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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU METRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
VILMA MARÇAL DE QUEIROZ
Análise da contaminação bacteriana na superfície de cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis
Cuiabá - MT 2020
1
VILMA MARÇAL DE QUEIROZ
Análise da contaminação bacteriana na superfície de cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC, como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Área de Concentração: Biociência. Orientadora: Profa. Drª. Cyntia R. A. Estrela.
Cuiabá - MT
2020
2
Z947e Vilma Marçal de Queiroz.
Análise da contaminação bacteriana na superfície de cimentos biocerâmicos por
Enterococcus faecalis.
Queiroz – Cuiabá, 2020.
52 f.:il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas) – Programa de Pós-Graduação em
Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá.
Orientadora: Profa. Drª. Cyntia R. A. Estrela.
1. Enterococcus faecalis. 2. Cimentos Dentários. 3. Microscopia eletônica de
varredura.
3
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU METRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
VILMA MARÇAL DE QUEIROZ
Análise da contaminação bacteriana na superfície de cimentos biocerâmicos por Enterococcus faecalis
Dissertação apresentada à UNIC, Doutorado em Ciências Odontológicas Integradas como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre
conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
_________________________________________
Prof. Dr. Helder Fernandes de Oliveira UnivEvangélica
_________________________________________
Prof. Dr. Luiz Evaristo Ricci Volpato Universidade de Cuiabá - UNIC
_________________________________________
Profª. Drª. Cyntia R. A. Estrela Universidade de Cuiabá - UNIC
Orientadora Cuiabá, ____ de ____________ de 2020.
4
Dedico este trabalho a Deus, pela
vida abençoada que me deste, ao meu
querido pai (in Memorian) que mesmo na
ausência física acredito estar torcendo
muito por mim, e minha mãe meu exemplo
de garra e persistência, e aos meus
queridos irmãos que sempre me apoiam e
incentivam na minha caminhada e na
realização dos meus sonhos.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus pela oportunidade da existência e pelo dom da vida.
Ao meu pai Otaviano Marçal de Queiroz (in Memorian) e minha mãe Dazia
Fernandes Pereira, meus exemplos de vida.
Aos meus queridos irmãos Daniel, Jonas e Jarbas por serem meu alicerce
durante a realização dos meus sonhos, que sempre acreditaram e me incentivaram
durante a minha caminhada.
Aos meus colegas e amigos de trabalho pelo apoio nos momentos em que não
pude estar presente nas tarefas laborais.
Aos eternos colegas de curso. Vivemos e sobrevivemos a momentos “mágicos”
que estão sempre em minha memória.
A minha professora e orientadora Profª. Drª. Cyntia Rodrigues de Araújo Estrela,
pela confiança, oportunidade, por me proporcionar direção, paciência, atenção,
disposição, e por todos os conhecimentos divididos durante todo o desenvolvimento
do trabalho, e por quem devo muito mais que um agradecimento.
A Universidade Federal de Goiás na pessoa da Profª. Drª. Cyntia Rodrigues
Estrela e Prof. Dr. Carlos Estrela por permitir a realização da parte experimental deste
trabalho na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás, mostrando
na prática o que é fazer pesquisa.
Aos Professores Doutores do Mestrado e Doutorado em Ciências Odontológicas
Integrada da Universidade de Cuiabá – UNIC: Prof. Dr. Alexandre Meireles Borba,
Profª. Drª. Andreza Maria Fábio Aranha, Profª. Drª. Cyntia Rodrigues Estrela, Prof. Dr.
Luiz Evaristo Ricci Volpato, Prof. Dr. Mateus Rodrigues Tonetto. Obrigada pelos
ensinamentos, profissionalismo e dedicação.
Ao Coordenador do Mestrado e Doutorado em Ciências Odontológicas
Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Alexandre Meireles Borba.
Muito obrigada pelo apoio, e profissionalismo.
Ao diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – Unic Prof.
Dr. Alessandro Tadeu Correa Marques. Obrigada pelo apoio.
6
A Reitora da Universidade de Cuiabá – Unic, a Profª. Drª. Maria Angélica Motta
da Silva Esser por nos oportunizar este momento dentro da nossa Universidade.
A Pró-reitora Acadêmica da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Edirles Mattje
Backes pelo apoio dado a pós-graduação.
Ao Diretor de Pós-graduação Strito Sensu da Kroton, Prof. Dr. Hélio Suguimoto.
Obrigada pela oportunidade.
A secretaria do Programa de Mestrado/Doutorado da Universidade de Cuiabá-
UNIC que sempre estiveram e estão solícitos as nossas necessidades e prestativas
aos alunos e professores do programa de pós-graduação da Universidade de Cuiabá.
7
“Desistir? Eu já pensei seriamente nisso,
mas nunca me levei realmente a sério. É
que tem mais chão nos meus olhos do
que cansaço nas minhas pernas. Mais
esperança nos meus passos do que
tristeza nos meus ombros. Mais estrada
no meu coração do que medo na minha
cabeça.” (Cora Coralina)
8
RESUMO
QUEIROZ, Vilma Marçal de. Análise da Contaminação Bacteriana na Superfície de Cimentos Biocerâmicos por Enterococcus faecalis. [Dissertação]. Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC. 2020.
O tratamento dos canais radiculares tem como objetivo esvaziar, sanificar, modelar e para finalizar, preencher tridimensionalmente o canal radicular por meio do selamento endodôntico e coronário. O presente estudo avaliou a contaminação bacteriana por Enterococcus faecalis através de análise superficial de diferentes cimentos endodônticos biocerâmicos empregados rotineiramente na Endodontia: MTA Angelus®, Biodentine® e Cimento Portland, por Enterococus faecalis. Vinte dentes incisivos bovinos de procedência conhecida foram utilizados neste estudo. Os dentes foram seccionados e foram confeccionadas cinco cavidades em cada secção radicular com largura similar e equidistantes 3mm uma da outra. Os materiais foram preparados de acordo com as especificações dos fabricantes e as cavidades preenchidas. Os espécimes foram colocados em tubos de ensaio contendo 5mL de Brain Heart Infusion (BHI; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA) e contaminados por uma cepa padrão de Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtida da American Type Culture Collection nos períodos experimentais de 7 e 30 dias. Nos períodos de 7 e 30 dias de contaminação, os materiais avaliados foram removidos das cavidades e individualmente imersos em 7mL de Letheen Broth seguido pela incubação a 37˚C por 48 horas. Após este período foi realizada a transferência, individualmente, para 5mL de infusão cérebro coração, seguido de novo período de incubação nas mesmas condições anteriormente citadas. A contaminação bacteriana foi avaliada por meio do espectrofotômetro UV. Para avaliação em microscopia eletrônica de varredura foram realizadas a aquisição das imagens com aumento de 50x, 1500x e 5000x para detectar a presença ou ausência de contaminação. A presença de Enterococcus faecalis foi detectada nos materiais tanto pela análise da densidade óptica de culturas de 07 e 30 dias, quanto pela análise das superfícies determinadas pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura.
Palavras-chave: Enterococcus faecalis; Cimentos Dentários; Microscopia eletrônica
de varredura.
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ABSTRACT
QUEIROZ, Vilma Marçal de. Analysis of Bacterial Contamination on the Surface of Bioceramic Cements by Enterococcus faecalis. [Dissertation]. Stricto Sensu Graduate Program in Integrated Dental Sciences at the University of Cuiabá - UNIC 2020.
