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LOUISE MORAES
ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE
PROGENITORES NEURAIS EM MODELO MURINO DA
DOENÇA DE HUNTINGTON
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Rio de Janeiro 2 0 0 7
LOUISE MORAES
ANÁLISE DA PROLIFERAÇÃO E MIGRAÇÃO DE
PROGENITORES NEURAIS EM MODELO MURINO DA
DOENÇA DE HUNTINGTON
Orientação: Rosalia Mendez-Otero.
Co-orientação: Claudia Maria de Castro Batista.
Rio de Janeiro
2 0 0 7
ii
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (FISIOLOGIA).
Banca examinadora: João Ricardo Lacerda de Menezes (UFRJ) Gabriel Rodríguez de Freitas (UFRJ) João Guedes da Franca (UFRJ)
iii
AGRADECIMENTOS
À professora Rosalia Mendez-Otero, que em face aos desafios encontrados
na elaboração deste trabalho me conduziu de maneira dedicada e competente,
norteando-me em momentos cruciais.
À professora Claudia Maria de Castro Batista, pela participação
fundamental ao definir o ponto de partida da nossa pesquisa e fornecer os
animais transgênicos utilizados como base desta dissertação.
Ao professor Marcelo Felippe Santiago, com quem pude esclarecer muitas
questões práticas, por compartilhar com tão boa vontade seus conhecimentos,
pela obtenção de imagens no microscópio confocal e pela revisão deste
trabalho.
A todos os amigos e colegas que com sua simpatia motivaram-me durante
os últimos dois anos, especialmente: Denise de Freitas Campos, pela infinita
paciência e disposição em auxiliar; Catarine Conti Lima, Arthur Giraldi
Guimarães e Ricardo Azevedo, que em atenção ao estudo disponibilizaram seu
tempo para discutir eventuais questões que surgiam; e Ana Carolina Machado
de Oliveira, pela gentileza, fator indispensável ao convívio diário.
À Marília Kimie Shimabukuro, por estar presente durante meus primeiros
passos na atividade de pesquisa contribuindo para o desenvolvimento deste
trabalho.
A Paulo Emílio Correa Leite, cujo entusiasmo pela ciência me incentiva a
cada dia e cujo humor torna leve qualquer tarefa.
Aos meus pais, por prezarem pela educação tornando possível este passo
da minha vida; e finalmente aos meus avós e minhas irmãs, pela companhia e,
especialmente, pelos ouvidos sempre acessíveis.
iv
“O conhecimento humano e o poder humano são um só, pois onde a causa
não é conhecida, o efeito não pode ser produzido. A natureza, para ser
comandada, deve ser obedecida... A sutileza da natureza é muitas vezes maior
do que a sutileza dos sentidos e da compreensão.”
Francis Bacon
v
RESUMO
A doença de Huntington (DH) é uma patologia neurodegenerativa
caracterizada pela perda seletiva de neurônios estriatais. A zona subventricular
(SVZ) de mamíferos adultos contém uma população de precursores neurais
envolvidos na neurogênese pós-natal. Estas células migram a partir da SVZ ao
longo da via migratória rostral (RMS) a se diferenciam em neurônios do bulbo
olfatório no cérebro adulto. Neste trabalho, procuramos verificar os efeitos da
mutação na DH sobre a neurogênese no cérebro adulto utilizando a linhagem
R6/2, um modelo murino da DH. Nosso objetivo foi verificar as possíveis
alterações na proliferação e na migração dos progenitores neurais neste
modelo experimental utilizando a incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU)
como metodologia para identificar estes progenitores. A marcação por BrdU
não evidenciou diferenças na proliferação de precursores entre camundongos
R6/2 e camundongos selvagens. A migração de neuroblastos em direção ao
bulbo olfatório era significativamente reduzida em camundongos R6/2
sintomáticos (n=4, p≤ 0,05), entretanto não evidenciamos migração para as
regiões cerebrais afetadas pela DH. A análise de duas moléculas expressas na
migração ao longo da RMS, a molécula de adesão celular polissialilada e o
gangliosídeo 9-O-acetil GD3, não mostrou diferenças entre os animais afetados
e os selvagens assim como o número de células em processo de apoptose na
RMS. Desta forma, o aumento de células na porção caudal da RMS de
camundongos R6/2 sugere uma alteração migratória nesta via.
vi
ABSTRACT
Huntington´s disease (HD) is a neurodegenerative disorder characterized
by a selective loss of striatal neurons. The mammalian brain subventricular
zone (SVZ) contains a population of neural precursor involved in postnatal
neurogenesis. The newly generated cells migrate from the SVZ through the
rostral migratory stream (RMS) and differentiate into mature olfactory bulb
neurons throughout adulthood. In the present work we sought to investigate the
effects of the HD mutation in the proliferation and migration of neural
progenitors using bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation as a marker of
progenitor cells. BrdU labeling did not show a difference in the proliferation
between WT and R6/2 symptomatic animals. The migration of neuroblasts
towards the olfactory bulb was significantly diminished in symptomatic R6/2
(n=4, p≤ 0,05) but we failed to find neuroblasts migrating to the cerebral regions
affected by HD. The expression of two molecules associated with migration in
the RMS, polysialylated neural cell adhesion molecule and 9-O-acetil GD3, as
well as the number of cells undergoing apoptosis in the RMS was similar in the
control and affected animals. The increased number of cells in the caudal RMS
of R6/2 mice suggests migratory alterations in this pathway.
vii
LISTA DE FIGURAS _______________________________________________________________
1 Principais regiões acometidas na DH........................................................3
2 Progressão da DH em camundongos R6/2............................................... 7
3 Alteração da resposta motora de um camundongo com DH.....................9
4 Marcação por Fluoro-Jade-C...................................................................11
5 Células ependimárias como células-tronco............................................. 13
6 Astrócitos como células-tronco................................................................15
7 A via migratória rostral.............................................................................19
8 Imagem confocal de neuroblastos em associação com astrócitos......... 20
9 Três diferentes fases da migração na RMS............................................ 21
10 Gangliosídeo 9-O-acetil GD3.................................................................. 23
11 Gangliosídeo 9-O-acetil GD3 na RMS.................................................... 24
12 Expressão de PSA-NCAM.......................................................................25
13 Estrutura da PSA-NCAM......................................................................... 26
14 Interação mediada por NCAMs............................................................... 27
15 Incorporação de BrdU............................................................................. 32
16 Representação das regiões analisadas.................................................. 34 + 17 Células BrdU nas regiões proximais da RMS ....................................... 40 + 18 Células BrdU nas regiões distais da RMS............................................. 41
19 Possível acúmulo de células na porção proximal da RMS......................43
20 Migração de neuroblastos para regiões diferentes dos bulbos............... 44
21 Possível aumento da morte celular ao longo da RMS............................ 44
22 Expressão de PSA-NCAM na porção proximal da RMS......................... 46
23 Expressão de PSA-NCAM em porção distal da RMS............................. 46
24 Células marcadas com PSA-NCAM e SYTOX green..............................47
25 Célula expressando o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em DH................... 49
26 Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 na RMS em selvagem........ 49
27 Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 em DHs.............................. 50
28 Morte celular na RMS.............................................................................. 51
29 Neurônios em degeneração no corpo estriado de camundongo R6/2.... 53
30 Ausência de células marcadas por Fluoro-Jade-C em WTs................... 54
viii
TABELA E GRÁFICOS _______________________________________________________________
Tabela de anticorpos......................................................................................... 35
+Células BrdU na RMS...................................................................................... 42 +Células PSA-NCAM na RMS............................................................................ 48
Células Fluoro-Jade-C+ na RMS........................................................................ 52
ix
LISTA DE ABREVIATURAS _______________________________________________________________
BDNF Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (do inglês: Brain-Derived
Neurotrophic Factor)
BrdU Bromodeoxiuridina
BSA Albumina do Soro Bovino (do inglês: Bovine Serum Albumin)
CAG Citosina-Adenina-Guanina
CT Célula-Tronco
DAPI Do inglês: 4′,6-diamidino-2-phenylindole
DH Doença de Huntington
DNA Ácido Desoxirribonucléico (do inglês: DesoxirriboNucleic Acid)
FGF-2 Fator de Crescimento de Fibroblasto 2 (do inglês: Fibroblast
Growth Factor 2)
GFAP Proteína Glial Fibrilar Ácida (do inglês: Glial Fibrillary Acidic
Protein)
Htt Huntingtina
IT – 15 Do inglês: Interesting Transcript-15
OCT Resina Comercial para Criostato (do inglês: Optimal Cutting
Temperature)
PBS Salina Tamponada com Fosfato (do inglês: Phosphate Buffered
Saline)
PoliQ Poliglutamina
PPD Para-Fenileno-Diamina (do inglês: p-Phenylene-Diamine)
PSA-NCAM Molécula de Adesão Celular Polissialilada (do inglês:
Polysialylated Neural Cell Adhesion Molecule)
RMS Via Migratória Rostral (do inglês: Rostral Migratory Stream)
SGL Camada Subgranular (do inglês: Subgranular Layer)
SNC Sistema Nervoso Central
SVZ Zona Subventricular (do inglês: Subventricular Zone)
TUNEL Do inglês: Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling
vl Ventrículo Lateral
x
SUMÁRIO ________________________________________________________________
INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1
1 Doença de Huntington............................................................................... 1
1.1 A doença................................................................................................... 1
1.2 Anatomo-patologia.................................................................................... 2
1.3 Manifestações clínicas.............................................................................. 4
1.4 Bases moleculares.................................................................................... 5
1.5 O modelo experimental R6/2..................................................................... 7
1.6 Morte celular na doença de Huntington.................................................... 8
2 Utilização do Floro-Jade-C como marcador de morte celular................. 10
3 Terapias sugeridas para o tratamento da DH......................................... 11
4 Células-tronco no SNC adulto................................................................. 12
5 A zona subventricular e a via migratória rostral...................................... 16
5.1 Migração na RMS.................................................................................... 17
5.2 Moléculas envolvidas.............................................................................. 21
5.2.1 Gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e migração celular.................................... 22
5.2.2 PSA-NCAM e migração celular............................................................... 24
6 Alterações migratórias geradas por lesões no SNC................................28
OBJETIVOS....................................................................................................... 30
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 31
1 Animais.................................................................................................... 31
2 Metodologia para o emprego de BrdU como traçador celular................. 32
3 Processamento do material..................................................................... 33
3.1 Perfusão.................................................................................................. 33
3.2 Criocortes................................................................................................ 33
3.3 Imuno-histoquímica................................................................................. 35 +4 Quantificação de células BrdU na RMS................................................. 36
5 Aquisição de imagens............................................................................. 37
6 Análise estatística................................................................................... 37
RESULTADOS................................................................................................... 39
1 Incorporação de BrdU na RMS................................................................39
2 Expressão de moléculas associadas à migração na RMS......................45
xi
3 Morte celular na RMS.............................................................................. 50
DISCUSSÃO...................................................................................................... 55
CONCLUSÕES.................................................................................................. 64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................65
ANEXOS............................................................................................................ 78
xii
INTRODUÇÃO
1 Doença de Huntington
Em 1872, George Huntington forneceu a primeira descrição completa da
doença que hoje recebe seu nome (HUNTINGTON, 1872). Esta patologia foi
inicialmente apresentada como coréia hereditária. Coréia (do grego “dança”) é uma
designação associada às alterações motoras que são observadas nos pacientes.
A Doença ou Mal de Huntington (DH) é uma patologia neurodegenerativa
relativamente rara, acometendo uma a cada dez mil pessoas no mundo todo. Apesar
dos esforços em se desenvolverem terapias para a cura, até o momento não existe
tratamento efetivo para a DH (MELONE et al., 2005; LI et al., 2005).
1.1 A doença
A DH pertence a uma família de doenças causadas pela expansão de um
segmento de poliglutaminas (poliQs) em determinadas proteínas. Na DH, a alteração
é causada por uma mutação no braço curto do quarto cromossomo, no qual o gene
IT – 15 (Interesting Transcript-15) ou huntingtin, é responsável pela codificação de
uma proteína essencial à sobrevivência: a huntingtina (htt) (BATES, 2001).
