. Br J Nutr. 87:337-342, 2002a. Busserolles, J., Zimowska, W., Rock, E., Rayssiguier, Y. & Mazur, A. Rats fed a high sucrose diet have altered heart antioxidant enzyme activity and gene expression. Life Sci. 71:1303-1312, 2002b.


81

Busserolles, J., Gueux, E., Rock, E., Mazur, A., Rayssiguier, Y. High fructose feeding of magnesium deficient rats is associated with increased plasma triglyceride concentration and increased oxidative stress. Magnes Res. 16:7-12, 2003a. Busserolles, J.; Gueux, E.; Rock, E.; Demigné, C.; Mazur, A.; Rayssiguier, Y. Oligofructose protects against the hypertriglyceridemic and pro-oxidative effects of a high fructose diet in rats. J Nutr. 133: 1903-1908, 2003b. Butler, R.; Morris, A.D.; Belch, J.J.; Hill, A.; Struthers, A.D. Allopurinol normalizes endothelial dysfunction in type 2 diabetics with mild hypertension. Hypertension. 35:746-51, 2000. Campese, V.M.; Karubian, F. Salt sensitivity in hypertension: implications for the kidney. J Am Soc Nephrol. 2:S53-61, 1991. Cannon, P.J.; Stason, W.B.; Demartini, F.E.; Sommers, S.C.; Laragh, J.H. Hyperuricemia in primary and renal hypertension. N Engl J Med. 275:457-464, 1966. Catena, C.; Cavarape, A.; Novello, M.; Giacchetti, G.; Sechi, L.A. Insulin receptors and renal sodium handling in hypertensive fructose-fed rats. Kidney Int. 64:2163-2171, 2003. Cai, H. Hydrogen peroxide regulation of endothelial function: origins, mechanisms, and consequences. Cardiovasc Res. 68:26-36, 2005. Cannizzo, B.; Luján, A.; Estrella, N.; Lembo, C.; Cruzado, M.; Castro, C. Insulin resistance promotes early atherosclerosis via increased proinflammatory proteins and oxidative stress in fructose-fed ApoE-KO mice. Exp Diabetes Res. 941304, 2012. Carlson, S.H.; Shelton, J.; White, C.R.; Wyss, J.M. Elevated sympathetic activity contributes to hypertension and salt sensitivity in diabetic obese Zucker rats. Hypertension. 35:403-8, 2000. Castro, G.S.; Cardoso, J.F.; Vannucchi, H.; Zucoloto, S.; Jordão, A.A. Fructose and NAFLD: metabolic implications and models of induction in rats. Acta Cir Bras. 26:45-50, 2011. CDC. National Health and Nutrition Examination Survey Data. Hyattsville, MD: US Department of Health and Human Services, CDC; 2011. Ceriello, A. Possible role of oxidative stress in the pathogenesis of hypertension. Diabetes Care. 31:S181-4, 2008. Cha, S.H.; Wolfgang, M.; Tokutake, Y.; Chohnan, S.; Lane, M.D. Differential effects of central fructose and glucose on hypothalamic malonyl–CoA and food intake. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:16871-5, 2008. Chabrashvili, T.; Tojo, A.; Onozato, M.L.; Kitiyakara, C.; Quinn, M.T.; Fujita, T.; Welch, W.J.; Wilcox,C.S. Expression and cellular localization of classic NADPH oxidase subunits in the spontaneously hypertensive kidney. Hypertension. 39:269-74, 2002. Chabrashvili, T.; Kitiyara, C.; Blau, J.; Karber, A.; Aslam, S.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. Effects of ANG II type 1 and 2 receptors on oxidative stress, renal NADPH oxidase, and SOD expression. Am J Physiol. 285:R117-R124, 2003.


82

Chen, P.Y.; Gladish, R.D.; Sanders, P.W. Vascular smooth muscle nitric oxide synthase anomalies in Dahl/Rapp salt-sensitive rats. Hypertension. 31:918-924, 1998. Chiolero, A.; Würzner, G.; Burnier, M. Renal determinants of the salt sensitivity of blood pressure. Nephrol Dial Transplant. 16:452-8, 2001. Cho, T.M.; Peng, N.; Clark, J.T.; Novak, L.; Roysommuti, S.; Prasain, J.; Wyss, J.M. Genistein attenuates the hypertensive effects of dietary NaCl in hypertensive male rats. Endocrinology. 48:5396-402, 2007. Choi, H.K.; Ford, E.S. Prevalence of the metabolic syndrome in individuals with hyperuricemia. Am J Med. 120:442-447, 2007. Choi, J.W.J.; Ford, E.S.; Gao, X.; Choi, H.K. Sugarsweetened soft drinks, diet soft drinks, and serum uric acid level: the Third National Health and Nutrition Examination Survey. Arthritis Rheum. 59:109-116, 2008. Cook, N.R.; Cutler, J.A.; Obarzanek, E.; Buring, J.E.; Rexrode, K.M.; Kumanyika, S.K.; Appel, L.J.; Whelton, P.K. Long term effects of dietary sodium reduction on cardiovascular disease outcomes: observational follow-up of the trials of hypertension prevention (TOHP). BMJ. 28:885-8, 2007. Cooper, S.A.; Whaley-Connell, A.; Habibi, J.; Wei, Y.; Lastra, G.; Manrique, C.; Stas, S.; Sowers, J.R. Renin-angiotensin-aldosterone system and oxidative stress in cardiovascular insulin resistance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293:H2009-H2023, 2007. Cowley, A.W.Jr.; Mattson, D.L.; Lu, S.; Roman, R.J. The renal medulla and hypertension. Hypertension. 25:663-673, 1995. Crapo, P.A.; Kolterman, O.G. The metabolic effects of 2-week fructose feeding in normal subjects. Am J Clin Nutr. 39:525-534, 1984. Dahl, L.K.; Heine, M. Primary role of renal homografts in setting chronic blood pressure levels in rats. Circ Res. 36:692-693, 1975. Dan, Y.H.; Boini, K.M.; Friedrich, B.; Metzger, M.; Just, L.; Oswald, H.; Wulff, P.; Kuhl, D.; Vallon, V.; Lang, F. Blunted hypertensive effect of combined fructose and high-salt diet in gene targeted mice lacking functional serum- and glucocorticoid-inducible kinase SGK1. Am J Physiol. 290:R935-R944, 2006. D’Angelo, G.; Elmarakby, A.A.; Pollock, D.M.; Stepp, D.W. Fructose feeding increases insulin resistance but not blood pressure in Sprague-Dawley rats. Hypertension. 46:806-811, 2005. Datta, K.; Sinha, S.; Chattopadhyay, P. Reactive oxygen species in health Band diseases. Natl Med J India. 13:304-10, 2000. DeAngelis, K.; Senador, D.D.; Mostarda, C.; Irigoyen, M.C.; Morris, M. Sympathetic overactivity precedes metabolic dysfunction in a fructose model of glucose intolerance in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 302:R950-R957, 2012. De Bold, A.J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 15:767-70, 1985.


83

Dekker, M.J.; Su, Q.; Baker, C.; Rutledge, A.C.; Adeli, K. Fructose: a highly lipogenic nutrient implicated in insulin resistance, hepatic steatosis, and the metabolic syndrome. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299:E685-E694, 2010. Delbosc, S.; Paizanis, E.; Magous, R.; Araiz, C.; Dimo, T.; Cristol, J.P.; Cros, G.; Azay, J. Involvement of oxidative stress and NADPH oxidase activation in the development of cardiovascular complications in a model of insulin resistance, the fructose-fed rat. Atherosclerosis. 179:43-49, 2005. Del Maestro, R.F. An approach to free radicals in medicine and biology. Acta Physiol Scand. 40:153-168, 1980. DeFronzo, R.A.; Cooke, C.R.; Andres, R. The effect of insulin on renal handling of sodium, potassium, calcium, and phosphate in man. J Clin Invest. 55: 845-855, 1975. DeFronzo, R.A. Insulin resistance, hyperinsulinemia, and coronary artery disease: a complex metabolic web. J Cardiovasc Pharmacol. 20:S1-S16, 1992. deRichelieu, T.; Louise, Sorensen, C.M.; Holstein-Rathlou, N-H. Salomonsson, M. NO-independent mechanism mediates tempol-induced renal vasodilation in SHR. Am J Physiol Renal Physiol. 289:F1227-F1234, 2005. Despopoulos, A.; Silbernagl, S. (Eds), 2003. Color Atlas of Physiology, 5th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Dietz, J.R. Mechanisms of atrial natriuretic peptide secretion from the atrium. Cardiovasc Res. 68:8-17, 2005. Dobrian, A.D.; Davies, M.J.; Schriver, S.D.; Lauterio, T.J.; Prewitt, R.L. Oxidative Stress in a Rat Model of Obesity-Induced Hypertension. Hypertension. 37:554-560, 2001. Dobrian, A.D., Schriver, S.D.; Lynch, T.; Prewitt, R.L. Effect of salt on hypertension and oxidative stress in a rat model of diet-induced obesity. Am J Physiol Renal Physiol. 285:F619-F628, 2003. Doehner, W.; Schoene, N.; Rauchhaus, M.; Leyva-Leon, F.; Pavitt, D.V.; Reaveley, D.A.; Schuler, G.; Coats, A.J.; Anker, S.D.; Hambrecht, R. Effects of xanthine oxidase inhibition with allopurinol on endothelial function and peripheral blood flow in hyperuricemic patients with chronic heart failure: results from 2 placebo-controlled studies. Circulation. 105:2619-24, 2002. Dornas, W.C.; de Lima, W.G.; Dos Santos, R.C.; de Souza, M.O.; Silva, M.; Diniz, M.F.; Silva, M.E. Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1 activity. Nutr Metab (Lond). 27:63, 2012. Ebenezer, P.J.; Mariappan, N.; Elks, C.M.; Haque, M.; Francis, J. Diet-induced renal changes in Zucker rats are ameliorated by the superoxide dismutase mimetic tempol. Obesity (Silver Spring). 17:1994-2002, 2009. Elliott, P.; Stamler, J.; Nichols, R.; Dyer, A.R.; Stamler, R.; Kesteloot, H.; Marmot, M. for the Intersalt Cooperative Research Group. Intersalt revisited: further analyses of 24 hour sodium excretion and blood pressure within and across populations. BMJ. 312:1249-53, 1996.


84

Elliott, P., Brown I. Sodium intakes around the world / Background document prepared for the Forum and Technical meeting on reducing salt intake in populations (Paris 5-7th October 2006), 85pág. El Mesallamy, H.O.; El-Demerdash, E.; Hammad, L.N.; El Magdoub, H.M. Effect of taurine supplementation on hyperhomocysteinemia and markers of oxidative stress in high fructose diet induced insulin resistance. Diabetol Metab Syndr. 30:46, 2010. Emmerson, B.T. Effect of oral fructose on urate production. Ann Rheum Dis. 33:276-80, 1974. Erejuwa, O.O.; Sulaiman, S.A.; Wahab, M.S.; Salam, S.K.; Salleh, M.S.; Gurtu, S. Comparison of antioxidant effects of honey, glibenclamide, metformin, and their combinations in the kidneys of streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 12:829-43, 2011. Évora, P.R.B.; dos Reis, C.L.; Ferez, M.A.; Conte, D.A.; Li, L.V.G. Distúrbios do equilíbrio hidroeletrolítico e do equilíbrio acidobásico. Uma revisão prática. Medicina (Ribeirão Preto) 32:451-469, 1999. Facchini, F.S.; do Nascimento, C.; Reaven, G.M.; Yip, J.W.; Ni, X.P.; Humphreys, M.H. Blood pressure, sodium intake, insulin resistance, and urinary nitrate excretion. Hypertension. 33:1008-12, 1999. Farah, V.; Elased, K.M.; Chen, Y.; Key, M.P.; Cunha, T.S.; Irigoyen, M.C.; Morris, M. Nocturnal hypertension in mice consuming a high fructose diet. Auton Neurosci. 130:41-50, 2006. Farquharson, C.A.; Butler, R.; Hill, A.; Belch, J.J.; Struthers, A.D. Allopurinol improves endothelial dysfunction in chronic heart failure. Circulation. 106:221-6, 2002. Faure, P.; Rossini, E.; Lafond, J.L.; Richard, M.J.; Favier, A.; Halimi, S. Vitamin E improves the free radical defense system potential and insulin sensitivity of rats fed high fructose diets. J Nutr. 127:103-107, 1997. Faure, P.; Rossini, E.; Wiernsperger, N.; Richard, M.J.; Favier, A.; Halimi, S. An insulin sensitizer improves the free radical defense system potential and insulin sensitivity in high fructose-fed rats. Diabetes. 48:353-7, 1999. Félétou, M.; Boulanger, M.; Staczek, J.; Broux, O.; Duhault, J. Fructose diet and VEGF-induced plasma extravasation in hamster cheek pouch. Acta Pharmacol Sin. 24:207-211, 2003. Feig, D.I.; Johnson, R.J. Hyperuricemia in childhood primary hypertension. Hypertension. 42:247-52, 2003. Fink, G.D.; Takeshita, A.; Mark, A.L.; Brody, M.L. Determinants of renal vascular resistance in the Dahl strain of genetically hypertensive rat. Hypertension. 2:274-280, 1980. Folch, J.; Lees, M.; Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226:497-509, 1957. Forman, J.P.; Choi, H.; Curhan, G.C. Fructose and vitamin C intake do not influence risk for developing hypertension. J Am Soc Nephrol. 20:863-871, 2009.


85

Forte, J.G.; Miguel, J.M.P.; Miguel, M.J.P.; de Pádua, F.; Rose, G. Salt and blood pressure – a community trial. Journal of Human Hypertension. 3:179-184, 1989. Fox, I.H.; Kelley, W.N. Studies on the mechanism of fructose-induced hyperuricemia in man. Metabolism. 21:713-21, 1972. Fox, S.M.; Campbell, S. Atualização: dois anos (1997-1998) de experiência clínica com rimadyl®. Pfizer Saúde Animal-Boletim Técnico. 1:4-6, 2000. Frederich, R.C.; Hamann, A.; Anderson, S.; Lollmann, B.; Lowell, B.B.; Flier, J.S. Leptin levels reflect body lipid content in mice: evidence for diet-induced resistance to leptin action. Nat Med. 1:1311-1314, 1995. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem. 64:97-112, 1995. Friedman, J.M.; Halaas, J.L. Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature. 395: 763-770, 1998. Fuenmayor, N.; Moreira, E.; Cubeddu, L.X. Salt sensitivity is associated with insulin resistance in essential hypertension. Am J Hypertens. 4:397-402, 1998. Fujiwara, N.; Osanai, T.; Kamada, T.; Katoh, T.; Takahashi, K.; Okumura, K. Study on the relationship between plasma nitrite and nitrate level and salt sensitivity in human hypertension: modulation of nitric oxide synthesis by salt intake. Circulation. 101:856-861, 2000. Galipeau, D.; Verma, S.; Mc-Neill, J.H. Female rats are protected against fructose-induced changes in metabolism and blood pressure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283:H2478-H2484, 2002. Gang, H.; Qiao, Q.; Tuomilehto, J.; Balkau, B.; Borch-Johnsen, K.; Pyorala, K. for the DECODE Study Group. Prevalence of the metabolic syndrome and its relation to all cause and cardiovascular mortality in nondiabetic European men in women. Arch Intern Med. 164:1066-1076, 2004. Gao, X.; Qi, L.; Qiao, N.; Choi, H.K.; Curhan, G.; Tucker, K.L.; Ascherio, A. Intake of added sugar and sugar-sweetened drink and serum uric acid concentration in US men and women. Hypertension. 50:306-12, 2007. Gersch, M.S.; Mu, W.; Cirillo, P.; Reungjui, S.; Zhang, L.; Roncal, C.; Sautin, Y.Y.; Johnson, R.J.; Nakagawa, T. Fructose but not dextrose accelerates the progression of chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 293: F1256-F1261, 2007. Giardino, I.; Edelstein, D.; Brownlee, M. Nonenzymatic glycosylation in vitro and in bovine endothelial cells alters basic fibroblast growth factor activity. A model for intracellular glycosylation in diabetes. J Clin Invest. 94:110-7, 1994. Girman, C.J.; Rhodes, T.; Mercuri, M.; Pyörälä, K.; Kjekshus, J.; Pedersen, T.R.; Beere, P.A.; Gotto, A.M.; Clearfield, M. for the 4S Group and the AFCAPS/TexCAPS Research Group. The metabolic syndrome and risk of major coronary events in the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S) and the Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study (AFCAPS/ TexCAPS). Am J Cardiol. 93:136-141, 2004. Gleiberman, L. Sodium, blood pressure, and ethnicity: what have we learned? Am J Hum Biol. 21:679-686, 2009.


86

Glinsmann, W.H.; Bowman, B.A. The public health significance of dietary fructose. Am J Clin Nutr. 58:820S-3S, 1993. Goldenfarb, P.B.; Bowyer, F.P.; Hall, E.; Brosious, E. Reproducibility in the hematology laboratory: the microhematocrit determination. Am J Clin Pathol. 56:35-9. 1971. Gordeeva, A.V.; Zvyagilskaya, R.A.; Labas, Y.A. Cross-talk between reactive oxygen species and calcium in living cells. Biochemistry (Mosc). 68:1077-80, 2003. Gordon, F.J.; Mark, A.L. Mechanism of impaired baroreflex control in prehypertensive Dahl salt-sensitive rats. Circ Res. 54: 378-387, 1984. Grattagliano, I.; Caraceni, P.; Calamita, G.; Ferri, D.; Gargano, I.; Palasciano, G.; Portincasa, P. Severe liver steatosis correlates with nitrosative and oxidative stress in rats. Eur J Clin Invest. 38:523-30, 2008. Griendling, K.K.; Sorescu, D.; Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circ Res. 17:494-501, 2000. Grundy, S.M.; Brewer, B.J.; Cleeman, J.I.; Smith, S.C.; Lenfant, C. Definition of metabolic syndrome. Report of the National Heart, Lung and Blood Institute/American Heart Association conference on scientific issues related to definition. Circulation. 109:133-138, 2004. Gus, I.; Fischmann, A.; Medina, C. Prevalence of risk factors for coronary artery disease in the Brazilian State of Rio Grande do Sul. Arq Bras Cardiol. 78:478-90, 2002. Gutteridge, J.M.C. Biological origin of free radicals and mechanisms of antioxidant protection. Chem Biol Interact. 91:113-140, 1994. Guyton, A.C.; Coleman, T.G.; Cowley, A.V.; Scheel, K.W.; Manning, R.D. Jr.; Norman, R.A. Jr. Arterial pressure regulation. Overriding dominance of the kidneys in long-term regulation and in hypertension. Am J Med. 52:584-594, 1972. Guyton, A.C. Blood pressure control--special role of the kidneys and body fluids. Science. 28:1813-6, 1991. Hall, J.E.; Mizelle, H.L.; Woods, L.L. The renin-angiotensin system and long-term regulation of arterial pressure. J Hypertens. 4:387-397, 1986. Hall, J.E.; Mizelle, H.L.; Hildebrandt, D.A.; Brands, M.W. Abnormal pressure natriuresis. A cause or a consequence of hypertension? Hypertension. 15:547-559, 1990. Hallfrisch, J.; Ellwood, K.C.; Michaelis, O.E. Effects of dietary fructose on plasma glucose and hormone responses in normal and hyperinsulinemic men. J Nutr. 113:1819-1826, 1983. Hallfrisch, J. Metabolic effects of dietary fructose. FASEB J. 4:2652-2660, 1990. Halliwell, B. Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimization of nutritional antioxidant intake in humans. Free Radic Res. 25:57-74, 1996.


87

Hanover, L.M.; White, J.S. Manufacturing, composition, and applications of fructose. Am J Clin Nutr. 58:724S-732S, 1993. Harrison, D.G. Endothelial function and oxidant stress. Clin Cardiol. 20:II-17, 1997. Hasegawa, H.; Takano, H.; Kohro, T.; Ueda, K.; Niitsuma, Y.; Aburatani, H.; Komuro, I. Amelioration of hypertensive heart failure by amlodipine may occur via antioxidative effects. Hypertens Res. 29:719-729, 2006. Hattori, Y.; Akimoto, K.; Gross, S.S.; Hattori, S.; Kasai, K. Angiotensin-II-induced oxidative stress elicits hypoadiponectinaemia in rats. Diabetologia. 48:1066-1074, 2005. Havel, P.J. Dietary fructose: implications for dysregulation of energy homeostasis and lipid/carbohydrate metabolism. Nutr Rev. 63:133-57, 2005. He, F.; MacGregor, G. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. A meta-analysis. Implication for public health. J Hypertension. 18:S126-S126, 2000. Henson, P.E.; Johnston, R.B. Tissue injury in inflammation: oxidants, proteinases, and cationic proteins. J Clin Invest. 79:669-674, 1987. Heinig, M.; Johnson, R.J. Role of uric acid in hypertension, renal disease, and metabolic syndrome. Cleve Clin J Med. 73:1059-1064, 2006. Heymsfield, S.B.; Greenberg, A.S.; Fujioka, K.; Dixon, R.M.; Kushner, R.; Hunt, T.; Lubina, J.A.; Patane, J.; Self, B.; Hunt, P.; McCamish, M. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA 282:1568-1575, 1999. Horita, S.; Seki, G.; Yamada, H.; Suzuki, M.; Koike, K.; Fujita, T. Insulin resistance, obesity, hypertension, and renal sodium transport. Int J Hypertens. 391762, 2011. Horton, T.J.; Gayles, E.C.; Prach, P.A.; Koppenhafer, T.A.; Pagliassotti, M.J. Female rats do not develop sucrose-induced insulin resistance. Am J Physiol. 272:R1571-R1576, 1997. Hwang, I.S.; Ho, H.; Hoffman, B.B.; Reaven, G.M. Fructose-induced insulin resistance and hypertension in rats. Hypertension. 10:512-6, 1987. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009: aquisição alimentar domiciliar per capita – Brasil e grandes regiões. Rio de Janeiro: IBGE; 2010. Ishibashi, S. The vascular renin-angiotensin system as a possible source of vascular inflammation in fructose-fed rats. Hypertens Res. 30:375-376, 2007. Jalal, R.; Bagheri, S.M.; Moghimi, A.; Rasuli, M.B. Hypoglycemic effect of aqueous shallot and garlic extracts in rats with fructose-induced insulin resistance. J Clin Biochem Nutr. 41:218-223, 2007. Jalal, D.I.; Smits, G.; Johnson, R.J.; Chonchol, M. Increased fructose associates with elevated blood pressure. J Am Soc Nephrol. 21:1543-1549, 2010. Jeppesen, J.; Chen, Y.I.; Zhou, M.Y.; Schaaf, P.; Coulston, A.; Reaven, G.M. Postprandial triglyceride and retinyl ester responses to oral fat: effects of fructose. Am J Clin Nutr. 61:787-91, 1995.


88

Jolly, S.R.; Kane, W.J.; Bailie, M.B.; Abrams, G.D.; Lucchesi, B.R. Cammine myocardial reperfusion injury: its reduction by the combined administration of superoxide dismutase and catalase. Circ Res. 54:277-285, 1999. Jones, D.P.; Park, Y.; Gletsu-Miller, N.; Liang, Y.; Yu, T.; Accardi, C.J.; Ziegler, T.R. Dietary sulfur amino acid effects on fasting plasma cysteine/cystine redox potential in humans. Nutrition. 27:199-205, 2011. Johnson, R.J.; Segal, M.S.; Sautin, Y.; Nakagawa, T.; Feig, D.I.; Kang, D.H.; Gersch, M.S.; Benner, S.; Sánchez-Lozada, L.G. Potential role of sugar (fructose) in the epidemic of hypertension, obesity and the metabolic syndrome, diabetes, kidney disease, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr. 86:899-906, 2007. Johnson, W.M.; Wilson-Delfosse, A.L.; Mieyal, J.J. Dysregulation of glutathione homeostasis in neurodegenerative diseases. Nutrients. 9:1399-440, 2012. Jürgens, H.; Haass, W.; Castañeda, T.R.; Schürmann, A.; Koebnick, C.; Dombrowski, F.; Otto, B.; Nawrocki, A.R.; Scherer, P.E.; Spranger, J.; Ristow, M.; Joost, H.G.; Havel, P.J.; Tschöp, M.H. Consuming fructose-sweetened beverage increases body adiposity in mice. Obes. Res. 13:1146-1156, 2005. Kannel, W.B.; Wilson, P.W. Comparison of risk profiles for cardiovascular events: implications for prevention. Adv Intern Med. 42:39-66, 1997. Kang, D.H.; Park, S.K.; Lee, I.K.; Johnson, R.J. Uric acid-induced C-reactive protein expression: implication on cell proliferation and nitric oxide production of human vascular cells. J Am Soc Nephrol. 16:3553-62, 2005. Kannappan, S.; Jayaraman, T.; Rajasekar, P.; Ravichandran, M.K.; Anuradha, C. V. Cinnamon bark extract improves glucose metabolism and lipid profile in the fructose-fed rat. Singapore Med J. 47:858-63, 2006. Kanuri, G.; Spruss, A.; Wagnerberger, S.; Bischoff, S.C.; Bergheim, I. Fructose-induced steatosis in mice: role of plasminogen activator inhibitor-1, microsomal triglyceride transfer protein and NKT cells. Lab Invest. 91:885-95,2011. Kaplan, J.H. Biochemistry of Na-K-ATPase. Annu Rev Biochem. 71:511-35, 2002. Katori, M.; Majima, M. A missing link between a high salt intake and blood pressure increase. J Pharmacol Sci. 100:370-90, 2006. Kaufmann, E.E.; Owoaje, S.A.; James, S.A.; Rotini, C.N.; Cooper, R.S. Determinants of hypertension in West Africa: contribution of anthropometric and dietary factors to urban-rural and socioeconomic gradients. Am J Epidemiol. 143:1203-18, 1996. Kawada, N.; Imai, E.; Karber, A.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. A mouse model of angiotensin II slow pressor response role of oxidative stress. J Am Soc Neprol. 13:2860-2868, 2002.


89

Kawasaki, T.; Igarashi, K.; Koeda, T.; Sugimoto, K.; Nakagawa, K.; Hayashi, S.; Yamaji, R.; Inui, H.; Fukusato, T.; Yamanouchi, T. Rats fed fructose-enriched diets have characteristics of Nonalcoholic Hepatic Steatosis. J Nutr. 139:2067-71, 2009. Kelley, G.L.; Allan, G.; Azhar, S. High dietary fructose induces a hepatic stress response resulting in cholesterol and lipid dysregulation. Endocrinology. 145:548-55, 2004. Kempner, W. Treatment of hypertensive vascular disease with rice diet. Am J Med. 4: 545-77, 1948. Khosla, U.M.; Zharikov, S.; Finch, J.L.; Nakagawa, T.; Roncal, C.; Mu, W.; U, Krotova, K.; Block, E.R.; Prabhakar, S.; Johnson, R.J. Hyperuricemia induces endothelial dysfunction. Kidney Int. 67:1739-42, 2005. Kim, M.K.; Sasaki, S.; Sasazuki, S.; Okubo, S.; Hayashi, M.; Tsugane, S. Lack of long-Term effect of vitamin C supplementation on blood pressure. Hypertension. 40, 797-803, 2002. Kim, H.Y.; Okubo, T.; Juneja, L.R.; Yokozawa T. The protective role of amla (Emblica officinalis Gaertn.) against fructose-induced metabolic syndrome in a rat model. Br J Nutr. 103:502-512, 2010. Kirsch, R.; Clarkson, V.; Verdonk, R.C.; Marais, A.D.; Shephard, E.G.; Ryfeel, B.; Hall, P.deL.M. Rodent nutritional model of steatohepatitis: Effects of endotoxin (lipopolysaccharide) and tumor necrosis factor alpha deficiency. J Gastroenterol Hepatol. 21:174-182, 2006. Kitiyakara, C.; Chabrashvili, T.; Chen, Y.; Blau, J.; Karber, A.; Aslam, S.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. Salt intake, oxidative stress, and renal expression of NADPH oxidase and superoxide dismutase. J Am Soc Nephrol. 14:2775-2782, 2003. Kobayashi, R.; Nagano, M.; Nakamura F.; Higaki, J.; Yoshihiko Fujioka, Y.; Ikegami, H.; Mikami, H.; Kawaguchi, N.; Onishi, S.; Toshio Ogihara, T. Role of angiotensin II in high fructose-induced left ventricular hypertrophy in rats. Hypertension. 21:1051-1055, 1993. Kodama, K.; Adachi, H.; Sonoda, J. Beneficial effects of long-term enalapril treatment and low-salt intake on survival rate of dahl salt-sensitive rats with established hypertension. J Pharmacol Exp Ther. 283:625-9, 1997. Kojsová, S.; Jendeková, L.; Zicha, J.; Kunes, J.; Andriantsitohaina, R.; Pechánová, O. The effect of different antioxidants on nitric oxide production in hypertensive rats. Physiol Res. 55:S3-S16, 2006. Komers, R.; Lindsley, J.N.; Oyama, T.T.; Allison, K.M.; Anderson, S. Role of neuronal nitric oxide synthase (NOS1) in the pathogenesis of renal hemodynamic changes in diabetes. Am J Physiol Renal Physiol. 279:F573-F583, 2000. Kone, B.C.; Baylis, C. Biosynthesis and homeostatic roles of nitric oxide in the normal kidney. Am J Physiol. 272: F561-F578, 1997. Kono, Y.; Fridovich, I. Superoxide radical inhibits catalase. J. Biol. Chem. 257:5751-5754, 1982. Kopkan, L.; Majid, D.S. Superoxide contributes to development of salt sensitivity and hypertension induced by nitric oxide deficiency. Hypertension. 46:1026-31, 2005.


90

Kopkan, L.; Cervenka, L. Renal interactions of renin-angiotensin system, nitric oxide and superoxide anion: implications in the pathophysiology of salt-sensitivity and hypertension. Physiol Res. 58:S55-67, 2009. Kotchen, T.A.; Kotchen, J.M. Dietary sodium and blood pressure: interactions with other nutrients. Am J Clin Nutr. 65:708S-11S, 1997. Kotchen, T.A.; Reddy, S.; Zhang, H.Y. Increasing insulin sensitivity lowers blood pressure in the fructose-fed rat. Am J Hypertens. 10:1020-6, 1997. Kuboki, K.; Jiang, Z.Y.; Takahara, N.; Ha, S.W.; Igarashi, M.; Yamauchi, T.; Feener, E.P.; Herbert, T.P.; Rhodes, C.J.; King, G.L. Regulation of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene expression in endothelial cells and in vivo: a specific vascular action of insulin. Circulation. 101:676-681, 2000. Kunde, S.K.; Roede, J.R.; Vos, M.B.; Orr, M.L.; Go, Y-M.; Park, Y.; Ziegler, T.R.; Jones, D.P. Hepatic oxidative stress in fructose-induced fatty liver is not caused by sulfur amino acid insufficiency. Nutrients. 3:987-1002, 2011. Lakka, H.M.; Laaksonen, D.E.; Lakka, T.A.; Niskanem, L.K.; Kumpusalo, E.; Tuomilehto, J.; Salonen, J.T. The metabolic syndrome and total and cardiovascular disease mortality in middle-aged men. JAMA. 288:2709-2716, 2002. Laursen, J.B.; Rajagopalan, B.; Galis, Z.; Tarpey, M.; Freeman, B.A.; Harrison, D.G. Role of superoxide in angiotensin II-induced but not catecholamine-induced hypertension. Circulation. 95:58893, 1997. Law, M.R.; Frost, C.D.; Wald, N.J. By how much does dietary salt reduction lower blood pressure? III--Analysis of data from trials of salt reduction. BMJ. 6:819-24, 1991. Lê, K.A.; Faeh, D.; Stettler, R.; Ith, M.; Kreis. R; Vermathen, P.; Boesch, C.; Ravussin, E.; Tappy, L. A 4-wk high-fructose diet alters lipid metabolism without affecting insulin sensitivity or ectopic lipids in healthy humans. Am J Clin Nutr. 84:1374-1379, 2006. Lê, K.A.; Ith, M.; Kreis, R.; Faeh, D.; Bortolotti, M.; Tran, C.; Boesch, C.; Tappy, L. Fructose overconsumption causes dyslipidemia and ectopic lipid deposition in healthy subjects with and without a family history of type 2 diabetes. Am J Clin Nutr. 89:1760-5, 2009. Lee, M.K.; Miles, P.D.; Khoursheed, M.; Gao, K.M.; Moossa, A.R.; Olefsky, J.M. Metabolic effects of troglitazone on fructose-induced insulin resistance in the rat. Diabetes. 43:1435-1439, 1994. Lee, Y.; Yu, X.; Gonzales, F.; Mangelsdorf, D.J.; Wang, M.Y.; Richardson, C.; Witters, L.A.; Unger, R.H. PPAR alpha is necessary for the lipopenic action of hyperleptinemia on white adipose and liver tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 99:11848-11853, 2002. Lenda, D.M.; Sauls, B.A.; Boegehold, M.A. Reactive oxygen species may contribute to reduced endothelium-dependent dilation in rats fed high salt. Am J Physiol. 279:H7-H14, 2000. Levi, B.; Werman, M.J. Long-term fructose consumption accelerates glycation and several age-related variables in male rats. J Nutr. 128:1442-1449, 1998.


91

Li, Y.; Xu, C.; Yu, C.; Xu, L.; Miao, M. Association of serum uric acid level with non-alcoholic fatty liver disease: a cross-sectional study. J Hepatol. 50:1029-1034, 2009. Liu, I.M.; Tzeng, T.F.; Liou, S.S. A chinese herbal decoction, Dang Gui Bu Xue Tang, prepared from Radix Astragali and Radix Angelicae sinensis, ameliorates insulin resistance induced by a high-fructose diet in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011:248231, 2011. MacDonald, I.; Keyser, A.; Pacy, D. Some effects, in man, of varying the load of glucose, sucrose, fructose, or sorbitol on various metabolites in blood. Am J Clin Nutr. 31:1305-11, 1978. Mascioli, S.; Grimm, R. Jr.; Launer, C.; Svendsen, K.; Flack, J.; Gonzalez, N.; Elmer, P.; Neaton, J. Sodium chloride raises blood pressure in normotensive subjects. The study of sodium and blood pressure. Hypertension. 17:I21-6, 1991. Majid, D.S.A.; Said, K.E.; Omoro, S.A.; Navar, L.G. Nitric oxide dependency of arterial pressure-induced changes in renal interstitial hydrostatic pressure in dogs. Circ Res. 88:347-351, 2001. Makino, A.; Skelton, M.M.; Zou, A.P.; Roman, R.J.; Cowley, A.W.Jr. Increased renal medullary oxidative stress produces hypertension. Hypertension. 39:667-672, 2002. Malta, D.C.; Moura, L.; Souza, F.M.; Rocha, F.M.; Fernandes, F.M. Doencas crônicas não transmissíveis: mortalidade e fatores de risco no Brasil, 1990 a 2006. In: Saúde Brasil 2008 Ministério da Saúde, Brasília. 337-62, 2009. Manning, R.D.Jr.; Meng, S.; Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179:243-250, 2003. Marchesini, G.; Babini, M. Nonalcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome. Minerva Cardioangiol. 54:229-239, 2006. Marklund, S.; Marklund, G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 47:469-474, 1974. Martinez, F.J.; Rizza, R.A.; Romero, J.C. High-fructose feeding elicits insulin resistance, hyperinsulinism, and hypertension in normal mongrel dogs. Hypertension. 23:456-4, 1994. Masuo, K.; Kawaguchi, H.; Mikami, H.; Ogihara, T.; Tuck, M.L. Serum uric acid and plasma norepinephrine concentrations predict subsequent weight gain and blood pressure elevation. Hypertension. 42:474-80, 2003. Matlib, M.A. Role of sarcolemmal membrane sodium-calcium exchange in vascular smooth muscle tension. Ann N Y Acad Sci. 639:531-42, 1991. Matthews, D.R.; Hosker, J.P.; Rudenski, A.S.; Naylor, B.A.; Treacher, D.F.; Turner, R.C. Homeostasis model assessment: insulin resistance and β-cells function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia. 28:412-419, 1985. Mayes, P.A. Intermediary metabolism of fructose. Am J Clin Nutr. 58:754S-765S, 1993. Maxwell, S.R.J. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs. 49:345-361, 1995.


92

Mazzali, M.; Kanellis, J.; Han, L.; Feng, L.; Xia, Y-Y.; Chen, Q.; Kang, D-H.; Gordon, K.L.; Watanabe, S.; Nakagawa, T.; Lan, H.Y.; Johnson, R.J. Hyperuricemia induces a primary renal arteriolopathy in rats by a blood pressure- independent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol. 282:F991-7, 2002. McManus, M.L.; Churchwell, K.B.; Strange, K. Regulation of cell volume in health and disease. N Engl J Med 333:1260-1267, 1995. Mellen, P.B.; Bleyer, A.J.; Erlinger, T.P.; Evans, G.W.; Nieto, F.J.; Wagenknecht, L.E.; Wofford, M.R.; Herrington, D.M. Serum uric acid predicts incident hypertension in a biethnic cohort: the atherosclerosis risk in communities study. Hypertension. 48:1037-42, 2006. Meng, S.; Cason, G.W.; Gannon, A.W.; Racusen, L.C.; Davis Manning Jr, R.D. Oxidative stress in Dahl salt-sensitive hypertension. Hypertension. 41:1346-1352, 2003. Mertens, A.; Holvoet, P. Oxidized LDL and HDL: antagonists in atherogenesis. FASEB J. 15:2073-2084, 2001. Miller, C.C.; Martin, R.J.; Whitney, M.L.; Edwards, G.L. Intracerebroventricular injection of fructose stimulates feeding in rats. Nutr Neurosci. 5:359-362, 2002. Miller, A., Adeli, K. Dietary fructose and the metabolic syndrome. Current Opinion in Gastroenterology. 24:204-209, 2008. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Indicadores de mortalidade. Brasil: Ministério da Saúde; 2009. Mitchell, J.B.; Samuni, A.; Krishna, M.C.; DeGraff, W.G.; Ahn, M.S.; Samuni, U.; Russo, A. Biologically active metal-independent superoxide dismutase mimics. Biochemistry. 29:2802-2807, 1990. Mohan, S.; Campbell, N.R.C. Salt and high blood pressure. Clin Sci. 117:1-11, 2009. Monteiro, C.A.; Mondini, I.; Costa, R.B.L. Mudanças na composição e adequação nutricional da dieta familiar nas áreas metropolitanas do Brasil (1988-1996). Rev Saúde Pública. 34: 251-8, 2000. Mooradian, A.D.; Chehade, J.; Hurd, R.; Haas, M.J. Monosaccharide enriched diets cause hyperleptinemia without hypophagia. Nutrition. 16:439-441, 2000. Motoyama, C.S.M.; Pinto, M.J.S.; Lira, F.S.; Ribeiro, E.B.; do Nascimento, C.M.O.; Oyama, L.M. Gum Guar fiber associated with fructose reduces serum triacylglycerol but did not improve the glucose tolerance in rats. Diabetol Metab Syndr. 2:61, 2010. Mueller, W.M.; Gregoire, F.M.; Stanhope, K.L.; Mobbs, C.V.; Mizuno, T.M.; Warden, C.H.; Stern, J.S.; Havel, P.J. Evidence that glucose metabolism regulates leptin secretion from cultured rat adipocytes. Endocrinology. 139:551-558, 1998. Mulè, G.; Nardi, E.; Cottone, S.; Cusimano, P. Influence of metabolic syndrome on hypertension-related target organ damage. J Intern Med. 257:503-513, 2005.


