UNIFIL - CENTRO UNIVERSITÁRIO FILADÉLFIACOLEGIADO DE BIOMEDICINA

BIOLOGIA MOLECULAR

APOSTILA DE NOÇÕES BÁSICAS EMBIOLOGIA MOLECULAR

Prof. Thiago Cezar Fujita

Londrina - PR.

2011

INTRODUÇÃO

Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido

significantemente para o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de

recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários

genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos

microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular

(principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também

apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no

diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas

entre as espécies ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os

testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de

allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e

outros.

Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como

serão descritas as aplicações da técnica de PCR e de outras tecnicas moleculares nos

diagnósticos clínico e nos testes de identificação.

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA)

As informações genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de

ácidos nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é

encontrado principalmente nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está

presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos.

Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é

constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato

(PO4=). Há dois tipos de açúcar nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA

(Figura 1A). As bases nitrogenadas são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e

as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contém A, C, G e T, enquanto que o RNA

contém U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos estão ligados formando uma

longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre o grupo fosfato

do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 1B).

Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o

DNA é composto de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria,

sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). As ligações covalentes do esqueleto de

açúcar-fosfato localizam-se na parte externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão

projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molécula de DNA segue uma

sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na segunda cadeia, de

modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina

sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura

tridimensional de dupla hélice, onde o ângulo e a distância entre um nucleotídeo e outro é

sempre constante.

(A) (B)

O

OH

OH

4

5

C H2OH

3 2

1

2-deoxiribose

1

23

C H2OH

5

4

OH

OH

O

OH

ribose

(C)

5’ fosfato 3’ hidroxila

OC H 2

P

P

C H 2 O

OC H 2

P

P

C H 2 O

A

G

T

C

T

C

A

G

O C H 2

P

P

C H 2O

O C H 2

P

P

C H 2O

OH

OH

3’ hidroxila 5’ fosfato

Figura 1. Características estruturais das moléculas dos ácidos nucleicos. (A) Molécula do açúcar. (B) Representação diagramática do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotídicas do DNA. P representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molécula de DNA mostrando as pontes de hidrogênio.

E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molécula de DNA a relação entre as purinas e

pirimidinas era constante na maioria das espécies animais, ou seja, a quantidade da purina,

adenina, é igual a da pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina é

igual à da pirimidina citosina. Essa característica importante é definida pela propriedade fisico-

química das moléculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante

afinidade (força de atração de Van Der Waals), somada à força de atração entre os átomos de

cargas opostas (ligações iônicas ou pontes de hidrogênio). Essas propriedades são bastante

específicas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultânea com significante

energia de interação, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de

CHARGAFF se baseia na especificidade da interação das bases puricas e pirimidicas, onde a

citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila.

É importante salientar que a ligação entre a A e T ou U ocorre por interação de 2 pontes de

hidrogênio, enquanto que entre a C e a G a ligação se dá por 3 pontes de hidrogênio (ligação

mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases; a sequência de uma

das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra (cadeia complementar).

A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick

em 1953, está disposta linearmente. Entretanto, pode ser também circular como nas bactérias,

plasmídeos e certos vírus, e pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos.

Entretanto, a disposição da molécula de DNA nos organismos superiores é de particular

importância, onde a informação genética está amplamente concentrada nos cromossomas

dentro do núcleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm,

entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é compactado na

forma super-enrolada em vários níveis: primário, duplex; secundário, ao redor das proteinas

ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; terciário, enrolado com os

nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternária, formando

voltas ou “loops”. Esta disposição super-enrolada é a forma natural do DNA.

Propriedades dos ácidos nucleicos

Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e

químicos. Em condições fisiológicas, a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. No

entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos

(menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo

de dissociação, desnaturação ou “melting”. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas

simples a condições de associação (temperatura a 65C, ou pH próximo de 7,0) por algumas

horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da

complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente

complementares. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação,

hibridização ou “annealing”. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais

para manipulação dos ácidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo

enormemente para o isolamento, comparação e identificação desses compostos. Outra

propriedade física muito importante dos ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver

energia na região do ultravioleta, apresentando o pico de absorbância máxima em 260 nm.

Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a pureza dessas

substâncias.

REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO

Replicação

Toda vez que uma célula se divide, todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na

íntegra, transmitindo em absoluto as informações genéticas contidas na célula precursora, esse

processo denomina-se replicação. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa, com as

duas cadeias precursoras (DNA de dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a síntese da

nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a replicação ocorrer é necessário que dupla fita

precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA). Esse é um

processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma proteina DNA-

específica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma

independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de

replicação é utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela

ação catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora

e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com

a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3',

a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a

outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela

enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção

da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim

como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além

da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica ou "a correção de leitura" na

qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é

fundamental para a manutenção a integridade da sequência original.

Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas.

Transcrição

A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA.

Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica

ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações

genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma

molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e

que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese de mRNA é conhecido por

transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que

o ácido nucleico codifica.

Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de

mRNA para cada gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por

uma sequência específica denominada promotor, localizada antes (“upstream”) da sequência

a ser transcrita, que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA).

Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à

extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5’ - 3’.

Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de

DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA

ribossômico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica.

O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue,

portanto, a direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição

reversa, na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada

transcriptase reversa. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus.

Figura 3. Representação da molécula de DNA e RNA durante a transcrição: Apenas uma das fitas de DNA serve de moldo para síntese da fita de RNA.

Tradução

A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da

proteina correspondente é denominada código genético. Esse código é universal e é

encontrado em todos os organismos vivos. O código genético é lido em grupos de três

nucleotídeos, cada um codificando um aminoácido (Tabela 1). Cada sequência de

trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons que codifica um polipeptídeo

específico é denominada cistron.