O gene huntingtin compreende 180kb e contém 67 éxons. No éxon 1, a
seqüência repetitiva de nucleotídeos citosina-adenina-guanina
(CAGCAGCAGCAG...) é responsável por codificar uma cauda de glutamina na
extremidade da htt. Genes huntingtin normais contêm 35 ou menos seqüências
CAG, enquanto o gene causador da doença contém 36 ou mais repetições. Este
1
aumento de repetições resulta em uma cauda poliQ aumentada e, por mecanismos
ainda desconhecidos, faz com que neurônios de determinadas regiões cerebrais se
tornem particularmente vulneráveis à morte celular (COTRAN et al., 1991; BATES,
2001; SUGARS e RUBINSZTEIN, 2003).
Assim como qualquer outro caracter autossômico dominante herdado, a DH
possui algumas particularidades: Praticamente todos os pacientes têm um genitor
afetado, que por sua vez também possui um genitor afetado, e assim por diante
(COTRAN et al., 1991; WILLARD, 1991); Homens e mulheres exibem a
característica em proporções aproximadamente iguais e os dois sexos têm a mesma
probabilidade de transmitir a característica. Indivíduos heterozigotos afetados
transmitem a característica para aproximadamente metade das suas proles (JORDE,
2000). Entretanto, por mecanismos ainda desconhecidos, na DH não há diferença
na expressão fenotípica de homozigotos e heterozigotos (NARAIN et al., 1999).
A manifestação da DH ocorre habitualmente nas terceiras e quartas décadas
da vida e a sobrevida média é de 15 anos após o início dos sintomas, sendo
doenças cardiopulmonares e caquexia as causas mais freqüentes de morte nestes
pacientes. Sabe-se que o número de repetições trinucleotídicas é instável de uma
geração para outra e que quanto maior for este número, mais precoce será o
aparecimento dos sintomas (COTRAN, et al., 1991; ELIAS et al, 2001).
1.2 Anatomo-patologia
A htt contém 3.144 aminoácidos e massa molecular de aproximadamente
330kDa. Apesar desta proteína (tanto a normal quanto a mutante) existir nos mais
2
variados tecidos, em associação com várias organelas no citoplasma e no núcleo, a
degeneração observada nos pacientes da DH é seletiva. Assim, o sistema nervoso
central (SNC) é primordialmente afetado e nele algumas regiões são mais afetadas
do que outras (LANDWEHRMEYER, 1995; CATTANEO et al., 2005). Existem
evidências de que também o músculo esquelético apresenta inclusões, o que deve
estar relacionado à atrofia muscular que é observada em estágios avançados da
doença (ORTH et al., 2003).
O núcleo caudado e o putâmen, que juntos compõem o corpo estriado, são
severamente afetados. Na fase mais adiantada, esta patologia também atinge o
córtex - principalmente as camadas profundas e os lobos frontais (TURMAINE et al.,
2000; ELIAS et al, 2001). Uma perda substancial também é observada no globo
pálido e no núcleo subtalâmico, e alguns estudos têm relatado perdas no hipotálamo
(KREMER et al., 1991). Assim, nos pacientes com DH há diminuição de até 7% do
volume cerebral total (AYLWARD, 1994). A Figura 1 ilustra as principais regiões
acometidas pela DH.
Figura 1: Principais regiões acometidas na DH (imagem adaptada de BEAR et al., 2001).
Núcleo
Caudado
Putâmen
Globo Pálido Núcleo Subtalâmico
3
1.3 Manifestações Clínicas
“A doença comumente se inicia por leves abalos dos músculos da face, que
aumentam gradativamente em violência e variedade. As pálpebras são mantidas
piscando, a testa franzida depois elevada, o nariz torcido para um lado e depois para
o outro e a boca se volta em direções variadas, dando ao paciente a aparência mais
ridícula que se possa imaginar. Parece haver alguma força oculta, algo que está de
certa forma brincando com a vontade e de algum modo dificultando e pervertendo
seus desígnios; e depois que a vontade para de exercer sua força numa direção
qualquer, assume o controle e mantém a pobre vítima numa agitação contínua
enquanto ela permanece acordada” (HUNTINGTON, 1872).
As manifestações clínicas na DH abrangem distúrbios de movimentos,
alterações endócrinas e deterioração mental. Com a progressão da doença, os
movimentos tornam-se coreiformes (semelhantes a uma marcha dançante
espasmódica, que se sobrepõe aos movimentos voluntários e que desaparece
durante o sono). Ocorre, ainda, comprometimento da fala (disartria) e da deglutição
(disfagia), além de incontinência urinária. Na fase final da DH, os movimentos
coréicos podem desaparecer dando lugar à rigidez muscular. As alterações
endócrinas incluem distúrbios dos níveis de hormônios de crescimento e do
metabolismo de glicose, havendo inapetência, emagrecimento e conseqüente
aumento no catabolismo, que leva à caquexia (VONSATTEL e DIFIGLIA, 1998;
ELIAS et al, 2001). Os sintomas mentais abrangem a demência progressiva,
distúrbios de personalidade e alterações psiquiátricas.
4
1.4 Bases moleculares
Desde a descoberta da mutação causadora da DH, há cerca de 14 anos
(GOLDBERG, 1993), muitos mecanismos têm sido propostos para se explicar a sua
patogênese. A htt é normalmente encontrada no citoplasma, enquanto a htt mutada,
capaz de formar agregados, é freqüentemente encontrada no núcleo dos neurônios.
Estas inclusões têm sido apontadas como fator crucial na patogênese da doença
(CATTANEO et al., 2005).
Muitas proteínas poliQ estão sujeitas a clivagem, e estudos têm atribuído um
papel tóxico aos produtos resultantes deste processo (CHAN et al., 2002). Também
a htt mutada é suscetível à clivagem efetuada por proteases, e sua porção N-
terminal possui a capacidade de unir-se a diversas proteínas (ELIAS et al, 2001).
Parece que o recrutamento de proteínas ativadoras e/ou regulatórias envolvidas na
transcrição, como CBPs (CREB-binding proteins), acaba por interferir em vias
transcripcionais. Esta hipótese é consistente com a regulação negativa de genes
específicos em modelos transgênicos da DH, como a redução da expressão de
genes que codificam fatores de crescimento, principalmente o BDNF (Brain-derived
neurotrophic factor) (SUGARS e RUBINSZTEIN, 2003).
Investigações são necessárias para que se compreenda por que os neurônios
estriatais são os alvos preferenciais e o mecanismo pelo qual a htt mutante conduz à
morte neuronal, mas já foi sugerido que o processo de clivagem possa variar de
acordo com a região cerebral, o que explicaria a característica seletiva da
degeneração na doença (SUGARS e RUBINSZTEIN, 2003).
O papel das inclusões observadas na DH é bastante controverso. Embora
alguns estudos tenham sugerido uma associação causal entre inclusões
5
intranucleares e toxicidade, outros defendem que a formação de agregados poderia
não estar relacionada com a patogênese da doença mas, ao contrário, representaria
um mecanismo neuroprotetor. Quando os cérebros de pacientes com DH são
analisados após a morte, apenas 3-6% dos neurônios corticais apresentam
agregados. Alguns pesquisadores sugerem que esta população não estaria sofrendo
um processo de morte celular, mas teria “escapado” da morte ao seqüestrar a
proteína mutante (LI et al., 2005).
Recentemente tem sido sugerido ainda que a perda da função normal da htt
também deve contribuir para a patogênese da DH. Isso porque a htt selvagem é
requerida para a sobrevivência celular, e o impedimento da sua função correlaciona-
se à neurodegeneração tanto em animais selvagens quanto nos doentes. Da mesma
maneira, o aumento da sua expressão favorece a sobrevivência neuronal em
ambos. A visão de que pelo menos algumas das disfunções moleculares observadas
na DH sejam conseqüências da redução da atividade da htt selvagem é baseada
nos inúmeros papéis que ela possui, dentre eles a ligação com fatores de
crescimento (TOBIN e SIGNER, 2000; CATTANEO et al., 2005).
O desenvolvimento de modelos transgênicos de camundongos com a DH tem
contribuído para o entendimento da doença. Neste trabalho, enfatizaremos um dos
modelos experimentais para a DH: a linhagem de camundongos transgênicos R6/2,
que reproduzem muitas das características da DH humana (MANGIARINI et al.,
1996).
6
1.5 O modelo experimental R6/2
Em 1996 foram desenvolvidos os primeiros modelos transgênicos para a DH:
camundongos R6/1 e R6/2. A linhagem R6/2 expressa o éxon 1 do gene huntingtin
humano contendo 150 repetições CAG e atualmente é a mais utilizada para o teste
de terapias nesta doença. Evidências apontam que os cérebros destes
camundongos apresentam características que já foram observadas nos encéfalos de
pacientes com DH (inclusões, alterações motoras e cognitivas) e que vários, se não
todos os aspectos da doença humana, são reproduzidos nos R6 (CARTER et al.,
1999).
Como podemos acompanhar na Figura 2, nos animais doentes os sintomas
motores começam com cerca de 3 semanas de idade, quando estes se tornam
hiperativos. Nesta idade, inclusões encefálicas já podem ser observadas.
Gradualmente, eles reduzem sua atividade motora e se tornam hipoativos. Assim,
com cerca de 8 semanas, os camundongos já apresentam um fenótipo neurológico
similar ao observado na doença humana, com alterações da marcha, movimentos
involuntários e deterioração da coordenação motora (LI et al., 2005). Observa-se
também uma resposta anormal dos membros, que são mantidos em flexão junto ao
tórax e o abdômen quando o animal é suspenso pela cauda (Figura 3) (MANGIARINI
et al., 1996). A rápida progressão da doença nos R6/2 torna relativamente fácil a sua
utilização para estudos experimentais.
7
Alterações na ex-pressão genética
Inclusões no córtex e déficit de aprendizado espacial
Inclusões no corpo estriado
Figura 2: Progressão da DH em camundongos R6/2 (adaptada de SUGARS e RUBINSZTEIN, 2003).
1.6 Morte celular na DH
Estudos sugerem que a apoptose é o principal mecanismo de
neurodegeneração na DH (TURMAINE et al., 2000; TOBIN e SIGNER, 2000). Nestes
estudos, a morte por apoptose no cérebro de pacientes foi caracterizada pela
observação de alterações no núcleo dos neurônios em degeneração, como a
condensação e a fragmentação nuclear. Diversos autores afirmam ainda que a
presença de agregados de htt intranucleares é capaz de ativar a apoptose, seja pelo
aumento da expressão de caspases (ZERON, 2001 apud ELIAS et al., 2001), seja
pela superativação de receptores N-metil-D-aspartato (NMDARs) (DEIGNER, 2000
apud ELIAS et al., 2001). Outros trabalhos, entretanto, sugerem a ocorrência de um
mecanismo de morte celular não apoptótico na DH. Já foram observadas
características típicas de autofagia na morte celular induzida pela htt mutada, como
a formação de vacúolos citoplasmáticos. A expressão aumentada da htt mutada leva
ao acúmulo desta proteína em vacúolos nos neurônios estriatais, entretanto não se
sabe quais fatores seriam responsáveis pela sinalização que desencadearia a
autofagia, bem como se esta resposta seria citotóxica ou protetora (SAWA et al.,
2003).