93

Nagai, Y.; Nishio, Y.; Nakamura, T.; Maegawa, H.; Kikkawa, R.; Kashiwagi, A. Amelioration of high fructose-induced metabolic derangements by activation of PPARα. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282:E1180-E1190, 2002. Nakagawa, T.; Hu, H.; Zharikov, S.; Tuttle, K.R.; Short, R.A.; Glushakova, O.; Ouyang, X.; Feig, D.I.; Block, E.R.; Herrera-Acosta, J.; Patel, J.M.; Johnson, R.J. A causal role for uric acid in fructose-induced metabolic syndrome. Am J Physiol. 290:F625-F631, 2006. Nakanishi, N.; Okamoto, M.; Yoshida, H.; Matsuo, Y.; Suzuki, K.; Tatara, K. Serum uric acid and risk for development of hypertension and impaired fasting glucose or type II diabetes in Japanese male office workers. Eur J Epidemiol. 18:523-30, 2003. Nandhini, A.T.A.; Thirunavukkarasu, V.; Ravichandran, M.K.; Anuradha, C.V. Effect of taurine on biomarkers of oxidative stress in tissues of fructose-fed insulin-resistant rats. Singapore Med J. 46:82-87, 2005. Nguyen, S.; Choi, H.K.; Lustig, R.H.; Hsu, C-Y. Sugar sweetened beverages, serum uric acid, and blood pressure in adolescents. J Pediatr. 154:807-813, 2009. Nieto, F.J.; Iribarren, C.; Gross, M.D.; Comstock, G.W.; Cutler, R.G. Uric acid and serum antioxidant capacity: a reaction to atherosclerosis? Atherosclerosis. 148:131-9, 2000. Nishimoto, Y.; Tomida, T.; Matsui, H.; Ito, T.; Okumura, K. Decrease in renal medullary endothelial nitric oxide synthase of fructose-fed, salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension. 40:190-194, 2002. Nkabyo, Y.S.; Gu, L.H.; Jones, D.P.; Ziegler, T.R. Thiol/disulfide redox status is oxidized in plasma and small intestinal and colonic mucosa of rats with inadequate sulfur amino acid intake. J Nutr. 136:1242-1248, 2006. Núñez, J.; Miñana, G.; Bodí, V.; Núñez, E.; Sanchis, J.; Husser, O.; Liàcer, A. Low lymphocyte count and cardiovascular diseases. Curr Med Chem. 18:3226–3233, 2011. Oda, A.; Bannai, C.; Yamoka, T.; Katori, T.; Matsushima, T.; Yamashita, K. Inactivation of Cu-Zn. SOD by in vitro glycosylation in erythrocytes of diabetic patients. Horm Metab Res. 26:1-4, 1994. Ogihara, T.; Asano, T.; Ando, K.; Sakoda, H.; Anai, M.; Shojima, N.; Ono, H.; Onishi, Y.; Fujishiro, M.; Abe, M.; Fukushima, Y.; Kikuchi, M.; Fujita, T. High-salt diet enhances insulin signaling and induces insulin resistance in Dahl salt-sensitive rats. Hypertension. 40:83-9, 2002. Ohashi, N.; Katsurada, A.; Miyata, K.; Satou, R.; Saito, T.; Urushihara, M.; Kobori, H. Role of activated intrarenal reactive oxygen species and rennin-angiotensin system in IgA nephropathy model mice. Clin Exp Pharmacol Physiol. 36:750-755, 2009. Oigman, W. O papel do sistema renina-angiotensina aldosterona no desenvolvimento da hipertensão arterial associada à obesidade. Rev Bras Hipertens. 2:142-8, 2000. Ortiz, P.A.; Garvin, J.L. Interaction of O(2)(-) and NO in the thick ascending limb. Hypertension. 39:591-596, 2002.


94

Osei, K.; Bossetti, B. Dietary fructose as a natural sweetener in poorly controlled type 2 diabetes: a 12-month crossover study of effects on glucose, lipoprotein and apolipoprotein metabolism. Diabet Med. 6:506-11, 1989. Ouyang, X.; Cirillo, P.; Sautin, Y.; McCall, S.; Bruchette, J.L.; Diehl, A.M.; Johnson, R.J.; Abdelmalek, M.F. Fructose consumption as a risk factor for non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 48:993-999, 2008. Pacher, P.; Beckman, J.S.; Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87:315-424, 2007. Pagliassotti, M.J.; Prach, P.A.; Koppenhafer, T.A.; Pan, D.A. Changes in insulin action. Triglycerides, and lipid composition during sucrose feeding in rats. Am J Physiol. 271:R1319-1326, 1996. Paolisso, G.; Giagliano, D. Oxidative stress and insulin action. Is there a relationship? Diabetologia. 39:357-363, 1996 Paravicini, T.M.; Touyz, R.M. Redox signaling in hypertension. Cardiovasc Res. 71:247-58, 2006. Park, Y.K.; Yetley, E.A. Intakes of food sources of fructose in the United States. Am J Clin Nutr. 58:737S-747, 1993. Patterson, M.E.; Mouton, C.R.; Mullins, J.J.; Mitchell, K.D. Interactive effects of superoxide anion and nitric oxide on blood pressure and renal hemodynamics in transgenic rats with inducible malignant hypertension. Am J Physiol Renal Physiol. 289:F754-F759, 2005. Pires, P.W.; Deutsch, C.; McClain, J.L.; Rogers, C.T.; Dorrance, A.M. Tempol, a superoxide dismutase mimetic, prevents cerebral vessel remodeling in hypertensive rats. Microvasc Res. 80:445-52, 2010. Pontis, H.G.; Fischer, C.L. Synthesis of D-fructopyranose 2-phosphate and D-fructofuranose 2-fhosphate. Biochem J. 89:452-9, 1963. Prada, P.; Okamoto, M.M.; Furukawa, L.N.; Machado, U.F.; Heimann, J.C.; Dolnikoff, M.S. High- or low-salt diet from weaning to adulthood: effect on insulin sensitivity in Wistar rats. Hypertension. 35:424-9, 2000. Preiss, D.; Sattar, N. Non-alcoholic fatty liver disease: an overview of prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment considerations. Clin Sci. 115:141-150, 2008. Preti, S.C.; da Cunha, V.; Vassallo, D.V.; Stefanon, I. The superoxide dismutase mimetic, tempol, reduces the bioavailability of nitric oxide and does not alter L-NAME-induced hypertension in rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 97:29-34, 2005. Rajagopalan, S.; Kurz, S.; Munzel, T.; Tarpey, M.; Freeman, B.A.; Griendling, K.K.; Harrison, D.G. Angiotensin II-mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NADPH oxidase activation. Contribution to alterations of vasomotor tone. J Clin Invest. 97:1916-1923, 1996. Rao, G.N.; Corson, M.A.; Berk, B.C. Uric acid stimulates vascular smooth muscle cell proliferation by increasing platelet-derived growth factor A-chain expression. J Biol Chem. 266:8604-8, 1991.


95

Rapp, J.P.; Wang, S.M.; Dene, H. A genetic polymorphism in the renine gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243:542-543, 1989. Rattigan, S.; Clark, M.G.; Barrett, E.J. Acute vasoconstriction-induced insulin resistance in rat muscle in vivo. Diabetes. 48:564-569, 1999. Reaven, G.M.; Chang, H. Relationship between blood pressure, plasma insulin and triglyceride concentration, and insulin action in spontaneous hypertensive and Wistar-Kyoto rats. Am J Hypertens. 4:34-38, 1991. Reaven, G.M. Abnormalities of carbohydrate and lipoprotein metabolism in patients with hypertension. Relationship to obesity. Ann Epidemiol. 1:305-311, 1991. Reaven, G.M. Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes. 37:1595-1607, 1988. Reeves, P.G.; Nielsen, F.H.; Fahey, G.C.Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition and hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr. 123:1939-51, 1993. Reiser, S.; Powell, A.S.; Scholfield, D.J.; Panda, P.; Ellwood, K.C.; Canary, J.J. Blood lipids, lipoproteins, apoproteins, and uric acid in men fed diets containing fructose or high-amylose cornstarch. Am J Clin Nutr. 49:832-9, 1989. Ren, Y.; Carretero, O.A.; Garvin, J.L. Mechanism by which superoxide potentiates tubuloglomerular feedback. Hypertension. 39:624-628, 2002. Roberts, T.J.M.; Chapman, A.C.; Cipolla, M.J. PPAR-γ agonist rosiglitazone reverses increased cerebral venous hydraulic conductivity during hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297:H1347-H1353, 2009. Rocchini, A.P.; Key, J.; Bondie, D.; Chico, R.; Moorehead, C.; Katch, V.; Martin, M. The effect of weight loss on the sensitivity of blood pressure to sodium in obese adolescents. N Engl J Med. 321:5805- 85, 1989. Roglans, N.; Vila, L.; Farre, M.; Alegret, M.; Sanchez, R.M.; Vazquez-Carrera, M.; Laguna, J.C. Impairment of hepatic Stat-3 activation and reduction of PPARalpha activity in fructose-fed rats. Hepatology. 45:778-788, 2007. Rosenblat, M.; Karry, R.; Aviram, M. Paraoxonase 1 (PON1) is a more potent antioxidant and stimulant of macrophage cholesterol efflux when present in HDL than in lipoprotein-deficient serum: relevance to diabetes. Atherosclerosis. 187:74-81, 2006. Rosón, M.I.; Dellsa Penna, S.L.; Cao, G.; Gorzalczany, S.; Pandolfo, M.; Toblli, J.E.; Fernández, B.E. Different protective actions of losartan and tempol on the renal inflammatory response to acute sodium overload. J Cell Physiol. 224:41-48, 2010. Ross, A.P.; Bartness, T.J.; Mielke, J.G.; Parent, M.B. A high fructose diet impairs spatial memory in male rats. Neurobiol Learn Mem. 92:410-6, 2009.


96

Rutledge, A.C.; Adeli, K. Fructose and the metabolic syndrome: pathophysiology and molecular mechanisms. Nutr Rev. 65:S13-23, 2007. Samuni, A.; Winkelsberg, D.; Pinson, A.; Hahn, S.M.; Mitchell, J.B.; Russo, A. Nitroxide stable radicals protect beating cardiomyocytes against oxidative damage. Clin Invest. 87:1526-1530, 1991. Satoh, M.; Fujimoto, S.; Haruna, Y.; Arakawa, S.; Horike, H.; Komai, N.; Sasaki, T.; Tsujioka, K.; Makino, H.; Kashihara, N. NAD(P)H oxidase and uncoupled nitric oxide synthase are major sources of glomerular superoxide in rats with experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol. 288:F1144-F1152, 2005. Sautin, Y.; Nakagawa, T.; Zharikov, S.; Johnson, R.J. Adverse effects of the classic antioxidant uric acid in adipocytes: NADPH oxidase-mediated oxidative/nitrosative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 293:C58-96, 2007. Sánchez-Lozada, L.G.; Tapia, E.; Jimenez, A.; Batista, P.; Cristóbal, M.; Nepomuceno, T.; Soto, V.; Ávila-Casado, C.; Nakagawa, T.; Johnson, R.J.; Herrera-Acosta, J.; Franco, M. Fructose-induced metabolic syndrome is associated with glomerular hypertension and renal microvascular damage in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 292:F423-F429, 2007. Sánchez-Lozada, L.G.; Tapia, E.; Batista-Garcia, P.; Soto, V.; Avila-Casado, C.; Vega-Campos, I.P.; Nakagawa, T.; Zhao, L.; Franco, M.; Johnson, R.J. Effects of febuxostat on metabolic and renal alterations in rats with fructose-induced metabolic syndrome. Am J Physiol. 294:F710-F718, 2008. Santuré, M.; Pitre, M.; Marette A.; Deshaies, Y.; Lemieux, C.; Lariviere, R.; Nadeau, A.; Bachelard. H. Induction of insulin resistance by high-sucrose feeding does not raise mean arterial blood pressure but impairs haemodynamic responses to insulin in rats. Br J Pharmacol. 137:185-196, 2002. Sartorio, A.; Del, C.A.; Agosti, F.; Mazzilli, G.; Bellentani, S.; Tiribelli, C.; Bedogni, G. Predictors of nonalcoholic fatty liver disease in obese children. Eur J Clin Nutr. 61:877-883, 2007. Scherrer, U.; Randin, D.; Vollenweider, P.; Vollenweider, L.; Nicod, P. Nitric oxide release accounts for insulin’s vascular effects in humans. J Clin Invest. 94:2511-2515, 1994. Schnackenberg, C.G.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. Normalization of blood pressure and renal vascular resistance in SHR with a membrane permeable superoxide dismutase mimetic: role of nitric oxide. Hypertension. 32:59-64, 1998. Schnackenberg, C.G.; Wilcox, C.S. Two-week administration of tempol attenuates both hypertension and renal excretion of 8-Iso prostaglandin f2alpha. Hypertension. 33:424-8, 1999. Schnackenberg, C.G.; Wilcox, C.S. The SOD mimetic tempol restores vasodilation in afferent arterioles of experimental diabetes. Kidney Int. 59:1859-1864, 2001. Scholz, G.H. Englaro, P.; Thiele, I.; Scholz, M.; Klusmann, T.; Kellner, K.; Rascher, W.; Blum, W.F. Dissociation of serum leptin concentration and body fat content during long term dietary intervention in obese individuals. Horm Metab Res. 28:718-723, 1996.


97

Sharma, A.M.; Schorr, U.; Distler, A. Insulin resistance in young salt-sensitive normotensive subjects. Hypertension. 21:273-279, 1993. Shapiro, A.; Mu, W.; Roncal, C.; Cheng, K.Y.; Johnson, R.J.; Scarpace, P.J. Fructose-induced leptin resistance exacerbates weight gain in response to subsequent high-fat feeding. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295:R1370-5, 2008. Shin, M.O.; Moon, J.O. Effect of dietary supplementation of grape skin and seeds on liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine in rats. Nutr Res Pract. 4:369-374, 2010. Shinozaki, K.; Kashiwagi, A.; Nishio, Y.; Okamura, T.; Yoshida, Y.; Masada, M.; Toda, N.; Kikkawa, R. Abnormal biopterin metabolism is a major cause of impaired endothelium-dependent relaxation through nitric oxide/O2- imbalance in insulin-resistant rat aorta. Diabetes. 48:2437-45, 1999. Shinozaki, K.; Nishio, Y.; Okamura, T.; Yoshida, Y.; Maegawa, H.; Kojima, H.; Masada, M.; Toda, N.; Kikkawa, R.; Kashiwagi, A. Oral administration of tetrahydrobiopterin prevents endothelial dysfunction and vascular oxidative stress in the aortas of insulin-resistant rats. Circ Res. 87:566-73, 2000. Shinozaki, K.; Kashiwagi, A.; Masada, M.; Okamura, T. Stress and vascular responses: Oxidative stress and endothelial dysfunction in the insulin-resistant state. J Pharmacol Sci. 91:187-91, 2003. Shinozaki, K.; Ayajiki, K.; Nishio, Y.; Sugaya, T.; Kashiwagi, A.; Okamura, T. Evidence for a causal role of the rennin angiotensin system in vascular dysfunction associated with insulin resistance. Hypertension. 43:255-262, 2004. Singh, A.K.; Amlal, H.; Haas P.J.; Dringenberg, U.; Fussell, S.; Barone, S.L.; Engelhardt, R.; Zuo, J.; Seidler, U.; Soleimani, M. Fructose-induced hypertension: essential role of chloride and fructose absorbing transporters PAT1 and Glut5. Kidney Intern. 74:438-447, 2008. Siu, Y.P.; Leung, K.T.; Tong, M.K.; Kwan, T.H. Use of allopurinol in slowing the progression of renal disease through its ability to lower serum uric acid level. Am J Kidney Dis. 47:51-9, 2006. Soleimani, M.; Alborzi, P. The role of salt in the pathogenesis of fructose-induced hypertension. Int J Nephrol. 2011:392708, 2011. Stamler, J.; Caggiula, A.; Grandits, G.A.; Kjelsberg, M.; Cutler, J.A. Relationship to blood pressure of combinations of dietary macronutrients. Findings of the Multiple Risk Factor Intervention Trial (MRFIT). Circulation. 15:2417-23, 1996. Stanhope, K.L.; Havel, P.J. Fructose Consumption: considerations for future research on its effects on adipose distribution, lipid metabolism, and insulin sensitivity in humans. J Nutr. 139:1236S-1241S, 2009. Steinberg, H.O.; Brechtel, G.; Johnson, A.; Fineberg, N.; Baron, A.D. Insulin-mediated skeletal muscle vasodilation is nitric oxide dependent. A novel action of insulin to increase nitric oxide release. J Clin Invest. 94:1172-1179, 1994. Steinberg, G.R.; Parolin, M.L.; Heigenhauser, G.J.; Dyck, D.J. Leptin increases FA oxidation in lean but not obese human skeletal muscle: evidence of peripheral leptin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab. 283:E187-E192, 2002.


98

Stenvinkel, P.; Ottosson-Seeberger, A.; Alvestrand, A. Renal hemodynamics and sodium handling in moderate renal insufficiency: the role of insulin resistance and dyslipidemia. J Am Soc Nephrol. 5:1751-60, 1995. Storlien, L.H.; Oakes, D.N.; Pan, D.A.; Kusunoki, M.; Jenkins, A.B. Syndromes of insulin resistance in the rat: inducement by diet and amelioration with benfluorex. Diabetes. 42: 457-462, 1993. Strazzullo, P.; D'Elia, L.; Kandala, N.B.; Cappuccio, F.P. Salt intake, stroke, and cardiovascular disease: meta-analysis of prospective studies. BMJ. 339:b4567, 2009. Sun, S.Z.; Flickinger, B.D.; Williamson-Hughes, P.S.; Empie, M.W. Lack of association between dietary fructose and hyperuricemia risk in adults. Nutr Metab. 1;7, 2010 Suzuki, M.; Nomura, C.; Odaka, H.; Ikeda, H. Effect of an insulin sensitizer, pioglitazone, on hypertension in fructose-drinking rats. Jpn J Pharmacol. 74:297-302, 1997. Taghibiglou, C.; Carpentier, A.; Van Iderstine, S.C.; Chen, B.; Rudy, D.; Aiton, A.; Lewis, G.F.; Adeli, K. Mechanisms of hepatic very low density lipoprotein overproduction in insulin resistance. Evidence for enhanced lipoprotein assembly, reduced intracellular ApoB degradation, and increased microsomal triglyceride transfer protein in a fructose-fed hamster model. J Biol Chem. 275:8416-8425, 2000. Takagawa, Y.; Berger, M.E.; Tuck, M.L.; Golub, M.S. Impaired endothelial alpha-2 adrenergic receptor-médiated vascular relaxation in the fructose-fed rat. Hypertens Res. 25:197-202, 2002. Teff, K.L.; Elliott, S.S.; Tschöp, M.; Kieffer, T.J.; Rader, D.; Heiman, M.; Townsend, R.R.; Keim, N.L.; D'Alessio, D.; Havel, P.J. Dietary fructose reduces circulating insulin and leptin, attenuates postprandial suppression of ghrelin, and increases triglycerides in women. J Clin Endocrinol Metab. 89:2963-72, 2004. ter Maaten, J.C.; Bakker, S.J.L.; Serné, E.H.; ter Wee, P.M.; Donker, A.J.M.; Gans, R.O.B. Insulin’s acute effects on glomerular filtration rate correlate with insulin sensitivity whereas insulin’s acute effects on proximal tubular sodium reabsorption correlate with salt sensitivity in normal subjects. Nephrol Dial Transplant. 14:2357-2363, 1999. Thornalley, P.J.; McLellan, A.C.; Lo, T.W.; Benn, J.; Sonksen, P.H. Negative association between erythrocyte reduced glutathione concentration and diabetic complications. Clin Sci. 5:575-582, 1996. Thorburn, A.W.; Storlein, L.H.; Jemkins, A.B.; Khouri, S.; Kraegen, E.W. Fructose-induced in vivo insulin resistance and elevated plasma triglyceride levels in rats. Am J Clin Nutr. 49:1155-63, 1989. Tian, N.; Moore, R.S.; Braddy, S.; Rose, R.A.; Gu, J.W.; Hughson, M.D.; Manning, R.D. Jr. Interactions between oxidative stress and inflammation in salt-sensitive hypertension. Am J Physiol. 293:H3388-3395, 2007. Tornheim, K.; Lowenstein, J.M. Control of phosphofructokinase from rat skeletal muscle. Effects of fructose diphosphate, AMP, ATP, and citrate. J Biol Chem. 251:7322-8, 1976.


99

Touyz, R.M. Reactive oxygen species in vascular biology: role in arterial hypertension. Expert Rev Cardiovasc Ther. 1:91-106, 2003. Touyz, R.M. Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells - implications in cardiovascular disease. Braz J Med Biol Res. 37:1263-1273, 2004. Tran, L.T.; MacLeod, K.K.; McNeill, J.H. Chronic etanercept treatment prevents the development of hypertension in fructose-fed rats. Mol Cell Biochem. 330: 219-228, 2009. Turner, J.L.; Bierman, E.L.; Brunzell, J.D.; Chait, A. Effect of dietary fructose on triglyceride transport and glucoregulatory hormones in hypertriglyceridemic men. Am J Clin Nutr. 32:1043-1050, 1979. Ueno, M.; Bezerra, R.M.; Silva, M.S.; Tavares, D.Q.; Carvalho, C.R.; Saad, M.J. A high-fructose diet induces changes in pp185 phosphorylation in muscle and liver of rats. Braz J Med Biol Res. 33:1421-1427, 2000. Unger, B.; Patil, B.M. Apocynin improves endothelial function and prevents the development of hypertension in fructose fed rat. Indian J Pharmacol. 41:208-212, 2009. Uusitupa, M.I.J. Fructose in the diabetic diet. Am J Clin Nutr. 59:753-7S, 1994. Vasan, R.S.; Larson, M.G.; Leip, E.P.; Evans, J.C.; O'Donnell, C.J.; Kannel, W.B.; Levy, D. Impact of high-normal blood pressure on the risk of cardiovascular disease. N Engl J Med. 345:1291-7, 2001. Vasankari, T.J.; Vasankari, T.M. Effect of dietary fructose on lipid metabolism, body weight and glucose tolerance in humans. Scand J Food Nutr. 50:55-63, 2006. Van Schaftingen, E. The discovery and role of fructose-2,6-bisphosphatate. Acta Gastroenterol Belg. 51:141-6, 1988. Vasdev, S.; Gill, V.; Parai, S.; Longerich, L.; Gadag, V. Dietary vitamin E and C supplementation prevents fructose induced hypertension in rats. Mol Cell Biochem. 241:107-114, 2002. Vasdev, S.; Gill, V.; Longerich, L.; Parai, S.; Gadag, V. Salt-induced hypertension in WKY rats: prevention by α-lipoic acid supplementation. Mol Cell Biochem. 254:319-326, 2003. Vasdev, S.; Gill, V.; Parai, S.; Gadag V. Fructose induced hypertension in Wistar-Kyoto rats: interaction with moderately high dietary salt. Can J Physiol Pharmacol. 85:413-421, 2007. Verma, S.; Bhanot, S.; McNeill, J.H. Antihypertensive effects of metformin in fructose-fed hyperinsulinemic, hypertensive rats. J Pharmacol Exp Ther. 271:1334-1337, 1994. Xu, X.; Zhao, C.X.; Wang, L.; Tu, L.; Fang, X.; Zheng, C.; Edin, M.L.; Zeldin, D.C.; Wang, D.W. Increased CYP2J3 expression reduces insulin resistance in fructose-treated rats and db/db mice. Diabetes. 59:997-1005, 2010. Wang, D.D.; Sievenpiper, J.L.; de Souza, R.J.; Chiavaroli, L.; Ha, V.; Cozma, A.I.; Mirrahimi, A.; Yu, M.E.; Carleton, A.J.; Di Buono, M.; Jenkins, A.L.; Leiter, L.A.; Wolever, T.M.; Beyene, J.; Kendall, C.W.; Jenkins, D.J. The effects of fructose intake on serum uric acid vary among controlled dietary trials. J Nutr. 142:916-23, 2012.


100

Ward, N.C.; Wu, J.H.; Clarke, M.W.; Puddey, I.B.; Burke, V.; Croft, K.D.; Hodgson, J.M. The effect of vitamin E on blood pressure in individuals with type 2 diabetes: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J. Hypertens. 25:227-234, 2007. Welch, W.J.; Blau, J.; Xie, H.; Chabrashvili, T.; Wilcox, C.S. Angiotensin-induced defects in renal oxygenation: role of oxidative stress. Am J Physiol. 288:H22-H28, 2005. Wexler, B.C.; Greenberg, B.P. Effect of increased serum urate levels on virgin rats with no arteriosclerosis versus breeder rats with preexistent arteriosclerosis. Metabolism. 26:1309-1320, 1977. Wexler, B.C. Allantoxan amide-induced myocardial necrosis in Sprague-Dawley vs spontaneously hypertensive rats. Proc Soc Exp Biol Med. 170:476-485, 1982. World Health Organization. Reducing Salt Intake in Populations: Report of a WHO Forum and Technical Meeting, 5–7 October 2006, Paris, France; WHO: Geneva, Switzerland, 2007. World Health Organization. Creating an enabling environment for population based salt reduction strategies: report of a Joint Technical Meeting held by WHO and FSA/UK. Genebra: World Health Organization; 2010. Widdowson, P.S.; Upton, R.; Buckingham, R.; Arch, J.; Williams, G. Inhibition of food response to intracerebroventricular injection of leptin is attenuated in rats with diet-induced obesity. Diabetes. 46:1782-1785, 1997. Wilcox, C.S.; Pearlman, A. Chemistry and antihypertensive effects of tempol and other nitroxides. Pharmacol Rev. 60:418-469, 2008. Wilcox, C.S.; Welch, W.J. Interaction between nitric oxide and oxygen radicals in regulation of tubuloglomerular feedback. Acta Physiol Scand. 168:119-124, 1999. Wilcox, C.S.; Welch, W.J. Interaction between nitric oxide and oxygen radicals in regulation -of tubuloglomerular feedback. Acta Physiol Scand. 168:119-124, 2000. Williams, B. The year in hypertension. JACC. 55:66-73, 2010. Wright, E. Jr.; Scism-Bacon, J.L.; Glass, L.C. Oxidative stress in type 2 diabetes: the role of fasting and postprandial glycaemia. Int J Clin Pract. 60:308-314, 2006. Wu, S.Q.; Hopfner, R.L.; McNeill, J.R.; Wilson, T.W.; Gopalakrishnan, V. Altered paracrine effect of endothelin in blood vessels of the hyperinsulinemic, insulin resistant obese Zucker rat. Cardiovasc Res. 45:994-1000, 2000. Yelinova, V.I.; Khramtsov, V.V.; Markel, A.L. Manifestation of oxidative stress in the pathogenesis of arterial hypertension in ISIAH rats. Biochem Biophys Res Commun. 263: 450-453, 1999. Yin Q-Q.; Pei, J-J.; Xu, S.; Luo, D-Z.; Dong, S-Q.; Sun, M-H.; You, L.; Sun, Z-J.; Xue-Ping Liu X-P. Pioglitazone improves cognitive function via increasing insulin sensitivity and strengthening antioxidant defense system in fructose-drinking insulin resistance rats. PLoS One. 8:e59313, 2013.


101

Yu, B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. Physiol Rev. 74:139-162, 1994. Zalba, G.; San José, G., Moreno, M.U.; Fortuño, M.A.; Fortuño, A.; Beaumont, F.J.; Díez, J. Oxidative stress in arterial hypertension role of NADPH oxidase. Hypertension. 38:1395-1399, 2001. Zare, F.; Magnusson, M.; Bergström, T.; Brisslert, M.; Josefsson, E.; Karlsson, A.; Tarkowski, A. Uric acid, a nucleic acid degradation product, down-regulates dsRNA-triggered arthritis. J Leukoc Biol. 79:482-488, 2006. Zavaroni, I.; Coruzzi, P.; Bonini, L.; Mossini, G.L.; Musiari, L.; Gasparini, V.; Fantuzzi, M.; Reaven, G.M. Association between salt sensitivity and insulin concentrations in patients with hypertension. Am J Hypertens. 8:855-858, 1995. Zhao, C.X.; Xu, X.; Cui, Y.; Wang, P.; Wei, X.; Yang, S.; Edin, M.L.; Zeldin, D.C.; Wang, D.W. Increased endothelial nitric-oxide synthase expression reduces hypertension and hyperinsulinemia in fructose-treated rats. J Pharmacol Exp Ther. 328:610-20, 2009. Zou, A.P.; Li, N.; Cowley, A.W. Production and actions of superoxide in the renal medulla.

Hypertension. 37: 547-553, 2001.

Anexos

102

Anexos

Anexo 1: Contribuição científica Artigos publicados

Dornas WC, Silva ME. Animal models for the study of arterial hypertension. Journal of Biosciences. 36(4):731–737, 2011.

Dornas WC, Lima, WG, dos Santos RC, de Souza MO, Silva M, Diniz MF, Silva ME, Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1 activity. Nutrition & Metabolism. 9:63, 2012.

Dornas WC, Lima, WG, dos Santos RC, Guerra JF, de Souza MO, Silva M, Silva LS, Diniz MF, Silva ME. High dietary salt decreases antioxidant defenses in the liver of fructose-fed insulin-resistant rats. Journal of Nutritional Biochemistry. 24:2016–2022, 2013.

Artigo aceito

Dornas WC, Lima, Silva M, Tavares R, Lima, WG, dos Santos RC, Pedrosa ML, Silva ME. Efficacy of the superoxide dismutase mimetic tempol in animal hypertension models: a meta-analysis. Journal of Hypertension.

Anexos

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Anexo 2: Protocolos de dosagens bioquímicas Kits Labtest Ácido úrico – referência 73 Albumina – referência 19 Colesterol-HDL – referência 13 Colesterol total – referência 76 Creatinina – referência 96 Fosfatase alcalina – referência 79 Glicose – referência 85 Proteínas totais – referência 99 Transaminase oxalacética (AST) – referência 52 Transaminase pirúvica (ALT) – referência 53 Triglicérides (Triacilglicerol) – referência 87 Ureia – referência 27 Crystal Chem Downers Grove IL e Rat Leptin ELISA Kit, Linco Research Insulina - Catálogo #90060 Leptina - Catálogo #90040

Animal models for the study of arterial hypertension

WALESKA C DORNAS1and MARCELO E SILVA2,*

1Research in Biological Sciences - NUPEB, 2Department of Foods, School of Nutrition, Ouro Preto University,Minas Gerais, Brazil

*Corresponding author (Fax, +55-31-35591828; Email, [email protected])

Hypertension is one of the leading causes of disability or death due to stroke, heart attack and kidney failure. Becausethe etiology of essential hypertension is not known and may be multifactorial, the use of experimental animal modelshas provided valuable information regarding many aspects of the disease, which include etiology, pathophysiology,complications and treatment. The models of hypertension are various, and in this review, we provide a brief overviewof the most widely used animal models, their features and their importance.

[Dornas WC and Silva ME 2011 Animal models for the study of arterial hypertension. J. Biosci. 36 731–737] DOI 10.1007/s12038-011-9097-y

1. Introduction

Owing to the high occurrence of hypertension and problemsoriginating from this disease over the years, a series ofexperimental models have been developed (Doggrell andBrown 1998). The use of relevant models to mimic humancardiovascular disease may offer useful information byallowing an understanding of the cause and progression ofthe disease status as well as potential therapeutic interven-tions (Badyal et al. 2003). However, an effective study ofparticular cardiovascular alterations emerging in the courseof the developmental process requires the use of adequateanimal models. Accordingly, it should be mentioned thateach one of the studied models involves a different role inthe development of the disease (Fazan et al. 2001).

2. Genetic hypertension

2.1 Spontaneously hypertensive rat

Spontaneously hypertensive rats (SHRs) were originallyinbred from Wistar rats and their Wistar–Kyoto (WKY)

inbred non-hypertensive controls (Okamoto and Aoki1963). These rats develop hypertension at about 4–6 weeksof age without physiological, pharmacological or surgicalintervention (Zicha and Kunes 1999); however, environ-mental factors affect the development of hypertension, andthe importance of this model has been attributed to thesimilarity of its pathophysiology with essential hypertensionin humans (Trippodo and Frohlic 1981).

In vivo studies have shown that in the early stages ofhypertension, SHRs have an increased cardiac output withnormal total peripheral resistance. As the SHR progressesinto the established hypertension state, the cardiac outputreturns to normal values and the hypertrophied bloodvessels produce an increase in the total peripheralresistance (Smith and Hutchins 1979). With the advanceof hypertension, the SHR progressively develops (between6 and 24 months of age) structural alterations in the heart,which are associated with progressive cardiac hypertrophy(Engelmann et al. 1987). As this is not a strictly inbredstrain, individual variations in the genetic background ofboth SHR and particularly of their control strain maysignificantly influence the resulting end-organ changes,what can be seen in figure 1.

http://www.ias.ac.in/jbiosci J. Biosci. 36(4), September 2011, 731–737, * Indian Academy of Sciences 731

Keywords. Blood pressure; cardiovascular disease; experimental models; hypertension

Abbreviations used: ANG II, angiotensin II; BHR, borderline hypertensive rat; CBF, cerebral blood flow; DOCA,11-desoxycorticosterone acetate; DR, Dahl salt-resistant rat; DS, Dahl salt-sensitive rat; EDCF, endothelium-derived constricting factor;EDRF, endothelium-derived relaxing factor; HR, heart rate; LV, left ventricle; MAP, mean arterial pressure; PRA, plasma rennin activity ;RAAS, rennin–angiotensin–aldosterone system; ROS, reactive oxygen species; RSNA, renal sympathetic nerve activity; SAD, sinoaorticbaroreceptors ; SHR, spontaneously hypertensive rat; SHRSP, stroke-prone spontaneously hypertensive rat; SOD, superoxide dismutase ;WKY, Wistar–Kyoto

Review

Stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP),bred from SHR developed with even higher levels of BPand a strong tendency to die from stroke, are extremeexamples of cerebrovascular lesions developing spontane-ously in animal models (Okamoto et al. 1974). It is the mostutilized animal model of spontaneous stroke and is regardedas a unique animal model in which prevention of stroke canbe studied experimentally as the incidence of spontaneousoccurrence of stroke lesions in these models reach 80% inmales and 60% in females, with extensive cerebral arterio-sclerosis (Yamori 1989).

Because of the high mortality rate of stroke in humans,and of the similarity of stroke in SHRSP to that observed inhuman essential hypertension, this model has been appliedto studies of stroke in human beings (Yamori et al. 1976).Hypertrophy leads to increased vascular resistance (figure 1)and wall sheer rates. As blood vessels become lessfunctionally responsive and more extensively filled withatherosclerotic plaques, there is a risk for complicationssuch as cerebral hemorrhage, thrombosis, nephrosclerosisand myocardial lesions in SHRs and especially cerebrallesions in SHRSPs (Henning et al. 2010). Therefore, thesemodels can be used to study not only the pathogenesis andtherapy but also prophylaxis in essential hypertension andits complications.

2.2 Dahl salt-sensitive rats

Another model is the Dahl salt-sensitive rat (DS), originallyderived by Dahl from the Sprague–Dawley stock on thebasis of developing hypertension with a high NaCl diet.When fed normal salt diet, these rats become hypertensive,indicating that this is a genetic model of hypertension withthe feature of salt sensitivity. On the basis of theseconsiderations, Dahl et al. (1962) selected from endo-crossings of Sprague–Dawley rats and, on the basis ofpressure levels associated with a diet high in salt (8% NaCl),

two strains of animals: the Dahl salt-sensitive rats (DS) andthe Dahl salt-resistant ones (DR).

The DS animals develop a systemic arterial hypertensionafter ingesting a high-salt diet, while the DR animals canmaintain BP within normal limits even with the same diet.The mechanisms of genetic salt-sensitive hypertension ofthe Dahl strain rats are not yet fully known. In addition, DSrats are possibly insulin resistant even before hypertensionis fully established, and salt-sensitive models of hyperten-sion manifest a decrease in afferent arteriolar resistance anda rise in glomerular pressure in response to an increase inBP (Campese 1994). This could indicate that insulinresistance and hypertension may be inherited as separatetraits that develop in a parallel but independent manner(Channa et al. 2004).

Dahl salt-hypertensive rats are prone to hypertensivenephropathy (figure 1). Hypertensive glomerular lesionswere conventionally characterized by mesangial prolifera-tion, matrix accumulation and glomerulosclerosis, in addi-tion to endothelial dysfunction (Nagase et al. 2006).

2.3 Transgenic hypertension models

Transgenic hypertension models can be generated by over-expression of a specific gene. This is an excellent model tostudy the role of a specific gene in the pathogenesis ofhypertension. A representative of this type of hypertension isthe TGR(mREN2)27 transgenic rat developed by Mullinset al. (1990), which suppresses endogenous renal renin(Bader et al. 1992). TGR develops fulminant hypertension(200 to 260 mmHg mean systolic BP) beginning at the 5thweek of age, exhibits more myocyte hypertrophy and, only toa small extent, hyperplasia, and more endothelial dysfunctionthan age- and BP-matched SHR (Mullins et al. 1990).

Structural lesions of the nephron in TGR are moderate inboth sexes at an age of 4 months, except for an overallincrease in wall thickness of the larger arterioles and arteries

Hypertension

Decreased CBF

Salt-diet

Hypertrophy

Cerebral and myocardial lesions

TGR(mREN2)27 DSSHRSHRSP

Ischaemia

BHR

Renal damage

Impaired endothelium

Proteinuria clearance

EDRF EDCF

Metabolic syndrome

Glomerulosclerosis Tubulointersticial fibrosis

Cardiac failure Risk factor for sudden death

Vascular resistance

Vascular remodelling

Figure 1. End-organ damage as affected by different experimental genetic models of hypertension: Cerebral blood flow (CBF);endothelium-derived relaxing factor (EDRF) and endothelium-derived constricting factor (EDCF).