Tabela 1. O código genético

1a.base(5’) 2a. base 3a.base (3’)U C A G

U Phe Ser Tir Cis UPhe Ser Tir Cis CLeu Ser Terminação Terminação ALeu Ser Terminação Trip G

C Leu Pro His Arg ULeu Pro His Arg CLeu Pro Glu Arg ALeu Pro Glu Arg G

A Isoleu Treo Asp Ser UIsoleu Treo Asp Ser CIsoleu Treo Lis Arg AMet* Treo Lis Arg G

G Val Ala AcAsp Gli UVal Ala AcAsp Gli CVal Ala AcGlu Gli AVal Ala AcGlu Gli G

* codon de iniciação

O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de

mRNA dirige a síntese proteica é denominado tradução. Esse processo envolve o mRNA, o

rRNA e o RNA de transferência ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90

nucleotídeos em comprimento e é de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro

da molécula, adquire a forma de uma folha de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotídeo

de sequência variável forma o anti-codon que pode parear com um codon da molécula de

mRNA. Na outra extremidade da molécula de tRNA está uma sequência para ligação a um

aminoácido específico. Portanto, um codon particular no mRNA é relacionado através de um

tRNA a um dado aminoácido. Na tradução, o ribossoma liga-se primeiramente a um sítio

específico na molécula de mRNA (codon de iniciação, ATG) que ajusta a fase de leitura

("reading frame"). O ribossoma, então, se movimenta ao longo da molécula de mRNA,

traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminoácios ao final da cadeia

polipeptídica em alongamento. A tradução é finalizada quando o ribossoma reconhece na fita

de mRNA o codon de terminação ("stop codon"). A direção da leitura é de 5’-3’, sendo que a

sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da

proteina traduzida na direção do N-terminal para o C-terminal.

Em princípio as sequências de bases nos ácidos nucleicos devem ser traduzidas em

qualquer fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificação se inicia.

Para uma dada sequência UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as três fases de leitura possíveis são :

UUA GCA AAG CUG CGA A

UAG CAA AGC UGC GAA U

AGC AAA GCU GCG AAU G

Entretanto, o código genético não se sobrepõe, pois a fase de leitura é ditada pelas sequências

de iniciação e de terminação da tradução presentes na molécula de mRNA. A fase de leitura

pode ser alterada por mutações que removem ou inserem bases na sequência nucleotídica.

Esse tipo de alteração é conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a

perda total da função da proteina produzida.

DNA RNA ProteinasReplicação

Transcrição

Transcrição reversa

Replicação e Transcrciçãodo RNA

Tradução

Fluxo da informação genética intracelular

ORGANIZAÇÃO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E

VIRAL

Estrutura Gênica

Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequência de

nucleotídeos na qual estão dispostos muitos genes. O gene é uma unidade de herança

constituida por uma sequência nucleotídeos que carrega as informações necessárias para a

síntese de um dado polipeptídeo. O gene é uma entidade estável mas pode sofrer mutações,

sendo que a nova forma do gene é herdada de modo estável, exatamente como a forma que

lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, denominadas alelos, que

determinam a expressão de alguma característica particular.

Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genômico não é

totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplóide (gamético)

humano compreende 3 x 106 kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento,

deveria haver 1 milhão de genes, mas somente 3000 locos de doença foram identificados.

Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as características normais como

altura e inteligência, uma grande porção do DNA genômico não tem função definida.

Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funções importantes, incluindo o

controle de ação gênica.

Genes que são responsáveis pela síntese de enzimas específicas ou peptídeos são

denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os

efeitos dos genes estruturais.

Controle da expressão gênica

Nas células existem mecanismos moleculares que controlam o número e a quantidade

das proteinas produzidas. As diferenças na síntese proteica resultam de sinais moleculares que

controlam as taxas em que as moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA (controle

transcricional) ou traduzidas (controle traducional)

Processamento pós-transcricional do mRNA

A transcrição e a tradução nos procariotos são processos concomitantes mas nos

eucariotos são processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos

eucariotos a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. Durante a passagem do

núcleo para o citoplasma, o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado

para que seja obtido o mRNA maduro.

Nos procariotos, a sequência de nucleotídeos do gene é colinear com a sequência de

aminoácidos de uma dada proteína, entretanto, nos eucariotos a sequência codificante é

geralmente interrompida por sequências adicionais.

A maioria dos genes dos eucariotos são compostos por regiões codificadoras

denominadas exons e regiões não-codificadoras denominadas introns. Estes introns são

sequências posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primário. Esse

processo é denominado processamento do RNA ou “RNA splicing”. Após a remoção dos

introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA extremidade 3’ do mRNA,

conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 resíduos de

adeninas ligadas à extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-

A polimerase. Antes que ocorra a remoção dos introns, o mRNA sofre a adição de resíduos de

7-metil-guanosina (Caps) na extremidade 5’, denominada metilação Cap. Esse processamento

sofrido pelo mRNA torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o

citoplasma. Entretanto, mutações que ocorrem nas regiões de junção dos exons podem

modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma proteína

diferente da original.

Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes, que são

processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos

em polipeptídeos diferentes. Esse processo é denominado processamento alternativo

(“alternative splicing”) e ocorre no mesmo tecido mas em diferentes estágios de

desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes tecidos.

Estrutura gênica dos procariotos

Existem regiões específicas no DNA, denominadas promotores que identificam o sítio

de início da transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a

transcrição).

Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via

metabólica são adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos

junto com sequências regulatórias. Este conjunto é denominado operon, sendo que a

sequência que regula a expressão desses genes é denominada operador. O operador

encontra-se antes (“upstream”) da sequência do promotor, nas posições de -35 a -10 antes do

início da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulação destes operons obedece a

condições nutricionais ou ambientais. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à

presença de um substrato particular é denominada indução. A lactose, por exemplo, pode

servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato

depende da hidrólise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase.