Nos camundongos R6/2, pouca morte celular foi documentada. Os neurônios
em degeneração apresentam condensação do citoplasma e do núcleo, porém não
exibem fragmentação do DNA (SAWA et al., 2003). No córtex e no corpo estriado,
este pequeno número de neurônios atróficos é marcado intensamente por ósmio. O
mecanismo de morte destas células foi definido como “dark cell degeneration”, uma
descrição morfológica de morte celular que não representa apoptose nem necrose
(LI et al., 2005). Esta forma não apoptótica de morte celular na DH foi também
8
sugerida por TURMAINE e colaboradores (2000), ao notarem que células em
degeneração (marcadas por azul de toluidina ou ósmio) não são TUNEL+. Ele
aponta que as características ultra-estruturais da morte celular na DH, tanto em
pacientes quanto no modelo R6/2, são diferentes daquelas que definem o processo
de apoptose. Por outro lado, já foram descritas células TUNEL+ em degeneração
nestes camundongos, o que sugere a ocorrência de apoptose no modelo
experimental. Estas observações devem implicar em mecanismos moleculares pelos
quais a htt mutada pode induzir tanto a apoptose quanto a resposta não apoptótica
(REDDY et al., 1998 apud SAWA et al., 2003). Como nunca foram encontrados
corpos apoptóticos TUNEL+ nos pacientes, TURMAINE e colaboradores (2000)
chamam a atenção para a necessidade de uma análise ultra-estrutural para se
afirmar se a morte nesta patologia se dá ou não por apoptose.
Figura 3: Alteração da resposta motora de um camundongo com DH (adaptada de MANGIARINI et al., 1996).
DHWT
9
2 Utilização de Fluoro-Jade-C como marcador de morte celular
O Fluoro-Jade é um derivado aniônico de fluoresceína que tem sido descrito
como marcador específico de neurônios em degeneração, detectando tanto o
processo de necrose quanto o de apoptose (SCHMUED e HOPKINS, 2000). Não
existem referências de que este composto seja capaz de marcar “dark cell
degeneration” e talvez isso nunca tenha sido investigado diretamente.
O Fluoro-Jade-B e posteriormente o Fluoro-Jade-C foram desenvolvidos a
partir do composto original, de maneira a atingir maior resolução e contraste. Entre
eles, o Fluoro-Jade-C é o marcador mais sensível, isto é, possui maior afinidade por
componentes do tecido em degeneração. Assim, o Fluoro-Jade-C requer as menores
concentrações e o menor tempo de marcação, com a vantagem de se obter um
“background” reduzido. Em comparação a métodos anteriormente utilizados para se
detectar neurodegeneração, este é um método rápido e simples, que não utiliza
reagentes tóxicos, podendo também ser utilizado em combinação com diversas
técnicas de imunofluorescência (SCHMUED et al., 2005).
A identidade exata do Fluoro-Jade ainda precisa ser confirmada, bem como as
moléculas as quais este composto se liga, entretanto diversos testes em modelos de
lesão têm demonstrado sua especificidade (SCHMUED et al., 1997; MITRUŠKOVÁ
et al., 2004). A figura 4 ilustra a marcação de neurônios em degeneração no
hipocampo após isquemia cerebral.
Alguns autores afirmam que é possível a ligação destas moléculas a grupos
de cargas positivas, como poli-aminas (SCHMUED e HOPKINS 2000; SCHMUED et
al., 2005). Tanto o Fluoro-Jade-C quanto seus antecessores Fluoro-Jade e Fluoro-
10
Jade-B tem afinidade pela célula inteira em degeneração, incluindo o corpo celular,
os dendritos, o axônio e os terminais axônicos.
Figura 4: Marcação por Fluoro-Jade-C. Neurônios em degeneração na região CA1 do hipocampo de um rato isquêmico. (MAYRHOFER, F., dados não publicados, 2006). Barra de calibração: 20 µm.
3 Terapias sugeridas para o tratamento da DH
Inúmeros tratamentos têm sido testados em linhagens de camundongos com
DH, como a utilização de inibidores de apoptose ou a inibição de transglutaminases
(que promovem a agregação da htt). Estes tratamentos demonstraram efeitos
positivos na sobrevida, na redução do número de agregados, na atrofia cerebral e na
coordenação motora de camundongos R6, mas não demonstraram efeitos
significativos em pacientes com DH (LI et al., 2005).
11
No que diz respeito à terapia celular, uma opção que tem sido considerada é
a estimulação da neurogênese endógena por fatores de crescimento,
especificamente FGF-2, que é capaz de estimular a proliferação de células-tronco
(CTs) neurais. Este fator, ao ser injetado no cérebro de camundongos R6/2, resultou
na formação de novos neurônios capazes de migrar para áreas afetadas na DH
reduzindo os tremores e melhorando a função motora (SPADA, 2005; JIN et al.,
2005). Poucas investigações têm sido feitas em relação ao possível papel
terapêutico das CTs da medula óssea (MO) na perda neuronal que ocorre na DH.
Até o momento, sabe-se que o tratamento utilizando CTs da MO tem efeito benéfico
na função motora de ratos tratados com ácido quinolínico, um modelo de DH. Além
disto, estas células permanecem por mais de um mês após a implantação, e são
capazes de migrar para regiões afetadas (LESCAUDRON, 2003). Estudos clínicos
em pacientes com Huntington mostraram alguma melhora funcional com o
transplante de neuroblastos fetais. Diversos estudos têm sido realizados neste
sentido, mostrando que a implantação do corpo estriado fetal nos pacientes resulta
em redução da coréia, sem que ocorra rejeição e sem que a doença induza
neurodegeneração no tecido transplantado (FREEMAN et al., 2000). Desta maneira,
a terapia celular tem demonstrado ser promissora no tratamento da DH.
4 Células-tronco no SNC adulto
Do final do século XIX até a primeira metade do século XX acreditava-se que
não era possível a adição de novos neurônios no cérebro de mamíferos adultos
(GROSS, 2000). A descoberta de que existem células com capacidade de auto-
renovação e geração de tipos celulares maduros no SNC de mamíferos adultos
12
(ALTMAN, 1962) veio não só a derrubar este dogma, mas também contribuiu para
que tais células se tornassem o tema de muitas discussões.
A parede do sistema ventricular e o giro dentado do hipocampo são regiões
reconhecidas como neurogênicas no SNC de mamíferos adultos. Na parede dos
ventrículos laterais (VLs) reside uma população de células em divisão conhecida
como zona subventricular (SVZ). Uma camada de células epiteliais, ou camada
ependimária, separa a SVZ dos VLs. Dois tipos celulares são candidatos ao termo
“célula-tronco” nestas regiões: as células ependimárias (JOHANSSON et al., 1999) e
os astrócitos residentes na zona subventricular (DOETSCH et al., 1999).
A suspeita de que as células ependimárias são capazes de gerar novos
neurônios em mamíferos adultos é antiga (ALTMAN, 1962 apud LAYWELL, 2000).
Esta possibilidade se baseia em parte na observação de que tais células expressam
altos níveis de nestina, uma proteína característica de células-tronco e progenitores
neurais. Em 1999, pela utilização de técnicas em que supostamente apenas as
células ependimárias são marcadas (como a injeção intraventricular de DiI), foi
observada a formação de neurosferas capazes de gerar neurônios, astrócitos e
oligodendrócitos. Sugeriu-se então que algumas células ependimárias são CTs que
alternam períodos de atividade e quiescência dando origem a populações de células
progenitoras na SVZ (JOHANSSON et al., 1999). A Figura 5 ilustra o modelo que
propõe as células ependimárias como células-tronco.
Figura 5: Células ependimárias como células-tronco. Neste modelo, a célula ependimária sofre uma divisão assimétrica gerando uma célula progenitora da SVZ (cinza), que por sua vez sofre uma série de divisões gerando células precursoras neuronais (azul) (adaptada de JOHANSSON et al, 1999).
13
No mesmo ano, entretanto, foi publicado um artigo em que se afirmava serem
astrócitos da SVZ as células-tronco. Um grupo de pesquisadores observou, através
de inúmeras técnicas, que estes astrócitos são capazes de formar neurosferas e dar
origem a neuroblastos capazes de migrar para o bulbo olfatório, onde se diferenciam
em células granulares e periglomerulares. Além disso, eles descartaram a
possibilidade de que as células ependimárias fossem células-tronco, já que as
mesmas não geram neurosferas quando se utilizam marcadores diferentes de DiI e,
além disso, nenhuma delas incorpora marcadores mitóticos. O modelo proposto
pode ser visualizado na Figura 6, em que os astrócitos dão origem aos neuroblastos
através de um tipo celular intermediário que se divide rapidamente. (DOETSCH et
al., 1999). Em trabalhos posteriores, foi demonstrado que também os astrócitos na
camada subgranular do giro dentado do hipocampo (SGL) são precursores primários
dos novos neurônios granulares no adulto (SERI et al., 2001; ALVAREZ-BUYLLA et
al., 2002). Ao investigar a SVZ humana, o grupo defendeu a mesma visão, isto é,
também os astrócitos humanos são capazes de gerar neurosferas multipotentes in
vitro (SANAI et al., 2004). Ainda no mesmo ano, este grupo publicou um artigo sobre
a origem dos astrócitos da SVZ que manteriam a neurogênese no cérebro de
mamíferos adultos, afirmando que a glia radial neonatal seria a precursora destes
astrócitos (MERKLE et al., 2004).
Muitos dos trabalhos publicados por outros grupos concordam que os
astrócitos sejam as células primordiais da neurogênese no cérebro de mamíferos
adultos, o que dá maior consistência a tal hipótese, como sintetizado a seguir:
14
Figura 6: Astrócitos como células-tronco. Os astrócitos, (células B), dão origem aos neuroblastos (células A), através de um tipo celular intermediário que se divide rapidamente (células C). As células ependimárias são definidas como células E (adaptada de DOETSCH et al, 1999).
Astrócito da SVZ Precursor imaturo
Neuroblasto em Migração
• CHIASSON e colaboradores (1999) contestam a metodologia utilizada
por Johansson e afirmam que, diferente do observado na SVZ, as células
ependimárias não possuem capacidade de auto-renovação (pois não são capazes
de formar neurosferas secundárias) nem formam neurônios.
• LAYWELL e colaboradores (2000) mostram que os astrócitos de
diversas regiões do cérebro em desenvolvimento formam neurosferas multipotentes
e que no adulto, esta capacidade é retida apenas por astrócitos da SVZ. Segundo
estes pesquisadores, as células ependimárias geram somente glia.
• IMURA e colaboradores (2003) apóiam a hipótese de Alvarez-Buylla ao
afirmarem que a população de células-tronco na SVZ expressa GFAP. Eles
sugerem, com base em seus dados, que estas células adquirem a expressão de
GFAP gradualmente durante o desenvolvimento.
• GARCIA e colaboradores (2004) mostram que a ablação de astrócitos
na SVZ e na SGL de camundongos transgênicos adultos impede a formação de
neuroblastos no BO e no giro dentado.
15
Finalmente, os mesmos autores que defendem que as células ependimárias
sejam “tronco” deixam aberta a possibilidade de que existam outras populações
independentes de CTs além da células ependimárias no SNC adulto (JOHANSSON
et al., 1999).
É bastante inovadora a idéia de que as células gliais tenham outra função,
além da tradicional visão de que estas células dão suporte aos neurônios. É também
curioso pensar que os astrócitos, tradicionalmente vistos como células diferenciadas,
sejam o tipo celular primordial. Entretanto, a comparação da morfologia dos
astrócitos de outras regiões cerebrais, como o córtex, e astrócitos que se comportam
como CTs na SVZ indica que estes últimos possuem menor quantidade de
ramificações (LAYWELL et al., 2000). Muitas outras questões levantadas sobre a
identidade das CTs neurais não serão mencionadas neste trabalho. É provável que
os esforços no sentido de descobrir o “verdadeiro nome” das células-tronco neurais
venham a responder muitas perguntas que têm sido feitas a respeito das mesmas, o
que favoreceria o desenvolvimento de terapias celulares.
5 A SVZ e a via migratória rostral (RMS)
A SVZ, formada durante o desenvolvimento embrionário, contém neurônios
imaturos, neuroblastos, células precursoras indiferenciadas, astrócitos e microglia
(STENSAAS E GILSON, 1972 apud MENEZES et al., 2002). A SVZ de
camundongos jovens, ao contrário da adulta, apresenta ainda a glia radial (KISHI K
et al., 1990; ALVES et al., 2002).