The treatment of root canals aims to empty, sanitize, shape and, finally, fill the spaces of the pulp cavities by means of endodontic and coronary sealing. The present study analyzed the surface contamination of materials routinely used in Endodontics: MTA Angelus®, Biodentine® and Portland Cement, by Enterococus faecalis. Twenty bovine incisor teeth of known origin were used in this study. The teeth were sectioned and five cavities were made in each root section with similar width and equidistant 3 mm from each other. The materials were prepared according to the manufacturers' specifications and the cavities filled. The specimens were placed in test tubes containing 5mL of Brain Heart Infusion and contaminated with a standard strain of Enterococcus faecalis (ATCC 29212) obtained from the American Type Culture Collection in the experimental periods of 7 and 30 days. In the periods of 7 and 30 days of contamination, the evaluated materials were removed from the wells and individually immersed in 7mL of Letheen Broth followed by incubation at 37˚C for 48 hours. After this period, 01mL was transfered, individually, to 5mL of brain-heart infusion, followed by a new incubation period in the same conditions. Microbial contamination was evaluated using the UV spectrophotometer. For scanning electron microscopy evaluation, images were acquired at 50x, 1500x and 5000x magnification to detect the presence or absence of contamination. The presence of Enterococcus faecalis was detected in the materials both by analyzing the optical density of cultures of 07 and 30 days, and by analyzing the surfaces determined by the scanning electron microscopy images.
Keywords: Anti-Infective Agents; Dental cements; Endodontics.
10
LISTA DE SÍMBULOS E ABREVIATURAS
% Porcento
< Menor
® Marca Registrada
ANOVA Análise de Variância
BA Bioagregado
DP Desvio padrão
et al. e colaboradores
LabMic Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução
mµ Micrômetro
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
min Minutos
mL Mililitro
Mm Milímetro
MTA Mineral Trixide Aggregate
nº Número de amostras
° Graus
ºC Grau Celsius
p Nível de significância
RRM Root Repair Material
SP São Paulo
™ Trademark (marca registrada)
UFG Universidade de Goiás
UNIC Universidade de Cuiabá
UV Ultravioleta
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição das amostras experimentais de acordo com os
materiais estudados, sua composição e número de amostras por
grupo................................................................................................ 30 Tabela 2. Distribuição dos grupos experimentais e modelos de estudos......... 33 Tabela 3. Distribuição de scores de acordo com a presença de contaminação
sobre a superfície dos materiais avaliados....................................... 35 Tabela 4. Análise estatística da contaminação da superfície de cimentos
biocerâmicos em 7 dias e 30 dias na avaliação por densidade
óptica............................................................................................... 36 Tabela 5. Frequência dos scores nos grupos.................................................. 37
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Preparo dos espécimes................................................................ 29 Figura 2. Inserção do material avaliado nas cavidades................................ 31 Figura 3. Contaminação bacteriana na superfície dos materiais
avaliados....................................................................................... 37
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 14
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 16
2.1. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS.................... 17
2.2. CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS.............................................. 23
3. HIPÓTESE................................................................................................. 27
4. OBJETIVO..................................................................................................... 28
4.1. OBJETIVO GERAL.................................................................................... 28
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................... 28
5. MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 29
5.1. ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................. 35
6. RESULTADOS.............................................................................................. 36
7. DISCUSSÃO................................................................................................. 38
8. CONCLUSÃO................................................................................................ 41
REFERÊNCIAS................................................................................................... 42
14
1. INTRODUÇÃO
O sucesso do tratamento endodôntico é alcançado após a realização
cuidadosa de várias etapas que se sucedem umas às outras e que são
interdependentes, com o objetivo de reduzir os microrganismos do sistema de canais
radiculares, ou reduzi-los a níveis insignificantes. Sanificação dos canais radiculares
é alcançar por meio alcançado pelo emprego da ação mecânica do instrumento
associada à solução irrigadora e da medicação intracanal, ambas com efeito
antimicrobiano (ESTRELA et al., 2014; HOLLAND et al., 2017).
A etapa da obturação visa o preenchimento é a obturação, ou seja, o
preenchimento do espaço radicular por meio do emprego do cimento endodôntico
associado a guta-percha de maneira a permitir o selamento hermético, e impedir a
recolonização bacteriana e estimular o processo de reparo na região apical (MANN et
al., 2007). Mesmo quando realizadas todas as etapas corretamente, podem
permanecer ainda no sistema de canais radiculares microrganismos residuais, que
sobreviveram ao preparo químico-mecânico. Estes microrganismos constituem um
potencial para o fracasso do tratamento endodôntico a longo prazo, enfatizando a
necessidade de se optar por um material obturador que também apresente efeito
antimicrobiano (LUCKMANN et al., 2013).
A escolha de um material para a obturação do sistema de canais radiculares
deve levar em consideração algumas características, como fluidez, capacidade de
preencher a totalidade do sistema de canais radiculares, biocompatibilidade, efeito
antimicrobiano, radiopacidade, estabilidade dimensional, além de prevenir o
manchamento dentário (BEATRICE et al., 2009).
Vários materiais obturadores têm sido propostos como o objetivo de promover
um selamento adequado do canal radicular. Entre estes destaca-se o MTA, um
cimento constituído de partículas hidrófilas a base de silicato tricálcico, silicato
dicálcio, aluminato tricálcio e óxido de cálcio (TORABINEJAD et al., 1993; CAMILIERI
et al., 2005), possuindo características químicas similares ao Cimento Portland
(WUCHERPFINING e GREEN, 1999).
Os biocerâmicos são materiais cerâmicos resultantes da combinação entre
silicatos de cálcio e fosfatos de cálcio, acrescidos de partículas de alumina, zircônio e
vidros bioativos. Alguns estudos relataram que estes materiais apresentam
15
propriedades físico-químicas e biológicas satisfatórias (LOUSHINE et al., 2011;
CANDEIRO et al., 2012; WANNES, SEYAM e EL-SAMMAN, 2012; ALMEIDA et al.,
2017; DUARTE et al., 2018).
Considerando o objetivo de se reduzir ao máximo, a quantidade de
microrganismos presentes no canal radicular, é necessário conhecer as
características dos materiais obturadores atualmente empregados dentre os quais se
destacam, os cimentos biocerâmicos.
16
2. REVISÃO DA LITERATURA
O tratamento de canais radiculares envolve várias etapas que merecem
cuidadosa execução para se alcançar o sucesso. O processo de esvaziamento,
sanificação e modelagem é essencial dentro deste contexto, contudo, o apropriado
selamento do sistema de canais radiculares e coronário é determinante ao reparo
tecidual. Um dos papéis da obturação é impedir a invasão microbiana e a colonização
do canal radicular, por meio do efeito antimicrobiano alcançado durante o preparo
químico-mecânico e a obturação do canal radicular, impedindo a disseminação de
microrganismos para os tecidos vizinhos. Todo espaço da cavidade pulpar que foi
submetido ao processo de sanificação e modelagem deve ser completamente
obturado (ESTRELA et al., 2009).
Um material restaurador endodôntico deve apresentar algumas
características físicas como vedação, estabilidade dimensional, estabilidade de cor,
radiopacidade, insolubilidade em contato com fluidos, fluidez, fácil inserção,
biocompatibilidade e efeito antimicrobiano (DUARTE et al., 2018).
