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Agradecimentos
Aos amigos por entenderem minha ausência, ou por não entenderem e brigarem comigo exigindo
minha presença. Saibam que nos momentos que fico distante sempre sofro de saudades. À minha
flor pelo incentivo, companhia e por me dar paz.
À minha mãe que se preocupa, mas finge que não, só para me dar tranqüilidade para continuar no
caminho que escolhi.
Ao Marco, meu guia, meu amigo, meu exemplo de pessoa e de profissional. Aprendo com você
nos dias bons e nos dias ruins. Obrigada por estar ao meu lado todos esses anos. E por sempre me
lembrar que tudo dá certo no final. Se não deu certo ainda é porque não chegamos nos final.
Ao Antônio, meu anjo da guarda, meu santo! Obrigada por me ouvir, me ajudar em tudo, e por
sempre chegar sorrindo acabando com qualquer possibilidade de um dia ruim.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, por me aguentarem reclamando, por
serem pessoas incríveis com quem aprendi muito e por terem cada um, uma história que os fazem
únicos nas suas particularidades.
Às Professoras Vêronica Calado e Lourdes Cabral pela orientação e compreensão ao longo desses
2 anos.
À Analy Leite (maluca!) e ao LEMM por me ajudarem na última etapa do trabalho de forma tão
atenciosa.
À Capes pela bolsa de mestrado.
Ao Programa de Ciência de Alimentos pela oportunidade.
Muito obrigada!
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BERES, Carolina. ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS COM POTENCIAL TECNOLÓGICO DE UVAS VITIS VINIFERA E DESENVOLVIMENTO DE UM MEIO DE CULTURA BASEADO NA UVA E SEUS DERIVADOS. Rio de Janeiro, 2013. Dissertação (Mestrado em Ciências de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.
Resumo
A vitivinicultura representa um importante segmento econômico e social no mercado. O papel biotecnológico dos microrganismos neste processo permite novos estudos, uma vez que os processos são intimamente dependentes de características da região produtora, assim como das variedades de uvas utilizadas. Na produção do vinho são utilizadas culturas comerciais, que aumentam os custos e não valorizam as particularidades encontradas em culturas nativas. Além da participação nos processos fermentativos, há produção de enzimas como pectinases e a seleção de estirpes probióticas, cujos produtos com estas características têm apresentado uma crescente demanda no mercado. Desta forma este estudo teve como objetivo isolar microrganismos da superfície de uvas que apresentem potencial de uso biotecnológico e características probióticas. E desenvolver um meio de cultivo que tem como componente principal a uva e seus derivados, para isolamento de bactérias láticas. Foram isolados em Agar MRS 485 microrganismos. Estes foram caracterizados presuntivamente como: BAL (189), fungos e leveduras (202) e bastonetes Gram negativos (69). Todos os microrganismos foram avaliados quanto à produção da enzima pectinase, resistência a sais biliares, pH ácido e produção de atividade antimicrobiana. Destes, 94 estirpes produziram pectinase e 9 estirpes foram presuntivamente caracterizadas como potenciais probióticas por apresentarem resistência aos sais biliares, resistência ao pH 3,5 e produzir antimicrobiano ao mesmo tempo. As estirpes que apresentaram alguma atividade biotecnológica de interesse foram identificadas através de técnicas moleculares. Foi realizada amplificação do material genético por PCR, ARDRA para análise de restrição do RNAr 16S e sequenciamento dos perfis representativos de cada espécie. Foram identificadas 12 estirpes de Paenibacillus sp., 2 de Bacillus sp., 2 Bacillus subtilis, 1 Klebsiela pneumoniae, 16 Klebsiela sp., 12 Leuconostoc e 1 Cellulosimicrobium funkei. Foi desenvolvido um meio de cultivo utilizando-se a uva Vitis
vinifera, bagaço de uva, extrato do bagaço de uva e suco de uva comercial para isolamento de BAL. Na formulação com 50% de suco e 50% de uva foi observado o crescimento das culturas de referência igual ou superior ao encontrado no meio comercial (MRS). O desenvolvimento de um meio de cultura a base de uva, com desempenho comparável a um meio comercial permitirá o isolamento de culturas a partir das uvas de uma forma mais econômica e utilizando as particularidades das variedades de uvas de cada região.
Palavras – chave: uva, bagaço, meio de cultura, microrganismo, bactéria lática, pectinases.
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BERES, Carolina. MICRORGANIMS WITH TECNOLOGICAL POTENTIAL ISOLATED FROM THE VITIS VINIFERA GRAPE SURFACE AND CULTURE MEDIUM DEVELOPMENT USING GRAPE AND ITS DERIVATIVES. Rio de Janeiro, 2013. Dissertation (Master in Food Science) – Chemistry Institute, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.
Abstract
The wine industry is an important economic and social sector. The role of microorganisms in biotechnological process allow further studies, as the processes are critically dependent on the characteristics of the grape varieties used. In the production of wine commercial cultures are used, which increase costs and do not value the particularities found in native cultures. In addition to cultures participating in fermentation processes, there are cultures that secrets enzymes such as pectinases, and the selection of probiotic strains, whose products with these characteristics have shown a growing demand in the market. Therefore, this study aimed to isolate microorganisms from the surface of grapes with biotechnological and probiotic potential, and develop a culture medium that has as main component the grape and derivatives, to isolate lactic acid bacteria. Were isolated in MRS Agar 485 microrganisms. These were characterized as presumptively: BAL (189), fungi and yeasts (202) and Gram negatives rod (69). These were evaluated for the production of the enzyme pectinase, resistance to bile salts, acid pH and production of antimicrobial activity. Among these, 94 strains produced pectinase and 9 strains were BAL characterized as presumptively due to its resistance to bile salts, pH 3.5 and to produce antimicrobial simultaneously. Strains that produced some biotechnological activity of interest were identified by molecular techniques. The DNA fragment amplified by PCR technique of the strains were used ARDRA. It was identified 12 strains of Paenibacillus sp., 2 Bacillus sp., 2 Bacillus subtilis, 1 Klebsiela pneumoniae, 16 Klebsiela sp., 12 Leuconostoc and 1
Cellulosimicrobium funkei. We developed a culture medium using the Vitis vinifera grape, grape pomace, grape pomace extract and commercial grape juice for the isolation of BAL. In the formulation with 50% fruit juice and 50% grape the growth in the Type cultures obtained was equal or superior to that found in commercial medium (MRS). The development of a culture medium based on grape, with performance comparable to a commercial medium allows the isolation of cultures from grapes with a cheaper methodology and using the particularities of grape varieties of each region.
Keywords: grape, pomace, culture medium, microrganism, lactic acid bacteria, pectinases.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Uva Vitis vinifera.
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Figura 2: Produção de vinhos, sucos e derivados a partir de uvas destinadas ao processamento no Rio Grande do Sul no ano de 2011.
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Figura 3: Partes integrantes do cacho de uva.
21
Figura 4: Estrutura química dos polifenóis resvetrol e catequina.
23
Figura 5: Fluxograma de operação para produção de vinho tinto (Barnabé, 2006).
25
Figura 6: Estrutura primária da pectina.
37
Figura 7: Ação da pectinase na produção do suco de uva (Rizzon e Meneguzzo, 2007).
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Figura 8: Mecanismos de ação das pectinases: (a) R=H para PG e CH3 para PMG; (b) PE. (c) R=H para PGL e CH3 para PL. A seta indica o local onde a pectinase reage com a substância péctica (Gogus, 2006). PMG: polimetilgalacturonase; PG: poligalacturonase; PE: pectinesterase; PL: pectina liase.
42
Figura 9: Alegação de propriedade funcional aprovada para os alimentos probióticos e os requisitos específicos (Brasil, 2008).
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Figura 10: Etapas da técnica de PCR.
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Figura 11: Atividade antimicrobiana de bactérias láticas isoladas da uva contra Listeria innocua.
72
Figura 12 A,B,C: Atividade antimicrobiana contra S. aureus das 9 culturas caracterizadas como bactérias láticas, isoladas da superfície das uvas. A seta indica o controle positivo L. lactis ATCC 11454 produtor de bacteriocina.
72
Figura 13: Triagem para determinação de microrganismos com atividade pectinolítica, a partir de revelação por vermelho de rutênio. A presença do halo foi considerada positiva para presença da enzima.
75
Figura 14: Estirpes isoladas da uva produtoras de atividade pectinolítica. As setas indicam dois controles positivos Candida krusei 50148 e Pichia anomala 50407.
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Figura 15: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima HhaI realizados em 9 culturas com atividade pectinolítica. As setas superiores indicam o padrão de bandas (Kb) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. Kb: padrão de
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bandas; pb: pares de base. Figura 16: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima HhaI realizados em 18 culturas com atividade pectinolítica. As setas superiores indicam o padrão de bandas (Genevuler 1Kb Plus DNA ladder) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. pb: pares de base.
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Figura 17: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima HhaI realizados em 9 culturas com atividade pectinolítica. As setas superiores indicam o padrão de bandas (Genevuler 1Kb Plus DNA ladder) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. pb: pares de base.
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Figura 18: (A e B) Meios elaborados com 100% e 50% de uva, respectivamente. (C) Meio constituído de 100% de suco. (D) MRS – meio controle. Nas figuras A, B e C, observam-se colônias com pigmentação, diferente do encontrado no MRS.
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Figura 19: Diagrama de caixa para o Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
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Figura 20: Diagrama de caixa para o Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
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Figura 21: Diagrama de caixa para o Lactobacillus casei ATCC 393, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
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Figura 22: Diagrama de caixa para o Lactobacillus sake CECT 906, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão
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Figura 23: Diagrama de caixa para o Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
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Figura 24: Diagrama de caixa para o Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
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Figura 25: Diagrama de caixa para o Lactobacillus casei ATCC 393 usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
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Figura 26: Diagrama de caixa para o Lactobacillus sake CECT 906, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
89
Figura 27: Gráfico das Médias para L. GG rhamnosus ATCC 53103 Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
90
Figura 28: Gráfico das Médias para L.delbrueckii ATCC 7830. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
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Figura 29: Gráfico das Médias para L.casei ATCC 393. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
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Figura 30: Gráfico das Médias para L. sakei CECT 906. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
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Figura 31: Comparação entre meios de cultivo com 100% ou 50% de suco em relação ao crescimento de colônias das estirpes analisadas. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro.
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Figura 32: Comparação entre meios de cultivo com 100% ou 50% de uva quanto ao crescimento de colônias das estirpes analisadas. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro. L: Lactobacillus.
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Figura 33: Comparação entre meios de cultivo com 100% de uva e meio MRS. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; L: Lactobacillus, MRS: de Man, Rogosa and Sharpe.
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Figura 34: Comparação entre meios de cultivo formulados com uva e suco de uva e meio MRS. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; MRS: de Man, Rogosa and Sharpe, pH: potencial de hidrogênio; min: minutos.
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Produção (em toneladas) de uvas para processamento e para consumo in natura, no Brasil.
19
Quadro 2: Composição da uva (Vitis vinifera L.) por 100 gramas de parte comestível.
22
Quadro 3: Conteúdo fenólico de sucos e vinhos.
24
Quadro 4: Principais aplicações do bagaço de uva na indústria.
26
Quadro 5: Microrganismos encontrados como fitopatógenos em uvas
32
Quadro 6: Efeitos benéficos à saúde, atribuídos pelos probióticos e seus respectivos mecanismos de ação.
46
Quadro 7: Substratos de origem vegetal utilizados como veículo de microrganismos probióticos.
49
Quadro 8: Aplicação de microrganismos probióticos em produtos no Brasil.
50
Quadro 9: Meios de cultura comumente empregados para isolamento e identificação de bactérias láticas de interesse.
52
Quadro 10: Meios de cultura comumente empregados para isolamento e identificação de leveduras de interesse.
54
Quadro 11: Composição do meio de cultura para pesquisa de microrganismos pectinolíticos.
54
Quadro 12: Composição do Agar MRS.
63
Quadro 13: Resultado da contagem de colônias para as corridas do planejamento.
81
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Culturas-padrão usadas nos experimentos.
59
Tabela 2: Planejamento de Misturas Simplex-Lattice com Pontos Interiores.
67
Tabela 3: Planejamento fatorial fracionário 22 e 3 pontos centrais.
69
Tabela 4: Caracterização morfotintorial das estirpes isoladas das uvas em diferentes condições.
71
Tabela 5: Resistência de bactérias láticas isoladas de uva ao pH 3,5.
73
Tabela 6: Viabilidade celular das culturas isoladas da superfície da uva em Caldo MRS suplementado com 0,3% de bile.
74
Tabela 7: Relação entre as estirpes isoladas e o perfil de bandas obtidos no ARDRA.
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Tabela 8: Identificação molecular por sequenciamento das cepas com perfil de bandas distintos.
79
Tabela 9: Melhores condições de pH, temperatura de incubação, tempo de autoclavação e formulação do meio para o crescimento de bactérias láticas.
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
µL: microlitros
16S rRNA: subunidade 16S do RNA ribossomal
a.C.: antes de Cristo
ANOVA: Analysis of Variance, Análise de variância
ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, Análise de Restrição do DNA Ribosomal Amplificado
ATCC: American Type Culture Colection
BAA: bactéria ácido acética
BAL: bactéria ácido lática
BHI: Brain Heart Infusion, infusão de cérebro e coração
DNA: Deoxyribonucleic, Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate, Desoxiribonucleotídeo Tri-fosfato
FAO: Food and Agriculture Organization
GC: conteúdo Guanina e Citosina
GRAS: Generally Recognaze as Safe
g/L: grama por litro
h: horas
Kb: padrão de bases
KDa: quilo Dalton
L: litros
LDH: desidrogenase lática
log: unidade logarítmica
MgCl2: cloreto de magnésio
mL: mililitros
11
MRS: Man, Rogosa and Sharpe
NAD: nicotinamida adenina dinucleotídeo
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo
oC: graus Celsius
PCR: Polimerase Chain Reaction, Reação em Cadeia da Polimerase
pH: potencial de hidrogênio
SO2: ácido sulfúrico
TAE: tris acetato EDTA
TBE: tris borato EDTA
UFC: unidade formadora de colônias
UFRJ: Universidade Federal do Rio de Janeiro
UV: ultravioleta
WHO: World Health Organization
12
SUMÁRIO
1. Introdução 14 2. Justificativa 16 3. Objetivos 17 3.1. Objetivo geral 17 3.2. Objetivos específicos 17 4. Revisão Bibliográfica 18 4.1. Uva e resíduos da vitivinicultura 18 4.2. Variedade de uva para produção de vinho 20 4.3. Produção de vinho e suco de uva 24 4.4. Resíduos agroindustriais 27 4.5. Microbiota da uva 29 4.5.1. Fatores que afetam a microbiota da uva 29 4.5.2. Principais microrganismos da microbiota da uva 29 4.5.3. Microrganismos fitopatogênicos 30 4.6. Presença de microrganismos de interesse industrial na uva 33 4.6.1. Levedura 33 4.6.2. Bactérias ácido láticas 34 4.7. Microrganismos pectinolíticos 36 4.7.1. Pectina 37 4.7.2. Definição e nomenclatura da enzima pectinase 37 4.7.3. Importância prática, econômica e aplicação industrial 38 4.7.4. Mecanismos de ação das pectinases 40 4.8. Microrganismos com potencial probiótico 42 4.8.1. Microrganismos probióticos 42 4.8.2. Mecanismos de ação de microrganismos probióticos 44 4.8.3. Legislação para probióticos 46 4.8.4. Aplicação de microrganismos probióticos 49 4.9. Seleção e isolamento de microrganismos de interesse 51 4.9.1. Métodos tradicionais 51 4.9.2. Métodos recentes 55 4.9.2.1. Técnicas moleculares 55 5. Material e métodos 59 5.1. Seleção de microrganismos com interesse tecnológico para a indústria de uvas e vinhos
59
5.1.1. Origem das uvas 59 5.1.2. Culturas padrão 59 5.1.3. Isolamento e estocagem dos microrganismos da superfície da uva 60 5.1.4. Seleção de bactérias láticas produtoras de substâncias antimicrobianas 60 5.1.5. Seleção de bactérias láticas com potecial probiótico 61 5.1.5.1. Resistência ao pH ácido 61 5.1.5.2. Resistência a sais biliares 62
13
5.1.5.3. Análise estatística 62 5.1.6. Seleção de microrganismos pectinolíticos 62 5.1.7. Identificação molecular dos microrganismos isolados que apresentaram propriedades tecnológicas de interesse
64
5.1.7.1. Extração do DNA das culturas analisadas 64 5.1.7.2. Amplificação do gene codificador do RNAr 16s por PCR 64 5.1.7.3. Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA) 65 5.1.7.4. Purificação do material genético 65 5.1.7.5. Identificação molecular por seqüenciamento 66 5.2. Desenvolvimento do meio de cultivo para isolamento de bactérias láticas de interesse para vitivinicultura
66
5.2.1. Planejamento de misturas 67 5.2.1.1. Obtenção dos componentes analisados no planejamento de misturas 68 5.2.2. Planejamento fatorial fracionário (23-1) 69 6. Resultados 71 6.1. Isolamento de microrganismos com interesse tecnológico para indústria de uvas e vinhos
71
6.1.1. Isolamento e caracterização morfotintorial de microrganismos isolados 71 6.1.2. Seleção de estirpes produtoras de substância antimicrobiana semelhante à bacteriocina
71
6.1.3. Determinação de características probióticas das culturas isoladas 72 6.1.4. Pesquisa de presença da enzima pectinase 75 6.1.5.Identificação molecular dos microrganismos isolados com interesse tecnológico
76
6.2. Desenvolvimento de meio de cultura para isolamento de bactérias láticas de interesse na vitivinicultura
79
6.2.1. Meios de cultura 79 7. Discussão 98 8. Conclusão 105 9. Referências bibliográficas 106
14
1. INTRODUÇÃO
A agricultura gera quantidades significativas de resíduos que, podem em alguns casos ser
considerados não perigosos, mas possuem um alto conteúdo de matéria orgânica, que causam
impactos no ambiente. O fato de sua produção ser concentrada em épocas específicas do ano
representa um potencial poluidor. O uso eficiente de resíduos industriais é importante não só para
diminuir o impacto ambiental, mas também para aumentar a rentabilidade. A matéria orgânica
apresenta potencial como fonte renovável de energia ou como substrato para a formulação de
outros produtos. Uma indústria que produz uma quantidade significativa de resíduos é a
vitivinicultura, que constitui uma parte importante da economia de diversas regiões no mundo, de
acordo com a FAO a cultura de uva produz mais de 60 milhões de toneladas anualmente (Ping et
al., 2011).
Durante o processamento e elaboração do vinho e do suco de uva alguns microrganismos
participam de forma efetiva. As bactérias ácido láticas (BAL) apresentam papel importante na
produção de vinho, onde seu crescimento e metabolismo podem ter efeitos positivos e negativos
no vinho. A transformação do ácido málico em ácido lático na fermentação malolática é positivo
para o vinho já que diminui a acidez e permite a formação de uma série de produtos, além da
remoção de ocratoxina A. Entretanto podem levar a formação de compostos com propriedades
sensoriais negativas como β – D- glucanas, ácido acético e formação de aminas biogênicas. Além
dessa característica, as bactérias ácido láticas podem ser aplicadas em melhorias no produto
devido seu potencial probiótico trazendo, portanto benefícios à saúde do consumidor e ação
contra patógenos devido a presença de substâncias antimicrobianas (Holzapfel, 2006; Terrade et
al., 2009).