A presença de lactose (indutor) induz a síntese de -galactosidase por ativação do operon da

lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligação da RNA polimerase ao DNA e a taxa de

síntese do mRNA da -galactosidase. Na ausência do indutor o operon é reprimido pela ação

do repressor. O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador, bloqueando a

ligação da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a síntese de mRNA que codifica para

a galactosidase.

Estrutura gênica dos eucariotos

Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição

deve iniciar-se e, possivelmente, controlam o nível de expressão do gene associado.

Geralmente estão localizados cerca de 30 bases “upstream” do codon de iniciação (ATG) e

ompreendemsêquencias denominadas “boxes” ou “motifs”. As mais frequentes são as TATA,

CAT e CG “boxes.

Além dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias

adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes

do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de

transcrição. É importante salientar que estes amplificadores não são específicos e potenciam a

transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de

um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos

amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes.

O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que são replicas de

genes ativos mas não produzem um produto reconhecível, geralmente ocorrem devido a

mutações acumuladas no gene.

Transposons são elementos genéticos móveis que se deslocam de uma região para

outra do genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localização

destes segmentos de DNA no genoma é instável. Estes transposons contém os genes que

codificam para as enzimas necessárias à sua inserção e para remobilização para outro sítio.

Geralmente, a inserção de um transposon produz mutação ou rearranjo cromossômico variável

que abole a função do gene que recebe esse elemento móvel.

Polimorfismo de DNA

A análise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de

sequências entre os indivíduos. Mini e microsatélites são sequências curtas, repetidas

consecutivamente, que estão distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando

cerca de 40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instáveis durante a

replicação do DNA de geração para geração. A consequência é que o número de repetições

dentro de uma sequência varia largamente entre os indivíduos. Em função dessa variabilidade

(polimorfismo de DNA), cada indivíduo, exceto gêmeos idênticos, terá um padrão ou perfil de

DNA pessoal (“Fingerprinting”). Esses perfis são usados para estabelecer a identidade dos

indivíduos em diversas situações.

As sequências de microsatélites mais comuns no DNA humano são CA ou GT,

dependendo de qual das fitas de DNA está sendo lida, pois há milhares dessas sequências

espalhadas no DNA humano. O tamanho da repetição pode ser muito variável e pode fornecer

excelentes marcadores genéticos para estudar o comportamento fenotípido das famílias. A

maioria dessas sequências repetitivas não produz efeito deletério, entretanto foi demonstrado

que uma forma de retardo mental em homens, a síndrome do X frágil, é causada pela

expansão de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repetições. Verificou-se também que

disturbios neurológicos na distrofia miotônica e na doença de Huntington, estão associados a

alterações no tamanho dos microsatétiles. Esta descoberta forneceu a base científica para o

fenômeno de antecipação no qual os disturbios genéticos tornam-se mais severos nas

gerações subsequentes.

IMPORTÂNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR

Muitas enzimas que atuam na replicação e transcrição tem sido purificadas e a sua

atividade biológica usada in vitro para reações moleculares específicas diretas. A maioria

dessas enzimas é isolada de bactérias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas são

utilizadas das mais diversas formas, a saber: clonagem e amplificação de genes de interesse,

preparo de sondas de ácidos nucleicos, ensaios de hibridização, entre outras aplicações.

As nucleases representam uma categoria de enzimas específicas de ácidos nucleicos

que hidrolizam as ligações fosfo-diester dos polímeros de ácidos nucleicos, uma de cada vez.

As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com

especificidade de 3' para 5', ou podem atuar somente em ligações internas (endonucleases).

As nucleases podem ser específicas para DNA ou RNA. As nucleases DNA-específicas podem

catalizar apenas cadeias únicas (por exemplo, a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I).

As endonucleases de restrição são nucleases encontradas naturalmente em

bactérias e são denominadas enzimas de restrição porque restringem sua atividade a DNA

estranhos. O DNA do hospedeiro não é atacado porque os sítios vulneráveis a suas próprias

enzimas são protegidos por um processo denominado metilação do DNA. Cada enzima é

designada de acordo com o organismo do qual é derivada. A EcoRI, por exemplo, é uma

enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo isolada. A maioria

das enzimas de restrição reconhecem sequências de 4, 5 ou 6 nucletídeos. Muito poucas

reconhecem sequências maiores. Algumas são denominadas isosquisomeros, por clivar em

diferentes sítios dentro de uma mesma sequência (Ex. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo sítio

mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras enzimas

reconhecem diferentes sequências com o mesmo sítio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para

cada região da molécula de DNA onde a sequência específica ocorre, a enzima de restrição

corta ambas as cadeias de forma reprodutível, formando extremidades assimétricas ou

coesivas (“stick-end”) ou simétricas ou cegas (“blunted-end”). Estas enzimas são utilissímas

para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutíveis e para preparar DNA

de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem.

As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicação, catalizam a formação de

ligações fosfo-diester entre dois segmentos de ácidos nucleicos. As DNA ligases requerem a

presença de um molde complementar, no entanto, as RNA ligases não tem essa exigência para

o processamento do mRNA.

As Polimerases catalizam a síntese do polímero de ácido nucleico complementar

usando uma cadeia precursora como molde. Essas enzimas são fundamentais para a

clonagem e ampificação de genes. A Taq DNA polimerase, por exemplo, é uma enzima

extremamente útil para a amplificação do DNA in vitro pela reação de polimerização em cadeia

(PCR).

A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovírus, cataliza a síntese de DNA a

partir de moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos vírus,

mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de

DNA a partir de mRNA. A transcrição reversa constitui-se um método útil para produzir uma

copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o

genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biológicas utilizando esse método.

PRINCÍPIOS DE ELETROFORESE

INTRODUÇÃO

Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas com

cargas em solução, sob ação de um campo elétrico. Portanto, qualquer partícula ou molécula

carregada pode se mover nessas condições, e consequentemente podem ser separadas,

desde que tenham diferentes cargas.

