Análise das alterações metabólicas de Canavalia ensiformis ... · DNS Ácido 3,5-dinitrossalicílico DTT Ditiotreitol ELISA Enzime Linked Imuno Assay EPACE-10 Genótipo de Vigna

Análise das alterações metabólicas de

Canavalia ensiformis durante germinação e

desenvolvimento pós-germinativo em resposta a

insulina e compostos relacionados

Simone Cayres de Souza

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF

Campos dos Goytacazes - RJ

Março - 2010

II






Orientadora: Dra. Antônia Elenir Amâncio Oliveira

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Química e Função de Proteínas e

Peptídeos do Centro de Biociências e Biotecnologia (LQFPP/CBB) - UENF, com

financiamento da FAPERJ.

Campos dos Goytacazes - RJ

Março - 2010

Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,

como parte das exigências para obtenção do

Grau de Mestre em Biociências e Biotecnologia

com ênfase em Biologia Celular.

III






Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do

Grau de Mestre em Biociências e Biotecnologia com ênfase em Biologia Celular.

Aprovada em 11 de março de 2010

Comissão Examinadora:

_____________________________________________________ Dra. Valdirene Moreira Gomes (LFBM/CBB/UENF)

_____________________________________________________ Dra. Maura Da Cunha (LBCT/CBB/UENF)

________________________________________________

Dr. Marco Antônio Lopes Cruz (UFRJ)

_______________________________________________________________ Orientadora: Dra. Antônia Elenir Amâncio Oliveira (LQFPP/CBB/UENF)

IV

A Deus eterno, imortal, invisível, mas real,

Que “com sabedoria fundou a Terra,

E com inteligência preparou os céus”.

(Provérbios 3:19).

À minha amada família,

Por grande amor e cuidado.

A Felipe R. P. Salim,

Por todo companheirismo e amor.

“Ó profundidade das riquezas, tanto da sabedoria

como da ciência de Deus!

Quão insondáveis são os seus juízos,

e quão inescrutáveis os seus caminhos!

Quem compreendeu a mente do Senhor?

Ou quem foi o seu conselheiro?

Ou quem lhe deu primeiro a Ele, para que lhe seja recompensado?

Porque Dele (Jesus) e por Ele e para Ele são todas as coisas.

Glória, pois, a Ele eternamente. Amém.”

(Romanos 11:33-36)

V

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora, professora Elenir por toda amizade e atenção durante a

realização deste trabalho. Por acreditar que eu conseguiria chegar ao fim, apesar de

muitas circunstâncias dizerem que não. Obrigada por todos os ensinamentos

científicos e de vida, por ser um exemplo de orientadora, de ser humano.

Aos professores Dra Valdirene Moreira Gomes, Dra Maura Da Cunha e Dr. Marco

Antônio Lopes Cruz pela participação na banca examinadora.

Em especial à professora Dra Kátia V. Sales Fernandes pela gentileza da revisão

deste trabalho.

Ao Dr. Selwyn York por ter cedido o composto D-pinitol, tão importante para a

realização desse trabalho.

À FAPERJ pelo apoio financeiro.

Aos colegas do grupo Elane, Amanda, Mariana, Tierry, Diego, e Daniel pelo convívio

tão agradável e por todos os ensinamentos compartilhados.

Especialmente a Elane, Amandinha e Mariana, não só por dividirem o ambiente

científico, mas suas vidas. Obrigada pela amizade tão especial de vocês.

Aos colegas do LQFPP Nathália Lima, Lucilene, Nathália Deus, Gustavo, Nádia e

Flávia pela agradável convivência.

Aos funcionários Cristóvão, Rogério e Dona Isabela por contribuírem para o bom

andamento deste trabalho.

Às amigas Juliana Barreto, Antônia, Raquel, Andréia, Eliliane (Lili), Elisângela,

Clarissa, Keity, Caroline, Juliana Sobreira, Barbara, Marianna, Marília e Luciane.

VI

Obrigada pela amizade e companheirismo que nasceram durante estes anos, desde

a graduação. Sentirei muitas saudades.

A todos que participaram de alguma maneira para realização deste trabalho.

VII

ÍNDICE pág.

LISTA DE FIGURAS................................... ............................................................... X

LISTA DE ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES ................. ...................................... XIIII

RESUMO ................................................................................................................XIV

ABSTRACT ........................................... ..................................................................XV

1 - INTRODUÇÃO.......................................................................................................1

1.1 - Sementes ........................................................................................................1

1.2 - Germinação e desenvolvimento pós-germinativo............................................1

1.2.1 - Emergência da radícula e o término da germinação.................................4

1.2.2 - Mobilização e degradação de reservas durante a germinação e o

desenvolvimento pós-germinativo........................................................................5

1.2.2.1 - Mobilização de proteínas....................................................................6

1.2.2.2 - Mobilização de polissacarídeos..........................................................7

1.3 - Insulina e suas vias de sinalização .................................................................9

1.3.1 - Compostos relacionados à insulina em plantas ......................................12

1.3.1.1 - Moléculas do tipo insulina.................................................................12

1.3.1.2 - D-pinitol ............................................................................................13

1.3.1.3 - Vanadil sulfato ..................................................................................17

1.4 - Canavalia ensiformis .....................................................................................19

2 - OBJETIVOS...................................... ...................................................................22

2.1 - Objetivo geral ................................................................................................22

2.2 - Objetivos específicos....................................................................................22

3 - MATERIAIS E MÉTODOS............................ .......................................................23

3.1 - Material botânico ...........................................................................................23

3.2 - Experimentos de germinação ........................................................................23

VIII

3.3 - Extração e dosagem de proteínas totais solúveis..........................................24

3.4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)

................................................................................................................................24

3.5 - Western blotting.............................................................................................25

3.6 - Dosagem de vicilinas e detecção de proteínas MAPK pelo método de ELISA

...............................................................................................................................26

3.7 - Determinação da atividade de proteinases do tipo cisteínicas do tipo papaína

...............................................................................................................................27

3.8 - Determinação da atividade de α-amilases.....................................................28

3.8.1 - Ensaio da atividade de α-amilases pelo método de DNS........................28

3.8.2 - Ensaio da atividade de α-amilases em PAGE-nativo..............................30

3.9 - Dosagem de D-pinitol, sacarose, rafinose e myo-inositol por Cromatografia

Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-MS) .....................................30

3.10 - Análise estastística .....................................................................................31

4 - RESULTADOS ..................................... ...............................................................32

4.1 - Perfil de embebição de sementes de Canavalia ensiformis: Influência de

insulina e compostos relacionados sobre o ganho de massa de cotilédones........32

4.2 - Teores de proteínas totais solúveis de cotilédones: Influência de insulina e

compostos relacionados ........................................................................................34

4.3 - Visualização do perfil protéico por SDS-PAGE e detecção de vicilinas por

Western blotting em cotilédones germinados em ausência e presença de insulina e

compostos relacionados ........................................................................................36

4.4 - Dosagem de proteínas imunorrelacionadas à vicilina em cotilédones

germinados em ausência e presença de insulina e compostos relacionados .......39

4.5 - Perfil de atividade de proteinases cisteínicas em cotilédones germinantes de

C. ensiformis: Influência de insulina e compostos relacionados............................41

IX

4.6 - Perfil de atividade de α-amilases de cotilédones germinantes de

C. ensiformis: Influência de insulina e compostos relacionados ................43

4.7 - Detecção de proteínas imunorrelacionadas à MAP quinase (MAPK) em

cotilédones germinantes de C. ensiformis: Influência de insulina e compostos

relacionados ..........................................................................................................46

4.8 - Dosagem de D-pinitol em cotilédones durante a germinação .......................48

4.9 - Detecção de myo-inositol, sacarose e rafinose em cotilédones durante a

germinação............................................................................................................50

5 - DISCUSSÃO........................................................................................................52

6 - CONCLUSÕES....................................................................................................61

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................... ...............................................63

X

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1

Conversão bioquímica de myo-inositol para D-pinitol................................................15

FIGURA 2

Vias propostas para síntese de ciclitóis, ciclitóis galactosídeos e RFO (α-

galactosídeos de sacarose).......................................................................................16

FIGURA 3

Canavalia ensiformis......................................... ........................................................19

FIGURAS 4A e 4B

Flores e vagem imatura de C. ensiformis .................................................................20

FIGURAS 5A e 5B

Vagem e sementes maduras de C. ensiformis.........................................................21

FIGURAS 6A, 6B e 6C

Teores de massa fresca e seca (gramas) de sementes de C. ensiformis germinadas

na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil

sulfato (1,809 µM) ou em água (experimento controle) em intervalos de 0

(quiescente) a 72 horas de embebição......................................................................33

FIGURAS 7A, 7B e 7C

Concentração de proteínas totais solúveis por mg de tecido (massa seca) de

cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina

(0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água

(controle) por até 72 horas de embebição.................................................................35

FIGURAS 8A e 8B

Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B),

de cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina

(0,36 µg/mL), D-pinitol (1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle)

por até 30 horas de embebição e semente quiescente ............................................37

XI

FIGURAS 9A e 9B

Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B),

de cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina

(0,36 µg/mL), D-pinitol (1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) de

42 por até 66 horas de embebição e semente quiescente .......................................38

FIGURAS 10A, 10B e 10C

Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à vicilina por mg de tecido (matéria

seca) de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A)

insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou

água (controle) por até 72 horas de embebição e quiescente...................................40

FIGURAS 11A , 11B e 11C

Atividade de proteinases cisteínicas em cotilédones de plântulas de C. ensiformis

germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C)

vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição.........42


Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de C. ensiformis

germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C)

vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição.........44

FIGURAS 13A e 13B

Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de C. ensiformis

germinadas na presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) durante as primeiras horas de

embebição. (A) Visualização zimográfica das bandas de α-amilase de cotilédones

embebidos por 6 a 24 horas e semente quiescente. (B) Análise da intensidade da

atividade das bandas pelo programa Image J...........................................................45

XII


Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à MAPK por mg de tecido (matéria

seca) de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A)

insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou

água (controle) por até 72 horas de embebição e quiescente...................................47

FIGURAS 15A e 5B

Quantificação de D-pinitol em cotilédones de sementes de C. ensiformis

quiescentes ou durante a germinação em água ou na presença de D-pinitol (1,44

µg/mL) por 24, 48 e 72 horas. As dosagens foram feitas por cromatografia gasosa

acoplada a espectrômetro de massas (CG-MS) ......................................................49

FIGURAS 16A, 16B e 16C

Detecção de myo-inositol (A), rafinose (B) e sacarose (C) em cotilédones de

sementes de C. ensiformis quiescentes ou durante a germinação em água ou na

presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) por 24, 48 e 72 h. As detecções foram feitas por

cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG-MS) ...................51

XIII

LISTA DE ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES Abs 440 nm Absorbância em comprimento de onda de 440 nm

Abs 492 nm Absorbância em comprimento de onda de 492 nm

Abs 540 nm

CG-MS

Absorbância em comprimento de onda de 540 nm

Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de

massas

DAB Diaminobenzeno

DNS Ácido 3,5-dinitrossalicílico

DTT Ditiotreitol

ELISA Enzime Linked Imuno Assay

EPACE-10 Genótipo de Vigna unguiculata

HCl Ácido Clorídico

H2O2 Peróxido de hidrogênio

IgG

MAPK

MPK4

Imunoglobulina G

Proteína-quinase ativada por mitógenos

Gene que codifica para MAPK4

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

OPD Orto-fenil-diamina

PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

PBS Tampão fosfato salino

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

TCA Ácido tricloroacético

TEMED N’Tetrametiletilenodiamina

TRIS

Tris-hidroximetilaminometano

XIV

RESUMO

A insulina é um hormônio peptídico que ativa diversos processos metabólicos

e crescimento celular. Este hormônio e compostos relacionados foram capazes de

influenciar a germinação e o desenvolvimento pós-germinativo de Canavalia

ensiformis. O objetivo desse trabalho foi, com base nas observações, verificar a

hipótese das moléculas insulina, D-pinitol e vanadil sulfato estarem envolvidas na

regulação de vias metabólicas de plantas. Sementes de C. ensiformis foram

germinadas em presença de soluções contendo insulina bovina, D-pinitol, vanadil

sulfato ou água (controle), em estufa incubadora sob ciclos de luz/escuro. Em

intervalos de 6h, até 72h, cotilédones foram separados, liofilizados e macerados. Os

resultados mostraram que cotilédones de C. ensiformis, embebidos por até 72h, não

apresentaram diminuições significativas de proteínas totais ou vicilinas, indicando

que nesse intervalo não houve mobilização dessas moléculas. Os tratamentos com

insulina, D-pinitol e vanadil sulfato acarretaram um aumento nas concentrações de

proteínas totais solúveis. A atividade de proteinases cisteínicas foi detectada em

sementes quiescentes e aumentou com a embebição durante a germinação, e os

tratamentos com insulina e D-pinitol promoveram aumentos nessa atividade. A

atividade da enzima α-amilase em cotilédones de C. ensiformis aumentou nas

primeiras horas de embebição e se manteve constante até 72h, e foi elevada em

cotilédones tratados com D-pinitol em quase todos os intervalos de tempo

estudados. Proteínas imunorrelacionadas a MAPK foram detectadas nos

cotilédones, e seus níveis foram diminuídos pelos tratamentos com insulina, D-pinitol

e vanadil sulfato. D-pinitol endógeno foi detectado em todas as amostras, e seus

níveis aumentaram em cotilédones embebidos por 48 e 72h. Os níveis de myo-

inositol foram maiores em cotilédones embebidos com D-pinitol por 24 e 48h. As

concentrações de rafinose diminuíram significativamente ao longo da germinação. O

tratamento com D-pinitol promoveu um aumento de rafinose nos cotilédones após

48h de embebição, porém as concentrações de sacarose não variaram

significativamente durante a germinação e nem entre os tratamentos. Esses dados

sugerem que insulina e compostos relacionados interferem no desenvolvimento de

plântulas de Canavalia ensiformis.

XV

ABSTRACT

Insulin is a peptide hormone that activates several metabolic processes and

cell growth. This hormone and related compounds were able to influence the

germination and the post-germination of Canavalia ensiformis. The objective of this

study, based on such observations, was to verify the hypothesis of the possible

involvement of the molecules insulin, D-pinitol and vanadyl sulfate in the regulation of

metabolic pathways of plants. Seeds of C. ensiformis were germinated in the

presence of solutions containing bovine insulin, D-pinitol, vanadyl sulfate or water

(control), inside a germination chamber under a light / dark photoperiod. At every 6

hours, during 72 hours, cotyledons were separated, dried and ground. The results

showed that cotyledons of C. ensiformis, imbibed for up to 72h did not show

significant decreases in the amounts of total proteins and vicilins, indicating that

during this interval there was no mobilization of such molecules. Treatments with

insulin, D-pinitol and vanadyl sulfate led to an increase in the concentrations of total

soluble proteins. The activity of cysteine proteinases was detected in quiescent

seeds and it increased with imbibition time, and treatments with insulin and D-pinitol

promoted increases in these activities. The activity of the α-amylase enzyme in

cotyledons of C. ensiformis increased after the first hours of imbibition, remained

constant until 72 hours, and was enlarged in cotyledons treated with D-pinitol in

almost all studied time intervals. Immunorelated MAPK proteins were detected in the

cotyledons, and their levels were decreased by treatment with insulin, D-pinitol and

vanadyl sulfate. D-pinitol endogenous was detected in all samples, and its level

increased in cotyledons imbibed for 48 and 72h. The amounts of myo-inositol were

higher in cotyledons imbibed with D-pinitol for 24 and 48h. Raffinose concentrations

decreased significantly during germination. Treatment with D-pinitol promoted an

increase in raffinose in the cotyledons after 48 hours of soaking, but the

concentrations of sucrose did not vary significantly during germination and not

between treatments. These data suggest that insulin and related compounds

interfere with the development of Canavalia ensiformis seedlings.

Introdução

Souza, S. C. (2010) 1

1 - INTRODUÇÃO

1.1 - Sementes

A semente é um dos órgãos reprodutores das plantas responsável pela

perpetuação da espécie e carrega por isso toda a informação genética necessária

para a formação de um novo indivíduo. Um dos principais fatores para o sucesso das

sementes no ambiente, é a presença de reservas nutritivas (para a maioria das

sementes), as quais são responsáveis por sustentarem uma planta jovem (plântula)

nos seus primeiros estágios de desenvolvimento, até que esta seja capaz de tornar-

se auto-sustentável, utilizando a luz solar para realização da fotossíntese (Bewley,

1997).

As sementes são formadas basicamente por três tecidos: o eixo embrionário, o

tegumento e o tecido de reserva. O eixo embrionário ou tecido meristemático

promove o desenvolvimento dos eixos no sentido da raiz e do caule. O tegumento,

comumente chamado de testa, corresponde ao tecido de revestimento cuja função

primordial é a de proteger o embrião em relação ao seu ambiente externo. E o tecido

de reserva, que pode ser representado pelo endosperma, pelo (s) cotilédone (s) e

em alguns casos pelo perisperma, é caracterizado por ser especialmente rico em

três grupos de macromoléculas: proteínas, lipídeos e carboidratos (citado em

Oliveira, 2001).

O conhecimento da composição química das sementes é relevante por vários

motivos, dentre os quais podemos citar a importância nutricional para animais e

humanos e como matéria-prima para a farmacologia e medicina (Carvalho &

Nakagawa, 2000). Porém, enquanto muitas espécies de sementes são

extensivamente estudadas dadas à importância de suas reservas, outras o são para

aumentar o conhecimento da fisiologia de sua germinação e desenvolvimento

(Ferreira & Borghetti, 2004).

1.2 - Germinação e desenvolvimento pós-germinativo de plântulas

Embora muito do interesse humano por sementes esteja associado, do ponto

de vista nutricional, à sua composição, a finalidade biológica de uma semente é

germinar e estabelecer uma nova planta (Ferreira & Borghetti, 2004).

Introdução

Souza, S. C. (2010) 2

A germinação das sementes começa com a captação de água por embebição

pela semente quiescente, seguida pela expansão do embrião. A captação de água é

trifásica com uma absorção rápida inicial (fase I, ou seja, embebição) seguido por

uma fase de estabilização (fase II). Um novo aumento na absorção de água (fase III)

ocorre quando o eixo do embrião alonga e rompe as camadas do tegumento para

completar a germinação. O alongamento celular é necessário e é geralmente aceito

como suficiente para o elongamento da radícula (germinação visível) (revisado por

Holdsworth et al., 2008).

Em 1997, Bewley resumiu o que ocorre após a embebição: a semente

quiescente rapidamente reassume seu metabolismo, e isto se deve ao fato das

estruturas e enzimas necessárias para essa retomada inicial de atividade já estarem

presentes dentro da semente, exceto os polissomos. No início do processo de

embebição o número de ribossomos livres diminui, pois eles passam a formar

complexos sintetizadores de proteínas, os polissomos, antes ausentes. A síntese

protéica inicial depende então de ribossomos pré-existentes. À medida que ocorre a

embebição e as células da semente tornam-se hidratadas, novos ribossomos são

sintetizados e usados para formar os polissomos, que por sua vez, passam a ser

responsáveis pela síntese protéica.

A retomada da atividade respiratória é um dos primeiros eventos após a

embebição, podendo ser detectada em poucos minutos, posteriormente inicia-se um

declínio nessa atividade até que a radícula penetre nas estruturas ao redor, quando

ocorre um novo aumento da atividade respiratória (Botha et al., 1992). A ativação da

via glicolítica, da via das pentoses fosfato, bem como a ativação das enzimas do

ciclo de Krebs ocorrem na primeira fase de absorção de água (Nicolas & Aldasoro,

1979; Salon et al., 1988). As mitocôndrias das células do embrião de sementes

quiescentes, embora sejam pobremente diferenciadas em conseqüência da

maturação e secagem, possuem enzimas do ciclo de Krebs e oxidases que

providenciam uma quantidade de ATP suficiente para sustentar o metabolismo por

várias horas após o início da embebição (Attucci et al., 1991).

