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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Análise bioquímica inicial do proteassoma em
populações do Trypanosoma cruzi com
diferentes fenótipos de resistência ao
benzonidazol
Tiago Ferreira Leal
Ouro Preto
2010
Catalogação: [email protected]
L435a Leal, Tiago Ferreira.
Análise bioquímica inicial do proteassoma em populações do Trypanosoma
cruzi com diferentes fenótipos de resistência ao benzonidazol [manuscrito] /
Tiago Ferreira Leal. - 2010.
xiii, 73 f.: il., color.; grafs., tabs.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Guerra de Sá.
Co-orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
1. Tripanossomo - Teses. 2. Drogas - Resistência - Teses. I. Universidade
Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 616.937
Tiago Ferreira Leal
Análise bioquímica inicial do proteassoma em
populações do Trypanosoma cruzi com
diferentes fenótipos de resistência ao
benzonidazol
Dissertação submetida ao programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas, área de concentração
Biologia Molecular.
Orientação: Dr.ª Renata Guerra de Sá
Co-orientação: Dr. Milton Hércules Guerra
Ouro Preto – MG
Junho de 2010
iii
Tudo o que somos é resultado do que pensamos.
Se uma pessoa fala ou age com mau pensamento, o sofrimento a segue como as rodas seguem
o pé dos bois que puxam o carro.
Se a pessoa fala ou age com pensamento puro, a felicidade a segue, como a sombra que nunca
a abandona.
(Budha)
iv
AGRADECIMENTOS
A ``todos nós falhos, que acreditamos que o amor governa. Levantemo-nos e deixemos que
ele brilhe. ``
Aos meus pais, pelo amor;
À minha irmã querida, a primeira;
À Prof.a Dr.
a Renata Guerra de Sá, pela ousadia de nos entusiasmar a estudar bioquímica do T.
cruzi, além claro, de fazer-me apto em todos os aspectos que posso imaginar a seguir esta
carreira que tanto almejo;
Ao Prof. Dr. Elísio Alberto Evangelista, por sempre estar disposto a me ajudar,
principalmente com a tal proteólise endógena;
Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra pelos ensinamentos (principalmente nos arranjos
técnicos) e ao Prof. Dr. Willian de Castro Borges pela compreensão de meus
questionamentos;
À Prof.a Dr.
a Marilene Demasi e toda sua equipe, que me receberam de portas abertas em seu
laboratório;
À Prof.a Dr.
a Silvane Murta, pelos parasitos, anticorpo e ajuda na confecção do artigo
referente a esta dissertação;
Ao Prof. Dr. Elio Hideo Babá, pela convivência tão agradável;
Aos demais professores do LBBM, Prof.a Dr.
a Maria Lúcia Pedrosa, Prof.
a Dr.
a Daniela
Caldeira Costa, Prof. Dr. Leandro Márcio Moreira, por terem escutado minhas reclamações ao
vento;
Aos demais Professores do Núcleo (NUPEB) que cederam gentilmente espaço e
equipamentos imprescindíveis à conclusão desta dissertação;
v
À Roberta Versiano e Natália por serem tão especiais, da minha turma, mas que eu só
descobri quando fui trabalhar no LBBM.
À Karina Barbosa (Sandy), por alegrar a todos;
À Ni-chan por me agüentar no lab, na sua casa, na sua república. Grande conselheira;
À equipe do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular da UFOP, que participou da
minha formação científica: Matheus, Eneida, Ezequiel, Roberta D’angelo, Priscila, Cássio,
Helaine, Naiara (baiana), Roenick, Nayara, Leonardo (Pipeta), Leandro (Nerso), Leandro
(Bartira), Victor, Diego e Gustavo.
Aos colegas que fiz pelo corredor durante o mestrado;
A Cida;
À república Maracangalha que me manteve em pé durante estes sete anos que passei em Ouro
Preto e a todos Maracangalhanos com quem tive a oportunidade de conviver. Com certeza
hoje sou um homem muito melhor do que ontem;
Às instituições que colaboraram para a realização deste trabalho: Oswaldo Cruz, Butantã
CNPq, Capes, FAPEMIG e UFOP.
vi
Dedico essa dissertação a todos.
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................................................... VIII
LISTA DE TABELAS ......................................................................................................................................... IX
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................................. X
RESUMO ............................................................................................................................................................. XI
ABSTRACT ....................................................................................................................................................... XII
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 14
1.1 O Trypanosoma cruzi ........................................................................................................................ 15
1.2 Catabolismo proteico no T. cruzi ....................................................................................................... 16
1.3 O proteassoma .................................................................................................................................... 19
1.3.1 O proteassoma 20S ................................................................................................................... 20
1.3.2 O proteassoma e seus reguladores ........................................................................................... 22
1.4 Proteassoma em T. cruzi .................................................................................................................... 25
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 29
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................................... 30
2.2 Objetivos específicos .......................................................................................................................... 30
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................................... 31
3.1 Populações de T. cruzi ....................................................................................................................... 32
3.2 Obtenção do extrato bruto ................................................................................................................. 33
3.3 Medida da atividade peptidásica do proteassoma 20S ...................................................................... 33
3.4 SDS-PAGE e ensaios de Western blot ................................................................................................ 34
3.5 Análise das proteínas oxidadas .......................................................................................................... 35
3.6 Eletroforese nativa do proteassoma ................................................................................................... 35
3.7 Determinação da taxa de proteólise intracelular não lisossomal ..................................................... 36
3.8 Análise estatística ............................................................................................................................... 36
4 RESULTADOS ....................................................................................................................................... 38
4.1 A atividade peptidásica do proteassoma ............................................................................................ 39
4.2 As populações apresentam níveis similares do proteassoma 20S e HslV .......................................... 41
4.3 Perfil de expressão dos reguladores Pa700 e PA26........................................................................... 43
4.4 Mobilidade eletroforética dos proteassomas nativos ......................................................................... 45
4.5 Perfil dos conjugados ubiquitinados .................................................................................................. 46
4.6 Perfil das proteínas oxidadas ............................................................................................................. 47
4.7 Degradação protéica intracelular, não lisossomal no T. cruzi .......................................................... 48
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................................... 52
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................................................ 62
7 PERSPECTIVAS .................................................................................................................................... 64
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................... 66
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de vida do T. cruzi.
Figura 2: Esquema geral da forma epimastigota do T. cruzi mostrando suas
principais estruturas celulares.
Figura 3: O proteassoma 20S.
Figura 4: Abertura dos poros dos anéis α pela ação dos ativadores do proteassoma
20S.
Figura 5: O proteassoma 26S.
Figura 6: A cascata de ubiquitinação.
Figura 7: Extrato bruto fracionado em SDS-PAGE gel 12%.
Figura 8: Expressão relativa da subunidade α7 do proteassoma 20S.
Figura 9: Expressão relativa do HslV.
Figura 10: Expressão relativa da subunidade RPN7 da partícula ativadora PA700.
Figura 11: Expressão relativa da subunidade PA26 da partícula ativadora PA26.
Figura 13: Perfil das proteínas conjugadas a ubiquitina.
Figura 14: Perfil das proteínas oxidadas.
Figura 15: Perfil das proteínas ubiquitinadas após a incubação na presença de
ubiquitina bovina e ATP.
Figura 16: Proteólise intracelular não lisossomal em T. cruzi.
Figura 17: Proteólise intracelular não lisossomal em Leishmania sp.
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Atividade peptidásica do proteassoma 20S do T. cruzi.
Tabela 2: Inibição da atividade peptidásica do proteassoma 20S do T. cruzi.
x
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP: Adenosina trifosfato
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3 indolil-fosfato
Bz: Benzonidazol
Be-62: Berenice-62
Be-78: Berenice-78
Col: Colombiana
DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: ácido desoxirribonucléico
DNPH: 2,4-Dinitrophenylhydrazine
DTT: Dithiothreitol
DTU: Discrete typing units (Tybayrenc, 1998)
g: aceleração da gravidade
HCl: Ácido clorídrico
HslV: heat shock locus V
HslU: heat shock locus U
Ig: Imunoglobulina
kDa: quilo Dalton
kDNA: DNA mitocondrial dos Kinetoplastidae
LIT: Liver infusion tryptose
xi
M: Molar
mA: Miliamper
MgCL2: Cloreto de magnésio
mL: Mililitro
mM: Milimolar
NaCl: Cloreto de sódio
NBT: Nitrobluetetrazolium
nm: Nanômetro
nM: Nanomolar
PA: Proteasome ativator
pH: Potencial hidrigeniônico
PM: Padrão de massa molecular
PSI: Proteasome Sintetyc Inhibitor
SDS: sódio dodecil sulfato
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Tris: Tris-hidroximetilaminometano
WHO: World Health Organization
µg: micrograma
µL: microlitro
ºC: Graus Celsius
xii
Resumo
Diferenças na susceptibilidade ao benzonidazol (Bz) e nifurtimox (NFX) entre as
populações do Trypanosoma cruzi podem explicar, pelo menos em parte, as diferenças
na eficácia do tratamento da Doença de Chagas. O proteassoma tem um papel
importante na degradação de proteínas normais, danificadas, mutadas, ou desnaturadas,
incluindo a degradação de proteínas reguladoras das diversas vias celulares, tais como
ciclo celular e apoptose e proteínas danificadas em resposta ao estresse. Este trabalho
teve como objetivo geral analisar se o perfil de expressão e a taxa de proteólise
intracelular dependente de proteassoma são afetados pelo fenótipo de resistência às
drogas. Para isso, foram utilizadas populações de T. cruzi com o mesmo genótipo e
resistência induzida in vitro (17WTS / 17LER) e in vivo (BZS / BZR), bem como
diferentes genótipos, uma população susceptível (CL) e outra naturalmente resistente
(Colombiana) ao benzonidazol. Inicialmente os níveis do proteassoma 20S, proteassoma
símile HslV, PA700 e a PA26 foram avaliados por Western blot. Os resultados obtidos
mostraram que não há efeito do fenótipo das cepas sobre a quantidade relativa tanto do
proteassoma 20S, HslV, como dos seus reguladores. Posteriormente, as atividades
peptidásicas do proteassoma 20S foram avaliadas utilizando-se substratos
fluorogênicos. Foram observadas variações significativas na atividade semelhante à
quimotripsina, tripsina, e caspase do proteassoma, sendo que somente a atividade
semelhante à tripsina mostrou-se correlacionar com o fenótipo de resistência ao
benzonidazol. Finalmente foi avaliada a taxa de proteólise intracelular nas mesmas
populações, na presença de ATP, ATP e ubiquitina e ATP, ubiquitina e MG132, um
inibidor clássico do proteassoma 20 e 26S. Os resultados obtidos sugerem que a adição
de ubiquitina não induziu um aumento real na taxa de proteólise, além disso, observou-
se um aumento real na proteólise após 90 minutos de indução na presença de ATP,
sugerindo a coexistência de mecanismos de proteólise dependente de proteassoma e
independente de ubiquitina. Para corroborar essa hipótese, foram avaliados os níveis de
proteínas oxidadas e ubiquitinadas. Os resultados sugerem um perfil similar de proteína
ubiquitinadas e diferencial para as oxidadas. Em conjunto, os resultados obtidos nesse
trabalho sugerem que o steady state protéico em epimastigota é influenciado pela
resistência a droga. Futuros experimentos serão realizados para determinar quais
proteínas são os alvos naturais desta via metabólica.
xiii
Abstract
Differences in susceptibility to benznidazole (Bz) and nifurtimox (NFX) among
populations of Trypanosoma cruzi may explain, at least in part, the differences in
efficacy of treatment of Chagas disease. The proteasome has an important role in the
degradation of normal proteins, damaged, mutated, or denatured, including the
degradation of regulatory proteins of different cellular pathways such as cell cycle,
apoptosis and damaged proteins in response to stress. This study intended to examine
whether the expression profile and the rate of proteasome-dependent intracellular
proteolysis are affected by the phenotype of drug resistance. For this, we used
populations of T. cruzi with the same genotype and resistance induced in vitro (17WTS
/ 17LER) and in vivo (BZS / BZR) and populations with different genotypes, a
susceptible (CL) and naturally resistant (Colombian) to benznidazole. Initially, the
levels of 20S proteasome, proteasome-like HslV, PA700 and PA26 were analyzed by
Western blot. The results showed no effect of the phenotype of the strains on the
relative amount of both the 20S proteasome, HslV, and their regulators. Subsequently,
the 20S proteasome peptidase activities were assessed using fluorogenic substrates. We
observed significant variations in activity chymotrypsin-like, trypsin-like, and caspase-
like of proteasome, and only the trypsin-like activity was shown to correlate with the
phenotype of resistance to benznidazole. Finally we evaluated the rate of intracellular
proteolysis in the same populations in the presence of ATP, ATP and ubiquitin and ATP
ubiquitin and MG-132, a classic proteasome 20 and 26S inhibitor. The results suggest
that the addition of ubiquitin did not induce a real increase in the rate of proteolysis, in
addition, there was an real increase in proteolysis after 90 minutes of induction in the
presence of ATP, suggesting the coexistence mechanisms of proteolysis proteasome-
dependent and independent of ubiquitin. To corroborate this hypothesis, we assessed the
levels of oxidized and ubiquitinated proteins. The results suggest a similar profile of
ubiquitinated protein and differential for the oxidized. Together, the present results
suggest that the steady state in epimastigote is influenced by drug resistance. Future
experiments will be performed to determine which proteins are the natural targets of this
pathway.
