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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

CURSO DE DOUTORADO

DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO

IMUNOENZIMTICO (ELISA) PARA DIAGNSTICO DE

LINFADENITE CASEOSA EM OVINOS E CAPRINOS

Aline Najara Domingos Gonalves

CAMPO GRANDE, MS

2017

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

CURSO DE DOUTORADO

DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO IMUNOENZIMTICO

(ELISA) PARA DIAGNSTICO DE LINFADENITE CASEOSA EM

OVINOS E CAPRINOS

Development of an immunoenzimactic test (ELISA) for diagnosis of caseous

lymphadenitis in sheep and goats

Aline Najara Domingos Gonalves

Orientadora: Prof. Dr. Grcia Maria Soares Rosinha

Tese apresentada Universidade Federal de

Mato Grosso do Sul, como requisito

obteno do ttulo de Doutora em Cincia

Animal.

rea de concentrao: Sade Animal.

CAMPO GRANDE, MS

2017

Dedico este trabalho minha me, Selma, e

minha av Benedita que, muitas vezes, doaram-

se e renunciaram aos seus sonhos para que eu

pudesse realizar os meus. Quero dizer-lhes que

essa conquista no s minha, mas nossa. Tudo

que consegui s foi possvel, graas ao amor,

apoio e dedicao que as senhoras sempre

tiveram por mim. Sempre me ensinaram a agir

com respeito, simplicidade, dignidade,

honestidade e amor ao prximo. Ao meu pai,

Gilmar, e ao meu pai de corao, Edivaldo, aos

meus irmos Kau e Cssio. Graas unio de

todos, os obstculos foram ultrapassados; as

vitrias foram conquistadas; e as alegrias,

divididas. Ao meu esposo, Edimilson, pela

pacincia e compreenso, durante essa longa

jornada.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me conceder o dom da vida e sade, permitindo assim, que eu siga meus

sonhos, por me trazer foras, mesmo nas adversidades e tribulaes e por me amar.

minha famlia, que o alicerce mais forte da minha existncia e que me permitiu

ser o qu sou, dando fora afetiva, impulsionando-me em, absolutamente, todos os momentos.

Me e v Dita, tenho certeza de que nada seria possvel sem as senhoras - Graduao,

Mestrado e, tampouco, Doutorado. Aos meus primos, desculpa pela ausncia, mas obrigada

pelo incentivo.

Ao meu esposo, obrigada pela sua fora, dedicao, compreenso e confiana em

mim, enfim, pela sua presena em minha vida.

s minhas amigas Marry e Anna L, por todas as vezes que me ajudaram na

obteno dos artigos, por todas as vezes que rimos juntas, por nos ajudarmos sempre, por

serem luz em minha vida e por nossa amizade, que foi alm das paredes do laboratrio e

assim permanecer.

Goretti, no apenas tcnica do LEGA, mas tambm minha amiga. Obrigada pelo

seu auxlio sempre que precisei!

Aos amigos Cleber, Matheus, Juliana, Nayana, Jennyfer e Lvia, pela amizade e

apoio. Vocs moram em meu corao!

Aos colegas que passaram pelo Laboratrio de Engenharia Gentica Animal, ao

longo desses anos de Doutorado.

Aos meus colegas da Agraer, que sempre me deram palavras de incentivo, no

decorrer dessa caminhada, em especial, Eliane, mesmo no integrando mais a equipe.

Deixei-lhe na mo por vrias vezes, porque precisava estudar, mas sei que compreende e se

orgulha do meu esforo.

minha orientadora, Prof. Dr. Grcia Rosinha, no somente por sua compreenso

com as transies que aconteceram, nos ltimos dois anos do curso, pela oportunidade

concedida, por acreditar em meu trabalho e no desistir de mim, mas, sobretudo, por sua

competncia terica e seus ricos ensinamentos, durante todo o Doutorado.

Dr. Lenita Ramires, pelos ensinamentos e pacincia, por toda a ajuda que me deu,

ao longo dessa jornada.

Ao Dr. Flbio Ribeiro de Arajo, pela contribuio na otimizao da sequncia do

gene xa1 e nos custos de sntese e clonagem deste, realizados pela Empresa Genone

Biotechnologies.

Ao pesquisador da Embrapa Gado de Corte, Fernando Reis, por todo apoio e ajuda

durante as coletas para obteno das amostras de soros.

Prof. Dr. Cssia Leal, por todo o suporte e auxlio para a execuo dos testes

bioqumicos realizados na UFMS/FAMEZ.

Ao Gerente Regional da Agraer Campo Grande, Slvio Vargas, por sua compreenso

durante a fase de estgio probatrio, por permitir-me as idas Embrapa para a finalizao

deste trabalho.

CAPES, pelo apoio financeiro, por meio da concesso da bolsa de estudos.

FUNDECT, pelo financiamento da pesquisa, concedido para a realizao do

trabalho.