O controle da germinação é um processo-modelo, chave para a compreensão

da integração da sinalização ambiental em plantas. Moléculas sinalizadoras

clássicas como auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico e, mais

recentemente brassinosteróides, têm sido amplamente estudadas no âmbito do seu

papel nos processos morfogenéticos vegetais. Nos últimos anos, tornou-se claro que

Introdução

Souza, S. C. (2010) 3

existem novas moléculas sinalizadoras, como N-aciletianolamidas, alcamidas,

glutamato e óxido nítrico, que podem desempenhar um papel importante na

regulação de processos de desenvolvimento, que vão desde a germinação das

sementes à modificação da arquitetura vegetal (revisado por López-Bucio et al.,

2006).

Outros estudos apresentaram uma visão integrada da evolução, genética

molecular, fisiologia, bioquímica, ecologia e modelagem de mecanismos de

dormência das sementes e controle da germinação. A dormência da semente é uma

propriedade inata da semente que define as condições ambientais em que a

semente é capaz de germinar. É determinada pela genética com uma influência

ambiental substancial que é mediada, pelo menos em parte, pelos fitormônios ácido

abscísico (ABA) e giberelina (GA) (revisado por Finch-Savage & Leubner-Metzger,

2006). Mais recentemente um modelo tem sido descrito para algumas conhecidas

características do equilíbrio hormonal. A particularidade central desse modelo é que

existe um complexo protéico heterodimérico que promove a germinação, e que a

abundância de um dos monômeros é influenciada por ABA e do outro por GA. Esse

complexo também regula o metabolismo de GA e ABA nas sementes, e isso cria um

“feedback” necessário para estabilizar os estados de dormência e germinação. Os

fatores mais importantes conhecidos por acionarem a sinalização em plantas

compreendem a qualidade da luz (sentida principalmente pelos fitocromos),

temperatura, disponibilidade de nutrientes e secagem pós-amadurecimento. Pós-

amadurecimento é o processo através do qual a dormência é perdida através do

aumento da duração de armazenamento de sementes em um estado de baixa

hidratação, através de um mecanismo que permanece ainda desconhecido. É

essencialmente uma resposta à desidratação que promove a germinação, logo que a

água esteja disponível (revisado por Penfield & King, 2009).

Vários estudos já evidenciaram a influência das condições ambientais nos

processos de dormência e germinação. Estes mostraram que o nitrato exógeno pode

afetar a exigência da luz para promover a germinação das sementes de Arabidopsis

thaliana, e que o nível inicial de dormência destas sementes é influenciado pelo

regime alimentar de nitrato da planta-mãe. Portanto, o nitrato afeta os requisitos para

a germinação e pode-se dizer que afeta diretamente a dormência em vez de apenas

promover a germinação. É amplamente aceito, também, que a temperatura regula

ambos, dormência e germinação e que a luz regula a germinação; no entanto, é uma

Introdução

Souza, S. C. (2010) 4

questão em discussão se a luz é também um regulador de dormência. A luz tem sido

considerada tanto por estimular a germinação como por quebrar a dormência

(revisado por Finch-Savage & Leubner-Metzger, 2006).

Estudos da expressão do genoma de sementes de A. thaliana também

forneceram informações importantes sobre novos mecanismos que controlam a

germinação e sugeriram novos caminhos para explorar. Há evidências de que as

alterações fisiológicas observadas durante a dormência e germinação são

submetidas a controle transcricional e pós-transcricional. Esses níveis de controle

são temporalmente coordenados e distribuídos a partir da maturação das sementes

através da dormência para a germinação. Parece que o controle em ambos os níveis

é essencial para a adaptação das sementes ao seu ambiente. Mudanças no

transcriptoma após a embebição pelas sementes sugeriram uma relação dinâmica

entre RNAs 'armazenados' nas sementes quiescentes, e síntese de novos RNAs

relacionados com estados de pós-embebição, germinação ou dormência de

sementes. Essas recentes abordagens pós-genômica sugerem que a tradução ou

pós-tradução do RNA são os principais níveis de controle para a realização da

germinação e que as mudanças no transcriptoma podem refletir alteração no status

de dormência ou aperfeiçoamento do vigor da germinação e efeitos sobre funções

pós-germinativas que se relacionam com o crescimento das plântulas (revisado de

Holdsworth et al., 2008).

1.2.1 - Emergência da radícula e o término da germi nação

A emergência e a extensão da radícula através das estruturas ao redor do

eixo embrião é o evento que caracteriza o término da germinação e marca o início do

desenvolvimento pós-germinativo, sendo que esta extensão pode ou não ser

acompanhada por divisões celulares (Osborne & Boubriak, 1994; Bewley, 1997).

Três possíveis mecanismos podem estar envolvidos no elongamento e no

crescimento da radícula. O primeiro deles está ligado aos eventos tardios da

germinação, e consiste no aumento do potencial osmótico das células radiculares

devido à acumulação de solutos, talvez como resultado da hidrólise de reservas

poliméricas presentes dentro das próprias células da radícula. A subsequente

diminuição do potencial osmótico leva ao aumento da tomada de água o que resulta

no aumento do turgor, levando a extensão celular. No entanto, não há evidências

Introdução

Souza, S. C. (2010) 5

consistentes para esta mudança no potencial osmótico durante a germinação. O

segundo mecanismo relaciona-se à flexibilidade da parede celular da radícula que

permite o seu crescimento, resultando no prolongamento da radícula. O

afrouxamento da parede celular pode ser resultado da clivagem e rearranjo de

moléculas de xiloglucanas, que são moléculas que mantêm microfibrilas de celulose

adjacentes ligadas, não permitindo sua separação, e com isso, a não expansão das

células da radícula. A enzima xiloglucano endotransglicosilase (XET) pode ser

responsável pelo afrouxamento da parede celular, pois é capaz de reverter a

clivagem de moléculas de xiloglucanas. O terceiro mecanismo baseia-se no

enfraquecimento dos tecidos da extremidade ao redor da radícula. A redução da

resistência destes tecidos é necessária para o término da germinação, e

provavelmente ocorre devido à ação de enzimas da parede celular, como hidrolases

(Bewley, 1997).

1.2.2 - Mobilização e degradação de reservas durant e a germinação e o

desenvolvimento pós-germinativo

Em sementes de leguminosas, a mais abundante reserva energética é

constituída de proteínas. A principal fase de mobilização das reservas das sementes

se inicia após o alongamento e emissão da radícula, sendo, portanto um evento pós-

germinativo. No entanto, a degradação dessas reservas se inicia nas primeiras horas

de embebição, antes da germinação estar completa (revisado por Lehmann &

Ratajczak, 2008). Concomitante com a degradação das reservas insolúveis de alto

peso molecular, ocorre a sua conversão a formas solúveis, que são rapidamente

transportadas aos tecidos em crescimento e utilizadas para diferentes propósitos,

tais como a geração de energia e a produção de matérias primas (proteínas, ácido

nucléicos, carboidratos e lipídeos) para a construção de novos tecidos e células

(Mayer & Poljakoff-Mayber, 1985, apud Dantas 2002). As modificações metabólicas

que ocorrem nesses estágios são resultados da atividade de várias enzimas (Bewley

& Black, 1994). Segundo Mayer & Poljakoff-Mayber (1985; apud Dantas, 2002), as

enzimas de degradação de reservas podem ou não estar presentes nas sementes

quiescentes. As enzimas pré-existentes são detectadas em baixa atividade nessas

sementes e, durante a embebição da semente, são ativadas e secretadas para as

células onde ocorrerá a degradação das reservas. Por outro lado, ainda durante a

Introdução

Souza, S. C. (2010) 6

embebição, acredita-se que seja induzida a síntese de novo de enzimas que não são

detectadas nas sementes quiescentes, a partir dos aminoácidos disponíveis (Varner

et al., 1965, apud Dantas, 2002).

1.2.2.1 - Mobilização de proteínas

As sementes das plantas superiores acumulam grandes quantidades de

proteínas de reserva durante o desenvolvimento e maturação, que são mobilizadas

para fornecer matéria-prima e energia necessárias para a germinação e crescimento

das plântulas. Em sementes de leguminosas, aminoácidos liberados durante a

mobilização de proteínas de reserva são parcialmente utilizados para a síntese de

proteínas no desenvolvimento do eixo (revisado por Bewley & Black, 1994; Lehmann

& Ratajczak, 2008). A maior parte das reservas protéicas em sementes consiste em

proteínas de reserva específicas (Shewry & Casey, 1999, apud Müntz et al., 2001),

como as globulinas, que predominam nas sementes de dicotiledôneas, ou as

prolaminas que são as principais proteínas de armazenamento em cereais. Há dois

tipos de globulinas nas sementes: as vicilinas e as leguminas com coeficientes de

sedimentação em ultracentrifugação de 7S e 11S, respectivamente (Miége, 1982).

As vicilinas (globulinas 7S) formam uma classe bem conhecida de proteínas de

reserva de sementes, e em feijão-de-corda constituem a maior parte das proteínas

presentes (Carasco et al., 1978; Khan et al., 1980). São moléculas oligoméricas,

classificadas como globulinas 7S de acordo com seu grau de sedimentação (Shutov

et al., 1995), apresentam uma composição de aminoácidos com altas concentrações

de ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, fenilalanina e leucina (Carasco et al.,

1978; Macedo et al, 1995). As vicilinas são solúveis em soluções salinas (Fernandes

& Xavier-Filho, 1998), não apresentam ligação dissulfeto em suas cadeias

polipeptídicas, apresentam grande heterogeneidade (Sales et al., 2000), massa

molecular em torno de 150 kDa e se agregam para formar trímeros de subunidades

com massas moleculares variando entre 45-70 kDa (Fernandes & Xavier-Filho,

1998). Estas proteínas de reserva parecem ser multifuncionais, atuando como uma

fonte de aminoácidos durante a germinação da planta e ao mesmo tempo podendo

participar dos mecanismos de defesa das sementes, sendo tóxicas a insetos e a

fungos fitopatogênicos (Shutov et al., 1995; Gomes et al., 1997; Sales et al., 2000).

O acúmulo de proteínas de reserva inicia-se durante os períodos medianos e tardios

Introdução

Souza, S. C. (2010) 7

dos estágios de maturação, quando o preenchimento da semente é responsável pelo

declínio dos níveis de nitrogênio da planta mãe (Müntz et al., 2001). Essas reservas

são depositadas em compartimentos membranosos denominados corpos protéicos

(CP), que são originados ou diretamente do retículo endoplasmático, como ocorre

em milho, ou de vacúolos armazenadores de proteínas, como ocorre na maioria das

espécies (Müntz, 1998). Durante esse período de deposição, a degradação e a

renovação protéicas são insignificantes, indicando que as proteínas estão protegidas

contra o ataque proteolítico prematuro (Madison et al., 1981). Proteínas são

armazenadas para posterior mobilização não só em tecidos de reserva específicos

como cotilédones e endosperma, mas também no eixo embrionário (Tiedemann et

al., 2000). A mobilização protéica nesses tecidos não é iniciada em todas as regiões

simultaneamente, pequenas quantidades dessas proteínas armazenadas são

mobilizadas em regiões limitadas durante a germinação (Smith, 1981 apud Müntz et

al., 2001).

Mudanças celulares que precedem e acompanham a proteólise têm sido

estudadas nos cotilédones de Vigna radiata, onde a principal proteína de reserva é a

vicilina, compreendendo mais de 70-80% do total, sendo a enzima responsável por

sua hidrólise uma endopeptidase cisteínica. O retículo endoplasmático (RE) é o sítio

de síntese desta enzima, e associado com esta síntese, o RE passa por várias

modificações. Cotilédones secos e recém embebidos contêm RE tubular, que é

desestruturado cerca de 12 a 14 horas após começar a embebição (Bewley & Black,

1994). Harris & Chrispeels (1975) demonstraram a atividade de uma endopeptidase

cisteínica nos cotilédones em germinação de sementes de Vigna radiata e em um

recente trabalho, Wang et al. (2007) relataram a síntese de novo de enzimas

hidrolíticas na mobilização protéica durante a germinação dessas sementes.

Para muitas sementes, a principal classe de globulinas degradadas é a das

vicilinas (globulinas 7S). Essa mobilização é provavelmente mediada por um

diferente complexo de proteinases cisteínicas (CPRs). Já foi anteriomente mostrado

que para sementes de Vicia sativa L., proteinases cisteínas do tipo papaína são as

principais responsáveis pela mobilização de proteínas do tipo globulinas (Schlereth

et al., 2000). Proteinases cisteínicas também foram identificadas em sementes de

Phaseolus vulgaris L. como responsáveis pela degradação das proteínas de reserva

do tipo globulinas 7S presentes no eixo embrionário e nos cotilédones dessas

sementes (Tiedemann et al., 2000).

Introdução

Souza, S. C. (2010) 8

1.2.2.2 - Mobilização de polissacarídeos

O amido é um glucano insolúvel composto de dois polímeros de glicose,

amilose e amilopectina. Como principal carboidrato de armazenamento, o amido

desempenha importante papel durante o ciclo de vida da planta. Em plantas

superiores, o amido é sintetizado nos plastídeos em ambas células fotossintética e

não fotossintética. Nos órgãos não fotossintéticos (por exemplo, caules, raízes,

tubérculos e sementes), a sacarose pode ser convertida em amido para

armazenamento a longo prazo, muitas vezes em níveis elevados, em plastídeos

especializados denominados amiloplastos. Este amido de armazenamento é

remobilizado para manter as fases de crescimento, como no estabelecimento das

plântulas após a germinação ou localmente, para atender a alta demanda de

carbono para processos específicos, como na secreção de néctar (revisado por

Zeeman et al., 2010).

Como o carboidrato de reserva mais abundante produzido em plantas, o

amido é considerado a mais importante fonte de energia na dieta humana (Tetlow,

2006). Como principal reserva polissacarídica de sementes, contribui, por exemplo,

com cerca de 60% da massa de algumas espécies sul-americanas de Araucária

(Cardemil & Varner, 1984). Em razão disso, sua mobilização tem sido avaliada em

diversas sementes, principalmente em cereais, onde o endosperma é composto por

dois tecidos distintos: o endosperma, principal tecido de reserva, constituído por

amido, e ao seu redor a camada de aleurona (Morrison et al., 1978 apud Mrva et al.,

2006). Destes, somente a camada de aleurona permanece no grão maduro

(Bradbury et al., 1956 apud Mrva et al., 2006).

A degradação enzimática do amido em plantas superiores é devida

principalmente à ação de fosforilases e amilases. As amilases têm sido

extensivamente estudadas e desde 1976 elas são descritas como responsáveis pela

decomposição química das reservas de polissacarídeos, particularmente em

sementes de lentilha (Tárrago & Nicolas, 1976). Após 40 anos desse relato já se

sabia que durante o processo germinativo, ou em resposta à giberelina (GA)

exógena, as enzimas do tipo α-amilase, principalmente, são sintetizadas e

secretadas para participarem da mobilização do amido presente no endosperma do

trigo (Mrva et al., 2006).

Introdução

Souza, S. C. (2010) 9

Estudos bioquímicos mais recentes estabeleceram a presença das enzimas α-

amilase (α-1,4-glucano glucanohidrolase; EC: 3.2.1.1), β-amilase (α-1,4-glucano

maltohidrolase; EC: 3.2.1.2), enzima desramificadora do amido (EC: 3.2.1.41) e α-

glucosidase (maltase; EC: 3.2.1.3) na degradação do amido no endosperma de

sementes. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre a importância de

cada uma dessas enzimas no processo de degradação. É geralmente aceito que a

α-amilase desempenha um papel central na degradação do amido do endosperma,

onde, após a germinação, há uma síntese maciça no aleurona e escutelo, seguido

por sua secreção no endosperma (revisado por Zeeman et al., 2010).

Para que o amido de reserva seja degradado e passível de utilização pelo

metabolismo, é necessário que os grânulos de amido sejam desmembrados em

estruturas menores, como a maltose e a glicose. Nesse processo, destacam-se as

enzimas α-amilase, β-amilase e amido fosforilase. Destas, somente a α-amilase é

capaz de atacar diretamente os grânulos de amido, o que a caracteriza como a

primeira enzima no processo de degradação do amido. A α-amilase é uma

endoenzima que hidrolisa aleatoriamente as ligações α-(1,4), ao longo dos polímeros

de amilose e amilopectina, liberando maltose e moléculas maiores contendo ligações

α-(1,6), as dextrinas. A β-amilase é uma exoglucanase que ataca somente os

terminais não-redutores dos constituintes do amido, liberando moléculas de maltose.

São capazes de hidrolisar completamente os polímeros ou fragmentos de amilose

(Ferreira & Borghetti, 2004). Foi visto, em sementes de ervilhas, que a partir da

quebra dessas ligações α-1,4, há liberação das unidades de glicose que serão

requeridas durante o processo germinativo (Zhu et al., 1998). Foi descrito ainda que

alguns cultivares de cevada originários do Tibet com quase completa ausência de β-

amilase no endosperma, apresentavam plântulas com crescimeto normal, apesar da

hidrólise das cadeias lineares ser catalisada primeiramente por essas enzimas. Além

do mais, maltose e oligossacarídeos curtos produzidos no endosperma são

degradadas a partir da glicose por α-glucosidase (maltase) e há evidências de que a

α-glucosidase também pode agir sinergicamente com a α-amilase na remoção da

glicose diretamente da superfície dos grânulos (revisado por Zeeman et al., 2010).

Introdução

Souza, S. C. (2010) 10

1.3 - Insulina e suas vias de sinalização

A insulina foi descoberta em 1921 por Frederick Banting e colaboradores

(Banting et al., 1922), como uma proteína secretada pelas ilhotas de Langerhans no

pâncreas, que restaurava a glicemia para níveis normais quando administrada a

cães pancreatectomizados. Este peptídeo de massa molecular de 5.700 Da formado

por duas cadeias (cadeias α e β com 21 e 30 resíduos de aminoácidos,

respectivamente) unidas entre si por duas pontes dissulfetos.

Em animais, a insulina exerce múltiplas ações sobre o metabolismo e

crescimento celular, que se iniciam sempre pela ligação da insulina com receptores

situados na membrana plasmática (Guyton & Hall, 2002). De maneira geral, a

insulina estimula processos endergônicos de síntese e armazenamento de reservas

energéticas isto é, promove a síntese de glicogênio, lipídeos e proteínas, possuindo

sua ação principalmente nos músculos, no tecido adiposo e no fígado (Sperelakis,

1994; Aires, 1999). A insulina partilha com os chamados fatores de crescimento

(IGF-I e II, dentre outros) a capacidade de aumentar a síntese de mRNA e a síntese

protéica, estimulando assim o crescimento celular (Guyton & Hall, 2002).

Todas as ações da insulina se iniciam pela sua ligação a um receptor

específico. O receptor da insulina humana, um receptor do tipo quinase, é uma

glicoproteína com quatro subunidades. Duas subunidades α idênticas (135 kDa) são

voltadas para o exterior da membrana, onde se localizam os sítios de

reconhecimento e ligação da insulina. Duas subunidades β (95 kDa) são de

localização trans-membranar, e parecem ser responsáveis pela transcrição dos

sinais que irão desencadear as ações hormonais. Uma conseqüência imediata da

formação do complexo entre a insulina e o receptor, que se comporta como uma

auto quinase tirosina específica, é a autofosforilação de resíduos de tirosina das

subunidades β. Esse parece ser o evento inicial que desencadeia as ações do

hormônio (Sperelakis, 1994).

