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ARCH SOC ESP OFTALMOL. 2014;89(1):17–21

ARCHIVOS DE LA SOCIEDADESPAÑOLA DE OFTALMOLOGÍA

www.elsev ier .es/of ta lmolog ia

rtículo original

nálisis citogenético del melanoma de coroides

. Filloya,∗, J.M. Caminala, M.M. Varelab, M. Gomàb, L. Ariasa y J. Arrugaa

Servicio de Oftalmología, Hospital Universitario de Bellvitge-IDIBELL, Universidad de Barcelona, Hospitalet de Llobregat, Barcelona,spanaServicio de Anatomía Patológica, Hospital Universitario de Bellvitge-IDIBELL, Universidad de Barcelona, Hospitalet de Llobregat,arcelona, Espana

I N F O R M A C I Ó N D E L A R T Í C U L O

istoria del artículo:

ecibido el 16 de enero de 2013

ceptado el 26 de julio de 2013

n-line el 16 de octubre de 2013

alabras clave:

elanoma

veal

itogenético

ultiplex-ligation-prove

mplification

nálisis de microsatélites

érdida de heterocigosidad

R E S U M E N

Objetivo: Investigar la presencia de las alteraciones citogenéticas conocidas del melanoma de

coroides en una serie de pacientes diagnosticados y tratados en nuestra Unidad de Oncología

Ocular. También exponemos una revisión de la literatura actual sobre este tema.

Método: Durante dos anos se han estudiado muestras procedentes de piezas de enucleación

o de resección de melanoma coroideo de un total de 27 pacientes mediante análisis de

microsatélites (MSA) para estudio de pérdida de heterocigosidad (LOH) del cromosoma 3 y

mediante multiplex-ligation-prove amplification (MLPA) para los cromosomas 1, 3, 6 y 8.

Resultados: Entre los casos estudiados, 20 mostraron como mínimo una de las alteraciones

citogenéticas que se buscaban, 11 LOH del cromosoma 3 (44%), 8 ganancias del cromo-

soma 6 p (30%), 8 ganancias en cromosoma 8 (30%) y 7 pérdidas totales o parciales del

cromosoma 1 (26%).

Conclusiones: Este es el primer estudio citogenético del melanoma de úvea en nuestro país.

La presencia y preponderancia de las distintas alteraciones citogenéticas se corresponden

con las de las series publicadas en la literatura.

El análisis citogenético nos permite conocer mejor el pronóstico vital individualizado.

También puede resultar una herramienta valiosa para establecer el protocolo de seguimiento

más adecuado y la necesidad de tratamientos adyuvantes en estos pacientes.

© 2013 Sociedad Española de Oftalmología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los

derechos reservados.

Cytogenetic analysis of choroidal melanoma

eywords:

elanoma

A B S T R A C T

Purpose: To investigate the presence of known cytogenetic alterations of choroidal melanoma

in a series of patients diagnosed and treated in our Ocular Oncology Service. A review of the

this topic is also presented.

veal present literature on ytogenetic

ultiplex-ligation-proveMethods: Microsatellite analysis (MSA) studies on loss of heterozygosity (LOH) of chromo-

some 3, as well as multiplex ligation prove amplification (MLPA) on chromosomes 1, 3, 6

and 8, were performed on enucleation or local resection samples obtained from a total of

27 patients, over a 2 year period.

∗ Autor para correspondencia.Correo electrónico: alejandrofilloy@gmail.com (A. Filloy).

365-6691/$ – see front matter © 2013 Sociedad Española de Oftalmología. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.oftal.2013.07.012

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amplification

Micsosatellite analysis

Loss of heterozigosity

Results: Twenty patients showed at least one of the cytogenetic alterations looked for. A total

of 11 cases were found that showed LOH of chromosome 3 (44%), 8 gains of chromosome 8

(30%), 8 gains of chromosome 6 p (30%), and 7 partial or total losses of chromosome 1 (26%).

Conclusions: This is the first study on the cytogenetics of choroidal melanoma performed in

our country. The results are similar to that published in the literature.

Cytogenetic analysis provides more accurate knowledge on a vital individual prognosis. It

also may become a valuable tool for establishing the most adequate follow-up regimes, and

the need for adjuvant therapies.

© 2013 Sociedad Espanola de Oftalmología. Published by Elsevier España, S.L. All rights

Introducción

El objetivo del trabajo ha sido investigar la presencia de lasalteraciones citogenéticas conocidas del melanoma de úveaen muestras obtenidas de pacientes de nuestra Unidad deOncología Ocular y comparar los resultados con los publicadosen la literatura actual.