A separação eletroforética das partículas pode ser realizada em meio líquido(eletroforese livre

de Tisellius) ou em um suporte inerte.

A carga eletrica aplicada sob a solução é realizada através de eletrodos que são

colocadas na solução. Um ion migra através da solução na direção ao eletrodo de carga

oposta. Portanto, uma partícula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo

(catodo), enquanto as partículas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).

PRINCÍPIOS BÁSICOS DA ELETROFORESE

Terminologia:

ânion: partícula carregada negativamente ou íon

cátion: partícula carregada positivamente

tampão: Uma mistura de substâncias que doam e aceitam proton com a função de manter a

concentração do proton (pH) constante ou dentro de um valor próximo. Um tampão pode ser

feito com uma mistura de um ácido fraco com o respectivo sal. Ex: ácido acético e acetato de

sódio.

Condutividade: a propriedade de uma substância conduzir a corrente elétrica. Numa solução

iônica, a soma do produto da concentração da carga e a mobilidade da mesma.

eletrodos: substâncias em contato com um condutor. A substância estão conectadas a fonte

elétrica.

Fonte elétrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contínua, que

possa ser controlada por um potenciometro, que permite variar a tensão, a corrente, a carga

elétrica que se quer aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir a tensão elétrica (em

Volts), a corrente elétrica(Amperagem), e a potência elétrica (Watts).

eletro-osmose; tendência da solução se mover em relação a uma substâncias estacionária

adjacente, quando uma diferença de potencial é aplicada.

força iônica: É a soma da concentração de todos ions na solução, medido pelo quadrado de

suas cargas.

mobilidade: a velocidade de uma partícula ou ion que é dado pela voltagem aplicada. Uma

medida relativa de quanto rápido um ions se movimenta em um campo elétrico.

Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substância sob certas condições. Geralmente é

menor que a mobilidade devido a menor carga, ou resistência do suporte ou meio.

poder de resolução: E’ a habilidade de separar substâncias que migram muito próximas.

gel: É uma malha de fibras, ou de polímeros que é sólida, mas retém uma grande quantidade

de solventes nos poros ou nos canais internos das malhas.

FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAÇÃO E MOBILIDADE

ELETROFORÉTICA

A aplicação de um campo elétrico a uma solução que contém partículas carregadas

pode separá-los. A separação depende de vários fatores que influenciam e que podem ser

resumidas em: Força aplicada nas partículas (voltagem), carga da partícula, pH do meio,

condutividade do meio, resistência da matrix, conformação da partícula, força iônica do meio,

temperatura, eletroendosmose, etc

1. Força na partícula

A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico, voltagem ou

volts por centímetro, e a carga da partícula, Q. A força sob a partícula carregada é o produto:

Feletrica=QV

A força elétrica, Feletrica, quando exercida na partícula, causará o seu movimento. No

entanto, o movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência,

devido a viscosidade, a resistência, a qual exerce uma força é proporcional a velocidade:

Fresistência= fv

A constante de proporcionalidade, f é chamada de coeficiente de fricção (medida de

resistência de uma partícula oferece quando em movimento em um solvente).

2. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da

partícula Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais

assimétrica a partícula, menor seu movimento através do solvente. O coeficiente de fricção de

uma grande partícula tais como proteinas é uma propriedade característica de cada elemento.

3. Mobilidade da partícula

Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada, ela inicia a

migração. A força eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra, e a velocidade dessa

aumenta até as forças se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula

alcança em um campo elétrico, V, é determinado por duas propriedades das partículas - sua

carga e seu coeficiente de fricção. Consequentemente, o valor de v/V é também uma

propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu próprio

nome: mobilidade.

4. Efeito do pH do meio

Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a solução

contém uma substância a qual o pK é próximo do pH do meio, esta substância ocorre em

ambas as formas: a carregada e a não carregada.

A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução.

Quando o pH é igual ao pK de um ácido fraco, somente 50% das partículas estarão

carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partículas estarão sob a forma

carregada. Desde que a carga efetiva de uma substância varia com o pH, a sua mobilidade

efetiva também varia com o pH.

O pH da solução é escolhido de tal forma, que a partícula a ser separada pela

eletroforese, se mantenha em um estado máximo de carga, para sua máxima separação. Os

tampões são substâncias iônicas por si, portanto, exercem a função de manterem o pH o mais

próximo possível da ideal e fazem parte do processo.

5. Condutividade e movimento dos íons

Em qualquer sistema elétrico, a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada;

V = resistência X Corrente ou V = corrente___condutividade

Na eletroforese, a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). A condutividade é

a soma das concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um

íon com maior mobilidade efetiva carreia uma maior fração da corrente

A voltagem, condutividade, e a corrente portanto estão todos relacionados. Se a

condutividade está aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém

constante, a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica, Feletrica,

nas partículas carregadas, diminuindo o movimento das macromoléculas. O aumento do tempo

seria necessário para uma separação, e a resolução diminui devido ao aumento da difusão. Se

a condutividade está aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto

aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento é proporcional ao

quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas soluções, a

qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. Desde que

o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério,

resultados ótimos podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a

condutividade em valores moderados.

6. Carga e conformação

Como já se discutiu, o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula

que se quer separar. Muitas vezes, a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua

conformação estérica, portanto, pode-se alterar a carga de uma partícula dependendo de sua

conformação, principalmente em se tratando de macromoléculas. As macromoléculas, em seu

estado relaxado, tendem a apresentar alguns eletrólitos ligados fortemente, portanto levando a

uma alteração na sua mobilidade.

7. Atmosfera iônica e o potencial zeta

Contra-íons, ou íons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar próximos a

grupos carregados das macromoléculas. No entanto, eles não chegam a neutralizar as cargas

das macromolécuals mas, por sua vez estão localizados próximos dos grupos carregados das

macromoléculas, formando uma dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de

atmosfera iônica.