Após a fosforilação do receptor de insulina, uma série de proteínas chamadas

substratos do receptor de insulina (IRS) também são fosforiladas e acredita-se que

essas fosforilações ativem diretamente a fosfoinositol quinase (PI3K) disparando a

produção de fosfoinositol tri-fosfatos (PI 3,4,5P3), os quais agem como segundos

mensageiros. Os PI (3,4,5) P3 funcionam ativando direta ou indiretamente enzimas

da classe das fosfoquinases (PKs) e proteíno-quinase dependente de

Introdução

Souza, S. C. (2010) 11

fosfatidilinositol (PDK). A ativação da fosfoquinase C (PKC) leva a um aumento da

captação de glicose pelas células por aumentar o número de transportadores GLUT4

ancorados nas membranas celulares. A PDK, por sua vez, ativa a fosfoquinase D

(PKD) também chamada de AKT que leva à regulação clássica do metabolismo

energético em direção ao aumento da síntese do glicogênio, proteínas e lipídeos

(revisado por Vanhaesebroeck & Alessi, 2000).

Outras duas grandes vias de sinalização desencadeadas por insulina e fatores

de crescimento como IGFs I e II também já são bem estudadas em animais. Na via

de ativação da PDK (AKT) ocorre o disparo da via TOR “Target Of Rapamycin” que

atua na regulação do crescimento celular devido a ativação do sistema traducional. A

ativação da via TOR inicia-se pela ligação da TOR-quinase a RAPTOR “Regulatory

Associated Protein of TOR” e é a formação desse complexo que é inibida pelo

antibiótico rapamicina. O próximo passo da via TOR é a ativação da proteína

ribossomal quinase S6 (S6K) que age ativando posteriomente a proteína ribossomal

S6, enzima chave na regulação da síntese protéica (revisado por Wang & Proud,

2006).

A via da MAP-quinase/MAPK (proteína-quinase ativada por mitógenos)

também tem sido estudada como alvo da insulina. Essa via é uma cascata linear que

envolve três proteínas quinases atuando consecutivamente em reações de

fosforilação. O último componente nesta série é MAP quinase (MAPK). Esta é

ativada pela fosforilação de resíduos de treonina e tirosina pela MAP quinase

quinase (MAPK quinase ou MAPKK ou MAP2K) que por sua vez é regulada pela

fosforilação de dois resíduos serina/treonina pela MAP quinase quinase quinase

(MAPKKK) (revisado por Pearson et al., 2001). Estas três quinases estão

funcionalmente ligadas (Samaj et al., 2004) e exercem um papel fundamental nos

mecanismos de transdução de sinal de muitos organismos eucarióticos diferentes,

incluindo leveduras, Dictyostelium, Drosofila, Caenorhabditis, e mamíferos. De fato, a

importância e complexidade destas vias de sinalização são mais bem estudadas em

leveduras e mamíferos (Schwartz & Madhani, 2004; Bardwell, 2005; Ikner &

Shinozaki, 2005). O sucesso da proliferação celular depende do bom funcionamento

das vias TOR e da MAPK.

Em plantas, diversas quinases têm sido identificadas e classificadas em

diferentes grupos, sendo que uma das maiores e mais importantes categorias é a

MAPK. Várias descobertas sobre as vias MAPK em plantas refletem a importância e

Introdução

Souza, S. C. (2010) 12

complexidade dos mecanismos de sinalização vegetal (Tena et al., 2001; Nakagami

et al., 2005).

Genes que codificam para as MAPKs foram identificados em Arabidopsis

thaliana (Asai et al., 2002) e três genes para MAPKs também foram identificadas em

arroz (OsMAPKs) (Yeh et al., 2007). Genes para MAPK fosfatases-MKPs

(reguladores negativos da MAPK) foram reportados em tabaco (NtMKP1), arroz

(OsMKP1) e Arabidopsis thaliana (AtMKP1) (Yamakawa et al., 2004; Lee et al.,

2008).

As MAPKs atualmente representam a mais abundante família de quinases

serina-treonina de plantas superiores. Os componentes da cascata MAPK estão

envolvidos em uma grande variedade de funções nas vias de transdução de sinais

em plantas tais como osmorregulação, sinalização hormonal incluindo proliferação

celular auxina-induzida ou processos etileno-responsivos, biossíntese da parede

celular, e crescimento e diferenciação celulares. É descrita a participação de MAPK

na divisão celular, na sinalização via hormônios auxina, ácido abscísico, ácido

giberélico, etileno e citocinina e também em respostas a estresses abióticos e

bióticos (revisado por Mishra et al., 2006).

1.3.1 - Compostos relacionados à insulina em planta s

1.3.1.1 - Moléculas do tipo insulina

Em plantas, a presença de insulina ainda não é amplamente aceita pela

sociedade cientifica, considerando que plantas realizam o transporte de sacarose e

não de glicose (Xavier-Filho et al., 2003). Porém, estudos de compostos vegetais

relacionados à insulina datam de quase 100 anos atrás. Pesquisadores envolvidos

na descoberta de insulina animal em 1921 (Banting et al., 1922), foram os primeiros

a indicar a presença de moléculas do tipo insulina em plantas. Trabalho realizado por

Collip (1923), estudando o efeito de extratos vegetais (folhas de cebola, cevada,

alface, trigo e feijão verde; raízes de cebola e cevada e caules de feijão verde) sobre

a glicemia em coelhos normais e cães sem pâncreas, observou que todos os

extratos promoviam a redução dos níveis de glicose do sangue de ambos os grupos

de animais. Outro pesquisador envolvido com a descoberta de insulina animal, Best,

observou que os níveis de glicose do sangue de cães diabéticos retornavam a níveis

Introdução

Souza, S. C. (2010) 13

normais após tratamento com extratos de beterraba (Best, 1924). Apesar da grande

importância dessas observações, os compostos presentes nesses extratos vegetais

não foram isolados ou caracterizados. Somente na década de 70 um peptídeo com

massa molecular de aproximadamente 6,0 kDa que reagia com anticorpos contra

insulina humana foi isolado de frutos e de sementes de Momordica charantia

(Khanna et al., 1976). Collier et al. (1987) relataram também o isolamento de

peptídeos de folhas de espinafre e plantas de Lemna gibba G3 que apresentaram

massas moleculares semelhantes aos da insulina, reagiram com anticorpos anti-

insulina suína e apresentaram a propriedade de ligação ao receptor de insulina

humana.

Trabalhos realizados pelo nosso grupo isolaram do tegumento de sementes

de Canavalia ensiformis, uma proteína de 6 kDa com seqüência de aminoácidos

homóloga à insulina bovina (Oliveira et al., 1999b). Experimentos de microscopia

mostraram que esse peptídeo está localizado na última camada de células do

tegumento dessas sementes (Oliveira et al., 2004). A presença de proteínas

homólogas à insulina também foi observada em vagens verdes de feijão-de-corda

Vigna unguiculata (Venâncio et al., 2003), e em folhas de Bauhinia variegata

(Azevedo et al., 2006).

Proteínas que reagiram com anticorpos anti-insulina humana também foram

observadas em folhas de Phaseolus vulgaris, das gimnospermas Cupressus

sempervirens, Pinus ponderosa, Cycas revolut, Cycadaceae zamia e Selaginella sp,

na parte aérea das pteridófitas Psilotaceae sp e Equisetoceae sp, na levedura

Saccharomyces cerevisiae, na alga Rhodophyta sp, na torta de filtro e caldo de cana

de Saccharum officinarum e em mais 27 espécies de dicotiledôneas (Silva et al.,

2002; Xavier-Filho et al., 2003).

Um polipeptídio com atividade hipoglicêmica também foi isolado de sementes

de Momordica charantia e com base na sua análise de aminoácidos mostrou-se

semelhante à insulina (Sheng et al., 2004).

1.3.1.2 - D-pinitol

O inositol é um poliálcool cíclico contendo um anel de seis átomos de carbono

e seis grupos OH (cicloexanopoliol), sendo um importante constituinte celular pois

está envolvido em diferentes processos bioquímicos. Em mamíferos o inositol existe

Introdução

Souza, S. C. (2010) 14

principalmente sob a forma de derivados fosforilados, participando na comunicação

celular como segundos mensageiros em vias de sinalização. Os inositóis podem ser

arranjados em nove estereoisômeros: scilo, myo, neo, epi, D e L quiro, cis, muco e

allo. Entre esses isômeros os myo-inositóis (myo-inositol - MI) são os mais

abundantes na natureza, sendo produzidos a partir da glicose (Almeida et al., 2003).

Os myo-inositóis (MI) e seus derivados são componentes importantes para o

crescimento e desenvolvimento das plantas. Além da reserva de fosfato os myo-

inositóis fosfatos estão envolvidos em muitos processos de rotas celulares como,

transdução e regulação de sinal, regulação da síntese de ATP, transporte e

estocagem de auxina, biossíntese de parede celular, endocitose e tráfico de

vesículas (Saiardi et al., 2004) e produção de moléculas relacionadas ao estresse

(Loewus & Murthy, 2000). Participam, ainda, do remodelamento da cromatina, reparo

e recombinação de DNA, expressão de genes e exportação de mRNA (Chun et al.,

2003).

A descoberta de que os MI funcionavam como fatores de crescimento para

certos microrganismos e como uma exigência para o desenvolvimento de certas

formas mutantes de levedura, motivou o interesse por novas características

bioquímicas e biológicas dessas moléculas. Logo tornou-se aparente que MI

possuíam um papel central no crescimento e desenvolvimento (Loewus & Loewus,

1983), especialmente para plantas, onde os MI estão associados à estrutura e

função de moléculas das quais eles fazem parte ou que os utilizam. Exemplos dessa

importância são os inositóis e seus ésteres de O-metil, como o D-pinitol, que atuam

na regulação osmótica de plantas constantemente expostas a condições de

estresse, como Mesembryanthemum crystallinum, também conhecida como planta

do gelo, sendo adaptada ao crescimento em altos níveis de sódio, sob seca e baixas

temperaturas (Yamada et al., 1995), e que chega a acumular D-pinitol, considerado

seu principal osmorregulador (Loewus & Murthy, 2000).

D-Pinitol (1D-3 O-metil-quiro-inositol) é um inositol formado diretamente pela

metilação de myo-inositol (Figura 1) e subseqüente epimerização de sequovitol ou D-

inositol e é um dos inositóis mais freqüentemente encontrados em tecidos vegetais

como sementes, raízes, folhas, etc. (Loewus & Murthy, 2000). Duas funções principais

têm sido propostas para a presença de myo-inositóis em plantas superiores (Bieleski,

1982; Drew 1983; Loescher, 1987). A primeira é como forma de transporte e

armazenamento de açúcares fotossinteticamente derivados e a segunda é o fato

Introdução

Souza, S. C. (2010) 15

desses compostos atuarem como solutos compatíveis com o ajuste osmótico em

tecidos de plantas em resposta a déficit de água ou alta salinidade (Loescher, 1987;

Bieleski et al., 1997). Dentro desta última função, o D-pinitol se destaca como

principal carboidrato envolvido nesse mecanismo de resposta em plantas (Bieleski,

1994a). Trabalhos mostraram que plantas que se desenvolveram em ambientes com

alta salinidade acumularam altos níveis de D-pinitol em suas folhas (Drew, 1983;

Bieleski, 1994b). O D-pinitol foi identificado como um significante componente no

“pool” de carboidratos totais em folhas e raízes de Limonium gmelini (Murakeozy et

al., 2002). Durante o desenvolvimento da soja, D-pinitol tem sido encontrado em

vários tecidos, incluindo folhas, pecíolos, raízes, caules e sementes que chegam a

conter até 0,9% (Kuo et al., 1997).

FIGURA 1 - Conversão bioquímica de myo-inositol para D-pinitol (Loewus & Murthy, 2000)

Em 2008, Obendorf e colaboradores demostraram como myo-inositóis, dentre

eles o D-pinitol, podem atuar na síntese de ciclitóis como sacarose, rafinose e

estaquiose a partir da glicose, em sementes de soja [Glycine max L. (Merrill)] (Figura

2). No esquema apresentado por eles glicose-6-P gera 1L-myo-inositol-1-P, através

da myo-inositol-fosfato sintase (MIPS), e na sequência, é formado myo-inositol pela

ação da myo-inositol-fosfato monofosfatase (IMP). Um dos produtos formados pela

degradação do myo-inositol através da myo-inositol 4-metiltransferase (IMT) é o D-

ononitol. D-pinitol é um produto obtido diretamente do D-ononitol através de um

mecanismo ainda desconhecido. Mas se sabe que estaquiose sintase (STS) pode

sintetizar galactopinitóis e ciceritol (di-galactosil pinitol A) com D-pinitol como

receptor de galactosil e galactinol como doador de galactose, e, possivelmente

Introdução

Souza, S. C. (2010) 16

também di-e tri-galactosídeos de myo-inositol (DGMI, TGMI), D-pinitol (ciceritol,

trigalactosilpinitol A) e D-chiro-inositol (fagopiritol B2, fagopiritol B3). Acredita-se que

essa enzima também esteja envolvida no metabolismo da sacarose, atuando após a

formação da rafinose (pela rafinose sintase - RFS) a partir da sacarose, na formação

de estaquiose, a partir de rafinose e de verbascose, a partir de estaquiose.

FIGURA 2 - Vias propostas para síntese de ciclitóis, ciclitóis galactosídeos e RFO (α-

galactosídeos de sacarose) (adaptado de Obendorf et al., 2008). Parenteses () com setas

indicam uma reação de catálise enzimática não identificada. Algumas reações podem ser

reversíveis. DP: grau de polimerização; DGMI, digalactosil myo-inositol; gol, galactinol; GolS,

galactinol sintase (EC 2.4.1.123); IMP, myo-inositol-fosfato monofosfatase (EC3.1.3.25); IMT,

myo-inositol 4-metiltransferase (EC 2.1.1.129); MIPS, myo-inositol-fosfato sintase (EC

5.5.1.4); myo, myo-inositol; RFS, rafinose sintase (EC 2.4.1.82); STS, estaquiose sintase

(EC 2.4.1.67); TGMI, trigalactosil myo-inositol; UDP, uridina difosfato; UDP-gal, uridina

difosfato galactosideo;VBS, verbascose sintase.

Trabalhos realizados por nosso grupo de pesquisa mostraram que D-pinitol

isolado de folhas de Bougainvillea spectabilis estimulou o aumento de tamanho e

ganho de massa do eixo hipocótilo-radícula e dos epicótilos de C. ensiformis

(Oliveira et al., 2004). Resultados semelhantes foram observados para Phaseolus

Introdução

Souza, S. C. (2010) 17

vulgaris, onde a aplicação exógena de D-pinitol promoveu um aumento no tamanho

e no ganho de massa das radículas e epicótilos dessas plântulas (Silva, 2006).

Fornaciari (2006) observou um acúmulo de proteínas totais solúveis nos cotilédones

e radículas de C. ensiformis tratadas com D-pinitol, sugerindo que esse composto

pode ter estimulado a síntese dessas proteínas. Souza, em 2007, estudando os

efeitos de D-pinitol durante as primeiras horas de germinação de C. ensiformis

percebeu que os cotilédones tratados apresentaram maior atividade de α-amilases

em quase todos os intervalos de tempo. E ainda, nosso mais recente trabalho

mostrou aumentos da atividade e dos níveis de expressão do gene da enzima α-

amilase em cotilédones de V. unguiculata e P. vulgaris tratados com D-pinitol

(Ribeiro et al., 2010).

Além disso, o D-pinitol é conhecido por exercer efeitos do tipo insulina em

animais, sendo utilizado para o tratamento alternativo do diabetes (Bates et al.,

2000). A atividade insulina-like do D-pinitol pode ser explicada por esse composto

ser análogo ao inositol - um segundo mensageiro presente em cascatas de

sinalização, como a desencadeada por insulina em animais. Acredita-se que D-

pinitol seja capaz de desencadear essa cascata, provocando ações ao nível de

membrana plasmática, citoplasma e núcleo. Ao nível de membrana, ocorrem

alterações no transporte de glicose, aminoácidos e íons; no citoplasma, há inibição

ou ativação de enzimas e no núcleo ocorre a regulação da síntese de DNA e RNA,

efeitos esses bem descritos para o hormônio insulina (Sperelakis, 1994).

Apesar da vasta distribuição e acúmulo de MI, inclusive de D-pinitol, em

vegetais durante a germinação e o desenvolvimento pós-germinativo, pouco se sabe

sobre possíveis rotas de sinalização e/ou moléculas alvo envolvendo esses

compostos e as funções que desempenham nesses sistemas.

1.3.1.3 - Vanadil sulfato

Vanadil sulfato (VOSO4) é um elemento ultratraço, distribuído amplamente na

natureza, importante para a modulação da atividade das enzimas das vias

metabólicas celulares. O papel aparente do vanádio está na regulação da

sinalização intracelular, como um co-fator das enzimas essenciais no metabolismo

energético. Também é considerado um agente terapêutico do tratamento do diabetes

(Thompson, 1999). Clark et al. (1985) demonstraram que o vanádio (V), no músculo

Introdução

Souza, S. C. (2010) 18

esquelético, altera o metabolismo de glicose de modo semelhante ao da insulina.

Esse elemento promoveu um aumento da entrada de glicose, síntese de glicogênio e

glicólise, em amplitude menor que a insulina. Resultados mais expressivos,

envolvendo compostos de vanádio, foram relatados com a utilização do composto

vanadil sulfato (VOSO4), onde foram demonstrados seus mecanismos de ação do

tipo insulina, possivelmente pelo fato do vanadil ser a forma intracelular ativa do

vanádio (Thompson, 1999; Shaver et al., 1995; Nakai et al., 1995; Goldwaser, et al.,

2000). De fato, o vanadil sulfato é a forma oxidativa do vanádio que in vitro e em

modelos animais de diabetes promoveu uma redução na hiperglicemia e na

resistência à insulina (Cusi et al., 2001). Recentemente, um trabalho de Thompson &

Orvig (2006) relatou que os compostos de vanádio para o tratamento do diabetes

são um tanto enigmáticos: o potencial terapêutico é claro, mas os mecanismos, e um

controle consistente de dosagem, são difíceis de fixar.

Apesar de relatos desde a década de 50 afirmarem que vanádio seria

essencial para plantas (Arnon & Wessel, 1953), encontramos trabalhos que mostram

os efeitos nocivos desse elemento no crescimento, produção e composição química

do milho e também no crescimento de plântulas de soja (Singh, 1971; Wang & Liu,

1999). Porém, já se sabe que vanádio e seus compostos derivados são ubíquos nas

plantas, a nível traço. Alguns relatos mais recentes mostram, por exemplo, que uma

quantidade traço de vanadato é benéfica ao crescimento vegetal, visto que

concentrações elevadas são tóxicas, chegando a inibir o movimento e

desenvolvimento foliar e a condutância estomática (Lin et al., 2009).

Vanadil sulfato em níveis traço, concentrações cerca de 10-2 M, também

mostrou ser um composto relacionado ao metabolismo vegetal. Singh & Wort (1969)

apresentaram efeitos do vanadil no crescimento, composição química e processos

metabólicos da beterraba madura (Beta vulgaris, L.), relacionando as mudanças no

crescimento e na composição química à estimulação ou inibição de diversas enzimas

pelo vanadil. Hattori & Ohta (1985) relataram que vanadil estimulou a acumulação de

isoflavonóides glicosídeos em culturas de célula em suspensão de Vigna angularis.

E mais tarde, Smith et al.,1987 relataram um rápido aumento na acumulação de

alcalóides por algumas linhagens de Catharanthus roseus em resposta à adição de

vanadil sulfato.

