Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Fisiologia e Biofísica Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia

Ana Paula Araújo Ferreira Ribeiro

ADAPTAÇÕES RENAIS INDUZIDAS PELO TREINAMENTO AERÓBIO EM RATOS NORMAIS EM

REPOUSO E SOB EFEITO DO EXERCÍCIO

Belo Horizonte

2009

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ANA PAULA ARAÚJO FERREIRA RIBEIRO

ADAPTAÇÕES RENAIS INDUZIDAS PELO TREINAMENTO AERÓBIO EM RATOS NORMAIS EM

REPOUSO E SOB EFEITO DO EXERCÍCIO

Trabalho apresentado ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do título de doutora em Ciências, na área de concentração de Fisiologia, sob orientação da Profa Maria Aparecida Ribeiro Vieira.

Belo Horizonte

2009

Dedico esta tese a todos que possam se

beneficiar de alguma maneira com este trabalho.

AGRADECIMENTOS

À Profa Dra Maria Aparecida Ribeiro Vieira, agradeço a oportunidade de

iniciar uma nova linha de pesquisa no Laboratório de Fisiologia renal, sob sua

orientação. Obrigada por comprar o bilhete de ida nesta viagem e espero que o

percurso da mesma tenha valido a pena. A sua contribuição foi muito valiosa

na minha formação pessoal, acadêmica e científica. Obrigada por tudo!

Aos meus “amigos” do Laboratório de Fisiologia Renal pelo

companheirismo em todas as etapas do processo, sendo eles: Lílian Fernanda

Pacheco, Lúcio Ricardo Leite Diniz, Viviane Gomes Portela, Roseli Martins

Rezende Pereira, Kátia Daniela da Silva, Priscila Elisa da Silveira, Regiane

Cerceau e Gustavo Cosenza.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pelo

fomento em bolsa de estudos e taxa de bancada para a realização deste

estudo.

A GAUSTEC Magnetismo, em nome de Cláudio Henrique Teixeira

Ribeiro, pela fabricação e concessão da esteira motorizada para ratos ao

Laboratório de Fisiologia Renal.

Ao Laboratório de Endocrinologia e Metabolismo do Departamento de

Fisiologia e Biofísica, em nome da Profa Dra Adelina Martha dos Reis, pela

realização dos radioimunoensaios de peptídeo natriurético atrial.

Ao Laboratório de Biofísica do Departamento de Fisiologia e Biofísica,

em nome do Prof. Dr. Jorge Luiz Pesquero, por permitir a utilização do

espectrofotômetro e da centrífuga para eppendorfs.

Ao Prof. Dr. Múcio Flávio Barbosa Ribeiro, do Departamento de

Parasitologia, por permitir utilização da microcentrífuga para hematócrito.

Ao Laboratório de Enzimologia e Físico-Química de Proteínas do

Departamento de Bioquímica e Imunologia, em nome de Jamil Silvano de

Oliveira, pela doação dos reagentes azida sódica e ácido succínico para o

ensaio da atividade enzimática da succinato desidrogenase.

Ao Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microorganismos do

Departamento de Microbiologia, em nome de Jacques Robert Nicoli, pela

doação do reagente tetrazólio para o ensaio da atividade enzimática da

succinato desidrogenase.

Ao Laboratório de Patologia Comparada, em nome de Geovanni Dantas

Cassali, pelo auxílio nos ensaios histológicos.

À secretaria da Pós-Graduação, em nome de Maria Célia da Silva Costa,

pela competência nos serviços prestados aos alunos durante o curso.

Aos técnicos Darcy Ferreira Santos e Janine Costa Ivo pela atenção e

dedicação quando solicitados. A contribuição de vocês foi de grande valia.

Ao Emerson Batista Machado, aluno voluntário de Iniciação Científica,

pelo auxílio na coleta de dados.

Aos colegas de corredores, principalmente aos do bloco D4 e B4,

agradeço a convivência saudável do dia-a-dia. Durante todo o processo

dividimos nossas dúvidas, expectativas, fracassos e sucessos. Foi muito bom

compartilhar isto com vocês.

Por último, e não menos importante, à minha família pelo apoio

incondicional. Ao meu marido, pelo carinho, compreensão e apoio nesse

período de formação tão extenso e árduo.

LISTA DE ABREVIATURAS ADH – vasopressina Ang II – angiotensina II ANP – peptídeo atrial natriurético Cosm – clearance osmolar CH2O livre – clearance de água livre ECA – enzima conversora de angiotensina EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético ET-1 – endotelina 1 FU – fluxo urinário FSR – fluxo sanguíneo renal FEH2O – fração de excreção de água FENa+ - fração de excreção de sódio FEK+ - fração de excreção de potássio FRNa+ - fração de reabsorção de sódio FRK+ - fração de reabsorção de potássio DTP – distância total percorrida LDH – lactato desidrogenase L-NAME – Ng-nitro-L-arginina metil éster K+ - potássio Na+ - sódio NADH - nicotinamida adenina dinucleotídeo NO – óxido nítrico NPr-A – receptor para peptídeo natriurético tipo-A

NPr-C – receptor para peptídeo natriurético tipo-C NT – não-treinado PMSF - fluoreto de fenilmetilsulfonil RFG – ritmo de filtração glomerular RIE – radioimunoensaio SDH – succinato desidrogenase SRA – sistema renina-angiotensina TEMP – teste de esforço máximo progressivo T – treinado TTE – tempo total de exercício Vmáx – velocidade máxima de corrida VO2máx - consumo máximo de oxigênio

RESUMO

A maioria dos trabalhos da literatura que relatam o efeito do exercício físico sobre a função renal se referem apenas ao efeito agudo do exercício aeróbio sobre os rins. Assim, não se sabe como os rins se comportam quando o organismo é submetido a sessões repetidas de exercício aeróbio. Os objetivos deste estudo foram investigar as adaptações renais, hormonais e morfológicas induzidas por um treinamento físico de intensidade moderada em ratos normais, em repouso e sob efeito do exercício. Ratos Wistar machos (n=69; 180 a 200g) foram aclimatados à esteira e submetidos a um teste de esforço (TEMP) usado para determinar a capacidade funcional de cada rato. Baseado nos resultados do TEMP, os ratos foram divididos em dois grupos: treinados (T) e não-treinados (NT). O grupo T foi submetido a 8 semanas de treinamento sendo 5 dias/semana, 60 min/dia a uma intensidade de 65% da velocidade máxima de corrida atingida no TEMP. O grupo NT caminhou a 5m/min sendo 5min/dia durante as 8 semanas. Os grupos passaram por dois protocolos experimentais sendo todos realizados após 48h da aplicação do TEMP pós-treinamento. No protocolo 1, os ratos permaneceram em gaiolas metabólicas com o intuito de se investigar o efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre o perfil geral (hematócrito, hemoglobina, ingestão de água e de ração e produção de fezes) e sobre parâmetros de função renal, na situação de repouso. Amostras de sangue foi coletado ao final de cada 24h. No protocolo 2 foi investigado o efeito desse treinamento sobre parâmetros de função renal e perfil hormonal, na situação pós-exercício de intensidade absoluta (35min a 21m/min). O ritmo de filtração glomerular (RFG) em todos os protocolos foi estimado pelo clearance de creatinina. Ambos os grupos foram sacrificados ao término dos protocolos 1 e 2 sendo coletados sangue, rins, átrios e músculos sóleo e gastrocnêmios. O volume plasmático foi medido em repouso (VP) usando a técnica do Azul de Evans. O desempenho no TEMP pós-treino foi maior no grupo T. A sobrecarga do treinamento não foi excessiva já que a atividade da lactato desidrogenase sérica foi menor no grupo T. O treinamento não alterou a morfologia dos rins e induziu uma menor variabilidade nas respostas diárias de ingestão de água e ração e produção de fezes e urina. Em repouso, o grupo T apresentou um aumento no RFG e na fração de reabsorção de Na+, K+ e água. Ambos foram acompanhados por um aumento no VP e no ADH plasmático. O treinamento não afetou o RFG e nem a excreção de água e eletrólitos pós-exercício. Os grupos, quando submetidos ao mesmo exercício, mostraram inibição da diurese, mas o grupo T foi mais eficaz em conservar água corporal, mesmo realizando um exercício de intensidade menor. A maior conservação de água provavelmente está relacionada ao aumento do VP, do vasopressina plasmática e do RFG. Portanto, o treinamento físico de intensidade moderada induziu alterações renais de repouso e pós-exercício que garantem uma maior eficiência na manutenção da homeostasia.

ABSTRACT RENAL ADAPTATIONS INDUCED BY EXERCISE TRAINING OF MODERATE INTENSITY IN NORMAL RATS AT REST AND POST-EXERCISE

Research papers linking exercise and renal function have focused on the acute effect of aerobic exercise. At present, there is no data showing how the kidneys respond when the body is submitted to repeated sessions of aerobic exercise. The main purpose of this study was to examine the renal, hormonal and morphological adaptations induced by exercise training of moderate intensity in normal rats at rest and post-exercise. Wistar male rats (n=69; 180 to 200g) were acclimatized using a treadmill and submitted to an effort test (ET) used to determine each rat exercise capacity. Based on the ET, the rats were divided into 2 groups: trained (T) and untrained (UT). Both groups exercised for 8 weeks, 5 days a week. The T group exercised for 60 min/day at an intensity of 65% of maximal speed reached on the TE. The UT groups walked 5 min/day at 5m/min. Both groups were submitted to two experimental protocols which were performed 48 hours after the post-training ET. In protocol 1, rats were kept at individual metabolic cages in order to investigate the effect of exercise training of moderate intensity on the general profile (hematocrit, plasma hemoglobin, food and water intake and faeces production) and on renal parameters at rest condition. Blood was sampled every 24 hours. In protocol 2, it was investigated the exercise training effect on the renal parameters as well as on hormonal profile at post-exercise (35min at 21m/min) condition. Glomerular filtration rate (GFR) in both protocols was estimated using the creatinine clearance. Both groups were sacrificed after protocols 1 and 3 when blood, kidneys, atriums, soleus and gastrocnemius muscle tissues were sampled. The plasma volume (PV) was measured at rest using the dye-dilution method Evans blue. The performance in the post-training ET activity was higher in the T group. Training load was not excessive since serum lactate dehydrogenase activity was even lower in the group T. The training did not alter the kidneys morphology and induced a lower variability in the daily responses of water and food intake, and faeces and urine production. At rest, group T showed an increase in GFR and in the reabsorption fraction of Na+, K+ and water. These effects were followed by an increase in PV and in the plasma vasopressin. Exercise training did not affect GFR and the excretion of water and electrolytes post-exercise. The groups after an absolute submaximal exercise showed diuresis inhibition, but group T was more efficient in conserving body water even when exercise intensity was lower. The water conservation was probably most related to the increase in PV and plasma vasopressin, and GFR. Therefore, exercise training of moderate intensity induced renal alterations at rest and post-exercise which would be responsible for a greater efficiency in homeostasis maintenance.

SUMÁRIO

Dedicatória i

Agradecimentos ii

Lista de abreviaturas iv

Resumo vi

Abstract vii

1 Introdução 01

1.1 Efeito do exercício agudo sobre a função renal 03

1.2 Efeito do exercício crônico sobre a função renal 07

2 Objetivos 10

2.1 Objetivos específicos 10

3 Materiais e Métodos 11

3.1 Cuidados éticos 11

3.2 Amostra 11

3.3 Procedimentos prévios ao treinamento 11

3.3.1 Protocolo do treinamento físico de intensidade moderada 12

3.3.2 Teste de esforço máximo progressivo (TEMP) 13

3.3.3 Atividade da desidrogenase lática (LDH) 14

3.3.4 Atividade da succinato desidrogenase ( SDH) 15

3.4 Protocolos experimentais 17

3.4.1 Protocolo I – perfil geral e função renal de ratos treinados na situação de repouso

18

3.4.1.1 Perfil geral dos ratos treinados em repouso 18

a) Hematócrito, hemoglobina e volume plasmático 18

b) Histologia dos rins 20

c) Ingestão e excreção 20

3.4.1.2 Função renal dos ratos treinados em repouso 23

3.4.2 Protocolo II – Função renal de ratos treinados na situação pós- exercício

27

3.4.2.1 Proteínúria 29

3.5 Dosagens complementares ( albumina sérica e hormônios) 30

3.5.1 Albumina sérica 30

3.5.2 Peptídeo atrial natriurético (ANP) 31

3.5.3 Vasopressina e aldosterona 33

3.6 Análise estatística 34

4 Resultados 35

4.1 Avaliação da eficácia do treinamento 35

4.2 Perfil geral dos ratos treinados em repouso (Protocolo I) 37

4.3 Função renal nos ratos treinados em repouso (Protocolo I) 40

4.4 Função renal nos ratos treinados pós-exercício (Protocolo II) 44

4.5 Perfil hormonal nos ratos treinados em repouso e pós- exercício (Protocolo II)

50

5 Discussão 53

5.1 Avaliação do treinamento 53

5.2 Função renal de ratos treinados em repouso 55

5.3 Função renal de ratos treinados pós-exercício 61

6 Conclusão 66

7 Referências 67

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Progressão do treinamento físico de intensidade moderada.

13

Tabela 2 - Concentrações plasmáticas e urinárias de sódio e potássio em ratos T e NT, em repouso.

41

Tabela 3 - Parâmetros renais pós-exercício dos ratos T e NT medidos após 8 horas de permanência em gaiolas comuns.

49

Tabela 4 - Albumina no soro e proteinúria em ratos T e NT em repouso e pós-exercício.

49

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fatores controladores da função renal durante o exercício agudo.

06

Figura 2 - Curva padrão de volumes crescentes de fração mitocondrial hepática ou muscular (sóleo e gastrocnêmio) de rato.

17

Figura 3 - Curva padrão do corante Azul de Evans.

19

Figura 4 - Representação esquemática da gaiola metabólica.

21

Figura 5 - Sequência de procedimentos que os grupos T e NT foram submetidos ao longo de 14 dias de permanência em gaiolas metabólicas.

21

Figura 6 - Esquema de coleta de dados para a medição da função renal dos ratos T e NT em repouso.

24

Figura 7 - Gaiola comum.

28

Figura 8 - Seqüência experimental para a medição da função renal dos ratos T e NT sob efeito do exercício.

29

Figura 9 - Curva padrão concentrações crescentes de proteína.

30

Figura 10 - Curva padrão concentrações crescentes de albumina.

31

Figura 11 - Resultados dos TEMP aplicados ao longo do treinamento.

35

Figura 12 - Progressão dos parâmetros medidos no TEMP aplicado ao longo do treinamento.

36

Figura 13 - Atividade enzimática da lactato desidrogenase sérica em ratos T e NT, em repouso.

37

Figura 14 - Atividade da SDH em fração mitocondrial de homogenato de músculo esquelético de ratos T e NT, nas situações de repouso e pós-exercício.

38

Figura 15 - Acompanhamento das variações diárias do peso corporal, ingestão de água, e de ração e produção de urina e de fezes em ratos T e NT, em repouso.

39

Figura 16 - Volume plasmático de ratos T e NT ao final das oito semanas de treinamento.

39

Figura 17 - Hematócrito e concentração de hemoglobina em ratos T e NT, em repouso, antes e após o treinamento.

40

Figura 18 - Corte histológico de rins esquerdos de ratos NT e T.

40

Figura 19 - Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre o RFG, o FU e a FEH2O.

41

Figura 20 - Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre a excreção, a reabsorção e o clearance de sódio.

42

Figura 21 - Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre a excreção, a reabsorção e o clearance de potássio.

43

Figura 22 - Efeito de uma sessão de exercício submáximo absoluto sobre o volume cumulativo de urina de ratos T e NT.

44

Figura 23 - Delta da área sob as curvas de volume cumulativo de urina produzido em repouso e exercício pelos grupos T e NT.

45

Figura 24 - Ritmo de filtração glomerular, fluxo urinário e fração excreção de água em ratos T e NT, em repouso e sob efeito do exercício.

46

Figura 25 - Correlação entre o RFG e o fluxo urinário dos ratos T e NT em repouso e sob efeito do exercício.

46

Figura 26 - Fração de excreção e reabsorção de sódio em ratos T e NT, em repouso e pós-exercício.

48

Figura 27 - Fração de excreção e reabsorção de potássio em ratos T e NT, em repouso e pós-exercício.

48

Figura 28 - Clearance osmolar e de água livre em ratos T e NT, em repouso e pós-exercício.

48

Figura 29 - Concentrações plasmáticas de vasopresina e aldosterona em ratos T e NT, em repouso e pós-exercício.

50

Figura 30 - Ensaio típico de binding de ANP em cortes longitudinais de rins de ratos T e NT.

51

Figura 31 - Concentração plasmática de ANP em ratos T e NT, em repouso e sob efeito do exercício.

52

1 INTRODUÇÃO

As sessões isoladas de exercício ocasionam respostas metabólicas e

cardiovasculares transitórias. As repetições freqüentes dessas sessões

produzem adaptações permanentes, caracterizadas como respostas crônicas

ao exercício ou treinamento físico (Thompson et al., 2001). Os componentes

essenciais do treinamento são a intensidade, a duração, a freqüência e a

progressão do exercício. A interação dessas variáveis resulta na sobrecarga

cumulativa à qual o tecido ou órgão terá que adaptar-se. Além disso, o

treinamento é adequado quando se determina objetivamente as respostas

iniciais do indivíduo ao exercício (consumo máximo de oxigênio, freqüência

cardíaca, pressão arterial, concentração de lactato sanguíneo) utilizando-se

testes de esforço máximo (American College of Sports Medicine, 2003).