O destino dos progenitores gerados nesta camada proliferativa foi muito
discutido, até que estudos traçando a sua migração por injeções localizadas de [3H]-
16
timidina, retrovírus, marcadores ou transplantes na SVZ anterior (LOIS e BUYLLA,
1994) indicassem sua presença no bulbo olfatório. Antes disso, embora se
acreditasse que este fosse um importante alvo, era sugerido que células da SVZ
originavam neurônios no córtex e no corpo estriado (ALTMAN, 1969). Alguns
trabalhos também sugeriam que estas células dão origem a glia (GOLDMAN 1995;
LEVISON et al., 1993).
O bulbo olfatório é uma formação cortical primitiva de substância cinzenta,
localizada na extremidade rostral do prosencéfalo. Os bulbos olfatórios de roedores
jovens e adultos contêm populações de interneurônios periglomerulares e granulares
que são constantemente renovadas por células geradas a partir da SVZ. Assim, esta
estrutura continua a crescer após o nascimento pela constante adição de neurônios,
capazes de estabelecer novos circuitos funcionais (ROSSELLI-AUSTIN e ALTMAN
1995; CARLÉN et al., 2002).
O sistema olfatório é plástico, e os neurônios do epitélio olfatório cujos
axonios chegam até o bulbo e fazem sinapses nos glomérulos morrem
constantemente, sendo substituídos por novos neurônios durante toda a vida.
Acredita-se, então, que este seja um motivo pelo qual a reposição de interneurônios
se faz necessária.
5.1 Migração na RMS
A migração neuronal pode ser classificada de acordo com sua orientação em
relação à superfície pial ou com o substrato celular de migração. No primeiro caso,
pode-se classificar a migração como tangencial (perpendicular à superfície pial) ou
17
radial (em direção à superfície pial) e, no segundo, como gliofílica (neurônio-glia) ou
neurofílica (neurônio-neurônio) (RAKIC, 1990).
A migração tangencial e neurofílica caracteriza o movimento celular dos
precursores neurais que partem da SVZ anterior e formam a via migratória rostral
(RMS), que se curva ventralmente e então rostralmente para invadir o centro do
bulbo olfatório (Figura 7). Neste caminho, os neuroblastos formam longas cadeias e
usam uns aos outros como substratos, estabelecendo contatos íntimos que incluem
pequenas junções especializadas. Os astrócitos, por sua vez, formam longos
cilindros denominados tubos gliais em torno das células em migração (LOIS et
al.,1996; PERETTO et al.,1997). Em camundongos adultos, os precursores
neuronais devem migrar longas distâncias (cerca de 5 mm) antes de atingirem seu
alvo (LOIS e ALVAREZ-BUYLLA, 1994).
As células em migração na RMS têm morfologia alongada, com um longo
filamento líder, que termina em um cone de crescimento orientado na direção da
migração (KISHI, 1987).
A função dos astrócitos envolvendo as cadeias de neuroblastos na RMS de
camundongos adultos ainda é uma incógnita. Segundo DOETSCH e colaboradores
(1997), eles poderiam fornecer fatores importantes para a proliferação, migração e
sobrevivência das células em migração. Alternativamente, os astrócitos funcionariam
como uma barreira, prevenindo a migração fora da RMS e/ou isolando células em
migração de substâncias no parênquima ao redor. Apenas em cultura a migração ao
longo da RMS é possível na ausência de células gliais (WICHTERLE et al.,
1997).Esta migração é bem rápida quando comparada às ondas migratórias guiadas
pela glia radial e pelos axônios no córtex e no cerebelo em desenvolvimento
(JACOBSON, 1991 apud LOIS E ALVAREZ-BUYLLA, 2007). Na Figura 8 podem ser
18
observadas células em migração na RMS de camundongos R6/2 em associação
com os astrócitos.
FiO
gura 7: A Via migratória rostral. s neuroblastos (em vermelho)
migram tangencialmente em ca-ias que são delimitadas por as-
trócitos (em verde). Ao invadirem o , passam a se diferenciar em
urônios maduros (adaptada de LENNINGTON et. al, 2003
de
BOne
).
células mitrais
células
periglome- rulares
Receptores olfatórios
granulares
19
VL
Figura 8: Imagem confocal de neuroblastos BrdU+ (em verde) em associação com astrócitos (marcados em vermelho para GFAP) e próximos à parede ventricular. Barra de calibração: 20 µm.
Segundo MENEZES e colaboradores (2002) a migração na SVZ/RMS pode ser
dividida em três fases, independente da idade do animal: 1) em regiões próximas à
SVZ, as células migram, mas ainda são capazes de sofrer mitose; 2) num dado
momento, as células param de se dividir, mas continuam migrando; 3) ao atingirem o
bulbo olfatório, elas deixam de migrar tangencialmente e passam a migrar
radialmente, invadindo o parênquima do bulbo olfatório diferenciando-se em células
granulares e periglomerulares (Figura 9).
20
Fica claro, então, que os precursores neuronais continuam se dividindo
durante a migração na RMS (MENEZES et al., 1995; LOIS e BUYLLA, 1994), mas
não se sabe o local exato onde a transição da primeira para a segunda fase ocorre.
Com a idade, a divisão celular torna-se cada vez mais restrita às regiões próximas
aos ventrículos laterais. É possível que as células gliais no bulbo olfatório forneçam
os sinais necessários para a transição de uma fase para a outra. (MENEZES et al.,
2002).
5.2 Moléculas envolvidas
Estudos têm mostrado que a RMS é rica em componentes de matriz extracelular,
moléculas de adesão, glicoproteínas e glicoesfingolipídios que têm sido sugeridos
Figura 9: Três diferentes fases da migração na RMS: 1) migração e divisão celu-lar; 2) apenas migração; 3) migração e diferenciação (adaptada de MENEZES et al., 2002).
1
3
2
Progenitores Neuroblasto ou neurônio imaturo Mitose Célula periglomerular Glia Radial Célula granular Neurônio migratório
21
como elementos importantes para mediar a interação celular durante a migração
neuronal (EDELMAN e RUTISHAUSER, 1981; MENDEZ-OTERO e CAVALCANTE,
1996). Neste trabalho, vamos nos restringir ao estudo da molécula de adesão
celular polissialilada (PSA-NCAM) e do gangliosídeo 9-O-acetil GD3.
5.2.1 Gangliosídeo 9-O-acetil GD3
Os gangliosídeos são glicoesfingolipídeos sialilados, isto é, glicolipídios
formados por uma cadeia de ácido graxo e uma cadeia de esfingosina ligada ao
ácido siálico (ALBERTS et al., 1997). Eles são importantes componentes na
estrutura das membranas biológicas, devido ao seu caráter anfipático, amplamente
expressos em tecidos de mamíferos e particularmente abundantes no SNC
(MENDEZ-OTERO et al., 1992). No caso do 9-O-acetil GD3, a esfingosina é uma
lactosilceramida, que se insere na membrana plasmática. Presas a ela, encontram-
se duas moléculas de ácido siálico que estão situadas na face externa da membrana
plasmática.
Uma importante modificação dos gangliosídeos é a O-acetilação dos resíduos
de ácido siálico, que lhes confere carga negativa. O 9-O-acetil GD3 é uma
modificação do gangliosídeo GD3, em que um ester acetil é formado na posição 9
do resíduo de ácido siálico terminal (MENDEZ-OTERO et al., 1992). A estrutura
deste gangliosídeo pode ser observada na Figura 10.
22
Figura 10: Gangliosídeo 9-O-acetil GD3. O gangliosídeo envolvido na migração de neuroblastos na RMS é composto por uma porção lipídica e uma porção glicídica contendo uma acetilação no carbono 9 (adaptada de MENDEZ-OTERO et al., 1992).
A distribuição do 9-O-acetil GD3 é temporalmente e espacialmente
correlacionada à migração neuronal e ao crescimento de neuritos no sistema
nervoso central e periférico, motivo pelo qual foi sugerida a sua participação nestes
processos (MENDEZ-OTERO et al., 1988). Sua implicação na migração foi
reconhecida inicialmente na migração radial – gliofílica: o imunobloqueio deste
gangliosídeo pela utilização do anticorpo monoclonal Jones dificulta a migração
celular no cerebelo (SANTIAGO et al., 2001; 2004) e no córtex cerebral (HEDIN-
PEREIRA et al., 1998). Posteriormente, um possível papel na migração neurofílica
foi sugerido, quando o gangliosídeo foi observado na SVZ e na RMS durante o
desenvolvimento e também no adulto, indicando que o mesmo deveria ter algum
papel no mecanismo que promove a migração tangencial (MENDEZ-OTERO e
CAVALCANTE, 1996). Esta hipótese foi posteriormente comprovada pelo
imunobloqueio do 9-O-acetil GD3 in vitro, o que impediu a migração das células da
RMS (MIYAKOSHI et al., 2001). A Figura 11 mostra a presença de células na RMS
marcadas com o anticorpo Jones, que reconhece o gangliosídeo 9-O-acetil GD3.
23
Figura 11: A. Fotomicrografia de campo claro mostrando células marcadas com Jones na RMS e B. uma única célula mostrando a marcação para o gangliosídeo (adaptada de MENDEZ-OTERO e CAVALCANTE, 1996).
A B
Os mecanismos pelos quais a expressão de gangliosídeos leva a migração
neuronal e o crescimento de neuritos ainda são desconhecidos. É possível que os
gangliosídeos contribuam para o reconhecimento célula-célula ou célula-matriz
extracelular. Outras informações importantes sobre o mecanismo de migração dos
precursores do bulbo olfatório vieram de estudos da molécula de adesão celular
polissialilada (PSA-NCAM), que é altamente expressa por estas células (NYGUEN
et. Al, 2003; HU et al., 1996a) e que será tratada em maior detalhe no tópico a
seguir.
5.2.2 PSA-NCAM e migração celular
NCAMs (do inglês neural cell adesion molecules) são glicoproteínas de
superfície celular envolvidas em interações célula-célula/célula-substrato e fazem
parte de uma grande família de moléculas de adesão (ALBERTS et al., 1997). No
sistema nervoso, elas são encontradas durante o estágio inicial da formação do tubo
neural e subseqüentemente em outras estruturas neuronais em desenvolvimento,
ocupando neste período um importante papel no estabelecimento de padrões
24
específicos de conexões sinápticas. Sua presença é limitada no cérebro adulto,
mantendo-se apenas em locais onde a plasticidade e a formação de novos
neurônios persistem (THEODOSIS et al., 1991; KISS e ROUGNON 1997; SEKI e
ARAI, 1999).
Figura 12: Expressão de PSA NCAM. CTs neurais dão origem a precursores neurais que expressam PSA-NCAM. O nível de expressão, representado em azul, decai com a progressão em direção a fenótipos mais diferenciados e, nas células diferenciadas por completo, ocorre apenas nos contatos sinápticos. As setas vermelhas indicam a capacidade de auto-renovação(adaptada de NYGUEN et. al, 2003).
CT neural
Astrócito Neurônio Oligodendrócito
Astroblasto
Progenitor bipotencial
Neuroblasto
Pré-progenitor de oligodendrócito
Progenitor de oligodendrócito
Astrócito tipo 2
Em estágios iniciais da determinação das linhagens celulares no SNC, CTs
neurais dão origem a progenitores que expressam uma molécula de adesão
chamada PSA-NCAM. A importância desta molécula no processo migratório foi
demonstrada pelos trabalhos em que a sua deficiência dificultava a migração de
precursores neurais ao longo da RMS, resultando na redução do bulbo olfatório
25
(CREMER et al., 1994; TOMASIEWICZ et al., 1993) e no acúmulo de células
próximo ao VL anterior (ONO et al., 1994). A Figura 12 ilustra os tipos celulares que
expressam esta molécula.
Embora a produção de NCAMs dependa de um único gene, pelo menos 20
formas distintas podem ser geradas por splicing alternativo e modificações pós-
transcripcionais. A PSA-NCAM é uma variação que surge com a glicosilação de
NCAMs, que podem ligar longos polímeros de α- 2-8 ácido siálico (PSA) na sua
parte extracelular (ALBERTS et al., 1997). A Figura 13 ilustra a estrutura molecular
da PSA–NCAM.