Introdução

Souza, S. C. (2010) 19

1.4 - Canavalia ensiformis

Canavalia ensiformis (L.) Dc. (Leguminosae) (Figuras 3 e 4), comumente

conhecida em inglês, como “jack bean” ou, em português, como feijão-de-porco, é

uma dicotiledônea anual originária da Índia e América Central, sendo atualmente

cultivada na maioria das regiões tropicais e subtropicais, apesar de poucos serem os

países que a cultivem em grande escala (Braga, 1960). Esta cresce facilmente em

regiões de baixa altitude, altas temperaturas e umidade relativa, condições

inadequadas para o crescimento de outros legumes utilizados na alimentação, tais

como Phaseolus vulgaris (feijão-comum). Desta forma, o feijão-de-porco tem elevado

potencial em regiões de climas e alturas variáveis como a América Central, onde não

competiria com o feijão-comum podendo ser uma fonte adicional de proteína (Molina

et al., 1974). Sua utilização como cultivo de cobertura tem uma grande importância

em uma variedade de sistemas agrícolas, onde se aproveita sua cobertura verde

durante temporadas de secas (Alemàn & Flores, 1993).

FIGURA 3 - Canavalia ensiformis

(Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Canavalia)

Introdução

Souza, S. C. (2010) 20

FIGURA 4 - Flores (A) e vagem imatura (B) de Canavalia ensiformis

(Fonte: http://plantsdatabase.com/members/Horseshoe/)

Normalmente, as sementes maduras são obtidas de 180 a 300 dias após o

plantio, dependendo do genótipo e das condições climáticas do local. Suas

sementes são geralmente brancas ou mais raramente podem apresentar uma cor

amarelada (Figura 5). Possuem dimensões aproximadas de 2,5 x 1,25 cm e pesam

cerca de 1,5 g (Braga, 1960). Algumas linhagens, dentro da mesma espécie,

apresentam características trepadoras, mas a maior parte possui características

arbustivas (Alemàn & Flores, 1993). Esta planta apresenta-se bastante tolerante a

sombra e a condições adversas de temperatura, sendo bastante resistente a seca e

adaptando-se bem a condições úmidas (Alemàn & Flores, 1993). Devido ao fato de,

quando dispersas da planta-mãe, apresentam baixo conteúdo de água, em torno de

5 a 10% de seu peso fresco, são consideradas sementes ortodoxas (Ferreira &

Borghetti, 2004).

A B

Introdução

Souza, S. C. (2010) 21

FIGURA 5 - Vagem madura (A) e sementes (B) de Canavalia ensiformis

(Fonte: http://plantsdatabase.com/members/Horseshoe/)

Sementes de Canavalia ensiformis têm sido objeto de estudo do nosso grupo

há muitos anos. Trabalhos realizados em 1999, identificaram proteínas envolvidas

com o mecanismo de defesa dessas sementes contra o ataque de Callosobruchus

maculatus (Oliveira et al., 1999c) e fungos fitopatogênicos (Oliveira et al., 1999a) nos

cotilédones e tegumentos das sementes quiescentes, sendo relevantes as proteínas

com sequência de aminoácidos homóloga a vicilinas (proteínas de reserva do tipo

7S) presentes nos cotilédones (Oliveira et al., 1999c). Além disso, Oliveira et al.

(1999b) demonstraram a presença de uma proteína homóloga à insulina nos

tegumentos de sementes quiescentes de C. ensiformis. Em 2004, um trabalho do

grupo também mostrou que insulina exógena (bovina) e D-pinitol foram capazes de

acelerar o desenvolvimento de radículas e epicótilos de plântulas de C. ensiformis

embebidas por 120 horas (Oliveira et al., 2004). Fornaciari (2006) constatou que

esses tratamentos estimularam a síntese protéica em todos os tecidos de C.

ensiformis (tegumentos, cotilédones, radículas e epicótilos) embebidos por 120

horas, exceto nos epicótilos, onde somente a insulina teve efeito.

O objetivo desse trabalho foi, com base nas observações, verificar a hipótese

das moléculas insulina, D-pinitol e vanadil sulfato estarem envolvidas na regulação

de vias metabólicas de plantas.

A B

Objetivos

Souza, S. C. (2010) 22

2 - OBJETIVO GERAL

Acompanhar o perfil metabólico de cotilédones de Canavalia ensiformis

durante a germinação e o desenvolvimento pós-germinativo, monitorando alterações

provocadas por insulina e compostos relacionados, como os mediadores miméticos

da sua ação, D-pinitol e vanadil sulfato.

2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Investigar os perfis de proteínas totais em cotilédones submetidos aos

diferentes tratamentos com os compostos relacionados à insulina;

• Investigar os perfis de proteínas imunorrelacionadas à vicilinas em

cotilédones submetidos aos diferentes tratamentos com os compostos

relacionados à insulina;

• Investigar os perfis de atividade das enzimas α-amilase e proteinases

cisteínicas em cotilédones submetidos aos diferentes tratamentos com os

compostos relacionados à insulina;

• Detectar proteínas imunorrelacionadas a MAP-quinases em cotilédones

submetidos aos diferentes tratamentos com os compostos relacionados à

insulina;

• Avaliar os níveis endógenos de D-pinitol, myo-inositol, sacarose e rafinose

em cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e o

desenvolvimento pós-germinativo.

Materiais e Métodos

Souza, S. C. (2010) 23

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Material botânico

Sementes de Canavalia ensiformis foram obtidas do Laboratório de Sementes

do Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias da Universidade

Federal do Ceará, e foram plantadas e mantidas no Centro de Ciências e

Tecnologias Agropecuárias (CCTA) da Universidade Estadual do Norte Fluminense

Darcy Ribeiro.

3.2 - Experimentos de germinação

Sementes de C. ensiformis foram desinfectadas com uma solução de álcool

etílico 70 % por 1 minuto e hipoclorito de sódio 2 % por 30 segundos. Após estes

processos as sementes foram postas para germinar em placas de Petri (20

sementes em cada placa) contendo algodão umedecido com 30 mL de água

destilada (experimentos controle) ou com o mesmo volume de diferentes soluções de

tratamentos com insulina (0,36 µg/mL), D-pinitol (1,44 µg/mL) e vanadil sulfato (1,809

µM) (Oliveira et al., 2004 e Silva, 2006). Os compostos químicos utilizados nos

experimentos de germinação, insulina bovina e vanadil sulfato, foram obtidos

comercialmente por Sigma Chemical Company, e o composto D-pinitol, isolado de

folhas de Bougainvillea spectabilis, foi cedido pelo Dr. Selwyn Yorke (New Zealand

Pharmaceuticals LTD).

Os experimentos foram mantidos em estufa incubadora por até 72 horas (12 h

luz/12 h escuro) a 28 ºC e 60 % de umidade relativa. Após 60 horas de incubação, o

algodão foi umedecido novamente com mais 30 mL de água ou das soluções acima

citadas. As sementes foram coletadas em intervalos de 6 horas (5 sementes em

cada intervalo) e os cotilédones foram separados e pesados para determinação da

massa fresca (em gramas). A emergência da radícula de deu em 30 horas de

embebição. Esses tecidos foram, então, congelados em nitrogênio líquido e

liofilizados. Após a liofilização, foram novamente pesados para determinação da

massa seca (em gramas) e em seguida, triturados em um liquidificador até obtenção

de um pó (farinha) que foi conservado a - 20 oC e, posteriormente, utilizado para as

dosagens apresentadas neste trabalho.


Souza, S. C. (2010) 24

3.3 - Extração e dosagem de proteínas totais solúve is

Para realização das dosagens protéicas das amostras foi utilizado o método

de Bradford (1976). A extração das amostras se deu na proporção de 2 mg de tecido

para 1 mL de tampão PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,6) por 30

minutos em temperatura ambiente. Após a extração as amostras foram centrifugadas

a 3000 x g por 5 minutos, o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi utilizado

para a dosagem de proteínas. Para os cálculos finais da concentração para

determinação de proteínas foi utilizada uma curva padrão de ovalbumina.

3.4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)

As proteínas foram visualizadas através de eletroforese em gel de

poliacrilamida 12% contendo SDS segundo metodologia descrita por Laemmli,

(1970), com modificações.

A eletroforese foi constituída por um gel de empacotamento (SDS 0,1%;

acrilamida 5%; bis-acrilamida 0,25%; Tris-HCl 0,75 M, pH 6,8; TEMED 0,04% e

persulfato de amônio 0,08%) e um gel de separação (SDS 0,1%; acrilamida 12%;

bis-acrilamida 0,06%; Tris-HCl 0,375 M, pH 8,8; TEMED 0,02% e persulfato de

amônio 0,5%). A eletroforese foi efetuada em ambiente de tampão de corrida Tris-

glicina (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1 %, pH 8,3) por aproximadamente 2

horas com uma voltagem de 50 V, enquanto as amostras estavam no gel de

empacotamento, e 80 V após as amostras terem passado para o gel de separação.

Para o cálculo da massa molecular aparente das proteínas, um padrão de massa

molecular (albumina sérica bovina (BSA) 66 kDa, ovalbumina 45 kDa, anidrase

carbônica 29 kDa, tripsinogênio 24 kDa, β-lactoglobulina 18,4 kDa e lisozima 14,3

kDa) foi submetido à eletroforese, juntamente com as amostras.

As amostras de cotilédones usadas na eletroforese foram extraídas por 30

minutos utilizando a seguinte proporção: 3 mg de tecido em 200 µL de tampão de

amostra (Tris-HCl 0,5 M, glicerol 10 %, SDS 10 %, Azul de bromofenol 1 %, pH 6,8).

Após extração, centrifugou-se a 3.000 x g por 5 minutos para retirar do sobrenadante

a alíquota de 30 µL de amostra, que foi aplicada no gel.

Após a eletroforese o gel foi corado com uma solução corante (0,8 g de Azul

Brilhante de Coomassie R, 320 mL de metanol, 80 mL de ácido acético e água


Souza, S. C. (2010) 25

destilada q.s.p. - volume final de 800 mL) e descorado por uma solução descorante

para Coomassie (35% de metanol e 10% de ácido acético em água destilada).

3.5 - Western Blotting

A presença de proteínas imunorrelacionadas a vicilina foi visualizada

utilizando-se o método de Western blotting, segundo metodologia descrita por

Towbin et al., (1979).

Um gel não corado, proveniente de uma SDS-PAGE feita de acordo com

metodologia descrita anteriomente, foi submetido à transferência para uma

membrana de nitrocelulose. O gel, 2 blocos de papel filtro e a membrana, de

medidas idênticas, foram embebidos no tampão de transferência (Tris 0,1 M, glicina

192 mM, metanol 20%) por aproximadamente 20 minutos. No sistema de

transferência Trans-blot semi seco foi colocado o papel de filtro e sobre ele foi

colocada a membrana. Sobre a membrana colocou-se cuidadosamente o gel, a fim

de evitarem-se espaços de ar que pudessem representar barreiras na passagem da

corrente elétrica, em seguida o papel de filtro restante foi colocado sobre o gel. O

“sanduíche” formado foi umedecido com tampão de transferência e o sistema foi

fechado. A transferência ocorreu usando-se uma voltagem calculada na razão de

1mA por cm2 do gel, por aproximadamente 2 horas, à temperatura ambiente.

Finalizada a transferência, a membrana foi “revelada” com Ponceau a fim de checar

se a transferência foi realizada. A membrana contendo as proteínas transferidas, foi

deixada por 16 horas em um tampão bloqueador (PBS contendo 2% de leite em pó

desnatado), à temperatura de 4 ºC. Após o bloqueio, a membrana foi lavada 5 vezes

com tampão PBS e então incubada com o primeiro anticorpo, anti-vicilina de

cotilédones de Vigna unguiculata (EPACE 10), diluído em tampão bloqueador

(diluição de 1:2000), por 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana

foi novamente lavada com tampão PBS por 5 vezes e incubada com o segundo

anticorpo, anti-IgG de coelho complexado a peroxidase, diluído em tampão

bloqueador (1:2000), por 1 hora, à temperatura ambiente. A membrana foi lavada

com tampão PBS mais 5 vezes e então foi aplicada uma solução reveladora

composta de 5 mg de DAB (diaminobenzeno) dissolvidos em 5 mL de uma solução

composta de 100 µL de tampão Tris-HCl 2M (pH 7,5 , 300 µL de imidazol 0,1M, 4,9

mL de água destilada e 5 µL de peróxido de hidrogênio (H2O2), este último colocado


Souza, S. C. (2010) 26

imediatamente no momento da revelação. A solução reveladora foi deixada em

contato com a membrana, na ausência de luz, até o aparecimento das bandas. A

reação foi parada lavando-se a membrana com água destilada.

3.6 - Dosagem de vicilinas e detecção de proteínas MAPK pelo método de

ELISA

O ensaio de ELISA foi empregado neste trabalho segundo metodologia

descrita por Engvall & Perlman (1971) com modificações, para quantificação de

proteínas imunorrelacionadas a vicilina e a detecção de MAPK.

Os anticorpos utilizados para os ensaios anti-MPK4 de Arabidopsis thaliana,

produzido em coelhos, e anti-IgG de coelho complexado a peroxidase, foram obtidos

comercialmente de Sigma-Aldrich Chemical Company e o anticorpo anti-vicilina de

Vigna unguiculata, cv. EPACE 10, produzido em coelhos, foi cedido pela Dra Adriana

Ferreira Uchôa.

As proteínas das amostras submetidas ao teste foram extraídas em tampão

carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, durante 30 minutos, à temperatura ambiente.

Para extração dos cotilédones foram usados 2 mg de pó em 1 mL de tampão. Após

a extração, as amostras foram centrifugadas a 3.000 x g por 5 minutos e os

sobrenadantes obtidos foram submetidos à dosagem de proteínas pelo método de

Bradford (1976).

Para a realização dos ensaios de ELISA, cada poço da placa foi sensibilizado

com 20 µg de proteína em 100 µL de tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6 e a placa

foi deixada em repouso a 4 °C por 16 horas. Após es se período, a placa foi lavada

10 vezes com tampão PBS-Tween (fosfato de sódio 0,1 M; cloreto de sódio 0,5 M,

pH 7,6; contendo 0,05 % do detergente Tween 20). Após essa lavagem inicial, foram

adicionados aos poços 300 µL de tampão bloqueador (tampão PBS-tween contendo

1 % de gelatina) por 2 horas, à temperatura ambiente. Passado esse tempo de

bloqueio os poços foram novamente lavados 10 vezes com tampão PBS-Tween e

então, colocados em cada poço 50 µL do primeiro anticorpo (anti-vicilina de Vigna

unguiculata, cv. EPACE 10, produzido em coelho ou anticorpo anti-MPK4 de

Arabidopsis thaliana, também produzido em coelho, diluídos 1:2000 em tampão

bloqueador) e deixou-se a placa em repouso durante 2 horas à temperatura


Souza, S. C. (2010) 27

ambiente. Após as 2 horas de incubação, a placa foi lavada 10 vezes com tampão

PBS-Tween; em seguida, foram adicionados a cada poço 50 µL do segundo

anticorpo (anti-IgG de coelho complexado a peroxidase, diluído 1:2000 em tampão

bloqueador). A placa foi então deixada em repouso durante 1 hora à temperatura

ambiente. Após a incubação, a placa foi mais uma vez lavada por 10 vezes com

tampão PBS-Tween e submetida à revelação. O tampão revelador foi composto por

ácido cítrico 0,1 M e fosfato de sódio 0,2 M, pH 5,0. A esta mistura, foram

adicionados, no momento da revelação, 10 mg de OPD (orto-fenil-diamina) e 10 µL

de peróxido de hidrogênio, e então 50 µL dessa mistura foram adicionados em cada

poço. A reação ocorreu na ausência de luz por aproximadamente 15 minutos e,

posteriormente, foi parada pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico 3N. A absorbância

foi determinada em um leitor de microplacas no comprimento de onda de 492 nm.

Foram feitos brancos para cada amostra onde não foram acrescentados os

anticorpos. Para os cálculos das concentrações de vicilina, foi utilizada uma curva

padrão com vicilina pura de cotilédones de Vigna unguiculata de 0,002 a 5 µg

vicilina/100 µL de tampão carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6. E para os cálculos

das concentrações de MAPK a análise foi representada dentro do total de proteínas

dos tecidos e foi relacionada baseada nas absorbâncias.

3.7 - Determinação da atividade de proteinases cist eínicas do tipo papaína

As amostras foram submetidas à extração de proteínas na proporção de 100

mg de pó para 1 mL de tampão citrato-fosfato (citrato de sódio 100 mM, fosfato de

sódio monobásico 100 mM, Triton X-100 0,1 %, DTT 1,5 mM, pH 5,6). A extração

ocorreu durante 2 horas, sob agitação a 4 ºC. Após esse período, as amostras foram

centrifugadas e o sobrenadante utilizado no experimento.

O ensaio de atividade papainásica foi baseado na metodologia desenvolvida

por Michaud et al., (1994), citado por Oliveira (2007), sendo feita uma curva padrão

de papaína, onde a azocaseína foi utilizada como substrato para a enzima. Para

obtenção da curva, papaína foi diluída na proporção de 1mg para 2mL de tampão

citrato-fosfato obtendo-se uma solução com uma concentração final de papaína de

500 µg/mL. Azocaseína foi preparada a uma concentração de 1% em tampão citrato-

fosfato. O ensaio foi preparado em microtubos e constou de quantidades crescentes

(1; 2; 4; 8; 10; 12; 14; 16; 18 e 20 µL) da solução estoque (500µg/mL) da papaína, 80


Souza, S. C. (2010) 28

µL da solução de azocaseína 1% e tampão citrato-fosfato para completar um volume

final de 120 µL. O período de incubação foi de 1 hora em banho-maria a 37 ºC. Em

seguida, a reação foi parada com 300 µL de ácido tricloroacético (TCA) 10%. Os

microtubos foram centrifugados por 2 minutos a 3000 x g. Transferiram-se 350 µL do

sobrenadante para tubos de ensaio, onde então foram adicionados 300 µL de NaOH

1 M. A leitura foi feita em comprimento de onda de 440 nm.

As atividades proteinásicas foram medidas através do uso do substrato

azocaseína em pH 5,6 (indicado para proteinases cisteínicas semelhantes à

papaína). A reação foi realizada incubando-se 80 µL da solução azocaseína 1% (que

deve ser previamente aquecida à temperatura de 37 ºC), com 30 µL da fonte de

enzimas (extratos dos tecidos das sementes) e 10 µL de tampão citrato-fosfato. Após

a incubação a 37 ºC em banho-maria por 1 hora, a reação foi parada pela adição de

300 µL de TCA 10%. Em seguida, a solução foi centrifugada por 2 minutos a 3000 x

g. Logo após foram retirados 350 µL do sobrenadante e adicionados 300 µL de

NaOH 1 M. As amostras finais foram avaliadas por leitura espectrofotométrica, em

comprimento de onda de 440 nm.

A concentração da atividade de proteinases cisteínicas nas amostras

foi calculada com base na curva padrão de papaína, mencionada anteriormente.

3.8 - Determinação da atividade de αααα-amilases

3.8.1 - Ensaio de atividade de αααα-amilases pelo método DNS

A determinação da atividade enzimática de α-amilases foi feita através da

dosagem de açúcares redutores, baseada na metodologia descrita por Miller (1959),

com modificações. O amido é clivado pela α-amilase, havendo liberação de maltose

(açúcar redutor) no meio. Na presença de açúcar redutor e NaOH, o ácido 3,5-

dinitrossalicílico (DNS) é reduzido ao ácido 3-amino-5-dinitrossalicílico (produto),

produzindo uma coloração vermelho-castanho, cuja formação pode ser

acompanhada a 540nm. Para a realização do ensaio foi preparado um reativo de

DNS como descrito abaixo:

- Solução 1 (volume 30 mL): 4,5% de hidróxido de sódio (NaOH)(1,35g em 30

mL de água destilada);


Souza, S. C. (2010) 29

- Solução 2 (volume 88 mL): 1% de ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) + 25,5%

de tartarato duplo de sódio e potássio (0,88g de DNS + 22,5g de tartarato em 88 mL

de água destilada);

- Solução 3 (volume 10 mL):

• Solução A: NaOH 10% (1g de NaOH em 10 mL de água destilada)

• Em 2,2 mL da solução A acrescentou-se 1g de fenol cristalino e o

volume foi completado para 10 mL de água destilada.