14
1 Introdução
15
1.1 O Trypanosoma cruzi
O parasito protozoário T. cruzi, agente causador da Doença de Chagas, foi
descoberto pelo médico e pesquisador brasileiro Carlos Chagas há 100 anos, porém a
doença continua endêmica na America Latina.
Este parasito flagelado, alterna seu ciclo de vida entre hospedeiros mamíferos e
insetos da família Reduviidae. Em seu ciclo biológico o T. cruzi apresenta-se nas formas
epimastigota, tripomastigota metacíclico no sistema digestório do inseto e na forma
amastigota e tripomastigota sanguínea nos mamíferos. Neste ciclo heteróxeno, o T.
cruzi passa por mudanças morfológicas complexas em sua jornada pelo hospedeiro
vertebrado e o inseto hematófago. Estes ambientes muito diferentes determinam o
aparecimento de inúmeras características adaptativas (BRENER, 1973).
Além do hospedeiro humano, um grande espectro de mamíferos pode ser infectado
e atuar como reservatório do parasito dificultando sua erradicação. Nos últimos tempos,
foram feitos avanços significativos no controle da transmissão vetorial nos países do Cone
Sul da América com a eliminação do principal vetor domiciliário T. infestans. Este fato
estimulou os países do grupo Andino e da América Central a iniciar campanhas para a
erradicação de outro vetor domiciliar, R. prolixus, obtendo-se um sucesso significativo
(MONCAYO & ORTIZ, 2006; WHO, 2002).
As populações do T. cruzi (também denominadas cepas) mostram um elevado
grau de variabilidade intra-específica detectada por marcadores biológicos, bioquímicos,
Figura 1: Ciclo de vida do T. cruzi. As diferentes formas
do T. cruzi ao longo de seu ciclo evolutivo no hospedeiro
vertebrado e invertebrado. Figura adaptada de Atwood III
et. al., (2005).
16
imunológicos e genéticos. Dentre as características fenotípicas destacam-se diferenças
morfológicas, de infectividade em modelos experimentais, tropismo tissular e
suscetibilidade a quimioterápicos (MACEDO et. al., 1998).
Estudos que iniciaram a classificação das diferentes cepas foram baseados na
variabilidade isoenzimática de seis loci, e classificaram as populações do T. cruzi em
três zimodemas maiores denominados Z1, Z2 e Z3. Outros estudos analisaram
diferentes aspectos com o intuito de refinar esta classificação, utilizando, por exemplo,
outros 15 loci de isoenzimas, dimorfismo de regiões do gene de mini-éxon e do gene do
RNA ribossômico (rRNA) 24S, análise da estrutura genômica por RAPD (Randomly
Amplified Polymorphic DNA) e a genotipagem multilocus, entre outras (MILES et. al.,
1978; TIBAYRENC et. al., 1986; TIBAYRENC e AYALA, 1988; SOUTO et. al.,
1996; FERNANDES et. al., 1998; TIBAYRENC, 1998).
A necessidade de uma normatização da nomenclatura e classificação das
diversas populações reuniu uma comissão de peritos em Búzios, Brasil, no dia 23 de
agosto de 2009, precedendo o XIII Congresso Internacional de Protologia, a XXV
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Protozoologia e da XXXVI Reunião Anual
de Pesquisa Básica em Doença de Chagas. Por consenso, esta comissão reconheceu que
a nomenclatura das cepas do T. cruzi deve ser classificada em seis DTUs, T. cruzi I-VI.
As DTUs foram estabelecidas para agrupar as cepas geneticamente relacionadas
identificadas por marcadores genéticos, moleculares e imunológicos (ZINGALES et.
al., 2009).
1.2 Catabolismo protéico no T. cruzi
As proteínas e aminoácidos são uma reserva energética para os parasitos, e a
endocitose é o mecanismo básico pelo qual macromoléculas são internalizadas. As
macromoléculas do meio extracelular e do sistema de ER-Golgi estão concentradas em
estruturas conhecidas como reservosomos nos epimastigotas. Essas organelas são
especialmente interessantes porque são encontradas exclusivamente no subgênero
Schizotrypanum, como os Trypanosoma cruzi, Trypanosoma vespertilionis e
Trypanosoma dionisii (SOARES et. al. 1992).
17
Os reservosomos têm sido descrito como uma estrutura exclusiva de formas
epimastigotas, e no processo de transformação da forma epimastigota em tripomastigota
modificações na estrutura do reservossomo são observadas, como o desaparecimento
inicial das inclusões lipídicas e posterior desaparecimento da organela, de tal forma que
ela não é mais encontrada na forma tripomastigota (revisto por DE SOUZA, 2008).
Embora a absorção de lipídios e proteínas nunca tenha sido demonstrada em
ambos, tripomastigotas e amastigotas, organelas intracelulares que compartilham
características com o reservossomo foram recentemente descritas nestas formas do T.
cruzi encontradas nos mamíferos.
Como reservosomos, essas organelas estão concentradas na região posterior do
parasita, acumulam cruzipaína e seu inibidor natural chagasina além de uma serino
carboxipetidase. São ácidas e tem uma H+-ATPase do tipo P, indicando que esses
compartimentos estão intimamente relacionados. No entanto, elas diferem das
reservosomos na capacidade de armazenamento de macromoléculas externas. Estas
organelas têm provavelmente funções lisossomais, uma vez que lisossomos clássico
nunca foram identificados no T. cruzi, conjuntamente o proteoma do subfracionamento
dos reservosomos corrobora com esta evidencia (SANT’ANNA et. al. 2008 e 2009).
Figura 2: Esquema geral da forma epimastigota do T. cruzi
mostrando suas principais estruturas celulares. 1-
citóstoma, 2- axonema, 3- estrutura paraflagelar, 4- vacúolo
contrátil, 5- golgi, 6- bolsa flagelar, 7- cinetoplasto, 8- núcleo,
9- glicossoma, 10- nucléolo, 11- mitocôndria, 12-
acidocalcinoma, 13- reservossoma, 14- microtúbulos
bubpeliculares. Do campo, (1975)
18
A principal protease do T. cruzi, a cruzipaína, uma cisteino protease, é muito
ativa em formas epimastigotas e está concentrada nos reservosomos. A enzima é uma
glicoproteína sintetizada no sistema RE-Golgi como pro enzima e dirigida à via
endocítica através da seqüência de pro - peptídeo, que é necessária e suficiente para
conduzir a cruzipaína reservosomos (SOUTO-PADRON et. al., 1990).
No metabolismo energético, o T. cruzi depende da disponibilidade de fontes de
carbono presente no microambiente em que se encontra nos seus hospedeiros. A
preferência em utilizar glicose como fonte energética ocorre em tripomastigotas, que
nos fluidos de seus hospedeiros vertebrados encontram uma fonte aparentemente
inesgotável. Já a forma intracelular amastigota utiliza aminoácidos, principalmente por
sua abundante disponibilidade no citosol. A forma epimastigota cultivada em meio com
glicose e aminoácidos consome preferencialmente a glicose.
As formas encontradas no inseto vetor, dependem do catabolismo de
aminoácidos com preferência a L-prolina. Os epimastigotas podem obter aminoácidos
por transporte ativo, biossintese a partir de precursores metabólicos ou pela degradação
de proteínas adquiridas por pinocitose. É conhecido que as formas epimastigotas do T.
cruzi são capazes de internalizar e consumir carboidratos e aminoácidos, excretando
principalmente succinato e amônia (CAZZULO, 1992 e 1994).
Desde a década de 70, do século passado, que a hipótese da participação de
enzimas proteolíticas, produzidas pelo parasito, no estabelecimento da Doença de
Chagas vem sendo investigada. As enzimas proteolíticas participam de numerosos
fenômenos fundamentais a vida da célula, como, por exemplo, do turnover protéico,
com a degradação de proteínas intracelulares (NOGUEIRA E COHN, 1976)
O T. cruzi, que apresenta várias formas evolutivas para completar um ciclo
biológico e depende de dois hospedeiros, necessita de constituintes protéicos para o seu
crescimento e diferenciação (PIRAS et. al., 1985), de forma que as enzimas
proteolíticas favoreceriam tanto a penetração como a migração dentro dos tecidos.
Algumas peptidases desempenham papel central em diversos processos além do
catabolismo de proteínas dos hospedeiros, tais como invasão celular, diferenciação,
progressão do ciclo celular, e evasão da resposta imune do hospedeiro (KLEMBA E
GOLDBERG, 2002).
Foram observadas várias atividades proteolíticas no T. cruzi, algumas já
caracterizadas; outras preditas a partir dos dados do projeto genoma. O genoma do T.
19
cruzi inclui 70 supostos cisteino peptidases, cerca de 40 supostos serino proteases, cerca
de 250 supostos metalopeptidases, a maioria dos quais são homólogos de
leishmanolysina, 25 supostos genes relacionado ao proteassoma 20S, uma treonino
peptidase e 2 supostos aspartil peptidases. O número real de enzimas proteolíticas no T.
cruzi é, provavelmente, cerca de metade, uma vez que os alelos foram descritos como
diferentes genes. É provável que o número total esteja mais próximo aos números
propostos para Trypanosoma brucei e Leishmania major, cerca de 160 em ambos os
casos (CAZZULO, 2002; EL-SAYED et. al., 2005; IVENS et. al., 2005).
As proteases melhor caracterizadas até o momento foram as cisteino proteases,
que apresentam inúmeras funções nos parasitas, muitas destas diferentes das enzimas
homólogas do hospedeiro. Elas exibem diferenças fundamentais na especificidade de
substrato, extensões de domínio e estabilidade sobre uma ampla faixa de pH. Está claro
que, em muitos parasitos, algumas destas proteases têm uma série de funções extra-
lisossomais.
Foram descritas sete famílias dos clãs CA (C1, C2, C12, C19, C65, C51 e C54),
três famílias do clã CD (C13, C14 e C50), um membro da família C48 do clã CE e um
membro da família C15 do clã CF (KOSEC et. al., 2006). A classificação das proteases
em famílias e clãs é baseada na estrutura das proteases em uma classificação
hierárquica, em que, cada protease é atribuída a uma família com base nas semelhanças,
estatisticamente significativas, na seqüência de aminoácidos, e as famílias homólogas
são agrupadas em um clã.
Além destas cisteino proteases caracterizadas no T. cruzi, podemos citar ainda
duas serino proteases, uma pertencente à família prolyl-oligopeptidase e outra serino
carboxipeptidase, metaloprotease de membrana, da família da leishmanolisina, ancorada
glicosilfosfatidilinositol (GPI), e o proteassoma (BURLEIGH et. al., 1997; BASTOS et.
al., 2005; PARUSSINI et. al., 2003; CUEVAS et. al., 2003; DE DIEGO et. al., 2001;
GONZÁLEZ et. al., 1996).