Os microrganismos pectinolíticos, principalmente fungos e bactérias, são importantes na
indústria pela sua ação hidrolítica na molécula de pectina. Sendo assim, tais microrganismos
podem ser relevantes por permitirem a clarificação do suco de uva e facilitarem a extração,
aumentando o rendimento da produção (Benoit et al., 2012).
O isolamento e identificação de microrganismos da microbiota da superfície de cascas de
uvas podem revelar microrganismos com potencial tecnológico para o beneficiamento da
15
vitivinicultura, além de reduzir o uso de microrganismos comerciais, prática que frequentemente
aumenta os custos do processamento.
16
2. JUSTIFICATIVA
O aumento do consumo de sucos de frutas naturais, impulsionado pela busca por hábitos
mais saudáveis e o reconhecimento da qualidade do vinho brasileiro, elevam o seu consumo pela
população. Desse modo, a cultura de uva e vinho no Brasil é crescente, representando um
importante segmento da economia nas regiões sul e nordeste do país.
No processamento da uva, normalmente são utilizados microrganismos de uso comercial,
aumentando assim o custo da produção. A aplicação de microrganismos isolados da superfície da
uva no processamento dos seus derivados, permite uma ação mais específica, visto que as
variedades de uvas influenciam suas características nutricionais e tecnológicas, assim como sua
microbiota. Poucos estudos avaliam a utilização de microrganismos da uva no processamento e
beneficiamento do suco e do vinho. A microbiota da uva é complexa e formada principalmente
por leveduras e bactérias. As bactérias desempenham funções importantes na vitivinicultura,
entretanto são menos estudadas que as leveduras. Além de atuar nos processos fermentativos, as
bactérias produzem enzimas importantes em etapas do processamento, além de uma possível
utilização nos resíduos agroindustriais.
O processamento industrial da uva resulta em uma produção alta de resíduos. Apesar de
estudos que buscam alternativas de uso para estes resíduos, ainda há uma quantidade significativa
de matéria orgânica com destino inadequado. Desse modo, a utilização de microrganismos para a
sua degradação é relevante. As bactérias pectinolíticas e celulolíticas adaptadas à superfície da
uva são importantes nessa utilização por aumentarem o rendimento dessa reação. Além da
possível degradação do bagaço, os microrganismos pectinolíticos isolados da uva podem atuar de
forma mais específica na etapa de clarificação da produção do suco.
Na literatura atual poucos estudos abordam o papel das bactérias láticas como produtoras
de pectinase. A sua aplicação na produção de suco de uva é vantajosa por unir as ações probiótica
e pectinolítica, em um microrganismo. Além disso, a presença de bactérias láticas com potencial
probiótico no suco permite a valorização do produto e o crescente mercado de produtos
probióticos indica a importância de avanços nessa área.
17
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Isolar microrganismos produtores de substâncias de interesse tecnológico, a partir da
superfície de uvas Vitis vinifera, usadas na vitivinicultura no sul do Brasil e desenvolver um meio
de cultivo baseado na uva Vitis vinifera e seus derivados.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Isolar microrganismos produtores de substâncias antimicrobianas semelhantes às bacteriocinas;
- Isolar microrganismos com potencial probiótico;
- Isolar microrganismos produtores de enzima pectinase;
- Identificar os microrganismos isolados por métodos moleculares;
- Desenvolver um meio de cultura sólido não seletivo composto de uva e seus derivados para
isolamento de microrganismos selvagens de interesse para indústria da uva.
18
4. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4.1 Uva e resíduo da vitivinicultura
A cultura da uva (Vitis sp.) é a segunda maior cultura no mundo depois apenas da laranja.
Dentre as espécies mais cultivadas encontra-se a Vitis vinifera (Figura 1), usada para produção de
vinho. A uva é uma fruta não climatérica que pode ser consumida in natura ou desidratada.
Também pode ser usada na elaboração de geléias, suco, vinagre e vinho. Aproximadamente 71%
das uvas no mundo são usadas para produção de vinho, 27% como fruta fresca e 2% como fruta
desidratada (Arvanitoyannis e Varzakas, 2008; Demiral e Ayan, 2011).
Figura 1: Uva Vitis vinifera
No Brasil, a vitivinicultura é uma atividade importante para sustentabilidade de pequenas
propriedades, tendo apresentado no ano de 2011 um aumento de 12,97% na produção de uvas. Na
vitivinicultura brasileira, parte da uva é destinada ao consumo in natura e parte é processada
(Quadro 1), destas 60,9% são destinadas à produção de vinho, enquanto 37,3% para produção de
suco de uva, como se pode observar na figura 2 (Embrapa Uva e Vinho, 2010; Mello, 2012).
19
Quadro 1: Produção (em toneladas) de uvas para processamento e para consumo in natura, no Brasil.
Discriminação/ano
2007 2008 2009 2010
Processamento
637.125 708.042 678.169 557.888
Consumo in natura
717.835 691.220 667.550 737.554
Total
1.354.960 1.399.262 1.345.719 1.295.442
Fonte: Embrapa Uva e Vinho, 2010.
Figura 2: Produção de vinhos, sucos e derivados a partir de uvas destinadas ao processamento no Rio
Grande do Sul no ano de 2011.
A uva é um dos alimentos mais antigos da humanidade, originário da Ásia, da região
árida do Cáucaso, existindo há cerca de 6.000 anos a.C. No Brasil o desenvolvimento da
vitivinicultura só ocorreu no século XIX, após a chegada dos imigrantes portugueses e italianos.
A uva é produzida pela videira e atualmente são conhecidas mais de 10.000 variedades
encontradas em todos os continentes, predominantemente em climas temperados. As uvas podem
ser cultivadas em várias regiões onde cada variedade se adapta a diferentes tipos de solo e clima
(Pereira et al., 2008; Vedana et al., 2008; Ferrari et al., 2010).
Vinho mesa
Vinho fino
Suco de uva integral
Suco concentrado
Outros derivados
20
4.2. Variedade de uva para produção de vinho
Em torno de 60% das uvas destinadas ao processamento, são utilizadas na elaboração do
vinho. As uvas da categoria Vitis vinifera são usadas para produção de vinhos finos e Vitis
labrusca, Vitis bourquina e híbridos para produção de vinhos comuns. A variedade Vitis vinifera
produz vinho de melhor qualidade; no entanto, seu cultivo está limitado a algumas regiões
brasileiras, como Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Região do Vale do São Francisco, pois as
condições de clima e solo são mais favoráveis. As uvas destinadas à produção de vinhos de mesa,
sucos e derivados para consumo in natura são, na sua maioria, da variedade Vitis labrusca
(Aquarone et al., 2001; Camargo et al., 2007).
No Brasil, as variedades de uvas cultivadas para o vinho são (Aquarone et al., 2001):
a) Vitis vinifera
• Tintas: Cabernet Sauvignon, Merlot, Cabernet Franc, Pinot Noir, Bonarda,
Sangiovese, Canaiolo, Syrah e Tannat;
• Brancas: Riesling Renano, Riesling Itálico, Chardonnay, Gewürztraminer,
Malvasia, Pinot Blanc, Trebbiano, Peverella, Moscatel Flora, Sauvignon Blanc e
Semillon;
b) Vitis labrusca
• Tintas: Isabel, Concord, Tercy, Bordô, Folha de Figo e York Madeira;
• Brancas: Niagara;
c) Vitis bourquina
• Tintas: Hebermont e Jaques;
d) Híbridas
• Tintas: Seibel 2, Seibel 10.096, IAC 138-22, Pignoletta e Couderc;
• Brancas: Seyve Villard 5.276, IAC 116-31, IAC 21-14.
21
O cacho de uva é composto por engaço que possui os pedúnculos e as almofadas. Estes
sustentam o cacho formado pelas bagas, também chamadas de grãos. A baga é composta
principalmente por casca (6-12%), semente (2-5%) e polpa (85-92%) (Figura 3). A uva é
composta basicamente por açúcares, ácidos, pectinas, gomas, compostos aromáticos e compostos
fenólicos (Peixoto, 2000; Souza, Lima e Vieites, 2010). A composição nutricional da polpa está
discriminada no Quadro 2.
Figura 3: Partes integrantes do cacho de uva.
22
Quadro 2: Composição da uva (Vitis vinifera L.) por 100 gramas de parte comestível.
Componentes Quantidade/100g parte
comestível
Umidade 81,6g Proteínas 0,6 g Lipídios 0,7 g Glicídios 16,7 g Fibra 1,1 g Cinzas 0,4 g Cálcio 12 mg Fósforo 15 g Ferro 0,9 mg Potássio 185 mg Magnésio 6 mg Manganês 0,06 mg Vitamina A (retinol) 7,3 mg Vitamina B1 (tiamina) 0,09 mg Vitamina B3 Niacina 0,3 mg Vitamina B5 (ácido pantotênico) 0,02 mg Vitamina B6 (piridoxina) 0,11 mg Vitamina C (ácido ascórbico) 10,8 mg Vitamina B2 (riboflavina) 0,06 mg
Fonte: Tabela de alimentos em composição química e medidas caseiras – 2003. Estudo Nacional da Despesa Familiar – 1999. g – grama; mg – miligrama.
Um dos componentes mais estudados da uva são os polifenóis, metabólitos secundários
da via pentose-fosfato em plantas, sendo considerado o grupo de fitoquímicos mais encontrados,
com importância fisiológica e morfológica para plantas, como funções antialérgicas,
antiarterogênica, antiinflamatória, antimicrobiana, antioxidante, antitrombótica, cardioprotetora e
vasodilatadora. O potencial antioxidante é considerado o mais importante em determinar as suas
características benéficas, vinculadas ao consumo de frutas e hortaliças. Estruturalmente consistem
de um anel aromático com moléculas de hidroxilas, normalmente conjugados com mono ou
polissacarídeos. O possível benefício à saúde depende da absorção dos polifenóis pelo organismo.
São polifenóis: quercitina, taninos, antocianinas, flavonóides, resveratrol, catequinas,
proatocianinas, ácido hidroxibenzóico e resviratrol (Figura 4) (Baydar, Özkan e Sagdiç, 2004;
Balasundram, Sundram e Samman, 2006; Baydar, Özkan e Yasar, 2007).
23
Figura 4: Estrutura química dos polifenóis resvetrol e catequina.
Os antioxidantes são compostos químicos que diminuem os efeitos maléficos ao
organismo, pois possuem capacidade de reagir com os radicas livres, sendo inibidores dos
processos oxirredutores. Os polifenóis são exemplos de antioxidantes não enzimáticos, assim
como vitaminas e ácido úrico (Pimentel et al., 2005; Dani, 2006; Vedana, 2008).
Os radicais livres são moléculas altamente reativas produzidas naturalmente no
metabolismo. Entretanto quando em excesso podem ser prejudiciais à saúde, causando oxidação
das células, facilitando o desenvolvimento de diversas patologias (Perin e Schott, 2011).
Os antioxidantes possuem mecanismo de ação variado, inativação dos radicais livres,
redução de hidroperóxidos e complexação de íons metálicos, podendo agir sobre radicais livres
tornando-os menos reativo. Os antioxidantes endógenos, ou seja, produzidos pelo organismo,
apresentam eficiência parcial, sendo necessária a ingestão de antioxidantes exógenos, por meio da
dieta, que podem ser encontrados nas plantas, principalmente nas frutas. Além disso, os
antioxidantes naturais têm a possibilidade de melhorar a estabilidade e qualidade dos alimentos,
trazendo consigo beneficio a saúde humana (Pimentel et al., 2005; Vedana, 2008).
Dentre as frutas, as uvas são consideradas uma das maiores fontes de compostos
fenólicos. Desse modo, os produtos derivados do seu processamento, como suco e vinho,
apresentam alto conteúdo fenólico (Quadro 3) (Balasundram, Sundram e Samman, 2006; Abe et
al., 2007).
24
Quadro 3: Conteúdo fenólico de sucos e vinhos.
Bebidas Conteúdo fenólico total (mg ácido gálico /L)
Sucos comerciais
Maçã 339 ± 43 Uva 535 ± 11 Laranja 755 ± 18
Suco fresco
Uva 1.728 Laranja 382-1.147
Vinho tinto
Argentino 1.593-1.637 Brasileiro 1.947-1.984 Chileno 2.133 Californiano 1.800-4.059
Vinho branco
Argentino 216 Brasileiro 256-353 Californiano
220-306
Adaptado de Balasundram, Sundram e Samman, 2006. mg- miligrama; L – litro.
4.3. Produção de vinho e suco de uva
O vinho é uma bebida proveniente exclusivamente da fermentação alcoólica de uva
madura e fresca ou suco de uva fresca (Brasil, 1973). A definição bioquímica do vinho seria:
bebida proveniente da fermentação alcoólica dos açúcares de suco de uva pelas leveduras ou
pelas bactérias láticas (Aquarone et al., 2001). O processo de elaboração do vinho está
exemplificado no fluxograma da figura 5.
25
Figura 5: Fluxograma de operação para produção de vinho tinto (Barnabé, 2006).
26
O processamento da uva para elaboração do suco e do vinho gera o bagaço de uva como
resíduo agroindustrial. O bagaço é definido como o produto resultante da prensagem de uvas
frescas, fermentado ou não, constituído pelas partes sólidas das uvas e pelo mosto (Regulamento
CE, 1999). Normalmente, o bagaço é usado como ração animal ou fertilizante orgânico. Assim
como a uva, o bagaço é rico em polifenóis. Desse modo, o resíduo agroindustrial da
vitivinicultura pode ser usado como fonte de polifenóis (Quadro 4). Há uma necessidade por
antioxidantes naturais derivados de frutas e plantas, já que antioxidantes sintéticos são
considerados tóxicos e carcinogênicos aos humanos (Ferrer et al., 2001; Arvanitoyannis e
Varzakas, 2008; Demiral e Ayan, 2011).
Quadro 4: Principais aplicações do bagaço de uva na indústria.
Uso do resíduo agroindustrial da vitivinicultura
Adequação do resíduo Referência
Antioxidantes para conservação de alimentos
Extração por Soxhlet Bayden, Ozkan e Sagdiç, 2004
Antioxidantes para conservação de alimentos
Ausente Balasunndam, Sundann e Sammam, 2006
Produção de ácido glucônico Processo fermentativo Sing e Sing, 2006
Antioxidante para conservação de alimentos
Extração por filtração Baydan, Ozkan e Yasar, 2007
Absorção de metais Secagem Farinella, Matos e Arruda, 2007
Produção de ácido lático e biossurfactantes
Hidrólise química Rivera et al., 2007
Produção de biodisel e compostagem
Ausente Arvanitoyamis e Varzakas, 2008
Atividade antimicrobiana em alimentos
Concentração por rotavapor Serra et al., 2008
27
Produção de celulose e hemicelulose
Hidrólise química Spino, Pizzoro e Farrei, 2008
Absorção de cobre e níquel Ausente Bhatnagan e Sillarpcia, 2010
Produção de celulose bacteriana Extração aquosa Carreira et al., 2011
Produção de biocombustível para aquecimento e gerador de eletricidade
Pirólise Demiral e Ayan, 2011
Imobilização de células para fermentação em estado sólido
Ausente Genisheva et al.,
2011
Elaboração de farinha para produção de biscoito
Maceração Perin e Schott,
2011.
Fonte de lignina, celulose e hemicelulose
Lavagem e diluição em ácido sulfúrico ou oxidação
Ping et al., 2011
4.4. Resíduos agroindustriais
Estudos demonstram possíveis finalidades para o bagaço de uva, principalmente como
substrato fermentativo para produção de substâncias com elevado nível comercial. O substrato
normalmente usado é a glicose comercial, entretanto o uso do bagaço além de representar uma
diminuição do resíduo agroindustrial é uma opção mais barata para indústria (Singh e Singh,
2006; Demiral e Ayan, 2011).
O bagaço da uva representa aproximadamente 20% do peso de uva colhida. Atualmente,
pouca quantidade desse subproduto é reaproveitada. Todos os dias toneladas de frutas e derivados
sofrem decomposição inapropriada e são descartadas em ambientes abertos causando sérios danos
ao meio ambiente. A bioconversão desse material pode ser parte do controle de poluição do meio
ambiente pelo produtor, além de proporcionar a produção com menor custo comercial de outros
produtos. O bagaço de uva contém alta concentração de açúcar e é facilmente disponível,
podendo ser considerado um bom substrato (Singh e Singh, 2006; Arvanitoyannis e Varzakas,
2008).
28
De acordo com o Decreto-Lei n.o 239/97, de 9 de Setembro, resíduo é qualquer
“substância ou objeto de que o detentor se desfaz ou tem intenção ou obrigação de se desfazer,
nomeadamente os previstos em portaria dos Ministérios da Economia, da Saúde, da Agricultura,
do Desenvolvimento Rural e das Pescas e do Ambiente, em conformidade com o Catálogo
Europeu de Resíduos, aprovado por decisão da Comissão Européia”.
De acordo com o Ministério do Meio Ambiente (Brasil, 2011), dentre os resíduos
sólidos, os resíduos agrícolas foram os que apresentaram maior potencial de geração de energia
elétrica, principalmente o bagaço de cana de açúcar. Entretanto sabe-se que a maior parte do
resíduo agrícola é utilizada para alimentação animal, alimentação humana e fertilizante orgânico,
praticas estas consideradas como nobres. Não é possível estimar as quantidades utilizadas de
resíduo agrícola, entretanto esta é considerada relevante. O crescimento dos setores agrícolas
indica que a geração de resíduos continuará aumentando, porém a legislação vigente não
apresenta exigências quanto ao destino dos resíduos. Sendo assim a Lei 9.795 de 27 de abril de
1999 (Brasil, 1999) é utilizada como referência, na qual define educação ambiental como “os
processos por meio dos quais o indivíduo e a coletividade constroem valores sociais,
conhecimentos, habilidades, atitudes e competência voltadas para a conservação do meio
ambiente, bem de uso comum do povo, essencial à sadia qualidade de vida e sua
sustentabilidade” (Brasil, 2011).
De acordo com a diversidade das possíveis aplicações, confirma-se que o aproveitamento
de resíduos materiais das indústrias agrícolas gera um impacto positivo para a indústria
correspondente e a economia local e nacional. O uso do resíduo pode diminuir o valor do produto
final, além de agregar valor ao resíduo, através da sua utilização e processamento para obtenção
de outros produtos, como meios de cultivo. As características nutricionais dos resíduos gerados
na vitivinicultura são determinantes na elaboração de meio de cultura específico para cultura de
microrganismo de interesse deste setor.
29
4.5. Microbiota da uva
A microbiota encontrada na casca da uva é variada e numerosa, a presença de cera na
superfície da casca permite a retenção da mesma. Entre os microrganismos presentes na uva,
existem os úteis e os indesejáveis (Aquarone, 2001).