O reativo de DNS é composto da soma das três soluções preparadas.

Para o preparo das amostras, os tecidos de C. ensiformis foram submetidos à

extração por 30 minutos à 4 °C, em tampão fosfato d e potássio 50 mM pH 6,8. As

amostras de cotilédones foram diluídas na proporção de 50 mg de pó para 1 mL de

tampão fosfato de potássio, e após a extração, foram centrifugadas a 3.000 x g por 5

minutos, para recuperação do sobrenadante usado na detecção da atividade de α-

amilases.

O ensaio foi constituído de 44 µL do extrato obtido na extração, adicionados

de 6 µL de uma solução de amido 1 %. Foram feitos três brancos: o branco do

reagente DNS (50 µL de tampão fosfato de potássio); o branco da solução de amido

1 % (44 µL de tampão fosfato de potássio, 6 µL da solução de amido 1 %) e os

brancos das amostras (50 µL de cada amostra). Os microtubos contendo essas

soluções foram incubados a 37 °C por 45 minutos. Ap ós esse período, aguardou-se

o resfriamento das soluções e foram, então, adicionados 100 µL do reativo de DNS.

Em seguida, as soluções foram fervidas durante 5 minutos e mais 100 µL de água

destilada foram acrescentados a cada amostra. Um volume de 200 µL das amostras

foi transferido para uma placa de micropoços para leitura em um leitor de

microplacas, sob um comprimento de onda de 540 nm.

Para quantificar a atividade de α-amilases nas amostras, foi feita uma curva

padrão utilizando maltose como açúcar redutor. Foi preparada uma solução de

maltose 0,25 % e quantidades crescentes desta solução (1,25; 2,50; 3,75; 5,00; 6,25;

7,50; 8,75; 10,0 e 11,25 µL) foram pipetadas em microtubos, aos quais foi adicionada

água para completar um volume final de 50 µL Em cada tubo adicionaram-se 100 µL

de DNS e a seguir ferveram-se as soluções por 5 minutos. Adicionaram-se, então,

100 µL de água destilada e 200 µL de cada solução foram transferidos para uma


Souza, S. C. (2010) 30

microplaca, para que a absorbância pudesse ser lida em um leitor de microplacas a

540 nm.

3.8.2 - Ensaio de atividade de αααα-amilases em PAGE-nativo

A determinação da atividade enzimática de α-amilases também foi feita

através de zimografia, uma técnica eletroforética pela qual a atividade enzimática

pode ser diretamente visualizada em um gel de poliacrilamida como bandas distintas,

segundo a metodologia de Upadhyay (2005), com modificações.

Para o preparo das amostras, os tecidos foram submetidos à extração por 30

minutos à 4 °C, em tampão PBS. As amostras foram di luídas na proporção de 12

mg/mL de tampão, e após a extração, foram centrifugadas a 3.000 x g por 5 minutos,

para recuperação do sobrenadante usado na detecção da atividade da α-amilase.

A amostra aplicada no gel de PAGE-nativo 10% foi constituída de 18 µL da

amostra extraída e de 12 µL de tampão de amostra nativo (sem SDS). Após a

corrida, o gel foi transferido para uma solução substrato/tampão (acetato de sódio

20mM, cloreto de sódio 0,2mM, cloreto de cálcio 100mM, pH5,5) contendo1% amido

solúvel (m/v). O gel foi incubado por 3 horas a 4 oC, à temperatura ambiente. Após

incubação, o gel foi rapidamente lavado com água destilada e revelado com uma

solução de revelação Lugol (Sigma) 1:50, em água destilada.

3.9 - Dosagem de D-pinitol, sacarose, rafinose e myo -inositol por

Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de M assas (CG-MS)

Estes experimentos foram realizados em colaboração com a professora Drª Rita de

Cássia Leone Figueiredo Ribeiro e do Dr. Danilo Centeno do Núcleo de Fisiologia e

Bioquímica de Plantas - Instituto de Botânica da USP, com participação da doutoranda Elane

da Silva Ribeiro, do LQFPP/UENF.

Cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas em 24, 48 e 72 horas,

e sementes quiescentes foram extraídos na proporção de 50 mg de pó seco para

500 µL de solução contendo metanol/clorofórmio/água (12:5:1). As amostras foram

colocadas em agitador (“vortex”) para homogeneização e posteriormente postas em

banho seco por 30 mim a 60 °C, sendo que todos os t ubos foram agitados a


Souza, S. C. (2010) 31

intervalos de 10 em 10 minutos. Após extração das amostras, os tubos foram

centrifugados em microcentrífuga durante 2 minutos, a 13000 rpm e temperatura

ambiente. Após centrifugação, o sedimento foi descartado e do sobrenadante foram

retiradas alíquotas de 350 µL, as quais foram transferidas para novos tubos de 1,5

mL e acrescentados, a estas, 350 µL de água destilada. Esses tubos foram

novamente agitados e centrifugados por 5 minutos a 13000 rpm em temperatura

ambiente. Foram então retirados 300 µL do sobrenadante, os quais foram secos por

2 horas em rotoevaporador (“speed vac”). Após serem secas, estas amostras foram

utilizadas para o processo de derivatização, o qual permite que a amostra se

volatilize. Para isso, foram colocados 150 µL do reagente piridina e 50 µL de

BSTFA/TMSC (trimetil fluoracetamida/ trimetilcloro silano). Estes foram deixados em

banho seco, sob temperatura de 75 °C durante 1 hora , sob agitação em vortex de 10

em 10 minutos. Após, o resfriamento das amostras em temperatura ambiente, um

volume de 200 µL foi transferido para frascos do tipo “crimp vial”. Estes frascos com

as amostras foram postos no equipamento CG-MS, para análise e detecção de

alguns compostos metabólicos. Solução padrão de D-pinitol foi usada para o cálculo

das concentrações finais desse composto nas amostras.

3.10 - Análise estatística

A maioria dos resultados foi analisada através do teste t de Student, e as

diferenças significativas foram consideradas quando valores de p < 0,05 (Bridge &

Sawilowsky, 1999).

Resultados

Souza, S. C. (2010) 32

4 - RESULTADOS

4.1 - Perfil de embebição de sementes de Canavalia ensiformis : Influência de

insulina e compostos relacionados sobre o ganho de massa de cotilédones

A figura 6 mostra os teores de massa fresca e seca durante a embebição de

sementes de Canavalia ensiformis. Foi possível observar que houve uma rápida

tomada de água durante as 6 primeiras horas de embebição, seguida por uma fase

de estabilização e com um novo aumento da absorção de água a partir de 54 horas.

Nos experimentos controle e tratamentos com insulina (6A), D-pinitol (6B) e vanadil

sulfato (6C) a emergência da radícula se iniciou em 30 horas de embebição. Não

foram observadas diferenças significativas nas massas seca e fresca entre os

experimentos controle e os tratamentos.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 33

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Embe b iç ã o ( hor a s)

Cont role- f resca Cont role-seca Insulina-f resca Insulina-seca

A

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Emb eb ição ( ho ras)

Controle-fresca Controle-seca D-pinitol-f resca D-pinitol-seca

B

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Emb eb ição ( ho ras)

Controle-f resca Controle-seca Vanadil-fresca Vanadil-seca

C

FIGURA 6 - Teores de massa fresca e seca (gramas) de sementes de Canavalia ensiformis

germinadas na presença de insulina (6A), D-pinitol (6B), vanadil sulfato (6C) ou em água (experimento

controle) em intervalos de 0 (quiescente) a 72 horas de embebição.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 34

4.2 - Teores de proteínas totais solúveis de cotilé dones: Influência de insulina

e compostos relacionados

Na figura 7 são mostradas as concentrações de proteínas totais solúveis em

cotilédones de sementes de C. ensiformis quiescentes e germinadas em intervalos

de 6 a 72 horas. É possível ver que após as primeiras horas de embebição em água

(próximas a 12 horas) há um aumento na quantidade de proteínas totais, seguida por

alguns picos de aumento, isolados, ao longo dos tempos de germinação. Até 72

horas não foram observadas diminuições significativas de proteínas, com relação ao

teor das sementes quiescentes, que indicassem uma possível mobilização (Figuras

7A, B e C).

Quando analisados os níveis protéicos de cotilédones que foram submetidos

aos tratamentos, observa-se que todos os tratamentos influenciaram nos níveis de

proteínas em algum momento da embebição. O tratamento com insulina teve um

efeito positivo nos níveis de proteínas totais solúveis em alguns intervalos de tempo

principalmente em 6 e 36 horas de embebição (Figura 7A). Esse efeito também foi

observado para o tratamento com D-pinitol nas primeiras horas de embebição,

principalmente em 6 e 12 horas (Figura 7B).

Quando avaliados os efeitos do tratamento com vanadil sulfato, notou-se um

aumento nos níveis de proteínas totais em quase todos os intervalos de tempo de

embebição (Figura 7C).

Resultados

Souza, S. C. (2010) 35

90

110

130

150

170

190

210

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

µg P

rote

ína/

m

g M

assa

sec

a

Controle Insulina

A

90

110

130

150

170

190

210

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

µg P

rote

ína/

m

g M

assa

sec

a

Controle D-pinitol

B

90

110

130

150

170

190

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

µg P

rote

ína/

mg

Mas

sa s

eca

Controle Vanadil

C

FIGURA 7 - Concentração de proteínas totais solúveis por mg de tecido (massa seca) de cotilédones

de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44

µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição. Os

resultados representam a média de 3 repetições.

*

* *

*

Resultados

Souza, S. C. (2010) 36

4.3 - Visualização do perfil protéico por SDS-PAGE e detecção de vicilinas por

Western blotting em cotilédones germinados em ausência e presença de


Com o objetivo de analisar o perfil protéico total, o perfil das vicilinas

(principais proteínas de reserva) e as possíveis mudanças induzidas pelos

tratamentos, proteínas foram extraídas dos cotilédones de C. ensiformis e

visualizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 12 %, na presença de SDS.

Para a análise do perfil de vicilinas, proteínas separadas em gel foram transferidas

para membrana de nitrocelulose e analisadas por Western blotting.

Observa-se que os cotilédones apresentam uma riqueza de bandas protéicas

com massas moleculares variadas desde superiores a 66 kDa até inferiores a 14 kDa

(Figuras 8A e 9A). Diversas bandas imunorreativas ao anticorpo anti-vicilina de Vigna

unguiculata também foram reveladas (Figuras 8B, e 9B).

As amostras dos tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato não

apresentaram diferenças no perfil protéico total quando comparados com os

respectivos controles (Figuras 8A e 9A). Na análise das vicilinas foi possível notar a

diminuição de intensidade de algumas bandas imunorrelacionadas a vicilinas nas

amostras tratadas com D-pinitol (setas) em todos os intervalos de tempo analisados

(Figuras 8B e 9B).

Resultados

Souza, S. C. (2010) 37

FIGURA 8 - Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B), de

cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina (0,36 µg/mL), D-pinitol

(1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 30 horas de embebição e semente

quiescente. M: marcador de massa molecular; MV: marcador vicilina; Q: quiescente; C: Tecidos

controle; I, P e V: Tecidos tratados com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato (respectivamente).

MV Q 6C 6I 6P 6V 18C 18I 18P 18V 30C 30I 30P 30V

B

M Q 6C 6I 6P 6V 18C 18I 18P 18V 30C 30I 30P 30V

A

66 kDa 45 kDa

29 kDa 24 kDa

18 kDa 14 kDa

Resultados

Souza, S. C. (2010) 38

FIGURA 9 - Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B), de

cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina (0,36 µg/mL), D-pinitol

(1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) de 42 por até 66 horas de embebição e

semente quiescente. M: marcador de massa molecular; Q: quiescente; C: Tecidos controle; I, P e V:

Tecidos tratados com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato (respectivamente).

Q 42C 42I 42P 42V 54C 54I 54P 54V 66C 66I 66P 66V

B

M Q 42C 42I 42P 42V 54C 54I 54P 54V 66C 66I 66P 66V

A

66 kDa 45 kDa

29 kDa 24 kDa

18 kDa 14 kDa

Resultados

Souza, S. C. (2010) 39

4.4 - Dosagem de proteínas imunorrelacionadas à vic ilina em cotilédones

germinados em ausência e presença de insulina e com postos relacionados

Com o intuito de investigar variações nas concentrações de vicilinas, foi feita

uma dosagem de vicilinas, através do método de ELISA utilizando-se anticorpo anti

vicilina de V. unguiculata (cv. EPACE 10).

A concentração de vicilinas durante a germinação de sementes de C.

ensiformis apresentou um padrão semelhante ao encontrado para proteínas totais

solúveis onde após as primeiras horas de embebição há um aumento na quantidade

de vicilinas, seguido por alguns picos em tempos específicos. Aparentemente não

houve mobilização significativa de vicilinas até 72 horas de embebição.

Com relação aos tratamentos foi observado que a quantidade de vicilina não

variou significativamente com o tratamento com insulina (Figura 10A). Nos

tratamentos com D-pinitol (Figura 10B) apenas nos intervalos de tempo de 24 e 42

horas houve um pequeno aumento na concentração de vicilinas. Para vanadil sulfato

(Figura 10C), observamos um aumento apenas em 66 horas de embebição.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 40

3

5

7

9

11

13

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Vic

ilina

(u

g/m

g m

assa

sec

a)

Controle Insulina

A

4

6

8

10

12

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Vic

ilina

(u

g/m

g m

assa

sec

a)

Controle D-pinitol

B

3

6

9

12

15

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Vic

ilina

(u

g/m

g m

assa

sec

a)

Controle Vanadil

C

FIGURA 10 - Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à vicilina por mg de tecido (matéria

seca) de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina (0,36

µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas

de embebição e quiescente. Os resultados representam a média de 3 repetições.

* *

*

Resultados

Souza, S. C. (2010) 41

4.5 - Perfil de atividade de proteinases cisteínica s em cotilédones germinantes

de C. ensiformis : Influência de insulina e compostos relacionados

Apesar das poucas variações nas quantidades de vicilinas durante o período

de embebição estudado, avaliou-se a atividade de proteinases cisteínicas. Os

resultados mostraram que o aumento da concentração de vicilinas durante as horas

iniciais de germinação com subseqüentes picos de aumentos protéicos foi

acompanhado por um aumento da atividade de proteinases cisteínicas também

durante as primeiras horas de embebição e posteriores aumentos durante os

intervalos posteriores de embebição (Figura 11).

Com relação aos tratamentos observamos que insulina e D-pinitol mostraram

efeitos positivos na atividade das proteinases cisteínicas. No tratamento com D-

pinitol (Figura 11B) foram observados efeitos positivos em todos os intervalos de

tempo, alcançando valores cerca de duas vezes maior do que os do controle.

Para os tratamentos com vanadil sulfato (Figura 11C) não foram observadas

variações muito significativas.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 42

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Pro

tein

ase

cist

eíni

ca

(µg/

mg

mas

sa s

eca)

Controle Insulina

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Pro

tein

ase

cist

eíni

ca

(µg/

mg

mas

sa s

eca)

Controle D-pinitol

B

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Pro

tein

ase

cist

eíni

ca

(µg/

mg

mas

sa s

eca)

Controle Vanadil

C

FIGURA 11 - Atividade de proteinases cisteínicas em cotilédones de plântulas de C. ensiformis

germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato

(1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição. Os resultados representam a média de

3 repetições.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 43

4.6 - Perfil de atividade de αααα-amilases de cotilédones germinantes de C.

ensiformis: Influência de insulina e compostos relacionados

A atividade da enzima α-amilase em cotilédones de C. ensiformis,

representada por µg de maltose produzida por 1 mg de tecido/minuto está mostrada

na Figura 12.

Os resultados mostram que há um aumento na atividade da enzima α-amilase

nas primeiras horas de embebição e essa atividade tende a se manter constante nos

demais períodos. Com relação aos tratamentos apenas nos cotilédones tratados com

D-pinitol foi possível observar alterações significativas, com aumento de atividade de

α-amilase em quase todos os intervalos de tempos estudados (Figura 12B).

A atividade de α-amilases em cotilédones de C. ensiformis foi ainda

visualizada através da zimografia, técnica eletroforética pela qual a atividade

enzimática é diretamente visualizada em um gel de poliacrilamida (Figura 13A).

Apenas as amostras de cotilédones tratados com D-pinitol de 0 - 24 horas foram

analisadas por apresentarem maior atividade in vitro (ensaio enzimático). A

intensidade das bandas visualizadas foi analisada pelo programa Image J (Figura

13B).

Foi possível comprovar que a atividade da enzima α-amilase em cotilédones

de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de D-pinitol teve um aumento

durante as primeiras horas de embebição, principalmente no tempo de 18 horas de

embebição (Figura 13B).

Resultados

Souza, S. C. (2010) 44

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Mal

tose

(µg

/mg/

min

)

Controle Insulina

A

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Mal

tose

(µg

/mg/

min

)

controle D-pinitol

B

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Mal

tose

(µg

/mg/

min

)

Controle Vanadil

C

FIGURA 12 - Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de Canavalia ensiformis

germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato

(1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição. Os resultados representam a média de

3 repetições.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 45

FIGURA 13 - Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas

na presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) durante as primeiras horas de embebição. (A) Visualização

zimográfica das bandas de α-amilase de cotilédones embebidos por 6 a 24 horas e semente

quiescente. (B) Análise da intensidade da atividade das bandas pelo programa Image J.

C: Tecidos controle; T: Tecidos tratados com D-pinitol.

C T C T C T C T Q 6h 12h 18h 24h

C T C T C T C T Q

6h 12h 18h 24h Q

A

B

Resultados

Souza, S. C. (2010) 46

4.7 - Detecção de proteínas imunorrelacionadas à MA P quinase (MAPK) em

cotilédones germinantes de C. ensiformis: Influência de insulina e compostos

relacionados

Desde que as MAPKs, da via MAP-quinase/MAPK (proteína-quinase ativada

por mitógenos), representam a mais abundante família de quinases serina-treonina

em plantas superiores, analisaram-se possíveis alterações nos teores desse

componente durante a germinação de sementes de C. ensiformis utilizando o

método de ELISA e o anticorpo anti-AtMPK4.

O perfil de expressão da MAPK em cotilédones durante a germinação mostrou

um aumento até 18 horas, seguido por um declínio mais acentuado entre 36 e 42

horas e um novo aumento em 48 horas (Figura 14). A análise dos níveis de MAPK

em relação ao total de proteínas dos tecidos mostra uma diminuição nos tratamentos

com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato em relação ao controle (Figura 14 A, B e C).

Nos tecidos submetidos a esses tratamentos observamos um perfil constante na

detecção dessa proteína.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 47

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Abs

. (49

2 nm

)

Controle Insulina

A

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Abs

. (49

2 nm

)

Controle D-pinitol

B

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72

Embebição (horas)

Abs

. (49

2 nm

)

Controle Vanadil

C

FIGURA 14 - Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à MAPK por mg de tecido (matéria seca)

de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL),

(B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de

embebição e quiescente. Os resultados representam a média de 3 repetições.