Estrela et al. (2018) descreveram as características de materiais com
potencial antibacteriano para o controle de infecções do sistema radicular e capazes
de promover a cicatrização por deposição de tecidos mineralizados. Os autores
relataram que para se recomendar um material para o tratamento de perfurações do
canal radicular, este deve apresentar boas propriedades físico-químicas e biológicas,
capacidade adequada de selamento, atividade antimicrobiana e potencial
osteogênico. Neste sentido, vários materiais obturadores têm sido atualmente
propostos e discutidos na endodontia, como o MTA, Cimento Portland e cimentos
biocerâmicos (GROSSMAN,1958; ORSTAVIK, 2005; GOMES-FILHO et al., 2007;
ESTRELA et al., 2009; DUARTE et al., 2018; ESTRELA et al.,2018).
17
2.1. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS, QUÍMICAS E BIOLÓGICAS
2.1.1. Cimento Portland
O Cimento Portland não foi originalmente destinado a ser utilizado na
cavidade bucal. Funteas et al. (2003) avaliaram este material e puderam concluir que
não há diferença significativa entre os elementos no MTA e Cimento Portland.
O Cimento Portland possui vários constituintes, sendo os principais o silicato
tricálcico (3CaO.SiO2), silicato dicálcico (2CaO.SiO2), aluminato tricálcico
(3CaO.Al2O3), aluminoferrito tetracálcico (4CaO.Al2O3.Fe2O3), cálcio hidratado
CaO.SO3.2H2O), óxidos alcalinos e outros constituintes. Vários autores relataram que
a constituição básica dos Cimentos Portland é a mesma, com algumas poucas
diferenças relativas ao fabricante e à localização da fonte de extração mineral (VAN
VLACK, 1973; WEIDMANN et al., 1994). Considerando a similaridade ao MTA na
composição química, o MTA e o Cimento Portland são compostos de silicato tricálcico
e dicálcico, alguns autores relataram que quando hidratados produzem gel hidratado
de silicato de cálcio e hidróxido e cálcio (ESTRELA et al; 2000a; CAMILLERI et al,
2005).
Wucherpfening e Green (1999) relataram que o Cimento Portland e MTA
apresentaram características idênticas, macroscopicamente e microscopicamente.
Ambos os materiais, MTA e Cimento Portland estão disponíveis nas formulações
branca e cinza, de acordo com a presença de óxido de ferro (CAMILERI et al., 2005;
ASGARY et al., 2005; ISLAM et al., 2006).
Holland et al. (2001a) observaram a reação do tecido subcutâneo de ratos a
tubos de dentina preenchidos com MTA, Cimento Portland e hidróxido de cálcio. Os
autores verificaram semelhança nos mecanismos de ação dos materiais estudados.
Em outro estudo, Holland et al. (2001b) avaliaram o comportamento da polpa dentária
de cães após a pulpotomia e a proteção direta da polpa com esses materiais. Após a
pulpotomia em dentes de cães, o remanecente pulpar foi protegido com MTA ou
Cimento Portland. A análise histomorfológica mostrou uma ponte tubular completa de
18
tecido duro em quase todas as amostras. O cimento MTA e Portland apresentaram
resultados semelhantes quando usado para proteção direta da polpa após pulpotomia.
A semelhança química entre MTA e Cimento Portland foi bastante
investigada. Ambos os materiais apresentam componentes semelhantes, exceto pela
presença de óxido de bismuto no MTA (CAMILERI et al., 2005; ESTRELA et al., 2012).
Além disso, MTA e Cimento Portland mostraram atividade antimicrobiana semelhante
(ESTRELA et al., 2000), biocompatibilidade (CAMILLERI et al., 2005), capacidade de
vedação (LEE, MONSEF e TORABINEJAD,1993; TORABINEJAD et al., 1995a),
adaptação marginal (PEREIRA et al., 2004) e estabilidade dimensional (DUARTE et
al., 2003), além de estimularem a cicatrização do tecido perirradicular e a formação
da barreira dentinária (BRISO et al., 2006).
Cutajar et al. (2011) avaliaram os resultados na radiopacidade e propriedades
físicas do Cimento Portland quando da adição do óxido de zircônio e os resultados
demonstraram um material com propriedades comparáveis ao agregado de trióxido
mineral.
O Cimento Portland, assim como o MTA, é disponibilizado nas formulações
branca e cinza, dependendo da presença de carbonatos, que são adicionados com a
função de melhorar a resistência, o Cimento Portland branco pode ainda ser
classificado como formulações estruturais e não estruturais (CAMILLERI et al., 2005;
ASGARY et al., 2005; ISLAN et al., 2006; BORGES et al., 2017).
2.1.2. Agregado Trióxido Mineral (MTA)
A busca de associar a um mesmo material diferentes propriedades desejáveis
(propriedades físico-químicas e biológicas) têm entusiasmado muitos estudos
(TORABINEJAD,1995; LOUSHINE et al.,2011; DUARTE et al., 2018; ESTRELA et al.,
2018). Depois de várias propostas e estudos em direção ao encontro de um cimento
que conquistasse a maioria das propriedades desejáveis foi proposto o Agregado
Trióxido Mineral (MTA) (LEE, MONSEF e TORABINEJAD, 1993; TORABINEJAD,
WATSON e PITT-FORD, 1993; TORABINEJAD et al 1995; CAMILLERI et al., 2005;
ORSTAVIK, 2005). Este material é constituído de partículas hidrofílicas à base de
19
silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico e óxido de cálcio (CAMILLERI
et al., 2005).
Holland et al. (1999) observaram resultados biológicos semelhantes entre o
Agregado de Trióxido Mineral (MTA) e o hidróxido de cálcio. Os mecanismos de ação
destas substâncias mostram-se similares valendo-se de implante destes materiais em
subcutâneo de ratos.
O MTA é composto principalmente de Cimento Portland adicionado com óxido
de bismuto como agente radiopacificador (TORABINEJAD et al., 1995). Estudos
analisaram o efeito do acréscimo do óxido de bismuto e não observaram alteração na
resistência à compressão (SALIBA et al., 2009; CAMILLERI, 2010a), porém, outros
afirmaram que porcentagens crescentes de óxido de bismuto afetam negativamente
a resistência do material (COOMARASWAMY et al., 2007).
Baseado nestes resultados foram realizados estudos para se adicionar outros
radiopacificadores que não alterassem as características o MTA, como o óxido de
zircônio. O óxido de zircônio foi inicialmente utilizado como um biomaterial para uso
em quadril ou outros implantes articulares em cirurgias ortopédicas, alta densidade e
boa resistência ao desgaste, mas também é usado como radiopacificante em
cimentos de ionômero de vidro (McCABE e WALLS, 2003) e na proporção 1:4 com o
Cimento Portland resultou em radiopacidade adequada (DUARTE et al., 2009;
CAMILLERI, 2010b).
Na sua primeira formulação do MTA apresentava colocação cinza, fato que
limitou sua aplicação em dentes anteriores (BORTOLUZZI et al., 2007). Para resolver
esta limitação, foi introduzido no mercado o MTA branco, com o objetivo de eliminar a
descoloração dos dentes (PARIROKH e TORABINEJAD, 2010).
O MTA branco apresenta em sua composição o silicato dicálcico e tricálcico e
20% de óxido de bismuto. Entretanto, alguns estudos demonstram que a alteração da
cor do material não resolveu a questão da descoloração da estrutura dentária
(BELOBROV et al., 2011; FELMAN e PARASHOS, 2013; MARCIANO et al., 2014).