Protocolos de treinamento aeróbio usados recentemente em estudos com

ratos, camundongos e coelhos também foram determinados a partir das

respostas desses animais aos testes de esforço máximo progressivo (TEMP)

(Carvalho et al., 2005; De Moraes et al., 2004; Evangelista et al., 2005; Martins

et al., 2005; Véras-Silva et al., 1997). Semelhante aos estudos com humanos,

nem todos os TEMP realizados em animais são acompanhados da medida

direta do consumo máximo de oxigênio (VO2máx) (Carvalho et al., 2005; Martins

et al., 2005; De Moraes et al., 2004).

Alguns parâmetros medidos em TEMP ou em testes não exaustivos vem

sendo utilizados como preditores da intensidade do treinamento aeróbio em

animais, na ausência da medida do VO2máx., sendo eles: a velocidade máxima

de corrida atingida no TEMP, o limiar de lactato sanguíneo, a velocidade crítica

e o estado estável do lactato sanguíneo. Todos esses parâmetros mostraram-

se adequados para tal objetivo (Billat et al., 2005; Carvalho et al., 2005;

Manchado et al., 2005; Martins et al., 2005; Priviero et al., 2004).

Nem sempre os princípios do treinamento físico são levados em

consideração em estudos que se utilizam dele. Os estudos de Bergamaschi et

al. (1997) e de Kohzuki et al. (2001) cujos objetivos foram avaliar os efeitos do

exercício crônico sobre a insuficiência renal não realizaram qualquer

progressão de carga até o alcance da velocidade desejada de corrida no início

do treinamento, e não forneceram nenhuma sobrecarga ao longo de até oito

semanas de treinamento. Carvalho et al. (2005) observaram um aumento

significativo na velocidade máxima atingida no TEMP após o treinamento de

quatro semanas a uma intensidade correspondente ao limiar de lactato

(19,50±1,63 x 27,60±1,17 m•min-1). Portanto, no início do treinamento a

velocidade correspondente ao limiar de lactato era 14,90±1,49 m•min-1 e, após

quatro semanas de treinamento, passou a corresponder a 22,60±1,17 m•min-1.

As velocidades de corridas anteriores foram estatisticamente diferentes entre

si, mas não houve diferença no percentual da velocidade máxima de corrida no

início e após as quatro semanas de treinamento (76±3% x 82±2%). A

intensidade de exercício proposta pelo estudo de Carvalho et al. (2005) foi

mantida devido ao incremento de carga obtido pelo TEMP. Se tal correção não

ocorresse, os animais passariam a correr em uma intensidade de exercício

mais baixa. As adaptações aeróbias provocadas pelo exercício crônico têm

estreita relação com a sobrecarga de exercício (American College of Sports

Medicine, 2003).

O aumento do volume sanguíneo é considerado uma adaptação ao

treinamento aeróbio de longa duração tendo como principal causa a expansão

do volume plasmático (Sawka et al., 2000; Kargotich et al., 1998; Fellmanm,

1992; Convertino et al., 1980). Estudos indicam haver uma redução do

hematócrito na ocorrência de hipervolemia induzida pelo treinamento (El-Sayed

et al., 2005; Fellmann, 1992), ao passo que outros estudos não mostraram

diferença (Sawka et al., 2000; Convertino, 1991). O aumento no conteúdo de

albumina no plasma é considerado o principal responsável pela expansão de

volume induzida pelo treinamento aeróbio (Bexfield et al., 2009; Nagashima et

al., 2000; Kargotich et al., 1998; Gillen et. al.,1994; Convertino, 1991). A

expansão do volume plasmático induzida pelo treinamento aeróbio mostra-se

uma adaptação vantajosa na dissipação de calor corporal, na obtenção de um

maior débito cardíaco e volume de ejeção durante o exercício, no aumento da

perfusão sanguínea dos músculos ativos durante o exercício e no aumento no

conteúdo de água corporal, postergando o início de um quadro de desidratação

(Zavorsky, 2000; Sawka et al., 2000; Kargotich et al., 1998; Fellmann, 1992;

Convertino, 1991).

O sistema cardiovascular tem um papel fundamental na execução do

exercício. Os músculos esqueléticos ativos dependem do débito cardíaco para

fornecendo-lhes oxigênio e substratos suficientes para a realização do

exercício. Essa relação é intensidade dependente (Maughan et al., 2000). Os

benefícios do exercício aeróbio crônico sobre o coração fizeram aumentar a

expectativa de vida bem como reduziu a ocorrência de eventos

cardiovasculares (American College of Sports Medicine, 2003). A quantidade

de estudos sobre treinamento aeróbio e coração citados no PubMed1 chega a

ser vinte e uma vezes maiores do que a combinação treinamento e rins (8075 x

377 estudos). Apesar de poucos estudos, o treinamento aeróbio está

demonstrando melhorar a qualidade de vida e a baixa capacidade funcional de

pacientes com doenças renais (Cheema e Singh, 2005; Molsted et al., 2004;

Segura-Ortí et al., 2009). Nos livros de Fisiologia do Exercício (Mcardle et al.,

2006; Powers e Howley, 2006) também se encontram citadas, em maior

volume, as adaptações cardiovasculares, seguidas das adaptações

bioquímicas e metabólicas induzidas pelo treinamento aeróbio. Interessante

ressaltar, que não há menção às adaptações causadas pelo treinamento

aeróbio nos rins em nenhuma dessas fontes bibliográficas consideradas

importantes na área de atividade física.

1.1 Efeito do exercício agudo sobre a função renal

Em condições de repouso, os rins possuem a maior taxa de perfusão

sanguínea entre todos os órgãos, se comparado como percentual do débito

cardíaco ou relativo à massa do órgão. O aumento do fluxo sanguíneo para os

músculos ativos, incluindo o miocárdio, durante o exercício é concedido em

parte pelo aumento do débito cardíaco e em parte pela diminuição da perfusão

da circulação esplânica e renal. O aumento da estimulação simpática nos

vasos renais e esplânicos parece ser o principal responsável pela redução do

fluxo sanguíneo nestes leitos durante o exercício agudo (Mcallister, 1998;

________________________ 1 http:// www.pubmed.gov

Mcallister et al., 1996). Di Carlo e Bishop (1990) mostraram um aumento na

atividade simpática renal em coelhos durante um exercício agudo na esteira

comparado com o repouso.

Embora o sistema nervoso simpático pareça ser determinante na

vasoconstrição induzida pelo exercício na vasculatura renal e,

conseqüentemente, na redução do fluxo sanguíneo renal (FSR), outros fatores

podem estar envolvidos. A endotelina 1 (ET-1), substância vasoconstritora

derivada do endotélio, está envolvida nas mudanças induzidas pelo exercício

na distribuição do fluxo sanguíneo (Maeda et al., 1998). No estudo de Maeda et

al. (2004) foi observado que o exercício de alta intensidade (30 m/min)

culminou no aumento da produção de ET-1 nos rins de ratos e associou-se que

essa resposta contribuiu para a redução do FSR. Os autores propuseram que

há uma interação da produção de ET-1 e do óxido nítrico na regulação do FSR

durante o exercício agudo. A administração de um antagonista do receptor ETA

reverteu a redução da atividade da óxido nítrico sintase e a produção de óxido

nítrico nos rins durante o exercício agudo. Portanto, a ET-1 pode participar da

redução do FSR durante o exercício agudo atenuando a produção de óxido

nítrico, além da ação vasoconstritora.

A angiotensina II (Ang II) contribui também para a redistribuição do débito

cardíaco durante o exercício agudo. O estudo de Stebbins e Symons (1995)

conduzido em porcos demonstrou que o antagonista da Ang II reverteu a

redução do fluxo sanguíneo esplânico durante exercício de alta intensidade na

esteira. Convertino et al. (1983) observaram que as concentrações plasmáticas

de Ang II aumentaram durante o exercício de maneira intensidade-dependente.

O aumento da atividade simpática renal durante o exercício pode induzir maior

liberação de renina nos rins, levando a uma formação aumentada de Ang II.

Recentemente, Maeda et al. (2005) demonstraram um aumento acentuado nas

expressões renal do RNA mensangeiro do angiotensinogênio e da enzima

conversora de angiotensina (ECA), medidas imediatamente após um exercício

agudo de alta intensidade (30 m/min). Além disso, foi confirmada uma

regulação para cima da proteína da ECA e um aumento da Ang II tecidual,

ambas respostas observadas nos rins, após o exercício. Esses resultados

sugerem que o exercício agudo de alta intensidade induziu uma maior

estimulação do sistema renina angiotensina no tecido renal. Ainda no estudo

de Maeda et al. (2005) foram observadas reduções do FSR e esplânico e

aumento do fluxo sanguíneo para o músculo tibial anterior durante o exercício

agudo. Atribuiu-se que o sistema renina angiotensina, mediante a Ang II, cause

vasoconstrição e o conseqüente decréscimo no FSR, o que auxiliaria no

aumento do fluxo sanguíneo para os músculos ativos, contribuindo, portanto,

para a redistribuição do fluxo sanguíneo durante o exercício.

A redução do FSR durante o exercício mostra-se intensidade-

dependente e está relacionada com o aumento da atividade do sistema

nervoso simpático e da ação de agentes vasoconstritores, como Ang II e ET-1

na vasculatura renal (Mcallister et al, 1996; Maeda et al., 1998). Concomitante

à redução do FSR, ocorre redução no ritmo de filtração glomerular (RFG), no

entanto, esta se mostra menos acentuada devido ao aumento da pressão

hidráulica intraglomerular. A vasoconstrição seletiva da arteríola eferente

mediada pela Ang II pode estar associada a esta resposta do RFG. Essa

vasoconstrição poderia elevar ou manter a pressão hidrostática nos capilares

glomerulares, ou seja, a fração de filtração aumenta (Bergamaschi et al., 1991).

Em situações de exercício agudo, sem qualquer interferência do

treinamento, o RFG mostrou-se ou ligeiramente reduzido ou permaneceu

inalterado durante exercício de baixa intensidade (40-50% do VO2max).

Entretanto, o RFG sofreu uma redução de até 50% dos valores de repouso

durante o exercício de alta intensidade ou máximo (Poortmans, 1984;

Zambraski, 1996). Além da vasoconstrição renal induzida pelo exercício agudo,

a alteração na permeabilidade dos capilares glomerulares pode ser

responsável por essa mudança no RFG. As proteínas plasmáticas

praticamente não atravessam a membrana basal dos capilares glomerulares,

mas durante o exercício agudo pode ocorrer um aumento da permeabilidade

glomerular das proteínas, com consequente aumento da pressão oncótica do

filtrado (Gündüz et al., 2003).

O comportamento de outros parâmetros renais e hormonais já foi

estudado durante o exercício agudo. A figura abaixo sintetiza algumas destas

respostas. O sistema nervoso simpático direta e indiretamente está relacionado

com a conservação de água e sódio durante o exercício agudo. Tanto o

glomérulo quanto os túbulos renais são inervados pelo sistema nervoso

simpático que, quando estimulado pelo exercício, estimula a secreção de

renina pela mácula densa do aparelho justaglomerular e aumenta diretamente

a reabsorção tubular de sódio e água. A secreção de renina ativa o sistema

renina-angiotensina- aldosterona contribuindo para a maior reabsorção tubular

de sódio e água e secreção tubular de potássio durante o exercício agudo.

Figura 1: Fatores controladores da função renal durante o exercício agudo. Sendo: FSR=fluxo sanguíneo renal, RVR= resistência vascular renal, PAM=pressão arterial média, RFG=ritmo de filtração glomerular, FF= fração de filtração e ADH= vasopressina. Adaptado de Zambraski (1996).

Dependendo da intensidade do exercício, observam-se respostas

diferenciadas no fluxo urinário (FU) e na excreção de eletrólitos. O fluxo de

urina e a excreção de sódio permaneceram inalterados ou aumentaram

ligeiramente durante o exercício de baixa intensidade. Contrariamente, durante

o exercício de intensidade moderada-alta foi observada uma inibição da

diurese e um declínio significativo na fração de excreção de sódio (Freund et

al., 1991; Montain et al., 1997; Nagashima et al., 2001).

O exercício agudo tende a reduzir o FSR e aumentar a conservação de

água e sódio. No entanto, não se sabe se o treinamento aeróbio irá

potencializar esta resposta durante o exercício. Adicionalmente, ainda se

desconhece se o treinamento aeróbio altera a função renal de repouso, sem

qualquer efeito do exercício.

As adaptações induzidas pelo treinamento aeróbio sobre os rins ainda

são pouco exploradas em animais ou humanos sem patologias. Estudos sobre

esse tema desenvolvidos até o momento priorizaram verificar os efeitos do

exercício sobre o FSR e a participação de alguns agentes vasoconstritores e

vasodilatores na resposta vascular renal mediando à redução do FSR durante

o exercício agudo.

1.2 Efeito do exercício crônico sobre a função rena l

Di Carlo e Bishop (1990) e Armstrong e Laughlin (1984) observaram

durante uma sessão de exercício agudo uma menor redução no fluxo de

sangue para os órgãos esplânicos e os rins em coelhos e ratos treinados,

comparado com os não-treinados. Essa menor redução do fluxo sanguíneo

renal e esplânico nos treinados poderia ser atribuída a uma menor atividade

simpática em uma mesma intensidade absoluta de exercício. Em artérias

renais de porcos, o treinamento reduziu as respostas contráteis induzidas pela

norepinefrina, um efeito que parece ser abolido pela remoção do endotélio.

Adicionalmente, o relaxamento independente do endotélio induzido pelo

nitroprussiato de sódio na artéria renal não foi afetado pelo programa de

treinamento, sugerindo então que a menor vasoconstrição da artéria renal

observada em animais treinados resulta da liberação aumentada de

substâncias relaxantes derivadas do endotélio (Mcallister et al., 1996).

De Moraes et al. (2004) verificaram que o treinamento aeróbio de

intensidade moderada alterou a reatividade vascular em rins de coelhos,

potencializando a vasodilatação renal dependente e independente do endotélio.

Os pesquisadores utilizando-se do método de perfusão em rim isolado

observaram um aumento da vasodilatação dependente do endotélio (54 ± 6%)

em animais treinados comparado com os não-treinados (41 ± 8%). A perfusão

contínua dos rins isolados com inibidor da síntese de óxido nítrico (L-NAME)

bloqueou completamente a vasodilatação adicional induzida pela acetilcolina

nos animais treinados, resposta não encontrada nos não-treinados. A pressão

de perfusão renal nos treinados foi reduzida de 54 ± 6 para 38 ± 5% em rins

perfundidos com L-NAME. A bradicinina induziu respostas vasodilatadoras

similares em rins dos animais treinados e não-treinados. Por último, o

treinamento aumentou a vasodilatação independente do endotélio induzida

pelo nitroprussiato de sódio (45 ± 10% x 36 ± 7%). Esses resultados sugerem

que o aumento da vasodilatação em rins de coelhos treinados está relacionada

a um aumento da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), provocada

provavelmente por alterações funcionais no endotélio vascular, e a um

aumento da sensibilidade do músculo liso vascular renal ao NO.

Sugere-se que o estresse por fluxo seja o principal estímulo para as

adaptações vasculares renais induzidas pelo exercício aeróbio crônico. O

estresse por fluxo torna-se aumentado no decorrer das repetições das sessões

agudas de treinamento aeróbio. O aumento do débito cardíaco e da pressão

arterial média durante o exercício, associados com a vasoconstrição renal,

resultaria em aumento da velocidade do fluxo sanguíneo e, consequentemente,

em aumento do estresse por fluxo na circulação renal, apesar da redução do

FSR total. O aumento do estresse por fluxo está associado com uma regulação

para cima da NO sintase endotelial e com a regulação para baixo da ET-1,

favorecendo, portanto, na resposta vascular aumentada observada após os

programas de exercício aeróbio crônico (Busse e Flemingm 1998; Chien et al.,

1998).

O comportamento das respostas induzidas pelo exercício aeróbio sobre

os rins altera com a intensidade do exercício. O exercício agudo de alta

intensidade provocou a liberação de citocinas pró-inflamatórias, aumentou a

expressão de RNA mensageiro de ET-1, reduziu os metabólitos estáveis do NO

e reduziu a expressão de RNA mensageiro da NO sintase endotelial, todas

essas respostas observadas em rins de ratos (Maeda et al., 1998; Miyauchi et

al., 2003; Pedersen e Hoffman-Goetz, 2000). Atribuí-se essas respostas a um

menor estresse por fluxo na rede vascular renal durante exercício de alta

intensidade. Embora não medido diretamente, esse estresse por fluxo

resultaria na regulação para baixo da NO sintase endotelial e uma conseqüente

redução na produção de NO em rins de rato, junto com aumento na expressão

e liberação de ET-1. Como ET-1 pode cronicamente regular para cima a NO

sintase endotelial, é concebível que exposição repetida a estímulos

vasoconstritores provocaria na circulação renal uma adaptação fisiológica

favorecendo a vasodilatação e preservando a perfusão renal durante o

exercício agudo (De Moraes, 2004).

Baseado nos estudos relatados até o momento sobre os efeitos do

exercício aeróbio agudo e crônico sobre a função renal, o FSR foi o foco

principal dos estudos com animais normais. Esses estudos objetivaram

investigar quais são os fatores envolvidos na redução do FSR durante o

exercício agudo bem como investigar o efeito do treinamento aeróbio sobre o

fluxo sanguíneo durante o exercício. Ao contrário do FSR, o comportamento de

outros parâmetros da função renal são ainda pouco explorados, principalmente

sobre influência do treinamento. O conhecimento da interação entre

treinamento aeróbio e função renal servirá para identificar os benefícios da

atividade física sobre a função renal tanto em repouso quanto durante o

exercício.