732 Waleska C Dornas and Marcelo E Silva

J. Biosci. 36(4), September 2011

(Bachmann et al. 1992). Although the model is notrepresentative of human hypertension, it does allow in vivoanalysis of the consequences of severe, monogeneticactivation of the Ras and allows identification of the typesof hypertensive damage that can be expected from anactivated Ras (figure 1).

2.4 Borderline hypertensive rat

Investigations using the borderline hypertensive rat (BHR)have demonstrated the important role genetic factors canplay in mediating both the behavioural and cardiovascularresponses to environmental stressors.

BHR is a genetic model of environmentally inducedhypertension and it is the first filial offspring of the SHRand the normotensive WKY rat, possessing genetic infor-mation from both parents (Sanders and Lawler 1992). Themechanisms by which environmental stress produces hy-pertension in BHR have not been identified. However, thesympathetic nervous system has been implicated. Increasesin plasma norepinephrine concentration during acute envi-ronmental stress have been observed in BHR, and changesin vascular reactivity induced by stress may contribute to thedifferential hemodynamic adaptations to stress observed inWKY rats and BHR (Fuchs et al. 1998). BHR arecharacterized by a high plasma concentration of vasopres-sin, exogenous vasopressin-induced hyperpressor action andcardiac hypertrophy (figure 1).

3. Renal hypertension

3.1 Renovascular hypertension

Since 1934, when Goldblatt and his coworkers induced anelevation of BP by partial constriction of the renal artery ofdog, many renal-induced models of hypertension have beensuccessfully established. Goldblatt’s technique consists ofconstricting one or both renal arteries by use of a smalladjustable silver clamp (Goldblatt et al. 1934). Generally,renal-induced experimental hypertension includes two-kidney one-clip hypertension (2K1C; constriction of onerenal artery while the contralateral kidney is left intact), one-kidney one-clip hypertension (1K1C; one renal artery isconstricted and the contralateral kidney is removed), andtwo-kidney two-clip hypertension (2K2C; constriction ofaorta or both renal arteries).

As the clip is not severe enough to cause ischaemia inthe 2K1C Goldblatt model, hypertension is induced byunilateral stenosis of the renal artery. However, thereduced renal perfusion pressure stimulates increasedrenin synthesis and angiotensin II (ANG II), via its directvascular effects, acutely increases total peripheral resis-

tance and raises BP and also has actions on almost everyorgan system (Guyton 1991).

Constricting the renal artery of the remaining kidney inuninephrectomized rats produces 1K1C Goldblatt hyperten-sion. This hypertensive model has been generally consid-ered to be sodium-fluid volume-dependent, and is an idealmodel for studying the role of volume expansion in thedevelopment of hypertension; owing to the absence of theother normal kidney, no compensatory increase in sodiumand water excretion can occur, and hence, fluid volume isretained (Liard et al. 1974).

When of the aorta or both renal arteries are constricted, thereis severe renal ischaemia caused by renal clipping, occasioningthe activation of renin-angiotensin and the sympatheticnervous system and the elevation of serum vasopressin,leading to increased BP (Suzuki et al. 1987). The 2K2C, witha high incidence of spontaneous stroke, can be used asSHRSP independent of a genetic deficiency. The lesionedsmall artery or arteriole with thrombotic occlusion is the maincause of cerebral infarction in 2K2C, and this may be similarto lacunar infarction in the human brain (Zeng et al. 1998).

3.2 Renoprival hypertension

Significant reduction of nephron mass by subtotal nephrec-tomy in experimental animals or by various diseases inhumans triggers a chain of events that lead to glomerulo-sclerosis, tubulointerstitial injury, proteinuria and progres-sion to end-stage renal disease (Quiroz et al. 2008).

Unilateral nephrectomy causes neither hypertension norcardiovascular lesions. However, hypertension caused byrenal arterial stenosis, exacerbated by high amounts ofprotein and salt in the diet and/or by high volumes of waterconsumed, as well as removal or not of the adrenal gland,can affect the severity of renoprival hypertension. Removalof one kidney and approximately two-thirds of the other isfollowed by a slow increase in BP. In these animals,intravascular volume increases and the resulting hyperten-sion may have the same pathogenesis as renoprivalhypertension (Ledingham and Pelling 1970). Since abilateral nephrectomy leads to hypertension with vascularlesions, especially if the animal’s life is prolonged after thecomplete removal of the kidneys (Ferrario et al. 2009).

4. Endocrine hypertension

4.1 Salt and mineralocorticoids

Mineralocorticoids cause retention of sodium and water inthe body until escape diuresis occurs due to increasedpressure on the kidneys and suppression of renin secretion.The renal effects of this model are similar to hyperaldoster-

Animal models in hypertension 733


onism in humans. 11-desoxycorticosterone acetate (DOCA)and a high-salt diet cause increase of BP within 3 weeks inisolated perfused cortical collecting ducts, and can cause a30-fold increase in sodium absorption (Garwitz and Jones1982). Moreover, there is a reduced plasma rennin activity(PRA), which is expected in a model of volume-dependenthypertension, and oxidative stress also may be involved inDOCA salt hypertension by the increase of superoxideformation (Ortiz and Garvin 2001).

DOCA salt models progress quickly to severe hypertensionand hypertrophy and are therefore not suited for long-termstudies in chronic, stable disease; there should be minimalmortality due to the procedures alone. Thereby, the majorlimitations of the DOCA salt model are: (1) the pharmacolog-ical (large) doses of drug required, (2) the requirement forsurgical reduction of renal mass and (3) the ingestion of alarge amount of NaCl required. Moreover, it is not a veryrealistic model for many human hypertensive patients(Doggrell and Brown 1998).

4.2 Psychosocial and environment-induced hypertension

It has been reported that elevation of BP resulting fromrepeated exposure to stressful situations may lead to a stateof persistent hypertension (Smith and Hutchins 1979).

Several mechanisms such as the resetting of the barore-ceptor reflexes and structural autoregulation in the periph-eral vasculature may operate to sustain BP at a high levelonce it is raised, but these account less convincingly for theinitial elevation. However, if psychosocial factors areinvolved in the development of hypertension, they are likelyto be linked with the early, triggering stages of thepathophysiological sequence (Steptoe 1986).

Chronic social stress in a modern world represents animportant risk factor for the development of cardiovasculardisease. Its deleterious effects depend on the critical periodof exposure, duration and type, as all these factors may alterfunctions of the basic autoregulatory stress responsecomponents in the hypothalamic–pituitary–adrenal axis,sympathoadrenal medullar system, rennin–angiotensin–aldosterone system (RAAS) and sympathetic nervous system(Zimmerman and Frohlich 1990; McCarty and Gold 1996;Esch et al. 2002).

Different types of stress have been applied, such asemotional stimuli, psychosocial stress, immobilizationstress, food deprivation and electric stimuli, air jet noise,flashing lights, cold, and interaction of members of a socialgroup as they compete for food and water (Henry 1975;Friedman and Dahl 1975; Papanek et al. 1991; Henry et al.1993; Tucker and Hunt 1993; Bechtold et al. 2009).

5. Neurogenic hypertension

Evidence suggests that the central nervous system partic-ipates in the genesis of hypertension. Neurogenic hyperten-sion can be defined as a permanent increase in BP resultingfrom a primarily neural change. Denervation of sinoaorticbaroreceptors (SAD) is the neurogenic model of hyperten-sion most often used. The details of these control mecha-nisms have been studied by observing steady state changesin mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and renalsympathetic nerve activity (RSNA) at various times aftercomplete disruption of these reflexes (DiBona and Jones2001), and in association with other models to obtain aglobal analysis of the baroreceptor-sympathetic reflex(table 1).

Table 1. Association of baroreceptor denervation and other models of experimental hypertension

Baroreceptor denervation and angiotensin-II-induced hypertensionSustained decrease in RSNA during angiotensin II infusion is baroreflex mediated (Barrett et al. 2005).

Sinoaortic denervation and administration L-NAMEBaroreflexes play an important role in the long-term control of BP, and one mediator of this control is nitric oxide (Ramchandra et al. 2003).

Sinoaortic denervation in chronic one-kidney, one-clip hypertensiveCentral and peripheral components of the baroreflex are acting efficiently at higher BP when the aortic nerve is maximally stimulated orthe activity is abolished, suggesting that baroreceptor resetting may not be complete in chronic hypertension (Trindade et al. 2009).

Sinoaortic denervation and stress in BHRBaroreflex resetting prevents a fall in BP when cardiac output is reduced during stress (Hatton et al. 1997).

Sinoaortic denervation with unilateral nephrectomy and administered NaClVasopressin and neurogenic stimuli work together in somemanner to elevate vascular resistance in salt-induced hypertension (Ryuzaki et al. 1991).

Sinoaortic denervation and administered NaClBaroreceptor reflex is required to prevent chronic salt-induced increases in arterial pressure (Osborn and Provo 1992).



In rats, SAD leads to marked and sustained increase inBP, and the increase of BP in rat is not accompanied by asmarked a tachycardia as that observed in dog (Krieger1964). Thus, an increase in MAP stimulates baroreceptorsand causes a reciprocal reduction in sympathetic outflow toresistance vessels and the heart so as to restore MAP to thenormal level and, therefore, cause neurogenic hypertension(Thrasher 2002).

6. Hypertension by chronic inhibition of nitric oxide

Nitric oxide (NO) plays an important role in regulatingsystemic vascular resistance by exerting a tonic vasodilatoreffect (Török 2008).

Chronic oral administration of an inhibitor of NO synthase,L-NAME, promoted a persistent hypertension associated withrenal injury, characterized by glomerulosclerosis, glomerularischaemia and interstitial infiltration in the kidney (Baylis et al.1992; Ribeiro et al. 1992). This hypertension is associatedwith intense peripheral vasoconstriction and the consequentincrease in peripheral vascular resistance. As for the cardiacoutput, some evidence seems to indicate a reduction evenduring chronic inhibition of NO synthase. A likelysympatho-excitatory action of central origin has also beenproposed by Biancardi et al. (2007), who showed thatvasoconstriction in response to L-NAME by the sympathetictone plays an important role in the initiation and maintenanceof hypertension.

In relation to cardiac abnormalities, the level of hyper-trophy in this model is relatively minor as compared withother models with similar BP levels. L-NAME-inducedpressure overload is associated with a distinct pattern of leftventricle (LV) remodelling characterized by a decrease inLV chamber size relative to wall thickness in the absence ofan increase in LV mass (Bartunek et al. 2000).

7. Hypertension induced by ANG II

ANG II is known to play an important role in the physiologicalregulation of vascular tone and BP and in pathologicalconditions such as hypertension and heart failure, althoughthe mechanisms by which ANG II chronically exerts its effectsremain unclear. ANG II, the final mediator of the RAS, plays apivotal physiological role in cardiovascular homeostasis. It is apotent vasoconstrictor of the peripheral vasculature andinduces growth of smooth muscle cells of blood vesselsand in the heart (Itoh et al. 1993).

This ANG II infusion rate does not cause immediateincreases in systemic BP but it rather leads to a slowlydeveloping hypertension over a period of 6–10 days. ANG-II-induced hypertension produces a presumably baroreflex-mediated sympathoinhibition corresponding to the increased

BP, but with the added challenge of increased dietary salt,the sympathetic nervous system does not respond to theincrease in pressure with the appropriate inhibition(McBryde et al. 2007).

8. Dietetically induced hypertension

It is known that long-term exposure to a special diet (highsalt, fat or sugar) results in dietary hypertension in someanimals or humans (Navarro-Cid et al. 1995; Kang et al.2004; Giani et al. 2009).

High-salt intake is able to decrease both plasma levelsand urinary excretion of nitrates (Fujiwara et al. 2000) andincreased superoxide production in both vasculature andkidney blockade by superoxide dismutase (SOD)-enhancedendothelium-dependent relaxation Roberts et al. (2000)demonstrated the presence of oxidative stress and inactiva-tion of NO in rats maintained on the high-fat or high-sugardiet, which may contribute to the development of hyperten-sion by enhanced generation of reactive oxygen species(ROS). The reduction in NO availability in the high-fat andhigh-sugar diet-fed animals was associated with marked saltsensitivity, as evidenced by a significant rise in BP on thehigh-salt diet (Roberts et al. 2003).

Dietary intake of fats and carbohydrate, particularly theintake of simple sugars and the resultant effects of plasmainsulin, adipokine and lipid concentrations, may affectcardiomyocyte size and function, especially with chronichypertension (Sharma et al. 2007). High fructose consump-tion by animals produces a model of the metabolicsyndrome with hypertension, hyperlipidaemia and insulinresistance, and this greatly accelerates progression ofchronic kidney disease (Gersch et al. 2007).

9. Concluding remarks

Animal models can lead to understanding of the interactionsof the principal regulatory factors in critical developmentalperiods of hypertension. Many of these models weredeveloped by using etiologic factors responsible for humanhypertension, although the cardiovascular response can bemore easily obtained in animals than in human studies.Thus, limitations are found for a direct and simplifiedapplication of these results, which suggests that there is noevidence to support that any experimental model ofhypertension exactly mimics all the symptoms of the humandisease. Furthermore, many researches have shown thatvariables such as duration of exposure to causal factors anddose, differences in animal species, gender as well as age ofthe animal at the beginning of exposure, and the techniquefor BP monitoring greatly differ amongst the studies andmay interfere with the results.



In this sense we suggest that the various models shouldbe increasingly investigated, providing subsidies for newfindings in the pathogenesis of hypertension, with a rationaldiscussion about the advantages and disadvantages of eachexperimental model in order to allow the best choice for thestudy in question.

Acknowledgements

We are grateful to Dr Rinaldo Cardoso dos Santos for hiscritical reading of the manuscript.

References

Bachmann S, Peters J, Engler E, Ganten D and Mullins J 1992Transgenic rats carrying the mouse renin gene: morphologicalcharacterization of a low-renin hypertension model. Kidney Int.41 24–36

Bader M, Zhao Y, Sander M, Lee MA, Bachmann J, Böhm M,Djavidani B, Peters J, Mullins JJ and Ganten D 1992 Role oftissue renin in the pathophysiology of hypertension in TGR(mREN2)27 rats. Hypertension 19 681–686

Badyal DK, Lata H and Dadhich A P 2003 Animal models ofhypertension and effect of drugs. Indian J. Pharmacol. 35 349–362

Barrett C J, Guild S J, Ramchandra R, Malpas S C 2005Baroreceptor denervation prevents sympathoinhibition dur-ing angiotensin II-induced hypertension; Hypertension46 168–72

Bartunek J, Weinberg EO, Tajima M, Rohrbach S, Katz SE,Douglas PS and Lorell BH 2000 Chronic N G-Nitro-L-Arginine methyl ester-induced hypertension novel molecularadaptation to systolic load in absence of hypertrophy.Circulation 101 423–429

Baylis C, Mitruka B and Deng A 1992 Chronic blockade of nitricoxide synthesis in the rat produces systemic hypertension andglomerular damage. J. Clin. Invest. 90 278–281

Bechtold AG, Patel G, Hochhaus G and Scheuer D A 2009 Chronicblockade of hindbrain glucocorticoid receptors reduces bloodpressure responses to novel stress and attenuates adaptation torepeated stress. Am. J. Physiol.-Reg. I. 296 R1445–R1454

Biancardi VC, Bergamaschi CT, Lopes OU and Campos RR 2007Sympathetic activation in rats with L-NAME-induced hyper-tension. Braz. J. Med. Biol. Res. 40 401–408

Campese VM 1994 Salt sensitivity in hypertension: renal andcardiovascular implications. Hypertension 23 531–550

Channa ML, Somova L and Nadar A 2004 Facets of themetabolic syndrome in Dahl hypertensive rats. Cardiovas. J.S. Afr. 15 61–63

Dahl LK, Heine M and Tassinari L 1962 Role of genetic factors insusceptibility to experimental hypertension due to chronicexcess salt ingestion. Nature (London) 194 480–482

DiBona GF and Jones SY 2001 Dynamic analysis of renal nerveactivity responses to baroreceptor denervation in hypertensiverats. Hypertension 37 1153–1163

Doggrell SA and Brown L 1998 Rat models of hypertension,cardiac hypertrophy and failure. Cardiovasc. Res. 39 89–105

Engelmann GL, Vitullo JC and Gerrity RG 1987 Morphometricanalysis of cardiac hypertrophy during development, matura-tion, and senescence in spontaneously hypertensive rats.Circ. Res. 60 487–494

Esch T, Stefano GB, Fricchione GL and Benson H 2002 Stress incardiovascular diseases. Med. Sci. Monitor 8 RA93–RA101

Fazan R Jr, da Silva VJD and Salgado HC 2001 Modelos dehipertensão arterial. Braz. J. Hypertens. 8 19–29

Ferrario CM, Varagic J, Habibi J, Nagata S, Kato J, Chappell MC,Trask AJ, Kitamura K, Whaley-Connell A and Sowers JR 2009Differential regulation of angiotensin-(1-12) in plasma andcardiac tissue in response to bilateral nephrectomy. Am. J.Physiol.-Heart C. 296 H1184–H1192

Friedman R and Dahl LK 1975 The effect of chronic conflict onthe blood pressure of rats with a genetic susceptibility toexperimental hypertension. Psychosom. Med. 37 402–416

Fuchs LC, Hoque AM and Clarke NL 1998 Vascular and hemody-namic effects of behavioral stress in borderline hypertensive andWistar-Kyoto rats. Am. J. Physiol.-Reg. I. 274 R375–R382

Fujiwara N, Osanai T, Kamada T, Katoh T, Takahashi K andOkumuraK 2000 Study on the relationship between plasma nitrite and nitratelevel and salt sensitivity in human hypertension: modulation ofnitric oxide synthesis by salt intake. Circulation 101 856–861

Garwitz ET and Jones AW 1982 Aldosterone infusion into the ratand dose-dependent changes in blood pressure and arterial ionictransport. Hypertension 4 374–381

Gersch M S, Mu W, Cirillo P, Reungjui S, Zhang L, Roncal C,Sautin YY, Johnson RJ and Nakagawa T 2007 Fructose, but notdextrose, accelerates the progression of chronic kidney disease.Am. J. Physiol.-Renal. 293 F1256–F1261

Giani JF, Mayer MA, Muñoz MC, Silberman E A, Höcht C, TairaCA, Gironacci MM, Turyn D and Dominici FP 2009 Chronicinfusion of angiotensin-(1–7) improves insulin resistance andhypertension induced by a high-fructose diet in rats. Am. J.Physiol.-Endoc. M. 296 E262–E271

Goldblatt H, Lynch J, Hanzal RF and Summerville WW 1934The production of persistent elevation of systolic bloodpressure by means of renal ischemia. J. Exp. Med. 59 347–379

Guyton AC 1991 Blood pressure control–special role of thekidneys and body fluids. Science 252 1813–1816

Hatton D C, Brooks V, Qi Y, McCarron DA 1997 Cardiovascularresponse to stress: baroreflex resetting and hemodynamics. AmJ Physiol; 272 R1588–94

Henning EC, Warach S and Spatz M 2010 Hypertension-inducedvascular remodeling contributes to reduced cerebral perfusionand the development of spontaneous stroke in aged SHRSP rats.J. Cerebr. Blood F. Met. 30 827–836

Henry JP 1975 The induction of acute and chronic cardiovasculardisease in animals by psychosocial stimulation. Int. J. Psyc.Med. 6 147–158

Henry JP, Liu YY, Nadra WE, Qian CG, Mormede P, Lemaire V,Ely D and Hendley ED 1993 Psychosocial stress can inducechronic hypertension in normotensive strains of rats.Hypertension 21 714–723

Itoh H, Mukoyama M, Pratt RE, Gibbons GH and Dzau VJ 1993Multiple autocrine growth factors modulate vascular smoothmuscle cell growth response to angiotensin II. J. Clin. Invest.91 2268–2274.



Kang DG, Moon MK, Sohn EJ, Lee DH and Lee HS 2004Effects of morin on blood pressure and metabolic changes infructose-induced hypertensive rats. Biol. Pharm. Bull. 271779–1783

Krieger EM 1964 Neurogenic hypertension in the rat. Circ. Res.15 511–521

Ledingham JM and Pelling D 1970 Haemodynamic and other studiesin the renoprival hypertensive rat. J. Physiol. 210 233–253

Liard JF, Cowley AW Jr, McCaa RE, McCaa CS and Guyton AC1974 Renin, aldosterone body fluid volumes and the barore-ceptor reflex in the development and reversal of Goldblatthypertension in conscious dogs. Circ. Res. 34 549–560

McBryde FD, Guild SJ, Barrett CJ, Osborn JW and Malpas SC2007 Angiotensin II-based hypertension and the sympatheticnervous system: the role of dose and increased dietary salt inrabbits. Exp. Physiol. 92 831–840

McCarty R and Gold PE 1996 Catecholamines, stress, and disease:a psychobiological perspective. Psychosom. Med. 58 590–597

Mullins JJ, Peters J and Ganten D 1990 Fulminant hyperten-sion in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.Nature (London) 344 541–544

Nagase M, Shibata S, Yoshida S, Nagase T, Gotoda T and Fujita T2006 Podocyte injury underlies the glomerulopathy of Dahlsalt-hypertensive rats and is reversed by aldosterone blocker.Hypertension 47 1084–1093

Navarro-Cid J, Maeso R, Perez-Vizcaino F, Cachofeiro V,Ruilope LM, Tamargo J and Lahera V 1995 Effects oflosartan on blood pressure, metabolic alterations, andvascular reactivity in the fructose-induced hypertensive rat.Hypertension 26 1074–1078

Okamoto K and Aoki K 1963 Development of a strain ofspontaneously hypertensive rats. Jpn. Circulation J. 27 282–293

Okamoto K, Yamori Y and Nagaoka A 1974 Establishment ofstroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHR). Circ. Res.34/35 143–153

Ortiz PA and Garvin JL 2001 Intrarenal transport and vasoactivesubstances in hypertension. Hypertension 38 621–624

Osborn O W, Provo B J 1992 Salt-dependent hypertension in thesinoaortic-denervated rat; Hypertension 19 658–62

Papanek PE, Wood CE and Fregly MJ 1991 Role of thesympathetic nervous system in cold-induced hypertension inrats. J. Appl. Physiol. 71 300–306

Quiroz Y, Ferrebuz A, Romero F, Vaziri ND and Rodriguez-Iturbe B2008 Melatonin ameliorates oxidative stress, inflammation,proteinuria, and progression of renal damage in rats with renalmass reduction. Am. J. Physiol.-Renal. 294 F336–F344

Ramchandra R, Barrett C J, Malpas S C 2003 Chronic blockade ofnitric oxide does not produce hypertension in baroreceptordenervated rabbits; Hypertension 42 974–77

Ribeiro MO, Antunes E, De-Nucci G, Lovisolo SM and Zatz R1992 Chronic inhibition of nitric oxide synthesis: a new modelof arterial hypertension. Hypertension 20 298–303

Ryuzaki M, Suzuki H, Kumagai K, Kumagai H, Ichikawa M,Matsumura Y, Saruta T 1991 Role of vasopressin in salt-induced hypertension in baroreceptor-denervated uninephrec-tomized rabbits; Hypertension 17 1085–91

Roberts CK, Vaziri ND, Wang XQ and Barnard RJ 2000Enhanced NO inactivation an hypertension induced by ahigh-fat, refined-carbohydrate diet. Hypertension 36 423–429

Roberts CK, Vaziri ND, Sindhu RK and Barnard RJ 2003 A high-fat, refined carbohydrate diet affects renal NO synthase proteinexpression and salt sensitivity. J. Appl. Physiol. 94 941–946

Sanders BJ and Lawler JE 1992 The borderline hypertensive rat(BHR) as a model for environmentally-induced hypertension: areview and update. Neurosci. Biobehav. R. 16 207–217

Sharma N, Okere IC, Duda MK, Chess DJ, O’Shea KM andStanley WC 2007 Potential impact of carbohydrate and fatintake on pathological left ventricular hypertrophy. Cardiovasc.Res. 73 257–268

Smith TL and Hutchins PM 1979 Central hemodynamics in thedevelopmental stage of spontaneous hypertension in theunanesthetized rat. Hypertension 1 508–517

Steptoe A 1986 Stress mechanisms in hypertension. Postgrad. Med. J.62 697–699

Suzuki H, Saruta T, Ferrario CM and Brosnihan KB 1987Characterization of neurohormonal changes following theproduction of the benign and malignant phases of two-kidney,two-clip Goldblatt hypertension. Jpn. Heart J. 28 413–426

Thrasher TN 2002 Unloading arterial baroreceptors causesneurogenic hypertension. Am. J. Physiol.-Reg. I. 282R1044–R1053

Török J 2008 Participation of nitric oxide in different models ofexperimental hypertension. Physiol. Res. 57 813–825

Trindade Jr AS, Moreira ED, Silva GJJ and Krieger EM 2009Evidence that blood pressure remains under the control ofarterial baroreceptors in renal hypertensive rats. Braz. J. Med.Biol. Res. 42 954–57

Trippodo NC and Frohlic ED 1981 Similarities of geneticspontaneous hypertension. Circ. Res. 48 309–319

Tucker DC and Hunt RA 1993 Effects of long-term air jet noiseand dietary sodium chloride in borderline hypertensive rats.Hypertension 22 527–534

Yamori Y 1989 Predictive and preventive pathology of cardiovas-cular diseases. Acta Pathol. Japon. 39 683–705

Yamori Y, Horie R, Handa H, Sato M and Fukase M 1976Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneouslyhypertensive rats and humans. Stroke 7 46–53

Zeng J, Zhang Y, Mo J, Su Z and Huang R 1998 Two-kidney, twoclip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-pronerats. Stroke 29 1708–1713

Zicha J and Kunes J 1999 Ontogenetic aspects of hypertensiondevelopment: analysis in the rat. Physiol. Rev. 79 1227–1282

Zimmerman RS and Frohlich ED 1990 Stress and hypertension.J. Hypertens. 8 S103–S107

MS received 21 January 2011; accepted 16 May 2011

ePublication: 16 August 2011

Corresponding editor: ASHIMA ANAND



BRIEF COMMUNICATION Open Access

Salt overload in fructose-fed insulin-resistant ratsdecreases paraoxonase-1 activityWaleska Cláudia Dornas1, Wanderson Geraldo de Lima1,2, Rinaldo Cardoso dos Santos3, Melina Oliveira de Souza1,Maísa Silva1, Mirla Fiuza Diniz2 and Marcelo Eustáquio Silva1,3*

Abstract

Paraoxonase 1 (PON1) is a HDL-associated esterase/lactonase and its activity is inversely related to the risk ofcardiovascular diseases. The aim of the present study was to evaluate the effect of a high-salt diet on serum PON1activity in fructose-fed insulin-resistant rats. Adult male Fischer rats were initially divided into two groups. Control(CON), which received a normal salt diet and drinking water throughout the study; high fructose (HF), whichreceived a normal salt diet and 20% fructose supplemented drinking water. After 10 weeks, half of the animals fromHF group were randomly switched to a high-salt diet and 20% fructose supplemented drinking water (HFS) formore 10 weeks. Serum PON1 activity was determined by synthetic substrate phenyl acetate. HFS rats showedmarkedly decreased PON1 activity (HFS rats, 44.3 ± 14.4 g/dL versus CON rats, 64.4 ± 13.3 g/dL, P< 0.05) ascompared to controls. In parallel, the level of oxidative stress, as indicated by thiobarbituric acid reactive substances(TBARS), was increased in HFS rats by 1.2-fold in the liver in relation to controls and was negatively correlated withPON activity. Differential leukocyte counts in blood showed a significant change in lymphocytes and monocytesprofile. In conclusion, these results show that PON1 activity is decreased in fructose-fed insulin-resistant rats on ahigh-salt diet, which may be associated with increased oxidative stress, leading to inflammation.

Keywords: Fructose-fed rats, High-salt diet, Paraoxonase, Atherosclerosis

FindingsDiabetes is a long-term disorder affecting the inner wallsof arteries and is characterized by endothelial dysfunc-tion and oxidative modification of low density lipopro-tein (LDL) which may induce atherosclerosis [1]. Incontrast, it is supposed that LDL particles can be pro-tected from free radical-induced oxidation by an HDLlinked enzyme, paraoxonase 1 (PON1).Although the precise mechanism of PON1 effect is

not yet completely known, it may possess anti-atherogenic and anti-inflammatory properties, resultingfrom its ability to destroy modified phospholipids and toprevent accumulation of oxidized lipids in lipoproteins[2-5]. In diabetes experimental models, it has beenreported that PON1 enzymatic activity is decreased [6,7]

and reduced PON1 activity was suggested to play a rolein the severity of coronary atherosclerosis [2]. Nonethe-less, oxidative stress pathways have also been proposedto act in this process, with increased reactive oxygenspecies (ROS) production and/or impaired antioxidantdefense, which may in turn lead to excessive peroxida-tion of polyunsaturated fatty acids contained in LDLparticles.Our laboratory has recently reported that a hypercho-

lesterolemic diet in rats cause a significant reduction ofPON1 activity, associated with increased oxidative stress[8]. Once rats fed a high dose of fructose are considereda nutritional model for insulin resistance [9-11], thepresent study investigated the effects of a high-salt dietin fructose-fed insulin-resistant rats on PON1 and its in-fluence in serum and oxidative parameters. In additionthe influence of the diets on the inflammatory cells pro-file was also assessed.Twenty-nine Fisher male rats, weighing about 300 g,

obtained from the School of Nutrition of the FederalUniversity of Ouro Preto, were housed in a temperature

* Correspondence: [email protected] in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto,Minas Gerais, Brazil3Department of Foods, School of Nutrition, University of Ouro Preto, MinasGerais, BrazilFull list of author information is available at the end of the article

© 2012 Dornas et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the CreativeCommons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, andreproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63


http://creativecommons.org/licenses/by/2.0

and humidity controlled room with a 12:12-h light/darkcycle (lights on at 06.00 AM). Animals were initiallydivided into two groups. The control group (CON)received the standard AIN93 diet [12] and the highfructose-fed group (HF) was given supplemented fruc-tose as a 20% solution instead of pure water ad libitumto induce insulin resistance. After 10 weeks, HF animalswere divided into 2 groups: those that continued to re-ceive only 20% fructose in water and those switched tothe high fructose regimen+ 8% NaCl in the standardAIN93 diet (HFS). After 20 weeks fasting rats wereanesthetized and sacrificed. The experiments wereapproved by the institutional Ethics Committee withprotocol number 068/2011 and were performed in ac-cordance with the principles of the Brazilian College ofAnimal Experimentation [13].To determine the levels of serum components, blood

samples were collected in test tubes and centrifuged.Serum total protein, albumin, total cholesterol, HDL-cholesterol and triglyceride were assayed with colorimet-ric or enzymatic methods using commercially availablekits Labtest (Lagoa Santa, MG, Brazil) # 99, 19, 76, 13and 87, respectively. The atherogenic index was calcu-lated as follows: total cholesterol - HDL cholesterol/HDL cholesterol.PON activity was measured by a spectrophotometric

assay using phenyl acetate as substrate as described byBeltowski et al. [14]. The enzymatic activity was calcu-lated assuming the molar extinction coefficient of phe-nylacetate to be 1310 L . mol-1 . cm-1. The results wereexpressed in units per milliliter, where 1 U of arylester-ase hydrolyzes 1 mmol of phenylacetate per minute.Basal lipid peroxidation status was measured in the liverby TBARS assay [15].A drop of blood was used to prepare blood smears,

which were stained with Panotic Fast which use essentialcomponents dyes of Romanowsky [16]. Counts of 100leukocytes were performed and the results wereexpressed as subtypes identified in polymorphonuclear(PMN), lymphocyte or monocyte cells.The normality of the sample distribution for each con-

tinuous parameter was tested with the Kolmogorov-Smirnov test. The significance of any differences in pro-portions or medians was tested with Kruskal-Wallis test,and in means analysis of variance (ANOVA) was used,followed by Dunns and Tukey test, respectively. Pear-son’s correlation coefficients were used to test the cor-relation among variables. A p-value of less than 0.05 wasconsidered statistically significant.A high-salt diet in fructose-fed insulin-resistant rats

significantly decreased serum levels of total protein, al-bumin, total cholesterol and HDL-cholesterol after 20wk of treatment in relation the control group as demon-strated in Table 1. Fructose-fed rats showed significantly

higher triglyceride concentrations in both HF and HFSgroups (P< 0.05) as compared to control rats. Theatherogenic index of each experimental group was alsocalculated and increased 66% in HFS rats as comparedto controls. PON1 activity markedly fell to 68% in thoseanimals, as compared to control and HF rats (P< 0.05and P< 0.01, respectively) (Table 1).Increased oxidative stress was noted in the liver

obtained fromHFS rats, sinceTBARS levels were raised by1.2 times (P< 0.05) as compared to controls (Figure 1A).When data from all experimental groups were analyzedtogether, the effects of all treatments on serum PON1activity were positively correlated with total protein(r = 0.7728, P< 0.001) (Figure 1B), albumin (r = 0.8142,P< 0.001) (Figure 1C), total cholesterol (r = 0.6228, P< 0.001) (Figure 1D) and HDL-cholesterol (r = 0.6145,P< 0.001) (Figure 1E). In addition, a negative correl-ation was found between serum PON1 activity andliver TBARS levels (r =− 0.6262, P< 0.01) (Figure 1F).Differential leukocyte counts in the total blood smear

in insulin-resistant rats treated or not with the high-saltdiet showed a significant decrease in the lymphocyteprofile in relation to the control group, but the percent-age of polymorphonuclear cells (PMNs) remained un-changed. Salt treatment caused a significant increase inthe monocyte profile in HF and HFS rats as comparedto the CON rats (Table 2).In this study we observed a decrease in serum PON1

activity in insulin-resistant rats on a high-salt diet andan association among PON1, oxidative stress and in-flammation, which can occur during the development ofatherosclerosis.HDL is the most powerful independent negative pre-

dictor of cardiovascular events. The protective effects of

Table 1 Serum total protein, albumin, triglyceride, totalcholesterol, HDL-cholesterol, atherogenic index andPON1 activity of experimental rats after 20 weeks oftreatment

CON HF HFS

Number of rats/group 9 10 10

Total protein (g/dL) 7,0 ± 2,0a 6,3 ± 1,8a 4,9 ± 1,5b

Albumin (g/dL) 2,8 ± 0,2a 2,6 ± 0,3a 2,1 ± 0,2b

Triglyceride (mg/dL) 126,1 ± 30,8b 183,5 ± 58,7a 197,1 ± 55,9a

Total cholesterol (mg/dL) 97,9 ± 20,9a 98,0 ± 13,3a 69,3 ± 9,0b

HDL-cholesterol (mg/dL) 66,4 ± 10,6a 65,8 ± 9,4a 43,6 ± 12,17b

Atherogenic index 0,39 ± 0,12b 0,47 ± 0,11b 0,65 ± 0,26a

PON1 (g/dL) 64,45 ± 13,36a 65,44 ± 17,29a 44,3 ± 14,43b

Values (mean ± SD) were obtained from groups CON (AIN diet and water for20 weeks); HF (AIN diet + 20% fructose solution in water for 20 weeks) andHFS (8% NaCl in AIN93 diet + 20% fructose solution in water for 10 weeks afterprevious treatment for a period of 10 weeks with HF). Different superscriptletters within the same row indicate significant difference at P< 0.05 byone-way ANOVA followed by Tukey’s test. High-density lipoprotein (HDL);paraoxonase1 activity (PON1).

Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63 Page 2 of 5http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63

HDL have been first attributed to its capacity to pro-mote cellular cholesterol efflux from peripheral cells anddeliver it to the liver for excretion, a process known asreverse cholesterol transport [1]. Furthermore HDL hasalso attracted particular attention because of its antioxi-dative potential. Interestingly this work sustains the rela-tionship between low paraoxonase activity and diseaseswith low antioxidant defense and excessive lipid peroxi-dation since paraoxonase may act protectively in athero-genesis by hydrolyzing some products of lipidperoxidation and consequently by limiting LDL oxida-tion and foam cell formation [17].In our model, serum albumin and protein levels are

reduced probably due to protein synthesis disruption in

the liver as observed by Shinn and Moon [18]. Thedamaged hepatocytes are potent sources of reactive oxy-gen intermediates and oxidative stress is important inmany types of liver injury. Lipid peroxidation, which wasfound increased in this study, could change the proper-ties of biological membranes, resulting in severe celldamage and play a significant role in the mechanismsrelated to the alterations observed by us, as it has beenpreviously documented [19].In rats, unlike in humans and rabbits, plasma triglycer-

ides and cholesterol are transported predominantly byHDL [14] and fructose per se, after having reached theliver, may contribute to the increase in serum triglycer-ide as demonstrated in this study and by others authors[9,20,21]. We showed that low PON1 activity is asso-ciated with decreased HDL levels and this contributes tothe hypothesis that PON1 is involved in the preservationof HDL. Since PON1 exerts a protective effect againstoxidative stress, it is logical to find an association be-tween this enzyme and liver impairment. PON1 activitydecreased while lipid peroxidation increased in HFS rats,suggesting that PON1 activity may be involved in thedefense against free radical production in liver orga-nelles. Moreover, the atherogenic index of these animalsindicated them to be more susceptible to the develop-ment of atherosclerosis. However the results of thisstudy showed that PON1 activity towards synthetic

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

CON HFHFS

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

a

b b

TB

AR

S (

nm

ol/m

g p

tn)

0 5 10 150

20

40

60

80

100

r = 0.7728P < 0.001

Total protein (g/dL)

PO

N1

(g/d

L)

1.5 2.0 2.5 3.0 3.50

20

40

60

80

100

r = 0.8142P < 0.001

Albumin (mg/dL)

PO

N1

(g/d

L)

0 50 100 1500

20

40

60

80

100

r = 0.6228P < 0.001

total-cholesterol (mg/dL)

PO

N1

(g/d

L)

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

r = 0.6145P < 0.001

HDL-cholesterol (mg/dL)

PO

N1

(g/d

L)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.00

20

40

60

80

100

r = - 0.6262P < 0.01

TBARS (nmol/mg protein)

PO

N1

(g/d

L)

Figure 1 (A) Liver TBARS levels; scatter plots illustrating the association between (B) PON1 and total protein and (C) albumin and (D)Total cholesterol and (E) HDL-cholesterol and (F) TBARS in experimental groups. Control (dark filled circle); high-fructose (dark filled triangle)and high-fructose + salt (dark filled square) rats. High-density lipoprotein (HDL); paraoxonase1 activity (PON1).