Pode-se verificar a existência de várias formas comerciais de MTA para
emprego na endodontia. Entre estas formas comerciais pode-se citar o ProRoot MTA
(Dentsply Tulsa Dental, Tulsa, OK, EUA), composto por 50-65% de óxido de cálcio e
15-25% em dióxido de silício (CAMILERI et al., 2005; DAMMASCHKE et al., 2005); o
MTA Bio (Angelus Indústria de Produtos Odontológicos Ltda, Londrina, PR, Brasil)
20
apresenta em sua composição 80% de Cimento Portland e 20% de óxido de bismuto
(DUARTE et al., 2003; SONG et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007; ESTRELA et al.,
2012).
De acordo com Moretti et al. (2008) este material tem a capacidade de manter
a vitalidade pulpar e promover a cicatrização quando em contato com polpa dentária
ou tecido perirradicular. O efeito do MTA como agente de capeamento também pode
ser observado nos canais radiculares, onde ocorre uma deposição ativa do tecido
mineralizado e um estreitamento ou obliteração do canal, de forma similar ao hidróxido
de cálcio, em que os íons cálcio reagem com o dióxido de carbono presente nos
tecidos, produzindo grânulos de calcita e resultando na formação de tecido
mineralizado (CASAGRANDE, RODE e MARQUES, 2005).
O MTA apresenta propriedades físicas, químicas e biológicas satisfatórias,
tendo como destaque a capacidade de selamento e a tolerância tecidual
(TORABINEJAD e PARIROKH, 2010). Dentre as indicações para aplicação clínica
encontram-se o tratamento de perfurações, reabsorções radiculares, apicificação,
capeamento pulpar, pulpotomia e obturação do canal radicular (CAMILLERI e PITT-
FORD, 2006; LIU, WANG e DONG, 2015; BOSSO–MARTELLO et al., 2016). O MTA
é um material dinâmico e sua interação com tecidos e fluidos é constante (CAMILLERI
et al., 2011). Quando hidratado ele libera íons cálcio (DUARTE, 2003; CAMILLERI et
al., 2008).
Prati e GANDOLFI (2015) relataram que o MTA requer umidade para o
endurecimento e é capaz de proporcionar uma superfície bioativa adequadas com
arquitetura apropriada devido à nucleação de fosfatos de cálcio e a formação de uma
apatita.
Apesar das inúmeras vantagens apresentadas pelo MTA, pode-se observar
relatos de alguns problemas, tais como o longo tempo de endurecimento, difícil
manuseio, dificuldade na remoção após o endurecimento, presença de alguns
elementos tóxicos na composição do material e alto custo (KRATCHMAN, 2004;
CAMILLERI et al., 2005).
Costa et al. (2018) avaliaram as propriedades físico-químicas, citotoxicidade
e bioatividade do MTA Angelus® (MTA), cimento à base de silicato de cálcio (CSC) e
CSC com 30% de óxido de itérbio (CSC/Yb2O3). Os autores verificaram que o Yb2O3
é agente radiopacificador adequado em cimentos à base de silicato de cálcio e que
21
era substância não afetou as propriedades físico-químicas e biológicas, além de
preservar o potencial bioativo desse material.
Algumas características do MTA têm induzido novos estudos, como a
possibilidade de alteração da coloração da estrutura dentária, mesmo sabendo que
este material não é indicado para uso em regiões estéticas, o tempo de trabalho e seu
manuseio (TORABINEJAD e PARIROKH, 2010; KOHLI et al., 2015; BOSSO-
MARTELO, 2016; MARCIANO et al., 2016; MARCIANO et al., 2017; DUARTE et al,
2012; DUARTE et al, 2018). A partir destes inconvenientes, novos materiais estão
sendo desenvolvidos, como novas formulações que tentam aprimorar as
características do MTA.
2.1.3. Biocerâmicos
Novos produtos contendo compostos de silicatos de cálcio e fosfatos de
cálcio, que têm sido denominados de biocerâmicos foram propostos na endodontia
recentemente (DAMAS et al., 2011). Estes materiais cerâmicos são resultantes da
combinação entre silicatos de cálcio e fosfatos de cálcio, além de partículas de
alumina, zircônio e vidros bioativos (KOCH e BRAVE, 2009; SHINBORI et al., 2015).
O nome biocerâmico tem sido designado devido as propriedades biológicas.
A alumina e a zircônio têm sido consideradas cerâmicas bioinertes (AL-HADDAD e
CHEAB AZIZ, 2016). Dentre estes estão os vidros bioativos, as vitro-cerâmicas e os
fosfatos de cálcio, compõe as cerâmicas bioativas, como por exemplo, a hidroxiapatita
representa o componente majoritário da fase mineral dos ossos e dentes humanos
(ORÉFICE, PEREIRA e MANSURM, 2006).
O vidro bioativo ou bioactive glass (BAG) é um material nanoparticulado, à
base de SiO2, Na2O, CaO2 e P2O5 que apresenta potencial osteoindutor e
propriedades antibacterianas (SHRESTHA e KISHEN, 2016; TELLES e PRADON
SIMÃO, 2017). Este material permite a liberação de íons Na+ e Ca2+ do vidro, e a
incorporação de prótons H3O+ no vidro elevam o pH do ambiente tornando-o
inadequado a diferentes microrganismos (ZEHNDER et al., 2004, 2006, 2007;
WALTIMO et al., 2007).
22
Diferentes propriedades dos biocerâmicos tem sido estudadas, incluindo
capacidade de selamento, radiopacidade, tolerância tecidual, alteração dimensional
em ambiente tecidual (KOCH e BRAVE, 2009; ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO,
2009; LOUSHINE et al, 2011; CANDEIRO et al, 2012; LIU, WANG e DONG, 2015;
WANG, 2015; LV et al., 2017).
Vários estudos relataram que os cimentos biocerâmicos apresentam
propriedades físico-químicas e biológicas satisfatórias, e seus componentes químicos
são responsáveis pelas qualidades de suas propriedades, como as características
antibacterianas (LOUSHINE et al., 2011; CANDEIRO et al., 2012; WANNES, SEYAM
e EL-SAMMAN, 2012; ALMEIDA et al., 2017; DUARTE et al., 2018).
Alguns estudos têm reportado o Biodentine® como substituto da dentina e com
indicações endodônticas semelhantes às do MTA (ZANINI et al., 2012; CAMILLERI,
SORRENTINO e DAMIDOT, 2013). Outros estudos mostraram que o Biodentine®
estimula a diferenciação celular e promove a mineralização nas células pulpares
humanas (NARAYAN et al., 2006; JI et al., 2010).
Attick et al. (2014) estudaram a biocompatibilidade do Biomedine® e MTA
sobre células humanas de osteoblastos e verificaram que o Biomedine®, comportou-
se de maneira semelhante ao MTA em termos de rugosidade da superfície,
citotoxidade e fixação celular. O conhecimento das composições químicas e das
características de superfícies dos cimentos biocerâmicos podem favorecer
determinadas propriedades como a agregação de células que interferem no processo
de reparação tecidual (MILLER et al., 2018) bem como de bactérias que favorecem a
formação de biofilme bacteriano.
Araújo et al. (2017) avaliaram o efeito do MTA, hidróxido de cálcio e
Biodentine® nas células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos in vitro. Os
autores verificaram que os materiais avaliados são biocompatíveis e mantêm a
viabilidade e estimulam a proliferação, migração e diferenciação em uma população
chave de células-tronco dentárias.