2 OBJETIVOS

Investigar as possíveis adaptações causadas pelo exercício físico crônico

de intensidade moderada na função renal de ratos normais em duas situações

distintas: em repouso e sob efeito do exercício agudo.

2.1 Objetivos específicos

• Montar e padronizar um protocolo de treinamento físico de intensidade

moderada para ratos, em esteira;

• Investigar se o exercício físico crônico de intensidade moderada:

• Afeta o perfil geral (hematócrito, hemoglobina, volume plasmático,

aspecto morfológico renal, ingestão de água e de ração) e

parâmetros de função renal, na situação de repouso;

• Interfere com parâmetros de função renal, na situação pós-

exercício agudo de intensidade absoluta.

• Altera o perfil plasmático de hormônios como a vasopressina

(ADH) e aldosterona tanto em repouso, quanto pós-exercício

agudo;

• Altera o conteúdo plasmático e atrial de ANP (peptídeo atrial

natriurético) bem como seu binding a rins de ratos normais, em

repouso e pós-exercício.

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Cuidados éticos

Todos os procedimentos utilizados neste estudo foram aprovados pelo

Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universide Federal de Minas

Gerais (n°182/08).

3.2 Amostra

Um total de 69 ratos machos adultos da linhagem Wistar foram utilizados

no presente estudo. O peso inicial dos ratos, antes do início do treinamento,

variou entre 180 e 200g.

Os ratos foram fornecidos pelo Centro de Bioterismo (CEBIO), localizado

no próprio Departamento de Fisiologia e Biofísica (ICB-UFMG). No biotério, os

ratos tiveram livre acesso à água e ração granulada sob monitoramento da

temperatura ambiente e controle do ciclo claro-escuro (14-10h).

3.3 Procedimentos prévios ao treinamento

Todos os ratos foram submetidos a um TEMP antes do início do

treinamento físico. O objetivo do mesmo foi caracterizar a capacidade de

corrida de cada rato medindo-se parâmetros de desempenho no teste de

esforço. Os ratos resistentes à corrida no TEMP bem como aqueles com

desempenho muito acima ou muito abaixo da média geral foram descartados.

O restante foi dividido aleatoriamente em dois grupos nos quais foi observado

se as variáveis de desempenho no teste de esforço permaneceram

semelhantes entre os grupos.

Os grupos experimentais consistiram em:

� Grupo controle: ratos não-treinados (NT);

� Grupo experimental: ratos treinados (T) a uma intensidade

moderada, correspondente a 65% da velocidade máxima de corrida

(Vmáx) atingida no TEMP.

Os ratos do grupo T foram treinados em uma esteira motorizada de

cinco pistas (GAUSTEC Magnetismo, Brasil). O treinamento físico foi realizado

em uma sala de experimentação animal do próprio Laboratório de Fisiologia

Renal (ICB/UFMG) e, nesse local, houve monitoramento da temperatura

ambiente durante todo o período de treinamento. A temperatura seca e úmida

foi de 24,6 ± 0,3 e 22 ± 0 °C, respectivamente.

3.3.1 Protocolo do treinamento físico de intensidad e moderada

O protocolo de treinamento utilizado no presente estudo foi adaptado de

um protocolo de treinamento de oito semanas, já descrito na literatura (Priviero

et al., 2004), utilizando ratos Wistar como amostra. Os ratos foram submetidos

a oito semanas de treinamento com sessões de 60 min/dia e freqüência de 5

dias/semana. As sessões de treinamento foram sempre realizadas no período

vespertino. A Vmáx atingida no TEMP foi o parâmetro usado para determinar a

intensidade de treinamento, conforme também utilizado por outros

pesquisadores (Jackson et al., 2005; Martins et al., 2005). Nas três semanas

iniciais, a velocidade e duração das sessões de exercício foram aumentadas,

gradualmente, até que a velocidade de corrida desejada (65% Vmáx atingida no

TEMP) fosse atingida. A partir da 4ª semana de treinamento, o grupo T correu

a uma velocidade correspondente a 65% Vmáx atingida no TEMP,

correspondendo a um exercício de intensidade moderada. A velocidade de

corrida do grupo T foi corrigida na 5ª semana de treinamento. A correção foi

baseada na Vmáx atingida no TEMP aplicado ao final da 4ª semana de

treinamento. O objetivo dessa manobra foi tentar manter a mesma intensidade

de exercício ao longo do treinamento. A Tabela 1 sumariza como foi a

progressão das sessões de exercício, em termos de intensidade e duração, até

atingir-se a intensidade desejada de 65% da capacidade máxima de cada rato,

respeitando-se o princípio da individualidade do treinamento.

Os ratos não-treinados também tiveram acesso à esteira para garantir a

mesma manipulação entre os grupos. Durante as oito semanas de treinamento,

os ratos do grupo NT (não-treinados) caminharam a uma velocidade de 5

m/min, por 5 min, numa freqüência também de 5 dias por semana.

Tabela 1: Progressão do treinamento físico de intensidade moderada. Adaptado de PRIVIERO et al. (2004). Sendo: TEMP= teste de esforço máximo progressivo; Vmáx= velocidade máxima de corrida atingida no TEMP; TTE= tempo total de exercício; DTP=distância total percorrida.

Progressão do treinamento

1°°°° TEMP Medição da Vmáx de cada rato; Medição de outros parâmetros de desempenho no TEMP: TTE e DTP

1a SEMANA Intensidade: 28% Vmáx Duração: 30-40 min diários Frequência: 5 vezes por semana

2ª SEMANA Intensidade: 44% Vmáx Duração: 45 min Frequência: 5 vezes por semana

3ª SEMANA Intensidade: 65% Vmáx Duração: 50 min Frequência: 5 vezes por semana

4ª SEMANA Intensidade: 65% Vmáx Duração: 60 min Frequência: 5 vezes por semana

2°°°° TEMP Medição da Vmáx de cada rato, novamente; Medição de outros parâmetros de desempenho no TEMP: TTE e DTP

5ª a 8ª SEMANAS Intensidade: 65% Vmáx, corrigida pelo teste de esforço realizado após a 4ª semana; Duração: 60 min Frequência: 5 vezes por semana

3°°°° TEMP Medição da Vmáx de cada rato, novamente; Medição de outros parâmetros de desempenho no TEMP: TTE e DTP

3.3.2 Teste de esforço máximo progressivo (TEMP)

Inicialmente, os ratos foram submetidos a um período de adaptação à

esteira, que consistiu em uma corrida diária de 10 min a uma velocidade de 5 a

8 m/min, durante uma semana (Jackson et al., 2005). Os ratos resistentes à

corrida durante o processo de adaptação foram excluídos da amostra.

Posteriormente, os ratos foram submetidos a um TEMP baseado no protocolo

de Carvalho et al. (2005). Os ratos iniciaram o teste com a velocidade de 6

m/min e, a cada 3 min de exercício, havia um incremento da velocidade em 3

m/min até o rato atingir a fadiga. Esta foi caracterizada pela recusa do animal

em continuar a correr mesmo sob a influência de um estímulo e/ou perda de

sua coordenação motora. O estímulo utilizado foi a estimulação elétrica na

grade de metal localizada na parte traseira da esteira. A intensidade do choque

foi a mínima necessária para manter o rato correndo (American Physiological

Society, 2006). A fadiga foi delimitada durante o TEMP quando, pela terceira

vez consecutiva, o rato parava na grade de estimulação elétrica por mais de 2

segundos com intervalo de 60 segundos entre as paradas e/ou na primeira e

única vez em que o rato parava de correr e estacionava na grade de

estimulação elétrica por mais de 10 segundos corridos (Balthazar, 2008).

O tempo total de exercício, a distância total percorrida e a velocidade

máxima de corrida, medidos no TEMP aplicado no início e ao final do

treinamento, foram parâmetros usados para determinar se os ratos estavam

realmente treinados, conforme já utilizados em outros estudos (Jackson et al.,

2005; Carvalho et al., 2005; De Moraes et al., 2004).

3.3.3 Atividade da desidrogenase lática (LDH)

A atividade da LDH total é um marcador de danos celulares induzidos

pelo exercício ou mesmo por implicações patológicas (Brancaccio et al., 2008).

A enzima LDH catalisa a redução do piruvato com o NADH, tendo como

resultado a produção de lactato e NAD+, sendo a reação reversível. No

presente estudo, a atividade da LDH em amostras de soro de ratos T e NT foi

determinada pré e pós-treinamento. Cerca de 80 µl de sangue, sem

anticoagulante, foi coletado por punção venosa da cauda. Posteriormente, o

sangue foi centrifugado por 10 min a 2000 rpm e o soro obtido foi armazenado

em geladeira. A dosagem da LDH no soro foi feita no mesmo dia da coleta das

amostras de sangue.

A determinação da atividade da LDH sérica foi feita pelo método de

cinética química utilizando-se o Kit da Bioclin (Quibasa, Brasil). A velocidade de

decomposição do NADH foi quantificada, medindo-se a queda da

absortividade, a 340 nm, a uma temperatura de 37 °C . A queda da absorbância

de cada amostra foi lida por um período de 3 min, especificamente, nos tempos

0, 1°, 2° e 3° min. Fez-se a média das diferenças d e absorbância por minuto

(∆A/min) e multiplicou-se o resultado pelo fator de calibração (FC = 8016) para

a obtenção do resultado.

3.3.4 Atividade da succinato desidrogenase (SDH)

A SDH é um complexo enzimático ligado à membrana interna da

mitocôndria que cataliza a oxidação do succinato a fumarato. Nos ratos

treinados aerobicamente, espera-se um aumento da atividade dessa enzima do

Ciclo de Krebs.

A atividade da SDH foi determinada de acordo com os métodos de

Narahara et al. (1979) e Kun e Abood (1949). A preparação da fração

mitocondrial foi de acordo com o estudo de Narahara et al. (1979) e a reação

colorimétrica para estimativa da SDH usando-se a fração mitocondrial foi de

acordo com o estudo de Kun e Abood (1949).

Inicialmente, padronizou-se o ensaio usando-se fígado de ratos Wistar

já que a atividade hepática da SDH é mais elevada do que no tecido muscular

esquelético (Kun e Abood, 1949). Fez-se uma curva padrão concentração-

efeito da atividade da SDH no tecido hepático e, posteriormente, fez-se a

mesma curva usando tecido muscular esquelético.

Padronização do ensaio do SDH usando fígado e músculo de rato

Nesse ensaio, foram utilizados três ratos Wistar não pertencentes à

amostra dos protocolos experimentais I e II. Imediatamente após o sacrifício

dos ratos, os fígados foram removidos e colocados em uma placa resfriada

contendo solução de Ringer. Um pool de 23 g de tecido hepático foi utilizado no

ensaio. O tecido foi cortado cuidadosamente em fatias menores e suspendido

em 3 volumes de solução tampão contendo 0,19 M de sucrose, 0,1 M de Cacl2

e 4 mM de Tris-HCl, a uma temperatura de 0 °C e pH 8. A suspensão foi

homogeneizada em um tubo falcon resfriado usando-se um homogeneizador

Polytron PT-35, em baixa velocidade, por 5 min. O homogenato resultante foi

centrifugado por 5 min a 800 g. O sobrenadante túrbido foi removido e

armazenado. O pellet foi ressuspendido em 3 volumes da solução tampão

citada acima e novamente foi homogeneizado por 5min sendo, esse

homogenato, centrifugado a 800 g por 5 min. O sobrenadante foi novamente

removido e armazenado. O pellet novamente foi ressuspendido,

homogeneizado e centrifugado como citado anteriormente. Os sobrenadantes

obtidos das três homogeneizações e centrifugações foram unidos e novamente

centrifugados por 15 min a 800 g para retirar a turbidez. O pellet resultante

dessa centrifugação foi descartado e o sobrenadante mais claro foi

centrifugado por 15 min a 10.000 g. O pellet resultante desta última

centrifugação foi considerado a fração mitocondrial. Esta fração foi

ressuspendida em um pequeno volume (2,5 ml) de solução tampão contendo

0,19 M de sucrose e 20 mM Tris-HCl, a uma temperatura de 0 °C e pH 7,5.

A atividade da SDH em preparações teciduais é detectável quando o

formazan é formado pela redução do tetrazólio na presença do succinato. Pela

determinação colorimétrica do formazan, estima-se a atividade da SDH (Green

e Narahara, 1980). No presente estudo, a reação colorimétrica foi preparada da

seguinte maneira: em um tubo de ensaio, adicionava-se 0,5 ml de tampão

fosfato 0,1 M (pH 7,4), 0,5 ml de succinato de sódio 0,2 M (pH 7,4), 1 ml de

cloreto de trifeniltetrazólio 0,1% e volumes crescentes de fração mitocondrial do

fígado (25, 50, 75, 100 e 200 µl), sendo corrigido o volume final da reação.

Posteriormente, os tubos foram agitados e colocados em banho-maria a 38 °C

por 15 min. Imediatamente após a retirada dos tubos do banho, 7 ml de

acetona foram adicionados em cada tubo. Os tubos foram vedados, agitados

vigorosamente e, posteriormente, centrifugados a 800 g por 5 min. A

absorbância do sobrenadante foi lida nos comprimentos de onda de 420 e

458nm sendo, a cor da reação, estável por várias horas.

O mesmo procedimento usado na preparação da fração mitocondrial do

fígado foi utilizado no preparo da fração mitocondrial de músculo esquelético de

ratos. Um total de seis ratos não pertencentes à amostra dos protocolos

experimentais I e II foi utilizado nesse ensaio. Os músculos esqueléticos

utilizados foram o sóleo e o gastrocnêmio medial e lateral. As curvas padrão

volume de fração mitocondrial hepática ou muscular versus absorbância do

formazan (proporcional à atividade da SDH) estão mostradas na Fig. 2.

Figura 2: Curva padrão de volumes crescentes de fração mitocondrial hepática ou muscular (sóleo e gastrocnêmio) de rato versus absorbância do formazan (proporcional à atividade da SDH). M, absorbância da fração mitocondrial de músculo esquelético lida a 420 nm (M420) e 458 nm (M458); F, fração mitocondrial de fígado lida a 420 nm (F420) e 458 nm (F458).

Para se determinar a atividade da SDH na fração mitocondrial do tecido

muscular de ratos T e NT, preparada como descrito na padronização do

ensaio, foi utilizada uma alíquota de 100 µl da fração obtida dos músculos

coletados nos protocolos experimentais I e II. Essa alíquota foi escolhida com

base na curva padrão obtida para a fração mitocondrial do músculo esquelético

de rato (Fig. 2), pois a absorbância do formazan foi superior a 0,100, como

recomendado por Green e Narahara (1980).

3.4 Protocolos experimentais

No presente estudo, foram utilizados dois protocolos experimentais de

acordo com seus respectivos objetivos:

1) Protocolo I: Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre o

perfil geral (hematócrito, hemoglobina, volume plasmático, aspecto morfológico

renal, ingestão de água e de ração) e sobre parâmetros de função renal, na

situação de repouso;

Músculo + Fígado

0 50 100 150 200 250-0.150

0.000

0.150

0.300

0.450

0.600

M420 (r2 = 0,98)

M458 (r2 = 0,99)

F420 (r2 = 0,94)

F458 (r2 = 0,98)

B

Fração Mitocondrial ( µµµµl)

Abs

orbâ

ncia

do

form

azan

(nm

)

2) Protocolo II: Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre

parâmetros de função renal, na situação pós-exercício de intensidade absoluta.

Além dos parâmetros renais (ritmo de filtração glomerular, fluxo urinário

e excreção de água e de Na+ e K+), as concentrações plasmáticas de ADH,

aldosterona e ANP bem como o conteúdo atrial de ANP foram determinados

em ambos os protocolos.

3.4.1 Protocolo I – Perfil geral e função renal de ratos treinados na situação de repouso

3.4.1.1 Perfil geral dos ratos treinados em repouso

a) Hematócrito, hemoglobina e volume plasmático

A concentração de hemoglobina no sangue e o hematócrito dos ratos T

e NT foram determinados antes e após o treinamento. O sangue foi coletado

por punção venosa da cauda. As amostras de sangue para hematócrito foram

coletadas em tubos capilares, em triplicatas. Para a quantificação do

hematócrito, utilizou-se o método de microhematócrito onde se obteve a

percentagem de hemácias pela centrifugação do sangue, dentro de um tubo

capilar, a 10.000 rpm por 5 min. Cerca de 40 µl de sangue heparinizado foi

coletado para a dosagem de hemoglobina sendo, a mesma, feita logo após a

coleta do sangue. A concentração de hemoglobina no sangue foi determinada

por teste colorimétrico usando o Kit da Bioclin (Quibasa, Brasil) cujo método

adotado é a cianometahemoglobina. O Ferricianeto de potássio, em pH

fracamente alcalino, oxida o átomo de ferro da molécula de hemoglobina

formando a metahemoglobina. Esta é convertida em cianometahemoglobina

após a reação com o cianeto de potássio. A coloração avermelhada é

proporcional à concentração de hemoglobina da amostra que é lida em

espectrofotômetro a um comprimento de onda de 540 nm.

O volume plasmático foi medido pelo método de Belcher e Harris (1957),

o qual utiliza o corante Azul de Evans. Para se medir o volume plasmático,

deve-se usar uma substância que não atravesse rapidamente a membrana dos

capilares, mas que permaneça no sistema vascular depois de injetada na

corrente sanguínea. O método baseia-se no princípio de conservação da

massa, no qual a massa total de uma substância, depois de dispersada num

compartimento líquido, é igual à massa total que foi introduzida no

compartimento. O corante Azul de Evans, que se liga às proteínas plasmáticas,

foi utilizado como marcador do volume plasmático (Hines e Mifflin, 1995; Hines

et al., 2005).