As macromoléculas movem-se com a camada de hidratação e com os contra ions. Esses

reduzem a carga efetiva das macromoléculas, a um nível dado pelo potencial zeta. Esse

potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromoléculas na superfície de

contato, que é a região limite do complexo macromolecular na solução e o material que o está

envolvendo.

8. Suportes

A grande meta da eletroforese é a separação de uma mistura heterogênea de

substâncias iônicas seja ela macromoléculas ou íons simples, em zonas completamente

identificáveis. Os suporte devem permitir a penetração do material a ser separado o máximo

possível e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). A maioria dos suportes

oferecem esse princípio determinando o tamanho do poro para o movimento eletroforético das

macromoléculas. O tubo capilar também exerce esse efeito.

9. Eletroendosmose

O suporte não deve interagir com as moléculas a ser separadas, isso poderia impedir

ou inibir a separação. Uma interação comum que pode ocorrer, não é a adsorção usual do

material. Mais comumente é o efeito dos grupos carregados que estão ligados ao suporte, que

resulta em eletro-endosmose. Como exemplo típico temos o suporte ágar, que é muito utilizado

na eletroforese. O ágar é uma mistura de agarose e agaropectina. A agaropectina tem um

número relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro tem contra-íons. Se o

campo elétrico for aplicado, os contra-íons irão se mover, mas o grupo carboxil ligados a matrix

(agar) não migrarão. Os contra-íons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo

significativo nesta direção, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes é

denominado de endosmose.

TIPOS DE SUPORTE

Os tipo de suporte podem variar desde uma solução de sacarose até em substância pouco

solúveis como fibras de celulose. Os suportes de meio contínuo mais comuns são: agar,

agarose, poliacrilamida e amido.

A porosidade ou a média do tamanho do poro em alguns suportes é fixo. Entretanto, em alguns

suportes podem ser controlados. Como exemplo, a mudança da concentração do gel de

agarose, agar e amido, pode mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de

poliacrilamida mais utilizados para macromoléculas está em torno de 5% a 10%, que separam

proteínas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do

poro como por carga elétrica.

TIPOS DE ELETROFORESE.

a. Dependendo da matrix

Eletroforese livre de Tiselius

Eletroforese em acetato de celulose

Eletroforese em gel de agar

Eletroforese em gel de agarose

Eletroforese capilar

b. pH de separação

pH ácido

pH neutro

pH alcalino

APLICAÇÕES DA ELETROFORESE NAS TÉCNICAS MOLECULARES

1. Gel de Agarose

Um dos métodos eletroforéticos mais comuns utilizados na prática diária em biologia

molecular é a de gel em agarose. Essa técnica muito simples, rápida, prática e apresenta boa

resolução na separação dos fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais

demoradas como a separação por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose.

Uma boa separação eletroforética do DNA utilizando gel de agarose depende de vários fatores:

1.1. Tamanho molecular do DNA.

As moléculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do

peso molecular através do gel de agarose.

1.2. concentração da agarose.

O fragmento do DNA migra em diferentes proporção através do gel contendo diferentes

concentraçào da agarose. Existe uma relação linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a

concentração do gel que é baseada numa equação matemática(Helling e cols , 1974) figura 1.

Log=logo- Kr

Onde o é a mobilidade eletroforética livre e Kr é o coeficiente de retardamento, = a

constante que é relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molécula em

migração.

Baseada nessa correlação podemos separar várias moléculas de DNA (de variado

tamanho) nas diferentes concentrações de agarose.

Porcentagem de agarose intervalo da efficiência da separação da molécula de

DNA em Kb

0,3% 5 a 60

0,6% 1 a 20

0,7% 0,8 a 10

0,9% 0,5 a 7

1,2% 0,4 a 6

1,5% 0,2 a 4

2,0% 0,1 a 3

1.3. Conformação do DNA

A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III)

do DNA com a mesmo peso molecular migra através do gel de agarose em diferentes posições

(Thorne, 1966, 1967). A mobilidade relativa das 3 formas são dependentes primariamente da

concentração do gel, mas são também influenciados pela corrente aplicada, força iônica do

tampão e da densidade superhelicoidal da torção na forma I do DNA (Johnsom and Grossman ,

1977). Em algumas condiçoes, a forma I do DNA migra mais rápido que a forma III, em outras

condições pode ser de ordem inversa. Um método geral para identificar as diferentes

conformações do DNA é utilizar na corrida eletroforética em agarose diferentes concentrações

de brometo de etídio(concentração crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao

DNA. As torções superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vão sendo progressivamente

removida e seu índice de migração diminui. Numa concentraçao crítica do corante livre, onde

não permanece a forma superhelicoidal, o índice de migração da forma I do DNA esta no seu

mínimo valor. Se ainda mais brometo de etídio for adicionado, torções superhelicoidais

positivas são gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta rapidamente.

Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA são diferentemente

diminuidas como consequência da neutralização da carga e da maior tenacidade é dada ao

DNA pelo brometo de etídio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentração critica do

brometo de etídio livre é de 0,1 a 0,5 g/ml

A corrente aplicada: A baixa voltagem, a razão da migração dos fragmentos de DNA linear é

proporcional a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga elétrica aumenta, a

mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa

maneira o intervalo efetivo da separação do gel de agarose decresce a medida que a voltagem

aumenta. Para obter a máxima resolução dos fragmentos de DNA, o gel deve ser submetido a

uma corrente de no máximo 5V/cm

Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de

agarose não é significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela

temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletroforética

dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não muda entre 40C a 300C. Em geral, os geis

de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentrações

muito baixas (0,5%) os géis são pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas

temperaturas, pois esses géis ganham mais firmeza, da mesma forma os géis de agarose de

baixo ponto de fusão(“low melting” agarose).