1.3 O proteassoma
O estudo da proteólise intracelular como um importante regulador dos processos
celulares iniciou em 1946 com a publicação: O estado dinâmico dos constituintes do
corpo por Schoenheimer. As pesquisas com a proteólise celular avançavam e em 1953
duas observações importantes surgiram: a descoberta dos lisossomos e a evidencia de
20
que a degradação protéica dos mamíferos dependia de energia. Posteriormente, em 1964
aparecem as evidencia da proteólise mediada pelo cálcio.
Uma revolução científica iniciou-se com a exposição à comunidade a um
sistema de degradação protéica, solúvel, não lisossomal dependente de ATP por Hough
e Rechsteiner em 1977. A contínua busca por uma resposta, leva primeiro a descoberta
de uma protease multi-subunitária, seguida pelo anuncio de uma cascata enzimática para
marcar as proteínas com a ubiquitina. Sua implicação na degradação protéica culminou
em 1987, com o uso dos termos proteassoma 20S e 26S e sua clássica função na
degradação de proteínas poli-ubiquitinadas (WILK & ORLOWSKI, 1980; HERSHKO
et. al., 1983; HOUGH et. al., 1987)
1.3.1 O proteassoma 20S
O proteassoma 20S é uma protease constituída de 28 subunidades, com o seus
sítios catalíticos no interior do barril formado por suas subunidades em um arranjo de
quatro anéis superpostos. É uma hidrolase nucleofílica N-terminal, com resíduo treonina
N-terminal essencial para a atividade proteolítico (uma treonino protease). Este
complexo é altamente regulado, cuja função pode requerer energia proveniente da
hidrólise de ATP. São conhecidos duas formas de proteassoma 20S. Um típico de
arquebactérias em que o complexo de 28 subunidades é formado por apenas duas
subunidades: 14 α e 14 β formando 2 anéis de sete subunidades α (externos) e 2 anéis de
sete subunidades β (internos). O outro, presente nos eucariotos, é formado por quatorze
subunidades α1, α2, α3, α4, α5, α6, α7 e β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7 formado por dois
anéis α(1 a 7) (externos) e dois anéis β(1 a 7) (internos). Neste complexo, que possuem seus
sítios catalíticos compartimentalizados no interior do barril, formado pelos quatro anéis
superpostos, encontramos os anéis α impedindo a entrada desordenada de proteínas,
evitando assim uma degradação desenfreada.
21
Como citado em revisão por (JUNG, CATALGOL & GRUNE, 2009), o
proteassoma 20S é uma estrutura celular complexa envolvido na degradação de
proteínas oxidadas, regulação do stead-state protéico, ``controle de qualidade`` protéico,
regulação do ciclo celular, expressão gênica, resposta imune, carcinogênese, reparo do
DNA entre outros.
Estruturalmente, o proteassoma 20S é normalmente encontrado em sua forma de
barril com o poro dos anéis α, fechado, mas pode ser ativado (abertura do poro) pelas
partículas reguladoras, proteínas desenoveladas ou substratos que não necessitam da
prévia ativação do complexo 20S por seus reguladores.
Devemos discriminar entre a atividade peptidásica do proteassoma 20S
(degradação de pequenos peptídeos) da atividade protease (degradação de proteínas):
enquanto a atividade da protease depende do estado de abertura do poro (dependente da
interação dos anéis α com os ativadores do proteassoma 20S), a atividade peptidásica
mostra-se pouco afetada pelo estado de abertura do poro, sugerindo que os anéis alfa
têm pouca interação com pequenos peptídeos e desempenha um papel-chave na
degradação de peptídeos maiores ou proteínas.
Nas proteínas oxidadas, o montante dos prejuízos causados, que seja suficiente
para causar um desdobramento parcial da proteína, fazendo com que as seqüências
hidrofóbicas, geralmente não expostas dentro da estrutura globular, sejam expostas na
superfície. Há evidências, que estas estruturas hidrofóbicas expostas são um sinal de
degradação pelo proteassoma 20S e reconhecido pelos seus anéis α.
Figura 3: O proteassoma 20S. Em A, o proteassoma 20S, composto por quatro anéis superpostos
com sete subunidades α distintas compondo os anéis mais externos, e sete subunidades β distintas,
compondo os anéis internos, sendo que as subunidades β1, β2 e β5 possuem atividades semelhantes à
caspase, tripsina e quimiotripsina respectivamente. Em B, o proteassoma 20 em perspectiva, Jung e
colaboradores (2009). Em C, um corte transversal em um modelo de preenchimento do proteassoma
mostrando em amarelo os sítios catalíticos Rechsteiner & Hill (2005).
A B C
22
1.3.2 O proteassoma e seus reguladores
Proteassoma 20S isolados, mostram-se pouco ativos, porque os substratos não
podem acessar os sítios proteolíticos. O PA700, PA28 e PA200 são ativadores que se
ligam ao proteassoma 20S e estimulam e regulam a hidrólise protéica.
Dos reguladores do proteassoma, o PA200, é o que foi caracterizado mais
recente, assim, pouco se sabe de suas funções biológicas. Há algumas especulações
devidas a sua homologia com a proteína de levedura Blm3p e estudos de expressão
diferencial em tecidos, como nos testículos, onde danos de quebra da fita dupla do DNA
ocorrem com freqüência elevada durante a recombinação meiótica. Finalmente, o
PA200 está presente no núcleo e como acontece como vários componentes da via de
reparo do DNA, forma focos após a incidência de irradiação γ.
O regulador 19S (também denominado PA700), contrariamente ao PA200, é o
ativador do proteassoma melhor caracterizado até o momento. Ele é constituído de uma
base em forma de anel e uma estrutura em ``tampa``, que quando associado ao
proteassoma 20S regula a entrada de substratos que foram modificados (marcados) com
uma cadeia de poli-ubiquitina (DEMARTINO et. al., 1994; LAM et. al., 1997;
STRICKLAND et. al., 2000; LIU et. al. 2002).
A estrutura base contém subunidades ATPases (Rpt1-Rpt6) e não ATPases
(Rpn1, Rpn2, Rpn10 e Rpn13). A ``tampa`` é formada por nove subunidades: Rpn3,
Rpn5-Rpn9, Rpn11, Rpn12 e Rpn15. A Rpn11 da tampa, contém um sitio proteolítico
dependente de Zn2 +
que catalisa a degradação das cadeias de poli-ubiquitina, liberando-
a cadeia de poli-ubiquitina que é hidrolisada em monômeros de ubiquitina pelas DUBs e
Figura 4: Abertura dos poro do anel α pela ação dos ativadores do proteassoma 20S. Através
do modelo de preenchimento é mostrado em A, o proteassoma 20S com o poro fechado, em B o
proteassoma 20S com o poro aberto pela ação de seus ativadores Rechsteiner & Hill (2005).
23
que são reutilizadas. As subunidades Rpt2, Rpt3 e Rpt5 estão envolvidos na abertura do
poro do proteassoma 20S. As Rpn10 e Rpn13 são receptores de ubiquitina (TANAKA,
2009).
Um regulador 19S se liga a cada uma das extremidades do proteassoma 20S
formando uma grande partícula, chamado proteassoma 26S, com uma massa total de
mais de 2 MDA. Em um mecanismo semelhante, como mostrado por outras partículas
reguladoras do proteassoma, o regulador 19S permite melhor acesso do substrato ao
interior da câmara proteolítica, alterando a estrutura do poro no centro dos anéis α.
(GLICKMAN & CIECHANOVER, 2002)
Como podemos notar, pela função das subunidades Rpn10 e 13, a ubiquitinação
é um passo importante para o endereçamento à degradação pelo proteassoma 26S, e
como exceção, apenas algumas proteínas podem ser degradadas pelo proteassoma 26S
sem a conjugação da cadeia de poli-ubiquitina.
A Ubiquitina (Ub) é uma pequena proteína que contém 76 aminoácidos,
altamente conservada na maioria das células eucarióticas e conforme mencionado, a
maioria dos substratos endereçados à degradação pelo proteassoma 26S, devem ser poli-
ubiquitinados. Neste processo, um sistema complexo, contendo quatro tipos diferentes
de enzimas (E1-E3) está envolvido. O primeiro passo é a ativação da ubiquitina, em um
processo dependente de ATP realizado pela enzima ativadora de ubiquitina E1.
Figura 5: O proteassoma 26S. O proteassoma 26S e
seus componentes. O proteassoma 20S e a partícula
regulatória PA700 composta pelas subunidades
ATPase formadoras da base e pelas subunidades
formadoras da tampa. KEGG 2009
(www.genome.jp/kegg/)
24
(WILKINSON et. al., 1980). A enzima E1 transfere a Ub a um resíduo de lisina de uma
enzima carreadora de ubiquitina E2 e ambos, a enzima E2 e o substrato alvo interagem
com a enzima conjugadora de ubiquitina E3, completando a transferência da Ub da E2
para o grupo amino de uma lisina do substrato.
Após a liberação das enzimas E2 e E3, pode ocorrer à transferência cíclica de
mais moléculas de Ub a primeira ligada ao substrato com o apoio de uma quarta enzima
recentemente caracterizada, a enzima E4, que auxilia a formação da cadeia crescente de
ubiquitinas. A especificidade pelo substrato é ditado pela classe de enzimas E3, que
contém milhares de Ub-ligases, cada uma específica para apenas um número limitado
de proteínas substrato.
A partícula ativadora PA28 dos mamíferos (também denominado como 11S ou
REG e PA26 em Trypanosomatidae) é encontrado como um complexo
heterohexamérico, heteroheptamérico ou homoheptamérico. O complexo é capaz de
ligar-se ao anel α do proteassoma e aumentar a taxa de degradação de peptídeos.
Figura 6: A cascata de ubiquitinação. O monômero de ubiquitina é ativado através de
sua ligação à enzima ativadora (E1) com gasto energético, a enzima E1 então transfere
a ubiquitina para enzima carreadora E2 que pode transferi-la pelo auxilio da enzima
conjugadora E3 de duas forma diferentes a proteína alvo.
25
Em mamíferos, o PA28 é constituído de três isoformas, PA28 α (28589 Da),
PA28 β (27230 Da) e PA28 γ (29365 Da) capazes de associar de diferentes formas para
construir o regulador do proteassoma PA28. A degradação protéica após a ligação do
11S ao 20S é realizada de uma forma independente de ATP e sendo que a degradação
de proteínas já desenovelada é intensificada, mas não a proteólise das proteínas em sua
forma nativa (RECHSTEINER et. al., 2000).
Análises de imunoprecipitação e microscopia eletrônica mostraram que PA28 e
PA700 podem se ligar simultaneamente ao proteassoma 20S formando proteassomas
híbridos, PA28-20S-PA700, sendo surpreendente que ambos os ativadores possam se
ligar ao mesmo 20S em posições opostas. Os proteassomas híbridos contribuem para
uma eficiente proteólise, pois as proteínas podem ser primeiramente reconhecidas pelo
PA700 e então endereçadas para a degradação no 20S, o qual tem suas atividades
peptidásicas fortemente estimuladas pelo PA28α/β. Também é observado o trabalho em
conjunto dos PA700 e PA28α/β na degradação de peptídeos para apresentação de
antígenos, como já descrito anteriormente. Curiosamente, forma-se também o
proteassoma híbrido PA200-20S-PA700. O motivo dessa formação é ainda
desconhecido (CASCIO et. al., 2002; SCHMIDT et. al., 2005).
O correspondente do PA28 em tripanossomatídeos é o PA26. A proteína PA26
foi identificada pela primeira vez em formas procíclicas e sanguíneas de T. brucei, com
um peso molecular de 26kDa sendo estável na ausência de ATP (Yao & Wang, 1997).
O PA26 apresenta cópia única no genoma de T. brucei e está presente no nucleo ou
citosol da célula sob a forma de um anel homoheptamérico. Quando interage com o
proteassoma 20S, induz um estimulo nas atividades peptidásicas semelhante à caspase,
quimotripsina e tripsina.