Table 2 Polymorphonuclear cells, lymphocytes andmonocytes count of experimental rats after 20 weeks oftreatment

CON HF HFS

PMN cells (%) 5-15 3-27 7-23

Lymphocytes (%) 19-58 4-33** 7-20***

Monocytes (%) 27-76 36-85** 40-83*

Values were obtained from groups CON (AIN diet and water for 20 weeks); HF(AIN diet + 20% fructose solution in water for 20 weeks), and HFS (8% high saltin AIN93 diet + 20% fructose solution in water for 10 weeks after previoustreatment for a period of 10 weeks with HF). Kruskall Wallis test followed byDunns test. Values indicate lowest and highest percentage of cells countedrespectively. *P< 0.05; **P< 0.01; ***P< 0.001. Polymorphonuclear (PMN) cells.


substrates reflects its relationship to oxidative stress bymeans of the marker used but this hypothesis needs sup-port by means of further investigation.A previous study has shown that PON1 protects

against atherosclerosis, by its ability to reduce macro-phage foam cell formation, via reducing oxidative stressand stimulation of cholesterol efflux from macrophages[22]. The present study proposes that oxidatively modi-fied LDL impair endothelial function, stimulate inflam-matory response of monocytes/macrophages, activatemigration and proliferation of vascular smooth musclecells and induce immune response, as indicated by theincrease of monocytes in HF and HFS groups. Therefore,inactivation of PON1 in HFS rats could reduce theability of HDL to inhibit LDL modification and alsodecrease the ability of HDL to inhibit monocytic-endothelial interactions. Both conditions appear to beimportant in the inflammatory response in arterial wallcells, as demonstrated by the change in lymphocyteprofile in relation to the control group, since this is acommon finding during the systemic inflammatory re-sponse. In addition, clinical and animal studies suggestthat low lymphocyte count plays a putative role inchronic inflammation [23].Our dietetic model was chosen due its relevance to

human nutrition because it mimics a common Westerndiet, with high consumption of sugar drinks and saltyfoods and this study is the first one to show an associ-ation between paraoxonase status and salt overload ininsulin-resistant rats. This supports the relationship be-tween low PON1 activity and diseases with low antioxi-dant defense and excessive lipid peroxidation.Paraoxonase may perform protectively in atherogenesisby hydrolyzing some products of lipid peroxidation andconsequently by limiting LDL oxidation and foam cellformation [24]. This allows us to hypothesize that para-oxonase activity may lead to failure in the protection ofLDL oxidation in insulin-resistant subjects on a high-saltdiet. Thus the lack of prevention of LDL oxidation byHDL could be explained by the quantitative alteration ofHDL, since PON1 generally seems to contribute to theantioxidant properties of HDL.In conclusion, the present study indicates that a high-

salt diet in fructose-fed rats leads to lowered serumPON1 activity, with deleterious effects on the antioxi-dant defense system. Furthermore, we suggest that achange in blood cells profile would reflect the oxidativestress detected. These findings we believe to be relevantin the field of human nutrition.

AbbreviationsHDL: High-density lipoprotein; LDL: Low-density lipoprotein;PMNs: Polymorphonuclear; PON: Paraoxonase1; ROS: Reactive oxygenspecies; TBARS: Thiobarbituric acid reactive substances.

Competing interestsThe authors declare that they have no competing interests.

Author details1Research in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto,Minas Gerais, Brazil. 2Department of Biological Sciences, Institute of Exact andBiological Sciences, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.3Department of Foods, School of Nutrition, University of Ouro Preto, MinasGerais, Brazil.

Author’s contributionsWCD and MES participated in the design of the study, interpretation of dataand edited the manuscript. WCD, MOS, MS, MFD collected the data. RCSmade substantial contributions in revising it critically for intellectual content.WGL contributed to the discussion of data and statistical analysis. MEScoordinated the study. All authors read and approved the final version of themanuscript.

Received: 29 March 2012 Accepted: 27 June 2012Published: 27 June 2012

References1. Mertens A, Holvoet P: Oxidized LDL and HDL: antagonists in

atherogenesis. FASEB J 2001, 15:2073–2084.2. Durrington PN, Mackness B, Mackness MI: Paraoxonase and

atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001, 21:473–480.3. Navab M, Ananthramaiah GM, Reddy ST, Van Lenten BJ, Ansell BJ, Fonarow

GC, Vahabzadeh K, Hama S, Hough G, Kamranpour N, Berliner JA, Lusis AJ,Fogelman AM: The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role ofoxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res 2004, 45:993–1007.

4. Richter RJ, Jarvik GP, Furlong CE: Paraoxonase 1 status as a risk factor fordisease or exposure. Adv Exp Med Biol 2010, 660:29–35.

5. Précourt LP, Amre D, Denis MC, Lavoie JC, Delvin E, Seidman E, Levy E: Thethree-gene paraoxonase family: physiologic roles, actions and regulation.Atherosclerosis 2011, 214:20–36.

6. Silva M, Lima WG, Silva ME, Pedrosa ML: Effect of streptozotocin on theglycemic and lipid profiles and oxidative stress in hamsters. Arq BrasEndocrinol Metabol 2011, 55:46–53.

7. Alp H, Varol S, Celik MM, Altas M, Evliyaoglu O, Tokgoz O, Tanrıverdi MH,Uzar E: Protective effects of beta glucan and glicazide on brain tissueand sciatic nerve of diabetic rats induced by streptozonin. Exp DiabetesRes 2012, 2012:230342.

8. de Souza MO, Silva M, Silva ME, Oliveira Rde P, Pedrosa ML: Dietsupplementation with acai (Euterpe oleracea Mart.) pulp improvesbiomarkers of oxidative stress and the serum lipid profile in rats.Nutrition 2010, 26:804–810.

9. Thorburn AW, Storlien LH, Jenkins AB, Khouri S, Kraegen EW: Fructose-induced in vivo insulin resistance and elevated plasma triglyceride levelsin rats. Am J Clin Nutr 1989, 49:1155–1163.

10. Mayes PA: Intermediary metabolism of fructose. Am J Clin Nutr 1993,58:754S–765S.

11. Bezerra RM, Ueno M, Silva MS, Tavares DQ, Carvalho CR, Saad MJ: A highfructose diet affects the early steps of insulin action in muscle and liverof rats. J Nutr 2000, 130:1531–1535.

12. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 purified diets for laboratoryrodents: final report of the American Institute of Nutrition and hocwriting committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. JNutr 1993, 123:1939–1951.

13. Colégio Brasileiro de Experimentação Animal: Princípios éticos naexperimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. SãoPaulo: COBEA; 1991.

14. Bełtowski J, Wójcicka G, Mydlarczyk M, Jamroz A: Cerivastatin modulatesplasma paraoxonase/arilesterase activity and oxidant-antioxidantbalance in the rat. Pol J Pharmacol 2002, 54:143–150.

15. Buege JA, Aust SD: Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978,52:302–310.

16. de Oliveira RB, de Paula DA, Rocha BA, Franco JJ, Gobbo-Neto L, UyemuraSA, dos Santos WF, Da Costa FB: Renal toxicity caused by oral use ofmedicinal plants: the yacon example. J Ethnopharmacol 2011, 27:434–441.

17. Watson A, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Fuall KF, Fogelman AM, NavabM: Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase:


inhibition of the biological activity of minimally oxidized low densitylipoprotein. J Clin Invest 1995, 96:2882–2891.

18. Shin MO, Moon JO: Effect of dietary supplementation of grape skin andseeds on liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine in rats. Nutr ResPract 2010, 4:369–374.

19. Camps J, Marsillach J, Joven J: Measurement of serum paraoxonase-1activity in the evaluation of liver function. World J Gastroenterol 2009,15:1929–1933.

20. Busserolles J, Gueux E, Rock E, Demigné C, Mazur A, Rayssiguier Y:Oligofructose protects against the hypertriglyceridemic and pro-oxidative effects of a high fructose diet in rats. J Nutr 2003,133:1903–1908.

21. D’Angelo G, Elmarakby AA, Pollock DM, Stepp DW: Fructose feedingincreases insulin resistance but not blood pressure in Sprague–Dawleyrats. Hypertension 2005, 46:806–811.

22. Rosenblat M, Karry R, Aviram M: Paraoxonase 1 (PON1) is a more potentantioxidant and stimulant of macrophage cholesterol efflux whenpresent in HDL than in lipoprotein-deficient serum: relevance todiabetes. Atherosclerosis 2006, 187:74–81.

23. Núñez J, Miñana G, Bodí V, Núñez E, Sanchis J, Husser O, Llàcer A: Lowlymphocyte count and cardiovascular diseases. Curr Med Chem 2011,18:3226–3233.

24. Bełtowski J, Wójcicka G, Mydlarczyk M, Jamroz A: The effect of peroxisomeproliferator-activated receptors alpha (PPARalpha) agonist, fenofibrate,on lipid peroxidation, total antioxidant capacity, and plasmaparaoxonase 1 (PON1) activity. J Physiol Pharmacol 2002, 53:463–475.

doi:10.1186/1743-7075-9-63Cite this article as: Dornas et al.: Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1 activity. Nutrition & Metabolism2012 9:63.

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High dietary salt decreases antioxidant defenses in the liver of fructose-fedinsulin-resistant rats

Waleska Claudia Dornasa, Wanderson Geraldo de Limaa,b, Rinaldo Cardoso dos Santosc,Joyce Ferreira da Costa Guerraa, Melina Oliveira de Souzaa, Maísa Silvaa, Lorena Souza e Silvaa,

Mirla Fiuza Dinizb, Marcelo Eustáquio Silvaa, c,⁎

aResearch in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, BrazilbDepartment of Biological Sciences, Institute of Exact and Biological Sciences, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil

cDepartment of Foods, School of Nutrition, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil

Received 23 November 2012; received in revised form 25 April 2013; accepted 14 June 2013

Abstract

In this study we investigated the hypothesis that a high-salt diet to hyperinsulinemic rats might impair antioxidant defense owing to its involvement in theactivation of sodium reabsorption to lead to higher oxidative stress. Rats were fed a standard (CON), a high-salt (HS), or a high-fructose (HF) diet for 10 weeksafter which, 50% of the animals belonging to the HF group were switched to a regimen of high-fructose and high-salt diet (HFS) for 10 more weeks, while theother groups were fed with their respective diets. Animals were then euthanized and their blood and liver were examined. Fasting plasma glucose was found tobe significantly higher (approximately 50%) in fructose-fed rats than in the control and HS rats, whereas fat liver also differed in these animals, producingsteatosis. Feeding fructose-fed rats with the high-salt diet triggered hyperinsulinemia and lowered insulin sensitivity, which led to increased levels of serumsodium compared to the HS group. This resulted in membrane perturbation, which in the presence of steatosis potentially enhanced hepatic lipid peroxidation,thereby decreasing the level of antioxidant defenses, as shown by GSH/GSSG ratio (HFS rats, 7.098±2.1 versus CON rats, 13.2±6.1) and superoxide dismutase(HFS rats, 2.1±0.05 versus CON rats, 2.3±0.1%), and catalase (HFS rats, 526.6±88.6 versus CON rats, 745.8±228.7 U/mg ptn) activities. Our results indicate thatconsumption of a salt-rich diet by insulin-resistant rats may lead to regulation of sodium reabsorption, worsening hepatic lipid peroxidation associated withimpaired antioxidant defenses.© 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: high-salt diet; fructose-fed rats; oxidative stress; steatosis; antioxidant defenses

1. Introduction

Increasing evidence suggests the involvement of oxidative stressin insulin resistance [1] and has generated high interest in the role offree radicals in the maintenance of adequate levels of antioxidantdefenses [2,3]. In type 2 diabetes, a significant inverse correlationexists between hepatic fat load and the antioxidant defense system[4], which may prevent generation of an adequate compensatoryresponse for restoration of cellular redox balance [5]. In particular,

changes have been demonstrated in some components of the freeradical defense system in different models [6–8].

We observed that the expression of genes encoding the antiox-idant enzymes glutathione peroxidase (GPx), gamma-glutamylcys-teine synthetase and superoxide dismutase (SOD) decreased in theliver tissue of streptozotocin-induced diabetic rats because ofincreased oxidative stress [9] associated with overproduction ofreactive oxygen species (ROS)[10]. Under normal conditions, almostall of the produced superoxide anions (O2

−) are converted tohydrogen peroxide (H2O2) by the action of SOD, which is furtherdetoxified to water by catalase (CAT) or GPx [11]. Howeverhyperglycemia induce the overproduction of O2

− [12] and dramaticchange in the oxidant/antioxidant balance has been postulated to playa role in the pathogenesis of diabetes.

Increasing the sugar intake has been reported to result indyslipidemia, as indicated by elevated levels of serum triglycerides,cholesterol, and low-density lipoproteins [13,14].These underlyingmetabolic disturbances appear to induce insulin resistance commonlyobserved in high-fructose fed human and animal models [15] whenfructose consumption causes progressive liver disease stimulated

Available online at www.sciencedirect.com

ScienceDirect

Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx

Abbreviations: AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine amino-transferase; CAT, Catalase; GFR, Glomerular filtration rate; GSH, Reducedglutathione; GSSG, Oxidized glutathione; GPx, Glutathione peroxidase (GPx);HOMA, Homeostasis model assessment; ROS, Reactive oxygen species; O2

−,Superoxide anions; SOD, Superoxide dismutase; TBARS, Thiobarbituric acidreactive substances.

⁎ Corresponding author. Research in Biological Sciences - NUPEB, FederalUniversity of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.

E-mail addresses: [email protected] (W.C. Dornas);[email protected] (M.E. Silva).

0955-2863/$ - see front matter © 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2013.06.006

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09552863

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09552863

http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2013.06.006






lipogenesis [16]. Furthermore, despite recent advances in elucidatingthe pathogenesis of related conditions, studies have shown thatpresence of insulin resistance and compensatory hyperinsulinemiawould lead to sodium retention [17].

Therefore in the present study we examined whether a high-saltdiet could impair antioxidant defenses in the liver of fructose-fed ratsdue activation of enhanced renal sodium reabsorption potentiatingoxidative stress.

2. Materials and methods

2.1. Animal and diets

Forty-five male 12-week-old Fischer rats, weighing approximately 300 g, wereindividually housed in a temperature-and humidity-controlled room under a 12 hlight/dark regimen. Initially, the rats were randomly assigned to three experimentalgroups (n=10–12) as follows: the control group (CON), fed with the AIN93M diet [18]and water; the high-salt group (HS), fed with the AIN93M diet plus 8% w/w NaCl andwater; and the high-fructose group (HF), fed with the AIN93M diet and a 20% w/vfructose solution as drinking water. After 10 weeks of treatment, the animals belongingto the HF group were further divided into 2 groups: rats that continued to be fed on thefructose solution (HF) and rats that were switched to a high-fructose + high-saltregimen (HFS) for 10 more weeks. Details of the experimental diets are given inTable 1. Food and water were provided ad libitum and their intake was measured. Atthe end of the experimental period, the rats were fasted for 12 hours, anesthetized withisoflurane and euthanized by total blood collection from the brachial plexus. The bloodwas centrifuged at 1500g for 15 min. One liver lobule from each animal was separatedfor histological analysis and the rest was frozen at−80°C until further analysis. All theprocedures were approved by the Ethical Committee for Animal Care and Use of theFederal University of Ouro Preto.

2.2. Biochemical determinations

Serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) activitiesand plasma glucose concentration were determined using commercial kits fromLabtest Diagnostica SA (Lagoa Santa, MG, Brazil) # 108, 109 and 84, respectively, byfollowing the manufacturer’s instructions. ELISA was utilized to quantify plasmainsulin and leptin levels using commercial kits from Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA,Crystal Chem Downers Grove, IL, USA, and Rat Leptin ELISA Kit, Linco Research, USA,(Catalog #90060 and #90040, respectively). The homeostasis model assessment(HOMA), described by Matthews et al. [19] as a measure of insulin resistance, wascalculated using the formula [insulin (μmol/ml)×glucose (mM/L)/22.5]. Hepatic fatwas extracted using a chloroform-methanol mixture (2:1, v/v) according to themethod of Folch et al. [20] and the total lipids were quantified gravimetrically byevaporating the solvents in the extract. Sodium concentrations were measured byflame photometry (Olidef model C-71 apparatus; São Paulo, Brazil).

2.3. Antioxidant defenses and oxidative stress

Liver SOD activity was measured by the method of Marklund and Marklund [21].One unit of SOD activity was defined as the amount of enzyme that inhibited the rate ofautoxidation of pyrogallol by 50%, which was determined at 570 nm. Catalase activitywas measured according to Aebi [22] and was expressed in units per milligram ofprotein using the extinction coefficient of 0.0394 L/mmol/L/cm. The rate of H2O2

decomposition was followed by monitoring absorption at 240 nm in 50 mM phosphatebuffer, pH 7.0, containing 5 mM H2O2. Tissue protein content was determinedaccording to the method developed by Lowry et al. [23] using bovine serum albumin asthe standard. The total glutathione (GSH + GSSG) was measured after precipitation of

proteins with an equal volume of 4% sulfosalicylic acid using the enzymatic methodpreviously described [24]. Oxidized glutathione (GSSG) was determined afterderivatization of total GSH with 2-vinylpiridine. Oxidative stress index was calculatedfrom the GSH/GSSG ratio and by lipid peroxidation status through of levels ofthiobarbituric acid reactive substances (TBARS) as described by Buege and Aust [25].

2.4. Liver histology

After removal from each animal, the livers were immediately fixed in 10% bufferedformaldehyde, embedded in paraffin, cut (4-μm thickness) and mounted on glassslides. The sections were deparaffinized in xylene, stained with hematoxylin and eosin(H&E) using the standard technique and then examined. Histological examination ofthe slides was performed by using concentrated light microscope equipped withphotographic digital camera (DM5000; Leica) with software Qwin Plus. Scoring of theslides was performed using a semi-quantitative method reported by Brunt et al. [26].Fat degeneration was graded according to the percentage of fat-containing hepato-cytes. Grade of vesicular steatosis according to the original system involved 10 grades,whereas in this system, steatosis was graded from 0–4 based on the percentage ofhepatocytes involved in the biopsy (0, none; 1, 10%; 2, 10–33%; 3, 33–66% and 4, N66%).

2.5. Statistical analysis

Normality of the sample distribution for each continuous parameter was testedwith the Kolmogorov–Smirnov test. The significance of any differences in proportionsof medians was tested with Kruskal–Wallis test and in means by one-way analysis ofvariance (ANOVA), followed by Dunns and Tukey tests, respectively. Correlationanalysis was used tomeasure the degree to which 2 variables were related. Significancefor all measures was defined when Pb.05. GraphPad Prism version 5.00 for Windows(San Diego, CA, USA) was used for statistical analyses.

3. Results

Notably, the mean food intake was significantly different amongstdifferent dietary groups. In relation to the control group, high dietaryNaCl resulted in a lower caloric value leading to higher food intake inHS rats (Pb.01). On the other hand, fructose supplementation led tolower food intake (Pb.001) due to its energy content (Fig. 1A). Meanvalues for liquid intake were significantly higher in the high-saltgroups (Pb.001) than in the CON and HF groups (Fig. 1B). Higherfructose intake lowered the energetic demand for solid food (Pb.001)in HFS rats than in other groups (Fig. 1C). The high-salt diet led toincreased liquid intake, thus compelling HS and HFS rats to drinkapproximately 4.0 and 3.0 times the liquid volumes consumed by theCON animals, respectively, resulting in the corresponding differencesin the liquid calorie intake of HFS rats drinking the fructose solution(Pb.001) in relation to HF rats (Fig. 1D). There were no significantdifferences in the total energy intake (Fig. 1E). Moreover, plasmaleptin concentrations in HF rats was higher (Pb.01) compared to thatin other groups (Fig. 1F).

The average final body weight was lower in HFS rats than in HFand CON rats (Pb.05). Relative liver weights were higher (Pb.05) infructose-fed rats (HF and HFS) and a corresponding increase wasobserved in the liver lipid content and plasma glucose in fructose-fedrats in relation to CON (Pb.05) and HS (Pb.001). The highest insulinconcentration was found in HFS rats (Pb.05) and HOMA analysisrevealed that this group had significantly higher values than thecontrols animals (Pb.01), thereby indicating that the combination ofdietary fructose with NaCl in HFS rats impaired insulin response. Fordetermination of whether the dietary treatment induced liver injury,serum AST and ALT activities were examined, and ALT but not AST inthe HF group were found to be significantly higher than that of thecontrol group (Pb.05). Augmented natriuretic response to a high-saltdiet significantly decreased serum sodium in HS rats compared to thatin other groups (Pb.05) and particularly HFS showed a substantialincrease in relation to the HS group (Table 2).

Photomicrographs of hepatic specimens stained with H&E areshown in Fig. 2A–D, and the scores of histological variables arepresented as medians in Fig. 2E. Mild or no hepatic steatosis occurredin CON rats (Fig. 2A). HS rats did not show predominant occurrence ofsteatosis, but hyperemic vessels were observed in the parenchyma

Table 1Diets composition

Ingredient Composition (g/kg diet)

CON HS HF3 HFS3

Starch 622.5 542.5 622.5 542.5Casein 140.0 140.0 140.0 140.0Sucrose 100.0 100.0 100.0 100.0Salt - 80.0 - 80.0Cellulose 50.0 50.0 50.0 50.0Fat 40.0 40.0 40.0 40.01Minerals 35.0 35.0 35.0 35.02Vitamins 10.0 10.0 10.0 10.0Choline 2.5 2.5 2.5 2.5Energy content (kcal/kg) 3810 3490 3810 3490

1Mineral mixture for AIN93M; 2Vitamin mixture for AIN93M; 3D-Fructose (SynthLab-synth, São Paulo, Brazil).

2 W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx

cells (Fig. 2B). As expected, the high fructose treatment causedhepatic lipid accumulation, which was evident in both HF and HFSrats (Fig. 2C and 2D) with no signs of necroinflammation. Fatdeposition in the HF group was classified as macrovesicular, whilelivers of HFS rats showed mainly a microvesicular pattern with lessergrade of lipid accumulation in relation to HF rats. A statisticallysignificant higher steatosis score (Pb.05) was seen in livers from HFcompared to CON animals (Fig. 2E).

Compared with the control group, the hepatic levels of totalglutathione and GSH were significantly lower in the HFS group(Pb.01), although no significant difference was observed in the GSSGlevels (Fig. 3). The GSH/GSSG ratio was calculated to determinewhether oxidative stress had been augmented and was found to belower in HFS rats than in control rats (Pb.01). Assessment of lipidperoxidation showed damage in hepatocytes, as verified throughTBARS content of HFS in relation to CON animals (Pb.05). Further-more, a progressive functional deficiency in antioxidant defenses wasalso evidenced in the HFS group, with a significant decrease in SODand CAT activities, (Pb.05; Pb.001, respectively) in relation to the CONgroup. Additionally, a negative correlation was found between TBARS

and GSH/GSGG ratio (r=−0.40, Pb.01), SOD (r=−0.56, Pb.0005) andCAT activities (r=−0.50, Pb.002) (Table 3).

4. Discussion

The present study suggested that the osmotic load caused byaugmenting dietary NaCl increased plasma osmolality, stimulatedthirst, and enhanced liquid intake, as observed by Manesh et al. [27].Studies in both rats [28] and humans [29] have reported that chronicfructose ingestion is associated with increase in plasma leptin levelsand leptin resistance, which alters the information that is relayed tothe central nervous system on energy intake and body fat stores forregulation of food intake and energy homeostasis [30]. Roglans et al.[31] reported that this increase precedes obesity, suggesting that theliver is a key organ in the development of metabolic derangementsinduced by fructose consumption. Nevertheless, in our study thisincrease of leptin levels only in HF rats occurred in the absence ofaugmented body weight: HF and control rats had the same bodyweight, although leptin potently activates cellular fuel consumptionby stimulating fatty acid oxidation and reducing lipogenesis [32].

On the other hand, while fructose is more soluble, sweeter, andless glucogenic than glucose or sucrose and has been recommendedas a replacement for these sugars in the diets of diabetic and obesepeople, it is lipogenic and usually causes greater elevation intriglyceride levels [3]. Significant differences due to fructose diet-induced development of fatty liver were observed in our experiments,as well as in other studies [33,34]. Fructose treatment-inducedincreased fatty liver and consequent hepatomegaly was found in HFand HFS animals. Fructose-fed rats served as a model for diet-inducedinsulin resistance, suggesting that pathophysiological mechanismsand lipid retention in hepatocytes (hepatic steatosis) was animportant early sign in the development of a metabolic abnormalitiesspectrum. Our model was thus proved appropriate because itreproduced histologically detectable steatosis resulting primarilyfrom the deposition of fat in hepatocytes of fructose-fed rats.However, our results demonstrated that HFS rats consumed morefructose than HF rats did, but displayed lower degree of steatosis

A B C

CON HS HF HFS0

5

10

15

20

25 a

bc

d

Fo

od

inta

ke/d

ay (

g)

CON HS HF HFS0

20

40

60

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b

cc

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uid

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ke/d

ay (

mL

)

CON HS HF HFS0

20

40

60

80

100a

aa

b

En

erg

y in

take

fro

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(kc

al)

D E F

CON HS HF HFS0

10

20

30

40a

b

En

erg

y in

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uid

/day

(kc

al)

CON HS HF HFS50

60

70

80

90

To

tal e

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ke/d

ay(k

cal)

CON HS HF HFS0

5

10

15

20a

bb

b

Lep

tin

(n

g/m

L)

Fig. 1. Food, fluid, caloric intake and serum leptin of experimental rats. Symbols represent the animals in scatter plots to each group. Different letters indicate significant differences atPb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test. Control diet (CON); high-salt diet (HS); high-fructose diet (HF); high-fructose and salt (HFS) diet for 10 weeks after previoustreatment for a period of 10 weeks with HF.

Table 2Characteristics of experimental rats

Variable Treatments

CON HS HF HFS

Initial body weight, g 295.0±21.5 295.1±23.1 295.1±22.2 294.4±28.5Final body weight, g 451.2±29.5a 428.2±28.2ab 448.2±36.9a 412.0±17.2b

Absolute weight liver, g 12.6±1.8ab 11.7±1.5b 13.7±1.9a 13.0±1.3ab

Relative liver weight, mg/g 27.8±3.0b 27.0± 2.3b 30.6±2.4a 31.6±1.3a

Total fat liver, mg/g 53.3±6.0b 42.5±4.4b 73.4±17.3a 72.6±12.6a

Plasma glucose, mmol/L 8.0±0.9b 8.7±1.1b 11,9±1.8a 12.7±1.6a

Plasma insulin, μmol/ml 20.9±13.1b 27.7±14.2b 34.0±19.4b 45.1±25.8a

HOMA-IR, score 7.6±5.4b 11.0±7.0b 17.4±11.1b 23.2±16.4a

Serum AST, U/L 56.8±17.3 56.8±16.3 58.3±17.3 57.1±16.0Serum ALT, U/L 16.0±5.4b 25.2±11.2ab 28.7±11.6a 24.8±7.2ab

Serum sodium, mmol/L 142.9±5.3a 127.6±4.5b 140.8±8.1a 135.8±4.5a

Values are expressed as means±S.D. Different letters within the same row indicatesignificant differences at Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test.

3W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx

development. This may indicate that the high-salt diet model, as inother studies, attenuated gain in body weight [35,36], which can leadto lower accumulation of fat in hepatocytes, as supported by our data.Determination of liver function parameters also revealed liverdysfunction due to fructose-feeding and hepatic damage in fruc-tose-fed rats. Fructose feeding was found to significantly enhanceserum ALT activity, indicating considerable hepatocellular injury inHF rats. ALT has been routinely measured and is considered asurrogate marker of liver fat accumulation [37]. Injury to thehepatocyte leads to disruption of the plasma membrane and leakageof the enzyme to the extracellular fluid. Thus it can be detected atabnormal levels in the serum and this condition may be a cause ofhepatocyte death.

Rats are an excellent animal model to study the effects offructose intake because their fructose metabolism closely re-

sembles that of humans [38] and studies have shown that fructoseinduces hyperglycemia and hyperinsulinemia [39,40]. The resultsdemonstrated that fructose administration produces insulin resis-tance in HFS rats consistently with previous studies carried outusing different techniques to assess insulin resistance [40,41].Insulin resistance in fructose-fed rats has been attributed to a lowlevel of insulin-stimulated glucose oxidation due to modificationsin the post-receptor cascade of insulin action [42]. Thus elevatedplasma insulin concentrations enhance the synthesis of very-low-density lipoprotein, and this may induce increase in fatty liver asobserved by us in HF and HFS rats with decreased in response ofHFS rats to glucose utilization, featuring a lower insulin action asindicated by higher HOMA values. In contrast, Nishimoto et al. [43]used fructose-fed insulin-resistant rats with a low or high-sodiumdiet and found no significant differences in plasma glucose or

Fig. 2. (A-D) Representative photomicrographs H&E staining of liver sections of experimental rats. Hepatocytes abnormalities were not observed in the CON group (A); note hyperemicvessels (arrowhead) and normal parenchyma appearance in the HS group (B); aspect of macrovesicular steatosis in the HF group (C). Note hepatocytes with a large negative image inthe cytoplasm with nucleus displaced into the periphery of the cell, large fat globule in most cases (white arrow); aspect of microvesicular steatosis in the HFS group (D). Note cellswith small cytoplasmic vacuoles without displaced nucleus (black arrow) magnification ×440. Grade of liver steatosis of rats in experimental groups (E). Values (medianne, n=8–11)(*Pb.05 vs. control rats).


insulin among their groups, although they used a lower dosage forboth salt and fructose than in our study. This discrepancy amongstudies may be better explained by the fact that diet-inducedmodifications in metabolic and hormonal profile are probablydependent on the duration of diet treatment, on the amount ofcarbohydrate and salt in the diet besides interactions with othernutrients [44–46].

Our model was based on the administration of a high-fructose dietinducing insulin resistance that resembles the so-called ‘fast food’that is highly popular nowadays. This type of diet constitutes animportant, typically westernized lifestyle, which includes consump-tion of processed foods that are high in salt and sugar. Fructose hasbeen broadly used in metabolic studies, although there is no dataconcerning liver abnormalities associated with ‘high-salt’ regimens.In this study, the high-salt diet led to greater urinary excretion ofsodium, but hyperinsulinemia showed in HFS rats has influence onsodium retention as demonstrated by higher serum sodium concen-trations in HFS when compared with the HS group. This antina-

triuretic effect may be opposed by a concomitant decrease inproximal tubular sodium reabsorption [47] or an increase inglomerular filtration rate (GFR) [48]. Chronic hyperinsulinaemiaincreases GFR in normal dogs [48], but not in obese insulin-resistantdogs [49] which suggest that insulin could increase GFR, and thus thefiltered sodium load, only in insulin-sensitive subjects. Insulin hasbeen known to enhance sodium reabsorption in the proximal tubuleand stimulates not only sodium but also volume absorption in therabbit proximal convoluted tubule. Thus, from these stimulatoryeffects, it is clear that insulin acts on proximal tubules to reabsorbsodium filtered from the glomeruli and yet, important regulatorymechanisms exist subsequently in the Henle’s loop, distal tubule andconnecting tubule [17].

Besides, Vasdev et al. [50] showed that intracellular sodium levelsincrease cytosolic free calcium, which can increase oxidative stress andthis condition changes the membrane components compromising itsintegrity [51] because increased ROS generation has been shown toinduce cell membrane lipid peroxidation [52]. Therefore, it has beensuggested that lipid accumulation in the liver makes hepatocytes moresensitive to oxidative stress [53], which in this study, potentiallyactivated lipid peroxidation, as demonstrated by increased TBARS inHFS rats. The observed steatosis could have affected lipid compositionand fluidity of mitochondrial membranes, which increased oxidativestress in the liver. In addition, changes in liver glutathione redox statusweremonitored in this work by recording the GSH/GSSG ratio, becausesevere oxidative stress may deplete cellular GSH, and glutathione playan important function in detoxification of free radicals [54]. Glutathioneis the major intracellular non-protein antioxidant, and GPx convertsH2O2 to H2O by oxidizing glutathione to glutathione disulfide [2]. Weobserved a decrease in liver GSH levels in HFS rats aswell as in the GSH/

Total Gluthatione

CON HS HF HFS0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

aa

a

bn

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CON HS HF HFS0.00

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nm

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CON HS HF HFS0

5

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TBARS

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Catalase activity

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Fig. 3. Antioxidant defenses and oxidative stress in the liver of experimental rats. Different letters indicate significant differences at Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test.

Table 3Regression analyses between TBARS (U/mg ptn) and antioxidant defenses ofexperimental rats

Variable r P

Glutathione total, nmol/ml −0.21 .1815GSH, nmol/ml −0.22 .1540GSSG, nmol/ml 0.18 .2558GSH/GSSG, ratio −0.40 .0194SOD, % inhibition −0.56 .0005Catalase, U/mg ptn −0.50 .0024


GSSG ratio, which could be a consequence of adaptation of the fattyliver, as suggested by the negative correlation of TBARS with GSH/GSSGratio. It may represent a consequence of the higher pro-oxidant statusdeveloped in HFS rats, which is likely responsible for the highconsumption of cellular and circulating antioxidants. Moreover,decreased SOD and CAT activities were observed in HFS rats thatcould participate in hepatic vulnerability to oxidative stress. Decreasedfeedback regulatory mechanisms involving these antioxidant enzymes,prevents the restoration to normal enzyme level. Thus, the suscepti-bility of the tissue to oxidative stress was dependent on the alterationin lipid composition and tissue damage. SOD play a key role in cellprotection against the deleterious effects of O2

−, and catalase preventsdamage by rapidly converting H2O2 to water [55]. There are possiblepathways by which cellular metabolism in this model may be altered,which in turn may accelerate oxidative stress. The increased oxidativestress could be due to production of oxygen free radicals [3] and H2O2

resulting from SOD activity, which can generate hydroxyl radicalsthrough the Fenton reaction, and thus, ROS can themselves reduce theactivity of antioxidant enzymes such as CAT and GPx [56]. Conse-quently, a lowering of these activities is suggestive of reducedscavenging potential in the insulin-resistant rats on high-salt diet.Another possibility is that accumulation of advanced glycation productsresulted in the production of free radicals [57]. Therefore the high-saltdiet might be regarded as an instigator that reduces antioxidantdefenses, worsening insulin sensibility in the early stage of experi-mental diabetes in rats; however, further research is needed to definethe interdependencies/interactions among fructose, salt and oxidativestress more clearly.

In conclusion, the high-salt diet reduced hepatic antioxidantdefenses in the fructose-fed rats, providing evidence to support theidea that increased oxidative stress is involved in membraneperturbation through important regulatory mechanisms. Thus, ourfindings suggest that hyperinsulinemia play a role in sodiumretention and it is therefore possible that the deleterious effects ofsalt overload on insulin- resistant subjects may be attributed, in part,to the development of a substantial pro-oxidant condition thatimpairs antioxidant defenses.

Acknowledgments

The authors would like to thank LAPAC (Pilot Laboratory of ClinicalAnalysis, School of Pharmacy, Federal University of Ouro Preto) fortechnical assistance.

References

[1] Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Are oxidative stress activatedsignaling pathways mediators of insulin resistance and beta cell dysfunction?Diabetes 2003;52:1–8.

[2] Sies H. Strategies of antioxidant defense. Eur J Biochem 1993;215:213–9.[3] Mayne ST. Antioxidant nutrients and chronic disease: use of biomarkers of

exposure and oxidative stress status in epidemiologic research. J Nutr 2003;133:933–40.

[4] Loguercio C, De Girolamo V, De Sio I, Turccillo C, Ascione A, Baldi F, et al. Non-alcoholic fatty liver disease in an area of southern Italy: main clinical, histological,and pathophysiological aspects. J Hepatol 2001;35:568–74.

[5] Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. EndocrRev 2002;23:599–622.

[6] Faure P, Rossini E, Lafond JL, RichardMJ, Favier A, Halimi S. Vitamin E improves thefree radical defense system potential and insulin sensitivity of rats fed highfructose diets. J Nutr 1997;127:103–7.

[7] Peixoto EB, Pessoa BS, Biswas SK, Lopes de Faria JB. Antioxidant SOD mimeticprevents NADPH oxidase-induced oxidative stress and renal damage in the earlystage of experimental diabetes and hypertension. Am J Nephrol 2009;29:309–18.

[8] Sinha-Hikim I, Sinha-Hikim AP, Shen R, KimH, French SW, Vazari ND, et al. A novelcystine based antioxidant attenuates oxidative stress and hepatic steatosis in diet-induced obese mice. Exp Mol Pathol 2011;91:419–28.

[9] Guerra JF, Magalhães CL, Costa DC, Silva ME, Pedrosa ML. Dietary açaí modulatesROS production by neutrophis and gene expression of liver antioxidant enzymesin rats. J Clin Biochem Nutr 2011;49:188–94.

[10] Ceriello A, Motz E. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlyinginsulin resistance, diabetes and cardiovascular disease? The common soilhypothesis revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:816–23.

[11] Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem1995;64:97–112.

[12] Fujita H, Fujishima H, Chida S, Takahashi K, Qi Z, Kanetsuna Y, et al. Reduction ofrenal superoxide dismutase in progressive diabetic nephropathy. J Am SocNephrol 2009;20:1303–13.

[13] Stanhope KL, Havel PJ. Fructose consumption: considerations for future researchon its effects on adipose distribution, lipid metabolism, and insulin sensitivity inhumans. J Nutr 2009;139:1236S–41S.

[14] Fried SK, Rao SP. Sugars, hypertriglyceridemia, and cardiovascular disease. Am JClin Nutr 2003;78:873S–80S.

[15] Basciano H, Federico L, Adeli K. Fructose, insulin resistance, and metabolicdyslipidemia. Nutr Metab 2005;2:5.

[16] Assy N, Nasser G, Kamayse I, Nseir W, Beniashvili Z, Djibre A, et al. Soft drinkconsumption linked with fatty liver in the absence of traditional risk factors. Can JGastroenterol 2008;22:811–6.

[17] Horita S, Seki G, Yamada H, Suzuki M, Koike K, Fujita T, et al. Insulin resistance,obesity, hypertension, and renal sodium transport. Int J Hypertens 2011:391762.

[18] Reeves PG, Nielsen FH, Fahey Jr GC. AIN-93 purified diets for laboratory rodents:final report of the American Institute of Nutrition and hoc writing committee onthe reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr 1993;123:1939–51.

[19] Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC.Homeostasis model assessment: insulin resistance and β-cells function fromfasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 1985;28:412–9.

[20] Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH. A simple method for the isolation andpurification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957;226:497–509.

[21] Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in theautoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur JBiochem 1974;47:469–74.

[22] Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol 1984;105:121–6.[23] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the

folin-phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265–75.[24] Akerboom T, Sies H. Assay of glutathione disulfide and glutathione mixed

disulfides in biological samples. Methods Enzymol 1981;77:373–82.[25] Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978;52:

302–10.[26] Brunt EM, Janney CG, Di Bisceglie AM, Neuschwander- Tetri BA, Bacon BR.

Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histologicallesions. Am J Gastroenterol 1999;94:2467–74.

[27] Manesh R, Hoffmann ML, Stricker EM. Water ingestion by rats fed a high-salt dietmay be mediated, in part, by visceral osmoreceptors. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2006;290:R1742–9.