Almeida et al. (2017) por meio de uma revisão sistemática, compararam as
propriedades físico-químicas e biológicas de cimentos endodônticos biocerâmicos
com cimentos endodônticos convencionais. Considerando as propriedades
analisadas encontraram-se resistência adesiva à dentina, radiopacidade, pH,
liberação de íons, solubilidade, tempo de trabalho e de presa, alteração dimensional,
23
escoamento, citotoxicidade, biocompatibilidade e atividade antimicrobiana. Os
resultados mostraram que os cimentos biocerâmicos apresentaram boas
propriedades físico-químicas e biológicas, semelhantes ou melhores que os cimentos
convencionais.
Rajasekharam et al. (2018) relataram que o Biodentine® não apresenta, em
sua composição, o silicato dicálcico. Dentre as características deste material pode-se
citar: tempo de presa variando entre 6 e 30 min, radiopacidade menor que outros
cimentos à base de silicato tricálcico; maior resistência à compressão superior,
microdureza, flexão, força, capacidade de vedação, força de ligação push-out e
liberação de íons cálcio em comparação com outros à base de silicato tricálcico.
2.2. CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS
As infecções endodônticas são polimicrobianas com mais de 150 espécies de
bactérias responsáveis pela infecção primária ou persistente. O Enterococcus faecalis
é uma espécie comumente isolada no sistema de canais radiculares e que pode
desempenhar um importante papel nas infecções endodônticas persistentes (ZHANG,
PAPPEN e HAAPASALO, 2009).
O E. faecalis é um coco anaeróbio facultativo Gram-positivo, presente em
canais radiculares tratados e com patologia periapical (SIREN et al.,1997;
MOLANDER et al., 1998; SUNDQVIST et al., 1998; LOVE, 2001; PORTENIER,
WALTINO e HAAPASALO, 2003). É um microrganismo que apresenta capacidade de
sobreviver em condições de elevado pH (NAIR et al., 1990; MOLANDER et al.,1998;
SUNDQVIST et al., 1998; LOVE, 2001; SIQUEIRA, 2001; SIQUEIRA e RÔÇAS,
2004), é capaz de aderir às células do hospedeiro e de expressar proteínas que
permitem a competição com outras células bacterianas (STUART et al., 2006).
Estudos relatam uma prevalência de E. faecalis até 77% em dentes com falha
no tratamento endodôntico (HANCOCK et al., 2001; STUART et al., 2006). Desta
forma, o emprego de um material com atividade antimicrobiana é considerado
vantajoso no esforço de reduzir os microrganismos remanescentes, prevenir infecções
24
recorrentes no canal radicular e auxiliar na cicatrização de tecidos periapicais
(ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO, 2009).
Estrela et al. (2000) estudaram a ação antimicrobiana e química do MTA,
Cimento Portland, pasta de hidróxido de cálcio, Sealapex e Dycal. A atividade
antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio foi superior a todas as outras
substâncias, sobre todos os microrganismos testados. O Cimento Portland contém os
mesmos elementos químicos que o MTA, com a exceção que o MTA também
apresenta, na sua constituição. Os autores relataram a necessidade de mais estudo
relativos ao MTA, Cimento Portland e hidróxido de cálcio, uma vez que há
semelhanças nos mecanismos de ação destas substâncias (HOLLAND et al., 1999).
Al-Nazham e Al-Judai (2003) estudaram, in vitro, a atividade antifúngica do
MTA e puderam verificar que, mediante a metodologia empregada, o MTA apresentou
efeito antifúngico sobre a C. albicans.
Tanomaru-Filho et al. (2007) avaliaram a atividade antimicrobiana do Sealer
26, Sealapex associado a óxido de zinco, cimento de óxido de zinco e eugenol,
Cimento Portland cinza e branco, MTA Angelus® cinza e branco e Pro Root MTA cinza,
utilizando o teste de difusão em ágar sobre Micrococcus luteus, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Enterococcus
faecalis. Os autores concluíram que todos os materiais testados apresentaram
atividade antimicrobiana sobre todos os microrganismos utilizados no estudo.
A atividade antimicrobiana dos biocerâmicos tem sido bastante relatada.
Estudos in vitro onde revelaram a capacidade de controle microbiano da biocerâmica,
uma propriedade relacionada à alcalinização do meio devido à liberação de íons
hidroxila e sua difusão através da dentina (ZHANG, PAPPEN e HAAPASALO, 2009;
LOVATO e Sedgley, 2011).
Zhang, Pappen e Haapasalo (2009) estudaram a eficácia antimicrobiana de
bioagregado (BA) e agregado de trióxido mineral (MTA) sobre Enterococcus faecalis
e verificaram que houve redução da viabilidade bacteriana.
Lovato e Sedgley (2011) analisaram a atividade antimicrobiana do MTA e
Endosequence sobre o E. faecalis e concluíram a atividade antibacteriana foi similar
para estes materiais.
Samiei et al. (2013) avaliaram a ação antimicrobiana do MTA branco e da
mistura de MTA com nanopartículas de prata. Os resultados mostraram que a adição
25
de nanopartículas prata ao material possibilitou melhora na atividade antimicrobiana
sobre E. faecalis, C. albicans e P. aeruginosa.
Kim et al. (2015) avaliaram a ação antibacteriana de três MTA (MTA Angelus®,
Endocem MTA e ProRoot MTA) sobre bactérias da cavidade bucal empregando testes
de difusão em disco. Os autores concluíram que MTA Angelus® e Endocem MTA
foram mais eficazes que o E. faecalis foi o microrganismo mais resistente.
Singh et al. (2016) comparam a atividade antibacteriana do EndoSequence
BC Sealer, um biocerâmico; do cimento resinoso MM Sealer; do Endoseal, um cimento
à base de óxido de zinco e eugenol; do ProRoot White MTA e MM - MTA sobre o E.
faecalis. Os autores verificaram que a atividade antibacteriana foi similar para todos
os materiais avaliados.
Monajemzadeh et al. (2017) avaliaram a eficácia antimicrobiana de três
selantes endodônticos com diferentes composições químicas, como resina AH 26),
óxido de zinco eugenol (ZOE) e MTA, sobre Candida albicans, Streptococcus sanguis,
Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans e Lactobacillus casei. Fio verificado
que o AH 26 apresentou a maior atividade antibacteriana, enquanto o MTA apresentou
a menor.
Farrugia et al. (2017) analisaram se as propriedades antimicrobianas dos
cimentos à base de Cimento Portland, como o agregado de trióxido mineral são
afetadas pelo contato com o sangue presente em situações clínicas. De acordo com
os resultados, o MTA, em contato com o sangue, exibiu descoloração e atividade
antimicrobiana reduzida causada pela biomineralização do MTA na presença de
fosfatos no sangue. Os autores concluíram que são necessários mais estudos em
condições próximas da situação clínica de forma a garantir o desempenho clínico a
longo prazo do MTA e sua atividade antimicrobiana a longo prazo.
Rajasekharam et al. (2018) verificaram que a atividade antimicrobiana de
Biodentine® foi significativamente mais alta sobre cepas como Streptococcus sanguis,
Enterococcus faecalis, Escherichia coli e Candida albicans, enquanto a atividade
antibacteriana significativamente menor observados sobre o Streptococcus mutans e
Streptococcus salivarius.
Considerando a necessidade de se conhecer o potencial antimicrobiano dos
diferentes materiais empregados no tratamento endodôntico, este estudo visa analisar
26
a contaminação da superfície do MTA, Biodentine® e Cimento Portland por
Enterococcus faecalis.