Nesta rede regulatória, existem também, inibidores endógenos do proteassoma
como HSP90, PI31, PR39, Tat e HBx que representam um apreciável e novo nível de
regulação do proteassoma, contudo necessita-se ainda estabelecer a relevância biológica
dos seus efeitos. A regulação da atividade do proteassoma é de extrema importância
para a função celular, e a compreensão da bioquímica e funções biológicas de proteínas
associadas (do inglês proteasome interaction protein – PIP) será uma prioridade para
futuros esforços das investigações.
1.4 Proteassoma em T. cruzi
26
Os estudos relativos à função do proteassoma no T. cruzi, iniciaram em 1996 por
Gonzáles et. al., que em uma gama de experimentos evidenciaram a inibição da
transformação in vitro de tripomastigotas a amastigotas, após incubação no meio de
transformação, pelos inibidores do proteassoma lactacistina e MG-132. O mesmo efeito
não foi observado com inibidores de cisteino proteases, Cbz-Phe-Ala-FMK, Cbz-(S-
Bz)Cys-Phe-CHN2 e E64. Os tripomastigotas tratados com os inibidores do
proteassoma, retiveram o epítopo Ssp-3, típico desta forma, e não expressaram o
epítopo Ssp-4, típico de amastigotas, após a incubação no meio de transformação (esta
observação é contrária ao grupo controle, em que, observaram-se a troca do epítopo
Ssp-3 para Ssp-4 após a incubação).
Outra abordagem feita pelo pesquisador foi pré-incubar os tripomastigotas com
os inibidores do proteassoma e realizar ensaios de invasão celular em mioblastos
cultivados. Foi observado que a inibição do proteassoma, não interfere neste processo.
Ainda neste trabalhando, células infectadas foram tratadas com lactacistina 48 horas
após a infecção, e a liberação de tripomastigotas no meio extracelular foi avaliada e
comparada a liberação dos tripomastigotas com células infectadas e não tratadas com o
inibidor. O resultado foi um significante decréscimo na liberação dos tripomastigotas no
grupo de células tratadas com o inibidor do proteassoma, lactacistina. Como observado
para a transformação tripomastigota / amastigota (in vitro), o tratamento com os
inibidores de cisteino proteases não interferiram com a transformação amastigota /
tripomastigota do T. cruzi.
O próximo passo dado, rumo à compreensão do envolvimento do proteassoma
para o remodelamento morfológico do T. cruzi, foi realizado pelo mesmo grupo de
pesquisadores (DE DIEGO et. al.,2001), onde inicialmente, mediram o impacto na
degradação das proteínas de vida curta e de vida longa, durante a transformação
tripomastigota / amastigota. Foi observado para as proteínas de vida curta um
decréscimo de 50% na degradação protéica por inibidores específicos do proteassoma,
enquanto outros inibidores de protease como metilalanina, leupeptina e E-64d não
inibiram ou demonstraram pouco efeito inibitório (< 10%). Já o inibidor de calpainas,
calpeptina, teve um efeito moderado (decréscimo em torno de 20%).
Para as proteínas de vida longa, o efeito dos inibidores foi similar. Os inibidores
do proteassoma causaram um decréscimo de 70% da proteólise, os inibidores de
27
cisteino proteases lisossomais causaram um decréscimo próximo a 12,5% e os
inibidores das calpainas 30%.
Quando este experimento foi realizado na presença destes inibidores e com a
depleção do ATP, os autores observaram que, a depleção do ATP tem impacto
majoritário ou exclusivo na degradação das proteínas pelo proteassoma.
Como as estruturas flagelares dos tripomastigotas, praticamente desaparecem
durante a transformação para amastigota, os autores também investigaram a relação da
degradação destas estruturas com sua ubiquitinação e posterior degradação, observando
que a marcação pela ubiquitina, aumenta quando os tripomastigotas são incubados no
meio transformador, o que não ocorre, quando o ATP é depletado. Também observaram
o decréscimo destas estruturas com o passar do tempo de incubação e uma inibição
desse decréscimo pelo tratamento com lactasistina, demonstrando assim, a importância
da ubiquitinação e da degradação dependente do proteassoma 26S para o
remodelamento morfológico na transição tripomastigota / amastigota no T. cruzi.
Hangai (2007) sugere que a inibição do proteassoma na fase replicativa
(epimastigota), bloqueia o ciclo celular pois induziu alterações morfológicas marcantes,
enquanto que, a inibição do proteassoma em tripomastigotas sanguíneos, previamente a
infecção experimental, comprometeu a progressão da infecção nestes camundongos.
A contribuição do proteassoma para a diferenciação dos epimastigotas a
tripomastigotas metacíclico foi recentemente publicada. Neste estudo os autores
observaram a inibição da metaciclogênese in vitro após o tratamento com lactacistina
como também um acúmulo de células na fase G2 do ciclo celular (CARDOSO et. al.,
2008).
Estudos recentes do nosso grupo de trabalho, têm demonstrado a expressão do
proteassoma-like, o complexo HslVU. Barbosa (2010) demonstrou a coexistência dos
dois complexos protéicos, o proteassoma 20S e o HslVU, bem como sua expressão em
epimastigotas cultivadas em meio LIT com ou sem o inibidor de treonino proteases,
PSI, em diversas cepas do T. cruzi.
Oliveira (2007) observou, utilizando o anticorpo monoclonal comercial contra
um epítopo conservado na porção N-terminal das subunidades do tipo α do proteassoma
20S que as populações susceptíveis 17WTS, BZS e CL possuem maior quantidade de
proteassoma que os respectivos pares de populações resistentes 17LER, BZR e
Colombiana. Além disso, ele descreve que apesar deste resultado, a medida da atividade
28
peptidásica utilizando substratos fluorogênicos do proteassoma 20S não diferia entre os
pares susceptível / resistente, lançando a hipótese de que modificações pós traducionais
estariam modulando a atividade do proteassoma em maior magnitude nas populações
resistentes quando comparado ao susceptível.
A descrição da participação do proteassoma 20/26S influenciando processos
celulares essenciais para o estabelecimento desses parasitos em seus hospedeiros
definivos, a presença do homologo HslV/U, em conjunto com os resultados descritos
por Oliveira (2007) nos motivaram a procurar relações entre a atividade e níveis de
proteassoma 20/26S associado no fenótipo de resistência a drogas, atualmente utilizada
para o tratamento da Doença de Chagas.
29
2 Objetivos
30
2.1 Objetivo Geral
Analise bioquímica inicial do proteassoma 20S e seus reguladores em epimastigotas de
populações de T. cruzi com fenótipo de resistência ao benzonidazol.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar as atividades peptidásicas do proteassoma 20S;
Analisar a expressão do proteassoma 20S e seu homologo HslVU;
Analisar o perfil de expressão dos reguladores do proteassoma 20S: RPN7 e
PA26;
Analisar o perfil de proteínas conjugadas a ubiquitina;
Analisar o perfil de proteínas oxidadas;
Avaliar a proteólise dependente de ubiquitina e proteassoma 26S;
Avaliar a proteólise dependente de ubiquitina e proteassoma 26S em formas
promastigotas de Leishmania sp.
31
3 Material e Métodos
32
3.1 Populações de T. cruzi
As populações de T. cruzi com fenótipo de resistência ao benzonidazol (Bz)
utilizados neste trabalho foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Parasitologia
Celular (Centro de Pesquisa René-Rachou, Fiocruz). As quatro populações, 17WTS,
17LER, BZS, BZR e as cepas CL e Colombiana (COL) do T. cruzi foram obtidas no
Instituto Oswaldo Cruz.
A população 17 LER, com resistência induzida in vitro, foi derivado da cepa
susceptível Tehuantepec cl2, 17 WTS (NIRDE et. al., 1995). Os parasitos 17LER foram
crescidos em LIT (Liver Infusion Tryptose, segundo Camargo, 1964) na presença de
220 mM de Bz, que corresponde a uma dose 23 vezes maior do que o IC50 para a
população 17WTS.
A população BZR, com resistência selecionada in vivo foi obtida a partir de uma
população da cepa Y susceptível ao Bz (MURTA & ROMANHA, 1998). A população
BZR foi recuperada de camundongos tratados com uma dose única e elevada de Bz (500
mg / kg de peso corporal), administrada por via oral, no pico da parasitemia. Os
camundongos foram sangrados 6 horas após a administração da droga e após sucessivas
re-infecções com o mesmo tratamento anterior, o sangue foi semeado em meio LIT a
28° C para a obtenção da massa de parasitos. Nós também utilizamos populações do T.
cruzi susceptível (CL) e naturalmente resistente (COL), ao Bz e NFX (FILARDI E
BRENER, 1987).
As formas promastigotas de L. braziliensis, L. chagasi e L. amazonense foram
cultivadas em meio LIT suplementado com 20mg/ml de gentamicina. Todos os estoques
das cepas de Leishmania foram mantidos rotineiramente no Laboratório de
Imunopatologia – NUPEB (UFOP). As culturas foram mantidas em estufa à
temperatura de 23ºC.
Para obtenção da massa de parasitos, as formas epimastigotas do T. cruzi a as
promastigotas da Leishimania sp foram recuperadas por centrifugação a 2000xg,
durante 20 minutos a 4°C. Após suspensão do sedimento em PBS realizou-se nova
centrifugação nas mesmas condições. Tal procedimento de lavagem foi repetido por
outras 2 vezes. Por fim, armazenou-se a massa obtida à -70°C para análises posteriores.
33
3.2 Obtenção do extrato bruto
Inicialmente, foram adicionados 1x109
parasitos a 1 mL do tampão 20S (Tris-
HCl 5mM pH 8,0, glicerol 10%, EDTA 1mM, DTT 1mM e 10µM dos seguintes
inibidores de proteases: PMSF, TPCK, TLCK e NEM preparados antes de sua adição
ao tampão). A seguir, em banho de gelo, a suspensão celular foi sonicada (Sonifier 250
– BRANSON) adotando 3 pulsos constantes de 60 segundos com mesmo intervalo de
repouso no banho de gelo.
O homogenato foi clareado por duas etapas de centrifugação. Inicialmente as
amostras foram centrifugadas a 20.000 xg durante 30 minutos. O precipitado foi
descartado e o sobrenadante centrifugação a 100.000 xg por 1h. O precipitado foi
descartado e o sobrenadante reservado para análises posteriores.
A determinação da concentração protéica presente no extrato bruto foi realizada
utilizando o método do BCA, segundo as recomendações do fabricante (QuantiPro™
BCA Assay Kit - SIGMA ALDRICH).
3.3 Medida da atividade peptidásica do proteassoma 20S dos parasitos
Nos ensaios da atividade proteolítica exógena (peptidásica) foram utilizados
diferentes substratos fluorogênicos como: Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-7-amido-4-
metilcumarina, Cbz-Gly-Gly-Arg-7-amido-4-metilcumarina e Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7-
amido-4-metilcumarina para a determinação das atividades semelhantes à caspase,
tripsina e quimotripsina, respectivamente, do proteassoma na fração citosólica (extrato
bruto – Materiais e Métodos 3.2) das formas epimastigotas do T. cruzi.
Foram utilizados 5µg de proteínas totais e 13µM dos substratos fluorogênicos. O
tampão utilizado foi 50mM Tris-HCl pH 8,0, 10mM MgCl2 e 1mM DTT, na presença
ou ausência de 20µM de MG-132, um inibidor clássico do proteassoma. O ensaio foi
realizado num volume final de 200 µL com incubação de 30 minutos a 37°C. A reação
foi interrompida pela adição de 2 mL de etanol. As leituras fluorimétricas foram
realizadas nos comprimentos de onda 380 nm de excitação e 440 nm de emissão
(Espectrofluorofotômetro RF-5301PC – SHIMADZU) e os resultados, expressos em
34
unidades arbitrárias de fluorescência por mg de proteína e normalizada em relação à
atividade semelhante à caspase.
3.4 SDS-PAGE e ensaios de Western Blot
20 µg de proteínas do extrato bruto, preparado como descrito no item 3.2, foram
fracionadas em SDS-PAGE 12% como descrito por Laemmli (1970). Um gel foi corado
com Coomassie Blue R-250 e outros foram posteriormente transferidos para
membranas do tipo PVDF. Foi utilizado como padrão de peso molecular o Prestained
SDS-PAGE Standards Low Range (BIO-RAD).