[28] Mooradian AD, Chehade J, Hurd R, Haas MJ. Monosaccharide enriched diets causehyperleptinemia without hypophagia. Nutrition 2000;16:439–41.

[29] Lê KA, Faeh D, Stettler R, Ith M, Kreis R, Vermathen P, et al. A 4-wk high-fructosediet alters lipid metabolism without affecting insulin sensitivity or ectopic lipidsin healthy humans. Am J Clin Nutr 2006;84:1374–9.

[30] Porte Jr D, Baskin DG, Schwartz MW. Leptin and insulin action in the centralnervous system. Nutr Rev 2002;60:S20–9.

[31] Roglans N, Vila L, Farre M, Alegret M, Sanchez RM, Vazquez- Carrera M, et al.Impairment of hepatic Stat-3 activation and reduction of PPAR-α activity infructose-fed rats. Hepatology 2007;45:778–88.

[32] Orci L, Cook WS, Ravazzola M, Wang MY, Park BH, Montesano R, et al. Rapidtransformation of white adipocytes into fat-oxidizing machines. Proc Natl AcadSci U S A 2004;101:2058–63.

[33] Ouyang X, Cirillo P, Sautin Y, McCall, Bruchette JL, Diehl AM, et al. Fructoseconsumption as a risk factor for non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol2008;48:993–9.

[34] Sánchez-Lozada LG, Mu W, Roncal C, Sautin YY, Abdelmalek M, Reungjui S, et al.Comparison of free fructose and glucose to sucrose in the ability to cause fattyliver. Eur J Nutr 2010;49:1–9.

[35] Hasegawa H, Takano H, Kohro T, Ueda K, Niitsuma Y, Aburatani H, et al.Amelioration of hypertensive heart failure by amlodipine may occur viaantioxidative effects. Hypertens Res 2006;29:719–29.

[36] Vasdev S, Gill V, Longerich L, Parai S, Gadag V. Salt-induced hypertension in WKYrats: prevention by α-lipoic acid supplementation. Mol Cell Biochem 2003;254:319–26.

[37] Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002;346:1221–31.[38] Mayes PA. Intermediary metabolism of fructose. Am J Clin Nutr 1993;58:754S–65S.[39] Liu IM, Tzeng TF, Liou SS. A Chinese Herbal Decoction, Dang Gui Bu Xue Tang,

Prepared from Radix Astragali and Radix Angelicae sinensis, ameliorates insulinresistance induced by a high-fructose diet in rats. Evid Based ComplementAlternat Med 2009.

[40] Nakagawa T, Hu H, Zharikov S, Tuttle KR, Short RA, Glushakova O, et al. A causalrole for uric acid in fructose-induced metabolic syndrome. Am J Physiol RenalPhysiol 2006;290:F625–31.

[41] Thorburn AW, Storlien LH, Jenkins AB, Khouri S, Kraegen EW. Fructose-induced invivo insulin resistance and elevated plasma triglyceride levels in rats. Am J ClinNutr 1989;49:1155–63.


[42] El Mesallamy HO, El-Demerdash E, Hammad LN, El Magdoub HM. Effect of taurinesupplementation on hyperhomocysteinemia and markers of oxidative stress inhigh fructose diet induced insulin resistance. Diabetol Metab Syndr 2010;30:46.

[43] Nishimoto Y, Tomida T, Matsui H, Ito T, Okumura K. Decrease in renal medullaryendothelial nitric oxide synthase of fructose-fed, salt-sensitive hypertensive rats.Hypertension 2002;40:190–4.

[44] Kotchen TA, Kotchen JM. Dietary sodium and blood pressure: interactions withother nutrients. Am J Clin Nutr 1997;65:708S–11S.

[45] Vasdev S, Gill V, Parai S, Gadag V. Effect of moderately high dietary salt and lipoicacid on blood pressure in WKY rats. Exp Clin Cardiol 2007;12:77–81.

[46] Schaefer EJ, Gleason JA, Dansinger ML. Dietary fructose and glucose differentiallyaffect lipid and glucose homeostasis. J Nutr 2009;139:1257S–62S.

[47] Gans RO, Bio HJ, Donker AJ. The renal response to exogenous insulin in non-insulin-dependent diabetes mellitus in relation to blood pressure and cardiovas-cular hormonal status. Nephrol Dial Transplant 1996;11:794–802.

[48] Hall JE, Coleman TG, Mizelle HL, Smith Jr MJ. Chronic hyperinsulinemia and bloodpressure regulation. Am J Physiol 1990;258:F722–31.

[49] Hall JE, Brands MW, Zappe DH, Dixon WN, Mizelle HL, Reinhart GA, et al.Hemodynamic and renal responses to chronic hyperinsulinemia in obese, insulin-resistant dogs. Hypertension 1995;25:994–1002.

[50] Vasdev S, Gill V, Parai S, Gadag V. Fructose-induced hypertension inWistar–Kyotorats: interaction with moderately high dietary salt. Can J Physiol Pharmacol2007;85:413–21.

[51] Gordeeva AV, Zvyagilskaya RA, Labas YA. Crosstalk between reactive oxygenspecies and calcium in living cells. Biochemistry 2003;68:1077–80.

[52] Ferret PJ, Hammoud R, Tulliez M, Tran A, Trebeden H, Jaffray P, et al. Detoxificationof reactive oxygen species by a nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase curesacetaminophen- induced acute liver failure in the mouse. Hepatology 2001;33:1173–80.

[53] Grattagliano I, Caraceni P, Calamita G, Ferrid D, Gargano I, Palasciano G, et al.Severe liver steatosis correlates with nitrosative and oxidative stress in rats. Eur JClin Invest 2008;38:523–30.

[54] Lu SC. Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts andcontroversies. FASEB J 1999;13:1169–83.

[55] Touyz RM. Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells -implications in cardiovascular disease. Braz J Med Biol Res 2004;37:1263–73.

[56] Datta K, Sinha S, Chattopadhyay P. Reactive oxygen species in health and diseases.Natl Med J India 2000;13:304–10.

[57] Levi B, Werman MJ. Long-term fructose consumption accelerates glycation andseveral age-related variables in male rats. J Nutr 1998;128:1442–9.


Finalidade .

Princípio .

Características do sistema .

Sistema enzimático para determinação do ácido úricopor reação de ponto final em amostras de sangue, urina e líquidos(amniótico e sinovial).

O ácido úrico é determinado de acordo com as seguintesreações:

UricaseÁcido Úrico + O + H O Alantoína + CO + H O

Peroxidase2H O + DHBS + 4-aminoantipirina Antipirilquinonimina + 4H O

O ácido úrico é oxidado pela uricase à alantoina e peróxido de hidrogênio.O peróxido de hidrogênio, na presença da peroxidase, reage com o DHBSe a 4-aminoantipirina, formando o cromogênio antipirilquinonimina.A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional àconcentração do ácido úrico na amostra.

A dosagem de ácido úricoutilizando a reação de Trinder caracteriza-se por ser um método direto,facilmente automatizável, que tem a especificidade da uricase. Muitosprodutos utilizam o fenol como reagente de acoplamento. Entretanto, abaixa sensibilidade do fenol e a incompatibilidade de pH ótimo entre auricase de origem animal e a peroxidase criam sérios obstáculos àconfiabilidade do método.

A Labtest, com o sistema Liquiform, supera estas dificuldadessubstituindo o fenol pelo ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato(DHBS), que é 4 vezes mais sensível, permitindo uma relação adequadaentre amostra e reagentes, possibilitando obter uma sensibilidade ótimaem relação à baixa concentração do analito. Ao mesmo tempo a utilizaçãoda uricase de origem vegetal possibilita trabalhar em pH onde se obtémexcelente atividade das enzimas envolvidas no processo.

A determinação do ácido úrico é direta utilizando apenas 0,02 mL deamostra. As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídasadequadamente em dois reagentes para conferir maior estabilidade naforma líquida original e manutenção das condições ótimas da reação,permitindo a utilização direta dos reagentes em sistemas automáticos,facilitando a eliminação da ação de interferentes.

A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando um Reagentede Trabalho estável 90 dias entre 2 e 8 ºC, obtendo-se desempenhoadequado mesmo em situações de baixas demandas do teste. O sistemapermite ainda preparar o volume de Reagente de Trabalho necessáriopara uma medição da concentração do ácido úrico.

A linearidade do método é de 20 mg/dL, o que diminui a necessidade deefetuar diluições em um número significativo de amostras.

[Somente para uso diagnóstico in vitro.]

2 2 2 2 2

2 2 2

O método proposto utiliza a técnica manual e é facilmente aplicável àmaioria dos analisadores automáticos e semi-automáticos capazes demedir uma reação de ponto final entre 490 e 540 nm.

Enzimático-Trinder.

Contém tampão 80 mmol/L pH 7,0, 4-aminoantipirina 0,82 mmol/L,peroxidase 16000 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenolpolioxietanol 1 g/L.

Contém tampão 80 mmol/L pH 7,0, DHBS 10 mmol/L, uricase 500 U/L,octil fenol polioxietanol 1 g/L e azida sódica 0,8 mmol/L.

Contém ácido úrico 6,0 mg/dL. Armazenar bem vedado para evitarevaporação.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condiçõesindicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo.Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminação denatureza química e microbiana que podem provocar redução daestabilidade.

Não utilizar o Reagente quando sua absorbância medida contra água em520 nm for igual ou maior que 0,300 ou quando mostrar-se turvo ou comsinais de contaminação.

Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente. Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica.Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água eprocurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamenteexplosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandevolume de água para descartar os reagentes.

Cuidados com o tempo de reação, temperatura de trabalho e pipetagenssão extremamente importantes para obtenção de resultados corretos.

Os reagentes devem ser manuseados seguindo as boas práticas delaboratório que indicam evitar ingestão e contato com pele, mucosas eolhos.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condiçõesindicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo.Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminações denatureza química e microbiana que podem provocar redução daestabilidade.

Metodologia .

Reagentes

1. -

2. -

3. -

Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 ºC.

Reagente 2 - Armazenar entre 2 - 8 ºC.

Padrão - Armazenar entre 2 - 8 ºC.

≥

≥

ÁCIDO ÚRICO LiquiformInstruções de Uso

Ref.: 73MS 10009010071

01 Português - Ref.: 73

Precauções e cuidados especiais

1

2

Material necessário e não fornecido1.2.

3.4.

Influências pré-analíticas .

Banho-maria ou incubador mantido à temperatura constante (37 °C).

Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 490 e540 nm.

Pipetas para medir amostras e reagentes.

Cronômetro.

O ácido úrico está aumentado nas 24horas que sucedem à ingestão aguda de álcool.As concentrações séricas mostram grandes variações no dia a dia evariações sazonais no mesmo indivíduo. O ácido úrico sérico se elevacom o stress, estados de jejum prolongado e aumento do peso corporal.

Níveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzem interferênciasnegativas por competição com o cromogênio na reação da peroxidase.Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o soro emrepouso durante 90 minutos antes de iniciar a dosagem para não obterresultados falsamente diminuídos.

Usar soro, urina e líquidos (amniótico e sinovial). O analito é estável 3 diasentre 2 - 8 ºC e 6 meses a 10 ºC negativos.

Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) queestabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação earmazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostrapodem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimentoanalítico.

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sanguenão transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas comopotencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, deve-se seguir asnormas estabelecidas para biossegurança.

Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar asnormas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental.

A utilização de plasma fornece resultados falsamente diminuídos.

Valores de bilirrubina até 19 mg/dL, hemoglobina até 90 mg/dL etriglicérides até 1800 mg/dL não produzem interferências significativas.

Valores de hemoglobina entre 90 e 180 mg/dL produzem resultadosfalsamente elevados que podem ser minimizados utilizando o branco daamostra.

Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em umaamostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mLda amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir aabsorbância em 405 ou 415 nm acertando o zero com água deionizadaou destilada.

Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467

≅≅

405

415

Branco da amostra .

Preparo do reagente de trabalho .

Este procedimento é aplicável quando houveração positiva de interferentes. Misturar 1 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,02 mL da amostra. Medir a absorbância em 520 nm,acertando o zero com água destilada ou deionizada. Subtrair aabsorbância assim obtida da absorbância do teste e calcular aconcentração. Este sistema de correção é aplicável apenas nos casos emque a amostra produz interferência fotométrica.

O conjunto de um frasco doReagente 1 e um frasco de Reagente 2 permite preparar o Reagente deTrabalho. Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para umfrasco do Reagente 1 e homogeneizar suavemente. Anotar a data deexpiração. Estável 5 dias entre 15 - 25 °C e 90 dias entre 2 - 8 °C quandonão houver contaminação química ou microbiana. Identificar o frasco doReagente de Trabalho para evitar confusão com outros frascos doReagente 1. Para preservar seu desempenho o reagente devepermanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para se obtero volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.

Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagente de Trabalhoutilizando a proporção de 4 volumes do Reagente 1 para 1 (um) volumedo Reagente 2.

O Reagente de Trabalho contém tampão 80 mmol/L pH 7,0,4-aminoantipirina 0,7 mmol/L, DHBS 2,0 mmol/L, peroxidase 13300 U/L,uricase 100 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenol polioxietanol 1 g/L.

Ver

Homogeneizar a urina, separar 10 mL, acertar o pH entre 7,0 e 9,0com NaOH 5% e aquecer 10 minutos a 56 °C para dissolver os cristais deurato e ácido úrico. Diluir a urina 1:10 (0,1 mL de urina + 0,9 mL de águadestilada). Multiplicar o resultado obtido por 10.

Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:

Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C durante 10 minutos. O nível daágua no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos deensaio. Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 520 nm ou filtroverde (490-540) acertando o zero com o branco. A cor é estável 15minutos.

O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetroscujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 1,0 mL.Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para ofotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem sermodificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho doteste e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimonecessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que0,01 mL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados comcautela porque aumentam a imprecisão da medição.

OBSERVAÇÕES 1 e 2.

Urina .

02

Interferências

Português - Ref.: 73

Procedimento

Amostra

Branco

1,0 mL 1,0 mL

Teste0,02 mL

0,02 mL

Padrão

1,0 mLPadrão (N° 3)Reagente de Trabalho

Amostra

O resultado da medição é linear até 20 mg/dL. Quando for obtido um valorigual ou maior que 20 mg/dL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L(0,85%), realizar nova medição e multiplicar o resultado pelo fator dediluição.

Diluir a amostra (com pH entre 7,0 e 9,0 e aquecida 10 minutos a56 ºC) 1:20 ou 1:40 com água destilada ou deionizada e repetir amedição. Multiplicar o resultado obtido por 20 (vinte) ou 40 (quarenta).

Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 5 e10 mg/dL.

Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e fotométrica, nomínimo semestralmente, utilizando amostra com valores até 20 mg/dL.

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha Qualitrol - Labtestpara controle interno da qualidade em ensaios de química clínica.

Os intervalos devem ser usados apenascomo orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, seuspróprios intervalos de referência na população atendida.

250 a 750 mg/24 horas

Unidades Convencionais (mg/dL) x 59,5 = Unidades SI( mol/L).

Em duas amostras com concentrações de ácido úricoiguais a 6,2 e 8,0 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito obtendo-se recuperações entre 96 e 98%. O erro sistemáticoproporcional médio obtido em um valor de 6,0 mg/dL foi igual a0,2 mg/dL ou 3,0%.

O método proposto foi comparado com um métodosimilar utilizando 40 amostras com valores situados entre 2,4 e11,0 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão: y =1,030x - 0,137 e um coeficiente de correlação (r) igual a 0,996.

Urina .

Urina:

Conversão:

Controle interno da qualidade .

Intervalo de referência .

Características do desempenho

Exatidão .

Especificidade .

µ

12

O laboratório deve manter umprograma de controle interno da qualidade que defina claramente osregulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios paraespecificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados paraavaliar a imprecisão e desvios da calibração.

Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o errototal sejam baseadas nos componentes da variação biológica (VB) .9,10

Cálculos

Exemplo

Exemplo

Calibração

Absorbância do TesteÁcido Úrico (mg/dL) = x 6

Absorbância do Padrão

Absorbância do Teste = 0,175Absorbância do Padrão = 0,138

0,175Ácido Úrico (mg/dL) = x 6 = 7,6

0,138

Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator.

6Fator de Calibração =


Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator

6Fator = = 43,5

0,138

Ácido Úrico (mg/dL) = 0,175 x 43,5 = 7,6

mg/dL x volume urinário (mL)Urina (mg / 24 horas) =

100

O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 913 doNational Institute of Standards and Technology (NIST).

Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando ocontrole interno da qualidade indicar.

Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/L(0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações de ácido úriconos calibradores da linha Calibra - Labtest são rastreáveis ao SRM 913 doNIST.

Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno da qualidadeindicar.

Rastreabilidade do sistema

Calibrações manuais

Sistemas automáticos

Intervalo de calibrações


Linearidade

Soro (mg/dL)

Crianças11

Adultos

HomemMulherHomemMulher

2,5 a 7,00,5 a 5,01,5 a 6,0

1,5 a 6,0

O erro sistemático total (constante e proporcional) verificado no nível dedecisão (6,0 mg/dL) foi igual a 0,043 mg/dL ou 0,7%. Como as amostrasforam selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório epacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra não contendo ácidoúrico foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 0,071 mg/dL, equivalente à média de 20ensaios mais dois desvios padrão.

Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro verificou-se queo limite de detecção fotométrica é 0,034 mg/dL, correspondendo a umaabsorbância igual a 0,001.

Duas amostras com valoresiguais a 13,7 e 15,2 mg/dL foram utilizadas para avaliar a resposta dosistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 91 e 103%.

Numerosas doenças, condições fisiológicas,alterações bioquímicas, fatores sociais e ambientais estão associados aelevações na concentração do urato plasmático. Entre as etiologias dahiperuricemia estão: insuficiência renal, cetoacidose, excesso de lactato,uso de diuréticos e em todas as patologias em que a destruição denucleoproteínas está aumentada. O aumento de urato está positivamenterelacionado à hiperlipidemia, obesidade, aterosclerose, diabetes mellituse hipertensão, embora os mecanismos destas alterações ainda nãosejam bem compreendidos.

A gota, manifestação clínica da hiperuricemia, é classificada comoprimária, secundária ou idiopática. É importante lembrar que a gotasecundária é uma complicação pouco comum quando relacionada àfrequência da hiperuricemia. É importante mencionar que a colchicina,utilizada nos casos de gota aguda, não modifica os valores do ácidoúrico.

São pouco freqüentes as causas da hipouricemia ocorrendo na síndromede Fanconi, doença de Wilson, acromegalia, anemia perniciosa edoenças malignas como linfoma de Hodgkin e carcinoma broncogênico.

A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatoresfundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultadoscorretos.

Sensibilidade metodológica .

Efeitos da diluição da matriz .

Significado clínico .

Observações

1.

2.

3.

Referências

O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos eprecisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causapotencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter aqualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes,usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, deve terresistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm econcentração de silicatos <0,1 mg/L. Quando a coluna deionizadora estácom sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder deoxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias oumesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, éfundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água.

Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar:<www.fxol.org/>.

1. Duncan PH, Gochman N, Cooper T, Smith E, Sayze D. Clin Chem1982;28:284-290.

2. Elin RJ, Johnson E, Chesler R. Clin Chem 1982;28:2089.

3. Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificaçãopara Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 1997.

4. Kabasakalian P, Kalliney S, Westcott A. Clin Chem 1973; 19:522.

5. Kageyama N. Clin Chim Acta 1971;31:421.

6. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-ChilcottLaboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada,1972.

7. Trivedi RC, Rebar L, Berta E, Stong L. Clin Chem 1978; 24:1908.

8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.

12. Labtest: Dados de arquivo.

≥ ≤

9. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular,Base de Da tos de Var i ac ión B io lóg ica . D ispon íve lem:<http://www.seqc.es/ar t ic le/ar t ic leview/330/1/170>(acessoem 04/2006).

10. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. LabtestDiagnóstica 2005.

11.Ferraz MHC, Delgado RB. Valores de Referência para ExamesLaboratoriais. In: Leão E, Corrêa EJ, Viana MB, Mota JAC (Ed).Pediatria Ambulatorial. 3a. edição Belo Horizonte: Coopmed, 1988:837-848.


Média

6,68,4

DP0,090,07

CV (%)

1,30,8

N

2020Amostra 2

Amostra 1

Repetitividade - imprecisão intra-ensaio

Média

6,68,5

DP0,130,12

CV (%)

2,01,4

N

2020Amostra 2

Amostra 1

Reprodutibilidade - imprecisão total

Estão disponíveis aplicações

O número de testes

garante o desempenho deste produto dentro dasespecificações até a data de expiração indicada nos rótulos desde que oscuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestasinstruções sejam seguidos corretamente.

para sistemas automáticos e semi-automáticos.

em aplicações automáticas depende dosparâmetros de programação.

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A Labtest Diagnóstica

Informações ao consumidor


Revisão: Novembro, 2004Ref.: 170309

Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Reprodução sob prévia autorização

Apresentação

Produto Referência Conteúdo

73-4/30

Ácido ÚricoLiquiform

73-2/100

4 x 6 mL1 x 5 mL

4 x 24 mL1

2

2 x 20 mL1 x 5 mL

2 x 80 mL1

2

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Conteúdo suficiente para < n > testesCC

ontenido suficiente para < n > testsontains sufficient for < n > tests

Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa)Estable hastaUse by

(aaaa-mm-dd o mm/aaaa)(yyyy-mm-dd or mm/yyyy)

Limite de temperatura (conservar a)Temperatura limiteTemperature limitation

(conservar a)(store at)

Material CalibradorMaterial CalibradorCalibrator Material

Material CalibradorMaterial CalibradorCalibrator Material

Consultar instruções de usoConsultar instrucciones de usoConsult instructions for use

Adições ou alterações significativasCambios o suplementos significativosSignificant additions or changes

LiofilizadoLiofilizadoLyophilized

Produto diagnóstico in vitroDispositivo de diagnóstico in vitroIn vitro diagnostic device

Número do catálogoNúmero de catálogoCatalog Number

Ref.: 170309

CorrosivoCorrosivoCorrosive

Controle negativoControl negativoNegative control

Controle positivoControl positivoPositive control

ControleControlControl

ControleControlControl

Marca CEMarcado CECE Mark

TóxicoTóxicoPoison

ReagenteReactivoReagent

Número do loteDenominación de loteBatch code

Risco biológicoRiesgo biológicoBiological risk

Fabricado porElaborado porManufactured by

ALBUMINA

Cat. 19

ANVISA10009010025

FINALIDADE

PRINCÍPIO

CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA

METODOLOGIA

REAGENTES

1. Reagente de Cor -

2. Padrão 3,8 g/dL -

Sistema para a determinação da albumina em amostras desoro por reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.

A albumina tem a propriedade de se ligar à uma grandevariedade de ânions orgânicos e moléculas complexas decorantes.O sistema de medição se baseia no desvio do pico deabsortividade máxima de um corante complexo (verde debromocresol) quando este se liga à albumina. A cor formada émedida colorimetricamente entre 620 e 640 nm, sendoproporcional à quantidade de albumina na amostra até aconcentração de 6,0 g/dL.

Os métodos mais comumente utilizados para a dosagem daalbumina se baseiam na ligação com corantes. Esta ligaçãoque promove um desvio do pico de absortividade do corante,permite que a cor resultante possa ser medidacolorimetricamente na presença de excesso do corante. A altaafinidade de ligação da albumina permite que todas as suasmoléculas presentes na amostra participem da reação. Osistema contém um detergente não iônico que reduz aabsorbância do branco, previne o aparecimento de turvação eaumenta a linearidade.

Vários corantes como o metilorange, HABA, verde debromocresol (VBC) e púrpura de bromocresol (PBC) têm sidoutilizados na dosagem da albumina sérica, mas o VBC é oreagente mais utilizado tendo inclusive sido recomendado pelaAACC . Este também tem sido o método de escolha doslaboratórios, pois foi utilizado por 60% dos participantes doprograma de proficiência do Colégio Americano dePatologistas no ano de 2002.

O verde de bromocresol possui especificidade para a albuminae não sofre interferência de valores elevados da bilirrubina ehemoglobina, permitindo também que a interferência devalores elevados dos triglicérides possa ser corrigidautilizando o branco da amostra.

O método tem excelente correlação com o fracionamentoeletroforético em acetato de celulose e é facilmente aplicável àmaioria dos analisadores semi-automáticos e automáticoscapazes de medir uma reação de ponto final entre 625 e640 nm.

Verde de Bromocresol.

Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém tampão 60 mmol/L, pH 3,8; verde de bromocresol300 mol/Le Brij 35 6,0 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém 3,8 g/dL de albumina bovina e azida sódica0,1%.Armazenar bem vedado para evitar evaporação.

3

� �

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente.

O padrão contém azida sódica que é tóxica. Deve-se tomarcuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com osolhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água paradescartar o reagente.

Um forte indício de deterioração é indicado por umaabsorbância maior que 0,300 quando o Reagente de Cor émedido em 630 nm contra água.

Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre600 e 640 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.

Usar soro. A albumina é estável no soro 3 dias entre 2 - 8 ºC e7 dias a 10 ºC negativos.

Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.

Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.

Valores de bilirrubina até 38 mg/dL, hemoglobina até180 mg/dL e triglicérides até 250 mg/dL não produzeminterferências significativas.Valores de triglicérides maiores que 250 mg/dL produzeminterferências positivas que podem ser minimizadas utilizandoo branco de amostra.

Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada, pode-se proceder do seguintemodo: Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl150 mmol/L (0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nmacertando o zero com água deionizada ou destilada.

Hemoglobina (mg/dL) Absorbância X 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância X 467

Branco da amostra: Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,01 mL da amostra. Medir a absorbância em

PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS

MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS

AMOSTRA

Não usar plasma.

INTERFERÊNCIAS

Minimização daAção de Interferentes

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405

415

Instruções de Uso

630 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada.Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste ecalcular a concentração. Este sistema de correção é aplicávelapenas aos casos em que a amostra produz interferênciafotométrica.

Em pacientes com depressão e pessoas obesas, o valor dealbumina tende a ser mais baixo.O uso de torniquete por mais de 3 minutos provoca o aumentodo valor da albumina.Plasmas obtidos com heparina de lítio e oxalato de potássiocombinado com fluoreto de sódio fornecem resultadosfalsamente diminuídos.


Misturar e após 2 minutos, no máximo 10 minutos, determinaras absorbâncias do teste e padrão em 630 nm ou filtrovermelho (600 a 640) acertando o zero com o branco.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.

Absorbância do testeAlbumina (g/dL) = x 3,8

Absorbância do padrão

Absorbância do teste = 0,242Absorbância do padrão = 0,302

0,242Albumina (g/dL) = x 3,8= 3,0

0,302


3,8Fator de Calibração =


Albumina (g/dL) =Absorbância do teste x Fator

Influências Pré-Analíticas

PROCEDIMENTO

CÁLCULOS

Exemplo:

Exemplo:

CALIBRAÇÃO

Calibrações Manuais

SistemasAutomáticos


LINEARIDADE

CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE

INTERVALO DE REFERÊNCIA

3,8Fator = = 12,6

0,302

Albumina (g/dL) = 0,242 x 12,6 = 3,0

O padrão é rastreável ao Certified Reference Material -CRM (BCR) 470 do Institute for Reference Materials andMeasurements/International Federation of Clinical Chemistry(IRMM/IFCC).

Obter semanalmente o fator de calibração.

Branco de reagentes: água ou solução de NaCl150 mmol/L (0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentraçõesde albumina nos calibradores da linha Calibra da Labtestsão rastreáveis ao CRM (BCR) 470 do IRMM/IFCC.

Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle internoda qualidade indicar.

O resultado da medição é linear até 6,0 g/dL. Para valoresmaiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontradose situe entre 3,0 e 4,5 g/dL. Sugerimos a verificação dalinearidade metodológica e fotométrica, no mínimosemestralmente, utilizando amostras com valores até 6,0 g/dL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,objetivos, procedimentos, critérios para especificações daqualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registrodas atividades. Materiais de controle devem ser utilizados paraavaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que asespecificações para o coeficiente de variação e o erro totalsejam baseadas nos componentes da variação biológica

(VB) .

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitol da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.

Os intervalos devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, seus próprios intervalos de referência.

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5, 6,7

Reagente de Cor (nº 1) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Padrão (nº 2) ---- ---- 0,01 mL

---- 0,01 mL ----Amostra

Branco Teste Padrão

31 a 182 dias 2,8 a 4,6

1 a 30 dias 2,6 a 4,3

Crianças e Adolescentes (g/dL)8

183 a 365 dias 2,8 a 4,8

1 a 18 anos 2,9 a 4,7

enteropatias com perda protéica (doença de Chron, coliteulcerativa), doenças inflamatórias como as doençasautoimunes, imobilização prolongada, falência cardíaca eoutros estados catabólicos crônicos. A elevação da albuminasérica é encontrada somente na desidratação.

1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.

2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia sugere-seconsultar: <www.fxol.org/>.

1. Bartholomew RJ, Delaney AM. Proc Austral Assoc ClinBiochem 1966;1:214.

2. Basques JCA, Cabral GL, Cruz RS. Com II Congr Bras AnalClin. Janeiro, 1972.

3. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Wamer-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.

4. Peters T, Biamont GT, Doumas BT. Albumin in serum. EmFaulkner WR. Meites S, eds. Selected methods of clinicalchemistry, volume 9, Washington:AACC Press, 1982:319.

5. Westgard JO, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.

6.Sociedad Española de Bioquímica Clínica y PatologíaMolecular, Base de Datos de Variación Biológica.Disponívelem:<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acesso em 04/2006).

7.Basques JC. Especificações da QualidadeAnalítica. LabtestDiagnóstica 2005.

8.Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric ReferenceRanges, 5a. edição, Washington:AACC Press, 2005:5-6.

9. Labtest: Dados deArquivo.

OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO

Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.

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�

�

Adultos: 3,5 a 5,5 g/dL

Conversão: Unidades Convencionais (g/dL) x 144,9 =Unidades SI (µmol/L)

Em duas amostras com concentrações de albumina iguais a2,7 e 4,2 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito, obtendo-se recuperações entre 97 e 103%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de 3,5 g/dLfoi igual a 0,04 g/dLou 1,1%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre2,5 e 5,3 g/dL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 0,09 + 0,98x e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,994. O erro sistemático total (constante eproporcional) verificado no nível de decisão (3,5 g/dL) foi iguala 0,02 g/dL ou 0,6%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra protéica não contendo albumina foi utilizadapara calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 0,015 g/dL, equivalente a média de20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro, verificou-se queo limite de detecção fotométrica é de 0,013 g/dL,correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.

Duas amostras com valores iguais a 6,3 e 6,7 g/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 95 e 103%.

A albumina é a proteína mais importante do plasma humano,representando 40 a 60% do total de proteína. Os níveisplasmáticos de albumina, devido à sua relação com o aportede proteína e à produção no fígado, são freqüentementeusados como parâmetro para avaliação do estado nutricional efunção hepática.

Diminuições da albumina ocorrem na cirrose e outras doençashepáticas incluindo o alcoolismo crônico, na gravidezassociado ao uso de contraceptivos orais, em muitas doençascrônicas incluindo neoplasias, síndrome nefrótica,

CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO

Exatidão

Especificidade

Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio

Reprodutibilidade - Imprecisão total

Sensibilidade metodológica

Efeitos da diluição da matriz

SIGNIFICADO CLÍNICO

6

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 3,5 0,03 0,9

Amostra 2 20 5,2 0,06 1,2

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 3,4 0,07 2,0

Amostra 2 20 5,1 0,06 1,2

19-250

1 x 250 mL1 x 1 mL

19-100

1 x 100 mL1 x 1 mL

Catálogo

Reagente de CorPadrão

Revisão: Dezembro, 2005. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 181206 Reprodução sob prévia autorização

O número de testes em aplicações automáticas depende

dos parâmetros de programação.

INFORMAÇÕESAO CONSUMIDOR

Termos e Condições de Garantia

Serviço deApoio ao Cliente


A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.

Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuitae-mail: [email protected]

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COLESTEROL HDLCat.13ANVISA10009010026

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

REAGENTES1. Precipitante -

2. Padrão 20 mg/dL -


MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO

Sistema para precipitação seletiva das lipoproteínas de baixa emuito baixa densidade (LDL e VLDL) e determinação doColesterol HDLno sobrenadante, com reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.

As lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e aslipoproteínas de baixa densidade (LDL) são quantitativamenteprecipitadas e após centrifugação, o colesterol ligado àslipoproteínas de alta densidade (Colesterol HDL) édeterminado no sobrenadante.

Na seleção de um sistema para dosar o Colesterol HDL, aLabtest optou pelo ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésioque, precipitando seletiva e quantitativamente as VLDL e LDLpermitem a obtenção de resultados comparáveis ao do métodode referência.

Após centrifugação o Colesterol HDL é determinado nosobrenadante utilizando o sistema enzimático ColesterolLiquiform - Labtest (Cat. 76).

O sistema de medida colorimétrica é facilmente adaptável àmaioria dos analisadores automáticos capazes de medir umareação de ponto final em 500 nm.

Labtest

Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém ácido fosfotúngstico 1,5 mmol/L e cloreto de magnésio54 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém Colesterol 0,52 mmol/L. Armazenar bem vedado paraevitar evaporação.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

Não utilizar o Reagente 1 - Colesterol Liquiform - Labtest(Cat.76) quando sua absorbância medida contra a água em500 nm for igual ou maior que 0,300, ou quando mostrar-seturvo ou com sinais de contaminação.


Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre490 e 540 nm.Pipetas para medir amostras e reagente.Cronômetro.Centrífuga com capacidade superior a 3500 rpm.Reagente para determinação de colesterol.

INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS

AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

As concentrações do colesterol HDL medidas em um mesmoindivíduo e em diferentes ocasiões podem flutuarconsideravelmente devido as variações biológicas e tambémàs variações do método analítico.As concentrações no sanguesão fortemente influenciadas por fatores tais como dietarecente, ingestão de álcool, variações do peso corporal,atividades físicas e hábito de fumar. Os hormônios e outrasmedicações também produzem variações na concentração docolesterol HDL.

Considera-se que a variação biológica está em torno de 7,5%.Assim, em uma série de repetições da dosagem em ummesmo indivíduo, dois terços dos resultados estarão entre7,5% do valor médio. Portanto, a variação biológica se

constitui no fator mais importante da variabilidade total docolesterol HDL. Os efeitos da variação biológica podem sercontrolados até certo ponto através da padronização dascondições de preparo do paciente e da colheita da amostra,mas o colesterol HDL não pode ser estimado com confiançaatravés de um ensaio de uma única amostra. Várias amostrasdevem ser obtidas e a média dos resultados pode serconsiderada como a concentração usual do colesterol HDL ou,mais exatamente, pode ser considerada a faixa usual deresultados para o indivíduo.


Usar soro. O analito é estável 3 dias entre 2 - 8 °C. Obter aamostra após jejum de pelo menos 12 horas. Não utilizaramostras fortemente hemolisadas.

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.


Valores de bilirrubina até 5 mg/dL, hemoglobina até180 mg/dL e triglicérides até 750 mg/dL não produzeminterferências significativas.

Valores de bilirrubina acima de 5 mg/dL produzem resultadosfalsamente diminuídos.

Valores de triglicérides acima de 750 mg/dL produzemresultados falsamente elevados.

Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.

Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601


�

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405

415

Instruções de Uso

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

PROCEDIMENTO

Precipitação das VLDL e LDL

Soro 0,25 mLPrecipitante 0,25 mL

Colorimetria

Manter sempre a relaçãoAmostra/Precipitante igual a 1:1.

Após a centrifugação, remover o sobrenadante límpido dentrode 15 minutos para evitar resultados falsamente elevados.

Amostras lipêmicas e ocasionalmente amostras não lipêmicaspodem apresentar o sobrenadante turvo. Neste caso diluir aamostra 1:2 com NaCI 150 mmol/L e repetir a precipitação.Multiplicar o resultado final por 2. Caso o sobrenadantepermaneça ainda turvo a amostra não pode ser utilizada paradeterminar o colesterol HDL.

Algumas amostras, principalmente lipêmicas, podemapresentar o sobrenadante límpido com uma camada na suasuperfície que não deve ser pipetado, para evitar resultadosfalsamente elevados.

Ver limitações do método.

Em um tubo 12 x 75 colocar:

Agitar vigorosamente durante 30 segundos. A agitaçãosugerida é fundamental para obtenção de resultadosconsistentes. Centrifugar a 3500 rpm por pelo menos 15minutos para obter um sobrenadante límpido. Pipetar osobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação,tomando o cuidado para não ressuspender o precipitado, a fimde evitar resultados falsamente elevados.

Verobservações1,2e3.

Utilizar com o Reagente 1 - Colesterol Liquiform - Labtest(Cat. 76).


Misturar e colocar no banho-maria a 37 C durante10 minutos. O nível da água no banho deve ser superior aonível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde(490 a 540) acertando o zero com o branco. A cor é estável por60 minutos.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.

Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em casode redução dos volumes é fundamental que se observe ovolume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumesda amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.

o

CÁLCULOS

Exemplo

Exemplo

LINEARIDADE


Devido a diluição 1:2 aplicada às amostras durante oprocedimento de precipitação das VLDL e LDL, o valor doPadrão para cálculo dos resultados deve ser corrigido para40 mg/dL.

Absorbância do TesteColesterol HDL(mg/dL) = x 40



0,290Colesterol HDL(mg/dL) = x 40 = 36

0,320




Colesterol HDL(mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator

40Fator = = 125

0,320

Colesterol HDL(mg/dL) = 0,290 x 125 = 36

O resultado da medição é linear até 200 mg/dL. Quando forobtido um valor igual ou maior que 200 mg/dL, diluir a amostra1:2 com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medição emultiplicar o resultado pelo fator de diluição.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorizar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e desvios de calibraçãodeve ser prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usarum controle com um valor situado na faixa de referência ou nonível de decisão e outro controle com um valor em outra faixade significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado decontrole para que o erro de bias seja ± 5,0%, e o erro total seja

13% e monitorar continuamente o estado de controle atravésdo sistema de regras de controle .

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da LinhaQualitrol - Labtest, para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.

�

�8

RASTREABILIDADE DO SISTEMAA calibração do sistema é rastreável ao Standard ReferenceMaterial (SRM) 911 do

(NIST).National Instituite of Standards and

Technology

Reagente 1


Sobrenadante ----

----

1,0 mL

0,1 mL

----

1,0 mL

----

0,1 mL

1,0 mL

Padrão (nº2)

VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS

Classificação ATP III de Colesterol Total, LDL e HDL(mg/dL):

Colesterol HDL

CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão

Especificidade

Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, sua própria faixa de valores de referência.