27
3. HIPÓTESE
A hipótese a ser testada é a de que materiais obturadores apresentam ação
antimicrobiana e não permitem o crescimento de microrganismos em suas superfícies.
28
4. OBJETIVO
3.1. OBJETIVO GERAL
Analisar a contaminação bacteriana na superfície de diferentes cimentos
biocerâmicos.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar se houve o crescimento bacteriano na superfície de diferentes
cimentos biocerâmicos, MTA Angelus®, Biodentine® e Cimento Portland em
períodos de 7 e 30 dias, através do espectrofotômetro UV;
2. Analisar a presença ou ausência de contaminação por E. faecalis nas
superfícies dos cimentos por meio de imagens de microscopia eletrônica de
varredura.
29
5. MATERIAL E MÉTODO No presente estudo foram utilizadas duzentas cavidades preparadas em 20
incisivos bovinos com rizogênese completa, de procedência conhecida (Matadouro
Mondelli, Bauru, SP, Brasil). Os dentes foram limpos com curetas periodontais,
submetidos à profilaxia, e armazenados em timol 0,1%. Os dentes foram
radiografados para se verificar o grau de normalidade entre as amostras. Aqueles
dentes que apresentavam calcificações, reabsorções internas ou externas, ou outras
alterações de desenvolvimento foram excluídos. As coroas dos dentes foram
seccionadas. O segmento radicular foi seccionado paralelamente ao longo eixo
radicular, com o emprego de disco diamantado de dupla face (4” x 0,12 x 0,12, Extec,
Enfield, CT, EUA) montado em micrótomo de tecido duro (Isomet 1000, Buehler Ltda.,
Bluff, IL, EUA) sob refrigeração com água (Figura 1).
Figura 1. Preparo dos espécimes.
Com o subsídio de uma broca cilíndrica reta no 1094 (KG- Sorensen, São
Paulo, SP, Brasil) montada em alta rotação (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, SP, Brasil)
com refrigeração de jato de água foram confeccionados em cada secção dos dentes
cinco cavidades de largura similar à profundidade de 2,0mm, equidistantes 3mm uma
da outra. As medidas dos cilindros de dentina foram determinadas por meio de
paquímetro digital (Mitutoyo, Suzano, SP, Brasil). Posterior ao preparo, os orifícios em
dentina foram limpos com água destilada, mantidos em EDTA a 17% (pH 7,2)
(Fitofarma, Goiânia, GO, Brasil) para remoção da smear layer por 5 minutos. A seguir,
todos os blocos de dentina bovina foram autoclavados por 30 minutos a 120˚C.
30
Neste experimento foram estudados os seguintes cimentos: 1. MTA Angelus®
(Angelus, Londrina, PR, Brasil; silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico,
óxido de cálcio, óxido de bismuto; n=40); 2. Biodentine® (Septodont, Saint-Maur-des
Fosses, França; Silicato tricálcico, silicato dicálcico, carbonato de cálcio, óxido de
cálcio, óxido de ferro e óxido de zircônio; n=40); 3. Cimento Portland (Cia. Cimento
Portland Itaú, Itaú de Minas, MG, Brasil; óxido de cálcio, dióxido de silício, óxido de
alumínio, óxido de magnésio, trióxido de enxofre, óxido de ferro, óxido de potássio e
óxido de sódio; n=40). Os grupos 4 e 5, respectivamente, servirão como grupos
controle positivo e negativo (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição das amostras experimentais de acordo com os materiais biocerâmicos empregados, sua composição e número de amostras por grupo. GRUPOS MATERIAIS ESPECIFICAÇÕES DO FABRICANTE
Grupo 1 MTA Angelus®
(Angelus, Londrina, PR, Brasil; silicato tricálcico,
silicato dicálcico, aluminato tricálcico, óxido de
cálcio, óxido de bismuto)
Grupo 2
Biodentine®
(Septodont, Saint-Maur-des Fosses, França;
silicato tricálcico, silicato dicálcico, carbonato de
cálcio, óxido de cálcio, óxido de ferro e óxido de
zircônio)
Grupo 3
Cimento Portland
(Cia. Cimento Portland Itaú, Itaú de Minas, MG,
Brasil; óxido de cálcio, dióxido de silício, óxido de
alumínio, óxido de magnésio, trióxido de enxofre,
óxido de ferro, óxido de potássio e óxido de sódio)
Grupo 4 Controle positivo Cavidades preparadas e contaminadas
Grupo 5 Controle negativo Cavidades preparadas e não contaminadas
31
Os materiais foram manipulados de acordo com as especificações dos
respectivos fabricantes, com exceção do Cimento Portland. A este material foi
acrescida água destilada esterilizada até se obter a consistência da pasta de hidróxido
de cálcio, ou seja, consistência de pasta de dente. O MTA Angelus® foi proporcionado
em uma placa de vidro na medida de 1 dose de pó (pá dosadora) e 1 gota de água
destilada, e manipulado por 30 segundos. O pó do cimento Biodentine® é
acondicionado em uma cápsula que foi cuidadosamente aberta, sendo aplicadas 5
gotas de água destilada em seu interior. A seguir, a cápsula foi fechada, levada a um
amalgamador digital (Astronmix, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, SP, Brasil) e agitada por
30 segundos. O Cimento Portland foi manipulado com água destilada na proporção
de água-cimento 1:3 (ESTRELA et al., 2012).
Após a manipulação, os materiais avaliados foram inseridos nas cavidades
com o auxílio de espátula flexível Hollenback (Duflex - SS White, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil) e condensador vertical tipo Paiva (Duflex - SS White, Rio de Janeiro, RJ,
Brasil), preenchendo completamente todas as cavidades (Figura 2). Os espécimes
foram mantidos em estufa (ECB 1.3, OdontoBrás, Ribeirão Preto, SP, Brasil), a
temperatura de 37ºC com umidade relativa de 95%, onde permaneceram por 48
horas. Após este período, os espécimes foram mantidos durante 30 minutos em
solução de hipoclorito de sódio a 5% (Longevitá, Goiânia, GO, Brasil) durante 30
minutos e, em seguida, lavados em água destilada esterilizada.
Figura 2. Inserção do material avaliado nas
cavidades.
32
Os espécimes foram colocados em tubos de ensaio contendo 5mL de Brain
Heart Infusion (BHI; Difco Laboratories, Detroit, MI, EUA). Para assegurar a
esterilização, o aparato foi incubado a 37oC por 24 horas e não foi observado
crescimento bacteriano. Nos grupos controle negativo e positivo os espécimes foram
submetidos ao mesmo protocolo, exceto por não serem inseridos materiais nas
cavidades.
Para a contaminação dos espécimes e desenvolvimento de biofilmes, cinco
mililitros de infusão cérebro coração (BHI; Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA)
esterilizado foram misturados com 5mL de uma cepa padrão de Enterococcus faecalis
(ATCC 29212) obtida da American Type Culture Collection. A cepa bacteriana foi
incubada a 37˚C por 24 horas. As suspensões experimentais foram preparadas pelo
cultivo do marcador biológico na superfície do ágar infusão cérebro coração (BHI;
Difco Laboratories), seguindo as mesmas condições de incubação. As células
bacterianas foram resuspensas em solução salina em uma concentração final de
aproximadamente 3X108 células/mL, ajustada para o padrão turbidade 1 de
McFarland.