A transferência das proteínas do gel para a membrana do tipo PVDF
(Invitrogen) ocorreu de acordo com o método descrito por Towbin et. al., 1979, com
modificações no tampão de transferência (Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM,
etanol 18% e SDS 0,02%). A eletrotransferência foi realizada durante 3 horas a 4ºC e
200 mA. Após o término da transferência, a membrana foi corada com Ponceau (0,25%
em ácido acético 1%) por 5 minutos e descorada com água para visualização das
proteínas.
A membrana foi então, incubada overnight a 4°C com TBS-T (Tris-HCl 50 mM
pH 8,3, NaCl 150 mM, Tween-20 0,05% e leite desnatado em pó 5%). Após este
bloqueio, a membrana foi incubada com anticorpo primário, na diluição 1:500,
produzido em camundongos a partir das proteínas recombinantes de T. cruzi: anti-
subunidade α7 do proteassoma 20S, anti-subunidade RPN7 do complexo regulador
19S, anti-PA26 do complexo regulador 11S, e anti-HslV. Esses anticorpos foram
gentilmente cedidos pelo Dr Marco Krieger do Instituto Oswaldo Cruz, Curitiba,
Paraná.
Para a análise do perfil de proteínas ubiquitinadas, foi utilizado anti-ubiquitina
(Sigma e Santa Cruz Biotechnology) na diluição 1:500 em TBS-T por 3 horas à
temperatura ambiente.
A normalização dos blots foi realizada utilizando anti-HSP70 do T. cruzi
(MURTA et. al., 2008), na diluição 1:5000, obtido em coelhos e gentilmente cedido
pela Dra Silvane Murta do Instituto de Pesquisa Reneé Rachou, Belo Horizonte, Minas
Gerais.
35
O anticorpo em excesso foi removido pela lavagem da membrana três vezes
com TBS-T e, em seguida, a membrana foi incubada por 1 hora, à temperatura
ambiente, com o anticorpo secundário (anti-IgG de rato ou coelho dependendo do
anticorpo primário utilizado, conjugado a fosfatase alcalina) na diluição 1:3000. Após
este período, a membrana foi lavada por três vezes durante 5 minutos em tampão de
revelação (100mM TrisHCl pH=9,5, 100mM NaCl e 5mM MgCl2). Finalmente, foram
adicionados à membrana, 5 mL do tampão de revelação acrescido de 66 µL de NBT e
33 µL de BCIP (Promega) até a visualização do sinal. Posteriormente a reação foi
interrompida pela remoção do tampão de revelação e lavagem da membrana com água.
Os níveis de expressão relativa foram obtidos por análise densitométrica de três
experimentos independentes, utilizando o software Quantity one® 4.4.1 (Bio-Rad).
3.4 Análise das proteínas oxidadas
Em uma primeira etapa, foi realizada uma reação de acoplamento da
difenilhidrazina (DNPH – SIGMA ALDRICH) com os grupos carbonilas das proteínas
solúveis do extrato bruto (Materiais e Métodos 3.2). Esta etapa envolve a reação de
1mg/mL de proteínas em 6% SDS e 10 mM de DNPH previamente preparado em 10%
ácido trifluoroacético em H2O. A reação foi incubada por 30 minutos ao abrigo da luz,
seguido de neutralização da reação pela adição de três volumes do tampão Tris 2M,
30% glicerol e 19% β-mercaptoetanol.
A seguir, 10 µg destas proteínas foram fracionadas em SDS-PAGE 10%,
transferido para membrana do tipo PVDF e realizado o Western Blot como descrito no
item 3.3, utilizando o anti-DNPH (SIGMA ALDRICH) como anticorpo primário, na
diluição 1:3000 e como anticorpo secundário, anti-IgG de coelho conjugado a
peroxidase, na diluição 1:5000. A reação antígeno-anticorpo foi detectada por auto-
radiografia, utilizando o kit ECL Plus (GE Lifescience). Também foi utilizado anticorpo
secundário anti-IgG de coelho conjugado a fosfatase alcalina, e as membranas reveladas
com NBT/BCIP, como descrito no item 3.3.
3.5 Eletroforese nativa do proteassoma
36
Este experimento foi realizado segundo o protocolo descrito por Hough et. al.,
(1987), e brevemente descrito a seguir. Inicialmente foram confeccionados géis de
poliacrilamida, sendo o gel de separação 4,5% pH 8,5 em tampão Tris 90 mM, ácido
bórico 80mM, EDTA 0.1mM e sacarose 10mM. O gel de concentração foi preparado a
3% pH 6.8 em tampão Tris-HCl 50mM. As proteínas foram separadas durante 5 horas a
4°C e 100 V, utilizando como tampão de corrida Tris 90mM, ácido bórico 80mM e
EDTA 0,1%. O gel foi corado com Coomasie blue R-250.
3.7 Determinação da taxa de proteólise intracelular não lisossomal
Para a determinação da taxa de proteólise intracelular não lisossomal,
inicialmente 100 µg de proteínas solúveis do extrato bruto, preparado como descrito no
item 3.2, foram transferidas para um meio reacional contendo: Tris.HCl 50 mM pH 8,0,
MgCl2 10 mM, DTT 5 mM e ATP 5 mM a 37 ° C por 90 minutos, na presença ou
ausência de 1mg/mL de ubiquitina e 50 µM de MG-132. A reação foi interrompida pela
adição de ácido tricloroacético (7 – 7,5% concentração final) seguida por 1 hora de
incubação em banho de gelo e centrifugação a 6.000 xg por 15 minutos.
Um mL do sobrenadante foi recuperado e a concentração de tirosina,
determinada por método fluorimétrico, segundo Waalkes & Undenfriend (1957) e
brevemente descrito a seguir. Inicialmente, foi preparada uma solução estoque de
tirosina (Sigma Aldrich) a 500 M em TCA 7% e preparada uma curva com
concentrações decrescentes de tirosina. A seguir foi adicionado ácido perclórico (0,14N
- concentração final) e o reagente nitroso-nafitol (0,05% nitroso-naftol, 0.025% nitrito
de sódio e 10% ácido nítrico – concentração final), seguido de incubação a 55°C por 30
minutos e extração do excesso de reagentes com clorofórmio. O produto fluorogênicos
aquoso formado neste protocolo foi medido no espectrofluorofotômetro (RF-5301PC –
SHIMADZU) utilizando comprimento de onda de 490nm de emissão e 570nm de
excitação. Simultaneamente, 1 mL do sobrenadante recuperado dos grupos do ensaio de
proteólise foi tratado de maneira equivalente. A taxa de proteólise foi obtida pela
diferença entre a concentração de tirosina no controle (tempo zero) e 90 minutos.
Análise estatística
37
A expressão relativa por Western blot e a medida das atividades peptidásica e
dependente de proteassoma foi comparada pela análise da variância (ANOVA) por
Repeated Measures ANOVA (Pós Teste de Tukey). A expressão relativa foi
considerada estatisticamente significante quando o teste de Tukey indicou diferença (p<
0,05) e observada uma diferença entre as médias de 50% entre os dados comparados.
A medida das atividades peptidásicas e a proteólise intracelular não lisossomal
foram consideradas significantes quando, o teste de Tukey indicou diferença (p< 0,05) e
observada uma diferença entre as médias de 15% entre os dados comparados. A análise
estatística foi realizada pelo programa PRISMA (GraphPad Prism 5 - portátil).
As comparações entre as populações foram centradas em populações com o
mesmo genótipo e diferentes fenótipos de resistência ao Bz, comparando a resistência
induzida in vitro (17WTS / 17LER), a resistência selecionada in vivo (BZS / BZR).
Também comparamos as cepas com diferentes genótipos e diferentes fenótipos de
resistência ao Bz, comparando a resistência selvagem (CL / COL).
38
4 Resultados
39
4.1 A atividade peptidásica do proteassoma
A atividade peptidásica do proteassoma 20S foi avaliada utilizado substratos
fluorogênicos, conforme descrito em Material e Métodos. A Tabela 1 mostra que a
atividade semelhante à tripsina da população resistente 17LER foi 18% inferior ao seu
par susceptível 17WTS (*). Também foi possível verificar que a atividade semelhante à
quimiotripsina foi similar nestas populações.
Já a população com resistência selecionada in vivo BZR, tanto a atividade
semelhante à tripsina como a atividade semelhante à quimotripsina mostraram uma
queda na hidrólise do substrato de 18,4% e 17,4%, respectivamente quando comparado
a população susceptível BZS.
Foi observado que a cepa, susceptível, CL apresentou a atividade semelhante à
tripsina 214% maior, porém a atividade semelhante à quimotripsina foi similar a cepa
naturalmente resistente Colombiana (*, Tabela 1).
As populações 17WTS, 17LER e a cepa CL (DTU TcVI), possuem a atividade
semelhante à tripsina maior que a atividade semelhante à quimotripsina. Nestas
populações a atividade semelhante à tripsina é 27,8%, 14,7% e 36%, respectivamente
maior que a atividade semelhante à quimotripsina. O contrario é observado nas
populações BZS, BZR (DTU TcII) e cepa Colombiana (DTU TcI), no qual observamos
a atividade semelhante à quimotripsina 39,2%, 40,3% e 71%, respectivamente maior
que a atividade semelhante à tripsina (ψ, Tabela 1).
A atividade semelhante à caspase foi muito baixa para todas as populações
analisadas e também não foi observado diferença entre os pares sensível e resistente ao
Bz (Tabela 1).
A atividade semelhante à quimotripsina é drasticamente inibida pela adição de
20µM de MG-132. Este efeito não é observado para a atividade semelhante à tripsina.
(Tabela 2)
40
Tabela 1- Atividade peptidásica do proteassoma 20S do T. cruzi.
Populações
Semelhante a Tripsina
Suc-Gly-Gly-Arg-AMC
Semelhante a Quimotripsina
Suc-Leu-Leu-Val-Tir-AMC
Semelhante a Caspase
Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-MCA
17WTS
17LER
11,88 ± 0,29
10,07 ± 0,08 *
9,29 ± 0,11 ψ
8,78 ± 0,11 ψ
0,04 ± 0,003
0,15 ± 0,002
BZS
BZR
12,39 ± 0,3
10,46 ± 0,22 *
17,25 ± 0,12 ψ
14,69 ± 0,33 * ψ
1,00 ± 0,02
0,69 ± 0,002
CL
COL
18,35 ± 0,29
8,56 ± 0,06 *
13,49 ± 0,03 ψ
14,64 ± 0,07 ψ
0,73 ± 0,005
0,62 ± 0,01
A tabela I contém a média e o erro médio padrão das atividades peptidásicas dos proteassomas de três
réplicas biológicas para as três atividades proteolíticas encontradas nesta protease; semelhante à tripsina
utilizando o peptídeo Suc-Gly-Gly-Arg-AMC, semelhante à quimotripsina utilizando o peptídeo Suc-Leu-
Leu-Val-Tir-AMC e semelhante à caspase utilizando o peptídeo Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-MCA.
Tabela 2- Inibição da atividade peptidásica do proteassoma 20S do T. cruzi.
Populações Semelhante a Tripsina Semelhante a Quimotripsina
20µM MG-132 20µM MG-132
17WTS
17LER
11,88 ± 0,29
10,07 ± 0,08
11,64 ± 0,22
10,12 ± 0,1
9,29 ± 0,11
8,78 ± 0,11
0,6 ± 0,08
0,65 ± 0,04
BZS
BZR
12,39 ± 0,3
10,46 ± 0,22
12,66 ± 0,17
10,35 ± 0,2
17,25 ± 0,12
14,69 ± 0,33
1,02 ± 0,12
0,89 ± 0,09
CL
COL
18,35 ± 0,29
8,56 ± 0,06
17,99 ± 0,29
8,86 ± 0,05
13,49 ± 0,03
14,64 ± 0,07
1 ± 0,04
0,92 ± 0,07
A tabela 2 contém a média e o erro médio padrão das atividades peptidásicas dos proteassomas de três
réplicas biológicas para as duas das três atividades proteolíticas encontradas nesta protease; semelhante à
tripsina utilizando o peptídeo Suc-Gly-Gly-Arg-AMC, semelhante à quimotripsina utilizando o peptídeo
Suc-Leu-Leu-Val-Tir-AMC e o efeito da inibição utilizando 20µM do inibidor MG-132.