O conhecimento da microbiota da uva é importante para produção de um vinho com
melhor qualidade e atributos desejáveis. As uvas apresentam uma complexa ecologia microbiana
que inclui fungos filamentosos, leveduras e bactérias, com diferentes características fisiológicas e
efeitos na produção do vinho. A microbiota residente apresenta interações dinâmicas, e estas vão
determinar a ecologia microbiana da superfície da uva no tempo de colheita e a comunidade
microbiana transferida para o vinho e o suco de uva (Bae, Fleet e Heard, 2004; Li et al., 2010;
Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012).
4.5.1. Fatores que afetam a microbiota da uva
Alguns microrganismos são encontrados apenas nas uvas, outros têm capacidade de
sobreviver no vinho. A proporção desses microrganismos depende do estágio de maturação da
uva e da viabilidade de nutrientes. Condições climáticas como temperatura, exposição aos raios
ultravioleta (UV), chuvas e ventos, e os vetores encontrados influenciam na microbiota da uva
(Bae, Fleet e Heard, 2004; Chiotta et al. 2009; Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012).
4.5.2 Principais microrganismos da microbiota da uva
Nos estudos envolvendo a microbiota da uva, as leveduras são mais estudadas do que as
bactérias sendo encontradas frequentemente, pois exercem papel fundamental na fermentação
alcoólica. Leveduras dos gêneros Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Issatchenkia,
Candida, Dekkera, Brettanomyces, Kluyveromyces e Pichia são encontrados na superfície das
uvas, sendo a Hanseniaspora uvarum e Candida zemplinina as mais comuns. As leveduras não
pertencentes ao gênero Saccharommyces, normalmente encontrada em menor concentração
30
durante a fermentação alcoólica, complementam a ação da Saccharomyces cerevisiae já que são
responsáveis por causar impacto positivo no aroma do vinho, reduzindo a acidez volátil e o
conteúdo de ácido málico (Bae, Fleet e Heard, 2004; Zott et al., 2010; Barata, Malfeito-Ferreira e
Loureiro, 2012).
Dentre as bactérias são encontradas frequentemente na uva as acéticas, destacando-se os
gêneros Gluconobacter spp., Acetobacter spp. e Gluconoacetobacter spp. Além destes, as
bactérias láticas podem aumentar a produção de compostos sensoriais responsáveis pelas
características sensoriais, a formação de aminas biogênicas e fenóis voláteis. As bactérias ácido
láticas, principalmente Oenococcus oeni são responsáveis pela fermentação malolática, que
melhora o equilíbrio ácido, o flavour e a estabilidade microbiana do vinho. Dentre as bactérias
láticas, o gênero lactobacilos e suas aplicações no alimento são mais estudados, tendo importante
papel na conservação, produção e alteração de alimentos. O Lactobacillus spp. e o Pediococcus
spp. são responsáveis por processos de fermentação espontânea na uva, com produção de vinho.
Algumas espécies de lactobacilos são comumente encontradas em uvas, e podem crescer em suco
e vinho. Algumas espécies novas foram isoladas recentemente de uvas, como por exemplo
Lactobacillus kunkeei, L. nagelii, L. bobalius e L. vini. (Bae, Fleet e Heard, 2004; Manes-Lazaro,
2008; Orduna, 2010; Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012).
4.5.3. Microrganismos fitopatogênicos
Os fitopatógenos são microrganismos que causam danos às plantas, principalmente frutas
e vegetais que são mais susceptíveis por apresentarem uma maior concentração de água (Duarte e
Ramirez, 2006). No Brasil, as doenças pós colheita causadas por microrganismos fitopatogênicos
constituem um grave problema e apresentam prejuízos em torno de 80% do valor total da
produção de frutas (Camargo et al., 2011). Desse modo é necessário o uso de fungicidas, o que
aumenta o nível de contaminantes no produto final (Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003).
31
Os mecanismos de ataque dos fitopatógenos podem ser por meio de:
Enzimas – desintegram componentes estruturais das células do hospedeiro. Por exemplo,
as exoenzimas do tipo cutinases, que são esterases que degradam a cutícula, camada lipídica
contínua que recobre a epiderme de folhas, frutos e talos jovens. A cutícula tem como principal
função evitar a difusão de água e nutrientes para o ambiente externo, protegendo a planta contra
efeitos adversos. Outra exoenzima prejudicial às plantas é a celulase que causa colapso das
células resultando na formação de lesões, ou alteração do fluxo normal de água devido o bloqueio
de elementos vasculares;
Fitotoxinas – alteram a permeabilidade das membranas. As fitotoxinas são substância de
baixo peso molecular (<1.000 daltons) ativas em concentrações fisiológicas e podem ser
peptídeos, glicopeptídeos ou derivados de aminoácidos. Estas substâncias alteram a
permeabilidade e o potencial de membranas, causando mudanças no equilíbrio iônico, perda de
eletrólitos, inibição ou estímulo de enzimas, aumento na respiração e na biossíntese de etileno;
Alteração hormonal – alteram a divisão e crescimento celular. Desequilíbrio hormonal de
auxinas que levam a um aumento da plasticidade da célula e alongamento celular, de ciocininas
alterando a divisão celular e do etileno, que gera uma desfolha e inibição do crescimento;
Ação mecânica – capacidade de atravessar a parede celular causando degradação
(Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003).
Micotoxinas - metabólitos secundários tóxicos provenientes de vias biossintéticas
comuns em fungos que proliferam em produtos agrícolas destinados a alimentação humana e
animal. Estas substâncias são consideradas toxinas naturais de difícil controle aliada a
termorresistência perante o processamento industrial. Portanto, as micotoxinas são consideradas
um dos pontos críticos de controle decisivos no comércio internacional de produtos agrícolas
(Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003).
O consórcio microbiológico do vinho (leveduras, bactérias acéticas e bactérias lácticas)
não é responsável por doenças na uva. Entretanto há microrganismos patogênicos que causam
doenças à uva (Quadro 5), prejudicando a produção de suco e vinho, como os fungos
32
filamentosos Botrytis cinerea, Penicillium sp. e Aspergillus sp., conhecidos por sua capacidade de
deteriorar as uvas antes da colheita. A presença da micotoxina ocratoxina A, encontrada em
vinhos indica contaminação principalmente por Aspergillus carbonarius e Aspergillus nigri
durante o cultivo. A presença dessa substância é um risco para o homem já que possui potencial
carcinogênico (Bae, Fleet e Heard, 2004; Chiotta et al., 2009; Barata, Malfeito-Ferreira e
Loureiro, 2012).
Quadro 5: Microrganismos encontrados como fitopatógenos em uvas
Microrganismos Espécies fitopatogênicas isoladas Referência
Fungos Alternaria alternata, Aspergillus niger,
Cladosporium herbarum, Penicillium
expansum, Lasiodiplodia theobromae,
Rhizopus stolonifer
Camargo et al., 2011
Botrystis spp; Penicillium spp.; Rhizopus spp. Coelho, Hoffmann e Hirooka, 2003
Botrytis cinera, Uncinula necator, Plasmopara
viticola
Rajo, Coello e Rodríguez, 2002
Plasmopara viticola Leite et al., 2011 Botrytis cinera, Aspergilluis niger,
Cladosporium cladosporoides, Alternaria
alternata, Mucor racemosus, Penicillium
expansum
Estay, 2006
Bactérias ácido acéticas
Acetobacter aceti Estay, 2006
As leveduras que causam danos aos vinhos são encontradas no material de vinificação e
dentro de recipientes vinários, como adegas de conservação. As leveduras deterioradoras
possuem ação oxidativa, que consiste na oxidação do álcool etílico a acetaldeído, gerando um
odor muito forte no vinho. Dentre as principais leveduras deterioradoras encontram-se Candida
mycoderma, Hansenula, Pichia ou Bretanomyces. Para evitar esse tipo de levedura, deve-se
manter o recipiente de armazenamento do vinho cheio, diminuindo a quantidade de oxigênio
(Aquarone, 2001).
33
Outro dano ao vinho provocado por microrganismos é denominado azedia, que consiste
no aumento da acidez volátil, é provocada por bactérias acéticas que pertencem ao gênero
Acetobacter, sendo mais frequentes as espécies A. rancens e A. ascendens (Aquarone, 2001).
4.6. Presença de microrganismos de interesse industrial na uva
4.6.1. Leveduras
No processo de fermentação alcoólica de açúcares os principais produtos como, álcool
etílico e gás carbônico, são produzidos em quantidades equimolares (Equação 1). Também são
produzidos acetaldeído, glicerol, 2,3 butilenoglicol, ácido lático, ácido succínico, ácido cítrico,
que contribuem para o aroma e sabor do vinho (Lerma e Peinado, 2011).
C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2
Equação 1: Reação química exotérmica de fermentação alcoólica.
As leveduras são agentes de fermentação alcoólica. Existe um grande número de espécies
de leveduras que se diferenciam pelo seu aspecto, suas propriedades, sua forma de reprodução e
também pela maneira de transformar o açúcar em álcool, através de processo fermentativo. As
leveduras encontradas na vinificação podem apresentar as formas: elíptica ou oval, alongada,
esférica e apiculada; e dois modos de reprodução: vegetativa por brotamento e por formação de
esporos. As leveduras se encontram na superfície da uva madura no momento da colheita e são
transportadas para a cuba ou recipiente de vinificação. Normalmente, as leveduras são
encontradas no solo em camadas superficiais, no verão são transportadas para superfície das uvas
pela poeira e sobretudo pelos insetos (Aquarone, 2001).
As leveduras apiculadas, como Kloeckera apiculata ou Hanseniaspora uvarum são
geralmente responsáveis pelo início da primeira fase da fermentação alcoólica, já que se encontra
na uva em estado ativo. Nas uvas danificadas, a fermentação pode ser iniciada com a Torulopsis
bacillares capaz de produzir álcool pelo processo de fermentação, entretanto pouco resistente ao
34
anidro sulfuroso, fase na qual as Saccharomyces entram em ação e as leveduras iniciais são
inibidas. Na fase final de uma fermentação alcoólica, as espécies dominantes são S. ellipsoideus e
S. bayanus, sendo esta última mais alcoogênica (Zott et al., 2010).
A sulfitação (adição de ácido sulfúrico) é importante na produção de vinho como agente
antioxidante e protetor. Um objetivo essencial é paralisar o desenvolvimento de microrganismos
existentes naturalmente no mosto, em particular os indesejáveis. Esses microrganismos não são
destruídos, permanecem somente em seu estado latente. Desse modo as leveduras naturalmente
presentes e melhor adaptadas podem tornar-se as predominantes (Li et al., 2010).
A adição do inóculo contendo leveduras selecionadas ou desejadas em plena atividade,
tem como objetivo eliminar as selvagens. Entretanto algumas vezes ocorre falha na seleção da
levedura e dificuldade na operação. A seleção da levedura deve levar em consideração
características fisiológicas como rendimento da produção de álcool, poder alcoogênico,
resistência à temperatura elevada, grande produtora de glicerol, pequena produção de ácido
acético, produção de aroma particular e degradação de ácido málico (Aquarone, 2001).
As vantagens do emprego de leveduras, quando bem realizado são:
• Início da fermentação rapidamente;
• Fermentação regular, com conclusão mais rápida, gerando um aumento no
rendimento da produção de álcool;
• Boa conservação do vinho, sendo mais seco e isento de açúcares fermentáveis
(Aquarone, 2001, Li et al., 2010).
4.6.2. Bactérias ácido láticas
Durante séculos observou-se que após o término da fermentação alcoólica, determinados
vinhos tintos de mesa turvavam e liberavam pequenas bolhas de gás. Esse fenômeno não
ocasionava prejuízo à qualidade, ao contrário parecia contribuir para a melhoria do vinho.
Posteriormente verificou-se que se tratava de transformação biológica ocasionada por bactérias, e
denominou-se fermentação malolática (Aquarone, 2001).
35
A fermentação malolática consiste essencialmente na descarboxilação bacteriana do
ácido málico em ácido lático, com liberação de gás carbônico. Esse fenômeno ocorre
naturalmente em muitos vinhos tinto de mesa. Essa reação é importante na maioria das regiões
vinícolas do mundo, particularmente naquelas como as brasileiras, onde os vinhos apresentam
acidez elevada. A fermentação malolática pode ocorrer durante, logo em seguida, após meses ou
um ano após a fermentação alcoólica, sendo então considerada tardia. Para que ocorra a
fermentação malolática é necessário que o vinho esteja armazenado em ambiente de temperatura
amena, com adição moderada de ácido sulfúrico, pH elevado devido uso de carbonato de cálcio,
ou adição de borra de vinho que tenha concluído a fermentação malolática. A inoculação de
bactérias láticas apropriadas pode influir favoravelmente na fermentação malolática. Existem
bactérias láticas comerciais para o emprego na produção de vinho tinto ou branco (Rodas, Ferrer
e Pardo, 2003; Cañas et al., 2008).
A bactéria lática Oeneococcus oeni é a espécie predominantemente responsável pela
fermentação malolática, entretanto outras espécies têm sido descritas com o mesmo potencial. As
bactérias determinadas como responsáveis pela fermentação malolática além de O. oeni são do
gênero Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus (Ruiz et al., 2010).
A fermentação malolática apresenta três efeitos no vinho:
• Reduz a acidez fixa;
• Estabiliza o vinho assegurando que a fermentação malolática não ocorra quando
engarrafado;
• Aumenta o aroma do vinho (Hernández-Orte et al., 2009).
O metabolismo do ácido málico pelas bactérias láticas pode ser realizado de duas
maneiras:
1) Bactérias que possuem a enzima málica, transformam o ácido málico inicialmente em
ácido pirúvico e gás carbônico na presença da co-enzima nicotinamida adenina
dinucleotídeo (NAD). Em seguida o ácido pirúvico é imediatamente reduzido a ácido
36
lático pela desidrogenase lática (LDH) com associação de nicotinamida difosfato reduzida
(NADH);
2) Enzima trans-hidrogenase málica transforma os ácidos málicos e pirúvico em ácidos
oxalacético e lático (Aquarone, 2001).
Outra aplicação das bactérias láticas na indústria do vinho é sua capacidade de alterar
frações voláteis do vinho liberando compostos aromáticos como fenóis voláteis, terpenos e
lactonas a partir de precursores encontrados na uva (Cañas et al., 2008; Hernandez-Orte et al.,
2009).
4.7. Microrganismos pectinolíticos
Aproximadamente 10% dos microrganismos do solo são pectinolíticos. Os fungos
Kluyveromyces, Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Penicillium e Fusarium são conhecidos
como bons produtores de pectinases, podendo ser utilizados em escala industrial, pois cerca de
90% das enzimas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura. Dentre as bactérias a
produção de pectinase é mais encontrada nos gêneros: Achromobacter, Aeromonas, Arthrobacter,
Agrobacterium, Enterobacter, Bacillus, Clostridium, Erwinia, Flavobacterium, Pseudomonas e
Xanthomonas. A atividade pectinolítica não é comum em bactérias láticas, mas há estudos que
mostram a ocorrência em Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
casei, Lactobacillus plantarum e Lactococcus lactis (APHA, 2001; Uenojo e Pastore, 2006;
Benoit et al., 2012).
O método básico de detecção de organismos pectinolíticos é o crescimento dos
organismos em meio de cultura sólido com adição de pectina. A produção da enzima pelo
organismo pode ser observada por depressões no meio ou pela revelação com substância que
faça deposição do substrato pectina. Desse modo ao redor da colônia produtora de pectinase será
formada uma zona clara onde o substrato foi degradado, enquanto as colônias não produtoras
permanecerão opacas (APHA,2001).
37
4.7.1. Pectina
A pectina é um dos maiores e mais complexos componentes da lamela média das paredes
primárias de células de vegetais superiores, com função estrutural. Pertence a uma família de
polissacarídeo composto por 17 monômeros com mais de 20 ligações glicosídicas do tipo α-1,4
parcialmente esterificados por grupos metil-éster (Figura 6). A pectina é composta por 6
estruturas covalentemente ligadas formando um esqueleto com cadeias laterais. A pectina é
classificada em protopectina, a forma nativa unida com outros constituintes das células vegetais,
insolúvel em água e totalmente metoxilada; ácido péctico, composto de resíduos de ácido
poligalacturônico coloidal completamente desmetoxilada; e pectina e ácido pectínico que
possuem um grau variável de metoxilação e, em condições adequadas, são capazes de formar géis
com ácidos e açúcares (Uenojo e Pastore, 2006; Benoit et al., 2012).
Figura 6: Estrutura primária da pectina.
4.7.2. Definição e nomenclatura da enzima pectinase
Enzimas são compostos bioativos que regulam mudanças em tecidos vivos. As
pectinases pesam em torno de 30-80 KDa (quiloDaltons) e são um grupo heterogêneo de enzimas
que hidrolisam as substâncias pécticas presentes principalmente em plantas. De acordo com seu
sítio de ação, são classificadas e recebem sua nomenclatura (Sharma, Rhatore e Sharma, 2012):
- Poligalacturonase PG (EC 3.2.1.15);
- Pectinaliase PNL (EC 4.2.2.10);
- Pectatoliase PL (EC 4.2.2.2);
- Pectina esterase PE (EC3.1.1.11).
38
4.7.3. Importância prática, econômica e aplicação industrial
As enzimas pectinolíticas ou pectinases são usadas principalmente na extração de suco
de frutas e sua clarificação, tratamento de fibra têxtil e extração de óleo vegetal. Elas hidrolisam
as substâncias pécticas, sob diferentes mecanismos de ação. Essas enzimas são classificadas em
pectinoesterase que promovem a desesterificação da cadeia de pectina e despolimerase que são
responsáveis pela quebra desta cadeia. Dentre as despolimerases, a poligalacturonase é a enzima
com função hidrolítica principal. Para maioria das finalidades industriais, as poligalacturonases
produzidas por fungos são úteis por sua atividade ótima em pH baixo, servindo para grande parte
das aplicações em processos com frutas e vegetais.
Países como Estados Unidos e Japão produzem pectinases e preparação comerciais de
pectinases. Atualmente essas enzimas correspondem a cerca de 25% do mercado mundial de
enzimas, com valor de vendas estimado em 1 bilhão de dólares (Dinu et al., 2007; Santos et al.,
2008; Benoit et al., 2012).
A hidrólise enzimática da pectina apresenta vantagens sobre a hidrólise química, já que
atua em sítios específicos da molécula, enquanto a química é pouco especifica. Esse fator é
importante quando a hidrólise parcial é necessária para produção de oligossacarídeos específicos.
Para atender esse requerimento, misturas de enzimas pectinolíticas são produzidas. Diferentes
microrganismos produzem diferentes enzimas que hidrolisam a molécula de pectina em pontos
específicos, formando oligossacarídeos distintos. A maior parte das enzimas é produzida por
fungos filamentosos (Benoit et al., 2012).
