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ANÁLISE DE GLÚTEN PARA FINS DE ROTULAGEM DE ANÁLISE DE GLÚTEN PARA FINS DE ROTULAGEM DE ALIMENTOSALIMENTOS
XVI ENCONTRO NACIONAL E II CONGRESSO LATINO AMERICANO DE ANALISTAS DE ALIMENTOS
19 a 23 de julho de 2009Belo Horizonte - MG
Instituto Adolfo LutzDivisão de Bromatologia e Química
Serviço de AlimentosSeção de Doces e Amiláceos
Rejane Weissheimer de [email protected]
DOENÇA CELÍACA
TRATAMENTO
RWA
Intolerância às proteínas provenientes do trigo, centeio, aveia e cevada
PROLAMINAS
Frações proteícas solúveis em álcool
Alimentação totalmente isenta de
glúten
proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina
LEGISLAÇÃO
Lei Federal nº 8543/1992 Determinou a impressão de advertência em rótulos e embalagens de alimentos industrializados que contenham glúten ou apresentem em sua composição trigo, centeio, malte, cevada, aveia e/ou seus derivados.
Resolução RDC nº 40/2002 Estendeu a obrigatoriedade da advertência “CONTÉM GLÚTEN” em caracteres com destaque, nítidos e de fácil leitura também as bebidas embaladas.
Lei nº 10.674/2003 Obriga as inscrições “CONTÉM GLÚTEN” ou “NÃO CONTÉM GLÚTEN” para os produtos alimentícios comercializados, como medida preventiva e de controle da doença celíaca.
RWA
ADVERTÊNCIA nos rótulos dos alimentos, em relação à presença ou ausência de glúten, deve ser absolutamente confiável
RWA
IMPLANTAÇÃO
Implantação de métodos analíticos sensíveis e específicos para
detecção de glúten em alimentos.
RWA
Testes Imunológicos
Parceria BQ e BM
Projeto FAPESP
Objetivo: desenvolver metodologia Comparação ELISA in house x kit comercial ω gliadina
RWA
ELISA “In house”
RWA
Equipamentos básicos: balança, pHmetro, agitador de tubos (PHOENIS), agitador orbital (FANEM), misturador digestor de líquidos (HEIDOLPH) e centrífuga (CELM)
EQUIPAMENTOS
RWA
Lavadora de placas Wellwash 4 – Labsystems
Leitora de placasMultiskan Ascent - Labsystems
RWA
Glúten de trigo (gluten from wheat)
SIGMA –– G5004
Gliadina (Gliadin): SIGMA – G-3375,
PADRÕES DE CONTROLE
RWA
ELISA COMPETITIVO INDIRETO
•Sensibilização com gliadina (antígeno) em etanol a 70%•Incubação 37ºC/16 h•Secagem
•Reação Ag-Ac (amostra/padrão) (anti-gliadina – competição)
•Incubação 37ºC / 2 h
RWA
Solução finalizadora da reação (H2SO4) – Leitura (492nm)
Substrato cromogêneo (OPD) – 37ºC/30min
Conjugado Peroxidase(37ºC/1h)
Placa sensibilizada com Ag (gliadina)
Sobra do Ac anti-gliadina (37ºC / 1hr)
Lavagem (5x)
Lavagem (5x)
ELISA COMPETITIVO INDIRETO
RWA
CURVA PADRÃO DE GLIADINA
y = -0,4575x + 0,8698R2 = 0,9712
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
-0,5 0 0,5 1 1,5 2log conc. gliadina ug/ mL
DO
492 m
n
RWA
RESULTADOS
* Concentração esperada* LQ =Limte de quantificação
Amostras Peso (g) Etanol Diluição Gliadina* DO DO Média log Gliadina Gliadina Recuperação(mL) (ug/ g) conc ug/ mL ug/ g %