41
Figura 7: Extrato bruto fracionado em SDS-PAGE
gel 12%. 15µg de proteínas do extrato bruto (Materiais
e Métodos 3.2) foram fracionados em SDS-PAGE e
visualizados pela Coomasie R-250. (PM) peso
molecular em kDaltons
4.2 As populações apresentam níveis similares do proteassoma 20S e Hslv
Os níveis do proteassoma 20S foram avaliados utilizando-se extrato bruto
conforme descrito em Materiais e Métodos 3.2. A Figura 7 mostra uma análise por
SDS-PAGE dos extratos utilizados. Observa-se a qualidade dos extratos pela
integridade das bandas reveladas pelo Coomassie Blue R-250. Posteriormente, foram
preparadas membranas para avaliar os níveis protéicos dos constituintes tanto do
proteassoma 20S como de seus reguladores utilizando-se a metodologia de Western
Blot.
A Figura 8 A mostra o padrão de reatividade do anti α7 (próximo a 28,8 kDa) e a
8 B da HSP70 próximo a 80 kDa. A análise densitométrica do sinal (Figura 8 C),
apresentou uma razão entre a proteína α7 e a proteína normalizadora HSP70. Não foram
observadas diferenças nas quantidades da proteína entre as populações estudadas.
42
A B
C
Figura 8: Expressão relativa da subunidade α7. Em A, o sinal na membrana para a proteína α7 em B o
sinal para a proteína HSP70 após reação com NBT/BCIP. (PM) Peso molecular em kDaltons. Em C a
análise densitométrica realizada no software Quantity One 4.4.1 (Bio-Rad).
Avaliamos também o homologo procariota do proteassoma 20S, o HslVU
(proteassoma-like), pela expressão relativa da subunidade HslV ao HSP70. A Figura 9
mostra uma das três membranas preparadas e visualizadas pelo NBT/BCIP após o
Western blot. Em A, o sinal para a HslV (entre 19,4 e 28,5 kDa) e B para a HSP70
(próximo a 80 kDa). Em C, vemos pela análise densitométrica do sinal, a expressão
semelhante entre as populações estudadas.
43
A B
C
Figura 9: Expressão relativa do HslV. Em A, a expressão da subunidade HslV do complexo HSLVU:
(entre 19,4 e 28,8 kDa) em B, o sinal para a proteína HSP70 (próximo a 80kDa) O sinal para a proteína
visualização com NBT/BCIP. (PM) Peso molecular em kDaltons. Em C a análise densitométrica
realizada no software Quantity One 4.4.1 (Bio-Rad).
4.3 Perfil de expressão dos reguladores PA700 e PA26
A Figura 10 mostra a expressão relativa da subunidade RPN7 da partícula
regulatória PA700. Observamos a regularidade da expressão indicada em A pela análise
densitométrica dos sinais visualizados após o Western blot. Em B o sinal para a proteína
RPN7 e, em C o sinal para a HSP70.
44
A
B C
Figura 10: Expressão relativa da subunidade RPN7 da partícula ativadora do proteassoma 20S,
PA700. Em A, a análise densitométrica realizada no software Quantity One 4.4.1 (Bio-Rad). (B) A
expressão da subunidade Rpn7 do PA700 pelo Western blot para a proteína Rpn7 (próximo a 49,5 kDa) e
(C) a HSP70 (próximo a 80kDa) após reação com NBT/BCIP.
A avaliação dos níveis relativos da proteína PA26 (Figura 11), também
analisada por Western blot. Na Figura 11 A, observamos os níveis relativos similares
entre as populações. Em B, o sinal de uma das membranas utilizadas na análise para a
proteína PA26 e, em C o sinal correspondente a HSP70. Nesta membrana não foi
possível visualizar o peso molecular.
45
A
B C
Figura 11: Expressão relativa da subunidade PA26 da partícula ativadora do proteassoma 20S,
PA26. Em A, a análise densitométrica realizada no software Quantity One 4.4.1 (Bio-Rad). (B) A
expressão da subunidade PA26 pelo Western blot e (C) a HSP70 após reação com NBT/BCIP. Nesta
membrana não é possível visualizar o peso molecular (PM).
4.4. Mobilidade eletroforética dos proteassomas nativos
Avaliamos os proteassomas dos pares fenotípicos por eletroforese nativa e como
mostrado na Figura 12 a cepa Colombiana apresenta uma menor mobilidade
eletroforética, discrepante das demais populações estudadas. Uma análise comparativa
das outras populações, evidencia pequenas diferenças na mobilidade eletroforética entre
elas. Este protocolo foi inicialmente estabelecido para proteassomas de mamíferos, e as
bandas coradas com Comassie Blue R-250, próximos ao peso molecular 640 kDaltons .
46
Figura 12: Eletroforese nativa do proteassoma. A eletroforese realizada com 50µg de extrato. Os
proteassomas em sua forma nativa, foram submetidos a técnica desenvolvida pelo grupo do pesquisador
Rechsteiner em 1987 para eletroforese nativa de proteassomas 20S e 26S de mamíferos. (PM) Peso
molecular em kDaltons.
4.5 O perfil dos conjugados ubiquitinados
Investigamos as proteínas modificadas pela ubiquitina (ubiquitinadas),
utilizando anticorpo contra a ubiquitina (Sigma) no extrato bruto do T. cruzi (Figura
13). Podemos visualizar proteínas ubiquitinadas de diversos pesos moleculares e
especialmente alguns aglomerados, estes aglomerados variam entre os diferentes DTUs.
O sinal indicado pela seta mostra um aglomerado que está conjugado à ubiquitina no
par fenotípico in vivo (TcII) e não aparece no par fenotípico in vitro (TcVI), a seta
indica um aglomerado de maior intensidade na cepa COL(Tc-I) comparado a cepa
CL(Tc-VI).
47
4.6 O perfil das proteínas oxidadas
As proteínas oxidadas, foram analisadas pelos grupos carbonila, a reação do
radical COO- com o DNPH e consecutivamente um Western blot utilizando um
anticorpo contra o DNPH. Essa abordagem gerou um rastro de marcação como a
ubiquitina, marcando proteínas dos mais diversos pesos moleculares, contudo podemos
observar alguns aglomerados de maior intensidade do sinal obtido pelo kit ECL-plus,
além de uma maior marcação nas populações susceptíveis 17WTS e BZS quando
comparados as populações resistentes correspondentes 17LER e BZR (Figura 14).
Figura 13: Perfil das proteínas conjugadas a ubiquitina. As proteínas foram visualizadas após
western blot utilizando anticorpo primário anti-ubiquitina. O anticorpo secundário, conjugado a
fosfatase alcalina e reação com NBT/BCIP. (PM) Peso molecular em kDaltons.
48
A B
Figura 14: Perfil das proteínas oxidadas. Os radicais –COO- das proteínas foram inicialmente
conjugados ao DNPH e visualizadas após western blot utilizando anticorpo primário anti-DNPH. Em A o
anticorpo secundário, conjugado a peroxidase visualizado em filme (10 segundos de exposição) após
tratamento com os reagentes do kit ECL plus e em B o anticorpo secundário, conjugado a fosfatase
alcalina seguido da reação com NBT/BCIP.
4.7 Degradação protéica intracelular, não lisossomal no T. cruzi.
A degradação de proteínas foi determinada pela liberação da tirosina das
proteínas degradadas no meio reacional. Foi observado o aumento da tirosina quando a
incubação ocorreu na presença de ATP e de ATP mais ubiquitina para todas as
populações estudadas, contudo este aumento não foi estatisticamente diferente entre
estes dois grupos.
Como controle da ação do proteassoma 20S e do proteassoma-like, foi
adicionado o MG-132 que bloqueou a liberação da tirosina em torno de 95%. Após a
incubação do extrato, retiramos uma alíquota do meio reacional e realizamos um
Western blot com o anticorpo contra ubiquitina (Santa Cruz Biotchenology). Foi
observado que a adição de ubiquitina levou a um discreto aumento dos conjugados
ubiquitinados e a adição de MG-132 levou a um aumento um pouco mais evidente
destes conjugados ubiquitinados (Figura 15).
49
Figura 15: Perfil das proteínas ubiquitinadas. 15µg de proteínas após incubação na presença de
ubiquitina bovina e ATP foram visualizadas para avaliar a degradação protéica dependente de
proteassoma: (1) basal, (2) ATP, (3) ATP + Ubiquitina e (4) ATP + Ubiquitina + MG-132. Os
conjugados foram visualizados após Western blot utilizando o anticorpo primário anti-ubiquitina e
reagidos com NBT/BCIP após incubação com o anticorpo secundário conjugado a fosfatase alcalina.
A Figura 16 A mostra, para o par fenotípico de resistência induzida in vitro, o
percentual da variação na concentração da tirosina, em relação à concentração de
tirosina basal (tempo 0) da população susceptível 17WTS. Observou-se que o nível
basal é 40% menor na população resistente ao BZ, 17LER, bem como um aumento após
a incubação de 75% para 17WTS e 135% para 17LER.
A Figura 16 B mostra, para o par fenotípico de resistência selecionada in vivo, o
percentual da variação na concentração da tirosina, em relação à concentração de
tirosina basal (tempo 0) da população susceptível BZS. Observou-se o nível basal 20%
maior na população resistente ao BZ, BZR, bem como um aumento após a incubação de
85% para BZS e 60% para BZS.
Finalmente, a Figura 16 C, mostra para o par das cepas CL (susceptível) e
Colombiana (naturalmente resistênte ao Bz), o percentual da variação na concentração
da tirosina, em relação à concentração de tirosina basal (tempo 0) da cepa CL.
Observou-se que o nível basal de tirosina é 73% maior na população resistente ao BZ,
Colombiana, bem como um aumento após a incubação de 113% para CL e 98% a
Colômbia.
1 2 3 4
50
Figura 16: Degradação protéica intracelular não lisossomal. Degradação relativa a concentração de
tirosina do grupo controle (tempo 0) da cepa susceptível: a concentração de tirosina foi mensurada no
tempo 0 (basal), e após 90 minutos de incubação com ATP, ATP + Ubiquitina e ATP + Ubiquitina + MG-
132. Os gráficos mostram a média da concentração obtida da triplicata técnica de um experimento. Vale a
pena ressaltar que a atividade sistema variou de preparação para preparação em termos absolutos,
entretanto, foi observado a manutenção na magnitude da taxa de proteólise entre as réplicas biológicas. a
diferença estatística ao controle e * diferença estatística ao mesmo grupo entre o par fenotípico.
Observamos pela Figura 17, o percentual da variação na concentração da
tirosina, em relação a concentração de tirosina basal (tempo 0) da população PP75, da
espécie L. chagasi. Observou-se que o nível basal de tirosina da espécie L. amazonensis
é 320% maior quando comparada as outras Leishmanias estudadas. A proteólise nos
grupos em que foram adicionados, ATP e ATP conjuntamente com ubiquitina, possui
níveis maiores de tirosina quando comparados ao controle, contudo, a comparação entre
estes dois grupos não revela diferença na proteólise.
A adição de 50µM de MG-132 reduziu a proteólise a níveis similares ao
encontrado no controle.
51
Figura 17: Degradação protéica intracelular não lisossomal em Leishmania sp. Degradação relativa a
concentração de tirosina do grupo controle (tempo 0) da população PP75 da espécie L. chagasi: a
concentração de tirosina foi mensurada no tempo 0 (basal), e após 90 minutos de incubação com ATP,
ATP + Ubiquitina e ATP + Ubiquitina + MG-132. a diferença estatística ao controle e * diferença
estatística do grupo controle entre as cepas de Leishmania sp. estudadas.
52
5 Discussão
53
A proteólise intracelular dependente de proteassoma é a principal via de
degradação não lisossomal em células eucarióticas e, responsável pela degradação de
proteínas anormais e de meia via curta tanto no citosol como no núcleo. Usualmente, o
proteassoma 20S é associado a reguladores, entretanto, os mecanismos envolvidos na
interação PA700-20S-PA700, PA28-20S-PA28 e híbridos ainda são pouco
compreendidos (revisado por RECHSTEINER & HILL 2005).