Os sucos de uva possuem alto teor de pectinase sendo, portanto difíceis de espremer e
prensar. No processamento das frutas para obtenção de suco (Figura 7) as frutas são
primeiramente esmagadas e aquecidas a temperaturas de 60-80ºC e as enzimas pectinases são
adicionadas para aumentar o rendimento nesse ponto do processo, além de diminuir o tempo de
prensa. Por filtração ou centrifugação, a parte líquida é separada da sólida. O líquido é, portanto
resfriado a 0oC de modo a evitar a fermentação. E então, ocorre novamente a adição de pectinases
na quantidade de 200 ppm durante 2 semanas. As enzimas permitem a floculação das partículas
em suspensão que são retiradas posteriormente por filtração. O suco finalmente é concentrado,
39
pasteurizado e engarrafado. Para produção do vinho, a enzima pode ser adicionada na etapa após
a fermentação, quando o vinho está pronto para ser engarrafado para aumentar a taxa de filtração
e a limpidez (Kashyap et al., 2001).
Figura 7: Ação da pectinase na produção do suco de uva (Rizzon e Meneguzzo, 2007).
As pectinases usadas na indústria de vinho e sucos de frutas são principalmente
provenientes de Aspergillus niger. A pectina pode causar problemas na indústria de alimentos,
aumentando a turbidez e a viscosidade durante a extração, filtração e clarificação. No caso de
sucos como maçã, pêra e uva as enzimas são adicionadas para aumentar o rendimento do suco
durante o esmagamento, melhorando até 100% do rendimento e para realizar o processo de
clarificação. O uso de enzimas também permite uma diminuição do tempo de filtração em até
50%. As enzimas pectinolíticas também podem atuar na água residual de processamento em
40
indústrias de alimentos. O pré-tratamento dessa água com pectinase melhora a remoção desse
material, facilitando seu descarte (Kashyap et al., 2001; Gogus, 2006).
A pectinase disponível no mercado é produzida por fermentação em estado sólido, de
modo a diminuir o custo da produção, uma série de derivados de frutas são usados como material
para imobilização. A utilização de resíduos agroindustriais como substrato de baixo custo para a
produção microbiana de enzimas resulta em um processo econômico e promissor. Entretanto, a
etapa de purificação ainda é cara. Bactérias pectinolíticas são mais baratas e mais facilmente
disponíveis para gestão ambiental. O uso de bactérias pectinolíticas isoladas da microbiota da uva
pode potencializar a ação enzimática além de reduzir os custos e aumentar o rendimento (Heerd,
2012; Sharma, Rathore e Sharma, 2012).
4.7.4. Mecanismos de ação das pectinases
As enzimas pectinolíticas podem ser classificadas em três grandes grupos, dependendo se
o substrato alvo é a pectina, ácido péctico ou o oligo-D-galacturonato, se a pectinase atua
realizando transeliminação ou hidrólise, ou se a quebra da molécula ocorre de forma randômica
(Jayani, Saxena e Gupta, 2005).
Os 3 principais modos de ação da pectinase são (Figura 8):
a) Protopectinases – degrada a protopectina insolúvel originando uma molécula de pectina
solúvel e altamente polimerizada. Essa enzima é encontrada principalmente em leveduras
e bactérias do gênero Bacillus sp.;
b) Esterases – catalisa a desesterificação da pectina removendo metoxi-esters. A pectina-
esterases (PE) catalisa a desesterificação de metil-ester ligados ao esqueleto galacturônico
liberando moléculas de pectina ácida e metanol. As pectinases de fungos atuam desse
modo de forma randômica, removendo grupos metil de diferentes posições;
c) Depolimerase – catalisa a hidrólise da ligação α-(1,4)-glicosídica no ácido D-
galacturônico das substâncias pécticas. Estas são subdivididas em hidrolases ou liases. As
hidrolases podem ser do tipo poligalacturonase (PG) que catalisa a hidrólise do ácido
41
poligalacturônico com a adição de uma molécula de água na ligação de ponte de
hidrogênio. Estas são as mais estudas dentro das pectinases, encontradas em fungos,
bactérias e leveduras. Outro tipo de hidrolase são as polimetilgalacturonase (PMG) que
quebra a molécula de pectina pelo mecanismo de hidrólise. As liases promovem quebras
não hidrolíticas na molécula de pectina e são encontradas como: poligalacturonato liase
(PGL), que quebra a molécula de pectato por β-eliminação. A polimetilgalacturonase
liase, promove a quebra da pectina pela β-eliminação. As liases são produzidas por
bactérias e fungos, sendo a sua forma endógena mais abundante que a forma exógena
(Gogus, 2006).
42
Figura 8: Mecanismos de ação das pectinases: (a) R=H para PG e CH3 para PMG; (b) PE. (c) R=H para PGL e CH3 para PL. A seta indica o local onde a pectinase reage com a substância péctica (Gogus, 2006). PMG: polimetilgalacturonase; PG: poligalacturonase; PE: pectinesterase; PL: pectina liase.
4.8. Microrganismos com potencial probiótico
4.8.1. Microrganismos probióticos
Probióticos são “microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades
adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro” (FAO/WHO, 2006).
A maioria dos microrganismos considerados como probióticos fazem parte do grupo de
bactérias ácido láticas (BAL), que são cocos, cocobacilos ou bacilos Gram-positivos, imóveis,
43
catalase negativos, não esporogênicos, preferem condições anaeróbias, mas são aerotolerantes,
fermentadores obrigatórios e produzem ácido láctico como o principal produto final, durante a
fermentação de carboidratos. Os principais gêneros representantes probióticos das BAL são:
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus e Weissella. Também
utilizada como probiótico, a classificação de Bifidobacterium spp. como BAL é controversa,
sendo mais considerada como uma BAL tecnológica. Existem probióticos que não são BAL,
como os gêneros Bacillus e Escherichia, assim como leveduras, sendo a Saccharomyces spp. a
mais utilizada (Axelsson, 2004; Costa, 2003; Costa, 2006). Entretanto, os principais
organismos utilizados como probióticos em alimentos são Lactobacillus spp. e Bifidobacterium
spp. (Fernandes, 2009).
O gênero Lactobacillus, pertence ao filo Firmicutes, classe bacilos, ordem
Lactobacillales e família Lactobacillaceae, encontrado em ambientes ricos em carboidratos,
Gram-positivo, não formador de esporos, catalase negativo, microaerofílico. Podem ser
homofermentativos, pela via Embden-Meyerhof-Parnas (glicolítica), onde o principal produto
final é o ácido lático, ou heterofermentativos, através da via Fosfocetolase em que são
produzidas, além do lactato, uma grande variedade de outros produtos de fermentação como
etanol, acetato, CO2, ácido fórmico, diacetil, acetoína e 2,3-butanodiol de citrato. Todos estes
compostos contribuem para as propriedades sensoriais e nutricionais dos produtos fermentados
(Vasiljevic e Shah, 2008; Oliveira et al., 2012).
O gênero Lactococcus apresenta-se como cocos Gram-positivos, microaerofílicos e
homofermentadores obrigatórios, produzindo ácido láctico. Tem sido comumente isolados de
milho, repolho, alface, abóbora, dentre outros. Geralmente, não são encontrados em material fecal
ou solo, e podem ocorrer em pequeno número na superfície do corpo da vaca e em sua saliva,
sendo comum seu isolamento em leite cru. Além disso, apresentam grande interesse pela indústria
de alimentos, visto que são empregados como culturas iniciadoras puras ou mistas para a
produção de diferentes produtos lácteos fermentados como queijos, iogurtes e manteiga (Stiles e
Holzapfel, 1997).
44
4.8.2. Mecanismos de ação de microrganismos probióticos
O uso de probióticos em alimentos tem como principal objetivo trazer benefícios à
saúde do consumidor (Holzapfel, 2006; Schmid et al., 2006). Contudo, melhorias na qualidade
do produto, como controle de patógenos (Diez-Gonzalez e Schamberger, 2006) pode ser
esperado, quando a cepa probiótica possui essa característica. Desta forma, os probióticos, em
virtude da produção de bacteriocinas e de seus metabólitos, têm sido empregados como
biopreservantes nos alimentos, o que confere maior segurança ao consumidor, que cada vez mais
prefere produtos livres de conservantes químicos e microbiologicamente seguros (Dabés, Santos
e Pereira, 2001; Holzapfel, Geisen e Schillinger, 1995).
A nisina, a única bacteriocina purificada e aprovada para alimentos em diversos países,
inclusive no Brasil, é produzida por Lactococcus lactis ssp. lactis. Essa bacteriocina foi
identificada pela primeira vez em leite fermentado e, desde então, tem sido isolada de outros
leites e produtos lácteos, bem como de vegetais e água de rio. A nisina possui importância
tecnológica, sendo empregada na indústria de lacticínios por apresentar atividade antimicrobiana
contra um amplo espectro de microrganismos Gram-positivos, além da prevenção da germinação,
dos esporos de bactérias esporogênicas, como Bacillus e Clostridium (Beasley e Saris, 2004).
As bactérias produtoras de nisina estão presentes no leite humano e, por isso, podem
proteger a lactante da mastite e o lactente da intoxicação por Staphylococcus aureus. No entanto,
os potenciais efeitos da ingestão de bactérias produtoras de nisina no trato gastrointestinal e na
sua microbiota permanecem desconhecidos. É sabido que essas bactérias sobrevivem à passagem
através do intestino, mas não, se a nisina é produzida no trato gastrointestinal (Jozala et al.,
2005).
Adicionalmente, como resultado das suas propriedades antimicrobianas, a nisina tem
sido utilizada no tratamento de úlceras de estômago e cólon (Jozala et al., 2011). Diversos países
permitem o uso da nisina em produtos lácteos como leite, queijo, além de tomates, vegetais
45
enlatados, sopas enlatadas, maionese e alimentos infantis. No Brasil, a nisina é aprovada para uso
em todos os tipos de queijo no limite máximo de 12,5 mg/kg (Oliveia, Siqueira e Silva, 2012).
Os principais benefícios atribuídos aos probióticos são aumento da tolerância e digestão
da lactose; influência positiva na microbiota intestinal; redução do pH intestinal; melhora do
peristaltismo contribuindo para a prevenção da constipação intestinal; efeitos
hipocolesterolêmico, anticarcinogênico e anti-hipertensivo; redução de compostos tóxicos;
síntese de vitaminas do complexo B como ácido fólico, cianocobalamina, biotina e ácido
pantotênico; restauração da microbiota normal após antibioticoterapia; tratamento e
prevenção de diarréia aguda por rotavírus e gastroenterite; redução da atividade ulcerativa de
Helicobacter pylori; controle da colite induzida por rotavírus e por Clostridium difficile;
imunoestimulação; diminuição do risco de doenças cardiovasculares e prevenção da obesidade,
do diabetes mellitus não insulino-dependentes e da osteoporose, em função do aumento da
biodisponibilidade de minerais como o cálcio (Buriti e Saad, 2007; Burgain et al., 2011; Costa,
2006; Prado et al., 2008; Quigley, 2010).
Os efeitos dos probióticos podem ser classificados em três modos de ação:
• Capacidade de modular as defesas do hospedeiro, incluindo o inato, bem como o sistema imune
adquirido, estando relacionado não só com a prevenção e terapia de doenças infecciosas, mas
também com o tratamento de inflamação crônica do trato digestório e à erradicação de células
neoplásicas;
• Estabelecimento de um balanço microbiano intestinal, modificando o ecossistema de
microrganismos que habitam o intestino humano, devido à competição pelos sítios de aderência,
impedindo a colonização de patógenos e estimulando o sistema imune, de forma a agir na
prevenção e terapia de infecções e na restauração do equilíbrio microbiano no intestino;
• Inativação de toxinas e de desintoxicação de componentes alimentares no intestino (Paseephol e
Sherkat, 2009; Oelschlaeger, 2010).
A maioria dos mecanismos de ação destes efeitos protetores das culturas probióticas à
saúde humana ainda não foi completamente esclarecida (Quadro 6). No entanto, alguns efeitos já
46
foram comprovados cientificamente, como a prevenção da diarréia e alívio da intolerância à
lactose.
Quadro 6: Efeitos benéficos à saúde, atribuídos pelos probióticos e seus respectivos mecanismos de ação.
Efeitos protetores Mecanismo de ação
Alívio da intolerância a lactose Sistema de enzima β-galactosidase
Prevenção e redução dos sintomas de diarréia associada a antibiótico e por Rotavírus
Exclusão competitiva Melhora do sistema imune
Tratamento e prevenção de alergia (eczema atópico e alergia alimentar)
Regulação do sistema imunológico
Redução do risco associado à mutagenicidade e carcinogenicidade
Metabolismo de agentes mutagênicos Alteração da microbiota e da atividade metabólica intestinal Imunidade intestinal aumentada
Efeito hipercolesterolêmico Desconjugação de sais biliares
Inibição da Helicobacter pylori e outros patógenos intestinais
Exclusão competitiva Produção de compostos antimicrobianos
Prevenção de doença inflamatória do intestino
Exclusão competitiva Modulação da resposta imune Produção de compostos antimicrobianos Decomposição de antígenos patogênicos
Estimulação do sistema imune Indução da imunidade inata adquirida
Fonte: Vasiljevic e Shah, 2008.
4.8.3. Legislação para probióticos
Um microrganismo para ser considerado como probiótico deve atender a diferentes
critérios pré-definidos que englobam aspectos de segurança, tecnológicos, funcionais e
fisiológicos desejáveis: status GRAS; história do uso seguro em alimentos; benefícios para a
47
saúde documentados; propriedades antimutagênica e anticarcinogênica; histórico de não
patogenicidade; tolerância às substâncias antimicrobianas; adesão à mucosa intestinal;
colonização, ao menos temporariamente, do trato gastrointestinal humano; capacidade de reduzir
à adesão das superfícies de patógenos; atividade antimicrobiana contra bactérias potencialmente
patogênicas através da produção de compostos como bacteriocinas, ácidos orgânicos, peróxido de
hidrogênio; ausência de genes determinantes da resistência aos antibióticos; imunoestimulação
sem efeito pró-inflamatório; tolerância ao ácido, suco gástrico humano e à bile; resistência aos
fagos; tolerância ao oxigênio e calor; atividade metabólica desejada; capacidade de crescer em
leite; boas propriedades sensoriais; permancer viável e estável durante o processamento e
estocagem de alimentos, até o momento de seu consumo (Naidu e Bidlack e Clemens, 1999;
Holzapfel, 2006; Saad, 2006).
Para se estabelecer potenciais benefícios dos probióticos a saúde, é necessário que sejam
realizados estudos in vitro antes dos ensaios in vivo. Além disso, as estirpes devem ser testadas
individualmente para cada propriedade, visto que as características atribuídas a uma estirpe
probiótica são cepa-específica (Monteagudo-Mera et al., 2012). Independentemente da forma de
introdução dos probióticos, a quantidade final de células devem obedecer à legislação vigente do
país. Segundo a legislação brasileira, a manutenção da viabilidade e estabilidade do
microrganismo probiótico durante o uso e a estocagem do produto, deve variar entre 108 e
109UFC na recomendação diária do produto, além da capacidade de sobrevivência no ecossistema
intestinal, condição necessária à promoção das alegações de saúde e propriedades funcionais de
um probiótico (Figura 9) (Brasil, 2008).
Contudo, culturas não viáveis podem exercer certos efeitos benéficos como a
imunomodulação (Ouwehand et al., 1999). No Brasil, a Comissão Tecnocientífica de
Assessoramento em Alimentos Funcionais e Novos Alimentos, instituída junto à Câmara Técnica
de Alimentos da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), têm avaliado os produtos
com alegações de propriedades funcionais e/ou de saúde aprovados no país, como por exemplo os
alimentos probióticos. Para a comercialização, deve haver um registro prévio mediante a
comprovação científica da sua eficácia, a qual deve ser avaliada caso a caso, tendo em vista que
podem ocorrer variações na ação do composto bioativo, em função da matriz ou formulação do
48
produto (Brasil, 2008; Komatsu,Buriti e Saad, 2008). Estas alegações podem fazer referências à
manutenção geral da saúde, ao papel fisiológico dos nutrientes e não nutrientes, bem como à
redução de risco de doenças, não sendo permitidas aquelas que façam menção à cura ou
prevenção de doenças (Moraes e Colla, 2006).
Figura 9: Alegação de propriedade funcional aprovada para os alimentos probióticos e os requisitos específicos (Brasil, 2008)
49
4.8.4. Aplicação de microrganismos probióticos
Os microrganismos probióticos são aplicados em uma variedade de produtos, sendo em
sua maioria de origem láctea. Entretanto estudos utilizam alimentos de origem vegetal (Quadro 7)
e origem animal para adição do caráter probiótico.
Quadro 7: Substratos de origem vegetal utilizados como veículo de microrganismos probióticos
Microrganismo Produto Referência
Enterococcus faecium CRL 183
Sorvete de “iogurte” de soja
Miguel e Rossi (2003)
Bifidobacterium lactis Bb-12
Maçã e mamão in natura
Tapia et al. (2007)
Lactobacillus rhamnosus GG
Maçã in natura
Alegre et al. (2011)
Lactobacillus paracasei LAFTI® L26
Sucos de frutas
Rodrigues et al. (2011)
No Brasil a aplicação de probióticos em produtos alimentícios é crescente, como
demonstrado no Quadro 8.
50
Quadro 8: Aplicação de microrganismos probióticos em produtos no Brasil
Microrganismo Produto Referência
Lactobacillus acidophilus LAC4, Bifidobacterium
longum BL04 Queijo petit-suisse Maruyama et .al. (2006)
My Bio 6 (Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium e Lactobacillus acidophilus)
Bebida láctea Thamer e Penna (2006)
Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB12,
Mesophilic Aromatic
Culture (MAC CHN-22) (Lactococcus lactis subsp.
cremoris, Lactococcus lactis
subsp. lactis, Lactococcus
lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis e Leuconostoc
mesenteroides subsp. cremoris)
Bebida láctea (buttermilk) Antunes et.al. (2007)
Lactobacillus rhamnosus
(Rhodia) Queijo prato Cichoski et al. (2008)
MyBio 6 e MyBio 2 (Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus
acidophilus e Bifidobacterium)
Bebida láctea com pêssego Kempka et al. (2008)
Bio-Rich®(Bifidobacterium Bb-12 e Lactobacillus
acidophilus LA-5)
Frozen yogurt de leite de cabra
Alves et. al. (2009)
L. rhamnosus GG ATCC 53103, B. animalis ssp.
lactis DN-173 e L. lactis
ssp. lactis ATCC 11454
Glóbulos similares à ovas de salmão e doce à base de
surimi Guimarães (2012)
51
4.9. Seleção e isolamento de microrganismos de interesse
4.9.1. Métodos tradicionais
Métodos tradicionais são conhecidos como método “ouro” ou método padrão de escolha,
e estão envolvidos principalmente com técnicas de cultivo. Tais métodos baseiam-se na
multiplicação do organismo alvo usando meios nutritivos em ágar ou caldo para obter um
crescimento visível, e assim realizar isolamento ou contagem microbiológica (Jasson et al.,
2010).
A utilização de meios seletivos e diferenciais é aparentemente mais simples, entretanto
esses métodos são mais demorados e podem não ser representativos principalmente em análise de
microrganismos semelhantes entre si, onde a caracterização baseada em técnicas fenotípicas e
bioquímicas pode apresentar resultados similares (Bernardeu, 2008; Martín, 2010).