Domínios de imunoglobulina
Polímeros de ácido siálico
Domínios de fibronectina III
Figura 13: Estrutura da PSA-NCAM. A molécula é constituída por regiões de fibronectina III e domínios de imunoglobulinas (Igs), comuns a todas as NCAMs, ligados a cadeias de ácido siálico (adaptada de NYGUEN et. Al, 2003).
O PSA é ligado exclusivamente ao quinto domínio de Ig da NCAM por
polissialiltransferases cujas expressões são reduzidas após o nascimento. Como
resultado, em muitos tecidos a PSA-NCAM altamente polissialilada é substituída
gradualmente por isoformas menos sialiladas. Entretanto, em locais como a camada
subependimária e a camada glomerular do bulbo olfatório, já foi observada a
persistência destas enzimas (NGUYEN et al., 2003).
26
Em virtude de suas cargas negativas, as longas cadeias de PSA bloqueiam a
adesão celular, atenuando a função adesiva da NCAM (ALBERTS et al., 1997). O
destacamento resultante permite que as células sofram alterações morfológicas
necessárias à motilidade e favorece a formação de novas sinapses (DIONYSIA et
al., 1999). A Figura 14 demonstra a interação celular na presença e na ausência de
sialilação.
B.
A.
Figura 14: Interação mediada por NCAMs. A. ligação mediada pela NCAM, em que todos os domínios de Igs estão envolvidos. B. As cadeias de PSA, quando presentes, funcionam como espaçadores, alterando esta interação de modo que apenas alguns domínios de Igs participem dela (adaptada de Kiss et al., 2001).
A PSA-NCAM tem ocupado outros papéis que não serão tratados em
detalhes neste trabalho, como a sensibilização de neurônios a fatores de
crescimento e a regulação negativa da mielinização (CHARLES et al., 2002). A
contribuição de PSA-NCAM e NCAMs em geral para a plasticidade sináptica e
neuronal sugere que estas moléculas possam favorecer a recuperação funcional
após lesões. Sabe-se que a expressão de PSA-NCAM aumenta em tecidos lesados,
o que parece ser funcionalmente importante, já que a regeneração e a recuperação
são atrasadas pelo bloqueio imunológico da NCAM ou por remoção enzimática de
PSA (KISS et al., 1997). Modelos de lesão cortical têm demonstrado o aumento da
27
expressão de PSA-NCAM na SVZ e em outras regiões encefálicas. Como esta
molécula é permissiva à migração de neuroblastos na SVZ, tem sido sugerido que a
lesão resulte na migração de células da SVZ para as regiões lesadas.
6 Alteração da neurogênese endógena em resposta à lesão. A neurogênese na SVZ adulta pode ser afetada (aumentada ou reduzida) por
diversos fatores, dentre eles lesões cerebrais. O aumento da neurogênese no
cérebro adulto já foi relatado em lesões por transecção ou aspiração,
desmielinização e também em pacientes com a doença de Alzheimer (JIN et al.,
2004); e Huntington (CURTIS et al, 2003).
A migração de células da SVZ para regiões que não o bulbo olfatório foi
também descrita em diversos modelos, dentre eles isquemia cerebral (ARVIDSSON
et al., 2002) e lesões corticais (GOINGS et al., 2004). Estes estudos evidenciaram a
migração de neuroblastos para regiões vizinhas à lesão, ou em direção às próprias
regiões lesadas, dentre elas o corpo estriado. Como mencionamos anteriormente,
alguns sinais que regulam o movimento normal das células da SVZ para o bulbo
olfatório são conhecidos, mas não se sabe por que as células normalmente não se
direcionam para núcleos adjacentes no adulto. Dada a proximidade do corpo
estriado ao subepêndima, a DH constitui uma boa condição para se investigar a
habilidade de precursores endógenos em regenerar locais afetados no SNC adulto.
Recentemente, foi demonstrado no modelo R6/2 que as células progenitoras
apresentam déficit na migração para o bulbo olfatório. Além disso, células
expressando PSA-NCAM foram encontradas no corpo estriado destes animais,
sugerindo que as mesmas sejam neuroblastos migratórios desviando da sua rota
normal em direção à região de maior perda celular (BATISTA et al., 2006). É
28
evidente que o aumento da proliferação é insuficiente para compensar a perda
neuronal observada nesta e em outras patologias em que o desvio da rota migratória
foi descrito, entretanto a possibilidade de restaurar a função cerebral ao induzir a
neurogênese surge como uma das opções terapêuticas.
29
OBJETIVOS
___________________________________________________________________
O objetivo geral deste trabalho foi investigar a proliferação e a migração de
progenitores neurais na RMS de camundongos com DH. Assim, tivemos como
objetivos específicos:
• Analisar a proliferação de células na SVZ de camundongos R6/2.
• Investigar a migração de progenitores ao longo da RMS de camundongos
R6/2.
• Avaliar a expressão de moléculas associadas à migração na RMS de
camundongos R6/2, especificamente: PSA-NCAM e 9-O-acetil-GD3.
• Quantificar células em processo de apoptose na RMS de camundongos R6/2.
30
MATERIAIS E MÉTODOS
___________________________________________________________________
A incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) é o método mais utilizado
recentemente para se estudar a proliferação celular e a neurogênese in vivo. O BrdU
injetado sistemicamente é incorporado ao DNA de todas as células em divisão,
como um análogo da timidina. Uma vez incorporado, ele pode ser detectado por
imuno-histoquímica em células pós-mitóticas. O primeiro passo para a realização
deste trabalho foi a análise comparativa de células BrdU+ ao longo da RMS de
animais com DH e animais sadios.
Após isso, nós investigamos a morte celular através de reações de Fluoro-
Jade-C (Histo-Chem) nesta via e, finalmente, verificamos a expressão de 9-O acetil
GD3 e PSA-NCAM na RMS destes animais.
1 Animais
Em todos os experimentos foram utilizados camundongos transgênicos R6/2
+/- (DHs) com 14 - 15 semanas de vida. O grupo controle era composto por animais
selvagens da linhagem B6CBAF1/J (WTs) com as mesmas idades. Estas linhagens
foram-nos gentilmente doadas pelo Dr Derek van der Kooy, da Universidade de
Toronto, Canadá.
A análise migratória de progenitores neurais foi realizada em 4 animais da
linhagem R6/2 e 4 animais selvagens. O mesmo grupo foi utilizado para a
investigação de moléculas envolvidas na migração celular e nas reações de Fluoro-
Jade. Como outros animais foram também utilizados nestas últimas reações, o
31
tamanho total das amostras foi de 5 DHs e 6 WTs. Todos os protocolos
experimentais foram aprovados pelo Comitê de Uso de Animais da nossa Instituição.
2 Metodologia para o emprego de BrdU como traçador celular
Todos os animais receberam cinco injeções intraperinoneais de BrdU (60
mg/kg) em intervalos de três horas, como descrito abaixo. Como o ciclo de divisão
da maior fração celular em proliferação na SVZ (células C) é de 12,4 horas (REF),
injeções num intervalo total de 12 horas nos permitiriam observar um grande número
de células que, em algum momento, sofreriam divisão incorporando BrdU. Então, de
acordo com a definição de alguns autores (figura 6), as células que incorporavam
este marcador eram em sua maioria células C e células A, além de células B que
eventualmente estariam sofrendo divisão dentro deste intervalo.
Figura 1
5: Incorporação de BrdU. Esquemailustrando a incorporação de BrdU pelo material genético da célula e posterior identificação por imuno-histoquímica(http://edoc.huberlin.de/habilitationen/kempermann-gerd-2002-01-29/HTML/chapter1.html).
Os animais foram perfundidos três dias após a última injeção de BrdU, para
que pudéssemos acompanhar o trajeto das células.
32
3 Processamento do material
3.1 Perfusão
Os camundongos foram colocados em um recipiente contendo algodão
embebido em éter e posteriormente perfundidos por via transcardíaca com solução
salina por cerca de dois minutos para retirada do sangue e em seguida com
paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M por 5 - 10 minutos para a sua fixação
dos tecidos. Esta última solução era também utilizada para pós-fixação durante a
noite. Os cérebros foram mantidos posteriormente em sacarose 30% para
crioproteção, emblocados em resina OCT e estocados a -20 °C.
3.2 Criocortes e regiões de análise
Para a análise migratória das células BrdU+, os encéfalos foram cortados a
uma espessura de 14 µm. Em cada lâmina numerada foram colhidos três cortes,
sendo os cortes adjacentes a cada um deles descartados, evitando assim que
contássemos repetidamente as mesmas células. Foram quantificadas duas lâminas
(seis cortes) de cada região por animal.
Como pode ser observado no esquema a seguir, nossa análise foi realizada
em seções coronais de quatro regiões encefálicas: porções proximais (regiões I e II)
e distais (regiões III e IV) da RMS.
33
34
RMS
B A I II III IV I
II
III
IV
posterior anterior
Região I ≈ 1,18 mm bregma.
Região II ≈ 1,42 mm bregma.
Região III ≈ 2,96 mm bregma.
Região IV ≈ 3,2 mm bregma.
Figura 16camu : Representação das regiões analisadas. A. seções coronais do encéfalo de
ndongos. Os quadros em vermelho indicam os campos contendo células em migração na RMS. B. representação sagital das mesmas regiões (coordenadas baseadas em PAXINOS e
N, 2001). FRANKLI
A primeira região, ou região I, consistiu nos primeiros cortes em que os
ventrículos laterais tornavam-se visíveis, isto é: a porção inicial da RMS.
Consideramos como RMS média, ou região II, aqueles cortes situados anteriormente
à região I (três lâminas antes). Localizada no bulbo olfatório, a região IV consistiu
nos primeiros cortes em que o córtex tornava-se visível e, da mesma maneira, a
região III ou RMS anterior distanciava-se três lâminas (140 µm) desta.
Para a análise de morte celular e da marcação por Jones, foram utilizadas
lâminas da região situada entre a região II e a região III, também identificadas por
numeração. Finalmente, para a contagem de células PSA-NCAM+ , nós utilizamos
lâminas imediatamente posteriores à primeira região.
3.3 Imuno-histoquímica
Para o procedimento imuno-histoquímico, todos os cortes foram lavados com
PBS 10mM ou PBS 0,01M contendo Triton X-100 a 0,01% ou 0,3% (Sigma). O
bloqueio de sítios inespecíficos foi feito por uma solução contendo soro normal de
cabra (NGS - Sigma) a 5%, Triton a 0,4%, albumina bovina (BSA – Sigma) a 3% e
glicina (Amersham) a 1% em PBS 10mM, por uma hora. Nas reações de BrdU foi
utilizado apenas NGS a 5% por 30 minutos.
A incubação com anticorpos primários específicos, descritos no quadro a
seguir, era realizada por 24 h a 4o C. Após este procedimento, os cortes foram
lavados com PBS 10mM e incubados com os respectivos anticorpos secundários por
2 h a 37°C. Em seguida, o material foi novamente lavado com PBS 10mM, contendo
em alguns casos o marcador de núcleo DAPI ou SYTOX green e as lâminas
montadas com meio contendo PPD (C H N ) em glicerol. 6 8 2
35
A metodologia descrita acima foi utilizada também nas duplas marcações com
o anticorpo para BrdU. Neste caso, o anticorpo primário era antecedido pelo
tratamento com paraformaldeído 4% por 20 min para fixação e HCl 2N por 30 min a
37ºC para desnaturar o DNA, seguido por tampão borato 0,1M pH 8,5 por 5 min.
Todos os protocolos para o preparo de soluções e das reações realizadas
encontram-se em anexo.
4 Quantificação de células BrdU+ na RMS:
Após a reação de imuno-histoquímica, cada hemisfério exibia um feixe de
células que incorporavam BrdU. Para a contagem de células foi considerado o lado
em que a marcação era mais evidente.