Um total de 13 ratos foi utilizado para a quantificação do volume

plasmático, sendo 6 não-treinados e 7 treinados. A medição foi feita após as 8

semanas de treinamento. Cada rato foi colocado em uma caixa de contenção e

a veia lateral direita da cauda foi puncionada utilizando um catéter BD de

calibre 24G. Em seguida, injetou-se 200 µl de Azul de Evans 0,5% dissolvido

em NaCl a 0,9%. Exatamente 5 min após a injeção, 500 µl de sangue foi

retirado da veia lateral esquerda da cauda. O sangue foi centrifugado a 3000

rpm, por 10min. A absorbância do plasma foi lida em espectrofotômetro a um

comprimento de onda de 620 nm. A concentração de Azul de Evans no plasma

foi quantificada multiplicando-se a absorbância pelo fator de calibração. Este

fator foi calculado a partir da curva padrão com concentrações conhecidas de

Azul de Evans, construída utilizando plasma de um rato doador (Fig. 3).

Figura 3: Curva padrão do corante Azul de Evans (r=0,99).

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125-0.500

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

Evans Blue (mg.ml -1)

Abs

orbâ

ncia

(620

nm

)

b) Histologia dos rins

Os rins esquerdos dos ratos T e NT foram utilizados nas análises

histológicas. Técnicas convencionais de coloração (eosina-hematoxilina) foram

usadas na preparação das lâminas (Prophet et al., 1992; Luna, 1968).

c) Ingestão e excreção

A função renal de repouso dos ratos T e NT foi medida em gaiolas

metabólicas onde houve monitoramento da ingestão de água e ração, bem

como a produção de fezes e urina (Fig.4). Previamente a medição da função

renal em si, verificou-se o efeito do treinamento sobre os parâmetros

monitorados nas gaiolas metabólicas. Após o treinamento, foram investigados

a ingestão de água e de ração e a produção de urina e fezes pelos ratos

treinados, mantidos em repouso em gaiolas metabólicas. Para essas medidas,

foram utilizados 14 ratos sendo sete treinados (T) e sete não-treinados (NT).

Os ratos foram colocados individualmente em gaiolas metabólicas

(Nalgene, USA) (Fig. 4) 48 h após a realização do TEMP aplicado ao final do

treinamento. A quantidade ingerida de água e ração e a produção de urina e

fezes foi medida a cada 24 h por um período de 14 dias (Fig. 5). Os frascos

para administração de água e coleta de urina das gaiolas eram graduados e

possuíam capacidade para 100 ml. A quantidade de ração ingerida era

quantificada, gravimetricamente, utilizando-se uma balança digital (Coleman,

Brasil) com precisão de 0,05 g. No início de cada dia, colocava-se sempre a

mesma quantidade de ração (35 g) em cada gaiola. A quantidade de fezes

produzidas também foi quantificada por gravimetria.

Durante todo o experimento as gaiolas metabólicas foram mantidas em

uma sala com controle do ciclo claro-escuro (14-10 h) e da ventilação, além do

monitoramento da temperatura ambiente. A sala possuía um ar condicionado

que foi sempre ajustado para manter a temperatura seca em torno de 23-25 °C.

Ao longo dos 14 dias de permanência nas gaiolas metabólicas, os ratos

treinados foram submetidos a sessões de exercício com o objetivo de evitar o

destreinamento dos mesmos. A manutenção do treinamento para o grupo T

consistiu em realizar a mesma sessão de exercício executada durante o

treinamento prévio, ao passo que para o grupo NT, consistiu em caminhar na

esteira a 5m/min, por 5min. A Figura 4 mostra os procedimentos a que ambos

os grupos foram submetidos ao longo dos 14 dias. Para se evitar um possível

efeito das sessões de exercício realizadas nos dias anteriores, no grupo T, as

variáveis sob estudo não foram quantificadas nos dias 4, 7, 10 e 13.

Figura 4: Representação esquemática da gaiola metabólica. Na gaiola é possível monitorar a ingestão de água e ração e a produção de urina e fezes.

Figura 5: Sequência de procedimentos que os grupos T e NT foram submetidos ao longo de 14 dias de permanência em gaiolas metabólicas. Sendo: T = manutenção do treinamento, R = repouso e L = limpeza das gaiolas.

Os ratos T e NT foram retirados das gaiolas metabólicas após o 14°dia e

foram colocados em caixas de polipropileno, mantidas na mesma sala das

gaiolas metabólicas. Posteriormente, esses mesmos ratos foram submetidos a

dois procedimentos experimentais com o objetivo de se delinear o protocolo

experimental, onde o efeito do exercício agudo sobre a função renal de ratos

treinados foi investigada. Esses procedimentos foram:

• Determinar por quanto tempo o grupo NT suportaria correr na esteira, a

uma velocidade de 21 m/min;

• Determinar o tempo mínimo, de permanência nas gaiolas, necessário

para o início de eliminação de urina pelos ratos T e NT após a sessão de

exercício a 21 m/min.

Inicialmente, o grupo NT foi submetido a duas sessões de exercício a

uma velocidade de 21 m/min cada, com intervalo de 3 dias entre elas. Essa

velocidade de corrida correspondeu a 65% Vmáx atingida no TEMP para o grupo

NT. O exercício foi interrompido quando os ratos NT atingiram a fadiga, a qual

foi determinada da mesma forma que aquela determinada no TEMP. O tempo

médio de corrida do grupo NT foi de 45,8 ± 10,2 min.

Para se determinar quando os ratos T e NT iniciariam a produção de

urina pós-exercício, ambos os grupos foram colocados em gaiolas individuais

comuns imediatamente após uma sessão de exercício de 35 min a 21 m/min. A

duração do exercício foi estipulada como sendo correspondente a 76% do

tempo no qual os ratos NT atingiram a fadiga. Devido à dificuldade de se

coletar urina e sangue durante o exercício, a função renal de ratos T e NT foi

avaliada imediatamente após os mesmos serem submetidos ao exercício. Dos

14 ratos avaliados, treze eliminaram urina nas primeiras 7 h de permanência

nas gaiolas e apenas um rato não eliminou urina até esse período. O tempo

médio para início da produção de urina foi de 305 ± 37 min. Ou seja, após o

exercício, os ratos levaram em média 5 h para iniciar a eliminação de urina.

Baseado nos resultados obtidos, considerou-se adequado o tempo de 480 min

(8 h) para se avaliar a função renal pós-exercício. Esse tempo foi

correspondente da média obtida do tempo para início da produção de urina

adicionada de dois desvios padrões (SD = 92 min). Se a média do tempo para

início do fluxo urinário fosse considerada, metade da amostra ainda não

haveria urinado.

3.4.1.2 Função renal dos ratos treinados em repouso

Nessa série experimental foram utilizados 12 ratos, sendo seis treinados

e seis não-treinados. A função renal de repouso foi medida a cada 24 h

utilizando-se gaiolas metabólicas. Durante todo o experimento, as gaiolas

metabólicas foram mantidas em uma sala com controle do ciclo claro-escuro

(14-10 h) e da ventilação, além do monitoramento da temperatura ambiente. A

sala possuía um ar condicionado que foi sempre ajustado para manter a

temperatura seca em torno de 23-25 °C.

Os ratos foram colocados individualmente nas gaiolas metabólicas 48 h

após a realização do TEMP aplicado ao final do treinamento. Ambos os grupos

permaneceram nas gaiolas metabólicas por 5 dias, sendo a função renal

medida no 1°, 4° e 5° dias (Fig.6). De acordo com dados prévios do nosso

laboratório, 3 dias de permanência nas gaiolas são suficientes para que haja

aclimatação dos ratos às mesmas. Por isso, o efeito do treinamento na função

renal de repouso foi avaliado a partir do 4° dia de permanência nas gaiolas. A

Figura 4 mostra o esquema do procedimento usado nessa série experimental.

Vale ressaltar que a urina coletada na gaiola metabólica não era

contaminada com resquícios de ração. Para evitar tal contaminação, foi

necessário fazer uma adaptação no compartimento de ração da gaiola para

evitar que o rato retirasse a mesma desse local. A ato de roer a ração fora do

local apropriado contamina a urina, já que resquícios de ração podem cair no

recipiente de coleta de urina.

Nos dias de coleta de sangue (1º, 4º e 5º dias), os ratos foram retirados

das gaiolas metabólicas ao final das 24 h e foram levados à uma outra sala

onde se fez o procedimento de coleta. Cada rato, individualmente, foi colocado

em uma caixa de madeira aquecida (31 cm altura x 31 cm largura), por um

período de 5 min. O objetivo do aquecimento foi causar vasodilatação na

cauda, facilitando assim a punção venosa da mesma. Logo após o período de

aquecimento, o rato foi transferido para uma caixa de contenção compatível

com o tamanho do mesmo, deixando exposta apenas a cauda. Após a

assepsia da mesma, cerca de 700 µl de sangue foram coletados por punção da

veia lateral esquerda da cauda utilizando um catéter BD de calibre 24. O

sangue foi centrifugado a 3000 rpm por 10 min e o plasma foi armazenado em

freezer a -20 °C. Terminada a coleta de sangue, os ratos retornavam para as

gaiolas metabólicas.

No 2° dia de gaiola metabólica o grupo T foi submet ido a uma sessão de

exercício na mesma intensidade e duração do treinamento prévio, com o

objetivo de evitar o destreinamento. O grupo NT caminhou na esteira a 5 m/min

por 5 min. Logo após o término do exercício, ambos os grupos retornaram para

as respectivas gaiolas metabólicas.

Ao final do 5° dia, os ratos foram retirados das ga iolas metabólicas

retornando, cada grupo, para as caixas de polipropileno. O grupo T foi

submetido novamente a mais uma sessão de exercício para a manutenção do

treinamento e o grupo NT novamente caminhou na esteira. Quarenta e oito

horas após a sessão de exercício, os ratos foram sacrificados por decapitação,

sem utilização de sedação. Após a decapitação, o sangue proveniente do

tronco foi coletado e as patas traseiras, rins e átrios foram removidos. Todos os

tecidos removidos foram pesados em balança digital (Coleman, Brasil) com

precisão de 0,05 g.

Figura 6: Esquema de coleta de dados para a medição da função renal dos ratos treinados e não-treinados em repouso.

1°°°° 2°°°° 3°°°° 4°°°° 5°°°°

Aclima tação à gaiola gaiola

dias

Medida da função renal

Coleta de sangue

Coleta de sangue

Coleta de sangue

T

Gaiola Metabólica

O sangue foi coletado em um tubo falcon heparinizado e,

posteriormente, foi aliquotado (2 ml) em tubos tipo eppendorf para avaliação da

função renal e para dosagens de ANP e vasopressina. Ao sangue destinado à

dosagem de ANP foi adicionado um pool de inibidores de proteases (EDTA 10-5

M, pepstatina 0,5x10-5 M e PMSF 10-5 M). Em seguida, esse sangue foi

centrifugado, por 20 min, a 2500 rpm a uma temperatura de 4 °C. Já o sangue

para a dosagem de vasopressina foi centrifugado a 4 °C, por 10 min, a 3000

rpm. O sangue destinado à dosagem de aldosterona foi coletado em um tubo

falcon à parte, sem anticoagulante, para a obtenção do soro. Após a

centrifugação, as amostras de plasma e soro foram armazenadas em freezer a

-80 °C.

Imediatamente após a decapitação e coleta de sangue, foram removidos

os rins, átrios e patas traseiras dos ratos. As patas traseiras direita e esquerda

foram cortadas utilizando-se uma tesoura cirúrgica e dissecadas até tornar

expostos os músculos posteriores da perna. Os músculos gastrocnêmio e sóleo

foram cortados em sua origem e inserção e colocados imediatamente em

nitrogênio líquido e, posteriormente, armazenados a -80 °C. Logo após a

retirada das patas, foi realizada uma incisão longitudinal no abdômen e as

vísceras abdominais foram deslocadas de modo que os rins ficassem expostos.

Com auxílio de uma tesoura, o rim esquerdo foi removido e armazenado em

solução de formol tamponado a 10% para análise histológica. O rim direito foi

também removido e colocado imediatamente em nitrogênio líquido e,

posteriormente, armazenado a -80 °C. O rim direito foi utilizado nos ensaios de

binding de ANP. Os átrios direito e esquerdo também foram removidos,

colocados em nitrogênio líquido e, posteriormente, armazenados a -80 °C.

Os parâmetros renais medidos foram: o ritmo de filtração glomerular

(RFG), o fluxo urinário (FU), as frações de excreção de sódio (FENa+) e de

potássio (FEK+), o clearance osmolar (Cosm), o clearance de água livre (CH2O

livre) e os clearances de sódio e potássio.

O RFG foi determinado por meio do clearance de creatinina, a qual foi

quantificada no plasma e urina utilizando-se o kit colorimétrico da Bioclin

(Quibasa, Brasil). As amostras de urina diluída (1:25) e plasma reagiram em

meio alcalino com o ácido pícrico (60 mmol/l) formando um complexo

creatinina-picrato de cor amarelo-avermelhada. A absorbância desse complexo

foi lida em espectrofotômetro (Barnstead/Turner SP-830 plus) a um

comprimento de onda de 510 nm. Como o ácido pícrico também reage com os

cromogênios plasmáticos, o ácido acético (12,25 mol/l) foi adicionado nas

amostras de plasma abaixando o pH do meio e promovendo a decomposição

do picrato de creatinina, permanecendo inalterada a cor derivada dos

cromogênios. A amostra de plasma foi novamente lida a 510 nm no

espectrofotômetro. A diferença entre as duas leituras das amostras de plasma

forneceu o valor final da absorbância da creatinina plasmática. A absorbância

da creatinina urinária foi corrigida pela diluição da urina (1:25).

As concentrações de creatinina no plasma e urina foram determinadas

multiplicando-se os valores das absorbâncias pelo fator de calibração. Esse foi

calculado a partir da curva padrão de creatinina feita com o reagente padrão do

kit (creatinina 3 mg/dl). Os pontos utilizados na curva foram 30 µg/ml, 15 µg/ml

e 0,5 µg/ml.

O RFG foi estimado utilizando a equação abaixo:

RFG (ml.24h -1) = ( [CREA] urina x FU ) / [CREA] plasma

Sendo:

[CRE] urina : concentração de creatinina na urina (µg/ml)

[CRE] plasma: concentração de creatinina no plasma (µg/ml)

FU: fluxo urinário (ml.24h-1)

A quantificação das concentrações de sódio (Na+) e potássio (K+) nas

amostras de plasma e urina foi feita por fotometria de chama (CELM, FC180).

O fotômetro de chama mede a intensidade da radiação emitida pelos átomos

excitados dos metais-terrosos e a intensidade dessa emissão é proporcional a

concentração desses metais nas amostras. Previamente à leitura das

amostras, o fotômetro foi calibrado com as soluções padrões de sódio (140

mEq/l) e potássio (5 mEq/l). As amostras de plasma foram diluídas 1:200 para

a leitura de sódio e potássio. Já as amostras de urina foram diluídas 1:200 para

a leitura do sódio e 1:6000 para a leitura do potássio.

A medição das osmolalidades do plasma e urina foi feita utilizando o

osmômetro de ponto de congelamento (Microsmette, Advanced Instruments,

USA). As amostras de plasma foram diluídas 1:2 e as amostras de urina foram

diluídas 1:5. Previamente à leitura das amostras, o osmômetro foi calibrado

com soluções padrões cujas concentrações eram 100 mOsm/kg, 290 mOsm/kg

e 500 mOsm/kg.

Conhecendo-se os valores de RFG, FU, concentração de Na+ e K+ no

plasma e urina bem como a osmolalidade plasmática e urinária, calculou-se

outros parâmetros renais como mostrado a seguir:

� Fração de excreção de água: FE H2O (%) = FU /RFG x 100

� Fração de excreção de Na +: FENa+ (%) = Qex Na+/QFNa+ x 100

� Fração de excreção de K +: FEK+ (%) = QexK+/QFK+ x 100

� Clearance de água livre: C H2O (ml.24h -1) = FU - Cosm

� Clearance osmolar:

Cosm (ml.24h -1) = Osmolalidadeurina x FU / Osmolalidadeplasma

Sendo:

� Quantidade excretada de Na +: Qex Na+ = [Na+]urina x FU

� Quantidade excretada de K +: Qex K+ = [K+]urina x FU

� Quantidade filtrada de Na +: QFNa+ = [Na+]plasma x RFG

� Quantidade filtrada de K +: QFK+ = [k+]plasma x RFG

3.4.2 Protocolo II – Função renal de ratos treinado s na situação pós-exercício

O objetivo do protocolo II foi investigar o efeito do exercício agudo de

intensidade absoluta na função renal em ratos treinados (n = 15) e não-

treinados (n = 15). O exercício consistiu em 35 min de corrida na esteira a uma

velocidade de 21 m/min. Ou seja, ambos os grupos realizaram um exercício de

duração semelhante e intensidade diferente. A duração do exercício foi

estipulada após testar quanto tempo o grupo NT conseguiria correr na

velocidade estabelecida de 21 m/min. Esta correspondeu a uma intensidade de

65% Vmáx atingida no TEMP para o grupo NT e 55% Vmáx atingida no TEMP

para o grupo T. Ou seja, para o grupo NT correspondeu a um exercício de

intensidade moderada e para o T correspondeu a uma intensidade baixa.

Quarenta e oito horas após a realização do teste de esforço aplicado ao

final do treinamento, os grupos T e NT foram colocados, individualmente, em

gaiolas comuns (Fig. 7) e submetidos a duas situações experimentais (Fig. 8).