O isolamento dos principais microrganismos da superfície da uva, bactéria ácido láticas e
leveduras é realizado prioritariamente usando meios de cultura seletivos relacionados nos
Quadros 9 e 11.
52
Quadro 9: Meios de cultura comumente empregados para isolamento e identificação de bactérias láticas de interesse.
Microrganismos de interesse Meios de Cultura Referência
Man, Rogosa and Sharpe (MRS) Man, Rogosa and Sharpe, 1960; Garrote, Abraham e Antoni et al., 2001; Simova et al., 2002;Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004; Guzel-Seydim et al., 2005;Irigoyen et al., 2005; Chen, Wang e Chen, 2008;Miguel et al., 2010; Magalhães et al., 2010; Öner, Zarahan e Çakmakçi, 2010; Magalhães et al., 2011; Gronnevik, Falstad e Narvhus, 2011; Kesmen e Kacmaz 2011
Lactobacillus MRS + 3% etanol Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004; Britz, 2005
Rogosa CW (Rogosa + 100% milk whey
solution, pH 5,4) Simova, 2002; García Fontán, 2006
Lactic Acid Whey (LAW) Mainville, 2006; Farnworth e Mainville, 2008
M17 Simova, 2002; Mainville, 2006; Irigoyen, 2005; Guzel-SEydim, 2005; Magalhães, 2010; Witthuhn, Schoeman e Brits, 2004; Magalhães , 2011
Edward’s modified Magalhães, 2011
Lactococcus Potassium carboxymethyl cellulose agar (KCA)
Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004
Lee medium Garrote, Abraham e Antoni, 2001
Azide Agar medium Simova, 2002
LUSM Magalhães, 2011; Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004
KCA+30µg vancomicina Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004
Leuconostoc Mayex, Sandine and Elliker (MSE) Gracía Fontán, 2006
LD-agar Gronnevik, Falstad e Narvhus, 2011
MRS+1% X-gal (5mL/L) Mainville, 2006
Oeneococcus
MRS Capello et al., 2010; Sánchez et
al., 2010; Mesas, Rodríguez e Alegre, 2011.
53
Medium for Leuconostoc oeni (MLO Agar)
Ruiz et al., 2010.
Elliker’s Guzel-Seydim, 2005
Meio 135 Magalhães, 2011
Universal Beer Agar (UBA) Rea, 1996
BAA Acid Acetic Bacteria (AAB) Garrote, Abraham e Antoni, 2001
GY medium Irigoyen, 2005
Acetobacter peroxydans medium (APM) Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004
254 medium Magalhães, 2010.
As bactérias láticas são fastidiosas, desse modo os meios utilizados para seu cultivo e
isolamento são complexos. Os componentes dos meios apresentam funções distintas e
complementares. O meio mais utilizado no cultivo de BAL é o MRS (Quadro 10), sendo este
considerado um meio de cultura complexo, contendo todos os nutrientes essenciais para o
crescimento de BAL. No MRS a peptona e o extrato de carne são fontes de compostos
nitrogenados e carbônicos. O extrato de levedura fornece vitaminas do complexo B e a dextrose
é o carboidrato fermentável e fonte energética. O Polisorbato 80 fornece ácidos graxos para o
metabolismo de bactérias láticas. O acetato de sódio e citrato de amônio inibem o crescimento
de estreptococos e bolores principalmente. O magnésio é um cofator para enzimas e está
presente na parede celular e membrana plasmática, sendo portanto importante para o
metabolismo das células microbianas. O cátion inorgânico mais abundante no interior da célula é
o potássio, ele atua como cofator enzimático, e o manganês é considerado um elemento traço,
importante para regulação do metabolismo secundário e excreção de metabólitos primários
(Aquarone, 2001).
54
Quadro 10: Composição do Agar MRS
Componentes Composição em g/L Peptona 10
Extrato de carne 10 Extrato de levedura 5
Dextrose 20 Polisorbato 80 1
Citrato de amônia 2 Acetato de sódio 5
Sulfato de magnésio 0,1 Sulfato de manganês 0,05 Fosfato de dipotássio 2
pH final a 25oC 6,5 ± 0,2 g:grama. L:litro. (Man, Rogosa e Sharpe, 1960)
Quadro 11: Meios de cultura comumente empregados para isolamento e identificação de leveduras de interesse.
Microrganismos de interesse
Meios de Cultura Referência
Yeast glucose chloramfenicol
(YGC) Garrote, Abraham e Antoni, 2001; Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004; Gronnevik, Falstad e Narvhus, 2011
Malt extract agar (MEA) Simova, 2002; Witthuhn, Schoeman e Britz, 2004; Guzel-Seydin, 2005;
Yeast extract Peptone Glucose (YEPG)
Magalhães, 2010; Magalhães, 2011
Yeast Extract Chloramphenicol
(SDC) Rea, 1996
Leveduras Sabouraund Dextrose
Chloramphenicol (SDC) García Fontán, 2006
Oxytetracicline Glucose Yeast
Extract (OGYE) Irigoyen, 2005
Yeast Extract Lactate + Naladixic
acid (YELN) Witthuhn, Schoeman e Britz, 2005
Malt extract, yeast extract,
glucose, peptone + chloramphenicol
Magalhães, 2010
YM Simova, 2002
55
Para o isolamento e caracterização de microrganismos de amostras que apresentam uma
microbiota complexa como a da uva, a utilização apenas das técnicas de cultivo pode ser um fator
limitante já que alguns microrganismos são exigentes quanto à adequação nutricional,
temperatura e tempo de incubação. Além disso, a seletividade do meio pode não ser eficiente
permitindo o crescimento de microrganismos que inibam o isolamento da cultura desejada (Jay,
2005).
4.9.2. Métodos recentes
Nos últimos 20 anos uma série de tecnologias inovadoras vem sendo desenvolvidas para
detecção e identificação de microrganismos que sejam mais rápidas e sensíveis. (Iqbal et al.,
2000; Jasson et al., 2010).
Dentre elas se destacam as técnicas moleculares. A detecção de ácidos nucléicos apresenta
diversas aplicações em identificação de bactérias e outros microrganismos. A maioria dos
métodos desenvolvidos é eficiente em identificar o organismo alvo (Iqbal et al., 2000).
4.9.2.1. Técnicas moleculares
Os métodos moleculares vêm sendo desenvolvidos para aumentar a velocidade das
análises, obtendo uma identificação mais rápida. Eles são baseados em hibridização de sondas ou
amplificação do sinal. A hibridização consiste na complementaridade entre as fitas de ácidos
nucléicos de acordo com o postulado de Watson e Crick. São usadas sondas moleculares, ou seja,
sequências de bases nitrogenadas complementares à seqüência alvo (Iqbal et al., 2000).
Os ensaios baseados em hibridização são limitados em termo de sensibilidade, já que
apresentam pouco sucesso em baixas concentrações de células alvo. Outra desvantagem da
técnica de hibridização está relacionada a microrganismos que apresentam como material
56
genético a molécula de RNA, pois são dificilmente detectadas já que esta se encontra em menor
quantidade (Iqbal et al., 2000).
O processo de amplificação do material genético permitiu o maior desenvolvimento de
técnicas de detecção de ácido nucléico. A amplificação exponencial permite a detecção de um
organismo na amostra, fazendo várias cópias do mesmo. Entretanto a maioria dessas técnicas
requer profissionais e procedimentos qualificados (Iqbal et al., 2000).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) descrito por Kary Mullis na década de 80
envolve a amplificação de uma região de ácido nucléico da célula alvo usando um primer ou
iniciador de oligonucleotídeos conhecido. A descoberta e implementação da enzima termoestável
DNA polimerase, oriunda da bactéria Thermus thermophilus com atividade de polimerase e de
transcriptase reversa, e o uso de equipamentos onde se podem programar ciclos de aquecimento e
resfriamento automático, trouxeram melhorias ao protocolo usado no PCR (Iqbal et al., 2000).
Frequentemente, os primers utilizados contêm de 20 a 30 nucleotídeos. A cada ciclo, a molécula
de DNA é desnaturada, formando uma fita simples de DNA, ao resfriar os primers hibridizam
com a seqüência alvo. O resultado é observado em gel de agarose por comparação do tamanho
das bandas obtidas com o padrão de pares de base, utilizados como referência (Figura 10) (Jasson
et al., 2010).
57
Figura 10: Etapas da técnica de PCR.
A identificação de microrganismos a nível de espécie e da diferenciação entre indivíduos
da mesma espécie apresentou avanços nos últimos anos, sendo desenvolvida uma série de novas
técnicas que analisam as variações encontradas no DNA destes microrganismos (Petri et al.,
2013).
Embora o método de análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (Amplified
Ribossomal DNA Restriction Analysis – ARDRA) tenha sido frequentemente utilizado para
caracterização de isolados de bactérias, ele também pode ser usado para análise de populações
microbianas. A técnica de ARDRA envolve o uso de um par de primers universais para a
amplificação do gene codificador do RNAr 16S ou da região espaçadora entre o RNAr 16S e o
RNAr 23S. Em seguida é realizada a digestão com enzimas de restrição e a análise dos perfis
obtidos (Oliveira, 2006).
Área a ser clonada
DNA
“primers”
Polimerase
Nucleotídeos
Desnaturação por calor
Anelamento
dos “primers”
Extensão dos “primers”
Desnaturação
58
A análise de restrição do rDNA amplificado (ARDRA) tem sido usada como um método
rápido e confiável para identificar as principais bactérias ácido láticas envolvidas na produção de
vinho (Zott et al., 2010; Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro, 2012). Essa técnica foi usada por
Rodas e colaboradores (2003) para identificar microrganismos isolados da superfície de uva
detectando espécies de Pediococcus, Lactobacillus e Leuconostoc.
59
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Seleção de microrganismos com interesse tecnológico para indústria de uvas e vinhos
5.1.1. Origem das uvas
A partir de um lote de uvas Vitis vinifera (safra – Janeiro/2012), de uma vinícola de Bento
Gonçalves – Rio Grande do Sul – Brasil, uma amostra de 1,5 kg foi transportada em condições de
refrigeração ao Laboratório de Microbiologia de Alimentos no Instituto de Microbiologia Paulo
de Góes. As uvas íntegras tiveram seus pedúnculos cortados. Posteriormente foi realizada
lavagem com água destilada estéril, destas 60 foram aleatoriamente selecionadas.
5.1.2. Culturas-padrão
As culturas padrão utilizadas nos experimentos foram descritas na Tabela 1.
Tabela 1: Culturas-padrão usadas nos experimentos.
Estirpes Identificação Candida glabrata 50079 (Hagler 1978;39) Candida guilliermondii 50091 (U.C.Davis, Lyph.) Candida guilliermondii 51286 (Rosa 1993) Candida krusei 50148A (Hagler 1978;66) Candida sake 50224 (U.C.Davis, Lyph) Bacillus cereus F 4433 Escherichia coli ATCC 25922 Lactobacillus casei ATCC 393 Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830 Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103 Lactobacillus sakei CECT 906 Lactococcus lactis ATCC 11454 Listeria innocua - Pichia anomala 50407 (Hagler, 1078;200) Pichia pijeperi 52103 (5P5 Carvalho 2007) Saccharomyces cerevisiae 51600 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Sthaphylococcus aureus ATCC 6538 ATCC: American Type Culture Colection; CECT: Colección Española de Cultivos Tipo
60
5.1.3. Isolamento e estocagem dos microrganismos da superfície da uva
As 60 unidades selecionadas do lote de uvas foram lavadas com água destilada estéril e
posteriormente inseridas e homogeneizadas em tubos plásticos de boca larga com 10 mL de caldo
MRS (Himedia®) e incubadas a 30oC. Antes da incubação e após 8 e 24 horas, foram retiradas
alíquotas do meio, semeadas por esgotamento em Agar MRS (Himedia®) e incubadas a 30oC por
até 5 dias em jarra de anaerobiose. Alíquotas da água de lavagem das uvas também foram
semeadas e inoculadas em Agar MRS incubadas como previamente descrito.
Colônias com diferentes características morfológicas foram selecionadas, transferidas para
Agar MRS e incubadas à 30º C por 18-24 horas. Após esse período, as colônias foram coradas
pelo método de Gram, observadas em microscópio óptico, assim como avaliadas quanto à
produção da enzima catalase, segundo a metodologia descrita por Konemman (2001).
Para o teste da presença de enzima catalase, foram utilizadas culturas de um cultivo em
meio sólido. Uma colônia do crescimento foi transferida para uma lâmina de microscopia na qual
era depositada uma gota de peróxido de hidrogênio 3,0% (v/v). A formação de bolhas de gás
indicava a produção da enzima catalase. Como controle positivo foi utilizada a estirpes
Sthaphylococcus aureus ATCC 6538 e como negativo Escherichia coli ATCC 25922.
As estirpes isoladas foram estocadas a -20º C em caldo Infusão de Cérebro e Coração
(Brain Heart Infusion - BHI) contendo 50% de glicerol.
Foram consideradas presuntivamente como bactérias láticas os microrganismos que se
apresentavam morfotintorialmente como: cocos, cocobacilos e bacilos Gram positivos, e que não
produziram a enzima catalase.
5.1.4. Seleção de bactérias láticas produtoras de substâncias antimicrobianas
Para seleção de BAL foi utilizado o teste de spot em Agar descrito por Fleming, Etchells e
Costilow (1975) e Schillinger e Lucke (1989). A partir de um crescimento de 24 horas em caldo
MRS, as culturas presuntivamente classificadas como bactérias láticas foram inoculadas em
61
forma de spot na superfície do Agar MRS. As placas foram incubadas em microaerofilia por 24
horas a 30oC. Após confirmação visual do crescimento, as culturas foram inativadas por
exposição a vapores de clorofórmio por 30 minutos. Após este período as placas foram deixadas
abertas por 30 minutos para a completa eliminação dos vapores. Isoladamente, 500 µL de culturas
com 18 horas de crescimento em caldo BHI foram inoculadas em 5 mL de Agar BHI semissólido
(contendo 0,75% de Agar bacteriológico) fundido e resfriado à 46º C, de modo a se obter 108
UFC/mL dos diferentes patógenos a serem testados, Listeria innocua, Bacillus cereus F4433 e
Staphylococcus aureus ATCC 6538. O meio semi-sólido inoculado com as estirpes indicadoras,
foi vertido sobre a superfície do ágar MRS contendo as estirpes candidatas a produção de
substância antimicrobiana. As placas foram incubadas a 37oC, por 24 horas.
Como controle positivo para produção de bacteriocina, foi utilizado a estirpe Lactococcus
lactis ATCC 11454, produtora da bacteriocina nisina. Como controle de susceptibilidade às
substâncias antimicrobiana, foi utilizado a estirpe L. sakei CECT 906, sensível à maioria das
bacteriocinas. O teste foi considerado positivo pela formação de halo de inibição com diâmetro
superior a 1 mm ao redor do crescimento das estirpes produtoras.
5.1.5. Seleção de bactérias láticas com potencial probiótico
Para determinação de um dos requisitos de avaliação do potencial de ação probiótica,
foram analisadas apenas as estirpes que apresentarem resultado positivo para atividade
antimicrobiana.
5.1.5.1. Resistência ao pH ácido
O teste foi realizado segundo a metodologia descrita por Hou et al. (2003) modificado em
relação à concentração final de células viáveis e ao tempo de avaliação da viabilidade. A partir de
uma cultura em fase logarítmica de crescimento em Agar MRS (Himedia®), foi preparada uma
Escala 0,5 de McFarland, diluída (1:1.000, v/v) em caldo MRS (controle) e caldo MRS
acidificado com HCl 4M (pH 3,5). Ambos os meios continham uma concentração final de células
62
de aproximadamente 1 x 105 UFC/mL. A contagem final de células foi avaliada pela metodologia
de contagem em superfície de placa. A sobrevivência da cultura foi avaliada pela técnica de
contagem em placa na superfície de Agar MRS após 3 horas de incubação a 37 °C em condição
de microaerofilia. Como controle positivo foi usado a estirpe L. lactis ATCC 11454 e a E. coli
ATCC 25922 como controle negativo.
5.1.5.2. Resistência a sais biliares
Foi avaliada segundo metodologia descrita por Huang e Adams (2004). A partir de uma
cultura em fase logarítmica de crescimento em Agar MRS (Himedia®) foi preparada uma Escala
0,5 de McFarland, diluída (1:1000, v/v), que foi dispensada em tubos contendo 5mL caldo MRS
suplementado com 0,3% de bile bovina (Bacto Oxgall, Difco, Le Pont de Claix France) que
foram incubados a 37 °C por 4 horas. Como controle as estirpes foram inoculadas também em
caldo MRS. Após a incubação a viabilidade foi analisada por contagem em placa como descrito
previamente. Como controle positivo foi usado a estirpe L. lactis ATCC 11454 e a E. coli ATCC
25922 como controle negativo.
5.1.5.3. Análise estatística
Os dados obtidos nas análises foram avaliados por estatística descritiva, sendo os
resultados dos testes de tolerância ao ácido e a presença de sais biliares analisados utilizando o
software Statistica versão 7.0, aplicando-se a análise de variância (ANOVA) seguida do teste de
médias de Fisher (LSD), com nível de significância de 5% (Montgomery, 2009).
5.1.6. Seleção de microrganismos pectinolíticos
As estirpes Candida glabrata 50079, Candida guilliermondii 50091 Type, Candida krusei
50148A, Candida sake 50224T, Pichia anomala 50407, Candida guilliermondii 51286,
Saccharomyces cerevisiae 51600 e Pichia pijeperi 52103, foram usadas como controle de
63
produção de pectinase. As estirpes da coleção de culturas do Instituto de Microbiologia Paulo de
Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, foram gentilmente cedidas pelo Professor Allen
Hagler.
O Quadro 12 apresenta a composição do meio utilizado para a detecção de atividade
pectinolítica (Locatelli, 2011).
Quadro 12: Composição do meio de cultura para pesquisa de microrganismos pectinolíticos.
Componentes Concentração (g/L)
Agar 15 Cloreto de potássio 0,5 Pectina 20 Extrato de levedura 1 Fosfato de Potássio dibásico 1 Nitrato de sódio 3 Sulfato de magnésio 0,5 Sulfato de zinco 0,01 Sulfato de ferro 0,01 pH 7,0± 0,2
g: grama, L: litro.
Todos os 485 microrganismos isolados foram testados para produção de pectinase. Após a
incubação por 5 dias a 30oC, as placas foram reveladas com o corante vermelho de rutênio
(0,04% p/v), que cora de vermelho os polissacarídeos e permite a observação de halo ao redor das
colônias que degradaram a pectina. Desse modo, a presença de halo é um indicativo da presença
da enzima pectinase como descrito por Uenojo e Pastore (2006).
64
5.1.7. Identificação molecular dos microrganismos isolados que apresentaram propriedades
tecnológicas de interesse
5.1.7.1. Extração do DNA das culturas analisadas
Foram identificadas geneticamente as culturas de bactérias positivas para presença de
potencial probiótico e para produção de pectinase. Desse modo 9 culturas com potencial
probiótico e 35 culturas de bactérias que apresentaram produção da enzima pectinase foram
analisadas.