Ao Programa de Doutorado em Cincia Animal da Universidade Federal de Mato

Grosso do Sul, pela oportunidade, e a todos os professores que dividiram comigo seus

conhecimentos e que fizeram de mim uma profissional melhor.

Embrapa Gado de Corte, por disponibilizar os laboratrios e pelo convvio com

pessoas maravilhosas que ali trabalham.

Enfim, a todos que, de alguma forma, contriburam para este trabalho ou que,

simplesmente, torceram para que eu obtivesse sucesso. A todos, muito obrigada!

Tem dia que a gente pe vrgula, tem dia que

colocamos reticncias, tem dia que colocamos ponto

final e tem dia que temos a necessidade de virar a

pgina.

Padre Fbio de Melo

Resumo

GONALVES, A. N. D. Desenvolvimento de um ensaio imunoenzimtico (ELISA) para diagnstico de linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. 65f. 2017. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, 2017. A Linfadenite Caseosa (LC) uma doena infectocontagiosa, causada pela bactria Corynebacterium pseudotuberculosis e que acomete ovinos e caprinos. Esta doena caracterizada por leses purulentas e caseosas nos gnglios linfticos e, ocasionalmente, pulmes, bao, rins e fgado. O diagnstico da LC, normalmente, baseado em sinais clnicos, no entanto, o teste padro ouro o isolamento microbiolgico, realizado a partir do material purulento dos abcessos. Faz-se necessrio um mtodo que seja capaz de diagnosticar animais doentes, com presena ou no de abcessos externos. Neste contexto, visto os esforos para identificar e controlar a doena, objetivou-se, neste estudo, avaliar o potencial da protena XA1 recombinante (XA1r) de C. pseudotuberculosis como candidata a compor um teste sorolgico do tipo ELISA indireto, para o diagnstico de linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. A sequncia do gene xa1, que codifica a poro hidroflica da protena XA1, foi selecionada com o auxlio do programa Protean (DNASTAR). Esta sequncia e a construo do plasmdeo de expresso gnica foram sinteticamente confeccionadas pela empresa de biotecnologia Genone Biotechnologies. O gene xa1 foi clonado em plasmdeo de expresso em procariotos pET-47b(+). O plasmdeo pet47Bxa1 foi introduzido em clula quimicamente competente de E. coli Rosetta-Gami e realizada a expresso gnica XA1r foi purificada por cromatografia de afinidade, em resina metlica com a coluna de agarose nquel, dialisada em PBS, quantificada pelo mtodo de Lowry e armazenada a -20C. Posteriormente, um teste de ELISA indireto foi padronizado com o uso desta protena como antgeno sistemtico (n= 23), assintomticos (n= 10) e histrico de LC (n= 10). O banco formado com soros de caprinos foi composto por soros positivos (n=29), negativos (n=19), soros de animais de um rebanho com histrico de LC (n= 15) e outros soros de caprinos com sinais clnicos da doena (n= 29), totalizando 92 soros. O ponto de corte foi feito por meio da curva ROC. O teste de ELISA indireto foi capaz de discriminar animais positivos e negativos, com sensibilidade de 90,9% e especificidade de 72,2%. Foram identificados cinco animais como falso-positivos e trs foram considerados falso-negativos. Quando testados os animais dos trs grupos - testes assintomticos, histrico de LC e controle sistemtico -, 90,7% foi considerado positivo para LC. O teste de ELISA indireto para diagnstico de LC em caprinos apresentou sensibilidade de 96,6% e especificidade de 67,2%. O teste de ELISA apresentou um animal falso-negativo e seis falso-positivos. A associao do teste de ELISA indireto, proposto a exames clnicos, foi capaz de diagnosticar como positivos 96,55% dos animais que possuam sinal clnico da doena, mostrando assim, o potencial da protena XA1r no reconhecimento de anticorpos contra C. pseudotuberculosis. Os resultados demonstram a potencialidade da protena XA1r, quando utilizada como antgeno em teste ELISA indireto. Deste modo, este imunoensaio poder ser utilizado para o diagnstico de ovinos e caprinos com LC, auxiliando no controle da doena. Palavras-chave: Linfadenite Caseosa. Corynebacterium pseudotuberculosis. Ovinos. Caprinos. ELISA.

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Abstract

GONALVES, A. N. D. Avaluation of recombinant antigen of corynebacterium pseudotuberculosis in sorological test for diagnosis of caseosa lymphenenite in goats and sheep/tese. 65f. 2017. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, 2017. Lymphadenitis Caseosa (LC) is an infectious disease, caused by the bacterium Corynebacterium pseudotuberculosis and affecting sheep and goats. This disease is characterized by purulent and caseous lesions in the lymph nodes and, occasionally, the lungs, spleen, kidneys and liver. The diagnosis of CL is usually based on clinical signs, however, the gold standard test is microbiological isolation, perfor