Na primeira situação (1º dia), os ratos T e NT permaneceram nas gaiolas em

repouso. Já na segunda situação (6º dia), previamente à entrada nas gaiolas,

ambos os grupos correram por 35 min a uma velocidade de 21m/min

(intensidade absoluta). Nas 2 situações experimentais, o volume de urina foi

medido a cada 30 min durante um período de 8 h. Ao final das 8 h, 700 µl de

sangue foram coletados por punção venosa da cauda para a medição da

função renal. O procedimento de coleta de sangue foi o mesmo citado no

protocolo I.

Ao término da 1ª e 2ª situações experimentais, os ratos foram retirados

das gaiolas e colocados em caixas de polipropileno. As situações

experimentais (1º e 6º dias) e exercício absoluto seguido de sacrifício (11º dia)

foram realizados com intervalo de quatro dias entre eles (Fig.8). O intervalo

consistiu em dias alternados de sessões de treinamento (T) e repouso (R),

como também executado em parte do protocolo I. Essas sessões de exercícios

serviram para a manutenção do treinamento do grupo T. Para o grupo T, a

sessão de exercício foi a mesma executada no treinamento prévio e, para o

grupo NT, consistiu em caminhar na esteira por 5min a 5m/min.

Figura 7: Gaiola comum: formada por um funil de vidro, suporte de madeira, proveta de 10 ml, tela de arame e gaiola. A tela de arame fica localizada entre o funil e a gaiola e sua função é reter as fezes produzidas pelos ratos durante o experimento. O funil de vidro desemboca na proveta onde a urina é coletada. O volume de urina foi medido em intervalos de 30 min durante 8h.

Figura 8: Seqüência experimental para a medição da função renal dos ratos treinados e não-treinados sob efeito do exercício. Sendo T = manutenção do treinamento e R = repouso.

Os ratos treinados (n = 10) e não-treinados (n = 10) foram sacrificados

por decapitação imediatamente após serem submetidos a um exercício de 35

min a 21 m/min, mesma sessão de exercício realizada na 2° situação

experimental. O restante dos ratos foi sacrificado no estado de repouso. Todos

os procedimentos de coleta de sangue, tecidos e órgãos pós-sacrifício foram os

mesmos realizados no protocolo I. As variáveis estudadas em repouso foram

as mesmas estudadas sob efeito do exercício. Portanto, os procedimentos de

dosagens descritos no protocolo I foram os mesmos para o protocolo II.

3.4.2.1 Proteínúria

A proteinúria foi medida na urina coletada ao final dos 480 min de

permanência dos ratos nas gaiolas, em repouso e pós-exercício. A dosagem da

proteinúria foi feita por reação colorimétrica usando-se o Kit da Labtest

Diagnóstica S.A. (Brasil). O complexo vermelho de pirogalol-molibdato de sódio

quando combinado com a proteína em meio ácido, forma um cromóforo de cor

azul, com o máximo de absorção em 600 nm. A quantificação da proteinúria foi

feita multiplicando-se as absorbâncias obtidas das amostras de urina pelo fator

de calibração, calculado a partir de uma curva padrão construída com

concentrações conhecidas de proteína. A curva padrão foi feita usando-se a

solução estoque de proteína do Kit cuja concentração era 50 mg/dl (Fig. 9).

Figura 9: Curva padrão concentrações crescentes de proteína versus absorbância a 600 nm (r=0,99).

3.5 Dosagens complementares (albumina sérica e horm ônios)

3.5.1 Albumina sérica

A concentração de albumina no soro dos ratos T e NT foi quantificada ao

final dos 480 min de permanência nas gaiolas, nas situações repouso e pós-

exercício.

A dosagem da albumina foi feita por reação colorimétrica usando-se o

Kit da Bioclin (Quibasa, Brasil). Em presença da albumina, o verde de

bromocresol forma um complexo corado, que exibe um espectro de absorção

diferente do corante no seu estado livre, permitindo assim, a dosagem da

albumina. O complexo formado foi lido em espectrofotômetro a um

comprimento de onda de 630 nm.

A quantificação da concentração de albumina no soro foi feita

multiplicando-se as absorbâncias obtidas das amostras de soro pelo fator de

calibração calculado a partir de uma curva padrão construída com

concentrações conhecidas da proteína. A curva padrão foi feita usando-se a

solução estoque de albumina do Kit cuja concentração era 3,8 g/dl (Fig. 10).

0.0 12.5 25.0 37.5 50.0 62.50.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Proteína (mg.dl -1)

Abs

orbâ

ncia

(600

nm

)

Figura 10: Curva padrão concentrações crescentes de albumina versus absorbância a 630 nm (r=0,99).

3.5.2 Peptídeo natriurético atrial (ANP)

A dosagem de ANP no plasma, átrios e urina (urodilatina) foi feita por

radioimunoensaio de duplo-anticorpo (RIE). O binding de ANP no rim,

especificamente, o ensaio de competição pela ligação com o receptor NPr-C e

NPr-A, foi realizado utilizando-se a técnica de autorradiografia.

Previamente à realização dos radioimunoensaios, fez-se a extração do

ANP no plasma e a homogeneização dos tecidos atriais coletados. O plasma

foi extraído usando-se as colunas Sep-Pak C18, que foram ativadas com 8 ml

de acetonitrila e lavadas com 8 ml de acetado de amônio a 0,2%, pH 4. Em

seguida, o plasma foi aplicado à coluna sendo, a mesma, lavada

posteriormente com 5 ml de acetato de amônio. O ANP adsorvido foi eluído

com 3 ml de acetronitrila 60% em acetato de amônio 0,2%. Após a evaporação

em Speed-Vac, as amostras foram reconstituídas com tampão (fosfato de sódio

0,1 M, NaCl 0,14 M, albumina bovina 0,1%, azida sódica 0,01%, triton X-100

0,1%, pH 7,4) e dosadas por RIE. Os átrios foram homogeneizados em 2 ml de

solução de ácido acético 0,1 M, contendo inibidores de proteases (EDTA 10-5

M, Pepstatina 0,5x10-5 M e PMSF 10-5 M). Após a centrifugação, alíquotas do

0.0 0.9 1.8 2.7 3.6 4.50.0

0.1

0.2

0.3

Albumina (g.dl -1)

Abs

orbâ

ncia

(630

nm

)

sobrenadante foram diluídas em tampão fosfato para a determinação do ANP

por RIE.

O RIE para dosagem de ANP foi baseado na técnica descrita por

Gutkowska et al. (1987). O ANP imunorreativo de rato, obtido após a iodação e

purificação do mesmo, foi determinado por RIE. O ANP extraído foi

reconstituído em 0,5 ml de tampão (fosfato de sódio 0,1 M, NaCl 0,14 M,

albumina bovina 0,1%, azida sódica 0,01%, triton X-100 0,1%, pH 7,4). O

homogenato de átrios foi diluído em tampão de ensaio (1:3000). As amostras

de urina foram usadas diretamente no ensaio. Todas as amostras (plasma,

átrios e urina) foram incubadas overnight com 100µl de anticorpo anti-ANP a

4°C. Adicionou-se 100 µl (8.000 cpm) de 125I-ANP e novamente as amostras

foram incubadas por mais 24 h. A separação do imunocomplexo foi feita por

precipitação com segundo anticorpo (soro de cabra anti gama-globulinade de

coelho). Após 2 h, à temperatura ambiente, adicionou-se 0,5 ml de

polietilenoglicol 6,25% em água. Os tubos foram centrifugados por 20 min, 4

°C, a 1.500 xg. Após aspiração do sobrenadante, a radioatividade do

precipitado foi determinada em contador gama (LKB).

O conteúdo de proteína foi determinado no homogenato do tecido atrial

utilizando-se o metódo de Bradford (1976).

O ensaio de competição pela ligação com o NPr-A e NPr-C foi feito em

cortes longitudinais de rins de ratos treinados e não-treinados. Os rins foram

cortados no criostato a -20 °C a uma espessura de 16 µm e, posteriormente,

foram colocados em lâminas de vidro gelatinizadas. Estas foram armazenadas

em freezer a -80 °C até o dia do ensaio. Dezesseis cortes de rins foram

necessários para cada rato. Inicialmente, os cortes passaram por uma lavagem

ácida de 10 min com acetado de sódio 0,04 M em NaCl 0,15 M, pH 5,0, no

gelo. Posteriormente, foram pré-incubados em Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 durante

15 min, a 25 °C e, logo após, incubados em Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, contendo

150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 40 µg/ml de bacitracina, 0,5% BSA e 125I-ANP

(20.000 cpm/100 µl). No processo de incubação, dos 8 cortes, cada um

recebeu uma concentração diferente e crescente de aANP (10-12 a 10-6 M). Nos

outros 8 cortes, cada um recebeu uma concentração também diferente e

crescente de cANP (10-12 a 10-6 M). As lâminas foram dispostas para

sensibilização das telas em cassetes de 48 h. Após esse período, as telas

sensibilizadas foram escaneadas pelo aparelho Phosphorlmager (Fugi, Bas-

1000) e as imagens digitalizadas foram analisadas utilizando o programa Image

Gauge 3.12. A medida da ligação de cada peptídeo aos seus receptores

específicos foi dada em pixels/mm2. O peptídeo aANP se liga ao receptores

NPr-A e NPr-C, contudo o peptídeo cANP se liga apenas ao receptor NPr-C.

Por diferença, sabe-se a quantidade de receptores NPr-A e NPr-C em cada

grupo experimental.

3.5.3 Vasopressina e aldosterona

As dosagens dos hormônios vasopressina e aldosterona foram feitas

pela Divisão Veterinária do Instituto Hermes Pardini. A técnica de

radioimunoensaio foi utilizada para a quantificação de ambos os hormônios.

3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste de normalidade Shapiro-Wilk foi aplicado para observar se as

variáveis estudadas possuíam distribuição normal. A análise Two-Way Anova

foi utilizada nas comparações entre os grupos ao longo do tempo e Post hoc foi

utilizado quando p ≤ 0,05. A análise Two-Way Anova com Medidas Repetidas

foi utilizada nas comparações entre repouso e exercício, ao longo do tempo, no

mesmo grupo. O teste t Student independente foi utilizado nas comparações

entre os grupos T e NT e o teste t pareado usado nas comparações dentro do

mesmo grupo antes e após o tratamento. O nível de significância considerado

foi p ≤ 0,05. Os dados estão expressos como média ± erro-padrão da média.

Nas variáveis que apresentaram distribuição não-normal, se aplicou testes não-

paramétricos.

4 RESULTADOS

4.1 Avaliação da eficácia do treinamento O tempo total de exercício no TEMP, aplicado ao final do treinamento, foi

maior no grupo T (34,0 ± 1,0 min) quando comparado com o grupo NT (24,0 ±

1,0 min) (Fig. 11A), mostrando que o treinamento foi efetivo para aumentar a

capacidade de corrida dos ratos. A intensidade relativa de corrida foi

equivalente durante todo o treinamento, mas a velocidade de corrida

determinada pelos TEMP diferiu no início (16,3 ± 0,5 m/min) e ao final da 4°

semana de treinamento (20,8 ± 0,7 m/min) (Fig. 11B). Ainda no TEMP pós-

treinamento, o grupo T correu uma distância 85% maior quando comparado ao

grupo NT (528 ± 44 vs 286 ± 33 m) (Fig. 11C).

Figura 11: Resultados dos TEMP aplicados ao longo do treinamento (n = 7 - 11). A, Tempo total de exercício no TEMP aplicado antes e após o treinamento; *p < 0,0001 vs Tantes e **p = 0,003 vs NTapós. B, Velocidades de corrida (65% da Vmáx) atingidas no TEMP no início e ao final da quarta semana de treinamento; *p < 0,001 vs Antes. C, Distância percorrida antes e após o treinamento; *p = 0,001 vs Tantes e **p = 0,0009 vs NTapós.

Antes 4°°°°semana0.0

10.0

20.0

30.0

*

B

Período do treinamento

Ve

loci

dade

de

cor

rida

cor

resp

onde

nte

a 6

5% V

máx

(m.m

in-1

)

NTantes NTapós Tantes Tapós

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

A**

Treinamento

*

T em

po t

otal

de

exer

cíci

o no

TE

MP

(min

)

NTantes NTapós Tantes Tapós

0

200

400

600

800

***

C

Treinamento

Dis

tânc

ia p

erco

rrid

a(m

)

A Figura 12 mostra as progressões significativas dos parâmetros medidos

nos TEMP aplicados ao longo do treinamento para o grupo T. Ao final do

treinamento, os ratos T apresentaram aumento de cerca de 54% no tempo total

de exercício (Fig.12A), 47% na velocidade máxima de corrida (Fig.12B) e

aumento de 111% na distância total percorrida no TEMP (Fig.12C)..

Figura 12: Progressão dos parâmetros medidos no TEMP aplicado ao longo do treinamento (n = 10). A, Tempo total de exercício no TEMP aplicado antes e na 4ª e 8ª semanas de treinamento. B, Velocidades máximas de corrida atingidas no TEMP antes e na 4ª e 8ª semanas de treinamento. C, Distância percorrida antes e na 4ª e 8ª semanas de treinamento. *p < 0,0001 vs Antes e **p < 0,0001 vs 4°semana.

A atividade da LDH sérica apresentou redução significativa no grupo T

ao final do treinamento, quando comparado ao grupo NT (Fig. 13). Previamente

ao início do treinamento, a atividade da LDH mostrou-se semelhante entre os

grupos (NT= 182,8 ± 29,4; T= 233,6 ± 37,3 U.litro -1 (p = 0,34). Quando se

compara a atividade enzimática da LDH pré e pós-treinamento dentro do

mesmo grupo, o grupo T mostrou uma redução significativa de 49% após o

treinamento, ao passo que o grupo NT não apresentou diferença na atividade

da LDH antes e pós-treinamento.

Antes 4°semana 8°semana0

15

30

45

*

***

A

Tem

po to

tal d

e ex

ercí

cio

(min

)

Antes 4°semana 8°semana0

10

20

30

40

50

****

B

Velo

cida

de m

áxim

a de

cor

rida

(m.m

in-1

)

Antes 4°semana 8°semana0

200

400

600

800

1000

*

***C

Dis

tânc

ia p

erco

rrid

a(m

)

Figura 13: Atividade enzimática da lactato desidrogenase sérica em ratos T e NT, em repouso, medida antes e após o treinamento (n = 5 -7). *p < 0,006 vs Tantes e **p < 0,02 vs NTapós.

A atividade enzimática da SDH, em tecido muscular, é outra ferramenta

utilizada para verificar a eficácia do treinamento. Assim, nesse estudo, houve a

tentativa de quantificar tal enzima em músculo esquelético de ratos treinados e

não-treinados, tanto em repouso quanto sob efeito do exercício submáximo.

Isto foi feito baseando-se na curva padrão que relacionou volumes crescentes

de fração mitocondrial, preparada a partir de músculo esquelético de ratos, com

a absorbância a 458 nm (Fig. 2).

A Fig. 14 mostra que não houve diferença significativa na atividade

enzimática da SDH, indicada por meio da absorbância do formazan, em tecido

muscular de ratos T e NT, em repouso. A atividade enzimática da SDH também

não se mostrou diferente entre os grupos T e NT quando ambos estavam sob

efeito do exercício (Fig. 14). No entanto, quando se compara a absorbância do

formazan entre repouso e exercício dentro do mesmo grupo, observa-se

diferença significativa somente no grupo T (Fig. 14).

4.2 Perfil geral dos ratos treinados em repouso (Protocolo I )

O treinamento físico pelo protocolo por nós utilizado não afetou

parâmetros como peso corporal, ingestão de água e de ração e produção de

urina e de fezes (Fig. 15). Com exceção do período de aclimatação (3 dias

NTantes NTapós Tantes Tapós

0

100

200

300

***

Treinamento

LDH

(U.li

tro

-1)

iniciais), a similaridade desses parâmetros nos grupos NT e T foi mantida

durante os demais dias de observação pós-treinamento físico.

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400* p=0,007 (vs Trepouso)

Abs

orbâ

ncia

do

form

azan

(45

8nm

)

Figura 14: Atividade da SDH em fração mitocondrial de homogenato de músculo esquelético de ratos T e NT, indicada por meio da absorbância do formazan, nas situações de repouso e pós-exercício (35min a 21m/min). Não houve diferença na absorbância do formazan entre os grupos, em repouso e pós-exercício. Comparação dentro de cada grupo: NTrepouso vs NTexercício (p=0,11); Trepouso ≠ Texercício (p=0,007).

Os ratos treinados, após as 8 semanas de treinamento, apresentaram

um aumento do volume plasmático comparado aos ratos NT (13,89 ± 0,83 ml

vs 17,87 ± 1,37 ml; p = 0,04) (Fig. 16). O aumento do volume plasmático pós-

treinamento não foi acompanhado por qualquer alteração na concentração de

hemoglobina (NT = 13,70 ± 0,53 mg.dl-1; T = 12,96 ± 0,42 mg.dl-1; p = 0,32) e

no hematócrito (NT = 49 ± 0%; T = 49 ± 1%; p = 0,60) após o treinamento

(Fig.17). Quando se compara pré e pós-treino dentro de cada grupo, apenas os

ratos NT tiveram um aumento nas concentrações de hematócrito (45 ± 1 vs 49

± 0 %; p = 0,007) e de hemoglobina (12,58 ± 0,44 vs 13,70 ± 0,53 mg.dl-1; p =

0,05) no pós-treino (Fig. 17). O treinamento físico de intensidade moderada não afetou o aspecto

morfológico dos rins (Fig. 18). Em ambos os grupos, observou-se uma

preservação da arquitetura tecidual, caracterizada pela presença de tecido

epitelial cúbico simples nos túbulos renais. As células do parênquima renal

apresentaram núcleos centrais e esféricos com nucléolo evidente.