Nos parasitos protozoários o entendimento da função do proteassoma 20S foi
realizado utilizando inibidores específicos para esta protease, tanto de natureza aldeídica
como -lactamica. Especialmente, no T. cruzi, foi observada a interferência no
remodelamento morfológico, e ainda, o impacto na proteólise durante o remodelamento
morfológico pela depleção de ATP, concomitante ao uso de inibidores do proteassoma e
outras proteases, avaliando a contribuição de cada via da degradação protéica.
(GONZÁLES et. al., 1996; DE DIEGO et. al., 2001).
O papel do proteassoma 20S no desenvolvimento do T. cruzi, foi investigado
Cardoso et. al., (2008) que demonstraram que a adição de lactacistina, um inibidor do
proteassoma 20S bloqueia a replicação das formas epimastigotas de T. cruzi. Além
disso, a adição desse inibidor no meio TAU bloqueou a metaciclogênese in vitro.
Também foi observado um arraste na fase G2 do ciclo celular. Esses resultados em
conjunto sugerem que o proteassoma é essencial no processo de metaciclogênese.
O uso de inibidores para avaliar a contribuição da proteólise dependente do
proteassoma no desenvolvimento de parasitas é uma linha de investigação que vem
sendo desenvolvida nos últimos cinco anos em nosso laboratório. Nesses estudos foi
observado que inibidores aldeídicos como, por exemplo, PSI e MG-132 bloqueiam a
replicação de epimastigotas das cepas Be-62, Be-78 e Y do T. cruzi. Além disso, o uso
de tripomastigotas sanguíneos das populações Be-62, Be-78 e Y do T. cruzi, pré-
incubados com PSI, promoveu uma inibição na parasitemia de 68, 42 e 73%
respectivamente quando comparado ao grupo controle (HANGAI, 2007).
Além disso, foi verificado que o tratamento prévio de tripomastigotas
sanguíneos da população Y do T. cruzi com PSI alterou o tropismo tecidual uma vez
que, foi detectado um aumento do parasitismo nos músculos cardíaco e esquelético
acompanhado de uma diminuição no baço e fígado. Considerando que a população Y é
descrita na literatura com reticulotrópica, este resultado abre questões interessantes
54
sobre a contribuição de um proteassoma funcional para o estabelecimento da DC
(BRENER, 1973).
Trabalho prévio deste laboratório (OLIVEIRA, 2007), utilizando as populações
17WTS, 17LER, BZS, BZR, Cl e Colombiana demonstraram um perfil de hidrólise
diferencial dos peptídeos GGR-MCA e LLVY-MCA, específicos para as atividades
semelhantes à tripsina e quimotripsina em frações enriquecidas de proteassoma. Além
disso, utilizando anticorpo contra as subunidades do tipo alfa, foi detectada uma
quantidade significantemente maior do proteassoma 20S nas cepas sensíveis em relação
às cepas resistentes ao benzonidazol, entretanto, como foi utilizado um anticorpo
comercial (clone MCP231- PW8195 – Biomol Biotechnology) que reconhece 5 das 7
subunidades alfa do proteassoma 20S, esse resultado foi questionado quanto a
especificidade uma vez que foi utilizado anticorpo contra subunidades de proteassoma
de mamíferos.
Neste mesmo trabalho foi demonstrado que o perfil de conjugados ubiquitinados
era equivalente entre as diferentes populações analisadas, não sendo detectados acúmulo
de substratos poli-ubiquitinados, os substratos naturais do proteassoma 26S, sugerindo
que esta via deveria estar funcionando de forma regulada nas populações de T. cruzi
estudadas.
Esses resultados abriram diversas questões sobre a contribuição do proteassoma
para o stead-stade protéico no T. cruzi, das quais destaca a influência das modificações
pós traducionais e da dinâmica de interações do proteassoma com seus reguladores e
PIPs (do inglês: Proteasome interaction proteins) na atividade peptidásica do
proteassoma 20S.
Dando continuidade a esta investigação, o objetivo geral desse trabalho foi a
analise bioquímica inicial do proteassoma 20S e seus reguladores em extratos protéicos
solúveis de epimastigotas de populações de T. cruzi com fenótipo de resistência ao
benzonidazol.
O uso de extratos protéicos solúveis justifica-se, pois nele encontra-se o
proteassoma 20S, o proteassoma símile HslV/U, os reguladores PA700 e PA26, PIPs e
os alvos naturais destas proteases. Análises anteriores de purificação do proteassoma,
utilizando métodos clássicos como precipitação com sulfato de amônio seguido de
cromatografia de troca iônica em Q-sepharose evidenciou sub-populações de
proteassomas sendo possível separar uma sub-população cuja capacidade de hidrolise
55
era maior para o peptídeo Gly-Gly-Arg-AMC (atividade semelhante à tripsina) e uma
outra para Suc-Leu-Leu-Val-Tir-AMC (atividade semelhante a quimotripsina-
resultados não apresentados).
Considerando a complexidade destas sub-populações e resultados de Barbosa
(2010) demonstrando a coexistência do proteassoma símile HslVU e a necessidade de
grande quantidade de parasitos nas etapas de purificação, optamos por avançar no
entendimento do funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma para posterior
retomada da purificação das sub-populações de proteassomas identificados (dados não
mostrados).
A Tabela 1 mostra a atividade do proteassoma 20S utilizando peptídeos para as
atividades semelhantes à tripsina, quimotripsina e caspase. Foi observado que somente a
atividade tripsina está associada ao fenótipo de resistência ao benzonidazol. A medida
da atividade peptidásica do proteassoma contra substratos fluorogênicos também revela
uma preferência à degradação do peptídeo CBZ-Gly-Gly-Arg-MCA, nas populações
17WTS e 17LER e na cepa CL. Este resultado é corroborado pelo descrito para o
proteassoma 20S purificado do T. cruzi e para o T. brucei (GONZÁLEZ et. al., 1996;
HUA et. al.,1996). É interessante notar que no proteassoma 20S e 26S purificado de
mamíferos a atividade peptidásica mais intensa é a semelhante à quimotripsina. O
motivo e função desta mudança na cinética dos sítios ativos não foram estabelecidos até
o momento. Vale a pena ressaltar que apesar dos estudos cinéticos demonstrarem que a
atividade semelhante à quimotripsina é secundária, a inibição desta atividade pela
adição de MG-132 ou PSI bloqueia o ciclo celular do T. cruzi (CARDOSO, 2008;
HANGAI, 2007).
Já a intensidade da degradação do peptídeo Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC
(atividade semelhante à quimotripsina), não variou no par fenotípico de resistência
induzida in vitro, foi maior na população susceptível no par fenotípico de resistência
selecionada in vivo e menor na população susceptível no par fenotípico de resistência
natural, assim não correlacionando com o fenótipo de resistência.
Esses resultados também evidenciaram que os proteassoma das populações BZS
e BZR e a cepa Colombiana, tem preferência para hidrolisar o peptídeo Suc-Leu-Leu-
Val-Tyr-AMC. Um resultado semelhante foi encontrado em tripanosomatideos, em um
único estudo, para o proteassoma 20S purificado em L. mexicana (ROBERTSON,
1999).
56
Também foi observado uma baixa atividade semelhante à caspase, que pode ser
atribuída ao peptídeo utilizado como substrato. Sabe-se que o peptídeo utilizado (Leu-
Leu-Asp-AMC) também pode ser construído com um grupo 2-naftilamina como
fluoroforo, apresentando uma taxa de degradação 600 vezes maior pelo proteassoma de
mamíferos quando comparado ao peptídeo contendo o fluoróforo 7-metilcumarina
(KISSELEV e GOLDBERG, 2005). Contudo a opção por utilizar o fluoróforo 7-
metilcumarina foi por ser o mesmo fluoróforo dos demais substratos e, evitou-se
trabalhar com o carcinógeno 2-naftilamina. Por outro lado, González et.al., (1996)
demonstrou que a atividade semelhante à caspase é aproximadamente 10 vezes menor
que a atividade semelhante à quimotripsina e 17 vezes menor que a atividade
semelhante à tripsina. Esses resultados corroboram os dados obtidos neste estudo.
O proteassoma do T. cruzi de forma semelhante ao de eucariotos, possui três
diferentes tipos de sítios ativos: dois semelhantes à quimotripsina, dois semelhantes à
tripsina, e dois semelhantes à caspase que diferem em sua especificidade em relação
peptídeo fluorogênico (substratos modelo). Para mamíferos, o sítio semelhante à
quimotripsina é freqüentemente considerado o mais importante na degradação de
proteínas, e é o único cuja atividade deve ser mensurada com o propósito de avaliar a
capacidade de degradar proteínas pelo proteassoma (KISSELEV e GOLDBERG, 2005).
Estes peptídeos são amplamente utilizados, bem conhecidos e específicos como visto
para o peptídeo Suc-Leu-Leu-Val-Tir-AMC em que apenas 5% da degradação não é
catalisado pelo proteassoma em células HeLa. Também ressaltamos que a hidrólise dos
peptídeos na Tabela 1 podem ser relacionadas ao proteassoma uma vez que a adição de
MG-132 bloqueia a atividade semelhante à quimotripsina sem afetar a atividade
semelhante a tripsina (Tabela 2).
González et, al., (1996) trabalhando com a cepa Y do T. cruzi demonstrou que,
em proteassomas purificados, a atividade semelhante à tripsina é aproximadamente 7
vezes maior que a atividade semelhante a quimotripsina. Não descartamos que o
substrato utilizado para a atividade semelhante à quimotripsina, também pode ser
degrado pelo proteassoma-like, HslVU, contudo a degradação de peptídeos por este
complexo mostra-se dependente de ATP, no tripanosomatideo T. brucei (LI et. al.,
2008), o que não é relatado para o proteassoma 20S. Já para o substrato utilizado para
mensurar a atividade semelhante à tripsina, não encontramos relatos de sua degradação
por este complexo. Ainda, não podemos descartar que as diferentes montagens do
57
proteassoma estejam influenciando a atividade semelhante a quimotripsina, uma vez
que González et. al., (1996) relata que a atividade quimotripsina sofre uma considerável
queda durante o processo de purificação do proteassoma.
Nosso próximo passo foi investigar se as diferenças da atividade peptidásica
eram resposta a diferenças na expressão protéica do proteassoma 20S. Uma outra
hipótese levantada foi que o complexo treonino protease HslVU, estaria contribuindo
para o resultado encontrado, uma vez que o T. cruzi é um dos raros organismos que co-
expressa os dois complexos.
Para avaliar os níveis do proteassoma 20S e da HslVU foram utilizados
anticorpos específicos produzidos em camundongos contra a proteína recombinante do
T. cruzi. Não foi observado variação na expressão da subunidade α7 entre as populações
estudadas (Figura 8). Vale apena ressaltar que foi considerado significativo, diferenças
quando a razão α7/HSP70 entre as populações foi maior ou igual 1,5.
Andrade et. al. (2008), utilizando abordagem proteômica, relataram que os
níveis protéicos da subunidade β5 do proteassoma 20S estão aumentados no clone
resistente 27R (derivado da população BZR) comparado ao clone 9S (derivado da
população BZS), contudo esta mesma correlação não foi encontrada quando foram
analisados os pares BZS / BZR e 17WTS / 17LER, sugerindo que a super expressão de
um dos constituintes do proteassoma 20S pode estar relacionada a um clone e que esta
up-regulation é perdida quando se analisa uma população policlonal.
Por outro lado, quando comparamos este resultado com os descritos por Oliveira
(2007), notamos uma diferença no padrão de reatividade do anticorpo entre as
populações. Essas diferenças estão relacionadas ao anticorpo utilizado, desenvolvido
para reconhecer um epítopo comum a todas as subunidades α do proteassoma de
mamíferos e como em um fracionamento por PAGE as subunidades do proteassoma
formam um agrupamento de bandas entre 25 a 32 kDa aproximadamente, forma-se um
sinal duplo dificultando a análise.