Amido (maisena) 2,1111 20 50 Neg 0,834 0,718 0,776 -0,176 0,667 316 < LQPolvilho 2,0115 20 50 Neg 0,821 0,793 0,807 -0,256 0,555 276 < LQFar. Mandioca 2,0874 20 50 Neg 0,947 0,868 0,908 -0,515 0,305 146 < LQFar. Milho 2,0691 20 50 Neg 0,931 0,949 0,940 -0,599 0,252 122 < LQSopa 2,0806 20 50 Neg 0,903 0,769 0,836 -0,331 0,467 225 < LQTempero 2,0316 20 50 Neg 0,829 0,806 0,818 -0,283 0,521 257 < LQGlúten (filha 1) 2,1085 20 50 5000 0,204 0,204 1,300 19,970 9471 189Glúten (filha 2) 2,0456 20 50 500 placa não respondeuLow kit 1,0813 10 50 placa não respondeuLow kit 1,0813 10 50 placa não respondeu
RWA
Sem reposta favorávelReprodutibilidade
Sensibilização da placaCálculos
Opção: Kit
“In house”
RWA
KITS
TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001
RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001
RWA
Amostras do teste de gliadina: controle negativo, controle A e controle B
(positivas)
RWA
KIT PARA ELISA
COMPOSIÇÃO: ω GLIADINA e R5
Substrato TMB concentrado (tetrametilbenzidina)
Solução de lavagem concentrada (tampão Tris-salino)
Solução diluente concentrada (PBS com gelatina e timerosal)
Solução finalizadora (ácido fosfórico 25%).
Placa de microtitulação com 12 tiras (96 alvéolos) sensibilizada com: * anticorpo anti-ω gliadina (ω gliadina) * pentapeptideo (R5) Padrão de gliadina liofilizada e padrões prontos
Conjugado peroxidase anti-gliadina (peroxidase ligada a anticorpo monoclonal de rato Anti-ω gliadina) diluído em PBS
Controles alto, médio e baixo
RWA
Amostras e controles extraídos com etanol já centrifugados
RWA
Amostras de teste de proficiência FAPAS
FAPAS 2733A e 2733BBolo de chocolate
FAPAS 2733A e 2733BBolo de chocolate
FAPAS T2712B Mistura para pão
FAPAS T2712B Mistura para pão
RWA
RESULTADOS – KIT ω GLIADINA
Glúten (mg/Kg) Valor z
ResultadoLaboratóri
o
Resultado
FAPAS
A 43 47,9 -0,6
B 440 665 -2,0
Teor de glúten em misturas de bolo e valor ZTeste de Proficiência FAPAS
RWA
y = 0,0288x + 0,1735R² = 0,9967
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 5 10 15 20 25 30
Ab
so
rbâ
ncia
(4
50
nm
)
Conc. gliadina (ng/mL)----- Curva-padrão média _____ Curva da regressão
Repetitividade de nove curvas-padrão de gliadinaKIT TRANSIA PLATE PROLAMINS (DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320)
REPETITIVIDADE DE NOVE CURVAS-PADRÃO SIMULTÂNEAS DE GLIADINA
KIT “TRANSIA PLATE PROLAMINS”
RWA
Reprodutibilidade de 3 curvas-padrão de gliadinaTRANSIA PLATE PROLAMINS (DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
0 5 10 15 20 25 30
Concentração gliadina (ng/mL)
Ab
sorb
ân
cia
(4
50
nm
)
1º dia (5/11/08) 2º dia (13/11/08) 3º dia (12/12/08) MEDIA Linear (MEDIA)
REPRODUTIBILIDADE DE TRÊS CURVAS-PADRÃO DE GLIADINA KIT “TRANSIA” DE MESMO LOTE, EM TRÊS DIAS DE ENSAIOS
RWA
Reprodutibilidade de 3 curvas-padrão de gliadinaRIDASCREEN® Gliadin (R Biopharm - Art. N◦ R7001)
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
0 20 40 60 80 100
Concentração gliadina (ng/mL)
Ab
sorb
ân
cia
(4
50
nm
)
1º dia (5/11/08) 2º dia (13/11/08) 3º dia (12/12/08) MEDIA Linear (MEDIA)