Resultados

Souza, S. C. (2010) 48

4.8 - Dosagem de D-pinitol em cotilédones durante a germinação

Cotilédones de sementes quiescentes ou embebidas por até 72 horas em

água ou D-pinitol foram submetidas a detecção e quantificação de D-pinitol. Os

resultados mostraram a presença de D-pinitol em todas as amostras analisadas,

entretanto as quantidades foram bastante variáveis (Figura 15). Em cotilédones

quiescentes (153,6 mg/kg) e embebidos por 24 horas (166,45 mg/kg) observaram-se

concentrações semelhantes de D-pinitol e essas quantidades não variaram

significativamente nos cotilédones tratados com o composto por 24 horas (153,4

mg/kg). A concentração de D-pinitol em cotilédones embebidos por 48 e 72 horas

aumentou consideravelmente alcançando os maiores níveis em cotilédones

embebidos em água por 72 horas (1303,72 mg/kg).

Resultados

Souza, S. C. (2010) 49

FIGURA 15 - Quantificação de D-pinitol em cotilédones de sementes de Canavalia ensiformis

quiescentes ou durante a germinação em água ou na presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) por 24, 48 e

72 horas. As dosagens foram feitas por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas

(CG-MS). Os valores estão expressos em mg/kg de massa seca e foram calculados a partir de uma

curva padrão com D-pinitol puro.

0200400600800

1000120014001600

Quiesc

ente

24 C

24 T

48 C

48 T

72C

72 T

Embebição (horas)

D-p

inito

l (m

g/K

g)

Resultados

Souza, S. C. (2010) 50

4.9 - Detecção de myo -inositol, sacarose e rafinose em cotilédones duran te a

germinação

Para essas detecções foram usados cotilédones de sementes quiescentes ou

embebidas por até 72 horas em água ou D-pinitol. Os resultados foram expressos

em unidade arbitrária levando-se em consideração a quantidade de cada um desses

compostos presentes em cotilédones quiescentes. A quantidade presente em

cotilédones quiescentes foi considerada igual a 1 e as concentrações dos compostos

durante os tempos de embebição foram grafadas em relação a essa quantidade. Os

resultados mostraram que as quantidades de myo-inositol encontradas em

cotilédones embebidos por 24 horas em água foram iguais aos encontrados nos

cotilédones quiescentes, entretanto em tecidos embebidos por 24 horas com D-

pinitol essas quantidades foram quase duplicadas (Figura 16A). Nos tempos de 48 e

72 horas as concentrações de myo-inositol foram maiores comparando-se a

cotilédones quiescentes e o tratamento com D-pinitol influenciou positivamente a

quantidade de myo-inositol no tempo de 48h. Em 72 h de embebição com D-pinitol

foi observada uma diminuição na concentração de myo-inositol em relação ao tecido

embebido em água (Figura 16A).

Com relação à dosagem de rafinose, observou-se uma diminuição significativa

desse composto ao longo da germinação, sendo que, em 72 horas, a concentração

desse composto já era cerca de 5 vezes menor quando comparada a de cotilédones

de sementes quiescentes.

Quando analisadas essas concentrações em relação ao tratamento, observa-

se que no tempo de 48 h há um aumento de rafinose nos cotilédones embebidos

com D-pinitol (Figura 16B).

As concentrações de sacarose não variaram significativamente nos

cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e nem entre os tratamentos

(Figura 16C).

Resultados

Souza, S. C. (2010) 51

FIGURA 16 - Detecção de myo-inositol (A), rafinose (B) e sacarose (C) em cotilédones de sementes

de Canavalia ensiformis (1,44 µg/mL) quiescentes ou durante a germinação em água ou na presença

de D-pinitol por 24, 48 e 72 h. As detecções foram feitas por cromatografia gasosa acoplada a

espectrômetro de massas (CG-MS). Os valores estão expressos em unidade arbitrária em

comparação com os valores encontrados em cotilédones quiescentes (considerado = 1- linha

pontilhada).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

24 C

24 T

48 C

48 T

72 C

72 T

Embebição (horas)

Uni

dade

arb

itrár

ia

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

24 C

24 T

48 C

48 T

72 C

72 T

Embebição (horas)

Uni

dade

arb

itrár

ia

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

24 C

24 T

48 C

48 T

72 C

72 T

Embebição (horas)

Uni

dade

arb

itrár

ia

A

B

C

Discussão

Souza, S. C. (2010) 52

5 – DISCUSSÃO

A insulina é descrita na literatura como um estimulador de metabolismo e

crescimento celular em diferentes organismos devido à modulação da síntese de

proteínas que regulam a tradução de mRNAs específicos. Desde 1923, a presença

de substâncias similares à insulina em plantas tem sido sugerida por diversos

trabalhos e em diversas plantas (Collip, 1923; Sanchéz de Gimenez et al., 1999).

Com base no que já se conhece sobre insulina em animais, muitos estudos já foram

desenvolvidos com o objetivo de verificar a hipótese de proteínas do tipo insulina

estarem envolvidas na regulação de vias metabólicas durante a germinação da

semente e o desenvolvimento da plântula. Trabalhos realizados por Ellis & Eyster

(1923) mostraram que insulina promovia um aumento do crescimento de plântulas de

milho, assim como um aumento do desenvolvimento de raízes primárias e

secundárias. Csaba & Pál (1982) observaram que insulina promovia o aumento do

tamanho e peso de raízes e coleóptilos de sementes de cevada. Goodman & Davis

(1993) mostraram que insulina humana, IGF I e IGF II promoveram o crescimento

das radículas de melancia (Citrullus vulgaris), girassol (Helianthus annuus) e pepino

(Cucumis sativus).

Nosso grupo vem trabalhando para elucidar os mecanismos pelos quais a

insulina é capaz de influenciar o crescimento e desenvolvimento de plântulas. Um

trabalho realizado pelo grupo (Oliveira et al., 2004), com plântulas de Canavalia

ensiformis, relatou que a insulina, D-pinitol e vanadil sulfato possuem um efeito

positivo sobre o crescimento de radículas e epicótilos, acelerando o desenvolvimento

dessas plântulas. Foi observado nesse estudo que, no período de 120 horas de

embebição, tanto o peso como o tamanho das radículas e dos epicótilos de plântulas

crescidas na presença desses compostos eram maiores do que de radículas e

epicótilos controles (desenvolvidos em água). Em 2006, Fornaciari ao estudar essas

plântulas de C. ensiformis observou que os tratamentos com insulina e D-pinitol

aumentaram os níveis de proteínas totais solúveis em todos os tecidos, exceto no

epicótilo tratado com D-pinitol, e que esse aumento na quantidade de proteínas

totais foi acompanhado pelo aumento de vicilinas. Entretanto esses experimentos

foram realizados apenas com tecidos de 120 horas de germinação, sendo

desconhecidos os efeitos do tratamento nos tecidos em intervalos de tempo

inferiores a 120 horas.

Discussão

Souza, S. C. (2010) 53

O D-pinitol constitui um princípio ativo encontrado em plantas anti-

glicemiantes e é conhecido por exercer efeitos do tipo insulina em animais e por isso

vem sendo utilizado para o tratamento alternativo do Diabetes. A atividade insulina-

símile do D-pinitol pode ser explicada pelo fato dele ser um composto análogo ao

inositol, que participa como um segundo mensageiro na cascata de sinalização

desencadeada por insulina em animais (Bates et al., 2000). O D-pinitol é originado a

partir do myo-inositol, o inositol mais abundante nas plantas e que é produzido a

partir da glicose (Almeida et al., 2003), e embora seja encontrado em várias partes

das plantas, como raízes, sementes e folhas (Kuo et al., 1997), principalmente de

plantas submetidas a estresses (Murakeözy et al., 2002), pouco se sabe sobre as

funções desempenhadas por esse composto em plantas.

Estudos mostram que as plantas usam açúcares como mensageiros

metabólicos ou moléculas sinalizadoras para coordenar atividades metabólicas entre

os tecidos fonte (onde há produção de açúcar) e os tecidos dreno (onde há

degradação ou armazenamento de açúcar), sinalizando para processos vitais que

estão envolvidos em todo ciclo de vida da planta, controlando o crescimento e

desenvolvimento (Rolland & Sheen, 2005). Tendo em vista o fato do D-pinitol ter

atividade do tipo insulina em animais e ser derivado da glicose, nosso grupo tem

desenvolvido estudos com o objetivo de verificar a hipótese dessas moléculas

estarem envolvidas na regulação de vias metabólicas de plantas. Como comparativo

também investigamos as ações do composto vanadil sulfato, que apresenta

mecanismos de ação do tipo insulina em animais (Goldwaser et al., 2002).

A partir dessas observações, o objetivo geral deste projeto foi analisar o perfil

metabólico de cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e o

desenvolvimento pós-germinativo e as possíveis alterações provocadas pelo

tratamento com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato. A identificação de algumas

alterações poderia justificar o maior desenvolvimento das plântulas tratadas com

alguns desses compostos. Uma hipótese para a promoção desse crescimento seria

a aceleração da mobilização de reservas, o que aumentaria a disponibilidade

energética e conseqüentemente poderia favorecer o crescimento.

Ao determinar a quantidade de proteínas totais solúveis nos tecidos tratados

com insulina observou-se que o tratamento teve um efeito positivo nos níveis dessas

proteínas em alguns tempos ao longo de todo o período analisado da germinação,

efeito esse que reforça a idéia de que este hormônio possa estar envolvido na

Discussão

Souza, S. C. (2010) 54

regulação da síntese protéica em plantas. Trabalhos anteriores mostram os efeitos

da insulina na síntese de proteínas ribossomais do eixo embrionário de sementes de

milho (Sánchez de Jiménez et al., 1999; Dinkova et al., 2000). Posteriormente García

Flores e colaboradores (2001) mostraram a purificação de uma proteína de peso

molecular de 20 kDa, que exerce uma função insulina-símile, promovendo uma

significativa diminuição no tempo de germinação de sementes de milho. Resultados

semelhantes também foram vistos para os tratamentos com D-pinitol e vanadil

sulfato.

Com a finalidade de analisar o perfil protéico e se houve aumento ou

aparecimento de proteínas induzidas pelos tratamentos, proteínas extraídas dos

cotilédones de C. ensiformis foram visualizadas por eletroforese em gel de

poliacrilamida e a presença de vicilinas foi analisada por Western blotting. Não foram

observadas mudanças significativas no perfil protéico das amostras oriundas dos

tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato. Já na análise específica de

vicilinas por Western blotting, foi possível notar o desaparecimento de bandas nas

amostras tratadas com D-pinitol em todos os intervalos de tempo analisados. Uma

possibilidade para esse desaparecimento seria a mobilização para o fornecimento de

aminoácidos para a síntese de proteínas envolvidas em eventos pós-germinativos,

ou fornecimento de energia, visto que D-pinitol estimulou o aumento de tamanho e

ganho de massa do eixo hipocótilo-radícula e de epicótilos de C. ensiformis (Oliveira

et al., 2004).

Com base nos resultados das dosagens, perfis de proteínas e Western

blotting, permanecia a questão se as variações nas concentrações protéicas,

promovidas pelos tratamentos, estariam relacionadas a variações nas proteínas de

reserva do tipo vicilinas (globulinas 7S), que constituem as proteínas mais

abundantes de sementes (Carasco et al., 1978; Khan et al., 1980). Para isso, foram

realizadas dosagens de vicilinas pelo método de ELISA. Os resultados mostraram

não haver variação significativa com o tratamento com insulina. Resultados

semelhantes foram encontrados também para D-pinitol onde apenas nos intervalos

de tempo de 24 e 42 horas houve um pequeno aumento na concentração de

vicilinas. Para vanadil sulfato observou-se aumento apenas em 66 horas de

embebição. Acredita-se que a diferença entre os teores de vicilinas das sementes

quiescentes para as germinantes seja devido a um possível aumento da

solubilização nas sementes durante a germinação somado ao alto grau de hidrólise

Discussão

Souza, S. C. (2010) 55

em que estas encontram-se durante o processo. Essa hidrólise poderia estar

gerando peptídeos que estariam expondo epítopos reconhecidos pelo anticorpo,

dando uma idéia de aumento das vicilinas. Na literatura foram comprovadas

mudanças celulares que precedem e acompanham a proteólise em cotilédones

germinantes de Vigna radiata, onde a maior proteína de reserva é a vicilina, e a

enzima responsável pela hidrólise é uma endopeptidase cisteínica. Essas alterações

observadas podem estar relacionadas ao retículo endoplasmático (RE), sítio de

síntese desta enzima, que, associado a esta síntese, passa por várias modificações.

Os cotilédones quiescentes, recém embebidos, contêm RE tubular, também sofrem

alterações, sendo desestruturados cerca de 12-14 horas após começar a embebição

(Bewley & Black, 1994).

Embora os resultados do presente trabalho tenham mostrado que os

tratamentos com insulina e D-pinitol influenciaram positivamente a atividade de

proteinases cisteínicas em cotilédones, não pode-se atribuir o aumento de

crescimento promovido por esses compostos a uma aceleração da mobilização de

reservas protéicas de cotilédones, visto que a diminuição dessas proteínas durante

esse tempo foi pouco acentuada. Uma possibilidade é que essas enzimas possam

estar participando da mobilização de proteínas de reserva de eixos embrionários,

uma vez que Müntz et al., (1996) demostraram que durante os primeiros dias após a

embebição, a biossíntese de proteínas no eixo embrionário é fornecida

principalmente pela mobilização de proteínas de reserva do próprio eixo e só

posteriormente ocorre a mobilização das proteínas de reserva dos cotilédones. A

questão é que para esse acontecimento existem proteinases cisteínicas do próprio

eixo embrionário agindo sobre suas reservas.

As sementes quiescentes de Canavalia ensiformis apresentaram atividade

enzimática, confirmando o relato de trabalhos quanto à presença de peptidases

ativas em corpos protéicos (CP) de sementes quiescentes, como as proteinases

cisteínicas do tipo papaína (CPRs), encontradas em CP de cotilédones de pepino

(Müntz et al., 2001). As proteinases estocadas devem ter sido formadas durante o

final da embriogênese e podem estar presentes nos estágios medianos e/ou

posteriores de maturação. CPRs que foram formadas durante o desenvolvimento de

sementes podem iniciar a mobilização de globulinas em eixos embrionários e

cotilédones de sementes em germinação (Müntz et al., 2001). As CPRs são

consideradas as candidatas favoritas para inicialização e mediação da degradação

Discussão

Souza, S. C. (2010) 56

de proteínas de reserva em cereais (Bewley & Black, 1994) e dicotiledôneas (Wilson,

1986 apud Müntz et al., 2001). Dado o fato de que os níveis de vicilinas não sofreram

grandes variações, como aconteceu com as proteinases, acredita-se que essa

classe enzimática possa também participar de outras rotas, não apenas na

degradação de proteínas de reserva. Alguns trabalhos sobre esse assunto têm

mostrado a complexidade da regulação celular em plantas por proteólise, indicando

que proteinases cisteínicas, além de participarem da degradação de proteínas de

reserva, também atuam no turnover de proteínas em resposta a estresses abióticos

e bióticos, na morte celular programada em resposta de hipersensibilidade ao ataque

de patógenos e também na senescência de órgãos (revisado por Grudkowska &

Zagdańska, 2004).

Ou outros fatores poderiam ser levados em consideração. O fato do efeito

estimulatório dos compostos sobre a atividade de proteinases cisteínicas não ter

correspondência perfeita na mobilização das reservas pode envolver questões de

localização subcelular, pré processamento proteolítico por outras classes ou

subclasses de proteinases ou um efeito de retardo no tempo de proteólise.

Uma outra abordagem do presente trabalho foi a investigação de possíveis

alterações nas reservas de amido, visto que essas reservas também são importantes

para as plantas, especialmente para algumas sementes e raízes (Cardemil & Varner,

1984). A degradação enzimática do amido é devida principalmente às α-amilases

(Tárrago & Nicolas, 1976).

Os resultados mostraram que apenas nos cotilédones tratados com D-

pinitol foi possível observar alterações significativas, com aumento de atividade de α-

amilase. Uma complementação desses resultados com as dosagens de amido

nesses tecidos seria importante para uma melhor interpretação, quando só

posteriormente a essas dosagens poderemos constatar se os aumentos da atividade

da α-amilase estão realmente relacionados à mobilização de amido.

O total de carboidratos em sementes de leguminosas varia enormemente de

concentrações entre 24% até 68% (Hoover & Sosulski, 1991). Para muitas sementes

a energia inicial necessária para os primeiros eventos da germinação é fornecida

pela quebra do amido estocado (Van der Maarel et al., 2002), desta forma a

degradação do amido é vital para o sucesso da germinação. Em sementes de sorgo

os conteúdos de amido durante a germinação foram reduzidos de cerca de 70 %

Discussão

Souza, S. C. (2010) 57

para concentrações inferiores a 35% (Elmaki et al., 1999), mostrando uma acentuada

mobilização desse carboidrato nas primeiras horas de embebição. A degradação de

amido é uma via modulada por fatores metabólicos e hormonais e o hormônio

giberelina (GA) tem sido considerado o responsável pela indução da síntese de novo

das enzimas responsáveis por esse processo, principalmente da α-amilase (Jones &

Jacobsen, 1991; Perata et al., 1997). A quebra do amido envolve um grupo de

enzimas, como as α-amilases, β-amilases, enzima desramificadora do amido e α-

glucosidases (Dunn, 1974). Ambas α-glucosidase e α-amilase são capazes de

quebrar grânulos de amido, sendo a α-amilase considerada a principal enzima a

desempenhar essa função durante a germinação (Perata et al., 1997; Saman et al.,

2008).

As α-amilases (EC 3.2.1.1) são enzimas endoglicolíticas responsáveis pela

degradação de carboidratos, através da quebra das ligações do tipo 1,4-poliglicanos

durante a mobilização de reservas glicídicas armazenadas. A síntese de α-amilase é

acompanhada por um dramático aumento no nível do mRNA, e sua acumulação

pode ser regulada em resposta a fitormônios, sinais metabólicos e estresse hídrico.

Na germinação de sementes de cereais, o ácido giberélico (GA) é sintetizado em

embriões de sementes embebidas, difunde-se nas camadas do aleurona, e induz

diversas enzimas hidrolíticas, incluindo a α-amilase. Estudos mais detalhados da

abrangência das funções da α-amilase e de seus padrões de expressão gênica nas

dicotiledôneas são ainda limitados e pouco claros (Tangphatsornruang et al., 2005).

Os presentes resultados apontam para a possibilidade do tratamento

com D-pinitol estar estimulando a mobilização do amido, com base no aumento na

atividade da enzima α-amilase encontrada nos cotilédones de C. ensiformis.

Trabalhos anteriores do grupo mostraram aumentos da atividade e dos níveis de

expressão do gene da α-amilase em cotilédones de Vigna unguiculata e Phaseolus

vulgaris tratados com D-pinitol (Ribeiro et al., 2010). Compostos que apresentam

efeito GA-símile na atividade e expressão do gene das α-amilases têm sido descritos

na literatura. Um análogo do mastoparano Mas7, um peptídeo que estimula

mudanças na razão GTP/GDP, induziu atividade de α-amilases na camada de

aleurona de Avena fátua (Jones et al., 1998). Em Oryza sativa L., ácido sulfurico

induziu a produção de α-amilases na ausência de GA (Mitsunaga et al., 2007).

Discussão

Souza, S. C. (2010) 58

A primeira etapa da ação da insulina é a sua ligação ao receptor específico.

Essa ligação, por sua vez, dispara uma cascata de sinalização que poderá ativar

proteínas quinases ou fosfatases. Da ativação dessas proteínas dependerá o tipo de

efeito que a insulina irá desencadear (Lehninger, 2003). Em plantas, a sinalização

desencadeada por insulina leva a ativação de diversas quinases, que já têm sido

identificadas e classificadas em diferentes grupos, sendo que uma das maiores e

mais importantes categorias é a MAPK. Várias descobertas sobre as vias MAPK em

plantas refletem a importância e complexidade dos mecanismos de sinalização

vegetal (Jonak et al., 1994; Mizoguchi et al., 1997; Hirt, 2000; Ichimura et al., 2000;

Morris, 2001; Tena et al., 2001).