Posterior ao preparo das suspensões bacterianas, as 200 cavidades
constituintes dos cinco grupos experimentais, foram inoculados com 0,1mL de
suspensão de E. faecalis ajustada para o padrão turbidade 1 de McFarland, nos
períodos experimentais de 7 e 30 dias. Este procedimento foi repetido a cada 72
horas, sempre utilizando cultura pura com 24 horas de preparo e ajustada ao padrão
1 de McFarland (Tabela 2).
33
Tabela 2. Distribuição dos grupos experimentais e modelos de estudos.
GRUPOS/TEMPO/MODELO MEV
7 dias MEV
30 dias Cultura
7 dias Cultura
30 dias MTA Angelus® 10 10 10 10
Biodentine® 10 10 10 10
Cimento Portland 10 10 10 10
Amostras mantidas em meio de cultura com
contaminação (controle positivo)
10 10 10 10
Amostras mantidas em meio de cultura sem
contaminação (esterilizado – controle negativo)
10 10 10 10
No grupo controle negativo (n=40), os espécimes foram mantidos em tubos
de ensaio com 5mL de infusão cérebro coração e sem o acréscimo do inóculo
bacteriano durante todo o período experimental, incubados a 37˚C por 48 horas. No
grupo controle positivo (n=40), os espécimes foram mantidos em tubos de ensaio com
5mL de infusão cérebro coração (BHI; Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) e com o
acréscimo de 0,1mL de inóculo bacteriano durante todo o período experimental,
incubados a 37˚C por 48 horas. Toda a técnica foi cuidadosamente desenvolvida
seguindo rigorosamente os princípios assépticos.
Nos períodos de 7 e 30 dias de contaminação, o material avaliado foi removido
das cavidades com o emprego de espátula flexível Hollenback (Duflex - SS White, Rio
de Janeiro, RJ, Brasil) e condensador vertical tipo Paiva (Duflex - SS White, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil), e individualmente imersos em 7mL de Letheen Broth (LB; Difco
Laboratories), seguido pela incubação a 37˚C por 48 horas. Como foi observada
alteração da coloração do meio de cultura em função da liberação de bismuto,
presente no MTA, após este período foi removida uma amostra de 0,1mL do meios de
cultura que continham os materiais avaliados e transferidos individualmente para 5mL
de infusão cérebro coração, seguido de novo período de incubação a 37˚C por 48
horas. Após 48 horas foi realizada a avaliação visual e avaliação da densidade ótica
34
de cada amostra coletada por meio do espectrofotômetro UV (Spectrophotometer
Model Nova 1600 UV, Piracicaba, SP, Brasil) ajustado em comprimento de onda de
λ=600 nm (nanômetros), correspondente à absorbância de 0,137 nm.
Para avaliação em microscopia eletrônica de varredura, os espécimes foram
fixados em solução tamponada de formalina por uma semana e posteriormente
desidratadas em álcool 70%, 96%, e 99%, em imersões de 30 minutos em cada, em
ordem crescente de concentração, sendo que a solução foi renovada a cada 10 min.
As amostras foram analisadas no Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta
Resolução (LabMic) da Universidade Federal de Goiás. As amostras foram
codificadas e fixadas em fita adesiva de carbono sobre porta amostras de alumínio e
recobertas com ouro. As fotomicrografias foram obtidas no microscópio eletrônico de
varredura - MEV (JSM-IT300, JEOL Ltda., Fukuoka, Japão) para as análises. A área
total do material estudado de cada espécime foi dividida em quatro quadrantes. As
áreas A, B, C e D foram analisadas com aumento de 50x, 1500x e 5000x para detectar
a presença ou ausência de contaminação usando os seguintes scores: 1 - todas as
áreas da superfície do material sem a presença do E. faecalis colonizando a superfície
(4 quadrantes); 2 – Apenas 1 quadrante coberto por E. faecalis na superfície do
material; 3 – 02 quadrantes coberto por E. faecalis colonizando a superfície do
material; 4 – 03 quadrantes coberto por E. faecalis colonizando a superfície do
material; 5 – todas as áreas cobertas por E. faecalis (4 quadrantes) (Tabela 3).
35
Tabela 3. Distribuição de scores de acordo com a presença de contaminação sobre a superfície dos materiais biocerâmicos empregados.
CATEGORIAS DESCRIÇÃO
Score 1 Todas as áreas da superfície do material isentas de
contaminação (4 quadrantes)
Score 2 O equivalente a 1 quadrante coberto por E. faecalis colonizando
a superfície do material
Score 3 O equivalente a 2 quadrantes coberto por E. faecalis
colonizando a superfície do material
Score 4 O equivalente a 3 quadrantes coberto por E. faecalis
colonizando a superfície do material
Score 5 Todas as áreas cobertas por E. faecalis (4 quadrantes)
Fonte: (OLIVEIRA et al. 2013; RENOVATO, 2018).
5.1. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores foram tabulados em uma planilha do Microsoft Office Excel
(Microsoft Corporation, Redmond, WA) para análise estatística. Os dados foram
descritos como mediana, valores mínimos e máximos e comparados pela ANOVA e
teste Tukey, com nível de significância estabelecido em 5%.
36
6. RESULTADOS
Em cada grupo, para a comparação da contaminação da superfície foi
empregada a análise de variância e o teste de Tukey.
Os resultados da contaminação da superfície de cimentos biocerâmicos por
Enterococcus faecalis são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Análise estatística da contaminação da superfície de cimentos biocerâmicos em 7 dias e 30 dias na avaliação por densidade óptica.
GRUPOS PERÍODO DE AVALIAÇÃO
VALOR DE p 7 dias 30 dias
MTA Angelus® 1,11 ± 0,18C.a 1,12 ± 0,10CD.a >0,05
Biodentine® 1,05 ± 0,05BC.a 1,06 ± 0,10C.a >0,05
Cimento Portland 1,12 ± 0,08C.a 1,16 ± 0,08D.a >0,05
Controle positivo 0,99 ± 0,05B.a 0,67 ± 0,08B.b <0,05
Controle negativo 0,00 ± 0,00A.a 0,00 ± 0,00A.a >0,05
Valor de p <0,05 <0,05
Teste ANOVA com post- hoc de comparações múltiplas com significância de 5%. Letras maiúsculas diferentes identificam diferenças entre as linhas. Letras minúsculas diferentes identificam diferenças nas colunas.
A Tabela 5 apresenta o resultado da análise das imagens de microscopia
eletrônica de varredura sobre a contaminação da superfície de cimentos biocerâmicos
por Enterococcus faecalis.
37
Tabela 5. Frequência dos scores nos grupos.
GRUPOS
PERÍODO DE AVALIAÇÃO
SCORE 7 dias
(n=10)
30 dias
(n=10)
MTA Angelus® 10 10 5
Biodentine® 10 10 5
Cimento Portland 10 10 5
Controle positivo 10 10 5
Controle negativo 10 10 1
Após a exposição dos materiais e análise em MEV, observou-se que todas as
amostras (100%) de todos os materiais avaliados apresentaram score 5, que
evidencia que houve presença de contaminação microbiana em todas as superfícies
do material avaliado, com exceção do controle negativo, que não apresentou qualquer
contaminação (Figura 3).
Figura 3. Contaminação bacteriana na superfície dos materiais avaliados.
