Profa. Dra. Vanessa Silveira

ALTERAÇÕES MOLECULARES COMO CAUSA DE DOENÇAS

GENÉTICAS

Genoma Humano - DNA

§  Variações genéticas

§  Alterações §  Erros de replicação do DNA §  Erros durante a divisão celular

§  Agentes externos §  Mutagênicos químicos §  Vírus

Ø  Somáticas: não transmissíveis

Ø Germinativas: herdáveis

Alterações genéticas - mutações

Tecido somático

Tecido germinativo

Progênie normal

Progênie normal

Progênie com mutação

Setor mutante

Setor mutante

1. Marcadores genéticos

Ø  Um locus que tenha alelos facilmente classificáveis e que possa ser usado em estudos genéticos.

Ø  Pode ser um gene ou um sítio de enzima de restrição, bem como qualquer característica do DNA que permita que versões diferentes de um locus (ou seu produto) sejam distintas umas das outras e seguidas nas famílias

Variabilidade genética

Qualquer característica situada na mesma região em um par de cromossomos homólogos que permite distinguir um homólogo do outro

Variabilidade genética

q  Modificação no material genético de um organismo

q  Alteração fenotípica?

q  Fonte da variabilidade

q  Variações no genoma - novos alelos

q  Matéria prima para o processo de evolução

q  Recombinação: Rearranjo da variabilidade

§  Desenvolvimento de marcadores genéticos

Marcadores moleculares - Definição

q  Sequências de DNA herdáveis e distintas

q  São baseados na ocorrência natural de polimorfismos de DNA

q  Adições/deleções de poucas bases

q  Substituições, inserções

q  Deleção/Duplicação

q  Repetições

I.  Polimórficos

II.  Herança co-dominante

III.  Distribuídos aleatoriamente pelo genoma

IV.  Fácil detecção

V.  Reprodutibilidade

Informativos

2. Tipos de marcadores moleculares

Polimorfismos genéticos

SSLP

Microssatélite

STR

Minissatélite

VNTR

SNP RFLP CNV

Mutações

3. Identificação de genes de doenças humanas

Perspectiva histórica

1865 Gregor Mendel, Leis da hereditariedade

1866 Johann Miescher, Purificação do DNA

1953

1970 Tecnologia do DNA Recombinante

1977 Sequenciamento de DNA

1985 Amplificação In Vitro do DNA (PCR)

2001 Projeto Genoma Humano

Watson and Crick, Estrutura do DNA

Anemia Falciforme, Mutação 1949

Linha do Tempo

Evolução histórica:

¤ 1953: Watson e Crick - Estrutura do DNA

¤ 1956: Estabelecimento do número de cromossomos

¤ A genética especialidade clínica;

¤ 1959: ¤  Síndrome de Down. ¤ Anormalidades cromossômicas

¤  Translocação, mosaicos, triploidias e microdeleções.

q  1960-1973: Cromossomo Filadélfia

q  Técnicas de identificação de cromossomos q  Citogenética-molecular

q  Mapeamento citogenético

q  Hibridização in situ

Evolução Histórica:

•  Técnicas de mapeamento:

•  1968: Gene do Daltonismo

•  1980: Análise de células somáticas através do uso de sondas

•  1983-1993: Mapeamento do 1º gene - Doença de Huntington

Mapeamento gênico

Mapa gênico humano §  30.000 genes nos 24 cromossomos §  Identificação de genes responsáveis por doenças humanas §  Aplicação ao diagnóstico a aconselhamento genético

Mapeamento físico

Reflexo da distância física

Mapeamento genético

Análise de ligação

Era Pós Genoma

Método Objetivo Híbridos de células somáticas (roedor/humana)

Localização no cromossomo

Mapeamento de híbrido de radiação Localização regional

Análise de dosagem gênica Cromossomo X e regional

Hidridização in situ com fluorescência (FISH)

Cromossomo/regional dentro de uma banda

FISH de fibra de cromatina/restrição de longo alcance

Mapeamento fino da região gênica

C l o n a g e m e m c r o m o s s o m o s artificiais/ bactérias

Clonagem gênica (f ragmentos grandes ou médios e pequenos)

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Clonagem e mapeamento gênico