Baseados nisto, os níveis de MAPK foram estimados nos cotilédones tratados

com os compostos relacionados à insulina. Nossos resultados mostraram que

existem proteínas imunorrelacionadas a MAPK em cotilédones durante a

germinação, entretanto diferentemente do esperado observamos uma diminuição

nos níveis dessas proteínas nos tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato.

Alguns fatores podem ser considerados como causa para estes resultados, como a

extração não ter sido eficiente para essa classe de proteínas, pois talvez sua

atividade não tenha sido preservada. Outro fato relevante a ser levantado é sobre a

especificidade do anticorpo a MAPK de C. ensiformis, visto que foi usado um

anticorpo comercial contra MAPK de Arabidopsis thaliana.

Estudos de expressão gênica poderiam ser propostos para futuras

confirmações destes dados, visto que são muitos os papéis que têm sido atribuídos

aos componentes das vias da MAPK, desempenhando uma grande variedade de

funções nas vias de transdução de sinais em plantas tais como osmorregulação,

sinalização hormonal incluindo proliferação celular auxina-induzida ou processos

etileno-responsivos, biossíntese da parede celular, e crescimento e diferenciação

celulares (revisado por Mishra et al., 2006). Nossos resultados mostraram pouca

variação nos níveis dessas proteínas durante o decorrer da germinação.

Uma outra questão levantada, no presente trabalho foi a necessidade de se

avaliar os níveis endógenos de D-pinitol e de compostos relacionados direta ou

indiretamente a sua via metabólica como os myo-inositóis, a sacarose e a rafinose.

Através da dosagem do D-pinitol durante a germinação de sementes de

Canavalia ensiformis foi possível ver que a concentração deste composto em

cotilédones embebidos por 48 e 72 horas aumentou consideravelmente, alcançando

Discussão

Souza, S. C. (2010) 59

os maiores níveis em cotilédones embebidos em água por 72 horas (1303,72 mg/kg).

Além do mais, as quantidades de myo-inositóis encontradas em cotilédones

embebidos por 24 horas em água foram iguais aos encontrados nos cotilédones

quiescentes, entretanto em tecidos embebidos por 24 horas com D-pinitol essas

quantidades foram quase duplicadas. Estes dados demonstram a importância dos

myo-inositóis nos processos durante a germinação de sementes e evidenciam o fato

da rafinose e outros açúcares, como os da série dos ciclitóis, derivados dos myo-

inositóis serem sugeridos como importantes para a proteção durante a dessecação e

seu complexo enzimático essencial durante o desenvolvimento das sementes

(Obendorf, 1997; Abid et al., 2009).

Com relação a dosagem de rafinose, observamos uma diminuição dos níveis

desse composto ao longo da germinação, indicando que esse açúcar está sendo

mobilizado durante a germinação. Quando comparado aos cotilédones de sementes

quiescentes, em relação ao tratamento, no tempo de 48 horas há um aumento de

rafinose nos cotilédones embebidos com D-pinitol. Os açúcares da série da rafinose

bem como os ciclitóis derivados dos myo-inositóis têm sido relacionados com a

proteção das sementes a dessecação (Obendorf, 1997 apud Hitz et al., 2002). Essa

função tem sido atribuída principalmente à capacidade desses compostos em

proteger a estrutura das membranas biológicas durante a desidratação

(Croweetal,1987 apud Hitz et al., 2002).

Oligossacarídeos da família rafinose desempenham muitas outras funções

nas plantas. Participam do transporte de carboidratos no floema, como reservas de

armazenamento e crioprotetores de órgãos de plantas resistentes ao frio, e se

acumulam em sementes em maturação, tendo um papel na aquisição da tolerância à

dessecação e a capacidade de armazenamento. Em sementes, as principais funções

são proteger estruturas celulares durante a dessecação e constituição de reservas

de carbono durante a germinação inicial (citado em Karner et al., 2004). Rafinose

como constituinte de reservas de carbono durante a germinação inicial de sementes

pode explicar a diminuição de seus níveis ao longo do tempo de germinação

apresentados nesse trabalho.

Embora as funções clássicas dos derivados dos myo-inositós, como rafinose e

D-pinitol sejam descritas principalmente durante a desidratação da sementes,

trabalhos tentam entender as funções que esses compostos desempenham na

germinação, visto que altos níveis desses compostos podem estar presentes em

Discussão

Souza, S. C. (2010) 60

algumas sementes durante esse processo. Myo-inositol fosfato sintase (MIPS) é uma

enzima central na via de síntese dos myo-inositóis. A completa eliminação dessa

enzima através de mutações no gene da MIPs interrompeu processos bioquímicos

necessários para a germinação (Hitz et al., 2002). Além disso, myo-inositol fosfato

sintase (MIPS), que catalisa a primeira etapa na biossíntese do inositol e a sacarose

sintase (Susi), uma enzima envolvida na formação da UDP-glicose, o principal

nucleosídeo difosfato na reação de quebra da sacarose e na biossíntese da trealose,

além de estarem envolvidas no desenvolvimento da semente também o estão em

vários processos fisiológicos que incluem, além da resistência a estresses abióticos,

também a estresses bióticos (Abid et al., 2009).

As concentrações de sacarose não variaram significativamente nos

cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e nem entre os tratamentos.

Como a sacarose é um substrato para a síntese de rafinose, a não síntese de

rafinose durante a germinação pode justificar os níveis constantes de sacarose

durante esse processo. Evidências para o papel de sacarose em sementes têm sido

relatadas pelo estudo de plantas transgênicas. Sementes oriundas de plantas

transgênicas de Vicia narbonensis, deficientes na transformação de sacarose em

amido, aumentaram os níveis de sacarose, o que conseqüentemente elevou os

conteúdo RFO (α-galactosídeos de sacarose), dentre eles rafinose (Rolletschek et

al., 2002, apud Karner et al., 2004).

Conclusões

Souza, S. C. (2010) 61

6 - CONCLUSÕES

1- Em cotilédones de Canavalia ensiformis embebidos por até 72 horas não foram

observadas diminuições significativas de proteínas totais ou vicilinas, indicando que

até esse tempo não houve mobilização dessas moléculas.

2- Os tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato acarretaram um aumento

nas concentrações de proteínas totais solúveis, em alguns intervalos de tempo após

embebição.

3- Atividade de proteinases cisteínicas foi detectada em sementes quiescentes e

aumentou com a embebição durante a germinação. Os tratamentos com insulina e

D-pinitol promoveram aumentos nessa atividade.

4- A atividade da enzima α-amilase em cotilédones de C. ensiformis aumentou nas

primeiras horas de embebição e se manteve constante até 72 horas. Essa atividade

foi aumentada em cotilédones tratados com D-pinitol em quase todos os intervalos

de tempo analisados.

5- Proteínas imurrelacionadas a MAPK estão presentes em cotilédones durante a

germinação. Seus níveis foram diminuídos pelos tratamentos com insulina, D-pinitol

e vanadil sulfato.

6- D-pinitol foi detectado em todas as amostras. Esses níveis aumentaram em

cotilédones embebidos por 48 e 72 horas.

7- Myo-inositol foi detectado nos cotilédones de sementes quiescentes e durante a

germinação. Esses níveis foram maiores em cotilédones embebidos com D-pinitol

por 24 e 48 horas.

8- As concentrações de rafinose diminuíram significativamente ao longo da

germinação. O tratamento com D-pinitol promoveu um aumento de rafinose nos

cotilédones após 48 horas de embebição.

Conclusões

Souza, S. C. (2010) 62

9- As concentrações de sacarose não variaram significativamente nos cotilédones de

C. ensiformis durante a germinação e nem entre os tratamentos.

10- Esses dados sugerem que insulina e compostos relacionados interferem no

desenvolvimento de plântulas de Canavalia ensiformis.

Referências bibliográficas

Souza, S. C. (2010) 63

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abid, G.; Silue, S.; Muhovski, Y.; Jacquemin, J-M.; Toussaint, A. & Baudoin, J-P. (2009). Role of myo-inositol phosphate synthase and sucrose synthase genes in plant seed development, Gene, 439:1-10.

Aires, M.M. (1999). Fisiologia. 2° ed. Rio de Janeiro. Guanabara Koogan.

Alemán, R. & Flores, M. (1993). Alguns dados sobre Canavalia ensiformis. National Academy of Sciences, pp: 54-59.

Almeida, M.V.; Silva, A.D.; Souza, M.V.N. & Benício, A.A.A. (2003). A cascata de sinalização dos fosfoinositídeos. Química Nova, 26: 105-111.

Aloresi, A.; Gestin, C.; Leydecker, M-T.; Bedu, M.; Meyer, C. & Truong, H-N. (2005). Nitrate, a signal relieving seed dormancy in Arabidopsis. Plant, Cell & Environment, 28: 500-512.

Arnon, D, & Wessel, G. (1953). Vanadium as an essential element for green plants. Nature. 172: 1039-1040.

Asai, T.; Tena, G.; Plotnikova, J.; Willmann, M.R.; Chiu, W-L.; Gomez-Gomez, L.; Boller, T.; Ausubel, F.M. & Sheen, J. (2002). MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature, 415: 977-983.

Attucci, S.; Carde, J.P.; Raymond, P.; Saint-Gès, V.; Spiteri, A. & Pradet, A. (1991). Oxidative Phosphorylation by Mitochondria Extracted from Dry Sunflower Seeds, Plant Physiology, 95: 390-398.

Azevedo, C.R.; Maciel, F.M.; Silva,L.B.; Ferreira, A.T.S., Cunha, M.; Machado, O.L.T.; Fernandes, K.V.S.; Oliveira, A.E.A. & J. Xavier-Filho, J. (2006). Isolation and intracellular localization of insulin-like proteins from leaves of Bauhinia variegate. Brazilian Journal of Medical Biological Research, 39: 1435-1444.

Banting, F.C.; Best, C.H.; Collip, J.B.; Campbell, W.R. & Fletcher, A.A. (1922) Pancreatic extracts in the treatment of diabetes mellitus. Canadian Medical Association Journal, 12: 141-146.

Bardwell, L. (2005). A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides, 26: 339-350.

Bates, S.H.; Jones, R.B. & Bailey, J.C. (2000). Insulin-like effect of D-pinitol. British Journal of Pharmacology, 130: 1944-1948.

Best, C.H. (1924). Recent work on insulin. Endocrinology, 1: 617-629.

Bewley, J.D. & Black, M. (1994). Seeds: Physiology of Development and Germination, 2° ed., New York, Plenum Press.

Bewley, J.D. (1997). Seed germination and dormancy. The Plant Cell, 9: 1055-1066.

Bieleski, R.L. (1982). Sugar alcohols. In: Loewus, W.T. (Ed.), Encyclopedia of Plant Physiology, New Series. Springer-Verlag, Berlin, pp. 158-192.

Bieleski, R.L. (1994a). It ain’t necessarily so: sugars, stress and shibboleths. New Zealand Bioscience, 3: 3-6.


Souza, S. C. (2010) 64

Bieleski, R.L. (1994b). D-pinitol is a major carbohydrate in leaves of some coastal plants indigenous to New Zealand. New Zealand Journal of Botany, 32: 73-78.

Bieleski, R.L.; Clark, C.J. & Klages, K.U. (1997). Identification of myo-inositol as a major carbohydrate in kiwifruit, Actinidia deliciosa. Phytochemistry, 46: 51-55.

Bögre, L.; Calderini, O.; Binarova, P.; Mattauch, M.; Till, S.; Kiegerl, S.; Jonak, C.; Pollaschek, C.; Barker, P.; Huskisson, N.S.; Hirt, H. & Heberle-Bors, E. (1999). A MAP kinase is activated late in plant mitosis and becomes localized to the plane of cell division. Plant Cell, 11: 101-114.

Botha, F.C., Potgieter, G.P. & Botha, A.M. (1992). Respiratory metabolism and gene expression during seed germination. Plant Growth Regulation, 11: 211-224.

Bradford, M.M. (1976). A rapid sensitive method for the quantitation of microgram quanties of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254.

Braga, R. (1960). Plantas do Nordeste do Brasil, Especialmente do Ceará. 2° ed. Fortaleza – Ceará. Imprensa Oficial, 543p.

Bridge, P.D. & Sawilowsky, S.S. (1999). Increasing physicians’ awareness of the impact of statistic on research outcomes: Comparative power of the T-test and Wilcoxon rank-sum test in small samples applied research. Journal of Clinical Epidemiology, 52: 229-235.

Carasco, J.F., Croy, R., Derbyshire, E. & Boulter, D. (1978). The Isolation and characterization of the major polypeptides of the seed globulin of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) and their sequential synthesis in developing seeds. Journal of Experimental Botany, 29: 309-323.

Cardemil, L. & Varmer, J.E. (1984). Starch degradation metabolism towards sucrose synthesis in germinating Araucaria araucana seeds. Plant Physiology, 76: 1047-1054.

Carvalho, N.M. & Nakagawa, J. (2000). Sementes: ciência, tecnologia e produção. 4. ed. Jaboticabal: FUNEP, 588 p.

Chun, J.A.; Jin, U.H.; Lee, J.W.; Yi, Y.B.; Hyung, N.I.; Kang, M.H.; Pyee, J.H;; Suh, M.C.; Kang, C.W.; Seo, H.Y.; Lee, S.W. & Chung, C.H. (2003). Isolation and characterization of a myo-inositol 1-phosphate synthase cDNA from developing sesame (Sesamum indicum L.) seeds: functional and differential expression, and salt-induced transcription during germination. Planta, 216: 874-80.

Clark, A.S.; Fagan, J.M. & Mitch, W.E. (1985). Selectivity of the insulin-like actions of vanadate on glucose and protein metabolism in skeletal muscle. Biochemistry Journal, 232: 273-276.

Collier, E.; Watkinson, A.; Cleland, C.F. & Roth, J. (1987). Partial purification and characterization of an insulin-like material from spinach and Lemma gibba G3. Journal of Biological Chemistry, 262: 6238-6247.

Collip, J.B. (1923). Glucokinin. A new hormone present in plant tissue. Journal of Biological Chemistry, 56: 513-543.

Csaba, G.& Pál, K. (1982). Effects of insulin, triidothyronine, and serotonin on plant seed development. Protoplasma, 110: 20-22.


Souza, S. C. (2010) 65

Cusi, K.; Cukier, R.A.; DeFronzo, M. & Torres, F.M. (2001). Vanadyl sulfate improves hepatic and muscle insulin sensitivity in type 2 diabetes. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 86: 1410-1417.

Dantas, B.F. (2002) Atividade amilolítica e qualidade de sementes de milho (Zea mays L.) submetidas ao alagamento. Tese de Doutorado – Universidade Estadual Paulista – Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, São Paulo.

Dinkova, T.D.; de la Cruz, H.R.; Flores, C.G.; Aguilar, R.; Jiménez-García, L.F. & Sánchez de Jiménez, E. (2007). Dissecting the TOR–S6K signal transduction pathway in maize seedlings: relevance on cell growth regulation. Physiology Plantarum, 130: 1-10.

Drew, E.A. (1983). Sugars, cyclitols and seagrass phylogeny. Aquatic Botany, 15: 387-408.

Dunn, G. (1974). A model for starch breakdown in higher plants. Phytochemistry, 13: 1341-1346.

Ellis, M.M. & Eyster, W.H. (1923). Some effects of insulin and glucokinin on maize seedlings. Science, 58: 541-542.

Elmaki, B.H.; Babiker, B.B, & El Tinay (1999). Change in chemical composition, grain malting, starch and tannin content and protein digestibility during germination of sorghum cultivars. Food chemistry. 64: 331-336.

Engvall, E. & Perlman, P. (1971) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8: 871-874.

Eyster, W.H. & Ellis, M.M. (1924). Growth of maize seedlings as affected by glucokinin and insulin. The Journal of General Physiology, 6: 653-670.

Fernandes, K.V.S. & Xavier-Filho, J. (1998). The biological roles of legume seed vicilins (7S storage proteins). Trends in Comparative Biochemistry and Physiology, 4: 241-245.

Ferreira, A.G. & Borghetti, F. (2004). Germinação: do básico ao aplicado. Porto Alegre: Artmed.

Finch-Savage, W.E. & Leubner-Metzger, G. (2006). Seed dormancy and the control of germination. New Phytologist, 171: 501-523.

Fornaciari, K.V. (2006). Efeito da insulina e do pinitol exógenos sobre o desenvolvimento de plântulas de Canavalia ensiformis. Monografia - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de biociências e Biotecnologia, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro.

García Flores, C.; Aguilar, R.; Reyes de la Cruz, H.; Albores, M. & Sánchez de Jiménez, E. (2001). A maize insulin-like growth factor signals to a transduction pathway that regulates protein synthesis in maize. Biochemical Journal, 358: 95-100.

Goldwaser, I.; Gefel, G.; Gershonov, E.; Fridkin, M. & Shechter, Y. (2000). Insulin-like effects of vanadium: basic and clinical implications. Journal of Inorganic Biochemistry, 80: 21-25.

Gomes, V. M. ; Labra, A. B. ; Sales, M.P.; Fernandes, K.V.S; Cordeiro, R.A & Xavier-Filho, J. (1997). Vicilin storage proteins from cowpea (legume) seeds inhibit fungal development. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 4110-4115.


Souza, S. C. (2010) 66

Goodman, D.B.P. & Davis, W.L. (1993) Insulin accelerates the post germinative development of several fat-storing seeds. Biochemical and Biophysical Research Communications, 190: 440-446.

Grudkowska, M. & Zagdańska, B. (2004). Review: Multifunctional role of plant cysteine proteinases. Acta Biochimica Polonica, 51: 609-624.

Guyton, A.C. & Hall, J.E. Tratado de Fisiologia Médica. 10º ed. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2002.

Harris, N. & Chrispeels, M.J. (1975). Histochemical and biochemical observations on storage protein metabolism and protein body autolysis in cotyledons of germinating Mung beans. Plant Physiology, 56: 292-299.

Hattori, T. & Ohta, Y. (1985). Induction of Phenylalanine Ammonia-Lyase Activation and Isoflavone Glucoside Accumulation in Suspension-Cultured Cells of Red Bean, Vigna angularis, by Phytoalexin Elicitors, Vanadate, and Elevation of Medium pH. Plant and Cell Physiology, 26: 1101-1110.

Hirt, H. & Scheel, D. (2000). Results and Problems in Cell Differentiation: MAP Kinases in Plant Signal Transduction (ed. Hirt, H.), 85-93 (Springer, Heidelberg).

Hitz, W.D.; Carlson, T.J.; Kerr, P.S. & Sebastien, S.A. (2002). Biochemical and molecular characterization of a mutation that confers a decreased raffinosaccharide and phytic acid phenotype on soybean seeds. Plant Physiology, 128, 650-660.

Holdsworth, M.J.; Finch-Savage, W.E.; Grappin, P. & Job, D. (2008). Post-genomics dissection of seed dormancy and germination. Trends in Plant Science, 13: 7-13.

Hoover, R. & Sosulski, F.W. (1991). Composition, structure, functionality and chemical modification of legume starches – a review. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 9: 79-92.

Ichimura, K.; Mizoguchi, T.; Yoshida, R.; Yuasa, T. & Shinozaki, K. (2000). Various abiotic stresses rapidly activate Arabidopsis MAP kinases ATMPK4 and ATMPK6. Plant Journal, 24: 655-665.

Ikner, A. & Shinozaki, K. (2005). Yeast signaling pathways in the oxidative stress response. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 569: 13-27.