Aproximadamente el 90% del melanoma uveal aparece enla coroides. A pesar de un tratamiento local correcto, cerca del50% de los pacientes morirán de enfermedad metastásica, quenormalmente involucrará al hígado1.

La estimación de la supervivencia se ha basado en carac-terísticas clínicas, sobre todo el diámetro tumoral máximo, laaltura del tumor, la afectación del cuerpo ciliar y la extensiónextraocular2.

Las características anatomopatológicas de mal pronósticoson, entre otras, la presencia de células de tipo epitelioide, unelevado índice mitósico y determinados patrones vasculares3.

Desde que en 1996 se demostró una correlación entre lapérdida en las células tumorales del cromosoma 3 y la muertepor metástasis4, se han identificado otros marcadores citoge-néticos de mal pronóstico incluyendo ganancia de 8 q, pérdidade 8 p, pérdida de 1 p y ganancia de 6 p.

Sujetos, material y métodos

Durante los dos últimos anos se han estudiado las mues-tras de melanoma de coroides de un total de 27 pacientes apartir de piezas de enucleación (habiendo sido esta por untratamiento primario o bien secundario por recidiva local trastratamiento conservador) y de resección local (tanto de resec-ción ab externo [transescleral] como de resección ab interno[endorresección]). Junto con la muestra tumoral se han obte-nido muestras de sangre periférica para comparar el análisiscitogenético de las células tumorales con el de los linfocitossanguíneos. Los estudios citogenético y anatomopatológico sehan llevado a cabo simultáneamente.

El estudio citogenético se llevó a cabo mediante análisisde microsatélites (MSA) que consiste en la utilización de lareacción en cadena de la ADN-polimerasa (PCR) para detectarla pérdida de 10 marcadores polimórficos propios del cromo-soma 3 y así estudiar la pérdida de heterocigosidad (LOH) delmismo, definida como una pérdida sustancial de uno de los

alelos de un cromosoma en comparación con una célula sanadel mismo individuo (marcadores comerciales propiedad deKit Human Genome Mapping Kit v2.5 de applied BiosystemInc., California, Estados Unidos).

reserved.

También se utilizó el multiplex ligation-dependent proveamplification (MLPA) para la detección de desequilibrios cro-mosómicos en cromosomas 1 (pérdida de 1 p), 3 (pérdida de3 p), 6 (ganancia de 6 p) y 8 (ganancia de 8 q y pérdida de 8 p)(MLPA kit Salsa po27; MRC-Holand, Amsterdam, Holanda).

En resumen, ambas técnicas se basan en sondas mole-culares preparadas para detectar regiones cromosómicasconocidas (fig. 1).

Estadística

Se ha realizado un analisis descriptivo de las variables de estu-dio, así como un estudio de proporciones mediante el testde chi-cuadrado o Fisher según demanda entre las diferentesvariables.

Todas las pruebas estadísticas se consideraron como sig-nificativas con una p ≤ 0,05. El análisis se realizó utilizando elpaquete estadístico SPSS 12.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, EE. UU.).

Resultados

Se han estudiado 27 casos, con un periodo máximo de segui-miento desde el tratamiento y la toma de la muestra dedos anos. La edad media de los pacientes ha sido de61,5 ± 11,16 anos y la distribución por sexos similar (48,1%mujeres y 51,9% hombres). La proporción de ojos derechosrespecto a izquierdos era similar y próxima al 50% en amboscasos. Las muestras tumorales procedían en 11 casos (40,7%)de la enucleación primaria del globo ocular, en ocho casos(29,6%) de la enucleación secundaria (recidiva o complicacio-nes) del globo ocular y en ocho casos (29,6%) de la resecciónlocal del tumor (cinco endorresecciones y tres reseccionestransesclerales). La distribución teniendo en cuenta el tamanotumoral (T) según la estadificación de la séptima edicion de laclasificación de la AJCC (TNM) fue de 3 pacientes (12%) T1,7 pacientes (28%) T2, nueve pacientes (36%) T3 y 6 pacien-tes (24%) T4. En seis pacientes (22,2%) se diagnosticó en algúnmomento (antes, durante o despues del diagnóstico de mela-noma de úvea) otra neoplasia distinta al melanoma.

En dos pacientes (7,4%) se evidenció en el momento deldiagnóstico una extensión extraescleral macroscópica.

En 19 (70,3%) de los casos hemos encontrado alguna de las

alteraciones que se buscaban (tabla 1).