Sequenciamento de DNA Sequência de nucleotídeos

Métodos de mapeamento

Ø  Cromatografia Líquida desnaturante

Ø  Sequenciamento

Indivíduo com alteração

4. Diagnóstico de doenças genéticas

q  Detecção de alterações no DNA ou RNA

q  Viabilizar o diagnóstico, detecção, sub-classificação, prognóstico, etc

Diagnóstico molecular

q  Expansão do conhecimento científico

q  Identificação de indivíduos e determinação de risco

de doenças específicas

q  Diagnóstico molecular - Revolução

Base do diagnóstico molecular

Causa

Mecanismo (Patogênese)

Alterações estruturais

Consequências funcionais

Impacto

Marcadores moleculares

Hematologia

Oncologia

Doenças genéticas

Identificação Indivíduos

Farmacogenômica

Entendimento da patogênese molecular das doenças

humanas permite o uso efetivos dos ensais moleculares

q Diagnóstico

q  Prognóstico

q  Terapia: predição de resposta terapêutica

q  Mutações que diminuem a eficiência do tratamento em

cancêr de pulmão por exemplo (k-ras, p53)

Hemoglobinopatias

Ø Anemia Falciforme Ø  Talassemias

Ø Medicina Forense

Ø Mapeamento genético

Ø Medicina clínica

Ø Interferência na expressão gênica Ø eQTL - Expression quantitative trait loci

Ø Variantes genéticas que interferem com a expressão de

genes associados a doenças complexas

Ø  Ex. Obesidade

Anemia Falciforme

¤  Causa:

¤  Substituição de um único

nucleotídeo

¤  cadeia B da hemoglobina

¤  Linus Pauling

¤  Determinou o início do

diagnóstico molecular

Hemáceas normais

Hemáceas falciformes

¤  Genótipos:

¤  HbA HbA – Hemáceas normais

¤  HbS HbS – Anemia servera; hemáceas em forma de foice

¤  HbA HbS – Não ocorre anemia, mas hemáceas adquirem

forma de foice sob baixas concentrações de oxigênio

Hemáceas normais

Hemáceas falciformes

q  Alelos: HbA, HbS

q  Códon CAG- CTG

Hemoglobinopatias

Ø Variantes

Ø  S, Anemia falciforme

Ø C, D Los Angeles

Ø  Talassemias

Ø Alfa

Ø  Beta

Desordens neuromusculares

Ø  Distrofia Muscular de Duchene

Ø  Distrofia de Becker

Ø  Atrofia muscular espinhal (SMN1)

Ø  Deteção de portadores

Procedimento cirúrgico

Teste para aberrações cromossômicas

Distrofia Muscular de Duchene

Microssatélites X Desordens de repetição

¤  Doença de Huntington

¤  Autossômica dominante

¤  Acúmulo de Repetições ..CAG..

¤  Penetrância influenciada pela idade

Normal

Huntington

Desordens genéticas

Ø Desordens trombóticas

Ø Mutações

Ø  Fator de Leyden

Ø  Fator II

Ø Demais desordens

Ø  Fibrose cística: 4 mutações

Ø Doença de Tay Sachs

Ø  Síndrome do X Frágil

Ø  Síndrome de Frederich (Ataxia)

Ø Distrofia muscular miotônica

Ø  PCR Ø  Sequenciamento

Oncologia

q  Diagnóstico

q  Estratificação de grupos de risco

q  Seguimento terapêutico q  Amplificação MYCN – Neuroblastoma

q  Translocações

q  t9;22

q  t4;11

q  t12;21

q Doença residual mínima

q Marcadores de rearranjos de imunoglobulina

q  Identificação clonal

q  Síndrome mielodisplásica

q  Leucemia mielóide crônica

q  Leucemia linfóide aguda

Cromossomo filadélfia- Ph1

Leucemia mielóide crônica

ü  Tirosino quinase

ü  Imatinibe 46, XX, t(9;22)(q34; q11.2)

Aplicação em genética médica

Ø  Utilização como marcador genético: análise de ligação

Ø  Diagnóstico pré-natal de doenças genéticas

Ø  Detecção de portador heterozigoto

Ø  Avaliação de pessoas com risco de predisposição a doenças complexas: câncer, doenças coronarianas e diabete

Ø  Teste de paternidade e aplicações forenses

Ø  Tipagem tissular para transplante de órgão

Exercício de fixação

q  Descrever uma aplicação do uso de alterações moleculares em medicina clínica q  Caracterização da alteração molecular

q  Doença