Com o auxílio de um microscópio Axiovert 200M equipado com o sistema
Apotome e o software Axiovision 4.3 (Zeiss), a área da RMS era delimitada e toda a
extensão da RMS considerada para a quantificação. Na região ventricular, a
contagem se restringiu à parede lateral. A contagem foi
realizada com objetiva de 40x. A Figura ao lado ilustra
algumas das células que consideramos BrdU+.
Para todas as quantificações de células, a área foi
convertida em volume através da multiplicação da mesma pela espessura do corte.
Após isso, o número de células foi dividido pelo volume resultante, obtendo-se o
número de células por micrômetro cúbico. Este valor foi então multiplicado por 109 e
portanto convertido ao número de células por milímetro cúbico.
36
5 Aquisição de imagens
As imagens apresentadas neste trabalho foram obtidas no microscópio
Axiovert 135 equipado com o software Axiovision 3.3 (Zeiss) ou em um microscópio
confocal LSM 510 Meta (Zeiss).
6 Análise Estatística
Para a análise estatística dos resultados foi utilizado o programa Microsoft
Excel. Como optamos pela representação gráfica dos dados quantitativos, em todas
as análises calculamos a média aritmética dos valores obtidos nos dois grupos
(camundongos com DH e camundongos selvagens), indicando o valor central de
uma série de medidas. O desvio-padrão foi estimado e utilizado como parâmetro
para o cálculo do grau de flutuação ou dispersão destas medidas. O tamanho
mínimo das amostras foi de 4 animais.
A comparação de médias obtidas nos dois grupos foi realizada através de
teste t. No nosso caso, este teste estatístico consistiu em testar a hipótese de que as
duas médias fossem iguais (chamada hipótese nula). Assim, o valor obtido através
do teste t é igual à probabilidade da hipótese nula entre as médias. Se, por exemplo,
essa probabilidade era inferior a 5% (p=0,05), então podíamos dizer que havia uma
diferença significativa entre os dois grupos.
O mesmo teste estatístico foi utilizado para a comparação de variações intra-
grupos, isto é, quando eram comparados os números de células entre diferentes
regiões da RMS de um mesmo grupo. Como um dos nossos objetivos foi avaliar a
migração, nós buscamos sempre comparar determinada região com a sua
37
subseqüente, por exemplo: região I e região II, região II e região III e assim por
diante.
38
RESULTADOS
___________________________________________________________________
1 Incorporação de BrdU na via migratória rostral
Nossos primeiros resultados demonstraram a incorporação de BrdU pela
população constitutiva de células progenitoras em proliferação nos diferentes níveis
rostrocaudais da RMS. Três dias após as injeções do marcador mitótico, notamos
um grande número de progenitores neurais em proliferação na RMS proximal
(regiões I e II) dos animais com DH. A quantidade de células que incorporaram BrdU
nas mesmas porções da RMS de camundongos selvagens era nitidamente menor,
como pode ser observado na Figura 17. Entretanto, na região III já não era tão clara
a diferença na quantidade de células BrdU+ entre os animais e, ao avançarmos em
direção ao bulbo olfatório e finalmente analisarmos a região IV, notamos que o
número de células parecia ser maior nos camundongos selvagens, demonstrando
um padrão oposto ao observado nas regiões proximais da RMS destes mesmos
animais (Figura 18).
+A quantificação do número de células BrdU em cada região demonstrou
diferenças significativas entre o número de células nas porções I, III e IV da RMS de
camundongos R6/2 e camundongos selvagens (p < 0,05). Na primeira região
analisada, havia menos células BrdU+ no grupo controle. Na segunda região, embora
aparentemente o número de células nestes animais seja menor, a diferença entre
selvagens e R6/2 não foi significativa. Já na terceira e na quarta região analisadas, o
número de progenitores era significativamente maior no grupo controle (Gráfico 1).
39
+ Não houve diferença significativa na quantidade total de células BrdU na extensão
total da RMS destes animais (Gráfico 1).
Região I
WT DH
A B
DH WT
Região II
Figura 17:
Regiões proximais da RMS de camundongos com DH apresentam número maior de progenitores em comparação ao grupo selvagem. A. e B. Células BrdU+ marcadas em
primeira região analisada, onde a cavidade ventricular ainda pode ser observada. C.e D. Células BrdU+ na segunda região analisada, anterior à primeira região. Barra de calibração:20 µm.
C D
verde na
40
WT
Região III DH
WT
A B
Região IV
Ao compararmos o número de progenitores entre diferentes regiões dentro de
cada grupo, notamos que o número de células observado nas regiões I e II da RMS
de camundongos R6/2 diminuía significativamente nas regiões III e IV (p< 0,05). Já
WT
DH DH
Figura 18: Regiões distais da RMS de camundongos com DH apresentam número menor de ação ao grupo selvagem. A. e B. Células BrdU+ marcadas em verde na
tercei a. C. e D. Células BrdU+ na quarta região analisada, anterior à terceira o, onde é evidente o maior número de células no grupo com DH. Barra de calibração: 20
µm.
C D
progenitores em comparra região analisad
regiã
41
no grupo selvagem, uma diferença significativa era observada entre a região I (com
menor número de células) e as demais. Nestes animais, o número de células
praticamente se manteve constante a partir da segunda região.
Células BrdU+ na RMS
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
TOTAL I II III IV
regiões
célu
las/
mm3 x
105
WTR6/2
#
* * *
#
DH
Total I II III IVIVIVIV
Gráfico 1: A
O grande número de progenitores neurais observado nas porções posteriores
da RMS de camundongos com DH não correspondia ao número de células
observado nos seus bulbos olfatórios. Diante desta observação, nós consideramos
três possíveis mecanismos que poderiam explicar esta redução de células ao longo
da RMS de camundongos com a patologia. Como foi mencionado anteriormente,
uma série de moléculas estão envolvidas na migração de neuroblastos ao londo da
RMS. Após a lesão, a alteração da expressão destas moléculas poderia resultar em
um padrão migratório incomum das células ao longo desta via. Assim, uma
possibilidade a ser considerada é a de que estas células apresentem uma alteração
RMS proximal dos camundongos com DH apresenta grande quantidade de enitores neurais e a porção distal apresenta um número reduzido destas células em
comparação ao grupo selvagem (p < 0,05), n=4.
prog
42
na expressão de moléculas associadas à migração na RMS, fazendo com que se
acumulem em regiões próximas aos VLs, como esquematizado na Figura 19.
Alterações migratórias e acúmulo de células próximo ao ventrículo
VL
BO Figura 19: Possível acúmulo de células na porção proximal da RMS que seria causado pela alteração da expressão de moléculas associadas à migração ao longo da RMS.
Também como resultado da alteração de fatores permissivos à migração na
RMS e de uma possível liberação que fatores quimioatrativos pela lesão, poderia
ocorrer a migração destas células em direção a áreas afetadas na doença, dada a
proximidade do corpo estriado e do córtex ao subepêndima adulto, reduzindo a
quantidade de células destinadas aos bulbos olfatórios (Figura 20).
A apoptose é admitida como um processo fisiológico que ocorre normalmente
nesta via (MITRUŠKOVÁ et al., 2004). O fenômeno foi relatado mesmo antes de ser
descrita a migração em direção ao bulbo olfatório e, por este motivo, antigos
trabalhos defenderam que o destino dos progenitores logo após a mitose era a
morte celular (MORSHEAD e VAN DER KOOY, 1992). Considerando ainda que o
aumento na proliferação de células subependimárias e de novos neurônios já foi
visto nos encéfalos de camundongos e pacientes com DH (CURTIS et al, 2003) uma
terceira hipótese é que esteja ocorrendo o aumento da proliferação celular na SVZ
43
destes animais em resposta à lesão, porém este aumento não seria observado nos
bulbos olfatórios de camundongos com DH devido a um aumento da morte celular
na RMS, como ilustra a Figura 21.
Migração de células em direção a áreas afetadas
Cx
St
VL
BO Figura 20: Esquema ilustrando a possível migração de neuroblastos para regiões diferentes dos BOs, especificamente áreas afetadas pela DH, como o córtex (Cx) e o corpo estriado (St).
Proliferação e morte celular aumentadas
Figura 21: Uma das possíveis expli-cações para a redução do número de progenitores em direção aos BOs nos camundongos com DH seria o aumento da morte celular ao longo da RMS, contrabalançando o aumento da prolife-ração de células progenitoras nos VLs.
VL
BO
Aumento da proliferação celular
Apoptose
44
Todos os resultados que se seguem dizem respeito ao teste das três
possibilidades listadas acima. Em relação à primeira hipótese, embora inúmeros
fatores estejam envolvidos na migração ao longo da RMS, neste trabalho nos
restringimos a investigar uma possível alteração na expressão de PSA-NCAM e do
gangliosídeo 9-O-acetil-GD3, ambos importantes para a migração ao longo da RMS
como descrito anteriormente.
2 Expressão de moléculas associadas à migração na RMS
A análise da PSA-NCAM no encéfalo dos camundongos com DH nos
permitiria avaliar se ocorre alteração na sua expressão, sugerindo a ocorrência de
um déficit migratório destas células. Além disso, a investigação de células PSA-
NCAM+ nas áreas afetadas nos responderia a uma importante questão, uma vez que
esta molécula é também um marcador de neuroblastos migratórios: Seria o desvio
da rota destes neuroblastos nos R6/2 a explicação para os nossos resultados
anteriores?
Em nossa análise, verificamos uma intensa expressão de PSA-NCAM na
RMS de camundongos R6/2, tanto em porções próximas aos VLs (Figura 22) quanto
nos bulbos olfatórios (Figura 23). Aparentemente, não havia diferença no perfil de
expressão desta molécula entre R6/2 e selvagens. Além disso, não encontramos
células PSA-NCAM+ no córtex ou no corpo estriado dos animais doentes,
descartando a possibilidade de que estas células estivessem migrando para regiões
afetadas.
45
PSA-NCAM BrdU PSA-NCAM/BrdU
A B C
Figura 22: Células BrdU+ (em verde) e PSA-NCAM+ (em vermelho) na RMS de camundongos WTs (A-C) e R6/2 (D-F). As linhas pontilhadas delimitam a cavidade ventricular e os quadrantes demonstram as áreas selecionadas em maior aumento. Barra de calibração: 20 µm.
WT
DH
D E F
A B C
Figura 23: Fotos ilustrando a expressão de A. PSA NCAM (vermelho) e B. BrdU (verde) na RMS distal de um camundongo R6/2. C. Co-localização de BrdU e PSA-NCAM. Barra de calibração: 20 µm.
DH
PSA-NCAM BrdU PSA-NCAM/BrdU
A B C
46
Para a quantificação de células expressando PSA-NCAM na RMS utilizamos
marcador de núcleo SYTOX green, o que facilitou a identificação das células, como
pode ser observado na Figura 24.
47
Figura 24: RMS de camundongos com DH contendo células PSA-NCAM+ (vermelho) em A: menor e B: maior aumento. Em verde, o marcador de núcleo SYTOX green. Barra de calibração: 20 e 50 µm, respectivamente.
A
B
Como pode ser observado no Gráfico 2, a quantificação de células PSA-
NCAM+ na RMS de camundongos selvagens e R6/2 não mostrou diferenças entre
os dois grupos.
Células PSA NCAM+ na RMS
0
5
10
15
20
WT DH
célu
las/
mm3 x
105
Gráfico 2: A quantificação de células PSA-NCAM na RMS (especificamente na região intermediária entre as regiões II e III) de camundongos com DH não evidenciou alterações significativas (respectivamente: n = 5 e n = 6).
Nossos resultados mostram que, se ocorre déficit migratório de neuroblastos
em camundongos com DH, tal fato não se deve à ausência ou redução de PSA-
NCAM na RMS. Assim passamos a investigar a expressão do gangliosídeo 9-O-
acetil GD3 nos animais selvagens e afetados.
Em relação à expressão do gangliosídeo nos dois grupos de animais,
pudemos notar pequenas quantidades na RMS de camundongos R6/2 e o mesmo
foi observado nos animais selvagens (Figuras 25, 26 e 27).