1.4. Tampões utilizados

Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação

eletroforética de DNA.

TAMPÕES CONCENTRAÇÃO FORMULAÇÃO

Tris-acetato (TAE) 0,04M Tris acetato

0,01M EDTA

50X 242g tris base

57,1 ml ácido acético

100ml EDTA 0,5M(pH8,0)

Tris-fosfato (TPE) 0,08M Tris-fosfato

0,002M EDTA

10X 108 g Tris Base

15,5ml de ac. fosfórico 85%

40ml EDTA 0,5M (pH8,0)

Tris-borato (TBE) 0,089M Tris borato

0,089M ac. bórico

0,002M EDTA

5X 54g Tris-base

27,5g ác. bórico

20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)

1.5. Tipos de Agarose

Muitos tipos de agarose estão disponíveis, o que se recomenda para uso diário é o tipo

II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de

polissacárides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases.

No entanto, a sua utilização é muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado

com sucesso nas clonagens e como substratos de reações com essas enzimas

1.6. Coloração do DNA em gel agarose

O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por

brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contém um grupo planar,

que intercala entre as bases do DNA. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases

causa uma ligação do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescência

comparada com o corante em solução sob a forma livre. A radiação UV absorvida pelo DNA a

260 nm é transmitida para o corante, ou a irradiação absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante

ligado propriamente dito, é emitido a 590nm na região da cor vermelho alaranjada, do espectro

visível.

O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla

fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa, e a

fluorescência emitida é fraca.

Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse

caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença

do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de

visualizar o gel durante a separação eletroforética, sem a necessidade de remover o gel do

suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da

coloração posterior basta imergir o gel numa solução de brometo de etídio, no próprio tampão

de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descoloração normalmente é

dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA é muito

reduzida, a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda

de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a

1mM por uma hora, a temperatura ambiente

1.7. Documentação:

O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia

instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem. O filme mais sensível para essa

finalidade é fornecida pela Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. Sob a luz UV de no mínimo

2500uW/cm2 e uma boa máquina , utilizando filtro laranja, expõe-se por alguns segundos.

Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma

velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho

do gel. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas.

2. Gel de poliacrilamida

O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para

separação e caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem

dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de

polimerização da acrilamida, que é o monômero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza

a reação de "cross linking" ou reação cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A

polimerização ocorre por ligação vinílica, sob ação de catalisadores, o perssulfato de amônia,

cuja fonte de radicais livres é o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxigênio é

um inibidor da reação. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reação

cruzada entre elas é dada pela bisacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado

pela concentração relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relação

entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel, que

darão subsídios para separação nesse tipo de gel.

O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem

ser preparados em uma variada concentração (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do

fragmento de interesse para a separação e identificação.

ACRILAMIDA (%) INTERVALO DE SEPARAÇÃO (NUCLEOTÍDEOS)

3,5 10-1000

5,0 80-500

8,0 60-400

12,0 40-200

20,0 10-100

Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois

necessita de um ambiente isento de oxigêncio para se polimerizar.

O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de

largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura

normalmente para DNA utiliza-se 0,75 a 1,5 mm.

REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)

PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR

A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica

que permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação

enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions

Mg++, e ocorre em 3 etapas: “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla

fita do DNA a ser amplificado), “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou

“primer” ao DNA a ser amplificado) e “extension”(extensão ou seja a polimerização

propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al.,

1.988):

1. Desnaturação - Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado

sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita

dupla de DNA em duas fitas simples. Este procedimento é chamado “Desnaturação” ou

“melting”, e muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e

depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento

DNA alvo ou de interesse.

2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funções, isto é, anexar as bases

complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um

fragmento de DNA já ligado na região previamente escolhida. A solução, então, é demarcar

as extremidades do DNA-procurado ou de interesse nas duas longas fitas simples,

tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, à solução, os “primers”

ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples,

oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que são sintetizados in

vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à

seqüência do segmento de DNA de interesse. O conhecimento da seqüência procurada é

naturalmente pré-requisito para a síntese dos “primers”. Os “primers” perseguem na reação

as regiões, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se às seqüências complementares

nas duas fitas simples (usualmente 5’). Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno

fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos “primers” descrito como

“Annealing” (do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 60

C).

3. Extensão - Quando os “primers” encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a

DNA-Polimerase pode assumir sua função. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de

DNA de fita dupla (resultado do anelamento do “primer”), incorporando um a um os

nucleotídeos correspondentes, isto é, as bases juntamente com as moléculas de açúcar e

fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples

e tornando-as duplas (extensão). A DNA-Polimerase não reconhece apenas o bloco de

início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos “primers” (3’ e 5’). Ela

inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do “primer”, completando a fita simples daí em

diante, portanto, sempre na direção do fragmento procurado.

Os fragmentos de DNA recém-formados fornecem mais moldes para a montagem de

novas fitas nos ciclos subseqüentes, no entanto, com região já determinada, resumindo, temos

uma reação em cadeia. Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um formando-

se 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que pode ser definida

matematicamente por:

N = número de moléculas amplificadasNo = número de moléculas iniciaisn = número de ciclos de amplificação

O modelo teórico considera que a eficiência do processo de amplificação corresponde

a 100%, o que não é observado na prática. Experimentalmente, a eficiência da reação está

abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente

após 20 ciclos têm-se cerca de um milhão; após 30 ciclos, cerca de um bilhão de cópias do

fragmento de DNA de interesse.