Os valores desejáveis ou recomendados substituem osvalores de referência e são determinados a partir de dadosepidemiológicos, calculados estatisticamente, que relacionamos níveis do colesterol com a prevalência de doença coronariaisquêmica (DCI).

Desejável:Limiar elevado: 200-239Elevado: 240

Ótimo: < 100Limiar ótimo: 100-129Limiar elevado: 130-159Elevado: 160-189Muito elevado: 190

Baixo: < 40Elevado (desejável): 60

Em duas amostras com concentrações de colesterol HDLiguais a 28 e 54 mg/dL foram adicionadas quantidadesdiferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 95 e100%. O erro sistemático proporcional médio obtido em umvalor de 60 mg/dL foi igual a 1,2 mg/dLou 2,0%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre 7 e86 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão:y = 1,337 + 0,932x e um coeficiente de correlação (r) igual a0,993. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (60 mg/dL) foi igual a2,74 mg/dL ou 4,5%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

�

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9

Crianças eAdolescentesColesterol Total

Colesterol LDL

Colesterol HDL

AdultosColesterol Total

Colesterol LDL

10

11

Idade: 2 a 19 anos: Desejável: < 170 mg/dLLimítrofe: 170 a 199 mg/dLElevado: 200 mg/dL

Idade: 2 a 19 anos: Desejável: <110 mg/dLLimítrofe: 110 a 129 mg/dLElevado: 130 mg/dL

Idade: < 10 anos: Desejável: 40 mg/dL10 a 19 anos: Desejável: 35 mg/dL

< 200

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COMO CALCULAR A CONCENTRAÇÃO DO COLESTEROLVLDL E LDL

Equação de Friedewald

Uma amostra protéica não contendo colesterol HDL foiutilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 0,40 mg/dL, equivalente àmédia de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecçãofotométrica é 0,12 mg/dL, correspondendo a uma absorbânciaigual a 0,001.

Uma amostra com valor igual a 92 mg/dL foi utilizada paraavaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de diluição que variaramde 1,2 a 2,0 encontraram-se recuperações entre 93 e 103%.

Não há dúvida de que o colesterol é um fator de risco para DCIe que ele marcha - junto com o fumo, hipertensão e intolerânciaà glicose - como um dos quatro grandes fatores de DCI.Estudos prospectivos e retrospectivos não deixam dúvidas daexistência de uma interrelação curvilinear entre os níveis decolesterol sérico, mais especificamente LDL e VLDL, e aincidência de DCI.

Em 1977 ficou demonstrado que o Colesterol HDL tem umefeito protetor contra a DCI. Os estudos de Framinghanrevelaram que os níveis do Colesterol HDL são inversamenteproporcionais à prevalência de DCI.

Está bem estabelecido que níveis elevados de Colesterol LDLestão associados com risco aumentado de DCI. Também nãohá dúvida de que tanto o Colesterol Total e as frações LDL eVLDL podem ser diminuídas com dieta ou medicamento.A redução de 1% no valor do Colesterol Total diminui aprevalência de DCI em aproximadamente 2%.

As concentrações do Colesterol Total e do Colesterol HDLdependem de metabolismos distintos e não se deve fazerqualquer tentativa de buscar correlação entre seus níveis deconcentração.

A concentração do Colesterol VLDL e LDL pode ser calculadautilizando a equação de Friedewald, que é exata paraamostras cujas concentrações de triglicérides nãoultrapassem 400 mg/dL e não pertençam a pacientesportadores de lipoproteinemia do Tipo III.

Colesterol VLDL= Triglicérides / 5Colesterol LDL= Colesterol Total - (HDL+ VLDL)

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 20

20

40

59

0,60

0,49

1,5

0,8Amostra 2

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 20

20

40

58

0,83

0,99

2,0

1,7Amostra 2

Revisão: Abril, 2004. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 300606 Reprodução sob prévia autorização

OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia sugere-seconsultar <www.fxol.org/>.

1. III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Diretriz dePrevenção da Aterosclerose. Sociedade Brasileira deCardiologia.Arq Bras Cardiol 2001;77(suppl III):1-48.

2. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.

3. Virella MFL, Stone P, Ellis S, Colwell G. Clin Chem 1977;23:882-884.

4. Warnick RG, Naguyent T,AlbersAA. Clin Chem 1985; 2:217-222.

5. Warnick RJ. Handbook of lipoprotein testing. Washington:AACC Press, 1997.

6. Warnick RG, Wood PD. Clin Chem 1995; 41: 1427-33.

7. NCEP - Detection, evaluation and treatment of high bloodcholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). NIHPublication 02-5215, Bethesda, MD, 2002.

8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493-501.

9. Labtest. Dados deArquivo.

10. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS,Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Riscocardiovascular: fatores metabólicos e nutricionais:diagnóstico e tratamento. São Paulo: Loyola, 1994. p.56.

11. Executive Summary of the Third report of the NationalCholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel onDetection, Evaluation, and Treatment of High BloodCholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA2001;285:2486-97.

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�

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APRESENTAÇÃO

INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e condições de garantia

Serviço de apoio ao cliente


A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.

Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected]

CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista AlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br

13-25

1 x 25 mL

1 x 5 mL

Catálogo

Precipitante

Padrão

COLESTEROLLiquiformCat. 76ANVISA10009010068

FINALIDADE

PRINCÍPIO


Sistema enzimático para a determinação do colesterol total emamostras de soro, por reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.

O colesterol total é determinado de acordo com as seguintesreações:

Os ésteres de colesterol são hidrolisados pela colesterolesterase a colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre éoxidado pela colesterol oxidase a colest-4-en-ona e peróxidode hidrogênio. Na presença de peroxidase e peróxido dehidrogênio, o fenol e a 4-aminoantipirina são oxidadosformando a antipirilquinonimina que tem absortividade máximaem 500 nm.

A intensidade da cor vermelha formada na reação final édiretamente proporcional à concentração do colesterol naamostra.

Os valores elevados do colesterol, principalmente ocolesterol ligado às lipoproteínas de baixa densidade, são umdos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimentoda doença arterial coronariana. O National CholesterolEducation Program (NCEP) recomenda que os sistemas demedição do colesterol apresentem características dedesempenho capazes de atingir os requisitos de exatidão eprecisão necessários para que os resultados tenham utilidademédica.

Os dados de exatidão, repetitividade e reprodutibilidadeobtidos com o sistema Colesterol Liquiform demonstram que ométodo é capaz de fornecer resultados que superam asexigências do NCEP, fazendo com que possa ser consideradocomo bastante seguro para a medição confiável do colesteroltotal nos níveis de decisão mais importantes. Adicionalmente,a comparação entre as imprecisões encontradas narepetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistemade medição é bastante robusto nas regiões de concentraçõessignificativas para uso clínico, indicando um desempenhoestável no dia a dia.

O sistema é composto de um único reagente pronto para uso,com estabilidade que garante desempenho consistente emsua forma líquida original e manutenção das condições ótimasda reação.

Colesterol Liquiform possui um sistema clarificador de altaeficiência que elimina as interferências positivas produzidaspor valores de triglicérides até 2600 mg/dL.

ColesterolÉsteres do colesterol Colesterol + Ácidos graxos

Esterase

ColesterolColesterol + O Colest-4-en-ona + H O

Oxidase

Peroxidase2 H O + Fenol + 4-Aminoantipirina Antipirilquinonimina + 4 H O

2 2 2

2 2 2

6

O sistema é facilmente aplicável em analisadores automáticose semi-automáticos capazes de medir uma reação de pontofinal em 500 nm e pode ser usado para medição do colesterolHDLapós precipitação seletiva das LDLe VLDL.

Enzimático-Trinder.

Armazenar entre 2 - 8°C.Contém tampão 50 mmol/L, pH 7,0; fenol 24 mmol/L; colato desódio 500 mol/L; azida sódica 15 mmol/L; 4-aminoantipirina500 mol/L; colesterol esterase 250 U/L, colesterol oxidase250 U/Le peroxidase 1000 U/L .

Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecerfora da geladeira somente o tempo necessário para se obter ovolume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.

Armazenar entre 2 - 30°C.Contém azida sódica 15 mmol/L. Após o manuseio sugere-searmazenar bem vedado para evitar evaporação.


Não utilizar o Reagente 1 quando sua absorbância, medidacontra a água em 500 nm, for igual ou maior que 0,300 ouquando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.

Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente. O Reagente 1 e o Padrão contémazida sódica que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar aingestão e no caso de contato com os olhos deve-se lavarimediatamente com grande quantidade de água e procurarauxílio médico. A azida pode formar compostos altamenteexplosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto,utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente.


Banho-maria mantido à temperatura constante (37°C).Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre490 e 510 nm.Pipetas para medir amostras e reagente.Cronômetro.

A postura durante a colheita da amostra deve ser padronizadaporque pode ter efeitos significativos nos resultados. Se asamostras são obtidas com o paciente na posição sentada,deve-se padronizar para que o indivíduo esteja sentadodurante 15 minutos e não mais que 30 minutos. Umgarroteamento maior que 1 minuto produz hemoconcentração,o que pode aumentar os valores do colesterol em 5,0% após2 minutos e 10,0 a 15,0% após 5 minutos. Portanto, é muitoimportante obter a amostra de sangue após liberar o torniquetedevendo-se padronizar todo o procedimento da colheita.

METODOLOGIA

REAGENTES1. Reagente 1 -

2. Padrão - 200 mg/dL -




�

� �

� �

Instruções de Uso

A variação biológica do colesterol, decorrente da variaçãotambém biológica das lipoproteínas transportadoras docolesterol, é observada quando a dosagem do colesterol érepetida em um mesmo laboratório no espaço mínimo de umasemana. Ela ocorre independentemente do erro analítico epode variar entre 1,7 e 11,6% com uma média de 6,1% devido,principalmente, à variação biológica da LDL que é a principallipoproteína transportadora de colesterol.

Níveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzeminterferências negativas por competição com o cromogênio nareação da peroxidase. Se houver suspeita da presença deácido ascórbico deixar o soro em repouso durante 90 minutosantes de iniciar a dosagem para minimizar a ação dointerferente.


De modo geral, a amostra de sangue pode ser obtida com ousem jejum, mas é altamente recomendável que todos osensaios dos lípides sanguíneos, incluindo o colesterol, sejamrealizados em amostras colhidas em jejum. As vantagens dautilização de amostras colhidas em jejum são decorrentes dapadronização da colheita, pois permitem a realização dadeterminação de outros lípides que requerem o jejum eminimizam a interferência da lipemia pós prandial que estáfreqüentemente presente em amostras obtidas sem o jejum.

Usar soro. Anticoagulantes como citrato, oxalato ou EDTAproduzem resultados falsamente diminuídos. O analito éestável 7 dias entre 2 - 8°C e 6 meses a 20°C negativos .Homogeneizar bem as amostras lipêmicas antes de iniciar adosagem. Não utilizar amostras fortemente hemolisadas.

Como o volume de amostra é pequeno, deve-se pipetar comcuidado para minimizar a imprecisão do sistema de medição.


Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.

Valores de bilirrubina até 5 mg/dL, hemoglobina até 180 mg/dLe triglicérides até 2600 mg/dL não produzem interferênciassignificativas. Valores de bilirrubina entre 5 e 38 mg/dLproduzem resultados falsamente diminuídos proporcionais àconcentração da bilirrubina.

Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.



AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

6

�

�

4 0 5

4 1 5

PROCEDIMENTO

CÁLCULOS

Exemplo:

Exemplo:

CALIBRAÇÃORastreabilidade do Sistema


Ver observações 1, 2 e 3.


Misturar e incubar em banho-maria a 37°C durante 10minutos. O nível de água no banho deve ser superior ao nívelde reagentes nos tubos de ensaio. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde(490 a 510), acertando o zero com o branco.Acor é estável por60 minutos.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.

Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.

Absorbância do TesteColesterol (mg/dL) = x 200



0,290Colesterol (mg/dL) = x 200 = 168

0,345




Colesterol (mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator

200Fator = = 580

0,345

Colesterol (mg/dL) = 0,290 x 580 = 168

O padrão é rastreável ao (SRM)911 do (NIST).

Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentesou quando o controle interno da qualidade indicar.

Standard Reference MaterialNational Institute of Standards and Technology

�


Amostra -- 0,01 mL --

Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

Padrão (N 2) -- -- 0,01 mL°

Crianças eAdolescentesColesterol

Colesterol HDL

Colesterol LDL

10


Idade: <10 anos: Desejável: 40 mg/dL10 a 19 anos: Desejável: 35 mg/dL


Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,026 =Unidades SI (mmol/L).

Em duas amostras com concentrações de colesterol iguais a146 e 245 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito, obtendo-se recuperações entre 94 e 110%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de200 mg/dL foi igual a 4,0 mg/dLou 2,0%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 60 amostras com valores situados entre 96 e495 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão:y = 6,92 + 0,96x e um coeficiente de correlação (r) igual a0,996. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (200 mg/dL) foi igual a1,08 mg/dL ou 0,54%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra protéica não contendo colesterol foi utilizadapara calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 1,04 mg/dL, equivalente a médiade 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro verificou-se que olimite de detecção fotométrica é de 0,06 mg/dL,correspondendo a uma absorbância igual a 0,0001.

Duas amostras com valores iguais a 330 e 400 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 8 encontraram-se recuperaçõesentre 99 e 113%.


Especificidade





9



LINEARIDADE


VALORES RECOMENDÁVEIS OU DESEJADOS

Classificação ATP III de LDL, Colesterol Total e HDL(mg/dL):

Adultos

�

�

�

�

Branco de reagentes: água deionizada ou destilada, ousolução de cloreto de sódio 150 mmol/L (0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentraçõesde Colesterol nos calibradores da linha Calibra Labtestsão rastreáveis ao SRM 1951 do NIST.

Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle internoda qualidade indicar.

O resultado da medição é linear até 500 mg/dL. Quando forobtido um valor igual ou maior que 500 mg/dL, diluir a amostracom NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medição emultiplicar o resultado pelo fator de diluição. Diluir a amostra detal modo que o valor encontrado se situe entre150 e 300 mg/dL. Sugerimos a verificação da linearidademetodológica e fotométrica, no mínimo semestralmente,utilizando amostras com valores até 500 mg/dL.

O laboratório deve manter um programa de controleinterno da qualidade que defina claramente os objetivos,procedimentos, normas, critérios para limites de tolerância,ações corretivas e registro das atividades. Ao mesmo tempodeve-se manter um sistema definido para monitorar avariabilidade analítica que ocorre em todo o sistema demedição. Portanto, o uso de controles para avaliar aimprecisão e desvios de calibração deve ser prática rotineirano laboratório clínico. Sugere-se usar um controle com umvalor situado na faixa de referência ou no nível de decisão eoutro controle com um valor em outra faixa de significânciaclínica. Deve-se criar uma meta de estado de controle paraque o erro de bias seja 3,0%, o coeficiente de variação seja

3,0% e o erro total seja 8,9%. Sugere-se realizar amonitoração contínua do estado de controle através dosistema de sistema de regras de controle .

Sugere-se utilizar os produtos da linha Qualitrol da Labtest,para controle interno da qualidade em ensaios de químicaclínica.

Os valores abaixo substituem os valores de referência e foramdeterminados a partir de dados epidemiológicos tratadosestatisticamente, que relacionam os níveis do colesterol com aprevalência de doença coronariana isquêmica (DCI).

6,9

8

�

� �

11

Colesterol Total

Colesterol HDL

Colesterol LDL

Desejável: < 200Limiar elevado: 200-239Elevado: 240

Baixo: < 40Elevado (desejável): 60

Òtimo: <100Limiar ótimo: 100-129Limiar elevado: 130-159Elevado: 160-189Muito elevado: 190

�

�

�

Amostra 3 10 357 4,23 1,2

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 10 175 2,69 1,5

Amostra 2 10 255 3,08 1,2

Amostra 3 10 353 8,46 2,1

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 10 173 4,23 2,4

Amostra 2 10 253 5,77 2,2

Revisão: Abril, 2006 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 190606 Reprodução sob prévia autorização


OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS

O grande dilema da aterosclerose é que ela é um processosilente. Está ativa em todos os indivíduos e permanece semqualquer manifestação por décadas e, subitamente semanifesta através de dor torácica, infarto agudo do miocárdioou morte súbita. Estudos populacionais longitudinais como osde Tecumset,Albany, Framinghan, Evans, Chicago, Oslo entreoutros, e também dados epidemiológicos e estudosexperimentais em animais, demonstraram uma correlaçãopositiva entre os níveis do colesterol, mais especificamente docolesterol LDL e o risco de doença arterial coronariana (DAC).Ao mesmo tempo foi evidenciado que os níveis de colesterolHDLsão inversamente proporcionais ao risco de DAC.

Valores aumentados de colesterol são encontrados nanefrose, hipotireoidismo, doenças colestáticas do fígado e nashiperlipoproteínemias dos tipos IIa, IIb e III.

Níveis diminuídos são encontrados no hipertireoidismo,doenças consumptivas e desnutrição crônica.

Além do nível do colesterol sérico, a hipertensão e o fumoconstituem fatores de risco de aterosclerose e DAC.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS.

, 3ª edição, Washington: AACCPress, 1990.

1. Alain CA, Poon LS, Cahn CSG, Richmond W, Fu PC. ClinChem 1974;20:470.

2. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analysis, 3ª edição,Verlag Chemie:Weinhein, 1984;8:141-8.

3. Bull Org Mond Santé. 1970;43:891.

4. Fredrickson DS, Levy RJ, Lee RS. New Engl J Med 1967;276:24, 94, 148, 215, 276.

5. Good NE, Winger GD, Winter W, Connoly TN, Izawa S,Singh RMM. Biochemistry 1966;5:467.

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�

�

�

Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests

6. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook oflipoprotein testing.AACC Press: Washington, 1997:75-97.

7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostics Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.

8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem1981;27:493-501.


O número de testes em aplicações automáticas depende dosparâmetros de programação.




CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br

APRESENTAÇÃO

INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia



10. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS,Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular:fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico etratamento. São Paulo: Loyola, 1994. P.56.

11. Executive Summary of the Third report of the NationalCholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel onDetection, Evaluation and Treatment of High BloodCholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA2001;285:2486-97.

76-2/100

2 x 100 mL

1 x 5 mL

76-2/250

2 x 250 mL

1 x 5 mL

Catálogo

Reagente 1

Padrão

CREATININAK

Sistema para a determinação da creatinina em soro, plasma,urina e líquido amniótico por cinética de dois pontos.Somente para uso diagnóstico in vitro.

A creatinina reage com o picrato alcalino formando umcomplexo de cor vermelha. A quantidade da cor formada éproporcional à concentração de creatinina na amostra.

Creatinina + Picrato alcalino Picrato de Creatinina

A metodologia é bastante simples e facilmente aplicável emaparelhos automáticos e semi-automáticos capazes de mediruma reação em modo cinético de 2 pontos em um tempo totalde 90 segundos. A interferência das proteínas plasmáticas,que ocorre na reação de Jaffé, introduz um erro constante namedição o qual é minimizado pela utilização de um índice decorreção (0,25 mg/dL) .

Os estudos realizados demonstraram que é possível eliminartambém as interferências causadas pela bilirrubina e lipemia .Os procedimentos propostos utilizam a adição do ferricianetode potássio que oxida a bilirrubina e a desproteinização queelimina a interferência da lipemia equivalente a umaconcentração de triglicérides de 1800 mg/dL.

O Picrato Alcalino mantém o desempenho analítico quandoarmazenado tampado e refrigerado durante 15 dias,permitindo o preparo de um volume maior de Reagente deTrabalho de acordo com a rotina do laboratório.

O desenvolvimento do método foi direcionado para automaçãonão sendo recomendada a utilização em técnicas manuais, anão ser que o laboratório disponha de facilidades para realizarmedições em cubetas termostatizadas utilizando pequenosintervalos de tempo.

Labtest.

Armazenar entre 15 - 30 °C.Contém hidróxido de sódio 200 mmol/L. Reagente corrosivo.

Armazenar entre 15 - 30 °C.Contém ácido pícrico 22,2 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 30 °C.Contém creatinina 4,0 mg/dL. Após o manuseio sugere-searmazenar bem vedado para evitar evaporação.

Armazenar entre 15 - 30 °C.Contém ferricianeto de potássio 11 mmol/L. Não refrigerar.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

Cat 96ANVISA10009010058

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

REAGENTES1. NaOH -

2. Ácido Pícrico -

3. Padrão 4,0 mg/dL -

4. Ferricianeto -

1 ,2 ,9

5



AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação dos reagentes, os quais não devem serpipetados com a boca.

O NaOH (N° 1) é corrosivo e pode produzir irritação,queimaduras na pele e olhos e ulcerações quando ingerido. Nocaso de ingestão oferecer grande quantidade de água comsuco de limão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurarauxílio médico. Quando houver contato com os olhos, deve-selavar imediatamente com grande quantidade de água eprocurar auxílio médico.

Caso ocorra ingestão do Ácido Pícrico (N° 2), oferecer 4 coposde água e, se o indivíduo estiver consciente, provocar vômitose procurar auxílio médico.

Um forte indício de deterioração dos reagentes é indicadoquando o Picrato Alcalino, medido em 510 nm contra a água,apresentar uma absorbância maior que 0,200.

Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medirabsorbância em modo cinético.Analisador automático capaz de processar 1 ou 2 reagentes(para aplicações automáticas).Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro (para medições manuais).


Soro ou plasma (heparina, EDTA, fluoreto, oxalato e citrato). Oanalito é estável 7 dias entre 2 - 8 °C. O anticoagulante Glistab -Labtest (Cat. 29) permite a colheita de uma só amostra desangue para as dosagens de creatinina, glicose e uréia.

Urina de 24 horas e líquido amniótico devem ser centrifugados.A amostra de urina não deve receber preservativos ouconservantes e deve ser refrigerada durante o período dacolheita e depois de recebida no laboratório.

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde material biológico humano não transmitem infecções, todaselas devem ser consideradas como potencialmenteinfectantes. Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir asnormas estabelecidas para biossegurança.


As proteínas presentes na amostra produzem umainterferência positiva introduzindo um erro sistemáticoconstante. Este erro pode ser minimizado aplicando um índicede correção. Como a urina não contém proteínas que podemproduzir interferências, o índice de correção não é aplicado nocálculo da concentração em amostras de urina. Ver a aplicaçãodo índice de correção no item Cálculos.

A determinação da creatinina na urina pode ser afetada poração de grandes quantidades de substâncias redutoraspresentes nos casos de cetoacidose. A fervura da amostra deurina por um minuto elimina parcialmente a interferênciadessas substâncias.

Instruções de Uso

Concentrações de bilirrubina maiores que 5 mg/dL interferemnegativamente na reação. Concentrações de hemoglobina até180 mg/dL e triglicérides até 900 mg/dL não interferem nareação.

Para avaliar a concentração aproximada de hemoglobina emuma amostra, proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mL daamostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir aabsorbância em 405 ou 415 nm, acertando o zero com águadeionizada ou destilada.

Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601

Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467

Nas amostras em que a concentração de bilirrubina está entre5 e 19 mg/dL, a interferência pode ser eliminada através doseguinte procedimento: adicionar 0,05 mL de Ferricianeto(N° 4) a 0,5 mL da amostra. Misturar e aguardar 5 minutos.Determinar a creatinina, multiplicar o resultado obtido por 1,1 eaplicar o índice de correção.

Quando a concentração de bilirrubina for maior que 19 mg/dL emenor que 38 mg/dL, diluir a amostra 1:2 com NaCl150 mmol/L (0,85%).Adicionar 0,05 mLde Ferricianeto (N° 4) a0,5 mL da amostra diluida. Misturar e aguardar 5 minutos.Determinar a creatinina, multiplicar o resultado por 2,2 e aplicaro índice de correção.

Para concentrações de triglicérides entre 900 mg/dL e1800 mg/dL a interferência da lipemia pode ser eliminadaatravés do procedimento com desproteinização. Quando aconcentração de triglicérides for maior que 1800 mg/dL emenor que 3500 mg/dL, diluir a amostra 1:2 com NaCl150 mmol/L (0,85%), seguir o procedimento comdesproteinização para determinar a creatinina e multiplicar oresultado por 2.

Uma diluição da amostra, maior que 1:2, não é aconselhávelporque, em amostras com baixas concentrações da creatinina,obtêm-se resultados com erros significativos devido aoaumento da imprecisão analítica.

Misturar 4 volumes de NaOH (N° 1) com 1 volume de ÁcidoPícrico (N° 2). Estável 15 dias entre 2 - 8 °C em frasco plásticobem vedado. Um forte indício de deterioração é indicado poruma absorbância maior que 0,200 quando o Picrato Alcalino émedido em 510 nm contra a água.

O CO atmosférico altera significativamente a estabilidade doNaOH (N° 1) e do Picrato Alcalino, quando os reagentes sãomantidos em recipientes abertos. A modificação daestabilidade é influenciada pelo tempo de exposição econdições ambientais. Sugerimos manter na bandeja doanalisador somente o volume suficiente para a realização deuma corrida analítica ou usar as informações do controle daqualidade como indicador da necessidade de realizar novacalibração.

Para a dosagem na urina diluir a amostra 1:25 (0,2 mL de urina+ 4,8 mL de água destilada ou deionizada). Multiplicar oresultado obtido por 25.

�

�

4 0 5

4 1 5

2

Eliminação da ação de interferentes

Não aplicar o índice de correção quandoutilizar o procedimento com desproteinização.

PREPARO DO PICRATOALCALINO

PROCEDIMENTO

O controle da temperatura é absolutamente indispensávelpara a reprodutibilidade dos resultados. Como o tempo dereação é muito pequeno, é necessário utilizar um equipamentocom cubeta termostatizada a 37 °C.

É fundamental que as operações com amostras e padrõessejam realizadas sempre de modo idêntico, mantendo-seconstante, ao máximo possível, o intervalo de tempo entre amistura da amostra ou Padrão com o reagente e o início damedição fotométrica.

Caso os volumes propostos não atendam às necessidades doinstrumento para realizar a leitura fotométrica, aumentarproporcionalmente os volumes de Picrato Alcalino e amostraou Padrão.

Ajustar o fotômetro a zero em 510 nm (490 a 520 nm) comágua. Adicionar 0,10 mL de Padrão ou amostra a 1,0 mL doPicrato Alcalino. Misturar e aspirar imediatamente para acubeta. Disparar o cronômetro e medir as absorbâncias aos30 e 90 segundos.

Misturar 0,2 mL de soro a 0,4 mL de Ácido Pícrico (N° 2), agitare centrifugar durante 10 minutos. Acertar o zero do fotômetroem 510 nm (490 a 520 nm) com água. Em outro tubo pipetar0,8 mL de NaOH (N° 1) e adicionar 0,3 mL do sobrenadantelímpido. Misturar e aspirar imediatamente para a cubeta.Disparar o cronômetro e medir as absorbâncias aos 30 e 90segundos. O Padrão deve ser ensaiado utilizando oprocedimento direto. Não aplicar o índice de correção.

Ado Teste ou Padrão =A segundos -A segundos

Ado TesteCreatinina (não corrigida) = x 4 mg/dL

Ado Padrão

A Teste = 0,118 A Padrão = 0,092A Teste = 0,130 A Padrão = 0,139

Creatinina (corrigida) = 1,02 mg/dL - 0,25 mg/dL= 0,77 mg/dL

A interferência das proteínas plasmáticas, que ocorre nareação de Jaffé , introduz um erro constante na medição o qualé minimizado pela utilização do índice de correção(0,25 mg/dL).

A utilização do índice de correção em medições automáticas éapresentada nas aplicações dos produtos Labtest parasistemas automáticos.

Procedimento direto

Procedimento com desproteinização

CÁLCULOS

Exemplo

Aplicaçãodoíndicedecorreção

Exemplo

�

�

�

9 0 3 0

3 0 3 0

9 0 9 0

0,130 - 0,118Creatinina (não corrigida) = x 4 mg/dL = 1,02 mg/dL

0,139 - 0,092

Creatinina(corrigida)=Creatinina(nãocorrigida)-Índicedecorreção(0,25mg/dL)

2

Exemplo

LINEARIDADE


VALORES DE REFERÊNCIA

Creatinina na urina (mg/dL) = 105Creatinina (corrigida) no soro (mg/dL) = 0,95Volume de 24 horas = 1520Volume minuto = 1520/1440 = 1,055

105Depuração (mL/minuto) = x 1,055 = 116

0,95

Peso = 60 Kg Altura = 165 cm

Superfície corporal = 1,66 m

116 x 1,73

Depuração corrigida = = 121 mL/minuto/1,73 m1,66

A reação é linear entre 0,2 mg/dL e 12 mg/dL. Para valoresmaiores diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%) erepetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição e aplicar o índice de correção. Diluir a amostra de talmodo que o valor encontrado se situe entre 2,0 e 6,0 mg/dL.

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol - Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.

Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça na populaçãoatendida sua própria faixa de valores de referência.

Conversão mg/dLpara Unidades SI: mol/L= mg/dLx 88,4.

2

2

�

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,objetivos, procedimentos, critérios para especificações daqualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registrodas atividades. Materiais de controle devem ser utilizados paraavaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que asespecificações para o coeficiente de variação e o erro totalsejam baseadas nos componentes da variação biológica

(VB) .8 ,1 0 ,11

Creatinina Urinária

Como as amostras de urina não contêm proteínas emconcentrações capazes de introduzir erros constantesnas medições, não é necessário aplicar o índice decorreção.

CALIBRAÇÃORastreabilidade do Sistema



Intervalos de calibração

DEPURAÇÃO DACREATININAENDÓGENA

CreatininaurináriaCreatininaUrinária(mg/24h)= xVolumedeurina(mL/24h)

100

mg/kg peso = mg/24 horas dividido pelo peso corporal

A concentração de creatinina no Padrão (N° 3) e noscalibradores da linha Calibra é rastreável ao

(SRM) 914 do(NIST).

Obter novo fator de calibração ao usar novo lote dereagentes ou quando o controle da qualidade indicar.

Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio150 mmol/L (0,85%);Padrão: usar calibradores da linha Calibra;

Calibração do branco ao usar novos frascos dereagentes;Calibração de 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 3 pontos quando o controle da qualidadeindicar.

Instruir o paciente para que faça corretamente a colheita daurina de 24 horas .

Dosar a creatinina no soro e na urina utilizando asmetodologias propostas. O soro pode ser obtido em qualquermomento durante o período de colheita da urina.

Aplicar os resultados obtidos na equação abaixo:

UDepuração = x VM (mL/minuto)

S

U: creatinina na urina (mg/dL)S: creatinina (corrigida) no soro (mg/dL)VM: volume minuto (volume urinário de 24 horas, em mL,dividido por 1440).

OBS.: A depuração deverá ser corrigida para a superfíciecorporal do paciente, que é obtida através do nomogramacorrelacionando peso e altura, ou usando a equação abaixo:

A= P x H x 0,007184

A= superfície corporal (m )P = peso (kg)H = altura (cm)

Multiplicar o valor da depuração por 1,73 e dividir pelasuperfície corporal do paciente.

StandardReference Material National Institute ofStandards and Technology

�

�

�

�

�

�

4

0 ,4 2 5 0 ,7 2 5

2

Soro/Plasma (mg/dL)

< 1 meses 0,4 - 0,7

Recém- nascidos 0,5 - 1,2

1 - 12 meses � 0,7

1 - 3 anos

4 - 7 anos

8 - 10 anos

11 - 12 anos

13 - 17 anos

Adulto

� 0,7

� 0,8

� 0,9

� 1,0

� 1,2

� 1,3

> 3 anos

Homem

Mulher

12 - 30

21 - 26

16 - 22

2 - 3 anos 6 - 22

Urina (mg/kg/24 h)


Especificidade






1 0

Em duas amostras com concentrações de creatinina iguais a2,7 mg/dL e 8,7 mg/dL foram adicionadas quantidadesdiferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 97 e100%. O erro sistemático proporcional médio estimado nonível de decisão (1,6 mg/dL) é igual a 0,0232 mg/dLou 1,45%.

O método proposto foi comparado com um métodoenzimático (rastreável ao método definitivo) utilizando20 amostras de soro com valores situados entre 0,52 e11,0 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressãoy = 1,007x + 0,028 e um coeficiente de correlação (r) igual a0,998. O erro sistemático total (constante e proporcional)estimado no nível de decisão (1,6 mg/dL) é igual a0,0354 mg/dL ou 2,2%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra não contendo creatinina foi utilizada paracalcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontradoum valor igual a 0,14 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaiosmais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância dopadrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecçãofotométrica foi 0,12 mg/dL, correspondendo a uma diferençade absorbância igual a 0,001.

Duas amostras com valores iguais a 8,6 e 10,0 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Utilizando fatores dediluição que variaram de 2 a 5 foram encontradasrecuperações entre 96,2 e 105%.

Aconstância na formação e excreção da creatinina faz dela ummarcador muito útil de função renal, principalmente da filtraçãoglomerular, em virtude da sua relativa independência defatores como dieta, grau de hidratação e metabolismo protéico.

A determinação da creatinina plasmática é um teste de funçãorenal mais seguro do que a uréia. Nas doenças renais acreatinina se eleva mais vagarosamente do que a uréia e sereduz mais vagarosamente com a hemodiálise.

Fatores extras renais como insuficiência cardíaca congestiva,choque e obstrução mecânica do trato urinário provocamelevação da creatinina plasmática.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/

1. Cook JGH. Clin ChimicaActa 1971;32:485-6.

2. Heinegard D, Tiderström G. Clin ChimActa 1973;43:305-10.

3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry,Principles and Technics, 2nd ed, New York, Harper &Row,1974.

4. Infotec Labtest,Ano II N° 2.

5. Knapp ML, Mayne PD. Clin ChimActa 1987;168:239-46.

6. O'Leary N, Pembroke A, Duggan PF. Clinical Chemistry1992;38:1749-51.

7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories. Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.

8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR,Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.

9. Yatzidis H. Clin Chem 1974,20:1131-34.

OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS

�

�

�

�

10. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y PatologíaMolecular, Base de Datos de Variación Biológica.Disponível em:<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acesso em 04/2006).

11. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica.Labtest Diagnóstica 2005.

12. Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric ReferenceIntervals, 5.ed. Washington:AACC Press, 2005. P.3-4.

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 20 0,66 0,027 4,10

Amostra 2 20 2,04 0,038 1,86

Amostra 3 20 7,49 0,273 3,64

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 20 0,66 0,013 1,97

Amostra 2 20 2,04 0,016 0,78

Amostra 3 20 7,49 0,144 1,92

Homens

Mulheres

97 - 137

88 - 128

Crianças 70 - 140

Depuração de Creatinina (mL/minuto/1,73 m )2

13. Ferraz MHC, Delgado RB. Valores de Referência paraExames Laboratoriais. In: Leão E, Corrêa EJ, Viana MB,Mota JAC (Ed). Pediatria Ambulatorial. 3.ed. BeloHorizonte: Coopmed, 1988. p.837-848


Algumas apresentações podem ser disponibilizadas somentemediante consulta.


Telefone 0800-31-3411 - Ligação GratuitaE-mail: [email protected]

CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br

APRESENTAÇÃO


O número de testes em aplicações automáticas dependedos parâmetros de programação.




96-300

1 x 60 mL

1 x 5 mL

1 x 5 mL

1 x 240 mL

Catálogo

NaOH

Ácido Pícrico

Padrão

Ferriacianeto

Revisão: Junho, 2005. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 200706 Reprodução sob prévia autorização

FOSFATASEALCALINALiquiformCat. 79ANVISA10009010050

FINALIDADE

PRINCÍPIO(FALC)


METODOLOGIA

REAGENTES:1. Reagente 1 -

Sistema para determinação em modo cinético da FosfataseAlcalina no soro.Somente para uso diagnóstico in vitro.

A fosfatase alcalina do soro, em pH alcalino,hidrolisa o p-nitrofenilfosfato liberando p-nitrofenol e fosfatoinorgânico, segundo a reação seguinte:

FALCp-Nitrofenilfosfato + H O p-Nitrofenol + fosfato

A quantidade produzida de p-nitrofenol que tem elevadaabsorbância em 405 nm é diretamente proporcional àatividade enzimática da fosfatase alcalina na amostra.

O substrato p-nitrofenilfosfato foi selecionado porque éprontamente hidrolisado pela fosfatase alcalina. O produto dahidrólise possui elevada absortividade molar, permitindoutilizar pequeno volume de amostra e curto tempo dereação porque utiliza um tampão transfosforilante queaumenta a velocidade do sistema.

O sistema se baseia no método de referência da AACC queotimiza todas as condições da reação, incluindotemperatura, pH, concentração dos reagentes e volumefracional da amostra. Este método, com pequenasmodificações, está sendo considerado por váriasorganizações nacionais e internacionais interessadas emestabelecer um método de referência para a fosfatase alcalina.

As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídasadequadamente em dois reagentes para conferir maiorestabilidade na forma líquida original e manutenção dascondições ótimas da reação, permitindo a utilização direta dosreagentes em sistemas automáticos.

A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando umReagente de Trabalho estável por 30 dias sob refrigeraçãoobtendo-se desempenho adequado mesmo em situações debaixas demandas do teste. O sistema permite ainda preparar ovolume de Reagente de Trabalho necessário para apenas umamedição da atividade enzimática da fosfatase alcalina.

O sistema é simples e utiliza medidas em modo cinéticocontínuo, podendo ser facilmente aplicado em analisadoresautomáticos e semi-automáticos capazes de medirabsorbância em 405 nm.

Bowers e Mc Comb modificado.

Armazenar entre 2 - 8°C.Contém tampão pH 10.4, HEDTA 2.0 mmol/L, sulfato de zinco1.2 mmol/L, acetato de magnésio 2.5 mmol/L, azida sódica8 mmol/L.

2

2. Reagente 2 -

RASTREABILIDADE DO SISTEMA



AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

Armazenar entre 2 - 8°C.Contém p-Nitrofenilfosfato 60 mmol/L, fenol 50 mmol/L.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

A absortividade molar do p-nitrofenol, produto da reação, éutilizada como sistema de referência para a calibração doensaio.


O Reagente 1 contém azida sódica, que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água paradescartar o reagente.

Não utilizar o Reagente de Trabalho quando sua absorbância,medida contra a água em 405 nm, for igual ou maior que 1.2 ouquando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.

Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medir comexatidão a absorbância em 405 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.


A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo8 horas.Soro ou plasma (heparina).Aamostra é estável por 7 dias entre2 - 8°C. Quando a amostra é armazenada na temperaturaambiente obtém-se resultados falsamente elevados.



Citrato, fluoreto ,oxalato e EDTA são inibidores da atividade dafosfatase alcalina porque formam complexos com o magnésio.

Valores de Bilirrubina até 32 mg/dLnão interferem na reação.

Amostras ligeiramente hemolisadas, com hemoglobina até30 mg/dL, podem ser toleradas, mas hemólises maisacentuadas não devem ser aceitas porque produzemresultados falsamente diminuídos.