Figura 15: Acompanhamento das variações diárias do peso corporal (A), ingestão de água (B), e de ração (C) e produção de urina (D) e de fezes (E) em ratos T e NT, em repouso, mantidos por 14 dias em gaiolas metabólicas individuais. *p < 0,05 vs NT; n = 10 ratos/grupo. Figura 16: Volume plasmático de ratos T e NT ao final das oito semanas de treinamento (n = 6 – 7 ratos/grupo). A, Volume plasmático total (ml), *p = 0,04 vs NT. B, Volume plasmático corrigido por peso (ml/100g), *p = 0,01 vs NT.

NT T0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

*

A

Vol

ume

plas

mát

ico

(ml)

NT T0.0

2.0

4.0

6.0

*B

Vol

ume

plas

mát

ico

(ml.1

00g

peso

-1)

1°°°° 2°°°° 3°°°° 5°°°° 6°°°° 8°°°° 9°°°° 11°°°° 12°°°° 14°°°°0.0

25

30

35

40

NTT

Aclimatação

Dias

Água

inge

rida

(ml.2

4h-1

)

B

1°°°° 2°°°° 3°°°° 5°°°° 6°°°° 8°°°° 9°°°° 11°°°° 12°°°° 14°°°°0.0

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

NTT

Aclimatação

D

Dias

Flux

o ur

inár

io(m

l.24h

-1)

1°°°° 2°°°° 3°°°° 5°°°° 6°°°° 8°°°° 9°°°° 11°°°° 12°°°° 14°°°°0.0

15

20

25

30

35

NTT

Aclimatação

* *

C

DiasR

ação

inge

rida

(g.2

4h-1

)

1°°°° 2°°°° 3°°°° 5°°°° 6°°°° 8°°°° 9°°°° 11°°°° 12°°°° 14°°°°-10

-5

0

5

10

* *

Aclimatação

A

TNT

Dias

∆∆ ∆∆ P

eso

corp

oral

(g)

1°°°° 2°°°° 3°°°° 5°°°° 6°°°° 8°°°° 9°°°° 11°°°° 12°°°° 14°°°°0

5

10

15

20

NTT

Aclimatação

**

Dias

Feze

s pr

oduz

idas

(g.2

4h-1

)

E

Figura 17: Hematócrito (A) e concentração de hemoglobina (B) em ratos T e NT, em repouso, antes e após o treinamento. A, *p = 0,0007 vs NTantes (n = 6). B, *p = 0,05 vs NTantes (n = 7).

.

Figura 18: Corte histológico de rins esquerdos de ratos NT (painel à esquerda) e T (painel à direita). Aumento, 60 vezes, Hematoxilina-Eosina.

4.3 Função renal nos ratos treinados em repouso (Protocolo I )

As concentrações plasmáticas e urinárias de sódio e potássio não se

diferiram entre os grupos NT e T, em repouso, durante 5 dias em que foram

mantidos em gaiolas metabólicas (Tab. 2).

Em repouso, os ratos treinados apresentaram um maior RFG (Fig. 19A)

e um fluxo urinário semelhante comparado aos ratos não-treinados. Como

esperado, o grupo T apresentou uma menor FEH2O (Fig. 19C).

NTantes NTapós Tantes Tapós

0

15

30

45

60

*A

Hem

atóc

rito

(%

)

NTantes NTapós Tantes Tapós

0

4

8

12

16

*B

Hem

oglo

bina

(g.

dl-1

)

Tabela 2: Concentrações plasmáticas e urinárias de sódio e potássio em ratos não- treinados (NT) e treinados (T), em repouso, medidas em 3 dias diferentes de permanência em gaiolas metabólicas. Sendo:[ ], concentração; ur, urina; pl, plasma.

Parâmetros renais 1º DIA 4º DIA 5º DIA

[Na+]ur (mEq/l) NT

T 57 ± 32 78 ± 13

99 ± 6 104 ± 9

106 ± 6 118 ± 4

[Na+]pl (mEq/l) NT T

134 ± 3 133 ± 1

129 ± 1 132 ± 3

130 ± 3 127 ± 2

[K+]ur (mEq/l) NT

T 179 ± 23 218 ± 22

197 ± 14 230 ± 11

233 ± 23 254 ± 11

[K+]pl (mEq/l) NT

T 4,3 ± 0,3 4,7 ± 0,3

4,0 ± 0,3 4,1 ± 0,1

8,0 ± 0,7 6,6 ± 0,4

Figura 19: Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre o RFG (A), o FU (B) e a FEH2O (C). Os ratos treinados (T) e não-treinados (NT) foram mantidos em gaiola metabólica por 5 dias, em situação de repouso (n =6). A, *p = 0,003 vs NT RFG. C, *p<0,001 vs NT. O fator dia não influenciou nos parâmetros avaliados.

0 10

500

1000

1500

2000

2500

4 5 6

NT

T

* *

A

`

Dias

Ritm

o de

filtr

ação

glo

mer

ular

(ml.2

4h-1

)

0 10

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

4 5 6

NT

T

B

´

´

Dias

Flu

xo u

rinár

io(m

l.24h

-1)

0 10.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4 5 6

NT

T

C

* **

Dias

´

Fra

ção

de e

xcre

ção

de á

gua

(%)

Em repouso, os ratos treinados apresentaram uma redução significativa

na FENa+ comparado ao grupo NT (Fig. 20A). Como esperado, a FRNa+ foi

maior no grupo T na situação de repouso (Fig. 20B).

Figura 20: Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre a excreção (A), a reabsorção (B) e o clearance (C) de sódio (n = 6). Os grupos T e NT foram mantidos em gaiola metabólica por 5 dias, em situação de repouso. *p < 0,05 vs NT e **p < 0,05 vs 1º dia. Em C, o treinamento não interferiu no clearance de sódio.

Com relação ao potássio, o comportamento foi similar ao sódio. Em

repouso, a FEK+ foi menor e, consequentemente, a FRK+ foi maior nos ratos

treinados comparativamente ao grupo controle (Fig. 21). O treinamento físico

de intensidade moderada não alterou a depuração plasmática de potássio (Fig.

21C).

0 10.0

4 5 6

98.5

99.0

99.5

100.0NT

T

****

B

´Dias

Fra

ção

de r

eabs

orçã

o de

Na

+

(%)

0 10.0

3.5

7.0

10.5

14.0

4 5 6

NT

T**

C

Dias

´

Cle

aran

ce d

eN

a+

( µµ µµE

q.24

h-1

)

0 10.0

0.4

0.8

1.2

1.6

4 5 6

NT

TA

**

´

**

Dias

Fraç

ão d

e ex

creç

ão d

e N

a+

(%)

Os valores da osmolalidade plasmática nos grupos T e NT foram baixos

(~240 mOsmKg-1) em todos os dias de gaiolas metabólicas. Utilizou-se plasma

diluído (1:10) para a medição da osmolalidade e acredita-se que isso possa ter

contribuído nas leituras baixas obtidas. No protocolo II utilizou-se plasma

diluído 1:2 e obteve-se leitura satisfatória da osmolalidade plasmática no grupo

controle. Portanto, no protocolo I, não serão apresentados os valores de

clearance osmolar e de água livre dos ratos T e NT.

Figura 21: Efeito do treinamento físico de intensidade moderada sobre a excreção (A), a reabsorção (B) e o clearance (C) de potássio (n = 6). Os grupos T e NT foram mantidos em gaiola metabólica por 5 dias, em situação de repouso. *p = 0,009 vs NT e **p < 0,001 vs 5º dia. Em C, o treinamento não interferiu no clearance de potássio.

0 10.0

4 5 6

25.0

35.0

45.0

55.0

65.0

75.0

NT

T

A

**

Dias´

Fra

ção

de e

xcre

ção

de K

+

(%)

0 10.0

4 5 6

25.0

35.0

45.0

55.0

65.0

75.0

NT

T

*

B*

´Dias

Fra

ção

de r

eabs

orçã

o de

K+

(%)

0 10

4 5 6

200

400

600

800

NT

T

C****

Dias

´

Cle

aran

ce d

e K

+

( µµ µµE

q.24

h-1

)

4.4 Função renal nos ratos treinados pós-exercício (Protocolo II )

Os grupos T e NT realizaram um exercício submáximo de intensidade

absoluta (35 min de corrida na esteira, a 21 m/min). Imediatamente após o

exercício, ambos os grupos foram colocados em gaiolas comuns, por um

período de 8 h (480 min). A produção de urina foi monitorada ao longo desse

tempo sendo, a função renal, investigada ao término do mesmo.

Em ambos os grupos, a sessão de exercício reduziu a produção de urina

(Fig. 22).

Figura 22: Efeito de uma sessão de exercício submáximo absoluto (35 min a 21 m/min) sobre o volume cumulativo de urina de ratos não-treinados (A, *p < 0,05 vs NTrepouso) e treinados (B, *p < 0,05 vs Trepouso) (n = 8 ratos/grupo).

No grupo NT, o exercício inibiu a produção de urina a partir dos 180 min,

ao passo que no grupo T, essa inibição já ocorreu aos 60 min (Fig. 22). No

grupo NT a inibição da produção de urina é mais tardia e a desinibição já

ocorre aos 420 minutos. Contrariamente, no grupo T, a inibição da produção de

urina ocorre logo aos 60 min pós-exercício e, mesmo ao final dos 480 min, a

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

NTrepouso

NTexercício

* * * * * **

A

Tempo (min)

Vol

ume

cum

ulat

ivo

de u

rina

(ml)

0 60 120 180 240 300 360 420 480 540-1.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

Trepouso

Texerccio

* * * * ** * *

** * *

**

*

B

Tempo (min)

Volu

me

cum

ulat

ivo

de u

rina

(ml)

inibição ainda permanece (Fig.22). Quando se compara o delta da área sob as

curvas (ASC) do volume cumulativo de urina produzido em repouso e pós-

exercício, o grupo T apresentou maior delta comparado ao grupo NT (Fig. 23),

evidenciando que a inibição da produção de urina foi realmente maior nesse

grupo.

Figura 23: Delta da área sob as curvas (ASC) de volume cumulativo de urina (VCU) produzido em repouso e exercício pelos grupos T e NT (n = 8 ratos/grupo). *p = 0,04 vs NT.

No grupo NT, a sessão de exercício fez aumentar significativamente o

RFG o que refletiu em uma FEH2O pós-exercício reduzida, já que o fluxo

urinário permaneceu inalterado (Fig. 24). Esta FEH2O pós-exercício reduzida

também foi observada no grupo T. No entanto, o RFG foi similar ao valor de

repouso e o fluxo urinário sofreu uma redução significativa após 8 h da

realização do exercício (Fig. 24).

Quando se correlaciona RFG e fluxo urinário pós-exercício, o grupo T

apresenta uma correlação menor (r = 0,25) comparado ao grupo NT (r = 0,59)

(Fig. 25, painel inferior). Já as correlações observadas em repouso foram

similares nos grupos NT e T que, por sua vez apresentou valor similar ao

observado no grupo NT pós-exercício (Fig. 25, painel superior).

NT T0

500

1000

1500

*

AS

C d

o V

CU

(del

ta: r

epou

so -

exe

rcíc

io)

Figura 24: Ritmo de filtração glomerular (A), fluxo urinário (B) e fração excreção de água (C) em ratos treinados (T) e não-treinados (NT), em repouso e sob efeito do exercício (35 min a 21 m/min) (n = 7 – 9 ratos/grupo). *p < 0,02 vs NTrepouso e **p < 0,05 vs Trepouso.

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0

200

400

600

800

**

A

Riti

mo

de fi

ltraç

ão g

lom

erul

ar(m

l.8h

-1)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

**

B

Flux

o ur

inár

io(m

l.8h

-1)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

C

Fra

çao

de e

xcre

ção

de á

gua

(%)

Figura 25: Correlação entre o RFG e o fluxo urinário dos ratos não-treinados e treinados em repouso (painéis A e B) e sob efeito do exercício (painéis C e D).

Nesse protocolo, no qual a função renal foi avaliada por um período de

apenas 8 h nenhuma diferença na fração de excreção e de reabsorção de

sódio e potássio foi observada, nem mesmo nos ratos do grupo T, em repouso

(Fig. 26 e 27). Como mostrado nas Figuras 20 e 21, as FENa+ e FEK+ analisadas

após um período mais longo, 24h, apresentaram-se reduzidas em relação ao

grupo NT. E, mesmo assim, nenhum efeito do exercício agudo foi detectado

(Fig. 26 e 27).

A sessão de exercício para o grupo NT provocou um aumento

significativo no clearance osmolar e tornou o clearance de água livre mais

negativo (Fig. 28). O simples treinamento aumentou o clearance osmolar e

tornou o clearance de água livre mais negativo no grupo T em repouso, mas o

exercício não foi capaz de afetar esses parâmetros.

Em ambos os grupos, a sessão de exercício aumentou

significativamente a osmolalidade urinária (Tab. 3). O peso do rim esquerdo

não se diferiu entre os grupos tanto em repouso quanto pós-exercício.

Não-treinado (Exercício)

0 200 400 600 800 10000.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0r=0,59C

RFG (ml.8h -1)

Flux

o ur

inár

io (m

l.8h

-1)

Treinado (Exercício)

0 200 400 600 800 10000.0

2.0

4.0

6.0

8.0r=0,25D

RFG (ml.8h -1)

Flux

o ur

inár

io (m

l.8h

-1)

Não-treinado (Repouso)

0 200 400 600 800 10000.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0r=0,60A

RFG (ml.8h -1)

Flux

o ur

inár

io (m

l.8h

-1)

Treinado (Repouso)

0 200 400 600 800 10000.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0r=0,49B

RFG (ml.8h -1)

Flux

o ur

inár

io (m

l.8h

-1)

Figura 26 : Fração de excreção (A) e reabsorção (B) de sódio em ratos treinados (T) e não-treinados (NT), em repouso e pós-exercício (35 min a 21 m/min) (n = 7 – 9 ratos/grupo). Não houve diferença dentro de cada grupo e nem entre os grupos.

Figura 27 : Fração de excreção (A) e reabsorção (B) de potássio em ratos treinados (T) e não-treinados (NT), em repouso e pós-exercício (35 min a 21 m/min) (n = 7 - 9 ratos/grupo). Não houve diferença dentro de cada grupo e nem entre os grupos.

Figura 28: Clearance osmolar (A) e de água livre (B) em ratos treinados (T) e não-treinados (NT), em repouso e pós-exercício (35 min a 21 m/min) (n = 7 – 9 ratos/grupo). *p = 0,01 vs NTrepouso e **p < 0,04 vs NTrepouso.

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5A

Fraç

ão d

e ex

creç

ão d

e N

a+ (

%)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0.0

99.5

99.6

99.7

99.8

99.9

100.0B

Fra

ção

de r

eabs

orçã

o de

Na

+(%

)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0

10

20

30

40A

Fra

ção

de e

xcre

ção

de K

+(%

)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0

70

85

100B

Fra

ção

de r

eabs

orçã

o de

K+(%

)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

-20

-15

-10

-5

0

***

BCle

aran

ce d

e H

2O li

vre

(ml.8

h-1

)

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0

5

10

15

20

***A

Cle

aran

ce o

smol

ar(m

l.8h

-1)

Tabela 3: Parâmetros renais pós-exercício dos ratos treinados e não-treinados medidos após 8 horas de permanência em gaiolas comuns. Sendo: Osm., osmolalidade.

Parâmetro medido Não-treinado (NT) Treinado (T)

Repouso Exercício Repouso Exercício

Rim esquerdo (g.100g-1 peso) 0,30 ± 0,01 0,31 ± 0,02 0,31 ± 0,01 0,37 ± 0,01

[Na+] plasma (mEq.L-1) 140 ± 2 140 ± 1 144 ± 1 139 ± 1

Conteúdo [Na+] plasma (mg) 44,7 ± 06 -- 59,2 ± 0,4# --

[K+] plasma, (mEq.L-1) 5,2 ± 0,1 5,0 ± 0,3 4,9 ± 0,1 4,9 ± 0,2

Conteúdo [K+] plasma (mg) 2,82 ± 0,05 -- 3,42 ± 0,07# --

[Na+] urina, (mEq.L-1) 34 ± 9 72 ± 14 54 ± 6 76 ± 12

[K+] urina, (mEq.L-1) 96 ± 12 201 ± 34 114 ± 12 193 ± 12

Osm. Plasmática, (mOsm.Kg-1) 283 ± 1 272 ± 1 284 ± 1 277 ± 2

Osm. Urinária, (mOsm.Kg-1) 779 ± 67 1324 ± 153* 933 ± 72 1237 ± 86**

*p <0,05 vs NTrepouso; **p <0,05 vs Trepouso; # p<0,0001 vs NTrepouso

A excreção urinária de proteína bem como a concentração plasmática de

albumina não foram afetadas pelo exercício agudo (Tab. 4). Em repouso,

ambos os parâmetros apresentaram semelhanças entre os grupos. No entanto,

a quantidade total de albumina no soro estava significativamente aumentada no

grupo T (0,70 ± 0,02 g vs 0,53 ± 0,01 g; p<0,0001), em repouso.

Tabela 4: Albumina no soro e proteinúria em ratos não-treinados e treinados em repouso e pós-exercício.