As culturas selecionadas para análise molecular foram inoculadas por isolamento em
placas de Petri com meio TSNI (Biomerieux®), incubadas em microaerofilía a 30oC por 48 horas.
De 2 a 3 colônias isoladas foram selecionadas e tranferidas para 100 µL de água MiliQ estéril.
Posteriormente, 100 µL da solução de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) foram adicionados
aos microtubos, e estes foram agitados em homogenizador por 2 minutos para ruptura mecânica
da membrana celular. Após 10 minutos de centrifugação a 14,000xg, 5 µL do sobrenadante foi
utilizado como molde de DNA na reação de amplificação.
5.1.7.2. Amplificação do gene codificador do RNAr 16S por PCR
Conforme metodologia descrita por Wang (2006) foram utilizados os oligonucleotídeos
iniciadores universais (primers) S-D-Bact-0008-a-S-20 (27F) (5’ –
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG – 3’) e S-*-Univ-1492R-b-A-21 (1492R) (5’ –
GGTTACCTTGTTACGACTT – 3’).
As moléculas de DNA extraídos das estirpes obtidos na seção anterior, foram utilizados
como moldes e amplificados em uma reação de PCR, com volume final de 50 µL, contendo 5 µL
de DNA, 5 µL do tampão da enzima 1x e 2,5 mM de MgCl2 (Fermentas®), 1 µL de dNTP
(contendo 0,2 mM de cada nucleotídeo) (Fermentas®) e 1 µL contendo 0,2mM de cada
65
oligonucleotídeo iniciador (27f e 1492r) e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Dream Taq®)
(Fermentas®).
A reação foi realizada em um termociclador Mycycler (Bio-Rad®) com desnaturação à
94oC por 30 segundos, anelamento a 55oC por 30 segundos e elongação a 72oC por 1 minuto.
Com etapa final de alongação a 72oC por 7 minutos. Num total de 44 ciclos.
Os produtos da reação de PCR foram visualizados em gel de agarose a 0,8% em cuba de
eletroforese com tampão TBE (0,5x). Após a corrida realizada a 90 Volts (V) por 30 minutos, os
géis foram corados com GelRed® 1x (Uniscience®) e visualizados sob luz ultravioleta.
5.1.7.3. Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA)
Uma alíquota de 5 µL dos produtos da amplificação foram digeridos com as enzimas de
restrição HaeIII e HhaI (Invitrogen Ltd.) conforme descrito pelo fabricante. Os produtos de PCR
digeridos foram então separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, por 1 hora e 45
minutos a 75V. Os géis foram corados com GelRed® 1X (Uniscience®) e visualizado sob luz
ultra violeta. As sequências com tamanho maior que 1.200 pares de bases foram identificadas em
nível de espécie, quando apresentaram tamanho menor, somente o gênero foi considerado para
identificação.
5.1.7.4. Purificação do material genético
Uma amostra de cada perfil identificado foi amplificado e purificado do gel de agarose
utilizando o kit de purificação de bandas de DNA, illustra TM GFX TM, de acordo com as
instruções do fabricante.
66
5.1.7.5. Identificação molecular por sequenciamento
O sequenciamento genético foi realizado pela MacroGen® (Coréia do Sul). A análise da
sequência foi realizada usando <http://conifergdb.muohio.edu/software/wtm1.2/index.php>.
Acesso em 04 de Março de 2013. Foi realizado o contig das sequências usando o software Bioedit
Sequence Aligment Editor versão 7.1.7 e comparadas no banco de sequências
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.
5.2. Desenvolvimento do meio de cultivo para isolamento de bactérias láticas de interesse para
vitivinicultura
A abordagem experimental escolhida para determinar a melhor composição do meio de
cultura usando a uva e seus derivados como fonte natural de nutrientes, foi um modelo de
misturas com variável de processo. No planejamento experimental de misturas qualquer variação
nos componentes promove uma variação proporcional na resposta, desse modo todos os
componentes são dependentes. Também foi realizado um planejamento experimental fatorial
fracionário, onde foram selecionados os fatores que apresentaram os maiores efeitos. O
planejamento foi realizado com tréplica no ponto central, com objetivo de minimizar falhas no
processo. Ambos os planejamentos experimentais foram realizados usando o software Statistica
7.0.
O meio de cultura, Agar MRS (formulação indicada no quadro 6) comumente utilizado
para cultivo de bactérias láticas foi usado como controle de crescimento das culturas de referência
testadas no meio desenvolvido nesse trabalho.
A variável de resposta consistiu na contagem de unidades formadoras de colônias (UFC)
obtidas nos meios de cultura. Os microrganismos usados nos experimentos foram: Lactobacillus
GG rhamnosus American Type Culture Colection (ATCC) 53103, Lactobacillus delbrueckii
ATCC 7830, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus sake ATCC 806. Os resultados
foram comparados com o crescimento obtido no meio MRS (De Man, Rogosa e Sharpe -
HIMEDIA®), com pH ajustado para 5,5 e autoclavado por 15 minutos.
67
5.2.1. Planejamento de misturas
Componentes como o sulfato de magnésio (0,01% p/v), sulfato de manganês (0,005%
p/v), Agar (1,5% p/v) e glicose (2% p/v), foram mantidos na formulação do novo meio, sem
quaisquer variações (componentes fixos), por serem considerados essenciais para o metabolismo
de BAL. Os componentes analisados como variáveis no planejamento de misturas foram: uva tipo
Isabel e bagaço resultante da extração da uva, provenientes de uma vinícola de Bento Gonçalves,
suco de uva comercial e extrato concentrado por rotavapor retido por nanofiltração elaborado pela
EMBRAPA – Agroindústria de Alimentos.
A Tabela 2 apresenta a matriz de planejamento, considerando apenas o planejamento de
misturas do tipo Simplex-Lattice, com pontos interiores. Os componentes foram: suco, extrato,
uva e bagaço.
Tabela 2: Planejamento de Misturas Simplex-Lattice com Pontos Interiores. Corrida Suco Extrato Uva Bagaço UFC/mL 1 1.000 0.000 0.000 0.000 2 0.000 1.000 0.000 0.000 3 0.000 0.000 1.000 0.000 4 0.000 0.000 0.000 1.000 5 0.500 0.500 0.000 0.000 6 0.500 0.000 0.500 0.000 7 0.500 0.000 0.000 0.500 8 0.000 0.500 0.500 0.000 9 0.000 0.500 0.000 0.500 10 0.000 0.000 0.500 0.500 11 0.625 0.125 0.125 0.125 12 0.125 0.625 0.125 0.125 13 0.125 0.125 0.625 0.125 14 0.125 0.125 0.125 0.625 15 0.250 0.250 0.250 0.250
UFC- unidade formadora de colônia; mL – mililitro
68
5.2.1.1. Obtenção dos componentes analisados no planejamento de misturas
- Extrato concentrado
Para obtenção do extrato concentrado foi utilizado o bagaço de uva Pinot Noir submetido
à vinificação branca. Este foi previamente re-hidratado em água destilada, razão sólido:líquido de
2:1, por uma hora a 30°C. A extração dos compostos bioativos de interesse foi conduzida por 120
minutos sob agitação mecânica de 48 rpm e temperatura controlada de 50°C em tacho
encamisado, empregando-se uma solução aquosa contendo 30% de etanol com o pH ajustado
para 4,0 ± 0,2 com ácido cítrico na proporção de 9:1. A separação das frações foi realizada em
centrífuga de cestos com rotação de 37,5g utilizando como meio filtrante uma malha de nylon de
150 µm. Este extrato foi concentrado em sistema piloto de nanofiltração com membrana
polimérica de poliamida (NF90-2540), plana de conformação espiral, até atingir um fator de
concentração volumétrica de 8. O extrato concentrado teve o etanol removido em rotaevaporador
marca Fisatom® modelo 802, com banho-maria ajustado para 50 °C, rotação do balão de 50 rpm e
pressão de – 700 mmHg obtida pela bomba de vácuo de bancada (Prismatec modelo 131)
acoplada ao sistema. O processo foi conduzido até a redução de 30% da massa inicial.
- Bagaço
O bagaço utilizado consistiu em um composto prensado contendo galhos, sementes, casca
e polpa, acondicionado e transportado sob refrigeração. Foi utilizado o bagaço resultante da
produção do vinho branco, considerado menos prensado, contendo maior quantidade de polpa.
Nenhum tratamento foi previamente realizado. No fracionamento do bagaço preocupou-se em
retirar apenas os galhos e detritos provenientes da colheita, permanecendo apenas polpa, casca e
sementes da uva. O bagaço proveniente da vinícola de Bento Gonçalves foi armazenado em
congelamento (-20oC).
- Uvas
As uvas usadas na elaboração do meio foram cortadas do cacho, lavadas com água
corrente, com posterior separação das unidades danificadas no transporte ou lavagem. Essas
foram armazenadas refrigeradas (7oC).
69
- Suco
O suco comercial utilizado foi “Casa de Bento”, suco de uva tinto, integral, sem adição de
açucares e conservantes, proveniente da Cooperativa Vinícola Aurora Ltda, na serra gaúcha.
Primeiramente, o suco foi filtrado com algodão em funil para retirada de cristais encontrados no
fundo dos frascos. Em seguida, para esterilização, o líquido foi passado em filtros Whatmam™
(110mm – Cat No 1001 110), com uso de bomba de vácuo.
Com auxílio do software foram geradas 15 corridas sendo 1 ponto central, realizado em
tréplica. O somatório dos componentes totaliza 1, o que representa 100% destes no meio.
Posteriormente, os outros componentes fixos foram adicionados ao meio.
5.2.2. Planejamento fatorial fracionário (23-1
)
Na análise das variáveis de processo, foi realizado um planejamento fatorial fracionário,
em que foram selecionados os fatores que apresentam os maiores efeitos (Tabela 3). Os
planejamentos foram realizados com 3 pontos centrais, com o objetivo de determinar o erro
experimental e a existência de curvatura no plano.
O planejamento fatorial apresentou como variável de resposta (dependente) a contagem de
unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL) e as variáveis independentes usadas foram
pH (5,5 e 6,5) e tempo de autoclavação (5 e 15 minutos), com ponto central com pH 6,0 e tempo
de autoclavação de 10 minutos.
Tabela 3: Planejamento fatorial fracionário 22 e 3 pontos centrais
Corrida pH Tempo (min) UFC/mL
1 5,5 5 2 6,5 5 3 5,5 15 4 6,5 15 5 6,0 10
oC: graus célsios; pH: potencial de hidrogênio; min – minutos; UFC- unidade formadora de colônia; mL – mililitro.
70
As variáveis de projeto analisadas nesse experimento foram: pH do meio de cultura (5,0;
5,5 e 6,0) e tempo de autoclavação (5, 10 e 15 minutos). Todos os meios elaborados foram
incubados em duas temperaturas de incubação (30ºC e 37ºC).
Os componentes do meio (fixos e propostos no planejamento) foram homogeneizada em
agitador de tubos tipo Vortex (Vixar – VTXF), o pH aferido em pHmetro de bancada (Quimis –
Q400AS) e ajustado com HCl (4M) ou NaOH (3M). As misturas foram inseridas em frascos
individuais e submetidas à autoclavação por tempo determinado no planejamento. Após
resfriamento, os meios foram vertidos em placas de Petri de plástico (15x60 mm).
71
6. RESULTADOS
6.1. Isolamento de microrganismos com interesse tecnológico para indústria de uvas e vinhos
6.1.1. Isolamento e caracterização morfotintorial de microrganismos isolados
Foram isoladas 485 colônias, incluindo bactérias, fungos e leveduras (Tabela 4).
Tabela 4: Caracterização morfotintorial das estirpes isoladas das uvas em diferentes condições.
Origem da amostra Número de
colônias isoladas
Gram positivas
Gram negativa
Produção da enzima catalase
positiva negativa
Fungos e leveduras
Uvas incubadas em caldo MRS
Após 0h 94 30 16 21 74 30 Após 8h 135 75 38 37 97 21 Após 24h 129 71 44 37 90 31
Água de lavagem 127 20 12 115 14 97 Total 485 196 110 210 273 179
h: horas
Foram isolados 202 fungos e leveduras, 69 bastonetes Gram negativos e foram
caracterizadas presuntivamente como bactérias ácido láticas 189 culturas.
6.1.2. Seleção de estirpes produtoras de substância antimicrobiana semelhante à bacteriocina
A ação inibitória contra Listeria inoccua, foi encontrada em 9 colônias (4,76%) do total
identificado de forma presuntiva como bactéria láctica (Figura 11). Todas as estipes apresentaram
halo de inibição medindo 10 mm de diâmetro contra L. inoccua
72
Figura 11: Atividade antimicrobiana de bactérias láticas isoladas da uva contra Listeria
innocua.
As culturas analisadas não apresentaram ação inibitória contra B. cereus. Todas as culturas
testadas foram capazes de produzir substância antimicrobiana contra S. aureus (Figura 12 a-c),
produzindo halos de inibição que variaram entre 10 e 15 mm.
Figura 12 A,B,C: Atividade antimicrobiana contra S. aureus das 9 culturas caracterizadas como bactérias láticas, isoladas da superfície das uvas. A seta indica o controle positivo L. lactis ATCC 11454 produtor de bacteriocina.
6.1.3. Determinação de características probióticas das culturas isoladas
As 9 estirpes que apresentaram ação inibitória contra patógenos foram testadas para
tolerância ao pH ácido e a sais biliares. Os resultados encontrados estão representados nas tabelas
5 e 6. Os resultados representam uma média de 3 repetições, e teste de Tukey para análise de
diferença significativa realizado no software Statistica versão 7.0.
A B C
73
Tabela 5: Resistência de bactérias láticas isoladas de uva ao pH 3,5
Viabilidade celular (Log UFC/ mL)
Tempo/horas Culturas / Meios de Cultura 0 3
U3 Caldo MRS Controle 9,25ª 9,20a Caldo MRS pH 3,5 9,83ª 9,54a U26 Caldo MRS Controle 9,60a 9,11a Caldo MRS pH 3,5 9,43ª 9,44a U41 Caldo MRS Controle 8,60ª 8,59a Caldo MRS pH 3,5 9,47ª 9,80a U42 Caldo MRS Controle 9,82ª 9,70a Caldo MRS pH 3,5 9,12ª 9,38a U86 Caldo MRS Controle 9,43ª 9,59a Caldo MRS pH 3,5 8,95ª 8,82a U128 Caldo MRS Controle 8,70ª 8,57a Caldo MRS pH 3,5 9,07ª 9,42b U133 Caldo MRS Controle 9,84ª 9,65a Caldo MRS pH 3,5 9,77ª 9,69a U135 Caldo MRS Controle 9,68ª 9,45a Caldo MRS pH 3,5 9,92ª 9,69a U259 Caldo MRS Controle 8,84ª 8,64a Caldo MRS pH 3,5 9,00a 9,00a L.lactis ATCC 11454 Caldo MRS Controle 9,00a 8,80a Caldo MRS pH 3,5 9,30ª 9,75b
Médias seguidas de letras diferentes, na mesma linha, diferem significativamente entre si (p<0,05). pH: potencial de hidrogênio. Log UFC/ mL: Logarítmico de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro. Caldo MRS: Caldo de
Man, Rogosa and Sharpe. L.lactis: Lactococcus lactis American Type Culture Colection 11454
74
Tabela 6: Viabilidade celular das culturas isoladas da superfície da uva em Caldo MRS suplementado com 0,3% de bile.
Viabilidade celular (Log UFC/ mL) Tempo/horas
Culturas / Meios de Cultura O 4
U3 Caldo MRS Controle 8,25ª 8,20a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,33ª 9,74b U26 Caldo MRS Controle 8,65ª 8,81b Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,47ª 9,54a U41 Caldo MRS Controle 9,66ª 9,59a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 8,89ª 8,80a U42 Caldo MRS Controle 9,82ª 9,70a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,12ª 9,38a U86 Caldo MRS Controle 9,55ª 9,59a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,72ª 9,82b U128 Caldo MRS Controle 8,70ª 8,67a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,27ª 9,42b U133 Caldo MRS Controle 8,82ª 8,85a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 8,57ª 8,59a U135 Caldo MRS Controle 9,78ª 9,75a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,32ª 9,29a U259 Caldo MRS Controle 9,34ª 9,30a Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,45ª 9,47a L. lactis ATCC 11454 Caldo MRS Controle 9,00a 9,35b Caldo MRS com 0,3% de sais biliares 9,37ª 9,77b
Médias seguidas de letras diferentes, na mesma linha, diferem significativamente entre si (p<0,05). Log UFC/ mL: Logarítmico de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro. Caldo MRS: Caldo de Man, Rogosa and Sharpe. L.lactis: Lactococcus lactis ATCC 11454.
75
Os resultados demonstram que as 9 culturas testadas foram resistentes ao pH ácido e a
presença de sais biliares. Foi possível observar um crescimento significativo nas culturas U128 e
na cultura controle no meio acidificado, e no meio suplementado com sais biliares foi observado
aumento na contagem de UFC, nas culturas U3, U86, U128 e na cultura de L. lactis ATCC
11454.
6.1.4. Pesquisa de presença da enzima pectinase
As 485 colônias isoladas foram testadas para produção de atividade pectinolítica, já que
na literatura bactérias, fungos e leveduras apresentam essa característica. As culturas que
apresentaram halo transparente ao redor do seu crescimento foram consideradas positivas (figuras
13 e 14). Dentre 485 estirpes isoladas, 94 (19,38%) possuíam atividade pectinolítica. Destas, 35
(37,23%) eram bactérias e 59 (62,77%) fungos e leveduras.
Figura 13: Triagem para determinação de microrganismos com atividade pectinolítica, a
partir de revelação por vermelho de rutênio. A presença do halo foi considerada positivo
para presença da enzima.
76
Figura 14: Estirpes isoladas da uva produtoras de atividade pectinolítica. As setas indicam dois controles positivos Candida krusei 50148 e Pichia anomala 50407.
As culturas apresentaram halos de 4 a 15 milímetros (mm).
6.1.5. Identificação molecular dos microrganismos isolados com interesse tecnológico
As nove culturas que apresentaram algumas das características exigidas para serem
classificadas com potencial probiótico, ou seja, produção de antimicrobiano contra patógeno,
resistência a pH ácido e a bile, foram identificadas por técnicas de biologia molecular. No
ARDRA (figura 15) foi observado que todas as culturas eram do mesmo gênero e espécie já que
apresentavam o mesmo padrão de bandas quando digeridas com as enzimas de restrição. Após o
sequencimento do perfil representativo destas nove estirpes, as mesmas foram identificadas como
Leuconostoc mesenteroides.
Figura 15: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a nas nove culturas com potencial probióticoe a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base, presente no Kb (DNA ladder) utilizado. pb: pares de base. • Perfil de bandas obtidos para estirpes testadas correspondente á Leuconostoc
Também foram analisadas pela técnica de ARDRA
apresentaram presença da enzima pectinase
gel do ARDRA para 27 das culturas analisadas.