Siete pacientes mostraron pérdidas totales o parciales delcromosoma 1 (26% de los casos), 12 han mostrado LOHdel cromosoma 3 (44% de los casos), siete mostraron

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D3S1593 D3S3630 D3S1265 D3S1279

Peripheralblood

Tumor

LOH LOH LOHNormal

3q24 3q29 3q25.13p26.3

Figura 1 – Ejemplo de gráfico que muestra la búsqueda de LOH del cromosoma 3 comparando la presencia de regionespolimórficas entre células sanguíneas (mitad superior) y células del tumor (mitad inferior). Se observa un descenso en 3 delas regiones del cromosoma 3 q en las células tumorales (flechas) en comparación con el mismo cromosoma de las célulassanas de la sangre.

Tabla 1 – Resultados de nuestro estudio

Paciente LOH CR 3 MLPA CR 1 MLPA CR 3 MLPA CR 6 MLPA CR 8 Tratamiento

1 Sí N LOH N N Enuc primaria2 Sí Ploss LOH N N Enuc secundaria3 No N N Pgain Gain Enuc primaria4 Sí N LOH pgain N Endo5 Sí Ploss LOH Pgain Gain Enuc secundaria6 No Loss N N N Enuc secundaria7 No N N Pgain N Enuc 1ARIA8 Sí Ploss Qloss N N Enuc primaria9 No N N N N Enuc secundaria10 Sí N LOH N Gain Enuc primaria11 No N N N N RESEC. ESC12 No N N Pgain Gain Enuc primaria13 No N N Pgain N Enuc primaria14 No N N N N Endo15 Sí Ploss LOH N N Enuc primaria16 Sí Ploss LOH N Gain Enuc secundaria17 No N N N N Enuc secundaria18 Sí N LOH N N Enuc primaria19 Sí N LOH N Gain Enuc primaria20 Sí N LOH N Gain Enuc primaria21 No N N N N Iridociclectomía22 No N N N N Enuc secundaria23 No N N N N Endo24 No N N N N Endo25 No Ploss N Pgain Gain Enuc secundaria26 No N N N N Transesc27 Sí N LOH N N Endo

Braqui: braquiterapia; CR: cromosoma; Endo: endorresección; Enuc: enucleación; gain: ganancia; LOH: pérdida de heterocigosidad; loss: pérdida;MLPA: multiplex-ligation-prove amplification; N/D: no disponible; N: normal; Transesc: transescleral.

ALMO

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ganancias en el cromosoma 6 p (26% de los casos), ocho mos-traron ganancias en el cromosoma 8 (30% de los casos).

Encontramos seis pacientes (22,2%) con una sola anomalíacromosómica, nueve pacientes (33,3%) con dos alteraciones,dos pacientes (7,4%) con tres alteraciones y un paciente (3,7%)con cuatro alteraciones. Este último paciente fue el único dela serie que en los dos anos del seguimiento desarrolló enfer-medad metastásica.

La combinación, pérdida del cromosoma 3 y ganancia delcromosoma 8, descrita como la que comporta un peor pronós-tico vital, fue encontrada en cinco pacientes (18,5%)5.

Estudiados según el tratamiento, el 100% de los casos querequirieron enucleación primaria y el 44% de aquellos en losque se indicó de forma secundaria tras recidiva, seguido deradioterapia, mostraron al menos una alteración citogené-tica. La tasa de alteraciones halladas entre los que recibierontratamiento por resección fue del 22%. Esta diferencia se jus-tificaría por ser los tumores de mayor tamano o por ser losque muestran crecimiento tras la radioterapia los que presen-tan mayores posibilidades de mostrar otros factores de malpronóstico.

Discusión

En el estudio del melanoma de úvea se han identificado variasanomalías citogenéticas que afectan a los cromosomas 1, 3, 6y 8. Existen amplias series en la literatura con largos periodosde seguimiento que han estudiado la presencia de estas alte-raciones y que las han relacionado con la supervivencia delos pacientes3,5–7. El objetivo de este trabajo es describir porprimera vez en nuestro país estos trastornos cromosómicosen la serie de pacientes diagnosticados y tratados en nuestrocentro.

La alteración citogenética que hemos encontrado conmayor frecuencia ha sido la monosomía 3 (44% de los casos),que en numerosos estudios se relaciona con un mal pronósticoen los pacientes afectos de melanoma de úvea.

En un estudio sobre 500 casos7 con muestras obtenidas apartir de aspiración transescleral con aguja fina, se concluyóque la probabilidad de metástasis acumulada a los 3 anos erade 2,6% para disomía 3, 5,3% para la monosomía parcial y 24%para la monosomía completa.