48
WT
Figura 26: Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 na RMS de camundongos com DH. A., B. e D. representam o mesmo campo (barra de calibração 10 µm). A. marcação para DAPI, B. 9-O-acetil GD3 e D. co-localização. C. imagem de outro campo da RMS de camundongo com DH, em menor aumento, evidenciando a mesma marcação (Barra de calibração: 20 µm).
A B
C D
B
C D
DH
Figura 25: Célula expressando o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 (vermelho) na RMS de um camundongo com DH. Em azul, o marcador de núcleo DAPI. Barra de calibração: 10 µm.
49
DH DH A
B
D
E
Figura 27: Expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 (em vermelho) na RMS de camundongos com DH (DAPI em azul). Os dois diferentes campos e são demonstrados à esquerda (A-C) e à direita (D-F). Barra de calibração: 10 µm.
C F
3 Morte celular na RMS
HD Nosso próximo passo foi investigar a morte de neuroblastos na RMS pela
marcação com Fluoro-Jade-C. Após testarmos a capacidade deste composto em
marcar neurônios em degeneração, utilizando como controles positivos os encéfalos
50
de ratos após isquemia global (Figura 4), realizamos a mesma reação na RMS dos
camundongos. Notamos a presença de células intensamente marcadas pelo Fluoro-
Jade-C tanto nos camundongos selvagens quanto nos doentes (Figura 28).
DH WT
Figura 28: Morte celular na RMS. Neuroblastos são marcados com Fluoro-Jade-C (em verde) na RMS de camundongos selvagens (A-C) e camundongos R6/2 (D-F). DAPI em azul. Barra de calibração: 20 µm.
A
B
C
D
E
F
51
Células Fluoro-Jade-C+ na RMS
1,2
1,3
1,3
1,4
1,4
1,5
1,5
WT HDanimais
cél
ulas
/mm
3 x 1
05
WTHD
DH
A morte celular foi observada em toda a extensão da via, inclusive em regiões
próximas aos VLs. Nem sempre era possível observar o DAPI nos neurônios que
incorporavam o composto, provavelmente devido à deterioração do núcleo devido à
morte das células. Não houve diferença significativa na taxa de morte celular entre
os grupos (Gráfico 3). Portanto, descartamos também a hipótese de que houvesse
um aumento da morte celular na RMS dos camundongos com DH.
Gca
ráfico 3: Análise quantitativa da morte celular na RMS (região intermediária entre II e III) de mundongos selvagens e R6/2. Não havia diferença significativa no número de células Fluoro-
Jade-C+ entre os grupos (respectivamente: n = 5 e n = 6)
Durante a nossa tentativa de estabelecer um controle positivo para a reação
de Fluoro-Jade-C, observamos que a reação no corpo estriado dos animais doentes
evidenciou neurônios em degeneração (Figura 29), o que não ocorria no grupo
controle (Figura 30). Isso mostra a capacidade deste composto em detectar a morte
celular também neste modelo animal, embora o mecanismo de morte celular na DH
ainda seja bastante discutido.
52
53
DH
Figura 29por
: Células em degeneração no corpo estriado de camundongos com DH, marcadas Fluoro-Jade-C (verde). Os dois diferentes campos são demonstrados à esquerda (A-C) e
à direita (D-F). (DAPI em azul). Barra de calibração: 10 µm.
A D
E B
C F
A
B
C
Figura 30: Ausência de células marcadas por Fluoro-Jade-C no corpo estriado de camundongos WT. A. marcação para Fluoro-Jade-C, B. marcação do núcleo com DAPI e C.sobreposição. Barra de calibração: 10 µm.
W
54
DISCUSSÃO
___________________________________________________________________
Os camundongos transgênicos da linhagem R6/2 apresentam a proteína htt
humana mutada e são considerados um modelo experimental adequado ao estudo
da DH. Embora a neurogênese humana na vida adulta demonstre peculiaridades,
como a ausência de migração na RMS (SANAI et al., 2004), a investigação do perfil
proliferativo e migratório de células subependimárias no modelo R6/2 é um indicador
das características dos progenitores neurais nesta patologia. O presente estudo
demonstra que neste modelo transgênico os precursores neurais oriundos da SVZ
apresentam alteração do perfil migratório, mas não têm a proliferação afetada. Esta
conclusão baseia-se na quantificação de células BrdU+ ao longo da RMS, que
demonstrou que a porção proximal nos camundongos R6/2 apresenta um número
maior de progenitores neurais em comparação ao grupo selvagem e, ao contrário, a
RMS distal destes camundongos apresenta um número menor de progenitores
neurais. Além disso, não há alteração na proliferação celular total ao longo das
regiões analisadas, bem como no número de células em degeneração na RMS dos
R6/2. Juntos, estes dados sugerem a existência de diferenças na migração (e não
na proliferação) na SVZ entre ambos os grupos, com um acúmulo de progenitores
na SVZ caudal.
Este estudo baseia-se em grande parte na incorporação de BrdU não só
como marcador de proliferação, mas também como ferramenta para investigarmos a
migração de células. Injeções intraventriculares de retrovírus são comumente
utilizadas para traçar a migração, mas além de serem menos viáveis dentro da
realidade do nosso laboratório, poderiam induzir efeitos similares aos que ocorrem
55
em lesões, que precisariam ser levados em conta na interpretação dos resultados.
Assim, o BrdU nos permitiu investigar a atividade de células progenitoras no cérebro
intacto.
No presente estudo, demonstramos que a alteração genética na DH não afeta
o número de células progenitoras em camundongos R6/2. Evidências indicam que
ocorre um aumento do número de células subependimárias e de novos neurônios no
cérebro de pacientes com DH, o que tende a aumentar com o avanço da doença
(CURTIS et al., 2003). Também ocorre este aumento em ratos tratados com ácido
quinolínico, um dos modelos animais para o estudo da DH (TATTERSFIELD et al.,
2004). Em 2005, CURTIS e colaboradores apontaram que as células B eram
responsáveis por este aumento. Recentemente, esta teoria foi reforçada através de
experimentos em que se determinava o número de neurosferas formadas a partir de
células isoladas do subepêndima e da análise morfológica das células na SVZ por
microscopia eletrônica (BATISTA et al., 2006). Assim, foi demonstrado que de fato
ocorre um progressivo aumento no número de CTs neurais no encéfalo de
camundongos R6/2 pós-sintomáticos e sugere-se que a progressão da doença deve
induzir divisões simétricas nesta população in vivo. Alguns estudos contrastam com
estes resultados, na medida em que não observaram mudanças na proliferação da
população de células subependimárias no modelo murino (GIL et al., 2005;
PHILLIPS et al., 2005; 2006).
Nossos resultados sugerem que, se ocorre alguma alteração na proliferação
celular na SVZ dos R6/2, o efeito é específico para as CTs, não atingindo as células
progenitoras. Todavia, é surpreendente que números aumentados de CTs neurais
não produzam um aumento indireto no número de progenitores e tem sido apontada
possibilidade de que os cérebros DH sintomáticos possam produzir um ambiente no
56
qual as CTS sejam inibidos de fazer divisões assimétricas (possivelmente ao serem
reprogramadas a se dividirem de maneira simétrica) (BATISTA et al., 2006).
Em nossa análise, observamos que no grupo controle o número de células
BrdU+ se manteve constante ao longo da via migratória, com exceção da primeira
para a segunda região. O aumento de células nesta porção inicial da RMS deve
estar relacionado à capacidade proliferativa, que é mantida pelos neuroblastos em
fases iniciais da migração (MENEZES et al., 1995; 2002). Nos animais com DH este
aumento não foi observado, o que poderia resultar da migração alterada destas
células no modelo.
Nossos dados se enquadram bastante nas descrições de BATISTA e
colaboradores (2006), que observaram a redução do número de neuroblastos na
camada granular do bulbo olfatório de camundongos R6/2 e, além disso, não
encontraram evidências de que a proliferação da população de células progenitoras
seja afetada in vitro e in vivo. Entretanto, este grupo atribuiu tal déficit ao
redirecionamento de neuroblastos da RMS para o corpo estriado. Este seria
exatamente o comportamento que desejaríamos de uma fonte de novos neurônios a
ser utilizada para substituir a perda de neurônios na DH, principalmente sendo os
neurônios recém-formados na SVZ capazes de estabelecer novos circuitos
funcionais (CARLÉN et al., 2002). BATISTA e colaboradores (2006) quantificaram o
número de células em proliferação na SVZ pelo mesmo marcador mitótico que foi
utilizado em nossos experimentos (BrdU) e observaram a expressão de PSA-NCAM
por células que o incorporaram. A co-localização de BrdU e do marcador de
neuroblastos (no caso PSA-NCAM) é fundamental para que se possa supor que as
células BrdU+ encontradas no corpo estriado R6/2 sejam neuroblastos, caso
contrário poderia ser contra-argumentado que a marcação resulta na verdade da
57
proliferação de astrócitos locais. Utilizando um protocolo similar, notamos algumas
células BrdU+ no córtex e no corpo estriado de camundongos R6/2 e também do seu
controle selvagem, contudo não notamos em nossa investigação a presença de
células PSA-NCAM+ nestas áreas. Esta divergência pode decorrer da menor
sobrevida dos animais após injetarmos BrdU (3 dias) em comparação à sobrevida
dos camundongos nos experimentos de BATISTA e colaboradores (2006), que foi de
30 dias. Por outro lado, verificamos a ocorrência do déficit migratório mesmo após
esta curta sobrevida, sendo então razoável que as células já estivessem começando
a migrar para o corpo estriado. Uma possibilidade é que as células recém-formadas
levem algum tempo para começarem a migrar para este local. Por este motivo, nós
teríamos observado um momento em que elas já eram influenciadas por fatores que
as atraíam para a lesão (o que comprometeria sua migração em direção ao bulbo
olfatório) porém não estivessem ainda migrando de fato para o corpo estriado. É
também curioso que as células migrem exclusivamente para tal região, em
detrimento de outras áreas afetadas. Como a migração para o corpo estriado tem
como principal justificativa a alteração de moléculas quimioatrativas ou repulsivas
nesta área, o que provavelmente ocorre em decorrência da lesão, uma possível
alternativa para se responder melhor tal questão seria investigar se o desvio da rota
ocorre também nos R6/2 assintomáticos, quando os encéfalos ainda não estão
afetados.
+Uma possível explicação para o menor número de celulas Brdu encontradas
na porção distal da RMS nos camundongos DH seria o aumento da morte neuronal
nesta região ou durante a migração. Através do marcador de morte neuronal Fluoro-
Jade-C, detectamos a presença de neurônios em degeneração na RMS de ambos
os grupos. O número de células marcadas por este composto na RMS do grupo
58
controle pode parecer surpreendente, porém um padrão similar já havia sido descrito
por MITRUŠKOVÁ e colaboradores (2004). Estes autores afirmaram ainda que o
processo de degeneração não é restrito a determinadas regiões da RMS, o que está
de acordo com nossos resultados. BRUNJES e ARMSTRONG (1996) evidenciaram
a presença de corpos apoptóticos na RMS. A morte celular programada é um
processo cuja importância fisiológica já foi reconhecida e, ao que parece, um grande
número de células é eliminado por este mecanismo na RMS antes que seja atingida
uma região que permita a diferenciação. Sabe-se ainda que a maioria das células
TUNEL+ na RMS co-localizam com Fluoro-Jade (MITRUŠKOVÁ et al., 2004), o que
indica que este composto seja seguro para a quantificação de células em apoptose
nesta via.
Por ser o BrdU incorporado em todas as células durante a síntese de DNA,
tem sido levantada a possibilidade de que este composto possa passar a fazer parte
do material genético das células nos momentos em que ocorrem reparos, como os
estágios finais da degradação apoptótica do DNA. Este fato é relevante para o nosso
estudo, se considerarmos que este é um evento comum na RMS. No entanto,
COOPER-KUHN e KUHN (2002) afirmam que as células BrdU+ não são marcadas
por TUNEL, sugerindo que doses de BrdU em torno de 50 mg/kg não são
suficientes para detectar o reparo de DNA durante a apoptose. Acreditamos então
que este método seja eficaz para estudar a proliferação celular e a neurogênese.