REPRODUTIBILIDADE DE TRÊS CURVAS-PADRÃO DE GLIADINA
KIT “RIDASCREEN GLIADIN” DE MESMO LOTE, EM TRÊS DIAS DE ENSAIOS
RWA
Resultados satisfatóriosCusto alto
Alternativas: DOTResultados satisfatórios
SemiquantitativoLimite de detecção 38 ppm = baixa
sensibilidade
RWA
DOT DOT ELISA NA DETECÇÃO DE GLIADINA
Linhas A – H: Diluição seriada ½ . Colunas: 1) Curva-padrão gliadina; 2, 3 e 4) Padrões glúten 3000, 400 e 160ppm; 5) Amostra FAPAS; 6) Sopa de feijão com macarrão; 7) Grão de cevada; 8, 9 e 10) Amido de milho, sopa de vegetais e Arroz - controle negativo
A
B
C
D
E
F
G
H
RWA
CODEX ALIMENTARIUS
Alimento naturalmente sem glúten até 20ppm
Mistura de alimentos naturalmente sem glúten até 200ppm
RWA
Dot ELISA
N.º ALI MENTO ELI SA (ppm) Dot ELI SA ROTULAGEM
1 Sopa de abobrinha 34 -
2 Sopa de carne 44 -
3 Sopa de mandioquinha ND -
4 Sopa de três queijos ND -
5 Sopa de galinha ND -
6 Caldo de carne ND -
7 Pipoca ND -
8 Macarrão ND -
9 Leite ND - Não
10 Creme de arroz ND - Contém
11 Amido de milho ND - Glúten
12 Creme de milho ND -
13 Biscoito sequilho ND -
14 Soja ND -
15 Lasagne ND -
16 Farinha de mandioca ND -
17 Sêmola de milho ND -
18 Farinha de arroz ND
19 Caldo de carne 54 -
20 Sopa de f eijão e macarrão 2393 +++
21 Biscoito maisena 745 +++
22 Sopa de cebola 2996 +++ Contém
23 Centeio 1704 +++ Glúten
24 Cevada ND
25 Biscoito integral aveia e mel 2679 +++
26 Farinha de aveia 247 -
ND = Não detectável – Abaixo dos limites de quantificação (10ppm)
DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS
RWA
ALIMENTOS ROTULAGEM Glúten (ppm) Dot ELISA*Farinha de centeio integral 37872 +++Grão de cevada 2501 ++Alimento a base de extrato de malte 434 +Farinha de aveia 193 +Biscoito integral "Contém glúten" 8514 +++Sopa de feijão com macarrão 2869 ++Biscoito tipo maisena 3804 ++Macarrão 25206 +++Sopa de cebola em pó com crotons 384 +Caldo de carne em pó ND 0Grão de arroz ND 0Grão de milho para pipoca ND 0Farinha de mandioca ND 0Proteína isolada de soja em pó ND 0Leite em pó semidesnatado "Não contém glúten" ND 0Grão de lentilha ND 0Grão de feijão ND 0Grão de ervilha ND 0Macarrão sem glúten ND 0Sopa 10 vegetais em pó ND 0Biscoito salgado sem glúten ND 0
ND (Não detectado – abaixo do limite de detecção de 3 ppm de glúten)* Intensidade do spot de cor violácea em referência a curva padrão de gliadina e o controle negativo (0) amido de milho
Detecção de glúten em amostras alimentícias pelos métodos R5 ELISA e dot ELISA
RWA
DESAFIOS
1. Composição do alimento – diferença entre as matrizes
quantidade e ingredientes do alimento interferem diretamente na quantificação do analito
VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO
2. Procedência dos ingredientes
3. Diferentes respostas ente os kitsExtração PadrãoReferência
RWA
ELISAFONTE DE GLIADINA DOS INGREDIENTES PCR
SEQUENCIAMENTO
TRABALHO INTEGRADO
CONCLUSÃO
RWA
ANVISA
CVE CVS
ALIMENTO
IALIAL
CELIACO
EQUIPE MULTIDISCIPLINAR