38
7. DISCUSSÃO A presença de Enterococcus faecalis foi detecdata nos materiais avaliados
(MTA Angelus®, Biodentine® e cimento Portland) tanto pela análise da densidade
ópticas de culturas de 07 e 30 dias, quanto pela análise das superfícies determinadas
pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura. A seleção dos materiais empregados neste estudo foi realizada considerando
estudos prévios (CAMILLERI, 2010a; CUTAJAR et al., 2011; CANDEIRO et al, 2012;
LIU, WANG e DONG, 2015; WANG, 2015; DUARTE et al., 2018; ESTRELA et al.,
2018; COSTA et al., 2018) que sugeriram estes materiais com características
biológicas apropriadas para o selamento de perfurações radiculares, materiais retro-
obturadores, pulpotomias, selamentos endodônticos, além de outras. O modelo de confecção de cavidades em dentina foi empregado previamente
para a avaliação de materiais odontológicos (HUFFMAN et al., 2009; NAGAS et al.,
2014; SILVA, 2019). Os períodos selecionados para este estudo levam em
consideração a possibilidade de estabelecimento de um biofilme bacteriano jovem e
maduro sobre os materiais biocerâmicos avaliados. Desta maneira, nestes períodos
foi possível verificar que os materiais empregados não conseguiram impedir a
colonização bacteriana por meio de um efeito antibacteriano. Porém, foi possível
verificar a presença deste indicador microbiano na superfície destes materiais tanto
no método por meio de cultura microbiológica, quanto na observação da presença do
E. Faecalis nas superfícies observadas nas imagens de microscopia eletrônica de
varredura. A microscopia eletrônica de varredura tem sido utilizada em estudos
prévios para a caracterização da superfície de materiais odontológicos (FORMOSA et
al., 2012). O microrganismo E. Faecalis foi selecionado para este estudo em função de
ser um patógeno endodôntico e estar associada a casos resistentes ao tratamento
endodôntico (SUNDQVIST et al., 1998; LOVE, 2001; ASGARY et al., 2007). Este
microrganismo é mais encontrado em casos de fracasso do tratamento endodôntico
(SIREN et al., 1997; SUNDQVIST et al., 1998; MOLANDER et al., 1998; ROÇAS et
al., 2004).
39
A análise de contaminação bacteriana pode ser verificada por várias
metodologias, dentre as quais o teste de difusão em ágar, teste de contato direto,
concentração inibitória mínima, formação de biofilme bacteriano (ESTRELA et al.,
1999; 2000b; 2009). O teste de difusão em ágar apesar de amplamente utilizado, não
estabelece parâmetros confiáveis para a comparação de substâncias com diferentes
características químicas, com, por exemplo, a capacidade de dissociação e de difusão
(PUMAROLA et al.,1992; WEISS et al., 1996; ESTRELA et al., 1999). Fuss et al.
(1997) relataram que a atividade antimicrobiana de um material pode ainda variar, de
acordo com o intervalo de tempo entre a mistura e o teste, sugerindo diferentes
propriedades físico-químicas. Desta forma, ao se avaliar o efeito antimicrobiano de
diferentes substâncias deve-se atentar à metodologia empregada para evitar o viés
de resultados. A atividade antimicrobiana de materiais obturadores do sistema de canais
radiculares em diferentes condições clínicas tem sido verificada em vários estudos
(TORABINEJAD et al., 1995; LOVE, 2001; MCHUGH et al. 2004). Estas análises têm
sido elaboradas por maio de uma grande variedade de testes microbiológicos.
Torabinejad et al. (1995) demonstraram efeito antimicrobiano de alguns materiais,
dentre os quais o MTA. De acordo com estes autores, esta ação antimicrobiana foi
alcançada em função da elevação do pH do meio pelo MTA e, como é conhecido, pH
acima de 12 pode exercer efeito sobre diferentes microrganismos, mesmo sobre o E.
faecalis, uma bactéria resistente (LOVE, 2001; MCHUGH et al., 2004). Resultados
semelhantes foram corroborados através de outros estudos (TANOMARU-FILHO et
al., 2007).
Estrela et al. (2000a) avaliaram o efeito antimicrobiano de diferentes materiais
endodônticos: MTA, cimento Portland, hidróxido de cálcio, Sealapex e Dycal, sobre
diferentes microrganismos encontrados no canal radicular e cavidade bucal. Os
resultados mostraram que para todos os microrganismos estudados o hidróxido de
cálcio apresentou ação antimicrobiana superior ao MTA, Cimento Portland, Sealapex
e Dycal. Estes resultados não condizem com os achados deste estudo em função da
diferença do teste microbiano utilizado. Neste estudo foi observado se ocorreria o
crescimento bacteriano na superfície do material, isto é, a formação de biofilme.
Sipert et al. (2005) verificaram que o MTA e cimento Portland apresentaram
piores efeitos antimicrobianos que o Sealapex e FillCanal. Zhang, Pappen e
40
Haapasalo (2009) estudaram a eficácia antimicrobiana de bioagregado (BA) e
agregado de trióxido mineral (MTA) sobre Enterococcus faecalis e verificaram que
houve redução da viabilidade bacteriana, mas não a completa eliminação dos
microrganismos, como verificado neste estudo.
Kim et al. (2015) avaliaram a ação antibacteriana do MTA Angelus®, Endocem
MTA e ProRoot MTA sobre bactérias da cavidade bucal e observaram que o MTA
Angelus® e Endocem MTA foram mais eficazes. Singh et al. (2016) compararam a
atividade antibacteriana do EndoSequence BC Sealer, um biocerâmico; do cimento
resinoso MM Sealer; do Endoseal, um cimento à base de óxido de zinco e eugenol;
do ProRoot White MTA e MM MTA sobre o E. faecalis. Os autores verificaram que a
atividade antibacteriana foi similar para todos os materiais avaliados. Como
anteriormente citado, neste estudo foi observado o crescimento microbiano na
superfície do material, ou seja, a formação de biofilme bacteriano. Isto diferencia os
resultados deste estudo com outros que empegaram técnicas para avaliação da ação
antimicrobiana distintos.
Sampaio (2016) analisou a superfície e avaliar a composição química de
materiais obturadores do canal radicular por meio de microscopia eletrônica de
varredura (MEV) e espectroscopia de dispersão de raios-X (EDX). Os cimentos
apresentaram diferentes regularidades em imagens por MEV, fato pode corroborar
para a agregação de microrganismo na superfície dos materiais, conforme os
resultados encontrados neste estudo. Por outro lado, Siqueira (2017) estudaram as
características de superfície de alguns cimentos biocerâmicos: Biodentine®, Bio-C
Fillapex®, Cimento biocerâmico MK Life, MTA Angelus® e Cimento Portland® e
concluíram que as superfícies de todos os cimentos avaliados mostraram partículas
com padrão de distribuição uniforme.
Considerando todo o exposto anteriormente, cabe ressaltar a necessidade de
mais estudos a respeito dos materiais disponíveis como seladores do sistema de
canais radiculares com vistas a se obter um cimento endodôntico ideal, com
propriedades físicas, químicas, biológicas e microbiológicas que atuem sobre a
microbiota do canal radicular favoreçam o reparo tecidual.
41
8. CONCLUSÃO
De acordo com a metodologia utilizada, pode-se concluir que:
1. Houve o crescimento bacteriano na superfície de todos os materiais
biocerâmicos testados nos diferentes períodos avaliados (7 e 30 dias)
utilizando o método de cultura microbiológica;
2. A análise das superfícies de todos os materiais biocerâmicos testados por meio
de imagens de microscopia eletrônica de varredura demonstrou a presença de
E. faecalis em todos os quadrantes analizados.
42
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