Figura 16: Perfil de bandas obtidos por ARDRA aem 18 culturas com atividade pectinolítica(Genevuler 1Kb Plus DNA ladder
pares de base.
15: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima com potencial probiótico. As setas superiores indicam o padrão de bandas (Kb)
e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base, presente no Kb () utilizado. pb: pares de base. • Perfil de bandas obtidos para estirpes testadas
Leuconostoc.
am analisadas pela técnica de ARDRA 35 culturas de bactér
apresentaram presença da enzima pectinase. Nas figuras 16 e 17 pode-se observar a revelação em
gel do ARDRA para 27 das culturas analisadas.
Figura 16: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima com atividade pectinolítica. As setas superiores indicam o padrão de bandas
Genevuler 1Kb Plus DNA ladder) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. pb:
77
enzima HhaI realizados dicam o padrão de bandas (Kb)
e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base, presente no Kb (Genevuler 1Kb Plus
) utilizado. pb: pares de base. • Perfil de bandas obtidos para estirpes testadas
35 culturas de bactérias que
se observar a revelação em
enzima HhaI realizados As setas superiores indicam o padrão de bandas
) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. pb:
Figura 17: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a em 9 culturas com atividade pectinolítica(Genevuler 1Kb Plus DNA ladder
pares de base.
Não foi possível analisar os perfis das culturas 16 e 17. Dentre os outros foram
identificados 8 perfis diferentes indicados na Tabela 7.
Tabela 7: Relação entre as estirpes isoladas e o perfil de bandas obtidosno ARDRA.
Perfil de bandas
Quantidade de cepas
• 12 ⁰ 11 ∆ 5 + 1 * 1 Ø 1 ≈ 1 † 2
: Perfil de bandas obtidos por ARDRA após tratamento com a enzima com atividade pectinolítica. As setas superiores indicam o padrão de bandas
Genevuler 1Kb Plus DNA ladder) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de b
Não foi possível analisar os perfis das culturas 16 e 17. Dentre os outros foram
identificados 8 perfis diferentes indicados na Tabela 7.
Tabela 7: Relação entre as estirpes isoladas e o perfil de bandas obtidosno ARDRA.
Estirpes correspondentes
U3,U4,U26,U41,U42,U86,U128,U132,U133,U135,U239,U259U5,U32,U47,U75,U85,U118,U141,U159,U203, U230,U235U2,U8, U55, U113,U291 U16 U145 U37 U82 U35,U65
78
enzima HhaI realizados As setas superiores indicam o padrão de bandas
) e a seta lateral indica a banda com 1.500 pares de base. pb:
Não foi possível analisar os perfis das culturas 16 e 17. Dentre os outros foram
Tabela 7: Relação entre as estirpes isoladas e o perfil de bandas obtidosno ARDRA.
Estirpes correspondentes
U3,U4,U26,U41,U42,U86,U128,U132,U133,U135,U239,U259 U5,U32,U47,U75,U85,U118,U141,U159,U203, U230,U235
79
Uma a duas estirpes de cada perfil foram enviadas para sequenciamento e os resultados
obtidos estão descriminados na tabela 8.
Tabela 8: Identificação molecular por sequenciamento das cepas com perfil de bandas destintos.
Quantidade de cepas isoladas
Código da cepa
Similaridade (%)
Espécie identificada Número de acesso
Tamanho do
fragmento (pb)
Perfil de
bandas
11
U5
100
Klebsiella
pneumoniae
JQ072599.F
1.053
⁰
5 U8 99 Klebsiella sp. JF274779.1 1.407 ∆ 1 U16 100 Paenibacillus sp. HQ600992.1 1.377 + 2 U35 99 Bacillus sp. HG662640.2 989 † 1 U37 99 Bacillus subtilis FR687210.1 1.366 Ø 11 U75 99 Klebsiella sp. JF274779.1 1.398 ⁰ 1 U145 99 Cellulosimicrobium
funkei
JQ659850.1 1.380 *
12 U239 100 Leuconostoc sp. KC417012.1 42 • 1 U275 98 Leuconostoc
mesenteroides
HM058686.1 1326
pb: pares de bases
6.2. Desenvolvimento de meio de cultura para isolamento de bactérias láticas de interesse na
vitivinicultura
6.2.1. Meios de cultura
Foram desenvolvidos 105 meios diferentes na composição e nas condições de pH e tempo
de autoclavação, todos incubados a 30ºC e a 37ºC. Foi observado que as misturas com mais de
25% de bagaço na sua composição, não ficavam homogêneas e a solidificação pelo Agar não foi
possível.
A variável de resposta neste trabalho foi a contagem de UFC/mL obtida com o meio de
cultura desenvolvido. Entretanto, houve uma quantidade significativa de casos em que não foi
observado crescimento do microrganismo. De modo a não obter uma falsa análise de dados, os
80
casos onde não houve crescimento para as 4 culturas testadas foram excluídos na análise. No
quadro 13 podem-se observar as corridas que foram consideradas na analise estatística.
81
Quadro 13: Resultado da contagem de colônias para as corridas do planejamento.
Repetições Suco Extrato Uva Bagaço L.rhamnosus GG
Log UFC/mL L. delbrueckii Log UFC/mL
L. casei
Log UFC/mL
L. sake Log UFC/mL
pH do meio
Tempo de autoclavação
Temperatura incubação (
oC)
1 100 0 0 0 6,30 7,56 7,11 6,48 5,5 5 30
1 0 0 100 0 7,67 7,65 0 0 5,5 5 30
1 50 50 0 0 0 7,58 0 0 5,5 5 30
1 50 0 50 0 7,54 7,68 0 0 5,5 5 30
1 0 50 50 0 1,61 7,60 7,34 7,78 5,5 5 30
1 0 0 50 50 7,61 7,62 7,30 7,60 5,5 5 30
1 100 0 0 0 0 7,63 7,53 7,56 6,5 5 30
1 0 0 100 0 7,17 7,72 7,73 7,66 6,5 5 30
1 50 50 0 0 6,77 7,71 7,65 7,62 6,5 5 30
1 50 0 50 0 7.34 7,80 7,75 7,71 6,5 5 30
1 0 50 50 0 0,84 7,59 7,67 7,60 6,5 5 30
1 0 0 50 50 7,63 7,62 7,34 7,61 6,5 5 30
1 100 0 0 0 7,04 7,80 0 0 5,5 15 30
1 0 0 100 0 7,50 7,72 0 0 5,5 15 30
1 50 50 0 0 7,17 7,49 0 0 5,5 15 30
1 50 0 50 0 6,90 7,71 7,66 7,70 5,5 15 30
1 0 50 50 0 1,50 7,46 0 7,60 5,5 15 30
1 0 0 50 50 7,67 7,64 7,38 7,59 5,5 15 30
1 100 0 0 0 7,25 7,62 0 0 6,5 15 30
1 0 0 100 0 7,45 7,72 7,67 7,46 6,5 15 30
1 50 50 0 0 6,60 7,56 0 0 6,5 15 30
1 50 0 50 0 7,59 7,60 7,81 7,86 6,5 15 30
1 0 50 50 0 1,47 7,45 7,23 7,49 6,5 15 30
1 0 0 50 50 7,60 7,63 7,30 7,60 6,5 15 30
82
1 62,5 12,5 12,5 12,5 0 6,30 0 0 6,5 15 30
3 0 0 100 0 7,41 7,59 0 0 6 10 30
3 50 50 0 0 6,70 7,77 7,70 7,43 6 10 30
3 50 0 50 0 7,11 7,70 7,74 7,60 6 10 30
3 0 50 50 0 1,63 7,71 7,65 7,52 6 10 30
3 0 0 50 50 7,63 7,61 7,25 7,58 6 10 30
1 100 0 0 0 6,30 7,75 8,03 7,72 5,5 5 37
1 0 0 100 0 7,95 7,81 8,04 8,00 5,5 5 37
1 50 50 0 0 7,68 7,72 8,01 7,83 5,5 5 37
1 50 0 50 0 7,50 7,63 7,95 8,01 5,5 5 37
1 0 50 50 0 7,98 7,46 8,12 7,50 5,5 5 37
1 0 0 50 50 7,70 7,67 7,50 7,65 5,5 5 37
1 100 0 0 0 6,78 7,65 8,00 7,94 6,5 5 37
1 0 100 0 0 6,30 0 0 0 6,5 5 37
1 0 0 100 0 7,77 7,84 8,07 7,97 6,5 5 37
1 50 50 0 0 7,90 7,75 8,00 7,87 6,5 5 37
1 50 0 50 0 7,46 7,64 8,15 7,87 6,5 5 37
1 0 50 50 0 7,92 7,81 8,15 7,93 6,5 5 37
1 0 0 50 50 7,71 7,68 7,52 7,66 6,5 5 37
1 62,5 12,5 12,5 12,5 7,77 0 0 0 6,5 5 37
1 100 0 0 0 7,72 7,65 8,00 7,83 5,5 15 37
1 0 0 100 0 7,95 7,77 0 0 5,5 15 37
1 50 50 0 0 6,00 7,53 7,98 7,90 5,5 15 37
1 50 0 50 0 7,61 7,62 8,20 7,97 5,5 15 37
1 0 50 50 0 7,56 7,86 7,84 7,75 5,5 15 37
1 0 0 50 50 7,73 7,72 7,48 7,60 5,5 15 37
1 100 0 0 0 7,32 7,49 8,07 7,89 6,5 15 37
1 0 0 100 0 7,84 7,72 8,04 7,95 6,5 15 37
83
1 50 50 0 0 7,43 7,38 7,67 7,82 6,5 15 37
1 50 0 50 0 7,43 7,90 8,08 7,78 6,5 15 37
1 0 50 50 0 7,76 7,83 8,00 7,61 6,5 15 37
1 0 0 50 50 7,75 7,67 7,50 7,63 6,5 15 37
1 62,5 12,5 12,5 12,5 7,53 6,45 0 0 6,5 15 37
3 100 0 0 0 0 0 7,99 7,73 6 10 37
3 0 0 100 0 7,95 7,70 8,02 7,87 6 10 37
3 50 50 0 0 6,60 7,73 7,70 7,67 6 10 37
3 50 0 50 0 0 7,81 8,04 7,83 6 10 37
3 0 50 50 0 7,53 7,74 8,00 7,78 6 10 37
3 0 0 50 50 7,72 7,65 7,46 7,61 6 10 37
3 62,5 12,5 12,5 12,5 0 7,23 0 0 6 10 37
L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo da unidade formadora de colônias por mililitro; pH: potencial de hidrogênio; oC: grau Celsius
84
Os meios elaborados apresentaram características diferentes em relação a sua
consistência e coloração. As colônias apresentaram características morfológicas
diferenciadas, como pode ser observado na Figura 18.
Figura: 18 (A e B) Meios elaborados com 100% e 50% de uva, respectivamente. (C) Meio constituído de 100% de suco. (D) MRS – meio controle. Nas figuras A, B e C, observam-se as colônias de Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103 com pigmentação, diferente das encontradas no MRS.
Devido ao fato de alguns experimentos gerados no planejamento não permitirem o
crescimento das culturas de lactobacilos, houve a necessidade de excluí-los da tabela, desse
modo não foi possível analisar o planejamento de misturas com o programa Statistica 7.0.
Para fazer uma análise comparativa entre os meios, onde foi observado crescimento
bacteriano os dados na tabela foram ordenados de forma decrescente para determinar em
que condição foi observado o maior crescimento da célula em questão (Tabela 9).
A B
C D
85
Tabela 9: Melhores condições de pH, temperatura de incubação, tempo de autoclavação e formulação do meio para o crescimento de bactérias láticas.
Microrganismos Maior contagem obtida
(LogUFC/mL)
pH Temperatura de incubação
(oC)
Tempo de autoclavação
(min)
Formulação do meio
Contagem obtida no
MRS
L. GG rhamnosus ATCC 53103 7,98 5,5 37 5 50% uva + 50%
extrato
7,74
L. delbrueckii ATCC 7830 7,90 6,5 37 15 50% uva + 50% suco
7,78
L. casei ATCC 393 8,20 5,5 37 15 50% uva + 50% suco
6,18
L. sake CECT 906 8,01 5,5 37 5 50% uva + 50% suco
7,65
pH: potencial de hidrogênio; L:Lactobacillus; ATCC: American Type Culture Collection; oC: grau Celsius; min: minutos.
De acordo com a tabela, pode-se observar que todos os lactobacilos apresentaram
maior crescimento na temperatura de incubação de 37ºC. O pH 5,5 foi determinado como
ótimo para três dos lactobacilos analisados, com exceção apenas para o L. delbrueckii, que
apresentou melhor crescimento no pH 6,5. L. GG rhamnosus e L. sakei obtiveram o melhor
crescimento com o meio autoclavado por apenas 5 minutos, enquanto os outros
apresentaram melhor crescimento em meio com autoclavação de 15 minutos. A formulação
do meio que permitiu melhor crescimento dentre os microrganismos analisados foi de 50%
de uva e 50% de suco, com exceção apenas para o L. GG rhamnosus que teve melhor
crescimento em meio com 50% de uva e 50% de extrato.
Para melhor visualização dos resultados obtidos com a observação dos dados
ordenados de forma decrescente, os dados foram expressos na forma de Diagramas de
Caixas (Box & Whisker) e das Medias (Means Plot), para os 4 lactobacilos analisados,
naqueles meios desenvolvidos onde foi observado melhor crescimento de colônias (figuras
19-26). Dentre os resultados não foi observada diferença estatístisca nos crescimentos
realizados nas temperaturas analisadas.
86
Box & Whisker Plot: L. delbrueckii Log UFC/mL
Mean Mean±SD Mean±1.96*SD
30 37
Temperatura incubação (oC)
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
L.
de
lbru
ec
kii
Lo
g U
FC
/mL
Figura 19: Diagrama de caixa para o Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colonias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
Box & Whisker Plot: L.rhamnosus GG Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
L.r
ham
nosus G
G L
og U
FC
/mL
Figura 20: Diagrama de caixa para o Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
87
Box & Whisker Plot: L. casei Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
8.2
8.4
8.6
L.
cas
ei
Lo
g U
FC
/mL
Figura 21: Diagrama de caixa para o Lactobacillus casei ATCC 393, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
Box & Whisker Plot: L. sake Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
L. sake L
og U
FC
/mL
Figura 22: Diagrama de caixa para o Lactobacillus sake CECT 906, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 5 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colonias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
88
Box & Whisker Plot: L.rhamnosus GG Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
L.r
ham
nosus G
G L
og U
FC
/mL
Figura 23 : Diagrama de caixa para o Lactobacillus GG rhamnosus ATCC 53103, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colonias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
Box & Whisker Plot: L. delbrueckii Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
L. delb
rueckii L
og U
FC
/mL
Figura 24 : Diagrama de caixa para o Lactobacillus delbrueckii ATCC 7830, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
89
Box & Whisker Plot: L. casei Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
8.2
8.4
8.6
L. casei Log U
FC
/mL
Figura 25 : Diagrama de caixa para o Lactobacillus casei ATCC 393 usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
Box & Whisker Plot: L. sake Log UFC/mL
Mean
Mean±SD
Mean±1.96*SD 30 37
Temperatura incubação (oC)
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
L. sake L
og U
FC
/mL
Figura 26: Diagrama de caixa para o Lactobacillus sake CECT 906, usando Agar Uva com pH 5,5 e autoclavado por 15 minutos. L: Lactobacillus; Log UFC/mL: logaritmo de unidades formadoras de colônias por mililitro; oC: grau Celsius; Mean: média; SD: desvio-padrão.
90
O objetivo da representação dos resultados em Box & Whisker, foi determinar se
houve diferença na contagem dos microrganismos analisados, após incubação por 48 horas
nas temperaturas de 30ºC e 37ºC. Desse modo, os quatro microrganismos analisados foram
inoculados nos 105 meios, elaborados pelo planejamento de misturas com variáveis de
processo, incubados nas duas temperaturas selecionadas. Nos gráficos foram comparados
apenas os meios com pH 5,5, autoclavado por 5 e 15 minutos, onde foram observados as
maiores crescimentos. Nas figuras 17 a 24, foi possível observar que a melhor temperatura
de incubação foi de 37ºC.
Nas figuras 27 a 30, foi observada a interação entre os três fatores do planejamento
fatorial: tempo de autoclavação, temperatura de incubação e pH. Para determinar em qual
condição, foi obtido o maior crescimento.
pH 5,5
pH 6,5
Temperatura incubação (oC): 30
5 15
Tempo de autoclavação
7.0
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
L.r
ham
nosus G
G L
og U
FC
/mL
Temperatura incubação (oC): 37
5 15
Tempo de autoclavação
Figura 27 : Gráfico das Médias para L. GG rhamnosus ATCC 53103 Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
Em relação ao L. GG rhamnosus a melhor condição de crescimento foi em pH 5,5,
com temperatura de incubação de 37oC e o tempo de autoclavação não influenciou no
resultado.
91
pH 5,5
pH 6,5
Temperatura incubação (oC): 30
5 15
Tempo de autoclav ação
7.0
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
L.
de
lbru
ec
kii L
og U
FC
/mL
Temperatura incubação (oC): 37
5 15
Tempo de autoclav ação
Figura 28 : Gráfico das Médias para L.delbrueckii ATCC 7830. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
O meio com pH ajustado para 6,5 e autoclavado por 5 minutos foi o melhor para o
crescimento de L. delbrueckii, quando incubado a 37ºC.
92
pH 6,5
pH 5,5
Temperatura incubação (oC): 30
5 15
Tempo de autoclav ação
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
L.
ca
sei
Log U
FC
/mL
Temperatura incubação (oC): 37
5 15
Tempo de autoclav ação
Figura 29 : Gráfico das Médias para L.casei ATCC 393. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
A maior contagem de colônias de L. casei foi obtida no meio com pH 5,5 e incubado
a 37ºC. O tempo de autoclavação no meio não interferiu no resultado.
93
pH 6,5
pH 5,5
Temperatura incubação (oC): 30
5 15
Tempo de autoclav ação
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
L.
sa
ke
Log
UF
C/m
L
Temperatura incubação (oC): 37
5 15
Tempo de autoclav ação
Figura 30: Gráfico das Médias para L. sakei CECT 906. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; oC: grau Celsius; pH: potencial de hidrogênio.
O pH de 5,5 e a incubação a 37ºC promoveram o maior crescimento de L. sake, o
tempo de autoclavação não interferiu nos resultados.
Na análise dos gráficos das Médias foi novamente possível confirmar a observação
feita na ordenação das variáveis de resposta obtidas.
94
Com objetivo de determinar qual variável do planejamento de misturas apresentava
maior influência no crescimento dos microrganismos analisados, os meios foram
comparados em relação ao percentual dos componentes em que foram observados os
maiores crescimentos (Figuras 31 e 32).
Figura 31: Comparação entre meios de cultivo com 100% ou 50% de suco em relação ao crescimento de colônias das estirpes analisadas. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro;
Os meios elaborados com 50% de suco promoveram um melhor crescimento de L.
sake e L. GG rhamnosus. No caso dos lactobacilos L. casei e L. delbrueckii, o maior
crescimento foi obtido no meio com 100% de suco, entretanto esta diferença foi menos
significativa.