Hemos encontrado una alta proporción de monosomía 3asociada a la ganancia del cromosoma 8 (18,5%) que tam-bién se relaciona con un mal pronóstico vital. Esta altaproporción de anomalías citogenéticas en nuestra serie que-daría explicada por la alta proporción de tumores de tamanogrande (88% T2, T3 y T4) en la misma, siendo este unode los factores clínicos más relevantes de mal pronós-tico.

En un estudio realizado por Damato et al.5 se llevó a cabola tipificación citogenética de 452 melanomas con MLPA y secorrelacionaron los resultados con la presencia de otros facto-res de riesgo conocidos del melanoma de coroides y con laprobabilidad de muerte por metástasis, concluyendo que

la muerte por metástasis entre estos pacientes ocurre predo-minantemente en pacientes cuyos tumores muestran pérdidadel cromosoma 3 (mortalidad específica a 10 anos del 55%),siendo todavía más frecuente si presentan a su vez ganancia

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en el cromosoma 8 q (mortalidad específica a 10 anos del 71%).De hecho, estos tumores con el doble hallazgo fueron práctica-mente los únicos que desarrollaron enfermedad metastásica.Estos datos contrastan con la nula mortalidad específica quemostraron los pacientes sin alteraciones en el cromosoma 3(0%). En estos tumores con ambas alteraciones citogenéticas,el tipo celular epitelioide, loops vasculares y un alto índicemitótico se correlacionaron también con una pobre supervi-vencia, así como la falta de ganancia en el cromosoma 6 p (lapresencia de esta alteración actuaría como un factor protec-tor).

Respecto a las técnicas de análisis, si bien se empezó autilizar por su alta sensibilidad la fluorescensce in situ hybri-dization (FISH) en muchos centros, los microsatélites y elMLPA ha mostrado ser una técnica igualmente fiable sin losinconvenientes de coste y de dependencia de las células con-cretas analizadas que presenta el FISH3,8 al ser una técnicaque estudia las características promedio de todas las célulasde la muestra. Por este motivo, iniciamos el estudio de nues-tros pacientes mediante microsatélites y MLPA, consiguiendodetectar una elevada proporción de anomalías citogenéticasen nuestros pacientes tal como queda reflejado en el presentetrabajo.

La utilidad clínica a día de hoy de los estudios de citoge-nética del melanoma de coroides es motivo de controversia.Damato et al.9,10 afirman que, dada la alta correlación dela monosomía 3 y la ganancia en 8 con la mortalidadpor metástasis, el pronóstico vital individualizado que seobtiene mediante el análisis citogenético es beneficioso parael paciente al hacer posible un seguimiento más laxo en aque-llos pacientes de bajo riesgo, mientras que los de alto riesgoreciben un screening más estricto, permitiendo un diagnósticoprecoz de las metástasis, lo que debería aumentar la probabi-lidad de tratarlas y de incluir a los pacientes en estudios deterapias adyuvantes.

Sin embargo, han surgido diversas críticas al trabajo ante-rior. Se ha argumentado11 que, a la hora de biopsiar con agujafina, no es posible saber si efectivamente se ha recogido mues-tra tumoral. Asimismo, los beneficios psicológicos que se hanatribuido a que el paciente conozca su pronóstico tambiénse han puesto en duda. El aumento de la supervivencia quese pudiese conseguir gracias a un screening más estricto enlos pacientes de alto riesgo podría tratarse simplemente de unsesgo de tiempo (el hecho de diagnosticar la metástasis másprecozmente no hace que el paciente viva hasta una fechamás tardía que si esta se hubiera hallado en una fase másevolucionada).

Actualmente, en la mayoría de los centros, el análisis cito-genético del melanoma de coroides se lleva a cabo únicamentecon propósito investigador. Sin embargo, todo parece indicarque el conocimiento acerca de estas alteraciones genéticasabrirá la puerta a conocer los mecanismos de malignizaciónde la enfermedad y los cambios en la expresión genética aso-ciados, lo que conllevaría nuevas posibilidades diagnósticasy terapéuticas. El conocimiento derivado de estos estudiosy la obtención de series largas parecen ser ahora mismoel siguiente paso para mejorar las expectativas de estos

12

pacientes .Dado el bajo número de pacientes, no hemos podido encon-

trar relaciones entre las alteraciones citogenéticas y otros

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actores clínicos e histológicos conocidos de mal pronósticoital.

Queda pendiente para un futuro trabajo el relacionar laresencia de una o varias anomalías citogenéticas con

a supervivencia específica de nuestra serie de pacientes, parao qual es importante tener un mayor número de pacientes.

onflicto de intereses

os autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

i b l i o g r a f í a

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