Automação da PCR

O procedimento da PCR foi tão aperfeiçoada desde a sua primeira descrição, que na

atualidade transcorre de forma totalmente automática. Uma importante condição para isto foi a

substituição da DNA-Polimerase originalmente utilizada (extraída de E. coli) por uma DNA-

Polimerase termoestável extraída da bactéria Thermus aquaticus (Taq-polimerase). Desta

forma, os vários ciclos transcorrem, seguidamente, em um único tubo de ensaio, sem

necessidade de interrrupção para a adição de nova DNA-Polimerase ativa. Todos os reagentes

necessários (o DNA-template, os “primers”, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) são misturados

com uma solução tampão que ajusta o pH ótimo da reação.

Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de

temperaturas. O operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a

amplificação. Um ciclo dura em média três minutos. Assim, em uma hora, podem ser

produzidas cerca de um milhão de cópias e, em menos de duas horas, cerca de um bilhão de

cópias da seqüência de DNA de interesse.

O produto amplificado pode alcançar aproximadamente 106 cópias em 30 ciclos e pode ser

realizado em 2 horas.

A PCR é uma ferramenta na biologia molecular tão poderosa quanto a descrição das

enzimas de restrição e o Southern blot. Anunciado na Conferência da Sociedade Americana de

Genética Humana de 1985, a técnica de PCR tem sido utilizada de forma multidisciplinar com

um número crescente de publicações por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600).

N = No 2n

Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando

a sua utilização. No entanto, é preciso salientar que para cada situação experimental, novas

modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é muito difícil descrever um único

procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, é fundamental o conhecimento básico

das etapas envolvidas na técnica, para um desenho experimental com sucesso.

A utilização de PCR é tão ampla que podem ser editados compêndios sobre a

metodologia de PCR em cada especialidade diagnóstica. Na aplicação diagnóstica e,

particularmente, na Microbiologia a atuação da biologia molecular é muito ampla, apesar de

estar ainda no cunho de afirmação e de uso restrito à pesquisa e ao ensino. Porém, muitas

doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro, que com certeza a única

solução está na PCR. A liberação para uso rotineiro no laboratório clínico ainda não é permitido

para toda as possíveis aplicações, no entanto, a necessidade de meios mais sensíveis e

precisos farão com que a técnica de PCR se torne uma ferramenta impressindível e quase

obrigatória no diagnóstico precoce de várias doenças, apesar do custo ainda estar um pouco

elevado.

A técnica de PCR é tão sensível que é capaz de amplificar uma simples

molécula de DNA e tal é a sua especificidade, que uma simples cópia de gene pode ser

extraida de uma mistura complexa da sequência genômica de forma rotineira e visualizada

como uma simples banda no gel de Agarose. Como se pode notar, a sensibilidade e a

especificidade que o método pode oferecer é algo singular. A PCR utilizando DNA polimerases

termoestáveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n

4.683.195, em julho de 1987 e n 4.683.202.

Saiki e cols, 1985, Mullis e cols,1986, Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas

aplicações do PCR para a comunidade científica e atualmente é inesgotável a sua aplicação

prática tanto na pesquisa básica como na aplicada.

Em termos práticos, podemos dizer que um protocolo geral pode ser seguido, mas com

a ressalva da necessidade da optimização para cada tipo de aplicação. Os principais

problemas citados na literatura para a padronização pode-se assim resumir: Não detecção do

produto, baixo rendimento do produto desejado, presença de bandas não específicas devido a

“mispriming” ou “misextension” dos “primers”, formação de dímeros dos “primers” que

competem pela amplificação com o produto desejado, mutação ou heterogeneicidade devido a

erro de incorporação.

Primer: é um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente

baseado na sequência já conhecida do ácido nucleico, geralmente sintetizado

quimicamente por instrumentos automáticos, que podem ser adquiridos no comércio

para fins já definidos ou se escolhe a região desejada do DNA ou RNA a ser

amplificada.

Sonda (probe): É um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas,

substratos antigenicos, substâncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem

ligar-se com alta especificidade a uma sequência complementar do ácido nucleico

alvo (escolhido).

PROTOCOLO GERAL PARA PCR

1. A reação pode ser realizada no volume de 100l ou 50l. Escolha o volume a ser usado.

2. Para o volume de 100l, colocar em um tubo de 0,5 ml com tampa com fechamento

hermético.

2.1. DNA a ser amplificado 105 a 106 moléculas(“target DNA” ou “Template”)

2.2. 20 pmol de cada “primer” (ou iniciadores,Tm>55C é preferido)

2.3. 20 mM Tris-HCl (pH8,3, 20C)

2.4. MgCl 2 1,5 mM

2.5. Kcl 25 mM

2.6. Tween 20 a 0,05%

2.7. 100g/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease

2.8. 50 M de cada dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

2.9. 0,2 a 2 unidades de Taq polimerase

3. Pré-incubar (se for DNA genômico) 10 minutos a 94o C

4. Programar o termociclo em:

Desnaturação: 96 C (pode variar de 94 a 96C), por 15 segundos a 2 minutos

Hibridização (Primer Annealing): 55 C (pode variar de 45 a 62C), por 30 segundos

a 2

minutos

Polimerização (Extension): 72C(pode variar de 55 a 72C) por 1,5 minutos

Extensão final do programa: de 25 a 30 ciclos, de 72C por 5 a 10 minutos

Estabilização e parada de reação: 4C ou adição de 10 mM de EDTA.

FATORES QUE INFLUENCIAM A PCR

1. Atividade enzimática da Taq polimerase

Se os outros componentes da reação estiverem optimizados, de 1 a 2,5 U são

suficientes para uma boa amplificação em 100l de volume total.

Quando em etapa de optimização, as quantidades da enzima a serem

utilizadas coompreendem o intervalo maior entre 0,5 a 5 U/100l. Obs: A quantidade de enzima

necessária varia com as características do “template” e do “primer.”

Se a concentração de enzima for muito alta, ocorre o aparecimento de produtos

inespecíficos que podem se acumular; e ao contrário, se baixo, a quantidade de produto

desejado será insuficiente.