6
6.5
7
7.5
8
8.5
L.rhamnosus L.casei L. delbrueckii L. sake
100% Suco 50% suco
Log
UFC
/mL
Microrganismos analisados
95
Figura 32: Comparação entre meios de cultivo com 100% ou 50% de uva quanto ao crescimento de colônias das estirpes analisadas. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; L: Lactobacillus.
Todas as estirpes analisadas apresentaram maior crescimento no meio com 100% de
uva. Com a comparação entre os meios com 100% e o meio MRS usado como controle,
obteve-se o resultado expresso na Figura 33.
6
6.5
7
7.5
8
8.5
L.rhamnosus L.casei L. delbrueckii L. sake
100% Uva 50% UvaLo
gU
FC/m
L
Microrganismos analisados
96
Figura 33: Comparação entre meios de cultivo com 100% de uva e meio MRS. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; L: Lactobacillus, MRS: de Man,
Rogosa and Sharpe.
Foi observado que para os 4 microrganismos analisados, o crescimento no Agar
com 50% de uva, foi maior do que no Agar MRS. A maior diferença, em torno de 2 ciclos
logarítmicos, foi encontrada para o L. casei.
A elaboração do meio de cultura com uva e seus derivados teve por objetivo
potencializar o isolamento de microrganismos da superfície da uva. De modo a determinar
se o meio elaborado e as condições determinadas como ideais, seriam adequadas para
microrganismos isolados da superfície da uva. A cultura U3 isolada da uva,
presuntivamente identificada como BAL, identificada como Leuconostoc sp., foi testada
nos meios desenvolvidos (Figura 34).
4
5
6
7
8
9
L.sake L.casei L.delbrueckii L.rhamnosus
Agar MRS Agar UVALo
g U
FC/m
L
Microrganismos analisados
97
Figura 34: Comparação entre meios de cultivo formulados com uva e suco de uva e meio MRS. Log UFC/mL: logaritmo de unidade formadora de colônia por mililitro; MRS: de Man, Rogosa and
Sharpe, pH: potencial de hidrogênio; min: minutos.
O meio de cultivo elaborado com 100% de uva e pH 5,5 apresenta o melhor
resultado, seguido do meio com 50% de uva e 50% de suco. A faixa de pH onde se
observou os melhores resultados foi 5,5 e 6,0 e os tempos de autoclavação de 10 e 15
minutos. A maior contagem de colônias foi observada no meio MRS, entretanto não houve
diferença estatística entre este e o meio com 100% de uva.
6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5
U3
50% suco + 50% uva pH 6,0 - 10 min
100% Uva pH 6,0 - 10 min
100% Uva pH 5,5 - 15 min
MRS
Log UFC/mL
98
7. DISCUSSÃO
Os microrganismos são importantes na indústria de vinho e suco de uva. Eles são
responsáveis pelo próprio processo de elaboração do vinho e por agregar características
sensoriais desejáveis ao vinho. Além de serem responsáveis por processos de
beneficiamento do suco aumentando seu rendimento. Entretanto, o uso de microrganismos
comerciais eleva os custos do produtor. Um microrganismo isolado da superfície da uva
pode apresentar características únicas para o melhoramento da vinícola. Entretanto, o
isolamento de culturas selvagens é prejudicado pela necessidade de adaptação do
microrganismo às mudanças nas condições de sobrevivência, como pH, oferta de nutrientes
e quantidade de água disponível. As técnicas moleculares auxiliam no isolamento de
microrganismos, porém quando são encontrados em baixa quantidade, estas isoladamente
não são eficientes, sendo também necessária a utilização de técnicas de cultivo.
No caso dos lactobacilos, eles apresentam exigências nutricionais e de incubação
complexas, muitas vezes semelhantes com outros microrganismos taxonomicamente
relacionados. As condições incluem meio rico e levemente acidificado (pH 4,5 – 6,4),
incubação em microaerofilia ou anaerobiose e temperatura mesofílica (15 – 40oC) (Sutula,
Coulthwaite e Verran, 2012). O meio comumente usado para cultivo de lactobacilos são os
de Man Rogosa Sharpe (MRS), Lactobacillo Selective Agar e Rogosa Agar. A superfície
das uvas apresenta uma microbiota mais complexa, dificultando o isolamento de gêneros
como o lactobacilos. Uma série de tentativas podem ser empregadas como adição de
substratos que favoreçam o crescimento como agentes redutores, vitaminas, minerais,
alterações nas condições de temperatura de incubação, ajuste de pH, adição de indicadores
de pH e adição de agentes seletivos (antibióticos, bile, cloreto de lítio e propionato de
sódio) para melhorar o isolamento dos microrganismos (Sutula, Coulthwaite e Verran,
2012).
As bactérias láticas são fastidiosas, o que atrapalha no estudo do seu crescimento e
sua capacidade metabólica. Além disso, as condições da superfície da uva podem
influenciar na microbiota e no seu estado fisiológico, afetando o isolamento destes
microrganismos. Desse modo, há necessidade de um meio de enriquecimento, com
características necessárias, semelhantes as da sua origem, para induzir o crescimento e
99
desenvolvimento de células viáveis e cultiváveis (Renouf e Lonvaud-Funel, 2007; Terrade
et al. , 2009).
Portanto nesse trabalho foi desenvolvido um meio de cultura sólido, não seletivo
que foi comparado com meio MRS. A melhor formulação desenvolvida foi determinada
como a que apresentou a maior faixa de crescimento dentre as culturas analisadas. A
composição do meio que apresentou melhor resultado na maioria dos microrganismos
analisados foi 50% de uva e 50% de suco. Esta formulação apresentou uma atividade de
água alta o suficiente para as necessidades dos microrganismos e quantidades satisfatórias
de nutrientes, além de um baixo teor de substâncias inibitórias. Baran e colaboradores
(2001) estudando o desenvolvimento de meios de cultura baseados em maçã também
observaram que a melhor composição foi encontrada ao utilizar 50% da fruta propriamente
dita, e concluiram que, neste caso o maior crescimento dos microrganismos foi devido a um
maior teor de água disponível.
A presença da fruta no meio permite uma maior disponibilidade de nutrientes
naturais. Terrade e colaboradores (2009) determinaram que para aumentar o isolamento de
BAL, era necessária adição de vitaminas. Neste trabalho presume-se que a adição da uva,
satisfaça as necessidades minerais dos microrganismos em questão. Entretanto deve-se
levar em consideração que o meio elaborado foi autoclavado, e a exposição a altas
temperaturas pode destruir as vitaminas e minerais sensíveis ao calor. Desse modo foram
utilizados diferentes tempos de autoclavação (5, 10 e 15 minutos) para avaliar a influência
deste fator no crescimento nos meios de cultivo. A partir dos resultados, foi possível
observar que a variação do tempo de autoclavação não influenciou no crescimento dos
microrganismos analisados. Mais estudos para avaliar as alterações físico-químicas nos
componentes do meio desenvolvido são necessários, de modo a minimizar perdas
nutricionais com o calor, além de diminuir o tempo utilizado para elaboração do meio.
Neste trabalho foi observado que a autoclavação por 5 minutos foi suficiente para os fins
desejados.
No estudo de Terrade e colaboradores (2009) foi desenvolvido um meio para
cultivo de BAL, o melhor resultado foi encontrado quando a fonte de carbono utilizada foi
a ribose. Os meios foram ajustados para os seguintes valores de pH: 3,6; 3,8 e 4,0. As BAL
100
utilizadas para determinar as condições do meio foram as seguintes: O. oeni, L. brevis, L.
plantarum, L. pasteurianus, L. delbrueckii e P. pentosaceus. Os autores obtiveram
melhores resultados com os meios desenvolvidos, quando comparados com o meio
comercial MRS. O pH 5,0 foi considerado o ideal para o crescimento dos microrganismos
analisados pelos autores, resultado próximo ao pH 5,5 determinado neste trabalho como
melhor para o crescimento das BAL analisadas. Entretanto, o meio de cultura elaborado por
Terrade apresenta 44 componentes, enquanto o meio desenvolvido nesse trabalho apresenta
apenas 7 componentes, tendo sua formulação mais simples.
De acordo com Gogus (2006), a fonte de carbono e de nitrogênio e suas
concentrações são de grande interesse na indústria, para diminuir o custo do meio de
cultura. Desse modo o uso de resíduos agroindustriais para a elaboração de meio de cultura
para cultivo de microrganismos é de interesse para indústria. O uso do resíduo não auxiliou
no crescimento dos microrganismos analisados, e foi um fator limitante na elaboração do
meio de cultura. O longo período de armazenamento sob refrigeração pode ter interferido
na sua utilização. Desse modo, talvez haja a necessidade de um tratamento prévio do
resíduo, além de evitar o acondicionamento por longo período.
Neste trabalho foi utilizada como fonte de carbono a glicose, além nos nutrientes já
encontrados na uva. De acordo com Metsoviti e colaboradores (2011) a fonte de carbono
usada no meio de cultivo é determinante para o rendimento das características tecnológicas
das cepas cultivadas. De acordo com Metsoviti e colaboradores, a fonte de carbono que
melhor estimula a produção da substância antimicrobiana é a glicose, potencializando a
atividade antimicrobiana. Neste estudo, cepas de Leuconostoc mesenteroides foram
identificada, por sequenciamento do gene codificador do RNAr 16s. Estas apresentaram
resistência a sais biliares e ao pH 3,5, além de produção de susbtância antimicrobiana,
podendo ser considerada BAL e candidata ao uso com potencial probiótico. Estudos
demonstram o isolamento deste microrganismo da superfície da uva.
Os métodos baseados na amplificação por PCR de regiões do RNA ribossomal 16s,
seguidos de análise de restrição são considerados mais simples, sendo usados para
diferenciar espécies. Essa técnica foi usada para diferenciar microrganismo da microbiota
da superfície da uva. A análise de restrição do RNA ribossomal amplificado (ARDRA) tem
101
sido usada como um rápido e confiável método para identificar as principais BAL
envolvidas na produção de vinho (Zott et al., 2010; Barata, Malfeito-Ferreira e Loureiro,
2012). Esta técnica foi usada por Rodas e colaboradores (2003) para identificar
microrganismos da superfície de uva e foram detectadas espécies de Pediococcus,
Lactobacillus e Leuconostoc. Estudos demonstram que a espécie Leuconostoc
mesenteroides é comumente isolada da superfície de uvas (Coton et al., 2010; González-
Arenzana et al., 2013). Entretanto há poucos trabalhos analisando seu potencial probiótico
e aplicabilidade tecnológica. O isolamento de microrganismos do bagaço de uva com a
técnica ARDRA – 16s RNA por Maragkoudakis e colaboradores (2013) identificou as
seguintes espécies de bactérias: Tatumella terrea, Acetobacter ghanensis, Tatumella
ptyseos, Oenococcus oeni e Lactobacillus plantarum. Entretanto nenhuma das culturas
apresentaram atividade antimicrobiana.
Ainda é necessária a caracterização da substância antimicrobiana para classificá-la
como bacteriocina. O tratamento com proteinase é necessário para confirmar a natureza
protéica da substância antimicrobiana, além da determinação da atividade quantitativa do
antimicrobiano, produção e concentração da substância antimicrobiana, determinação do
espectro de ação, avaliação da sensibilidade química e física, susceptibilidade à enzimas,
determinação da massa molecular, análise da atividade bacteriostática ou bactericida e a
cinética de produção (Metsoviti et. al., 2011).
Além da produção de substância antimicrobiana semelhante à bacteriocina a
espécie identificada foi isolada em outros trabalhos e classificada como uma das
responsáveis pela fermentação malolática espontânea em vinhos, podendo ser usada para o
beneficiamento do vinho devido à produção de substâncias sensoriais de interesse (Ruiz et
al., 2010; García-Ruiz, 2012; Petri et al., 2013).
A xilana é um dos maiores componentes da hemicelulose na parede celular de
plantas, sendo o segundo polissacarídeo mais abundante após a celulose. Na natureza, a
completa hidrólise da xilana requer uma ação sinérgica entre diferentes enzimas
xilanolíticas. Ao longo dos anos, uma série de xilanases vêm sendo obtidas a partir de
microrganismos como bactérias, actinomicetos, fungos e leveduras. Estas enzimas são
principalmente investigadas para sua aplicação na hidrólise de resíduos agroindustriais. Os
102
microrganismos celulolíticos são encontrados amplamente em ecossistemas, como no solo.
Um dos microrganismos mais usados para obtenção desse maquinário enzimático é o
Cellulosimicrobium sp., isolado neste trabalho. O uso de culturas comerciais com esta
propriedade é limitado pelo elevado custo e pelo baixo rendimento destas quando aplicados
na prática. Entretanto a hidrólise de lignocelulose presente no bagaço de uva por cepas
celulolíticas isoladas do próprio resíduo, aumenta o interesse por esses microrganismos. Na
tentativa de aumentar o rendimento e diminuir o custo, o próprio bagaço é aplicado no meio
de cultivo para estimular a produção da enzima. Dessa forma, há uma minimização do
impacto do resíduo agroindustrial no meio ambiente (Kim et al., 2009; Kim et al., 2009; Lo
et al., 2009; Daí et al., 2010; Song e Wei, 2010; Kim et al., 2011; Kim et al., 2011; Tanabe
e Oda, 2011; Kamble e Jadhav, 2012)
Estudos afirmam que apesar de avanços na genética na fisiologia microbiana terem
apresentado impacto na produção de enzimas, programas de screening para a seleção de
microrganismos aptos a produzir moléculas bioativas, continua tendo importância
biotecnológica. No caso de microrganismos pectinolíticos, um fator que influencia na
otimização da identificação da presença da enzima é a formulação do meio. De acordo com
Gogus (2006) há uma relação próxima entre a formulação do meio e a produção secundária
de produtos. Neste trabalho o meio formulado com 20% de pectina mostrou-se eficiente na
seleção de microrganismos pectinolíticos.
Dentre as culturas isoladas 18% apresentaram atividade pectinolítica, percentual
semelhante ao encontrado por Uenojo e Pastore (2006), que foi de 17%. Dados da literatura
relatam que os maiores produtores de pectinase são as leveduras. Isso também foi
observado neste trabalho onde mais de 60% das culturas positivas para atividade
pectinolítica, foram classificadas morfologicamente como leveduras. Perfil semelhante
também foi encontrado em isolados da floresta tropical brasileira (Buzzini e Martini, 2002).
As medidas do raio total do halo das colônias produtoras de pectinase variaram de 0,4 a 1,5
centímetros. Os resultados obtidos neste trabalho são semelhantes aos encontrados por
Hankin, Zucker e Sands (1971), onde as medições de halo total das colônias variou de 0,4 a
1,3 cm, entretanto menor do que as medições encontradas em isolados de resíduos
agroindustriais por Uenojo e Patore, em 2006 (1,3 a 7,0 cm).
103
A presença de cocos gram negativos, com atividade pectinolítica tem sido
reportada como de origem de resíduos agro-industriais. Portanto a identificação de novas
espécies é desejada. Entretanto uma maior caracterização da enzima para aplicação no
manejo desses resíduos e outras aplicações deve se realizada (Kumar e Sharma, 2012;
Sharma, Rathore e Sharma, 2012).
O gênero Bacillus possui mais de 60 espécies e é comumente encontrado no
ambiente. Existem muitas classificações para esse gênero, a mais utilizada divide as
diferentes cepas em 3 grandes grupos, que contém as espécies mais relevantes e
conhecidas, agrupadas principalmente pelo tamanho das células e características dos
esporos. O grupo I é formado por espécies semelhantes ao Bacillus cereus, o grupo II
espécies semelhantes ao Bacillus subtilis e o grupo III espécies relacionadas
taxonomicamente com Bacillus circulans, relacionada ao controle biológico e
principalmente relacionada à atividade antifúngica, com produção de quitinase (Estay,
2006). Neste trabalho foram isolados dois Bacillus sp e dois Bacillus subtilis, produtores de
pectinase. Podendo ser aplicados na degradação do bagaço resultante da vitinivicultura já
que estudos desmonstram que são capazes de produzir pectinaliase, poligalacturonase,
xilanase e celulase (Das et al., 2012). Neste trabalho foram identificados 3 Bacillus
produtores de pectinase. De acordo com Ping e colaboradores (2011) o bagaço de uva é
composto por 36% celulose, 34% lignina, 24% hemicelulose e 6% tanino, desse modo um
microrganismo com capacidade para secretar celulase é de grande importância para a
aplicação na diminuição do resíduo da vitivinicultura.
As culturas de uva são suscetíveis a fitopatógenos, e agrotóxicos como fungicidas,
utilizados na tentativa de evitar danos às uvas e seus derivados. Devido os riscos agregados
a estas substâncias, aumenta o interesse de microrganismos que possam proteger as plantas
desses agressores. Em um trabalho prévio, estirpes isoladas do gênero Paenibacillus
apresentaram ação inibitória contra fungos patogênicos de plantas (Antonopoulos et al.,
2008). No presente trabalho 12 cepas destes microganismos também foram isoladas com
atividade pectinolítica, porém mais estudos são necessários para a aplicação deste
microrganismo para essa finalidade. Entretanto, a presença de estirpes desse gênero na
104
superfície da uva pode indicar uma possível ação de proteção específica da própria
microbiota da uva em defesa contra patógenos externos.
105
8. CONCLUSÃO
� Nove cepas de Leuconostoc mesenteroides (U86, U133, U259, U135, U3, U42, U41,
U26, U128) produziram substância antimicrobiana contra L. inoccua e S. aureus
ATCC 6538. Esta propriedade deve ser melhor caracterizada e suas propriedades
tecnológicas avaliadas a fim de serem usadas na vitivinicultura;
� As nove cepas de Leuconostoc mesenteroides (U86, U133, U259, U135, U3, U42,
U41, U26, U128) mostraram-se boas candidatas para o uso como probióticos
embora sejam necessários estudos adicionais para assegurar suas propriedades
benéficas à saúde e de segurança, incluindo ensaios in vivo;
� Doze cepas de Paenibacillus sp. (U16, U5, U1, U75, U55, U113, U118, U474,
U463, U454, U430 e U417) e duas cepas de Bacillus sp. (U35 e U37) apresentaram
atividade pectinolítica, entretanto tais enzimas devem ser caracterizadas;
� Foi isolada uma cepa de Cellulosimicrobium funkei (U145) bactéria descrita com
presença de ação celulolítica, podendo ser usada na degradação do resíduo
agroindustrial da vitivinicultura;
� Três cepas de Leuconostoc sp. (U239, U4 e U132) apresentaram atividade
pectinolítica podendo ser utilizado simultaneamente para o clareamento do suco e
como possibilidade de agir como agente probiotizante. Entretanto suas propriedades
benéficas e seguranças devem ser caracterizadas assim como as enzimas pectinases;
� O meio desenvolvido que apresentou melhor resultado para o isolamento e cultivo
de lactobacilos foi composto por 50% de uva e 50% de suco, com pH de 5,5 e
autoclavado por 5 minutos.
106
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
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