Parâmetro medido Não-treinado (NT) Treinado (T)

Repouso Exercício Repouso Exercício

[Albumina] soro (g.dl-1) 3,83 ± 0,06 4,09 ± 0,06 3,87 ± 0,10 4,18 ± 0,05

[Proteína] urina, (mg.dl-1) 45,70 ± 3,82 59,60 ± 8,63 46,37 ± 3,23 60,88 ± 3,24

Excreção urinária de proteína, (mg.8h-1)

1,65 ± 0,26 1,94 ± 0,16 2,24 ± 0,24 2,11 ± 0,16

4.5 Perfil hormonal nos ratos treinados em repouso e pós-exercício (Protocolo II )

Em repouso, a concentração plasmática do ADH se mostrou aumentada

nos ratos T comparado aos NT (22,3±1,7 vs 17,5 ± 0,9 pg.ml-1; p=0,05), mas

não houve diferença na concentração plasmática de aldosterona (T=18,1 ± 6,1

ng.dl-1 vs NT=15,5 ± 3,4 ng.dl-1; p=0,76). O grupo T, quando sob efeito do

exercício, apresentou um aumento na concentração plasmática de

vasopressina (T = 31,2 ± 3,9 vs NT = 18,7 ± 1,8 pg.ml-1; p=0,01) e uma redução

na concentração plasmática de aldosterona (T=46,73 ± 2,64 vs NT=75,10 ±

10,81; p<0,05) (Fig. 29).

Figura 29: Concentrações plasmáticas de vasopresina (A) e aldosterona (B) em ratos treinados (T) e não-treinados (NT), em repouso e pós-exercício (35 min a 21 m/min). Em A (n = 4 – 5): *p < 0,05 vs NTexercício e **p <0,05 vs Trepouso; # p=0,05 vs NTrepouso; B (n = 3 – 6), #p < 0,05 vs NTrepouso, *p < 0,05 vs Trepouso e **p <0,05 vs NTexercício.

Quando se compara as respostas hormonais dentro do mesmo grupo,

pôde-se observar que o exercício aumentou a concentração plasmática de

vasopressina para o grupo T e que esta resposta não foi observada para o

grupo NT (Fig. 29A). Já a aldosterona plasmática foi aumentada pelo exercício

tanto nos ratos NT, como nos ratos T (Fig. 29B). No entanto, o aumento de

aldosterona pós-exercício, no grupo T, foi significativamente menor do que no

grupo NT.

Com relação ao ANP, a Fig. 30 ilustra um experimento de ligação do

mesmo em cortes longitudinais de rim direito de rato NT (painel à esquerda) e

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0

10

20

30

40

***A

Vas

opre

ssin

a pl

asm

átic

a(p

g.m

l-1) #

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0

30

60

90 #

***

BA

ldos

tero

na p

lasm

átic

a(n

g.dl

-1)

de um rato T (painel à direita). Pode-se observar que não houve diferença

detectável de ligação do ANP entre os rins (NT e T).

Figura 30: Ensaio típico de binding de ANP em cortes longitudinais de rins de ratos não-treinados (NT, painel à esquerda)) e treinados (T, painel à direita) em repouso. O ensaio de competição foi feito pelo deslocamento do 125I-ANP com concentrações crescentes de ANP não marcado (10-12 a 10-6 M). Não houve diferença, em pixels/mm2, entre os rins de ratos NT e T.

A síntese tecidual de ANP nos átrios direito (T = 326 ± 15 vs NT = 324 ±

50 ng.mg-1 proteína; p = 0,96) e esquerdo (T = 300 ± 21 vs NT = 283 ± 65

ng.mg-1 proteína; p = 0,84) bem como a sua concentração plasmática não se

diferirem entre os grupos quando em repouso ((T = 1,14 ± 0,22 vs NT = 1,56 ±

0,27 ng.ml-1) (Fig. 31). No entanto, contrariamente ao observado para a

vasopressina e aldosterona, o exercício reduziu o ANP plasmático sendo, esta

redução, observada apenas no grupo NT (de 1,56 ± 0,27 para 0,44 ± 0,04

ng.ml-1; p=0,01; Fig.31).

Figura 31: Concentração plasmática de ANP em ratos treinados (T) e não-treinados (NT), em repouso e sob efeito do exercício (35 min a 21 m/min). #p < 0,05 vs NTrepouso, *p < 0,05 vs NTexercício (n = 3 – 6).

A excreção urinária de urodilatina foi semelhante nos grupos NT (92,4 ±

13,2 pg.8h-1) e T (119,6 ± 13,4 pg.8h-1) em repouso e o exercício não foi capaz

de afetar tal excreção (T = 112,5 ± 6,6 pg.8h-1 e NT = 93,1 ± 9,3 pg.8h-1).

NTrepouso NTexercício Trepouso Texercício

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

#

*A

NP

pla

smát

ico

(ng.

ml-1

)

5 DISCUSSÃO

5.1 Avaliação do treinamento

O treinamento físico utilizado no presente estudo se mostrou eficiente já

que houve uma melhora significativa, nos ratos treinados, em todos os

parâmetros medidos no TEMP aplicado ao final das oito semanas de

treinamento. A velocidade de corrida na qual os ratos treinaram dependeu da

Vmáx atingida no TEMP. Como este parâmetro mostrou uma melhora

significativa ao final da 4ª semana para o grupo T, se fez necessário a correção

da velocidade de corrida. Sem este ajuste, os ratos correriam em uma

intensidade de exercício mais baixa, podendo afetar as respostas adaptativas a

serem adquiridas com o exercício crônico. A correção da velocidade de corrida

foi uma adaptação feita ao protocolo de treinamento descrito por Priviero et al.,

2004 e utilizado no presente estudo.

Outras ferramentas utilizadas para verificar a eficiência e a sobrecarga

do treinamento foram as medições das atividades da SDH no músculo e da

LDH no soro, respectivamente. A determinação da atividade da LDH sérica nos

ratos treinados teve por objetivo assegurar que a função renal fosse medida

sem que os ratos apresentassem quaisquer danos celulares em decorrência

dos exercícios (treinamento e teste de esforço). Níveis elevados de LDH na

circulação sanguínea durante e após o exercício estão associados a rupturas

celulares induzidas, principalmente, por exercícios intensos com características

excêntricas (Dieli-Conwright et al., 2009; Brancaccio et al., 2006; Kobayashi e

Takeuchi, 2005; Rumley et al., 1985 ). Como as corridas de longa duração têm

um componente excêntrico predominante, a enzima LDH pode aumentar

consideravelmente no soro (França et al., 2006). Dependendo das condições

em que o exercício for realizado, como a intensidade e duração do mesmo, a

atividade da LDH pode permanecer alterada por horas ou até mesmo semanas

(duas) após a realização do exercício (Brancaccio et al., 2008; Kobayashi e

Takeuchi, 2005). A enzima LDH encontra-se no citoplasma das células

musculares e, na circulação sanguínea, encontra-se em baixas quantidades,

salvo quando ocorre ruptura celular e extravasamento da LDH para a

circulação (Brancaccio et al., 2006; Lott e Stang, 1980). Como esperado, o

grupo NT não apresentou qualquer alteração na atividade da LDH pré e pós-

treino. O mesmo comportamento era esperado no grupo T, no entanto, houve

uma redução significativa na atividade da LDH pós-treino. Este resultado

mostra pelo menos que a função renal foi medida em ratos T com integridade

muscular, sem danos provocados por sessões prévias de exercício. Essa

redução observada no grupo T talvez possa estar associada ao aumento do

volume plasmático, o que diluiria a LDH o soro. No entanto, a redução da

enzima no grupo T pós-treino foi de 49%, ao passo que o aumento do volume

plasmático foi de 29%. Dubouchaud et al. (2000) relataram um aumento das

isoenzimas LDH1-4 (lactato-piruvato) e uma redução da LDH5 (piruvato-

lactato) no músculo pelo treinamento aeróbio sugerindo que o músculo adquiriu

maior capacidade oxidativa com o treinamento. No entanto, não se sabe se a

LDH no soro é influenciada pelo treinamento aeróbio, em condições de

repouso.

Não houve diferença na atividade da SDH entre os grupos T e NT tanto

em repouso, quanto sob efeito do exercício, embora se esperasse encontrar

um aumento na atividade da SDH nos músculos dos ratos T ao final do

treinamento. Embora Criswell et al. (1993) tenham verificado que 12 semanas

de treinamento aeróbio de intensidade moderada foram suficientes para

aumentar a atividade da SDH nos músculos sóleo e gastrocnêmio de ratos,

Terblanche et al. (2001) relataram que o treinamento aeróbio intenso de 6

semanas não alterou a atividade da SDH de repouso medida no músculo

gastrocnêmio de rato. Já o estudo de Silva et al. (2009) mostrou que 8

semanas de treinamento aeróbio de intensidade moderada aumentou a

atividade da SDH em quadríceps de camundongos, em repouso. Percebe-se

que a resposta da SDH frente ao treinamento aeróbio se difere entre os

estudos, uma vez que há diferenças no volume e intensidade do treinamento e

nos grupos musculares onde a medição da atividade da SDH foi realizada.

Talvez a combinação do volume-intensidade do treinamento e músculos

selecionados para a medição (sóleo e gastrocnêmio) não tenha sido suficiente

para aumentar a atividade da SDH nos ratos T no presente estudo. Os

músculos da pata do rato exibem perfis metabólicos diferentes dependendo da

predominância das fibras musculares tipo I ou II (Mccullagh et al., 1996;

Laughlin e Armstrong, 1983). Pode-se esperar que a atividade do complexo

enzimático oxidativo da SDH apresente diferenças entre os músculos da pata e

uma maior atividade é esperada em músculos com predomínio de fibras tipo I,

como o músculo sóleo. Como o método empregado para a medição da SDH,

neste estudo, exigia uma maior quantidade de músculo para a detecção da

enzima, o uso do sóleo apenas era insuficiente. Então, adicionou-se ao último,

o gastrocnêmio que é um músculo com perfil mais glicolítico (fibras tipo II) do

que oxidativo (fibras tipo I). No entanto, Takekura e Yoshioka (1990) mostraram

que o treinamento aeróbio de 16 semanas aumentou a atividade de enzimas

oxidativas, como a SDH, tanto em fibras tipo I, quanto em tipo II. O treinamento

aeróbio de 8 semanas talvez seja insuficiente para produzir um aumento

detectável na atividade da SDH em músculos oxidativos-glicolíticos de ratos.

Isto porque, em estudos nos quais foram usados volumes maiores de

treinamento (12 e 16 semanas), foi observado um aumento da SDH em

músculos com o mesmo perfil dos utilizados no presente estudo (Criswell et

al.,1993; Takekura & Yoshioka,1990).

O mesmo exercício executado por ambos os grupos levou a um

aumento na atividade da SDH nos ratos T, o mesmo não ocorrendo para os

ratos NT. Mesmo sob estímulo de um exercício de menor intensidade, o grupo

T apresentou uma maior atividade da SDH, mostrado pelo aumento da

absorbância do formazan, resposta esta não obtida no grupo NT após exercício

de maior intensidade. Terblanche et al. (2001) e Lawler et al. (1993) verificaram

que o exercício agudo não altera a atividade da SDH em ratos sedentários.

5.2 Função renal de ratos treinados em repouso

O treinamento físico de intensidade moderada induziu adaptações tanto

no glomérulo, quanto no túbulo renal. Os resultados obtidos em gaiolas

metabólicas onde se mediu diariamente a função renal de repouso em ratos T

mostraram um aumento do RFG e da reabsorção de água e dos eletrólitos

sódio e potássio, ambos importantes na manutenção do equilíbrio hídrico-

eletrolítico do organismo.

O aumento do RFG nos ratos T não foi acompanhado por um aumento

no FU, o que levou a uma menor FEH2O em repouso. O FSR não foi medido no

presente estudo e não há estudos recentes sobre o efeito crônico do exercício

aeróbio sobre o mesmo. Em 1984, Armostrong e Laughlin verificaram que o

FSR permanecia inalterado em ratos após 13 semanas de treinamento aeróbio

(30 m/min), em esteira. Em estudos recentes, o foco principal tem sido a

investigação dos fatores envolvidos na vasoconstrição renal induzida pelo

exercício agudo (Maeda et al., 1998; 2004; 2005).

O aumento do RFG pode ser associado, em parte, à elevação da

vasopressina plasmática observada no grupo T em repouso. Bouby et al.

(1996) observaram um aumento no RFG em ratos normais e acordados após

administração crônica de um análogo da vasopressina (1-desamino 8-D

vasopressina). Os autores sugeriram que o efeito da vasopressina sobre o

RFG se daria pela sua ação antidiurética e não por sua ação vasoconstritora

nos rins. O aumento da vasopressina induziria um aumento da reciclagem

intra-renal da uréia que, por sua vez, reduziria a concentração de NaCl na

mácula densa do aparelho justaglomerular. Esta menor concentração de NaCl,

levaria a um aumento do RFG pelo mecanismo de feedback túbulo-glomerular.

Neste estudo, observou-se que o exercício inibiu a diurese em ambos os

grupos e esta conservação de água corporal está associada à vasopressina.

Portanto, espera-se que sessões repetidas de exercício induzam liberações

crônicas de vasopressina e esta, por sua vez, também possa estar relacionada

ao aumento do RFG, como observado por Bouby et al. (1996) e também

proposto por Bankir et al. (1993).

O aumento do RFG de repouso induzido pelo treinamento físico não

pode ser explicado apenas pela vasopressina. No entanto, pouco se sabe a

respeito do efeito do treinamento aeróbio sobre os rins. As respostas já

estudadas estão relacionadas ao efeito do treinamento sobre a atividade

simpática renal e a reatividade vascular renal. Assim, Negrão et al. (1993)

verificaram que o treinamento aeróbio de 13 semanas reduziu a atividade

simpática renal de repouso em ratos normotensos. Adicionalmente, foi

observado que o treinamento aeróbio levou a um aumento da vasodilatação

renal dependente e independente do endotélio (De Moraes et al., 2004) e uma

“regulação para baixo” (downregulation) da endotelina renal (Maeda et al.,

1998). Esses fatores citados poderiam influenciar mais na resposta do RFG em

situação de exercício, onde se observa maior estimulação simpática renal e

maior resposta vascular frente à alteração do fluxo sanguíneo.

O grupo T apresentou um aumento de 29% no volume plasmático após

o treinamento. Sabe-se que as respostas renais à expansão de volume incluem

aumento do RFG, diurese e natriurese (Randolph et al., 1998; Kaufman, 1990).

Contrariamente, o aumento do volume plasmático observado neste estudo foi

acompanhado por menor FENa+ e FEH2O, apesar do RFG se mostrar

aumentado no grupo T. O aumento do volume plasmático induzido pelo

treinamento físico não foi acompanhado por qualquer alteração nos valores de

hematócrito e hemoglobina.

A hipervolemia induzida pelo treinamento aeróbio geralmente é

associada a um aumento no conteúdo de albumina no plasma (Bexfield et al.,

2009; Nagashima et al., 2000; Kargotich et al., 1998; Gillen et. al.,1994;

Convertino, 1991). Neste estudo a concentração de albumina sérica não se

mostrou diferente entre os grupos após o treinamento. No entanto, quando se

analisa o conteúdo total de albumina no soro, o grupo T apresentou um

aumento comparado ao grupo NT. Consequentemente, espera-se uma maior

retenção de água no espaço vascular do grupo T devido ao aumento de

proteína circulante, já que 1 g de proteína promove a contenção de 14-15 ml

H2O (Scatchard et al.,1944; Yang et al., 1998). Então, em nosso estudo, o

aumento, de albumina no soro, de 0,17g (de 0,53 para 0,70 g) no grupo T

promoveria um aumento no volume plasmático de 2,38 - 2,55 ml. Isto

corresponde a 60 - 65% do volume real de aumento (4 ml) observado no

volume plasmático (de 13,8 ± 0,9 ml no NT para 17,9 ± 1,5 ml no T). Fatores

como síntese hepática aumentada de albumina, decréscimo na degradação de

albumina e a redistribuição da albumina do espaço intersticial para o espaço

vascular podem contribuir para o aumento no conteúdo de albumina sérica

(Nagashima et al., 2000; Yang et al., 1998). No entanto, não se sabe como o

treinamento aeróbio interfere nesses fatores. Recentemente, observou-se um

aumento na expressão do mRNA para albumina hepática em ratos submetidos

a 12 dias de treinamento aeróbio moderado e intenso (Bexfield et al., 2009). Ou

seja, a síntese hepática de albumina provavelmente está relacionada com o

aumento no conteúdo de albumina sérica observado com o treinamento.

As concentrações de sódio no plasma bem como a osmolalidade

plasmática permaneceram constantes entre os grupos, apesar do grupo T estar

volume expandido. Semelhantemente à albumina, o conteúdo de sódio no

plasma foi maior no grupo T. Portanto, o treinamento físico induziu um aumento

de 32% no conteúdo de sódio no plasma. Estudos têm atribuído um papel

importante aos hormônios vasopressina e aldosterona na expansão do volume

plasmático induzido pelo treinamento aeróbio devido à ação desses hormônios

nos túbulos distais e ductos coletores onde promovem maior reabsorção de

sódio e água. Porém, não há relatos a cerca de medidas efetivas das frações

de excreção de eletrólitos e água (Zavorsky, 2000; Shoemaker et al., 1998).

Neste estudo, foi verificado uma menor FENa+ e de FEH2O nos ratos

treinados, em repouso. A redução da FENa+ ocorreu devido ao aumento

significativo da carga filtrada de sódio no grupo T, sem alterar a carga

excretada do mesmo, acarretando uma maior reabsorção de sódio no grupo T.