� �

Instruções de Uso

Valores de Triglicérides acima de 1800 mg/dL produzemresultados falsamente elevados.

Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0.05 mL da amostra em 2.0 mL de NaCl 150 mmol/L(0.85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.

Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 467

O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco doReagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho.Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para umfrasco do Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar adata de expiração.

Estável 5 dias entre 15 - 25°C e 30 dias entre 2 - 8°C quandonão houver contaminação química ou bacteriana. Identificar ofrasco do Reagente de Trabalho, para evitar confusão comoutros frascos do Reagente 1. Para preservar o desempenho,o Reagente de Trabalho deve permanecer fora da geladeirasomente o tempo necessário para se obter o volume a serutilizado. Evitar exposição à luz solar direta.

Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagentede Trabalho utilizando a proporção de 4 (quatro) volumes doReagente 1 e 1 (um) volume do Reagente 2. Ex.: Para preparar1 mL do Reagente de Trabalho misturar 0.8 mL do Reagente 1com 0.2 mLdo Reagente 2.

O Reagente de Trabalho contém tampão pH 10.4, sulfato dezinco 1.0 mmol/L, fenol 10 mmol/L, HEDTA 1.6 mmol/L,acetato de magnésio 2.0 mmol/L, p-nitrofenil fosfato12 mmol/L, azida sódica 6.4 mmol/L.

1. Em um tubo rotulado Teste pipetar 1.0 mL do Reagente deTrabalho.

2. Adicionar 0.02 mL da amostra, homogeneizar e transferirimediatamente para a cubeta termostatizada a 37 ± 0.2°C.Esperar 1 minuto.

3. Fazer a leitura da absorbância inicial (A ) disparandosimultaneamente o cronômetro. Repetir a leitura após 2minutos (A ).

Para avaliar a linearidade da reação verificar se asabsorbâncias medidas em intervalos de 1 minuto sãocomparáveis.

Calcular o ( A/minuto) subtraindoA deA e dividindo por 2.

Ver linearidade.

A -AATeste =

2

Atividade da FosfataseAlcalina = ATeste x 2764

�

�

�

�

�

�

�

405

415

1

2

1 2

2 1

PREPARO DO REAGENTE DE TRABALHO

PROCEDIMENTOCondições da reação: comprimento de onda 405 nm;cubeta termostatizada a 37 ± 0.2°C, com 10 mm deespessura de solução, banda de passagem de 8 nm oumenos e luz espúria menor que 0.1%.

CÁLCULOS

O fator 2764 foi calculado para as condições acima propostas.Recalcular o fator quando for efetuada qualquer modificaçãoem um dos parâmetros utilizados para calculá-lo.Ver método para cálculo do fator.

A Teste = 0.610

A Teste = 0.660

0.660 - 0.610A/minuto = = 0.025

2

FosfataseAlcalina (U/L) a 37°C = 0.025 x 2764 = 69

VT x 1000Fator =

x VAx d

VT = volume total do ensaio (1.02 mL)VA= volume da amostra (0.02 mL)1000 = conversão de U/mLpara U/Ld = espessura da solução (1 cm)

= absortividade milimolar do p-nitrofenol em 405 nm (18.45)

1.02 x 1000Fator = = 2764

18.45 x 0.02 x 1

A reação é linear até 1500 U/L. Para valores maiores diluir aamostra 1:10 com NaCl 150 mmol/L (0.1 mL de soro + 0.9 mLde NaCl 150 mmol/L), repetir a determinação e multiplicar oresultado obtido por 10.Sugerimos a verificação da linearidade metodológica efotométrica no mínimo semestralmente utilizando amostrascom atividades até 1500 U/L.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorizar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira no laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para verificar a estabilidade do sistema de medição.

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 eQualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.

Estes valores podem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça a sua própriafaixa de valores de referência da população atendida.

Exemplo:

Método para cálculo do fator

Exemplo:

LINEARIDADE



1

2

�

�

�

5

Efeitos da diluição da matriz:


OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS

Uma amostra com valor igual a 850 U/L foi utilizada para avaliara resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl150 mmol/L. Usando fatores de diluição que variaram de 2 a 8encontrou-se recuperações entre 101 e 104%.

A fosfatase alcalina é produzida por muitos tecidos,principalmente por ossos, fígado, intestino e placenta, e éexcretada pela bile. A dosagem sérica desta enzima éparticularmente útil na investigação das doençashepatobiliares e ósseas.Níveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem em pacientescom doenças ósseas caracterizadas por um aumento daatividade osteoblástica, como a osteite deformante,raquitismo, osteomalácia, hiperparatireoidismo, metástaseóssea, sarcoma osteogênico e doença de Paget.

Níveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem também empacientes com doenças obstrutivas das vias biliares,metástases hepáticas, doenças granulomatosas e na cirrosehepática. Nas doenças hepatocelulares como a hepatiteaguda viral, em geral ocorre um ligeiro aumento da enzima .

Níveis diminuídos da fosfatase alcalina são encontrados nadesnutrição crônica, na hipofosfatasemia e ocasionalmente nohipotireoidismo e anemia perniciosa.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0.1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0.1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Como ocorre em toda medição da atividade enzimática, arigorosa observação do tempo e da temperatura de incubaçãoé de grande importância para a qualidade dos resultadosobtidos.

4. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS.


1. IFCC Methods for the measurement of catalyticconcentration of enzymes-Part 5, IFCC method for AlkalinePhosphatase. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:731-47.

2. McComb RB, Bowers GN, Upretti A. Clin Chem1981;27:135-41.

3. Tietz NW, Burtis CA, Ducan P et al. Clin Chem 1983;29: 751-761.

�

�

�

�


*(incluindo adolescentes até 16 anos)

Conversão de U/Lpara Unidades SI: kat/L= U/Lx 0.0167

A tabela abaixo permite converter a atividade medida em umadeterminada temperatura para o valor que seria obtido namedição realizada em outras temperaturas.

a atividade enzimática obtida em 37°C deve sermultiplicada por 0.70 para se obter a atividade em 30°C ou por0.48 para se obter a atividade em 25°C.

Em 2 amostras com concentrações de Fosfatase Alcalinaiguais a 59 e 200 U/L foram adicionadas quantidadesdiferentes do analito, obtendo-se recuperação entre 94 e102%.

O método proposto foi comparado com método similarutilizando 40 amostras de soro com valores situados entre 47 e707 U/L. A avaliação estatística dos resultados resultou naequação da regressão y = 1.091x - 10.926 e um coeficiente decorrelação (r) igual a 0.999. O erro sistemático total (constantee proporcional) verificado no nível de decisão (100 U/L) foiigual a 2 U/L ou 2.0%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra protéica não contendo fosfatase alcalina foiutilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 2.4 U/L, equivalente à médiade 20 ensaios mais dois desvios padrão.

�

TEMPERATURA

Exemplo:


Especificidade




6

25 ºC 30 ºC 37 ºC

25 ºC ---- 1.45 2.08

30 ºC 0.69 ---- 1.43

37 ºC 0.48 0.70 ----

Fatores de correção da temperaturaTemperaturade trabalho

MÉDIAN DP CV (%)

Amostra 1 10 92 1.1 1.2

Amostra 2 10 174 1.6 0.9

Amostra 3 10 451 2.4 0.5

MÉDIAN DP CV (%)

Amostra 1 10 89 2.0 2.2

Amostra 2 10 175 2.8 1.6

Amostra 3 10 447 6.3 1.4

37 ºC

27 - 100Adultos (U/L)

Crianças* (U/L) 75 - 390

Revisão: Outubro, 2001 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 230306 Reprodução sob prévia autorização

4. Tonks DB Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.





CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br

APRESENTAÇÃO

Estão disponíveis as aplicações para sistemasautomáticos.

O número de testes em aplicações automáticas dependedos parâmetros de programação.




79-4/30Catálogo

4 x 24 mLReagente 1

4 x 6 mLReagente 2

GLICOSE HK LiquiformCat. 85ANVISA10009010052

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

Sistema enzimático para determinação da Glicose porfotometria ultravioleta de ponto final, em amostras de sangue,urina, líquor e líquidos ascítico, pleural e sinovial.Somente para uso diagnóstico in vitro

A adenosina trifosfato promove a fosforilação da glicose emuma reação catalisada pela hexoquinase (HK), de acordo coma seguinte reação:

HKGlicose + ATP Glicose-6-fosfato + ADP

A glicose-6-fosfato produzida na reação anterior é oxidada a6-fosfogluconato na presença da nicotinamida adeninadinucleótide (NAD), em reação catalisada especificamentepela glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH). Ocorre aprodução de um mol de NADH para cada mol de glicose-6-fosfato que é oxidado. A absorbância resultante, medida em340 nm, é diretamente proporcional à concentração da glicosena amostra.

G-6-PDHGlicose-6-fosfato + NAD 6-Fosfogluconato + NADH

A hexoquinase é uma enzima que catalisa a transferência dofosfato do ATP não somente para a glicose, mas também paraa D-frutose, D-manose, D-glucosamina e 2-deoxi-D-glicose.Como a G-6-PDH tem elevada especificidade para a glicose-6-fosfato, outras hexoses ou ésteres de pentose que sãofosforilados não participam da reação. Assim, o ensaio éextremamente específico para a glicose.

A especificidade da reação proporcionada pela G-6-PDHpossibilita a determinação da glicose urinária com um grauelevado de exatidão, o que não é conseguido quando seempregam sistemas utilizando outras enzimas comoreagentes.

Os dados da repetitividade e da reprodutibilidadedemonstram de modo inequívoco que o sistema Glicose HKLiquiform possui uma robustez extremamente desejável evaliosa para um sistema analítico.

As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídasadequadamente em dois reagentes, para conferir maiorestabilidade na forma líquida original e manutenção dascondições ótimas da reação, permitindo a utilização direta dosreagentes em sistemas automáticos.

A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando umReagente de Trabalho estável 60 dias sob refrigeração,obtendo-se desempenho adequado mesmo em situações debaixas demandas do teste. O sistema permite ainda preparar ovolume do Reagente de Trabalho necessário para umamedição da atividade enzimática da glicose.

O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos esemi-automáticos, capazes de medir com exatidão aabsorbância em 340 nm.

Bondar e Mead modificado.

REAGENTES1. Reagente 1 -

2. Reagente 2 -


RASTREABILIDADE DO SISTEMA




AMOSTRA

Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém tampão 90 mmol/L pH 7,4, ATP 4,1 mmol/L,NAD 3,3 mmol/L, cloreto de magnésio 10 mmol/L e azidasódica 7 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém Hexoquinase 4100 U/L; G-6-PDH 12500 U/L eazida sódica 15 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 30 °C.Após o manuseio armazenar bem vedado para evitarevaporação.O estabilizador do padrão pode precipitar-se em baixastemperaturas, o que não interfere em seu desempenho.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

A calibração do sistema é rastreável ao Standard ReferenceMaterial 917a do National Institute of Standards andTechnology.


Os reagentes de Glicose HK Liquiform contêm azida sódica,que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão eno caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamentecom grande quantidade de água e procurar auxílio médico. Aazida pode formar compostos altamente explosivos comtubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandesvolumes de água para descartar o reagente.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

Não utilizar o Reagente de Trabalho quando a sua absorbânciamedida a 340 nm contra a água for maior que 0,350.

Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em340 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.

Nas 24 horas que se sucedem à ingestão aguda de álcool,ocorre significativa redução da glicemia. As reduções podemtambém ser significativas nos indivíduos submetidos a jejumprolongado ou em obesos tratados com dietas com baixo valorcalórico.Pacientes diabéticos em uso continuado de clorpropamida(Diabinese) podem desenvolver hipoglicemias importantesque são muito difíceis de corrigir

Usar plasma, soro ou urina tomando as precauções a seguir. Aamostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo8 horas ou de acordo com recomendação médica.

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Instruções de UsoDIAGNÓSTICA

Pagina: 1

Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulantecontendo um inibidor da glicólise. O uso do anticoagulanteGlistab (Labtest Cat.29) permite a colheita de uma só amostrapara as dosagens de creatinina, glicose e uréia.As amostras de sangue não contendo antiglicolítico devem sercentrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ousoro, separados das células ou coágulo.Nas amostras de sangue tratadas com antiglicolítico, aconcentração da glicose permanece estável até 8 horas. Noplasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicosepermanece estável 3 dias entre 2 - 8 °C se não ocorrercontaminação microbiana .Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar oplasma ou soro em repouso durante 90 minutos antes de iniciara dosagem para não obter resultados falsamente diminuídos.

Em outros líquidos biológicos (líquor e líquidos ascítico, pleurale sinovial), adicionar anticoagulante contendo antiglicolítico namesma proporção usada para a amostra de sangue ecentrifugar antes da dosagem.

As amostras de urina devem ser armazenadas entre 2 - 8 °Cpara evitar interferências por contaminação microbiana.

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde material biológico humano não transmitem infecções, todaselas devem ser consideradas como potencialmenteinfectantes. Portanto, ao manuseá-las deve-se seguir asnormas estabelecidas para biossegurança.


Valores de Bilirrubina até 16 mg/dL, Hemoglobina até100 mg/dL e Triglicérides até 350 mg/dL não produzeminterferências significativas.Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL, Hemoglobina até160 mg/dL e Triglicérides até 1800 mg/dL produzeminterferências positivas que podem ser minimizadas utilizandoo branco da amostra.Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando ozero com água deionizada ou destilada.


este procedimento é aplicável quandohouver ação positiva de interferentes. Misturar 1,0 mL de NaCl150 mmol/L (0,85%) com 0,01 mL da amostra. Medir aabsorbância em 340 nm acertando o zero com águadeionizada ou destilada. Subtrair a absorbância assim obtidada absorbância do teste e calcular a concentração.

O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco doReagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho.Transferir o conteúdo de um frasco de Reagente 2 para umfrasco de Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar adata de expiração. Estável 5 dias entre 15 - 25 °C e 60 diasentre 2 - 8°C quando não houver contaminação química oubacteriana. Identificar o frasco do Reagente de Trabalho paraevitar confusão com outros frascos do Reagente 1. Parapreservar seu desempenho o reagente deve permanecer forada geladeira somente o tempo necessário para se obter ovolume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.

6

INTERFERÊNCIAS

Branco da amostra:

PREPARO DO REAGENTE DE TRABALHO

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�

405

415

Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagentede Trabalho utilizando-se da proporção de 4 (quatro) volumesdo Reagente 1 para 1 (um) volume do Reagente 2.Ex.: Para preparar 1,0 mL do Reagente de Trabalho, misturar0,8 mLdo R1 com 0,2 mLdo R2.

O Reagente de Trabalho contém tampão 72 mmol/L pH 7,4,ATP 3,3 mmol/L, NAD 2,6 mmol/L, Hexoquinase 820 U/L,G-6-PDH 2500 U/L, cloreto de magnésio 8,0 mmol/L, azidasódica 9 mmol/L.


Misturar e incubar em banho maria a 37 ºC durante 5 minutos.O nível da água no banho deve ser superior ao nível dosreagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbânciasdo teste e padrão em 340 nm, acertando o zero com o branco.Aabsorbância é estável 60 minutos.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste,e o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em casode redução dos volumes é fundamental que se observe ovolume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumesda amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.

Ver linearidade.

Absorbância doTesteGlicose (mg/dL) = x 100


ATeste = 0,322APadrão = 0,357

0,322Glicose (mg/dL) = x 100 = 90

0,357

Devido à grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, o método do fator pode ser empregado

100Fator de calibração =


Glicose (mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator

100Fator = = 280

0,357

Glicose (mg/dL) = 0,322 x 280 = 90

�

�

PROCEDIMENTO

CÁLCULOS

Exemplo:

Exemplo:

DIAGNÓSTICA

Pagina: 2

Amostra ---- 0,01 mL ----

Reagente de Trabalho 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

---- ---- 0,01 mLPadrão


Plasma (jejum de 8 horas):

Líquor: 2/3 da glicemia quando a medição é realizada emamostras colhidas simultaneamente.Urina: menor que 20 mg/dLou até 250 mg/24 horas


Em duas amostras com concentrações de glicose iguais a118 e 320 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito, obtendo-se uma recuperação entre 96 e 108%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de120 mg/dL foi igual a 2,4 mg/dLou 2,0%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 40 amostras com valores situados entre25 e 590 mg/dL. A comparação resultou na equação daregressão y = 0,995x + 1,01 e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,999. O erro sistemático total (constante eproporcional) verificado no nível de decisão (120 mg/dL) foiigual a 0,41 mg/dL ou 0,34%. Como as amostras foramselecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório epacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método temuma especificidade metodológica adequada.

Uma amostra protéica não contendo glicose foi utilizada paracalcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontradoum valor igual a 2,9 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaiosmais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância dopadrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecçãofotométrica é de 0,0277 mg/dL, correspondendo a umaabsorbância igual a 0,0001.

Três amostras com valores iguais a 500, 700 e 1000 mg/dLforam utilizadas para avaliar a resposta do sistema nasdiluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 8, encontrou-se umarecuperação entre 95 e 103%.


Especificidade


Reprodutibilidade Imprecisão total



8

mg/dLx volume (mL)urina (mg/24 horas) =

100

O padrão é rastreável ao (SRM)917a do(NIST).

Obter o fator de calibração ao usar novo lote dereagentes ou quando o controle interno da qualidadeindicar.

Branco de reagentes: água ou solução de cloreto desódio 150 mmol/L (0,85%);Padrões: usar cal ibradores protéicos. Asconcentrações de Glicose no Calibra 1 e Calibra 2 sãorastreáveis ao SRM 965 do NIST.

Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração do branco ao usar novo frasco dereagente;Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controleinterno da qualidade indicar.

A reação é linear até 700 mg/dL. Para valores maiores, diluir aamostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar novadeterminação e multiplicar o resultado obtido pelo fator dediluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado sesitue entre 80 e 200 mg/dL. Sugerimos a verificação dalinearidade metodológica e fotométrica, no mínimosemestralmente, utilizando amostras com valores até700 mg/dL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter umsistema definido para monitorizar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira no laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 5% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para verificar a estabilidade do sistema de medição.


Os valores abaixo substituem os valores de referência. Estesvalores foram determinados pela American DiabetesAssociation (ADA) a partir de dados epidemiológicostratados estatisticamente e relacionam os níveis deglicose com o risco de desenvolver diabetes mellitus(Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1): S5-S10 ou

CALIBRAÇÃO




LINEARIDADE



Standard Reference MaterialNational Institute of Standards and Technology

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�

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�

7

http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).

Pagina: 3

DIAGNÓSTICA

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 10 86 1,08 1,25

Amostra 2 10 165 1,62 0,98

Amostra 3 10 302 3,78 1,25

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 10 88 2,52 2,90

Amostra 2 10 169 3,78 2,20

Amostra 3 10 300 5,04 1,70

70 a 99 mg/dL Glicemia de jejum normal

� a 126 mg/dL Provável Diabetes Mel l i tus:O diagnóstico de diabetes deveser confirmado em nova amostracolhida em dia subseqüente.

Glicemia de jejum alterada100 a 125 mg/dL



OBSERVAÇÕES

Valores elevados de glicose ocorrem nos vários tipos dediabetes primários, nos estados de intolerância à glicose e nodiabetes secundário a várias doenças (hipertireoidismo,hiperpituitarismo, hiperadrenocorticismo, etc.). Para umarevisão dos critérios diagnósticos e classificação dodiabetes mellitus consultar Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1):S5-S10 ou:

Valores diminuídos de glicose ocorrem nas hipoglicemias quepodem ser devidas a várias causas. Quando a ocorrência desintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duasformas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia dojejum e pós-prandial.As causas mais comuns de hipoglicemia do jejum são:hiperinsulinismo endógeno (insulinoma e sulfonilurea),hiperinsulinismo exógeno (factício), tumores extrapancreáticos,síndrome auto imune ( formação expontânea de anticorpospara receptores da insulina), insuficiência supra-renal e ouhipofisária, doença hepática grave e alcoolismo.A hipoglicemia pós-prandial, dependendo da história clínica eda resposta ao teste oral de tolerância à glicose, é classificadaem hipoglicemia alimentar, do diabético tipo II, do paciente comintolerância à glicose, funcional ou reativa.

Para uma revisão dos critérios diagnósticos e classificação dodiabetes mellitus consultar Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1):S5-S10 ou:

A redução da concentração de glicose nos líquidos corporaisencontra-se usualmente relacionada a processosinflamatórios ou infecciosos.

A determinação da concentração de glicose no líquorrepresenta um dos parâmetros para a distinção entremeningite bacteriana e virótica tendo, porém, sensibilidadeinferior à avaliação da celularidade no mesmo material.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS

, 3ª edição, Washington:AACC Press,1990.



�

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Effects of Drugs onClinical Laboratory Tests

REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO


SERVIÇO DEAPOIOAO CLIENTE


1. Bergmeyer HU. Methods of Enzimatic Analisys, 3ed, vol 6,Deerfield Beach: Verlag Chemie,1984;163-172.

2. Bjorkem I, Blomstrand R, Falk O, and Ohman G. Clin ChimActa 1976;72:353-62.

3. Bondar RJL, Mead D. Clin Chem 1974;20:586-90.

4. Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas deVerificação paraAvaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro,1997.

5. Kaplan LA, Pesce AJ.: Methods in Clinical Chemistry, St.Louis: The C.V. Mosby Co., 1987;105-11.

6. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia:W.B. Saunders Co, 1970;155.


8. Labtest : Dados deArquivo.




Estão disponíveis as aplicações para sistemas automáticos.

CGC: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br

Pagina: 4

DIAGNÓSTICA

85-4/50

1,0 mL

4 x 10 mL

200

4 x 40 mL

1 x 5 mL

Catálogo

Nº de testes

Volume/teste

Reagente 1

Reagente 2

Padrão

PROTEÍNAS TOTAISCat. 99ANVISA10009010080

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

1. Reagente Biureto - Reagentepronto para uso.

2. Padrão 4,0 g/dL -


Sistema para a determinação colorimétrica das ProteínasTotais em amostras de sangue e líquidos pleural, sinovial eascítico por reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.

Os íons cobre (Cu ) em meio alcalino (Reagente de Biureto)reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricasformando cor púrpura, que tem absorbância máxima em545 nm, proporcional à concentração das proteínas naamostra.

O sistema Proteínas Totais da Labtest é um método direto erápido que tem elevada sensibilidade, associada com aespecificidade da reação de biureto que é uma das reaçõesmais simples e exatas para determinação das proteínas emlíquidos biológicos. O reagente possui excelente estabilidade eresposta semelhante para todas as proteínas do soro.

Concentrações moderadas de bilirrubina e hemoglobinapresentes na amostra não provocam erros significativos. Asconcentrações de triglicérides maiores que 500 mg/dLproduzem interferências positivas que podem ser minimizadasutilizando branco de amostra ou aplicando fotometria de leiturabicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundárioem 700 nm.

O sistema é facilmente aplicável em analisadores semi-automáticos e automáticos capazes de medir com exatidão aabsorbância entre 530 e 550 nm.

Biureto.

REAGENTESArmazenar entre 15 - 30 °C.

Contém hidróxido de sódio 600 mmol/L, sulfato de cobre12 mmol/L, estabilizador e antioxidante. Manusear comcuidado. Reagente corrosivo. Não pipetar com a boca.

Armazenar entre 15 - 30 °C. Armazenarbem vedado para evitar evaporaçãoContém albumina bovina 4 g/dLe azida sódica 14,6 mmol/L.


Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação dos reagentes que não devem ser pipetados coma boca. O Reagente Biureto contém hidróxido de sódio que écorrosivo e pode produzir queimaduras. No caso de contatocom os olhos deve-se lavar imediatamente com grandequantidade de água e procurar auxílio médico. Em caso deingestão oferecer grande quantidade de água com suco delimão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurar auxíliomédico. Devem-se utilizar os equipamentos de proteçãoadequados para manipular reagentes corrosivos.

+2

O Padrão contém azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomarcuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com osolhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar oreagente.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas e manuseados de acordo com as boaspráticas de laboratório, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.

Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre530 e 550 nm e opcionalmente entre 700 e 800 nm.Analisador automático capaz de processar 1 reagente (paraaplicações automáticas).Pipetas para medir amostras e reagentes (aplicaçõesmanuais).Cronômetro (para aplicações manuais).

Em amostras colhidas durante a manhã, as concentrações dasproteínas são 3% maiores que em amostras colhidas noperíodo da tarde. A mudança da posição em pé para a posiçãodeitada, provoca uma passagem de líquido do espaçoextravascular para os espaços intravasculares, que podereduzir as concentrações relativas das proteínas e dos analitosligados às proteínas em até 10%. No período de gestação,devido ao aumento do líquido intravascular, a proteína totaldiminui significativamente podendo apresentar reduções deaté 14%.

Quando o torniquete é mantido por mais de 3 minutos durantea colheita da amostra, ocorre um aumento de até 5% no valorda proteína total no sangue. Exercícios físicos aumentam asconcentrações das proteínas.

Soros fortemente hemolisados ou contendo expansores deplasma (Dextran, PVP e Hemacel) nas amostras leva aobtenção de resultados falsamente elevados.


Usar soro e líquidos (pleural, sinovial e ascítico). As proteínassão estáveis 3 dias entre 2 - 8 °C e 7 dias a 10 °C negativos.

A metodologia não é adequada para a dosagem das proteínasna urina ou no líquor. Para estas amostras deve ser utilizada ametodologia proposta por Meulemans e Pennock , ou utilizaro produto Sensiprot Labtest, (Cat. 36).

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.




AMOSTRA

5 6

Instruções de Uso

INTERFERÊNCIAS

Minimização daAção de InterferentesBranco da Amostra:

PROCEDIMENTO

CÁLCULOS

As concentrações de bilirrubina até 32 mg/dL, hemoglobina até130 mg/dL e triglicérides até 500 mg/dL não produzeminterferências significativas.

Concentrações de triglicérides entre 500 mg/dL e 1100 mg/dLproduzem interferências positivas que podem ser minimizadasutilizando o Branco da Amostra ou fotometria de leiturabicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundárioem 700 nm.

Concentrações de hemoglobina maiores que 130 mg/dLproduzem interferências positivas que não podem serminimizadas utilizando o Branco da Amostra.



Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,02 mL da amostra. Medir a absorbância em 545nm, acertando o zero com água destilada ou deionizada.Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste ecalcular a concentração. Este sistema de correção só pode seraplicado nos casos em que a amostra produz umainterferência fotométrica como ocorre nas amostras lipêmicasou com concentração de bilirrubina maior que 32 mg/dL.


Misturar e incubar a 37 °C durante 10 minutos. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 545 nm (530 a 550),acertando o zero com o branco.Acor é estável durante 1 hora.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste.O procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.

Ver linearidade.

Absorbância do testeProteínas Totais = x (4 g/dL)


�

�

405

415

Exemplo:

Exemplo:

CALIBRAÇÃO




LINEARIDADE



0,405Proteínas Totais = x 4 g/dL= 6,80 g/dL

0,238

Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator para calcularas concentrações das amostras com absorbância dentro dointervalo de linearidade.

4 g/dLFator de calibração =


Proteínas Totais =Absorbância do teste x Fator (g/dL)

4 g/dLFator = = 16,80 g/dL

0,238

Proteínas Totais = 0,405 x 16,80 g/dL= 6,80 g/dL

A concentração de proteínas no Padrão (No. 2) e noscalibradores da serie Calibra é rastreável ao

(SRM) 927 do(NIST).

Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentesou quando o controle interno da qualidade indicar.

Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio150 mmol/L (0,85%);Usar os calibradores da linha Calibra Labtest.

Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle internoda qualidade indicar.

O resultado da medição é linear entre 1,0 e 14,0 g/dL. Paravalores maiores diluir a amostra com NaCI 150 mmol/L(0,85%) e repetir a medição. Multiplicar o resultado obtido pelofator de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valorencontrado se situe entre 4,0 e 8,0 g/dL. Sugerimos averificação da linearidade metodológica e fotométrica, nomínimo semestralmente, utilizando amostras com valores até14,0 g/dL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,objetivos, procedimentos, critérios para especificações daqualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registrodas atividades. Ao mesmo tempo deve manter um sistemadefinido para monitorar a variabilidade analítica que ocorre emtodo o sistema de medição. Portanto, o uso de controles paraavaliar a imprecisão e inexatidão das determinações deve serprática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usar umcontrole com um valor situado na faixa de referência ou nonível de decisão e outro controle com um valor em outro nívelde significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado decontrole para que o coeficiente de variação máximo seja

2,0% com um erro total em relação ao valor real 5,2 % ouentão utilizar um sistema de regras de controle para verificar aestabilidade do sistema de medição.

StandardReference Material National Institute ofStandards and Technology

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TESTEBRANCO PADRÃO

Amostra 0,02 mL--- ---

0,02 mL------Padrão (n° 2)

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1,0 mL

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1,0 mL

0,02 mL

1,0 mL

Água destiladaOu deionizada

Reagente Biureto

Especificações de erro máximo baseadas na VariaçãoBiológica: Imprecisão (CV%) 2,0%; Bias: ± 1,8%; Erro total:

5,2%.

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.


6,0 a 8,0 g/dL.Conversão: Unidades Convencionais (g/dL) x 10 = UnidadesSI (g/L).

Em duas amostras com concentração de Proteína igual a6,3 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analito,obtendo-se recuperações entre 99,4 e 99,6%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de 6,0 g/dLé igual a 0,03 g/dLou 0,5%.

O método Proteínas Totais Labtest foi comparado com outrométodo utilizando tecnologia similar, sendo obtidos osseguintes resultados:

O erro sistemático médio é igual a 1,75% no nível de decisão6,0 g/dL e 0,44% no nível de decisão 8,0 g/dL. Os erros sãomenores que o erro sistemático analítico da especificaçãobaseada na variação biológica que é 1,8%. Confirma-se ahipótese nula de que as diferenças entre o método ProteínasTotais Labtest e o método comparativo não se desviam emmais que o desvio provocado pelas imprecisões inerentes,caracterizando a identidade ou relação funcional entre osmétodos. O erro total (erro aleatório + erro sistemático)estimado em um nível de decisão igual a 6,0 g/dL, é igual a0,11 g/dL ou 3,55%. O método Labtest é substancialmenteequivalente ao método comparativo. O coeficiente decorrelação (0,999) confirma a força da relação entre osmétodos.

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Soro:


Estudos de comparação de métodos


8


Sensibilidade Metodológica

Efeitos da Diluição da Matriz


OBSERVAÇÕES

Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, olimite de detecção fotométrica é 0,0168 g/dL, correspondendoa uma absorbância igual a 0,001.

Duas amostras com valores iguais a 12,3 e 15,1 g/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L. Usando um fator de diluiçãoigual a 2, foram encontradas recuperações entre 100,5% e101,3%. Os erros sistemáticos encontrados sãosignificativamente menores que o bias analítico daespecificação baseada nos componentes da variaçãobiológica.

A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, porque aalteração em uma das frações pode ser compensada poralteração oposta de outra fração, como ocorre nas doençascrônicas em que há diminuição de albumina com aumento degamaglobulina. Ocorrência similar pode ser observada emrespostas de fase aguda, tais como infecções ou traumas,ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas nofígado aumentam sua concentração, enquanto a albumina sereduz, mantendo a concentração protéica total praticamenteinalterada.

As proteínas estão aumentadas em algumas neoplasias,especialmente em mieloma múltiplo; na macroglobulinemia;doenças autoimunes, como artrite reumatóide e lupuseritematoso sistêmico; doenças granulomatosas como asarcoidose, leishmaniose visceral; endocardite bacterianasub-aguda e linfogranuloma; em alguns casos de doençahepática crônica, como hepatite autoimune e na desidratação.As proteínas estão diminuídas na gravidez; hiperhidratação,desnutrição grave, cirrose e outras doenças hepáticas,incluindo alcoolismo crônico; imobilização prolongada;insuficiência cardíaca; nefrose e insuficiência renal;hipertireoidismo; deficiência de cálcio e vitamina D e nasíndrome de má absorção.

Adosagem de proteína no líquido sinovial tem sensibilidade de52% e especificidade de 56% nas doenças inflamatórias. Adeterminação da concentração de proteínas no líquido pleuralé de pouco valor, exceto quando combinada com outrosparâmetros que permitam fazer a diferença entre exsudato etransudato. Em 15 a 20% dos indivíduos com hepatopatiasacompanhadas de ascite, a concentração de proteína nolíquido ascítico é superior a 2,5 g/dL. Nos pacientes com ascitede etiologia neoplásica, as concentrações de proteínas sãomenores que 2,5 g/dL.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para usar nas medições,

Média das estimativas (g/dL)

Equação da regressão

Coeficiente de correlação

Erro sistemático médio (g/dL)

Intervalo de concentração (g/dL)

2020Número de amostras

MétodoComparativo

Proteínas TotaisLabtest

2,68 a 12,352,53 a 12,45

7,72

0,999

0,05

Método Labtest =0,965xComparativo + 0,315 g/dL

7,77

MÉDIAN DP (g/dL) CV%

Amostra 1 20 4,68 0,03 0,64

Amostra 2 20 6,40 0,04 0,63

Amostra 3 20 8,20 0,05 0,61

MÉDIAN DP (g/dL) CV%

Amostra 1 20 4,68 0,05 1,07

Amostra 2 20 6,40 0,07 1,09

Amostra 3 20 8,20 0,06 0,73

Labtest Diagnóstica S.A.CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br

Revisão: Agosto, 2005. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 180805 Reprodução sob prévia autorização

deve ter resistividade 1 megaohm ou condutividade1 microsiemens e concentração de silicatos < 0,1 mg/L (água

tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água pode ser do tipo III,com resistividade 0,1 megaohms ou condutividade

10 microsiemens. No enxágüe final utilizar água tipo II.Quando a coluna deionizadora está com sua capacidadesaturada ocorre a produção de água alcalina com liberação devários íons, silicatos e substâncias com grande poder deoxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucosdias ou mesmo horas, alterando os resultados de modoimprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programade controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/

1. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of ClinicalC h e m i s t r y , 2 a . E d i ç ã o , W B S a u n d e r sCompany:Philadelphia, 1986, 695-700.

2. Faulkner WR, Meites S. Selected Methods for theS m a l l C l i n i c a l C h e m i s t r y L a b o r a t o r y ,AACC:Washington,1982;9:317-320.

3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry,Principles and Technics, 2a. Edição. Harper & Row:NewYork, 1974,405-435.

4. Inmetro - Boas Praticas de Laboratório Clínico e Listas deVerificação para Avaliação, Qualitymark eds:Rio de Janeiro,1997.

5. Meulemans O. Clin ChimActa 1960;5:757.

6. Pennock CA., Passant LP, Bolton FG. J Clin Path1968;21:518.





Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected] Estão disponíveis aplicações parasistemas automáticos.

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REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO



Catálogo

Reagente Biureto

Padrão

99-100

1 x 3 mL

1 x 100 mL

99-250

1 x 250 mL

1 x 3 mL

TRANSAMINASEOXALACÉTICACat. 52ANVISA10009010031

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

REAGENTES1. TGO Substrato

2. Reagente de Cor

3. NaOH - Estoque -

4. Padrão


Sistema para medida da atividade da TransaminaseOxalacética (TGO) em amostra de sangue por método cinéticode tempo fixo e medição de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.

A transaminase oxalacética promove a transferência degrupamentos amina de -aminoácidos para -cetoácidos.

TGOL-Aspartato + -cetoglutarato Glutamato + Oxalacetato

O oxalacetato formado é medido através da formação dehidrazona, a qual tem intensa cor em meio alcalino.

O sistema Transaminase Oxalacética Labtest contém todos osreagentes necessários a uma segura determinação, utilizandoum processo em 4 etapas e permitindo que a fotometria sejarealizada em qualquer fotômetro que tenha filtros com emissãoentre 490 a 540 nm.

Os reagentes são rigorosamente padronizados e estabilizadosvisando à manutenção de rígidas e ótimas condições para aação enzimática.

O hidróxido de sódio é preparado e titulado em condições derigoroso controle, o que elimina a presença de carbonato eassegura uma ação correta do reagente.

Reitman e Frankel.

-Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém tampão 67 mmol/L, pH 7,4; ácido -cetoglutárico2,0 mmol/L, ácido L-aspártico 99 mmol/L e azida sódica15,4 mmol/L.

- Armazenar entre 2 - 8 ºC. Não congelar.Contém 2,4-dinitrofenilhidrazina 1,0 mmol/L e ácido clorídrico1,0 mol/L.

Armazenar entre 15 - 25 ºC.Contém hidróxido de sódio 1,25 mol/L. Reagente corrosivo.

-Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém piruvato de sódio 2 mmol/L. Após o manuseiosugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação.


Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação de reagentes.

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O NaOH - Estoque contém hidróxido de sódio que é corrosivo epode produzir queimaduras.

O TGO Substrato contém azida sódica que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar oreagente.

Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosaobservação do tempo e da temperatura de incubação é degrande importância para a qualidade dos resultados obtidos. Adiferença de 1 minuto no tempo de incubação desta dosagemintroduz um erro de 3,3% nos resultados.

Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC)Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre490 e 540 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.

Amostras hemolisadas produzem interferência positiva devidoà elevada concentração de TGO nas hemácias.

O alcoolismo crônico aumenta a atividade da TGO de 18 a100%.


Usar soro ou plasma (EDTA, heparina) e líquor. A atividadeenzimática é estável 4 dias entre 2 - 8 ºC e 2 semanas a 10 ºCnegativos.



Valores de Bilirrubina até 5 mg/dL e Triglicérides até 170 mg/dLnão produzem interferências significativas.

Amostras hemolisadas produzem interferência positiva devidoà elevada concentração de TGO nas hemácias.

Valores de Triglicérides entre 170 e 900 mg/dL produzeminterferência positiva que pode ser minimizada utilizando oBranco deAmostra.

Misturar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,05 mL da amostra. Medir a absorbância em505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zero com águadestilada ou deionizada. Subtrair a absorbância assim obtidada absorbância do teste e obter a atividade da transaminaseoxalacética utilizando a curva de calibração. Este sistema decorreção é aplicável apenas nos casos em que a amostraproduz interferência fotométrica.



AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

Minimização daAção de InterferentesBranco de Amostra:

Instruções de Uso

PREPARO DO REAGENTE

NaOH de Uso:

CURVADE CALIBRAÇÃO

TRAÇADO DACURVADE CALIBRAÇÃO

PROCEDIMENTO

Ver observações 1 e 2.

Transferir quantitativamente o conteúdo do frasco nº 3(160 mL) para um balão volumétrico ou proveta, completarpara 500 mL com água destilada ou deionizada livre de CO ehomogeneizar. Estável 12 meses em recipiente de plásticoentre 15 - 25 ºC.

A água utilizada deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L.