Neste trabalho, foi utilizada uma subunidade para quantificar os níveis de
proteassoma existentes em epimastigotas. A hipótese de que os resultados da Figura 8
estão superestimados foi descartada uma vês que não é relatado a transcrição e tradução
esterioquimicamente excessiva de subunidades do tipo α do proteassoma, de forma que
todas estão incorporadas nos proteassomas 20S e 26S (DAHMANN, 2005).
58
A quantificação da subunidade HslV (Figura 9), do complexo proteolítico
HslVU, mostrou-se semelhante nas populações estudadas. Barbosa (2010) estudando as
cepas Berenice 62, Berenice 78 e Y do T. cruzi observou que tanto o proteassoma
quanto o HslV possuem uma expressão própria em cada uma destas cepas, e que seus
perfis de expressão foi modulado na presença do inibidor de treonino protease MG-132.
Considerando que os níveis protéicos tanto do proteassoma 20S como do
proteassoma-like HslVU são equivalentes, as diferenças nas atividades peptidásicas
observadas na Tabela 1, poderiam ser explicadas pela dinâmica de montagem do
proteassoma com seus ativadores: PA700 e PA26. Para essa avaliação, foi utilizada a
proteína RPN7 da partícula ativadora PA700 na intenção de reduzir interferentes no
Western blot, uma vez que outros componentes da partícula PA700 possuem domínios
conservados a outras proteínas não associadas ao reconhecimento do substrato e
endereçamento ao proteassoma como por exemplo as subunidades RPT 1-6 ATPases
que possuem o domínio AAA (cd00009) comum a outras ATPases envolvidas em
diversos processos celulares, a RPN10 que possui o domínio UIM também presente em
membros da família E3 de ligação a ubiquitina (LE BLOAS, 2007).
A Figura 9A mostra que os níveis da proteína RPN7 não variaram entre as
populações estudadas, assim como os níveis da proteína PA26 (figura 10A).
A Figura 10 também mostra que o anticorpo contra a proteína PA26 reconheceu
outras proteínas. Novos experimentos estão sendo realizados para identificar quais
proteínas estão reagindo com o anticorpo, contudo, como as proteínas de interação ao
proteassoma utilizam motivos similares, não excluímos a possibilidade dos anticorpos
estarem reagindo com outras proteínas que possuem estes mesmos motivos.
Resultados similares foram descritos por Cardoso (2010) que demonstra níveis
equivalentes do PA700 e PA26 durante a metaciclogênese in vitro do T. cruzi,
sugerindo que as diferentes montagens do proteassoma estão co-existindo na célula ao
longo da metaciclogênese, sendo ativados em locais específicos conforme a necessidade
celular.
Em conjunto estes resultados evidenciam pela primeira vez níveis semelhantes
dos ativadores PA700 e PA26 em epimastigotas tanto de populações com o mesmo
genótipo como em populações com diferentes DTUs.
A fim de verificar possíveis diferenças no proteassoma nativo, neste trabalho
também foi avaliada a mobilidade eletroforética do proteassoma, com o propósito de
59
avaliar a dinâmica das interações do proteassoma 20S com seus ativadores. Foi
observada uma mobilidade eletroforética diferencial para os proteassomas das
populações analisadas (Figura 12) sugerindo que essas diferenças na migração podem
estar relacionadas à cinética de interação do proteassoma 20S com seus reguladores.
Entretanto, como esta metodologia alia a carga elétrica e o peso molecular, uma
hipótese bastante atrativa é que a migração diferencial do proteassoma 20S quando
comparamos a população Colombiana e as demais seria conseqüência direta da
interação do proteassoma 20S com seus ativadores e proteínas acessórias (PIPs). No pH
8,3, a mobilidade é afetada pela carga, assim proteassomas com número maior de cargas
negativas teriam uma maior mobilidade, por exemplo, sendo afetada pelo ``status`` de
fosforilação o que também justificaria o resultado encontrado (Figura 12). Diversos
grupos independentes vêem demonstrando que a fosforilação das subunidades do tipo α
é uma forma de regulação da atividade do proteassoma 20S (LÓPEZ-OTÍN et. al.,
2010; RAABEN et. al., 2010).
Resultados preliminares sugerem um efeito da fosforilação na atividade
peptidásica do proteassoma de T. cruzi (dados não mostrados). Futuros experimentos
irão investigar a dinâmica de interação do proteassoma 20S com seus ativadores e a
fosforilação regulando a atividade. Os resultados das Figuras 8, 9 e 10, analisados em
conjunto sugerem que nas formas epimastigotas do T. cruzi co-existem proteassomas
livres e associados aos seus reguladores.
Já está bem documentado que em células de mamíferos 40% dos proteassomas
estão em sua forma livre de ativadores (proteassoma 20S), 25% formam proteassoma
híbrido PA700-20S-PA28, 20% proteassoma ligado a duas partículas PA26 e 15%
proteassoma 26S (Cascio et. al., 2002), o que corrobora os resultados encontrados neste
trabalho.
O próximo objetivo foi determinar a taxa de proteólise intracelular não
lisossomal e dependente de proteassoma. Para isso, foi determinada a concentração de
tirosina livre, após a adição de ATP, ATP e ubiquitina, na presença ou ausência de MG-
132.
Foi observado que a concentração de tirosina basal variou significativamente
quando foram comparados as populações com o mesmo genótipo e diferentes fenótipos
de resistência, sugerindo uma variação do stead-state protéico e/ou a diferente captação
deste aminoácido nas populações resistentes (Figura 16). Resultado similar também foi
60
observado quando foram comparadas as cepas CL e Colombiana, que possuem
diferentes classificações DTUs.
Também foi observado um aumento na taxa de proteólise não lisossomal após a
adição de ATP e que a adição de ubiquitina não induziu um aumento nesta taxa, sendo
bloqueado pela adição de MG-132.
Esse resultado levantou algumas questões sobre a contribuição do proteassoma
para a taxa de proteólise intracelular não lisossomal, das quais se destaca: (a) a
manutenção dos níveis de tirosina livre após a adição de ubiquitina estaria relacionada a
baixa concentração dos alvos naturais desta protease, uma vez que trabalhamos com o
extrato solúvel; (b) a concentração de ubiquitina livre no extrato solúvel está elevada de
forma que a adição de uma quantidade extra não desloca o equilíbrio para a conjugação;
(c) o aumento na taxa após a adição de ATP foi devido à degradação preferencial de
proteínas oxidadas pelo proteassoma 20S livre e (d) como co-existem concentrações
equivalentes de PA700 e PA26, haveria predominância no extrato solúvel de
proteassomas híbridos (PA700-20S-PA26).
Cardoso et. al. (2010) demonstrou para a cepa DM28 (DTU Tc-III) que a taxa de
proteólise não lisossomal se mantém após a adição de ubiquitina, contudo se reduz a
medida que a metaciclogenese ocorre atingindo um mínino na tripomastigota
metacíclica, corroborando com os resultados encontrados neste estudo.
Para analisar estas questões foram determinados tanto os perfis de proteínas
ubiquitinadas, que são reconhecidas pelo proteassoma 26S como das oxidadas que
podem ser reconhecidas pelo proteassoma 20S.
A Figura 13 mostra um perfil semelhante de proteínas conjugadas a ubiquitina.
Além disso, na presença de MG-132 foi verificado um acúmulo discreto das proteínas
ubiquitinadas, sugerindo que estas proteínas são degradadas pelo proteassoma 26S. De
Diego, (2001) observou acúmulo de conjugados durante a transição tripomastigota para
amastigota da cepa Y do T. cruzi, entretanto, considerando que a técnica não distingue
modificações envolvendo K29, K48 e K63, não é possível correlacionar este resultado
com um aumento da taxa de proteólise. Além disso, o anticorpo não detectou ubiquitina
livre nos blottings, sugerindo que não há excesso de ubiquitina livre nos extratos
utilizados para a medida de proteólise. Esses resultados são corroborados pelos
apresentados na Figura 15, onde se pode observar um aumento na quantidade de
proteínas ubiquitinadas após a adição de ATP e ubiquitina ao extrato, sugerindo que a
61
ubiquitina adicionada ao meio foi conjugada aos alvos protéicos existentes no extrato
solúvel.
Foi utilizado o ensaio com DNPH para detectar e monitorar os níveis de
proteínas carboniladas em epimastigotas das populações de T. cruzi utilizadas neste
estudo. A carbonilação de proteínas é um indicador clássico de estresse oxidativo dentro
das células. É uma alteração irreversível, que desestabiliza as proteínas pela
modificação na conformação, e que geralmente são degradadas pelo proteassoma 20S
(GRUNE et. al., 1995; LEVINE, 2002 e BERLETT E STADTMAN, 1997). A Figura
14 sugere diferenças na quantidade de proteínas oxidadas nos extratos utilizados para a
determinação da taxa de proteólise intracelular, sendo mais abundantes nas populações
17WTS e BZS quando comparado com as populações 17LER e BZR.
Na literatura não encontramos correlações sobre a oxidação protéica no
tratamento da Doença de Chagas com benzonidazol, mas como este composto é um
agente redutor e, sabidamente, age desregulando o equilíbrio redox ligando-se
covalentemente para formar intermediários nitrorreduzidos com os componentes do
parasita, DNA, lipídios e proteínas (WERNER et. al., 2008), o benzonidazol pode estar
ligando-se aos grupos carbonila ou prevenindo seu surgimento devido ao stress
oxidativo que parece ser importante na manutenção da viabilidade celular. Futuros
experimentos serão realizados para confirmar essa hipótese.
Em conjunto esses resultados sugerem que a taxa de proteólise não lisossomal
dependente de proteassoma é regulada por mecanismos dependentes e independentes de
ubiquitina. Essa hipótese é corroborada pela existência de proteassomas híbridos em T.
cruzi e pelos resultados que demonstram que a degradação de substratos como a ornitina
descarboxilase acontece de forma dependente de ATP e independente de ubiquitina
(MURAKAMI et. al., 1992; JARIEL-ENCONTRE et. al.,2008), sendo reconhecida por
proteassomas híbridos (PA700-20S-PA26). Além disso, deve-se considerar a co-
existência dos complexos HslVU e proteassoma 20S e que o HslVU, pode contribuir de
forma significativa para a taxa de proteólise não lisossomal.
62
6 Conclusão
63
Os principais resultados obtidos neste trabalho foram:
A correlação entre a atividade semelhante à tripsina do proteassoma e o fenótipo
de resistência a drogas em T. cruzi;
Não foram detectadas diferenças significativas nos níveis protéicos de
proteassoma 20S, do proteassoma- símile HSLV/U, PA700 e PA26;
A taxa de proteólise intracelular foi estimulada pela adição de ATP;
A adição de ubiquitina não induziu um aumento real na taxa de proteólise
intracelular não lisossomal;
Não há diferenças entre o perfil de proteínas ubiquitinadas quando comparamos
populações sensíveis e resistentes ao benzonidazol;
O perfil de proteínas oxidadas mostrou-se diferente entre as populações
analisadas.
A analise em conjunto desses resultados permite concluir que o turnover
protéico em epimastigotas de populações com o mesmo genótipo e fenótipo distinto de
resistência ao benzonidazol e DTU´S exibe um elevado grau de complexidade sendo
extremamente bem regulado por fatores internos e externos ao T. cruzi.
64
7 Perspectivas
65
Diante dos resultados já obtidos, abrem-se as seguintes perspectivas:
Realização de géis 2D seguido de imunoblotting para confirmar a ausência de
acúmulo de conjugados poli-ubiquitinados no padrão de cepas estudado;
Determinação dos níveis do proteassoma 20S a partir das formas tripomastigota
e amastigota, bem como da atividade proteolítica e peptidásica;
Determinação de modificações pós-traducionais e do efeito da fosforilação e
glicosilação de subunidades do proteassoma sobre a atividade enzimática;
Purificação do complexo HslVU, bem como sua caracterização bioquímica;
Obtenção de anticorpos em ratos e coelho para localizar o complexo HslV/U e o
proteassoma 20S em diferentes populações e formas evolutivas de T. cruzi.
66
8 Referencias
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