A aldosterona plasmática não explica esta resposta já que esta variável não

apresentou diferença entre os grupos quando em repouso (Fig. 28). Ressalta-

se que a ação da aldosterona está mais direcionada ao túbulo distal e ao ducto

coletor, locais onde percentualmente se têm menor reabsorção de sódio

comparado ao total reabsorvido no túbulo proximal (67% do sódio filtrado) e no

segmento espesso ascendente da alça de Henle (25%). Isso sugere que o

efeito do treinamento físico na reabsorção renal aumentada de sódio possa

ocorrer no túbulo proximal e/ou no segmento espesso ascendente.

Alguns fatores podem ter contribuído para o aumento na FRNa+ nos ratos

T. Se o aumento do RFG observado no presente estudo fosse acompanhado

por um FSR constante, se esperaria um aumento na concentração de proteínas

nos capilares peritubulares, aumentando a pressão oncótica nesse local. Como

resultado, ocorreria aumento da reabsorção de sódio e água no túbulo

proximal. A reabsorção de sódio tanto no túbulo proximal, quanto no segmento

espesso ascendente da alça de Henle está associada direta e indiretamente à

bomba Na+, K+-ATPase localizada na membrana basolateral das células. No

entanto, até o presente, não se sabe o efeito do treinamento aeróbio sobre

essa enzima nos diferentes segmentos do néfron.

Em repouso, os ratos T apresentaram uma redução na FEH2O

acompanhado por um aumento no CH2O livre negativo. Esses resultados

sugerem que a vasopressina contribuiu para o aumento da reabsorção renal de

água induzida pelo treinamento físico. A vasopressina se liga ao receptor V2 na

membrana basolateral das células principais do ducto coletor aumentando a

reabsorção de água pelo deslocamento de canais de água (aquaporina 2) para

a membrana apical das células (Bankir, 2001). Ainda é desconhecido o efeito

do treinamento aeróbio sobre os sítios de ação da vasopressina nos rins.

Os resultados do presente estudo indicam reabsorção tubular de sódio

não mediada pela aldosterona e reabsorção tubular de água via vasopressina

nos ratos T em repouso, ou seja, a reabsorção de sódio parece ocorrer nos

segmentos iniciais do néfron, ao passo que na reabsorção de água há

participação dos segmentos distais. Não se pode descartar que o treinamento

tenha induzido reabsorção de sódio, via ativação da bomba Na+, K+-ATPase,

não acompanhada por reabsorção de água, como ocorre no segmento espesso

ascendente da alça de Henle. No entanto, como citado anteriormente, ainda

não é conhecido o efeito do treinamento aeróbio na atividade e/ou densidade

da bomba Na+, K+-ATPase renal.

As alterações renais de FENa+ e FEH2O observadas nos ratos T, na

situação de repouso, não foram acompanhadas por alterações significativas no

ANP plasmático e nem na urodilatina. Como os ratos T se encontram volume-

expandidos poderia se esperar uma maior secreção atrial de ANP para o

plasma e também uma maior excreção urinária de urodilatina, no sentido de

corrigir o aumento da volemia. No entanto, os níveis destes dois peptídeos

foram similares nos grupos T e NT em repouso. Importante ressaltar que,

nesse estudo, pela primeira vez, foi investigado o efeito do treinamento aeróbio

sobre a urodilatina urinária. O treinamento físico também não afetou, quando

em repouso, o conteúdo de ANP nos átrios direito e esquerdo e nem o binding

renal de ANP, observações semelhantes àquelas obtidas para o ANP

plasmático. Alguns estudos têm relatado que a expansão de volume induzida

pelo treinamento aeróbio é acompanhada por um reajuste na sensibilidade dos

reflexos reguladores de volume, tornando-os menos sensíveis (Randolph et al.,

1998; Gillen et al., 1994; Kaufman, 1990). Isto poderia, talvez, ser a razão da

expansão de volume não ter sido acompanhada por um aumento no ANP

plasmático.

Em repouso, a FEK+ foi menor nos ratos T. Como a carga filtrada de

potássio foi maior nesses ratos e não houve diferença na carga excretada,

houve um aumento na FRK+. O efeito do treinamento aeróbio sobre a FEK+

ainda era desconhecido até o presente estudo. Enquanto o eletrólito sódio é

apenas reabsorvido nos túbulos renais, o potássio é tanto reabsorvido quanto

secretado, sendo que esta secreção ocorre nas células principais do túbulo

distal final e ducto coletor, via bomba Na+,K+-ATPase. Em condições

fisiológicas normais, espera-se que o sódio seja reabsorvido enquanto o

potássio seja secretado nos túbulos renais. Curiosamente, o treinamento físico

moderado levou a uma maior FRK+, similar ao observado para o sódio. Tanto a

concentração plasmática de potássio, quanto a aldosterona plasmática,

principais reguladores da secreção renal de potássio, foram semelhantes nos

grupos T e NT. A possível explicação para a reabsorção renal aumentada de

potássio seria a manutenção da concentração plasmática do mesmo, já que os

ratos T estavam volume-expandidos. Como esperado, houve um aumento de

21% no conteúdo de potássio no plasma do grupo T. Resta saber como o

treinamento aeróbio afeta o transporte tubular de potássio viabilizando uma

maior fração de reabsorção do mesmo. A reabsorção de potássio se dá

predominantemente por transporte paracelular e está associada indiretamente

ao transporte de soluto e água em diferentes segmentos do néfron. Especula-

se que seja no túbulo proximal e/ou no segmento espesso ascendente da alça

Henle, locais onde ocorre maior reabsorção renal de potássio (67% e 25%,

respectivamente). Portanto, o treinamento pode ter aumentado a reabsorção de

potássio via arraste de solvente no túbulo proximal e/ou pela diferença de

voltagem gerada pela reabsorção de sódio no segmento espesso ascendente.

O treinamento físico não alterou os clearances de sódio e potássio em

repouso já que as concentrações plasmáticas e urinárias de ambos os

eletrólitos bem como o fluxo urinário não foram diferentes entre os grupos.

5.3 Função renal de ratos treinados pós-exercício

Para investigar o efeito do exercício sobre a função renal de ratos T e

NT, amostras de sangue e urina foram coletadas durante de 8 h após a

realização da sessão de exercício. Este procedimento se fez necessário pela

dificuldade de se coletar a urina durante o exercício. Avaliar a função renal pós-

exercício teve por objetivo investigar o efeito, sobre os rins, do exercício em

ratos sob efeito ou não do treinamento.

O clearance de creatinina foi o método adotado para a quantificação da

RFG pós-exercício. A constância na formação e excreção de creatinina faz dela

um marcador do RFG comumente usado nos últimos 40 anos, em virtude de

sua estreita relação com o clearance de inulina e da sua relativa independência

de fatores como dieta, grau de hidratação e metabolismo protéico (Gualano et

al., 2008; Fleck, 1999; Poortmans e Vanderstraeten, 1994). Os valores de

creatinina no plasma e urina apresentam variações circadianas e, devido a

isso, a função renal pós-exercício e em repouso foi medida em dias diferentes,

mas sempre no mesmo horário do dia (Pasternack & Kuhlback, 1971). O

clearance de creatinina também tem sido utilizado, em outros estudos, para a

medição de função renal durante o exercício agudo (Poortmans e Ouchinsky,

2006; Banfi et al., 2008; Mallié et al., 2002).

No presente estudo, o RFG pós-exercício não foi diferente entre os ratos

T e NT. Como já relatado anteriormente, o treinamento físico de intensidade

moderada aumentou o RFG de repouso. Quando se compara o RFG pós-

exercício dentro de cada grupo, o exercício absoluto aumentou o RFG do grupo

NT, o mesmo não ocorrendo para o grupo T. Durante o exercício espera-se

uma redução do fluxo sanguíneo para os rins e, paralelamente, uma redução

do RFG. O exercício elevou o RFG nos ratos NT provavelmente porque o

mesmo foi quantificado 8 h após o exercício. Caso a medição ocorresse

durante o exercício, muito provavelmente, seria observada uma redução do

mesmo, como já verificado em outros estudos (Zambraski, 1996; Freund et al.,

1991; Tidgren et al., 1991; Musch et al., 1987). Pode ter ocorrido um aumento

compensatório do RPG após o exercício devido à vasoconstrição renal sofrida

pelos ratos NT durante o exercício absoluto, que foi mais intenso

comparativamente ao realizado pelo grupo T. Este não apresentou o mesmo

aumento do RFG após o exercício como obtido pelo grupo NT. Como a sessão

de exercício representou um menor esforço para o grupo T, provavelmente

induziu uma menor vasoconstrição renal a ser compensada após o exercício.

Além disso, o RFG já se encontrava aumentado nos ratos T em repouso. Isto

pode estar associado a uma menor redução do FSR durante o exercício

conforme observado em ratos e coelhos treinados (Di Carlo e Bishop, 1990;

Armstrong e Laughlin, 1984). Esta resposta é atribuída a uma menor atividade

simpática renal em uma mesma intensidade absoluta de exercício.

Quando se compara o comportamento do FU imediatamente após o

exercício, ao longo de 480 min, o grupo T mostrou uma inibição maior da

diurese. Portanto, os ratos treinados têm maior capacidade de retenção de

volume mesmo realizando um exercício de intensidade menor. Aliado a isto,

está o fator tempo. A diurese, nos ratos T, foi inibida mais rapidamente durante

o exercício e a inibição foi mantida por mais tempo. Ao final dos 480 min de

permanência nas gaiolas, o FU do grupo NT já se mostrava semelhante ao

valor de repouso, ao passo que o FU do grupo T ainda se mostrava reduzido.

Quando se correlaciona RFG e FU durante o exercício, o coeficiente de

correlação torna-se menor para o grupo T. Isto provavelmente está relacionado

com a maior capacidade dos ratos T em conservar volume durante o exercício.

Ou seja, considerando um mesmo RFG durante o exercício, o grupo T produz

um menor volume de urina comparado ao grupo NT.

A FEH2O pós-exercício não apresentou diferença entre os grupos já que

o RFG e o FU mostraram-se também semelhantes. Comparando-se dentro de

cada grupo, o exercício absoluto promoveu uma redução significativa na FEH2O

e a intensidade desta redução foi proporcional em ambos os grupos (40-50%).

Uma maior redução da FEH2O pós-exercício era esperada no grupo T devido à

inibição mais intensa da diurese, nesse grupo. O aumento do RFG pós-

exercício no grupo NT contribuiu para a menor FEH2O observada nesse grupo.

Como relatado anteriormente, parece ter havido uma compensação do RFG já

que o mesmo foi medido após e não durante o exercício. Durante o exercício,

poderia se esperar uma maior FEH2O para o grupo NT, devido a uma redução

esperada tanto do RFG, quanto do FU nesse grupo.

As FENa+ e FEK+ também não foram diferentes entre os grupos. Para o

grupo T, talvez a sessão de exercício não tenha sido suficiente para induzir

alguma alteração tubular na reabsorção e secreção de eletrólitos, apesar de ter

aumentado a concentração plasmática de aldosterona. O grupo NT, mesmo

realizando um exercício mais intenso, também não apresentou diferença na

fração de excreção de eletrólitos, mas aumentou a concentração plasmática de

aldosterona. Portanto, o grupo NT, pós-exercício, filtrou mais eletrólitos, mas

também os excretou na mesma intensidade.

O exercício absoluto foi suficiente para elevar a concentração plasmática

de aldosterona em ambos os grupos, mas de maneira diferenciada. O exercício

absoluto causou maior aumento no grupo NT. A secreção de aldosterona está

diretamente relacionada à estimulação do sistema renina-angiotensina-

aldosterona (SRA), principalmente o aumento na concentração de Ang II no

plasma. Alguns estudos já mostraram que o exercício agudo eleva a

concentração de Ang II circulante e também de seus precursores, angiotensina

I e renina (Woods et al.,2004; Kinugawa et al.,1997; Milledge e Catley, 1982). O

SRA é estimulado quando ocorre aumento da atividade simpática renal. Como

o exercício aumenta a atividade simpática de maneira intensidade-dependente

causando vasoconstrição renal e esplâcnica a fim de aumentar a perfusão dos

músculos ativos, espera-se um aumento da aldosterona também intensidade-

dependente como observado por Montain et al. (1997). Já foi observado que o

treinamento aeróbio reduz a estimulação do eixo-hipotálamo-hipófise-adrenal

após o exercício agudo (Park et al., 2005; Watanabe et al., 1992; Buono et al.,

1987). No entanto, não se sabe se o treinamento aeróbio afeta a secreção de

Ang II durante o exercício submáximo. Filho et al. (2008) verificaram que o

treinamento reduziu as concentrações de Ang II circulante, em repouso.

Baseado no exposto acima é compreensível observar um maior aumento da

aldosterona durante o exercício no grupo NT comparado ao T.

Quando a função renal foi medida em períodos de 24 h, em repouso, foi

observado que o treinamento levou a uma maior FRNa+ e FRK+, o que não

aconteceu quando tais frações foram medidas pelo período de 8 h, também em

repouso. Isto poderia ser devido ao fato de que a produção de urina e excreção

de Na+ e K+ são afetadas pelo ritmo circadiano sendo o período de luz escura

onde ocorre maior excreção de eletrólitos e produção de urina (Aizman et al.,

1994). Assim, há uma maior precisão nos valores de função renal de repouso

quando medida por período de 24 h. No presente estudo, a função renal de

repouso foi medida por período de 8 h com o intuito de se detectar, caso

houvesse, o efeito do exercício agudo sobre a função renal nos ratos reinados.

Os ratos T e NT apresentaram Cosm e CH2O livre pós-exercício

semelhantes entre os grupos. Ambos Cosm e CH2O livre, no grupo T, não foram

afetados pela sessão de exercício. Porém, para o grupo NT, a sessão de

exercício mais intensa levou a um aumento no Cosm e a um CH2O livre mais

negativo. O aumento do Cosm pós-exercício no grupo NT está associado,

provavelmente, ao aumento da quantidade filtrada e excretada de solutos pós-

exercício. O CH2O livre mais negativo, no grupo NT, não pode ser explicado por

um aumento na concentração plasmática de vasopressina. Os resultados

obtidos de Cosm e CH2O livre pós-exercício, para o grupo NT, não traduzem o

que está acontecendo durante o exercício.

A concentração plasmática de vasopressina aumentou ainda mais no

grupo T quando o mesmo foi submetido a uma sessão de exercício de

intensidade mais leve comparado ao grupo NT. Esse aumento da vasopressina

imediatamente após o exercício não refletiu em um CH2O livre pós-exercício

mais negativo para o grupo T. No entanto, o CH2O livre pós-exercício já se

encontrava aumentado (mais negativo) no grupo T, na situação de repouso.

Sabe-se que a concentração plasmática da vasopressina eleva-se de maneira

intensidade-dependente do exercício agudo (Montain et al., 1997; Wade,

1984).No entanto, ainda não é claro o efeito do treinamento aeróbio sobre a

concentração plasmática de vasopressina em repouso e durante o exercício e

nem sobre os receptores de vasopressina, V1 e V2.

Os hormônios vasopressina e ANP possuem ações opostas no

organismo. Enquanto a vasopressina é antidiurética, o ANP caracteriza-se por

ser natriurético e diurético, e executa essa função inibindo o receptor V2 de

vasopressina nos ductos coletores renais. No presente estudo, a sessão de

exercício causou uma intensa inibição no ANP plasmático no grupo NT,

resposta esta, contrária aos estudos onde foi observado um aumento no ANP

plasmático durante o exercício (Rogers et al., 1991; Ibanez et al., 1990). O

exercício causa um aumento no débito cardíaco e, consequentemente, no

retorno venoso causando expansão atrial, o que é considerado o principal

estímulo para a secreção de ANP. Portanto, durante o exercício se esperaria

um aumento do ANP plasmático nos ratos NT. Pan (2007) mostrou que ratos

treinados secretam ANP para o plasma de maneira intensidade-dependente

durante exercícios de diferentes intensidades. Em nosso estudo, a sessão de

exercício, para o grupo T, não foi suficiente para aumentar o ANP plasmático,

embora sua concentração tenha sido superior à encontrada no grupo NT pós-

exercício. Mesmo assim, as FENa+ e FEH2O foram semelhantes nos ratos T e

NT pós-exercício.

Em conjunto, os resultados desse trabalho mostram que o protocolo de

treinamento aeróbio de intensidade moderada, aqui utilizado foi adequado e

que o treinamento leva a adaptações renais de repouso como maior filtração

glomerular e maior reabsorção renal de sódio e potássio. O treinamento

também interfere na resposta renal ao exercício agudo de intensidade absoluta.

6 CONCLUSÃO

O protocolo de treinamento físico de intensidade moderada para ratos

em esteira, padronizado neste trabalho, foi adequado ao estudo da função

renal;

O treinamento físico de intensidade moderada induziu adaptações na

função glomerular e tubular, além de induzir adaptações em alguns hormônios

atuantes nos rins.

Em repouso:

• O treinamento aumentou a filtração glomerular, a qual pode, pelo

menos em parte, ser atribuída à vasopressina;

• A reabsorção aumentada de sódio provavelmente não é devido à

aldosterona, ao passo que a reabsorção aumentada de água está

associada à vasopressina. Já a reabsorção aumentada de

potássio parece não ocorre via inibição da aldosterona;

• Apesar do aumento no volume plasmático, o treinamento não

alterou o ANP circulante, nem a urodilatina na urina. Isto favorece

a conservação renal de água e sódio.

Pós-exercício:

• Os ratos treinados são mais eficientes em provocar antidiurese e

a vasopressina é um dos responsáveis diretos por esta resposta;

• O ritmo de filtração glomerular (RFG), já aumentado pelo

treinamento (repouso), não foi afetado pelo exercício sugerindo

que o treinamento induziu adaptação renal o que preveniria

oscilações durante o exercício.

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