Como o sistema de medida Reitman-Frankel (Unidades/mL)não segue a lei de Beer, é impossível utilizar o método do fatorpara cálculo, sendo necessária a preparação de curva decalibração.


Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos.Determinar as absorbâncias ou T% em 505 nm ou filtro verde(490 a 540), acertando o zero com água destilada oudeionizada.Acor é estável por 60 minutos.

Traçar a curva de calibração correlacionando as leiturasobtidas com os valores em Unidades/mL expressos na tabelaabaixo, utilizando papel linear (para absorbâncias) ou monolog(para T%).

Ver observação 3.

Tomar 1 tubo de ensaio e proceder como a seguir:

Incubar em banho-maria a 37 ºC durante 2 minutos. O nível daágua no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nostubos de ensaio.

Misturar e incubar em banho-maria a 37 ºC exatamente 60minutos.

Misturar e deixar a temperatura ambiente 20 minutos.

2

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Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbâncias ouT% em 505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zerocom água destilada ou deionizada.Acor é estável 60 minutos.

Obter o valor de TGO usando a curva de calibração (verDesempenho do Sistema).


Quando for obtido um valor igual ou maior que 190Unidades/mL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontradose situe entre 50 e 150 Unidades/mL. Sugerimos a verificaçãodo desempenho do sistema no mínimo semestralmente,utilizando amostras com valores até 190 Unidades/mL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para avaliação do estado de controle.

Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.


Soro: 4 a 36 Unidades/mL

UI = Unidades/mLx 0,482

Em duas amostras com concentrações de transaminaseoxalacética iguais a 22 e 129 Unidades/mL foram adicionadasquantidades diferentes da enzima obtendo-se recuperaçõesentre 104 e 108%. O erro sistemático proporcional médioobtido em um valor de 60 Unidades/mL foi igual a 3,6Unidades/mLou 6,0%.

DESEMPENHO DO SISTEMA




7

8

mLmL mLmL mLmL mLmL mLmL

Tubo nºTubo nº 11 22 33 44 55

Água destilada ou deionizada 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Reagente de Cor (nº 2) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Padrão (nº 4) --- 0,1 0,2 0,3 0,4

TGO Substrato (nº 1) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6

NaOH de Uso 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

Zero 24 61 114 190TGO (Unidade/mL)

Tubo nº 1 2 3 4 5

0,25 mLTGO Substrato (nº 1)

Teste

Amostra 0,05 mL

Reagente de Cor (nº 2) 0,25 mL

NaOH de Uso 2,5 mL

Várias drogas comumente usadas encontram-se relacionadasao aumento da AST: isoniazida, fenotiazinas, eritromicina,progesterona, esteróides, opiáceos, indometacina, halotano emetildopa.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

3. Para uma revisão das fontes medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia, sugere-seconsultar Young, DS.

, 3 edição, Washington:AACC Press, 1990.

1. KarmenA. J Clin Invest 1955;34:131.

2. Reitman S, Frankel S.Am J Clin Path 1957;28:56.

3. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B.Saunders Co, 1970.


5. Varley H. Practical Clinical Biochemistry, Willian HeinemannMedical Book Ltd. 1967.

6. Wroblewski F, Cabaud P.Am J Clin Path 1957;27:235.



Termos e Condições de Garantia A Labtest Diagnósticagarante o desempenho deste produto dentro dasespecificações até a data de expiração indicada nos rótulos,desde que os cuidados de utilização e armazenamentoindicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidoscorretamente.

OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO


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Effects of Drugs on Clinical LaboratoryTests

a

Especificidade


Reprodutibilidade Imprecisão total




O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre 11 e 174Unidades/mL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 0,895x - 6,818 e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,99. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (60 Unidades/mL) foi igual a 13Unidades/mL ou 22%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra protéica não contendo transaminase oxalacéticafoi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 5,0 Unidades/mL, equivalenteà média de 20 ensaios mais dois desvios padrão.

Duas amostras com valores iguais a 149 e 165 Unidades/mLforam utilizadas para avaliar a resposta do sistema nasdiluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 88 e 100%.

Elevações das transaminases ocorrem na hepatite (viral etóxica), na mononucleose, cirrose, colestase, carcinomahepático primário ou metatástico, pancreatite, traumatismoextenso e no choque prolongado. Nas hepatopatias agudas,geralmente, o valor da transaminase pirúvica (ALT) excede oda oxalacética (AST).

Atransaminase oxalacética quase sempre está elevada após oinfarto agudo do miocárdio, fato incomum para a pirúvica. Atransaminase oxalacética começa a elevar-se 6 a 12 horasapós o infarto para alcançar o pico máximo entre 24 a 48 horas,normalizando-se pelo 5º ou 6º dia. Deve-se ressaltar que asensibilidade e especificidade da dosagem de AST nodiagnóstico do infarto agudo do miocárdio são baixas,tornando a determinação desta enzima a menos indicada paraeste diagnóstico.

Auremia encontra-se associada à queda da AST.

Elevações significativas da atividade daAST no líquor têm sidoobservadas em pacientes com acidentes cerebrovasculares.Se o nível sérico da enzima encontra-se também elevado,trata-se provavelmente de dano maciço ao parênquimacerebral. Neoplasias envolvendo o cérebro e a medulaespinhal são acompanhadas de vários graus de elevação naatividade da AST no líquor.

Nos indivíduos com meningite bacteriana observam-se,usualmente, valores dentro da faixa de referência.

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 19 1,53 7,9

Amostra 2 20 61 2,66 4,4

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 20 2,86 14,7

Amostra 2 20 59 3,85 6,53

1 x 50 mL

1 x 4 mL

1 x 50 mL

1 x 160 mL

TGO Substrato

Reagente de Cor

NaOH - Estoque

Padrão

Catálogo

Nº de testes

Volume/Teste

52-200

3,0 mL

200





CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br

TRANSAMINASEPIRÚVICACat. 53ANVISA10009010027

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

REAGENTES1. TGP Substrato

2. Reagente de Cor

3. NaOH - Estoque

4. Padrão


Sistema para medida da atividade da Transaminase Pirúvica(TGP) em amostra de sangue por método cinético de tempofixo e medição de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.

A transaminase pirúvica promove a transferência degrupamentos amina de -aminoácidos para -cetoácidos.

TGPL- Alanina + -cetoglutarato Glutamato + Piruvato

O piruvato formado é medido através da formação dehidrazona, a qual tem intensa cor em meio alcalino.

O sistema Transaminase Pirúvica Labtest contém todos osreagentes necessários a uma segura determinação, utilizandoum processo em 4 etapas e permitindo que a fotometria sejarealizada em qualquer fotômetro que tenha filtros com emissãoentre 490 a 540 nm.

Os reagentes são rigorosamente padronizados e estabilizadosvisando à manutenção de rígidas e ótimas condições para aação enzimática.

O hidróxido de sódio é preparado e titulado em condições derigoroso controle, o que elimina a presença de carbonato eassegura uma ação correta do reagente.

Reitman e Frankel.

-Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém tampão 67 mmol/L, pH 7,4; ácido -cetoglutárico2,0 mmol/L; L-alanina 100 mmol/Le azida sódica 15,4 mmol/L.

- Armazenar entre 2 - 8 °C. Não congelar.Contém 2,4-dinitrofenilhidrazina 1,0 mmol/L e ácido clorídrico1,0 mol/L.

-Armazenar entre 15 - 25 °C.Contém hidróxido de sódio 1,25 mol/L. Reagente corrosivo.

-Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém piruvato de sódio 2 mmol/L. Após o manuseiosugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação.



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O NaOH - Estoque contém hidróxido de sódio que é corrosivo epode produzir queimaduras.

O TGP Substrato contém azida sódica que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar oreagente.

Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosaobservação do tempo e da temperatura de incubação é degrande importância para a qualidade dos resultados obtidos. Adiferença de 1 minuto no tempo de incubação desta dosagemintroduz um erro de 3,3% nos resultados.

Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C)Fotômetro capaz de medir, com exatidão, absorbância entre490 e 540 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.

Exercícios em excesso (alta atividade) diminuem a atividadedaALT.

Em pessoas do sexo feminino de todas as idades, a atividadedaALT é mais baixa que em indivíduos do sexo masculino.

Esteróides anabólicos, andrógenos, cloranfenicol,clorotiazida, uso prolongado de aspirina, gentamicina, entreoutros, podem provocar um aumento da atividade da TGP.


Usar soro ou plasma (EDTA, heparina) e líquor. A atividadeenzimática é estável 4 dias entre 2 - 8 °C e 2 semanas a 10 °Cnegativos.



Valores de Bilirrubina até 5 mg/dL, Hemoglobina até 90 mg/dLe Triglicérides até 250 mg/dL não produzem interferênciassignificativas.

Valores de Hemoglobina até 180 mg/dL e Triglicérides entre250 e 750 mg/dL produzem resultados falsamente elevadosque podem ser corrigidos utilizando o branco de amostra.

Valores de Bilirrubina acima de 5 mg/dL e Triglicérides acimade 750 mg/dL produzem resultados falsamente elevados.Neste caso o branco de amostra não é aplicável.



AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

Instruções de Uso



Misturar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,05 mL da amostra. Medir a absorbância em505 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada.Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste eobter a atividade da transaminase pirúvica utilizando a curvade calibração. Este sistema de correção é aplicável apenasnos casos em que a amostra produz interferência fotométrica.


Transferir quantitativamente o conteúdo do frasco nº 3(160 mL) para um balão volumétrico ou proveta, completarpara 500 mL com água destilada ou deionizada livre de CO ehomogeneizar. Estável 12 meses em recipiente de plásticoentre 15 - 25 °C.

A água utilizada deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos0,1 mg/L.

Como o sistema de medida Reitman-Frankel (Unidades/mL)não segue a lei de Beer, é impossível utilizar o método do fatorpara cálculo, sendo necessária a preparação de curva decalibração.



Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos.Determinar as absorbâncias ou T% em 505 nm ou filtro verde(490 a 540), acertando o zero com água destilada oudeionizada.Acor é estável 60 minutos.

Traçar a curva de calibração correlacionando as leiturasobtidas com os valores em Unidades/mL expressos na tabelaabaixo, utilizando papel linear (para absorbâncias) ou monolog(para T%).

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405

415

2

Minimização daAção de InterferentesBranco de Amostra:

PREPARO DO REAGENTE

NaOH de Uso:

CURVADE CALIBRAÇÃO

TRAÇADO DACURVADE CALIBRAÇÃO

PROCEDIMENTO

DESEMPENHO DO SISTEMA


Ver observação 3.

Tomar 1 tubo de ensaio e proceder como a seguir:

Incubar em banho-maria a 37 °C durante 2 minutos. O nível daágua no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nostubos de ensaio.

Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C por exatamente 30minutos.


Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbâncias ouT% em 505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zerocom água destilada ou deionizada.Acor é estável 60 minutos.

Obter o valor de TGP usando a curva de calibração (verDesempenho do Sistema).


Quando for obtido um valor igual ou maior que 150Unidades/mL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado pelo fator dediluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado sesitue entre 50 e 120 Unidades/mL. Sugerimos a verificação dodesempenho do sistema, no mínimo semestralmente,utilizando amostras com valores até 150 Unidades/mL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para avaliação do estado de controle.7

mLmL mLmL mLmL mLmL mLmL

Tubo nºTubo nº 11 22 33 44 55

Água destilada ou deionizada 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Reagente de Cor (nº 2) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Padrão (nº 4) --- 0,1 0,2 0,3 0,4

TGP Substrato (nº 1) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6

NaOH de Uso 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0

Zero 28 57 97 150TGP (Unidades/mL)

Tubo nº 1 2 3 4 5

0,25 mLTGP Substrato (nº 1)

Teste

Amostra 0,05 mL

Reagente de Cor (nº 2) 0,25 mL

NaOH de Uso 2,5 mL

No infarto agudo do miocárdio, os valores de ALT encontram-se dentro da faixa de referência ou ligeiramente aumentados.Elevações da ALT também são relatadas na polimiosite,dermatomiosite e rabdomiólise.



3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young, DS.


1. KarmenA. J Clin Invest 1955;34:131.

2. Reitman S, Frankel S.Am J Clin Path 1957;28:56.

3. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B.Saunders Co, 1970.


5. Varley H. Practical Clinical Biochemistry, Willian HeinemannMedical Book Ltd. 1967.

6. Wroblewski F, Cabaud P.Am J Clin Path 1957;27:235.



Termos e Condições de GarantiaA Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.

OBSERVAÇÕES

REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO


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Soro: 4 a 32 Unidades/mL.

UI = Unidades/mLx 0,482

Em duas amostras com concentrações de transaminasepirúvica iguais a 9 e 75 Unidades/mL foram adicionadasquantidades diferentes da enzima obtendo-se recuperaçõesentre 94 e 104%. O erro sistemático proporcional médio obtidoem um valor de 60 Unidades/mL foi igual a 1,8 unidades/mL ou3,0%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre 2 e 140Unidades/mL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 0,817x - 0,241 e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,99. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (60 Unidades/mL) foi igual a 11Unidades/mL ou 18%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.

Uma amostra protéica não contendo transaminase pirúvica foiutilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 3,0 Unidades/mL, equivalenteà média de 20 ensaios mais dois desvios padrão.

Duas amostras com valores iguais a 112 e 154 Unidades/mLforam utilizadas para avaliar a resposta do sistema nasdiluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 4 foram encontradasrecuperações entre 91 e 100%.

Elevações das transaminases ocorrem na hepatite (viral etóxica), na mononucleose, cirrose, colestase, carcinomahepático primário ou metastático, pancreatite, traumatismoextenso e no choque prolongado. Valores de ALT são iguais ousuperiores aos de AST na maioria dos pacientes com hepatiteviral, icterícia pós-hepática ou colestase intra-hepática. Noscasos de cirrose hepática, hepatite alcóolica ou carcinomametastático, os valores deALT são inferiores aos deAST.



Especificidade






8

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 21 0,91 4,3

Amostra 2 20 43 1,24 2,9

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 22 1,42 6,5

Amostra 2 20 42 2,20 5,3

1 x 50 mL

1 x 4 mL

1 x 50 mL

1 x 160 mL

TGP Substrato

Reagente de Cor

NaOH - Estoque

Padrão

Catálogo

Nº de testes

Volume/Teste

53-200

3,0 mL

200





CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br

TRIGLICÉRIDES LiquiformCat. 87ANVISA10009010070

FINALIDADE

PRINCÍPIO


Sistema enzimático para determinação dos triglicérides porreação de ponto final em amostras de soro ou plasma (EDTA).Somente para uso diagnóstico in vitro.

Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintesreações:

A lipase da lipoproteína promove a hidrólise dos triglicéridesliberando glicerol, que é convertido, pela ação daglicerolquinase, em glicerol-3-fosfato. Este é oxidado adihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio na presença daglicerolfosfato oxidase. Em seguida, ocorre uma reação deacoplamento entre peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e4-clorofenol, catalisada pela peroxidase, produzindo umaquinoneimina que tem máximo de absorbância em 505 nm.A intensidade da cor vermelha formada é diretamenteproporcional à concentração dos triglicérides na amostra.

Triglicérides Liquiform utiliza metodologia colorimétricaenzimática que confere boa reprodutibilidade e grandeespecificidade ao sistema.

O reagente é disponibilizado sob a forma líquida, facilitandoassim sua aplicação e eliminando a possibilidade de seintroduzir erros durante as preparações de reagentes.

A necessidade de se repetir o teste em amostras de valoreselevados é minimizada pela grande linearidade do sistema quese estende até 1100 mg/dL.

Os dados de repetitividade e reprodutibilidade obtidos com osistema Triglicérides Liquiform demonstram que o método écapaz de fornecer resultados que superam as metas dedesempenho para as medidas dos triglicérides estabelecidaspelo (NCEP). Acomparação entre as imprecisões encontradas narepetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistemade medição é bastante robusto nas regiões de concentraçõessignificativas para uso clínico, indicando que tem umdesempenho muito estável no dia a dia.

O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos esemi-automáticos capazes de medir com exatidão aabsorbância em 505 nm.

1-5

Lipase daTriglicérides Glicerol + Ácidos Graxos

Lipoproteína

GlicerolquinaseGlicerol + ATP Glicerol-3-Fosfato + ADP

Mg

Glicerol-3-FosfatoGlicerol-3-Fosfato + O Dihidroxiacetona + H O

Oxidase

Peroxidase2 H O + 4-Aminoantipirina + 4-Clorofenol Quinoneimina+ 4 H O

+2

2 2 2

2 2 2

National Cholesterol Education Program

METODOLOGIA

REAGENTES1. Reagente 1

2. Padrão -




Enzimático-Trinder .

-Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém tampão 50 mmol/L, pH 6,9; acetato de magnésio4 mmol/L; 4-clorofenol 5 mmol/L; 4-aminoantipirina300 mol/L; ATP 1,0 mmol/L; lipase da lipoproteína 1400 U/L;glicerolquinase 1000 U/L; glicerolfosfato oxidase 1500 U/L;peroxidase 900 U/Le azida sódica 7 mmol/L.

Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecerfora da geladeira somente o tempo necessário para se obter ovolume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta. Oreagente tem uma tonalidade rósea.

Armazenar entre 2-30 °C.Contém triglicérides 200 mg/dLe azida sódica 7 mmol/L.Após o manuseio armazenar bem vedado para evitarevaporação.

Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução do tempo de estabilidade.

Para preservar o desempenho, os reagentes devempermanecer fora da geladeira somente o tempo necessáriopara se obter o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luzsolar direta.

Não utilizar o Reagente 1 quando sua absorbância medidacontra água em 505 nm for igual ou maior que 0,300 ou quandomostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. O reagentetem uma tonalidade rósea.

Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação dos reagentes.

Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar osreagentes.

Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre490 e 520 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.

Como a concentração de triglicérides é influenciada porhábitos dietéticos recentes, como consumo de álcool e porvariações do peso corporal e exercício físico, os valores dostriglicérides em um mesmo indivíduo são bastante variáveis.Os dados obtidos dentro de um mês, usando um método comCV analítico de 3,0%, mostraram que a variação biológicapode ser maior que 90% da variação intra-individual total.Mesmo nos estados de jejum, ocorre considerável variaçãobiológica, podendo mostrar diferenças de 21% em mediçõesrepetidas no mesmo indivíduo. Portanto, ao compararresultados repetidos de triglicérides com intervalos desemanas ou meses deve-se considerar o efeito da variaçãobiológica.

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5, 7, 8

Instruções de Uso

Na ausência de jejum a concentração plasmática dostriglicérides modifica-se consideravelmente no mesmoindivíduo apresentando diferenças de até 1000%.

Amostras colhidas com heparina podem fornecer resultadosfalsamente diminuídos.

Obter a amostra com o paciente assentado. O torniquete nãodeve ser mantido por tempo maior que um minuto. Liberar otorniquete antes de aspirar o sangue.

A contaminação do material utilizado ou da amostra comglicerol fornece valores falsamente elevados. Assim, osresultados obtidos em pacientes recebendo alimentaçãoparenteral devem ser interpretados com cautela porque estaalimentação contém elevados teores de glicerol.

Níveis elevados de ácido ascórbico (vitamina C) produzeminterferências negativas por competição com o cromogênio nareação da peroxidase. Se houver suspeita da presença deácido ascórbico, deixar o soro em repouso durante 90 minutosantes de iniciar a dosagem para evitar resultados detriglicérides falsamente diminuídos. Este procedimentominimiza os valores de ácido ascórbico, podendo não sereficiente caso a concentração deste esteja elevada naamostra.


A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de 12-14horas. Deve-se enfatizar ao paciente a necessidade do jejumno tempo recomendado. A falta de padronização nas colheitasdas amostras para a dosagem dos triglicérides tem geradoenormes conflitos entre pacientes, médicos clínicos e oslaboratórios, porque, em muitos casos, não se toma o cuidadode enfatizar aos pacientes a necessidade do jejum de 12-14horas antes da colheita da amostra.

Usar soro ou plasma com EDTA. O analito é estável por doisdias entre 2-8 °C. O armazenamento prolongado da amostranão é recomendado. Os triglicérides podem ser hidrolisados,liberando glicerol, o que leva à obtenção de resultadosfalsamente diminuídos quando o ensaio utiliza branco paraeliminar a interferência do glicerol livre.

A heparina promove a ativação in vivo ou in vitro da lipase dalipoproteína, fazendo com que a concentração dos triglicéridesse reduza gradativamente em amostras contendo heparina.Este fenômeno ocorre também em amostras de soro obtidasem pacientes recebendo doses terapêuticas de heparina.

Estas orientações para obtenção e conservação da amostraestão padronizadas segundo as recomendações do NCEP .

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las, devem-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.

Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.

Valores de bilirrubina até 10 mg/dL e hemoglobina até200 mg/dL não produzem interferências significativas. Valoresde bilirrubina maiores que 10 mg/dL produzem resultadosfalsamente diminuídos.

AMOSTRA

INTERFERÊNCIAS

9

Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando ozero com água deionizada ou destilada.



Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C durante 10minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao níveldos reagentes nos tubos de ensaio. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 505 nm ou filtro verde(490 a 520), acertando o zero com o branco. A cor é estável 60minutos.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente, sem prejuízo para o desempenho do teste,mantendo-se inalterado o procedimento de cálculo. Em casode redução dos volumes, é fundamental que se observe ovolume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumesde amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.

Ver linearidade.Absorbância do Teste

Triglicérides (mg/dL) = x 200Absorbância do Padrão


0,174Triglicérides (mg/dL) = x 200 = 172

0,202




Triglicérides (mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator

200Fator = = 990

0,202

Triglicérides (mg/dL) = 0,174 x 990 = 172

O padrão é rastreável ao (SRM)1951 do(NIST).

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405

415

PROCEDIMENTO

CÁLCULOS

Exemplo:

Exemplo:

CALIBRAÇÃOStandard Reference Material

National Institute of Standards and Technology

Amostra ---- 0,01 mL ----

Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL

---- ---- 0,01 mLPadrão


Valores desejáveis ou recomendados pediátricos


Especificidade





12


A recuperação foi obtida utilizando diluições de amostras comvalores elevados de triglicérides. As recuperações variaramentre 100 e 102%.O erro sistemático proporcional médioobtido em um valor de 200 mg/dLé igual a 4 mg/dLou 2%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 40 amostras com valores situados entre38 e 652 mg/dL medidas em duplicata. A comparação resultouna equação da regressão: y = 1,035x -1,4 e um coeficiente decorrelação (r) igual a 0,998. O erro sistemático total (constantee proporcional) verificado no nível de decisão (200 mg/dL) éigual a 7,0 mg/dL ou 3,5%. O erro total no mesmo nível dedecisão é 5,0%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada e atende aosrequisitos especificados pelo NCEP .

Uma amostra protéica não contendo triglicérides foi utilizadapara calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 1,72 mg/dL, equivalente à médiade 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro, verificou-se que olimite de detecção fotométrica é de 0,99 mg/dL,correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.

Duas amostras com valores iguais a 977 e 1051 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 100 e 102%.

13

9




LINEARIDADE



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Obter o fator de calibração ao usar novo lote dereagentes ou quando o controle interno da qualidadeindicar.

Branco de reagentes: água ou solução de cloreto desódio 150 mmol/L (0,85%);Padrão: usar calibradores protéicos. As concentraçõesde triglicérides na linha Calibra são rastreáveis ao SRM1951do NIST.

Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração do branco ao usar novo frasco dereagente;Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controleinterno da qualidade indicar.

O resultado da medição é linear até 1100 mg/dL. Para valoresmaiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontradose situe entre 100 e 250 mg/dL. Sugerimos a verificação dalinearidade metodológica e fotométrica, no mínimosemestralmente, utilizando amostras com valores até1100 mg/dL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e desvios de calibraçãodeve ser prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usarum controle com um valor situado na faixa de referência ou nonível de decisão e outro controle com um valor em outra faixade significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado decontrole para que o erro de bias seja 5,0%, o coeficiente devariação seja 5,0% e o erro total 15,0%, conformeestabelecido pelo NCEP . Sugere-se realizar a monitorizaçãocontínua do estado de controle através do sistema de regrasde controle.


São valores que substituem os valores de referência. Foramdeterminados a partir de dados epidemiológicos tratadosestatisticamente e estabelecem a concentração detriglicérides como fator de risco independente para doençacoronariana isquêmica .

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11

Amostra 1 15180 1,59 1,06

Amostra 3 41280 4,30 1,04

19780 2,59 1,31Amostra 2

MÉDIAN DP CV(%)

Amostra 1 15180 2,89 1,92

Amostra 3 41280 6,58 1,60

19780 3,80 1,93Amostra 2

MÉDIAN DP CV(%)

Desejável <150

Elevado 200 - 499

Muito Elevado >500

150 - 199Limiar Alto

Triglicérides (mg/dL)

Desejável �130

10 a 19 anos

�100

< 10 anos

>130>100Elevado

Triglicérides (mg/dL)

Revisão: Novembro, 2004. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 200606 Reprodução sob prévia autorização


OBSERVAÇÕES

Recentes meta-análises de estudos prospectivos indicam queos triglicérides elevados são também um fator de riscoindependente para doença coronariana isquêmica (DCI).Fatores que contribuem para valores elevados de triglicéridesna população em geral incluem obesidade e sobrepeso,inatividade física, tabagismo, consumo excessivo de álcool edietas com elevado conteúdo de carboidratos.Os achados de que valores triglicérides elevados representamum fator de risco independente para DCI sugerem quealgumas lipoproteínas ricas em triglicérides sejamaterogênicas, principalmente as VLDL parcialmentedegradadas, comumente chamadas lipoproteínasremanescentes.

Na prática clínica, o colesterol VLDL (Triglicérides 5) é a maissimples medida das l ipoproteínas aterogênicasremanescentes. Assim, o colesterol VLDL pode ser tambémum alvo da terapêutica para redução do colesterol. O

(ATP) III proposto pelo NCEP identifica asoma dos valores de colesterol LDL+VLDL [

(colesterol total - colesterol HDL)] como alvo secundárioda terapêutica em pessoas com triglicérides elevados( 200 mg/dL). A meta para o colesterol não HDL, em pessoascom valores elevados de triglicérides, pode ser estabelecidacomo sendo o valor do colesterol LDL mais 30 mg/dL (VLDL),com base na premissa de que valores de colesterol VLDLmenores que 30 mg/dLsão considerados desejáveis .

São causas de elevação dos triglicérides as várias doenças delípides chamadas hiperlipidemias ou hiperlipoproteinemias.Nestas, sejam de causa primária ou secundária, ocorreelevação dos triglicérides nos tipos I, IIb, III, IV e V.

As hiperlipidemias ocorrem secundariamente no diabetes,pancreatite, doença do armazenamento de glicogênio,síndrome nefrót ica, insuf ic iência renal crônica,hipotireoidismo, gravidez e mieloma múltiplo.

Várias mulheres em uso de estrógenos ou contraceptivos oraisapresentam aumento nas concentrações de triglicérides. Ahipertrigliceridemia também encontra-se associada ao uso debloqueadores beta-adrenérgicos, corticosteróides, diuréticostiazídicos e retinóides.



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AdultTreatment Panel

Colesterol nãoHDL

11

3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar: Young, DS.


1. Bucolo G, David H. Clin Chem 1973;19:475.

2. Fossati P, Prencipe L. Clin Chem 1982;28:2077.

3. Mc Gowan MW, Artiss JD, Strandbergh DR, Zak B. ClinChem 1983;29:538.

4. Nagele V, Hagele EO, Sauer G, Wiedeman E, Lehmann P,Wahlefeld AW, Gruber W J Clin Chem Clin Biochem1984;22:165.

5. Stein EA, Myers Gl. Clin Chem 1995;41:1421-26.

6. Trinder P.Ann Clin Biochem 1969;6:24.

7. Narayanan S. Indian J Clin Biochem 1996;11:12-16.

8. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook oflipoprotein testing., Washington:AACC Press, 1997:75-97.

9. NCEP - Recommendations on Lipoprotein Measurement.NIH Publication 95-3044, Bethesda, MD, 1995.


11. Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment ofHigh Blood Cholesterol inAdults. JAMA2001;285:2486-97.

12. Leite PF, Martinez TLR, Halpeen A, Cendoroglo MS,Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular:fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico etratamento. São Paulo: Loyola, 1994.p.56.




CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista AlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br


REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO




Catálogo

Reagente 1

87-2/100

2 x 100 mL

1 x 5 mL

87-2/250

2 x 250 mL

1 x 5 mL

87-2/500

2 x 500 mL

1 x 5 mL

87-1/100

1 x 100 mL

1 x 5 mLPadrão

URÉIACECat. 27ANVISA10009010011

FINALIDADE

PRINCÍPIO


METODOLOGIA

REAGENTES1. Urease -

2. Tampão - Estoque -

3. Oxidante - Estoque -



Sistema enzimático-colorimétrico para a determinação dauréia em amostras de sangue e urina, por reação de pontofinal.Somente para uso diagnóstico in vitro.

A uréia é hidrolisada pela urease à íons amônio e CO . Os íonsamônio reagem em pH alcalino com salicilato e hipoclorito desódio, sob a ação catalisadora do nitroprussiato de sódio paraformar azul de indofenol.

A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade deuréia na amostra.

O sistema Uréia CE Labtest enzimático-colorimétrico utilizaconcentrações otimizadas de reagentes, principalmente aurease, permitindo operar com cinética de ordem zero até umaconcentração de 300 mg/dL.

Consegue-se obter uma faixa dinâmica bastante extensa,reduzindo-se acentuadamente a repetição de testes emvalores elevados.

O método utiliza a técnica manual e é facilmente aplicável emanalisadores semi-automáticos e automáticos capazes depipetar dois reagentes e medir com exatidão a absorbânciaentre 580 e 620 nm.

Por todas estas razões, a Uréia CE Labtest é o método deescolha quando se deseja utilizar uma metodologiaenzimática-colorimétrica para a determinação da uréia.

Urease-Labtest.

Armazenar entre 2 - 8 oC. Contém tampão fosfato10 mmol/Le urease 268 KU/L.

Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contémtampão fosfato 100 mmol/L, pH 6,9; salicilato de sódio312 mmol/Le nitroprussiato de sódio 16,8 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contémhidróxido de sódio 2,8 mol/Le hipoclorito de sódio 121 mmol/L.

Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contém azidasódica 7,7 mmol/L.Armazenar bem vedado para evitar evaporação.


Não armazenar os reagentes nas proximidades de soluçõesde amônia.

2

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Como o volume da amostra é pequeno, deve-se pipetardiretamente no fundo do tubo de ensaio realizando umamedição cuidadosa para minimizar problemas de imprecisão.

Contaminação da água, vidraria e ambiente com amônia podeproduzir resultados falsamente elevados. Deve-se evitar fumarpróximo ao local das dosagens.


O padrão de uréia contém azida sódica que é toxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água paradescartar o reagente.


Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre580 e 620 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.

Os níveis de uréia no soro ou plasma aumentamconsideravelmente após exercícios físicos e com a idade.

Em mulheres grávidas, os níveis de uréia no soro e na urinadiminuem consideravelmente.

A alimentação aumenta os níveis de uréia no soro ou plasma,principalmente em mulheres.

Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostrasempre no mesmo horário devido a variações circadianas dauréia.

Deve ser criado um procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.

Usar soro ou plasma (fluoreto, oxalato, heparina, EDTA) eurina. Não usar anticoagulantes contendo amônia. Aconcentração de fluoreto na amostra não deve ser maior que3 mg/mL pois o fluoreto em altas concentrações é inibidor daurease.

O uso de anticoagulante Glistab da Labtest (Cat.29) permite acolheita de uma só amostra para as dosagens de uréia, glicosee creatinina.

A uréia é estável no soro ou plasma por 12 horas entre15 - 25 ºC e vários dias entre 2 - 8 ºC. Não utilizar amostras comsinais de contaminação microbiana.

A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo2,0 mL de HCI 50% e centrifugada antes de usar. Não utilizarformol como preservativo para a urina.



AMOSTRA

Instruções de UsoDIAGNÓSTICA

Pagina: 1

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.


Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL, Hemoglobina até 80 mg/dLe Triglicérides até 900 mg/dL não produzem interferênciassignificativas.

Valores de Hemoglobina maiores que 80 mg/dL e Triglicéridesmaiores que 900 mg/dL produzem interferências positivas quenão podem ser minimizadas com o uso do branco da amostra.


Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 467


Adicionar o conteúdo do frasco nº 2 (100 mL) a 400 mL de águadestilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses emfrasco âmbar entre 2 - 8 ºC.

Adicionar o conteúdo do frasco nº 3 (25 mL) a 475 mL de águadestilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses emfrasco plástico entre 2 - 8 ºC.

A água deve ter uma resistividade 1 megaohm ou umacondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L.

Adicionar 1,0 mL de Urease (nº 1) a 20 mL do Tampão de Uso.Estável 21 dias em frasco de vidro âmbar entre 2 - 8 ºC.

Não armazenar os reagentes nas proximidades de soluçõesde amônia.

Ver Precauções e Cuidados Especiais.

Para a dosagem de uréia na urina, diluir a amostra 1:50 (0,1 mLde urina + 4,9 mL de água destilada ou deionizada). Multiplicaro resultado obtido por 50.


Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos.

INTERFERÊNCIAS

PREPARO DE REAGENTES

Tampão de Uso:

Oxidante de Uso:

Urease Tamponada:

PROCEDIMENTO

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�

�

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405

415

Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 600 nm (580 a 620),acertando o zero com o branco.Acor é estável 2 horas.

O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 2,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica.

Ver Linearidade.

Absorbância do testemg/dL= x 70



0,269Uréia (mg/dL) = x 70 = 31

0,610

Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia pode-se utilizar o método do fator.

70Fator de calibração =


mg/dL=Absorbância do teste x Fator

70Fator = = 114,8

0,610

Uréia (mg/dL) = 0,269 x 114,8 = 31

mg/dLx volume de 24 horas (mL)Urina (mg/24 horas) =

100

O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM)912a do National Institute of Standards and Technology (NIST).

Obter semanalmente o fator de calibração.

Branco de reagentes: água ou solução de NaCl 150 mmol/L(0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações deUréia no Calibra 1 e Calibra 2 da Labtest são rastreáveis aoSRM 912a do NIST.

Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno daqualidade indicar.

CÁLCULOS

Exemplo:

Exemplo:

CALIBRAÇÃO

Calibrações Manuais

SistemasAutomáticos


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�

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DIAGNÓSTICA

Pagina: 2

TESTEBRANCO PADRÃO

Amostra 0,01 mL--- ---

0,01 mL------Padrão (nº 4)

1,0 mL1,0 mL1,0 mLUrease Tamponada

TESTEBRANCO PADRÃO

Oxidante de Uso 1,0 mL1,0 mL 1,0 mL





OBSERVAÇÕES

Uma amostra protéica não contendo uréia foi utilizada paracalcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontradoum valor igual a 2,03 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaiosmais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância dopadrão como parâmetro, verificou-se que o limite de detecçãofotométrica é de 0,11 mg/dL, correspondendo a umaabsorbância igual a 0,001.

Duas amostras com valores iguais a 74 e 264 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 16 foram encontradasrecuperações entre 99 e 108%.

Fisiologicamente a uréia se eleva devido à dieta hiperprotéicaou com a idade, particularmente após 40 anos. Sua diminuiçãoocorre na gravidez normal e nos indivíduos em dietas combaixo valor protéico e alto teor glicídico.

Elevações da uréia ocorrem também por catabolismo elevado(febre, septicemia) e hemorragias internas, principalmente dotrato gastrointestinal.

As elevações da uréia por defeito de excreção se devem àcausas pré-renais (insuficiência cardíaca congestiva), causasrenais (nefrites, pielonefrites e insuficiência renal aguda oucrônica). A uréia começa a se elevar no sangue quando avelocidade de filtração glomerular é menor que 10 mL/minuto.As causas pós-renais são obstruções no trato urinário(cálculos, carcinomas ou pólipos).

Diminuições da uréia não têm expressão clínica e sãoencontradas na soroterapia com carboidratos devido aproblemas de diluição, redução do catabolismo protéico eaumento da diurese.

A dosagem sérica de creatinina é considerada mais específicapara a avaliação da função glomerular, mas pode ser menossensível em algumas doenças renais precoces. A disfunçãorenal é melhor avaliada através das dosagens de uréia ecreatinina associadas.


2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.

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�

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LINEARIDADE




Especificidade


O resultado da medição é linear até 300 mg/dL. Quando aabsorbância do teste for maior que 1,0, diluir o produto coradoe o branco 1:5 com água destilada ou deionizada, fazer novaleitura e multiplicar o resultado obtido por 5. Se após a diluiçãofor obtido um valor igual ou maior que 300 mg/dL, diluir aamostra com NaCl 150 mmol/L (0,85 %), realizar novamedição e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situeentre 50 e 100 mg/dL.

O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 5% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para avaliação do estado de controle.


Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sua própriafaixa de valores de referência na população atendida.

Soro ou plasma: 15 a 40 mg/dL.Urina: 26 a 43 g/24 horas.Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,166 =Unidades SI (mmol/L).

Em duas amostras com concentrações de uréia iguais a 20 e50 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analitoobtendo-se recuperações entre 97 e 100%. O erro sistemáticoproporcional médio obtido em um valor de 60 mg/dL foi igual a0,9 mg/dLou 1,5%.

O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 40 amostras com valores situados entre17 e 116 mg/dL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 1,147 + 0,973x e um coeficiente de correlação(r) igual a 0,998. O erro sistemático total (constante eproporcional) verificado no nível de decisão (60 mg/dL) foi iguala 0,47 mg/dL ou 0,78%. Como as amostras foramselecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório epacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método temuma especificidade metodológica adequada.

5

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Pagina: 3

DIAGNÓSTICA

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 24 0,30 1,3

Amostra 2 20 60 0,57 0,9

MÉDIAN DP CV%

Amostra 1 20 24 0,12 0,5

Amostra 2 20 60 0,48 0,8

Revisão: Agosto, 1999 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 260104 Reprodução sob prévia autorização

3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS. Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests. 3ª edição, Washington DC: AACCPress, 1990.

1. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analisis, Volume 9,pag 449-453, VCH Publishers, Florida, 1985.

2. Bollet WT, Bushman CJ, Tidwell PT. Anal Chem1961;33:592-594.

3. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories.Diagnostic Reagents Division, Ontario, 1970.

4. Weatherburn MW.Anal Chem 1967;39:971-974.

5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR Clin Chem 1981;27:493-501.


REFERÊNCIAS

APRESENTAÇÃO

*O número de testes em aplicações automáticas dependedos parâmetros de programação.





Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuitae-mail: [email protected]ão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.

CGC: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br

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DIAGNÓSTICA

27-500

2,0 mL

1 x 100 mL

500

1 x 25 mL

1 x 25 mL

1 x 3 mL

Catálogo

Nº de testes*

Volume/teste

Urease

Tampão - Estoque

Oxidante - Estoque

Padrão

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