Uma outra possível explicação para o menor número de células no bulbo
olfatório seria a alteração na expressão de moléculas envolvidas na migração. Para
investigar este aspecto, observamos, através da técnica de imuno-histoquímica, a
expressão de PSA-NCAM e 9-O-acetil GD3. Observamos que os camundongos DH
e os do grupo controle apresentam padrão similar tanto na expressão da PSA-
59
NCAM quanto na expressão do gangliosídeo 9-O-acetil GD3. Embora a expressão
de PSA-NCAM na SVZ de modelos DH não tenha sido investigada diretamente, no
hipocampo e no córtex de camundongos R6/1 e R6/2 foi descrita a redução do
número de células expressando esta molécula (BORGHT e BRUNDIN, 2006). A
alteração foi detectada mesmo no período pré-sintomático da doença e os autores
apontam que ela possa resultar da redução dos níveis totais de NCAMs ou de um
decréscimo da polisialilação nos R6. Também foi sugerido que o decréscimo de
PSA-NCAM no hipocampo possa ser responsável pela redução da plasticidade e
portanto pelo declínio cognitivo observado nos camundongos. Entretanto, nossos
dados não evidenciaram diferenças significativas na quantidade de células
expressando esta molécula na RMS dos camundongos R6/2. Como alguns estudos
demonstraram que no hipocampo destes camundongos a neurogênese é reduzida
(GIL et al., 2005), a menor quantidade de células PSA-NCAM+ observada por
BORGHT e BRUNDIN (2006) neste local poderia refletir na verdade a redução da
neurogênese. É importante salientar que, assim como estes autores, em nosso
estudo avaliamos apenas a quantidade de células que expressam a molécula, e não
a intensidade de expressão da mesma, o que seria útil para elucidar esta questão.
Diante da complexidade e da diversidade de fatores que poderiam estar causando a
alteração, nossa investigação ainda é incipiente. São muitas as “pistas” moleculares
implicadas na migração na RMS e muitos estudos são ainda necessários para
compreendermos o(s) fator(es) por trás da dificuldade migratória. Além disso, a
análise da expressão do gangliosídeo é apenas qualitativa e se faz necessária uma
quantificação para a obtenção de dados mais conclusivos. As investigações de
outros autores, alguns deles citados a seguir, nos levam a especular quais
60
elementos poderiam estar ou não relacionados aos nossos resultados, indicando
novas perspectivas para a nossa pesquisa.
PHILLIPS et al., 2006 investigaram a expressão de doublecortina, uma
proteína associada a microtúbulos necessária à migração de neuroblastos na SVZ, e
demonstraram a ocorrência de uma redução no número de células doublecortina+ no
córtex mas não na SVZ de camundongos R6/2. Portanto, a alteração que nós
encontramos na RMS provavelmente não está relacionada a este fator. Da mesma
maneira, é provável que não haja influência do bulbo olfatório neste sentido, uma
vez que a sua remoção não previne a migração dos precursores neuronais e, além
disso, as células da SVZ não migram em direção a um explante de bulbo olfatório
em cultura (JANKOVSKI et al., 1998).
BEINRAISS e colaboradores (2001) demonstraram que o BDNF tem a
capacidade de aumentar o número de neurônios recém-formados no corpo estriado
e no bulbo olfatório. Já em camundongos que expressam baixos níveis de BDNF, a
migração para o bulbo olfatório é reduzida (ZUCCATO et al., 2005). Como os
encéfalos de camundongos com DH apresentam baixos níveis de BDNF, esta tem
sido sugerida como a principal causa da reduzida migração em direção ao bulbo
olfatório (BATISTA et al., 2006; FAN, 2006).
Como foi relatado anteriormente, também tem sido atribuído um papel aos
astrócitos que formam o “tubo glial” na migração e na proliferação na RMS. A
proliferação de neuroblastos nesta via ocorre justamente na periferia, próximo aos
astrócitos (MENEZES et al., 2002), o que sugere uma importante influência destes
sobre a população de células migratórias. CONOVER e colaboradores (2000)
mostraram que os astrócitos na SVZ expressam receptores para efrinas e que a
infusão de efrinas truncadas nos VLs, perturbando sua sinalização, resulta no
61
aumento da proliferação celular na SVZ e da formação de agregados de células
junto aos VLs, impedindo a migração. O referido trabalho sugeriu que as efrinas
devem ajudar a definir a via de migração dos neuroblastos. Sendo assim, seria
interessante verificar se ocorre alguma alteração destas moléculas ou dos seus
receptores nos astrócitos da RMS de camundongos com DH.
Utilizando Fluoro-Jade-C, nós detectamos células em degeneração no corpo
estriado de camundongos com DH, mas não nos selvagens. Alguns dados apontam
que o Fluoro-Jade é capaz de marcar astrócitos reativos após lesão cortical
(COLOMBO e PUISSANT, 2002) e que o Fluoro-Jade-B marca astrócitos reativos e
quiescentes na medula espinal (ANDERSON et al., 2003). Por ouro lado, SHMUED
e colaboradores (2005) observaram que a marcação de astrócitos utilizando o
Fluoro-Jade-C é rara e bem menos intensa, o que talvez indique a maior
especificidade deste último em marcar neurônios em degeneração. Se
concordarmos com este argumento, podemos assumir que a marcação por Fluoro-
Jade-C é um bom parâmetro para verificar a influência de terapias sobre a
degeneração neuronal observada na DH, embora existam controvérsias a respeito
do exato mecanismo de morte celular nesta patologia.
Nosso trabalho objetivou compreender melhor alguns aspectos da
neurogênese na DH. Não sabemos se a alteração da migração que observamos
contribui para a patogênese da doença (reduzindo o número de neurônios
disponíveis para a reposição das células mortas ou afetando sua migração também
em estágios iniciais do desenvolvimento), se resulta na proteção contra a toxicidade
da htt (ao reter as células próximas ao subepêndima), ou se a alteração não gera
conseqüência alguma, agindo simplesmente como efeito da mutação da htt.
Algumas restrições durante a nossa investigação se devem à dificuldade de manter
62
a reprodução de camundongos R6/2. Já existem estudos mostrando a redução de
gonadotrofinas e infertilidade neste modelo (PAPALEXI et al., 2005) e
provavelmente por este motivo não obtivemos sucesso em manter exemplares desta
linhagem no Brasil. Esperamos adquirir novos animais em breve, pois temos como
perspectiva continuar nossa pesquisa nesta mesma linha, utilizando uma abordagem
terapêutica. Neste sentido, pretendemos verificar a influência da injeção de células-
tronco da medula óssea sobre a população de progenitores neurais e sobre a
degeneração do corpo estriado na DH.
63
CONCLUSÕES
___________________________________________________________________
Nós demonstramos que ocorre um déficit migratório de neuroblastos ao longo
da RMS de camundongos R6/2. O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e a PSA-NCAM,
cujos papéis na migração foram reconhecidos, não apresentam alteração de
expressão neste modelo. Entretanto, são muitos os fatores que podem estar
contribuindo para o déficit e investigações são necessárias para que se
compreendam as causas, bem como as conseqüências desta alteração.
Verificamos também que células em degeneração no corpo estriado de
camundongos com DH e na RMS podem ser detectadas através da utilização do
Fluoro-Jade-C. Esperamos que as informações obtidas com este estudo possam
contribuir para a melhor compreensão do comportamento dos progenitores
neurais na DH, favorecendo desta forma a aplicação de terapias celulares na
recuperação funcional dos pacientes.
64
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ANEXOS ___________________________________________________________________
PROTOCOLOS I) Imuno-histoquímica: BrdU
• Deixar os cortes descongelarem.
• PBS 10mM + Triton a 0,3 %: 10min, 3x.
• Desnaturar DNA com HCl 2N: 30 min a 37° C.
• Tampão borato 0,1 M pH 8,5: 5 min.
• PBS 10mM: 10min, 3x.
• Primário 1:100 em NGS 10%: overnight a 4° C.
• PBS 10mM: 10min, 3x.
• Anticorpo secundário 1:200 em PBS 10mM + Triton a 0,3 %: 2h a 37° C
• PBS 10mM: 10min, 3x. II) Imuno-histoquímica: Jones
• Deixar os cortes descongelarem.
• PBS 10mM + Triton a 0,01%: 10min, 1x.
• PBS 10mM: 10min, 2x.
• Solução bloqueio (NGS 5% + BSA 3% + glicina 1% em PBS10mM): 1h em temperatura ambiente.
• Anticorpo primário 1:100 na solução bloqueio: overnight a 4° C.
• PBS 10mM: 10min, 3x.
• Anticorpo secundário1:1000 em PBS 10mM: 2h a 37° C.
• PBS 10mM: 10min, 3x (lavar também com DAPI, se quiser).
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III) Imuno-histoquímica: PSA-NCAM/BrdU
• Deixar os cortes descongelarem.
• PBS 10mM: 10 min, 3x.
• Solução bloqueio (NGS 5% + Triton 0,4% + BSA 3% + glicina 1% em PBS10mM): 1h em temperatura ambiente.
• Anticorpo primário 1:200 na solução bloqueio: overnight a 4ºC.
• PBS 10mM: 10 min, 3x.
• Anticorpo secundário1:1000 em PBS + 0,3% Triton: 2h a 37ºC.
• PBS10mM: 10 min, 3x.
• Pós-fixação com paraformaldeído 4%: 20 min.
• PBS10mM: 10 min, 3x.
• Desnaturar DNA com HCl 2N: 30 min a 37ºC.
• Tampão borato 0,1 M pH 8,5: 5 min.
• PBS10mM: 10 min, 3x.
• Solução bloqueio (NGS 5% + Triton 0,4% + BSA 3% + glicina 1% em
PBS10mM): 1h em temperatura ambiente.
• Primário 1:100 na solução bloqueio: overnight a 4° C.
• PBS10mM: 10 min, 3x.
• Anticorpo secundário 1:200 em PBS 10mM + Triton a 0,3 %: 2h a 37° C
• PBS10mM: 10 min, 3x.
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IV) Reação: Fluoro-Jade C
• Deixar os cortes descongelarem.
• Lavar os cortes com água destilada e deixar secar na estufa a 45°C (20-30 min).
• Lavar por 3 min em álcool etílico a 100%.
• Lavar por 1 min em álcool a 70%.
• Lavar por 1 min em água destilada.
• Colocar as lâminas em uma placa de petri mergulhadas em permanganato de
potássio (KMnO4) 0,06% e agitar brandamente na placa rotatória por 15 minutos.
*Enquanto isso, preparar a solução de Fluoro-Jade C a 0,001%. A solução inicial deverá estar estocada a 0,01% em água destilada, na geladeira. A solução final será obtida pela diluição desta solução estoque em ácido acético a 0,1%.
• Lavar por 1 min em água destilada.
• Incubar as lâminas com a solução de Fluoro-Jade C a 0,001% por 30 min em
temperatura ambiente.
• Fazer 3 lavagens de 1 min em água destilada ou lavar 1 vez em água destilada, colocar solução de bisbenzimida (diluída em água) e então lavar novamente por 2 vezes.
• Secar na estufa a 45°C (5-10 min).
• Clarear com xilol por 1 min.
• Montar em DPX.
• Visualizar no filtro FITC.
Importante:
não poderá ser reutilizada. A solução de KMnO4 A solução de Fluoro-Jade C, após diluída, poderá ser utilizada dentro de um intervalo de duas horas.
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V) Soluções:
• PBS 10 mM
- NaCl - 0,8 % - KCl - 0,02% - KH PO - 0,02% 2 4 - Na HPO .7H O - 0,2% 2 4 2
• Tampão fosfato (Tp PO ) 0,2M 4
HPO - 2% - Na2 4 - NaH PO - 0,6% 2 4
• Tampão Borato 0,1 M - pH 8,5
- Ácido bórico - 0,3% - Bórax (borato de sódio) - 0,5%
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