Jonak, C.; Heberle-Bors, E. & Hirt, H. (1994). MAP kinases: Universal multi-purpose signaling tools. Plant Molecular Biology, 24:407-416.

Jones, H.D.; Smith, S.J.; Desikan, R.; Plakidou-Dymock, S.; Lovegrove, A. & Hooley, R. (1998). Heterotrimeric G proteins are implicated in gibberellin induction of a-amylase gene expression in wild oat aleurone. Plant Cell, 10: 245-253.

Jones, R.L., & Jacobsen, J.V. (1991). Regulation of synthesis and transport of secreted proteins in cereal aleurone. International Review of. Cytology, 126: 49-88.

Karner, U.; Peterbauer, T.; Raboy, V.; Jones, D.A,; Hedley, C.L. & Richter, A.(2004). myo-Inositol and sucrose concentrations affect the accumulation of raffinose family oligosaccharides in seeds. Journal of Experimental Botany, 55: 1981-1987.


Souza, S. C. (2010) 67

Khan, M.R.I.; Gatehouse, J.A. & Boulter, D. (1980). The seed proteins of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.). Journal of Experimental Botany, 31: 1599-1611.

Khanna, P.; Nag, T.N.; Chandrajaia, S. & Mohan, S. (1976). Process for isolation of insulin from plant source. United States Patent, 3: 945-988.

Kuo, T.M.; Lowell, C.A. & Nelsen, T.C. (1997). Occurrence of Pinitol in developing soybean seed tissues. Phytochemistry. 45: 29-35.

LaemmLi, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685.

Lee, J.S.; Wang, S.; Sritubtim, S.; Chen, J.G. & Ellis , B.E. (2008). Arabidopsis mitogen-activated protein kinase MPK12 interacts with the MAPK phosphatase IBR5 and regulates auxin signaling. The Plant Journal, 57: 975-985.

Lehmann, T. & Ratajczak, L. (2008). The pivotal role of glutamate dehydrogenase (GDH) in the mobilization of N and C from storage material to asparagine in germinating seeds of yellow lupine. Journal of Plant Physiology, 165: 149-158.

Lehninger, A.L.; Nelson, D.C. & Cox, M.M. (1993). Priciples of Biocheistry. 2° ed. New York. Worth Publishers.

Lin, C-W.; Lin, C-Y, Chang, C-C.; Lee, R-H.; Tsai, T-M.; Chen, P-Y.; Chi, W-C. & Huang, H-J. (2009). Early signalling pathways in rice roots under vanadate stress. Plant Physiology and Biochemistry, 47; 369-376.

Loescher, W.H. (1987). Physiology and metabolism of sugar alcohols in higher plants. Physiology Plantarum, 70: 53-557.

Loewus, F.A. & Loewus, M.W. (1983). myo-Inositol: Its biosynthesis and metabolism. Annual Review of Plant Biology, 34: 137-161.

Loewus, F.A. & Murthy, P.P.N. (2000). Myo-Inositol metabolism in plants. Plant Science, 150: 1-19.

López-Bucio, J.; Acevedo-Hernández, G.; Ramírez-Chávez, E.; Molina-Torres, J. & Herrera-Estrella, L (2006). Novel signals for plant development. Current Opinion in Plant Biology, 9: 523-529.

Macedo, M.L.R.; Fernandes, K.V.S.; Sales, M.P. & Xavier-Filho J. (1995). Purification and properties of storage proteins (vicilins) from cowpea (Vigna unguiculata) seeds which are susceptible and resistant to the bruchid beetle Callosobruchus maculatus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 28: 183-190.

Madison, J.T.; Thompson, J.F. & Muenster, A.E. (1981). Turnover of storage protein in seeds of soybean and pea. Annals of Botany, 47: 65-73.

Miége, M.N. (1982). Protein types and distribution in: nucleic acids and proteins part 1, Structure, Biochemistry and Phisiology of proteins. Berlim: Spring-Verlag, p. 205.

Miller, G. L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31: 426-428.

Mishra, N.S.; Tuteja, R. & Tuteja, N. (2006). Signaling through MAP kinase networks in plants. Archives of Biochemistry and Biophysics, 452: 55-68.


Souza, S. C. (2010) 68

Mitsunaga, S-I.; Kobayashi, M.; Fukui, S.;Fukuoka, K.; Kawakami, O.; Yamaguchi, J.; Ohshima, M. & Mitsui, T. (2007). α-Amylase production is induced by sulfuric acid in rice aleurone cells. Plant Physiology and Biochemistry, 45: 922-925.

Mizoguchi, T.; Ichimura, K. & Shinozaki, K. (1997). Environmental stress response in plants: the role of mitogen-activated protein kinases. Trends in Biotechnology, 15: 15-19.

Molina, M.R.; Argueta, C.E. & Bressani, R. (1974). Extraction of Nitrogenous Constituents from the Jack Bean (Canavalia ensiformis). Journal of agricultural and food chemistry, 22: 309-312.

Morris, P.C. (2001). MAP kinase signal transduction pathways in plants. New Phytologist, 151: 67-89.

Mrva, K.; Wallwork, M. & Mares, D.J. (2006). α-Amylase and programmed cell death in aleurone of ripening wheat grains. Journal of Experimental Botany, 57: 877-885.

Müntz, K. (1996). Proteases end proteolytic cleavage of storage proteins in developing and germinating dicotyledonous seeds. Journal of Experimental Botany, 47: 606-622.

Müntz, K. (1998). Deposition of storage proteins. Plant Molecular Biology, 38: 77-99.

Müntz, K.; Belozersky, M.A.; Dunaevsky, Y.E.; Schlereth, A. & Tiedeman, J. (2001). Stored proteinases and the initation of storage protein mobilization in seeds during germination and seedling growth. Journal of Experimental Botany., 52 (362): 1741-1752.

Murakeözy, E.O.; Smirmoff, N.; Nagy, Z. & Tuba, Z. (2002). Seasonal accumulation pattern of Pinitol and other carbohydrates in Limonium gmelini subsp. Hungarica. Journal of Plant Physiology, 159: 485-490.

Nakagami, H.; Pitzschke, A. & Hirt H. (2005). Emerging MAP kinase pathways in plant stress signalling. Trends in Plant Science, 10: 339-346.

Nakai, M.; Watanabe, H.; Fujiwara, C.; Kakegawa, H.; Satoh, T.; Takada, J.; Matsushita, R. & Sakurai, H. (1995). Mechanism on insulin-like action of vanadyl sulfate: studies on interaction between rat adipocytes and vanadium compounds. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 18: 719-725.

Nicolas, G. & Aldasoro, J.J. (1979). Activity of the pentose phosphate pathway and changes in nicotinamide nucleotide content during germination of seed of Cicer arietinum L. Journal of Experimental Botany, 30: 1163-1170.

Obendorf, R.L. (1997). Oligosaccharides and galactosyl cyclitols in seed desiccation tolerance (review update), Seed Science Research, 7: 63-74.

Obendorf, R.L.; Sensenig, E.M.; Wu, J.; Ohashi, M.; O’Sullivan, T.E.; Kosina, S.M. & Schnebly, S.R. (2008). Soluble carbohydrates in mature soybean seed after feeding D-chiro-inositol, myo-inositol, or D-pinitol to stem-leaf-pod explants of low-raffinose, low-stachyose lines. Plant Science, 175: 650-655.

Oliveira A.E.A.; Gomes, V.M.; Sales. M.P; Fernandes, K.V.S.; Carlini, C.R. & Xavier-Filho, J. (1999a). The toxicity of Jack bean [Canavalia ensiformis (L.) DC.] canatoxin to plant pathogenic fungi. Revista Brasileira de Biologia, 59: 59-62.


Souza, S. C. (2010) 69

Oliveira A.E.A.; Ribeiro, E.S.; Da Cunha, M.; Gomes, V.M.; Fernandes, K.V.S. & Xavier-Filho, J. (2004). Insulin accelerates Canavalia ensiformis seeds germination and development. Plant Growth Regulation, 43: 57-62.

Oliveira A.E.A.; Sales. M.P; Machado, O.LT.; Fernandes, K.V.S. & Xavier-Filho, J. (1999c). The toxicity of Jack bean seed coat (Canavalia ensiformis) cotyledon and seed proteins to the cowpea weevil (Callosobruchus maculatus). Entomologia Experimentalis et Applicata, 92: 249-255.

Oliveira, A.E.A.; Machado, O.L.T.; Gomes, V.M.; Xavier-Neto, J.; Pereira A. C.; Vieira J. G. H.; Fernandes K. V. S. & Xavier-Filho J. (1999b). Jack bean seed coat contains a protein with complete sequence homology to bovine insulin. Protein & Peptide Letters, 6: 15-21.

Oliveira, L.O. (2007). Atividades de proteinases cisteínicas e de seus inibidores do tipo cistatinas durante a germinação de sementes de feijão-decorda (Vigna unguiculata L. Walp.). Monografia - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de biociências e Biotecnologia, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro.

Oliveira. A. E. A. (2001). Comprovação da presença de insulina em plantas. Campos dos Goytacazes. Tese (Doutorado em Bioquímica). Setor de Bioquímica de plantas, Universidade estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro.

Osborne, D.J. & Boubriak, I.I. (1994). DNA and desiccation tolerance. Seed Science Research, 4:175-185.

Pearson, G.; Robinson, F.; Gibson, T.B.; Xu, B-E.; Karandikar, M.; Berman, K. & Cobb, M.H. (2001). Mitogen-Activated Protein (MAP) kinase pathways: Regulation and physiological functions. Endocrine Reviews, 22: 153-183.

Penfield, S. & King, J. (2009). Towards a systems biology approach to understanding seed dormancy and germination. Proceedings the Royal Society B, 276: 3561-3569.

Perata, P.; Matsukura, C.; Vernieri, P. & Yamaguchi, J. (1997). Sugar repression of a gibberellin-dependent signaling pathway in barley embryos. Plant Cell, 9: 2197-2208.

Ribeiro, E.S.; Souza, S.C.; Mury, F.B.; Dansa-Petretski, M.; Gomes da Silva, L.; Fernandes, K.V.S.; Xavier-Filho, J. & Oliveira, A.E.A. (2010). D-pinitol accelerates seedling growth of Vigna unguiculata and Phaseolus vulgaris. (Submetido).

Rolland, F. & Sheen, J. (2005). Sugar sensing and signalling networks in plants. Biochemical Society Transactions, 33: 269-271.

Saiardi, A.; Bhandari, R.; Resnick, A.C.; Snowman, A.M. & Snyder, S.H. (2004). Phosphorylation of Proteins by Inositol Pyrophosphates. Science, 306: 2101-2105.

Sales M.P.; Gerhardt I.R.; Grossi-de-Sá M.F. & Xavier-Filho J. (2000). Do legume storage proteins play a role in defending seeds against bruchids? Plant Physiology, 124: 515-522.

Salon, C., Raymond, P., & Pradet, A. (1988). Quantification of carbon fluxes through the tricarboxylic acid cycle in early germinating lettuce embryos. Journal of Biological Chemistry, 263: 12278-12287.


Souza, S. C. (2010) 70

Samaj, J.; Baluska, F. & Hirt, H. (2004).Endocytosis, Actin Cytoskeleton, and Signaling. Journal of Experimrntal Botany, 55: 189-198.

Saman, P.; Vázquez, J.A. & Pandiella, S.S. (2008). Controlled germination to enhance the functional properties of rice. Process Biochemistry, 43: 1377-1382.

Sanchez de Jiménez, E.; Beltrán-Penã, E. & Ortiz-López, A. (1999). Insulin-stimulated ribossomal protein synthesis in maize embryonic axes during germination. Physiology Plantarum, 105: 148-154.

Sanchez de Jiménez, E.; Beltrán-Penã, E. & Ortiz-López, A. (1999). Insulin stimulated ribossomal protein synthesis in maize embrypnic axes during germination. Physiology Plantarum, 105: 148-154.

Schlereth, A.; Becker, C.; Horstmann, C.; Tiedemann, J. & Muntz, K. (2000). Comparison of globulin mobilization and cysteine proteinases in embryonic axes and cotyledons during germination and seedling growth of vetch (Vicia sativa L.). Journal of Experimental Botany; 51: 1423-1433.

Schwartz, M.A. & Madhani, H.D. (2004). Principles of MAP kinase signaling specificity in Saccharomyces cerevisiae. Annual review of genetics, 38: 725-748.

Shaver, A; Ng, J.B.; Hall, D.A. & Posner, B.I. (1995). The chemistry of peroxovanadium compounds relevant to insulin-mimesis. Molecular and Cellular Biochemistry, 153: 5-15.

Sheng, Q.; Yao, H.; Xu, H.; Ling, X. & He T. (2004). Isolation of plant insulin from Momordica charantia seeds by gel filtration and RP-HPLC. Journal of Chinese medicinal materials, 27: 414-416.

Shutov, A.D., Karhovskaya, I.A., Braun, H., Baümlein, H. & Müntz, K. (1995). Legumin-like and vicilin-like seed storage proteins: evidence for a common single-domain ancestral gene. Journal of Molecular Evolution, 41: 1057-1069.

Silva, L.B. (2006). Estudo das funções de insulina em plantas. Tese de Doutorado - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Biociências e Biotecnologia, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro.

Silva, L.B.; Azevedo, C.R.; Lopes, M.A.C.; Venâncio, T.M.; Cavalcante, C.P.; Uchôa, A.F.; Astolfi-Filho, S.; Oliveira, A.E.A.; Fernandes, K.V.S. & Xavier-Filho, J. (2002). The leaves of green plants as well as cianobacterium, a red alga, and fungi contain insulin-like antigens. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 35: 297-303.

Silva, L.B.; Sales, M.P.; Oliveira, A.E.A.; Machado, O.L.T; Fernandes, K.V.S. & Xavier-Filho, J. (2004). The seed coat of Phaseolus vulgaris interferes with the development of the cowpea weevil [Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Bruchidae)]. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 76: 57-65.

Singh, B. & Wort, D.J. (1969). Effect of vanadium on growth, chemical composition, and metabolic processes of mature sugar beet (Beta vulgaris L.) plants. Plant Physiology, 44: 1321-1327.

Singh, B.B. (1971). Effect of vanadium on the growth, yield and chemical composition of maize ( Zea Mays L.). Plant and Soil, 34: 209-212.

Smith, J.I.; Smart, N.J.; Misawa, M.; Kurz, W.G.W.; Tallevi, S.G. & DiCosmo, F. (1987). Increased accumulation of indole alkaloids by some cell lines of


Souza, S. C. (2010) 71

Catharanthus roseus in response to addition of vanadyl sulphate. Plant Cell Reports, 6: 142-145.

Souza, S.C. (2007). Efeitos de D-pinitol sobre as reservas energéticas durante a germinação e desenvolvimento pós-germinativo. Monografia - Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Biociências e Biotecnologia, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro.

Sperelakis N. 1994. Cell Physiology. Academic Press, Inc., San Diego, 738 pp.

Tangphatsornruang, S.; Naconsie, M.; Thammarongtham, C. & Narangajavana, J. (2005). Isolation and characterization of an α-amylase gene in cassava (Manihot esculenta). Plant Physiology and Biochemistry, 43: 821-827.

Tárrago, J.F. & Nicolas, G. (1976). Starch degradation in the cotyledons of germinating lentils. Plant Physiology, 58: 618-621.

Tena, G. & Renaudin, J.P. (1998). Cytosolic acidification but not auxin at physiological concentration is an activator of MAP kinases in tobacco cells. Plant Journal, 16: 173-182.

Tena, G.; Asai, T.; Chiu,W.-L. & Sheen, J. (2001). Plant MAP kinase signaling cascades. Current Opinion in Plant Biology, 4: 392-400.

Tetlow, I.J. (2006). Understanding storage starch biosynthesis in plants: a means to quality improvement. Canadian Journal of Botany, 84: 1167-1185.

Thompson, K.H. & Orvig, C. (2006). Vanadium in diabetes: 100 years from Phase 0 to Phase I. Journal of Inorganic Biochemistry, 100: 1925-1935.

Thompson, K.H. (1999). Vanadium and diabetes. BioFactors, 10: 43-51.

Tiedemann, J.; Neubohn, B. & Müntz, K. (2000). Different functions of vicilina and legumin are reflected in the histopatter of globulin mobilization during germination of vetch (Vicia sativa L.). Planta, 211: 1-12.

Towbin, H.; Staehelin, N.T. & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets; procedures and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 176: 4350-4354.

Upadhyay, M.K.; Sharma, R.; Pandey, A.K. & Rajak, R.C. (2005). An improved zymographic method for detection of amylolytic enzymes of fungi on polyacrylamide gels. Mycologist, 19: 138-140.

Van der Maarel, M.J.E.C.; Van der Veen, B.; Uitdehaag, J.C.M.; Leemhuis, H. & Dijkhuizen, L. (2002). Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family. Journal of Biotechnology, 94: 137-155.

Vanhaesebroeck, B. & Alessi, D.R. (2000). The PI3K-PDK1 connection: more than just a road to PKB. Biochemical Journal, 346: 561-576.

Venâncio, T.M.; Oliveira, A.E.A.; Silva, L.B.; Machado, O.L.T.; Fernandes, K.V.S. & Xavier-Filho, J. (2003). A protein with sequence homology to bovine insulin is found in the legume Vigna unguiculata (cowpea). Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 36: 1167-1173.


Souza, S. C. (2010) 72

Wang, J.; Li, Y.; Lo, S.W.; Hillmer, S.; Sun S. S.M.; Robinson, D.G. & Jiang, L. (2007). Protein mobilization in germinating Mung bean seeds involves vacuolar sorting receptors and multivesicular bodies. Plant Physiology, 143: 1628-1639.

Wang, J.F. & Liu, Z. (1999). Effect of vanadium on the growth of soybean seedlings. Plant and Soil, 216: 47-51.

Wang, X. & Proud, C.G. (2006).The mTOR pathway in the control of protein synthesis. Physiology, 21: 362-369.

Xavier-Filho, J.; Oliveira, A.E.A.; Silva, L.B; Azevedo, C.R.; Venâncio, T.M.; Machado, O.L.T.; Oliva, M.L.; Fernandes, K.V.S. & Xavier-Neto, J. (2003). Plant insulin or glucokinin: a conflicting issue. Brazilian Journal of Plant Physiology, 15: 67-78.

Yamada, S; Katsuhara, M.; Kelly, W.B.; Michalowski, C.B. & Bohnert, H.J. (1995). A family of transcripts encoding water channel proteins: tissue-specific expression in the common ice plant. Plant Cell, 7: 1129-1142.

Yamakawa, H.; Katou, S.; Seo, S.; Mitsuhara, I.; Kamada, H. & Ohashi, Y. (2004). Plant MAPK Phosphatase Interacts with Calmodulins. The Journal of Biological Chemistry, 279: 928-936.

Yeh, C-M.; Chien, P-S. & Huang, H-J. (2007). Distinct signalling pathways for induction of MAP kinase activities by cadmium and copper in rice roots. Journal of Experimental Botany, 58: 659-671.

Zeeman, S.C.; Kossmann, J. & M. Smith, A.M. (2010). Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants. The Annual Review of Plant Biology, 61:1-26.

Zhu, Z-P.; Hylton, C.M.; Rössner, U. & Smith, A.M. (1998). Characterization of starch-debranching enzymes in Pea embryos. Plant Physiology, 118: 581-590.

WEB-SITES

http://plantsdatabase.com/members/Horseshoe/ acessado em 14/05/2008

http://pt.wikipedia.org/wiki/Canavalia acessado em 21/09/2009

Documents

Análise das alterações metabólicas de Canavalia ensiformis ... · DNS Ácido 3,5-dinitrossalicílico DTT Ditiotreitol ELISA Enzime Linked Imuno Assay EPACE-10 Genótipo de Vigna