A origem comercial da Taq polimerase é um importante fator, se a aquisição for de

vários fornecedores, pode-se obter resultados diferentes, devido as diferentes formulações,

diferentes condições de ensaio e pode diferir na definição da unidade.

2. Deoxinucleotídeo trifosfato:

Se a solução de uso for preparada a partir de solução estoque é necessário

neutralizar para pH 7,0, seguida de determinação espectrofotométrica da concentração. A

solução primária deve ser preparada a 10mM, distribuida em alíquotas e estocada a -20C. A

solução de trabalho recomendada é de 1mM de cada dNTP. A estabilidade dos dNTPs após os

vários ciclos de amplificação permanece em aproximadamente 50% da concentração inicial. Na

reação, a concentração recomendada varia de 20 a 200M para um resultado com boa

especificidade e reprodutibilidade. Deve-se utilizar as mesmas concentrações de dNTP ou

valores equivalentes, isto minimiza os erros de incorporação. Quanto menor a concentração de

dNTPs menor o risco de “mispriming” ou erro de incorporação de nucleotídeos. A quantidade

mínima recomendada é de 20M de cada dNTP para 100l de reação, quantidade suficiente

para sintetizar 2,6 g de DNA ou 10pmol de uma sequência de 400bp. Ultimamente se

estabeleceu que 2M foi capaz de dar uma alta sensibilidade de detecção e amplificação de

pontos de mutação do gene ras. De qualquer modo, para cada experimento deve-se encontrar

uma quantidade ótima.

3. Concentração de Magnésio.

A concentração de magnésio é bastante importante, pois afeta a

hibridização(“annealing”), a temperatura de separação do DNA alvo (“melting”), o produto de

PCR, a especificidade do produto, a atividade da enzima Taq, leva à formação de dimerização

de “primer”, prejudicando a fidelidade do experimento. A concentração dos ions Mg++ deve estar

entre 0,5 a 2,5 mM acima da concentração total do dNTPs. Sempre deve-se considerar a

concentração de EDTA na amostra que pode interferir na concentração dos íons Mg++.

4. Outros componentes

O tampão recomendado para o PCR é o TRIS-HCl na concentração de 10 a 50

mM com pH entre 8,3 a 8,8 medido a 20C. Este tampão dipolar tem um pKa de 8,3 a 20C e

um pKa de -0,0021/C, portanto, o pH verdadeiro de 20mM de TRIS pH 8,3 a 20C varia de 7,8

e 6,8 durante as condições de termociclagem.

Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reação para facilitar a

hibridaçào dos “primer”. O Cloreto de sódio a 50 mM, ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade

da Taq polimerase.

O DMSO (dimetilsulfoxido) é util para a reação de amplificação com Klenow

fragmento de E. coli DNA polimerase I; 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em

50%, apesar de Chamberlain e cols. o recomendarem para amplificação de sequências

multiplas, na mesma reação.

A gelatina, a proteína (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente não iônico

como o Tween 20(0,05-0,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos

protocolos tem dispensado a sua utilização.

5. HIbridação dos iniciadores (“Primer Annealing”)

A temperatura e tempo requerido para o hibridação de “primer ” depende da

composição em bases, do comprimento e da concentração. A temperatura básica aplicável

seria de 5C abaixo da Tm verdadeira dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa

abaixo do intervalo de temperaturas, a extensão dos primers ocorrerá em baixas temperaturas,

incluindo a etapa de hibridação. O intervalo de ação da atividade enzimática varia na ordem de

2 vezes a magnitude entre 20 a 85C. A temperatura de “annealing” no intervalo de 55 a 72C,

geralmente dá melhor resultado. Numa concentração típica de primers(0,2M), o “annealing” só

requer poucos segundos.

O aumento da temperatura de “annealing” aumenta a discriminação contra os

erros de hibridização dos primers “mispriming”, reduzindo a extensão ou polimerização dos

nucleotídeos incorretos no final 3’ dos “primers”. Portanto, as temperaturas de “annealing” mais

estringentes, especialmante nos primeiros ciclos poderá aumentar a especificidade. Para se

obter uma especificidade máxima, no início dos ciclos aumenta-se a temperatura de

“annealing” e adiciona-se a Taq polimerase após a primeira etapa de desnaturação e

“annealing” do primer.

Baixas temperaturas de etapas de “extension” com altas concentrações de dNTPs

favorecem os erros de polimerização, ou seja, os nucleotídeos são incorporados erroneamente,

motivo pelo qual alguns autores recomendam a utilização de “primers” mais longos e de 2

temperaturas para o PCR. As temperaturas são de 55 a 75C para “annealing” e “extension” e

94 a 97C para desnaturação e separação de cadeias.

6. Extensão (ou polimerização)

O tempo de polimerização ou “extension” também depende de alguns fatores como a

concentração e o comprimento do DNA a ser amplificado. A extensão dos “primers”

tradicionalmente é realizada a 72C, porque esta temperatura é próxima do ótimo para

extensão de “primers” no modelo de DNA do M13. A média de incorporação dos nucleotídeos a

72C varia de 35 a 100 nucleotídeos por seg-1 dependendo do tampão, pH, concentração salina

e natureza do DNA alvo.

O tempo de 1 minuto a 72C é considerado suficiente para a extensão de

produtos de até 2kb. No entanto, tempos mais prolongados podem ser úteis em casos de

poucos ciclos e se a concentração do substrato for muito baixa e também em ciclos

prolongados quando a concentração do produto ultrapassa a concentração da enzima.

7. Tempo e temperatura de desnaturação

A maioria das causas de insucesso do PCR é a incompleta desnaturação do DNA a ser

amplificado ou do produto de PCR. Uma temperatura típica de desnaturação é 95C por 30

segundos, ou 97C por 15 segundos, porém, temperaturas mais altas podem ser apropriadas

especialmente para DNA ricos em G+C. Apenas alguns segundos são necessários para

desnaturar e separar as cadeias de DNA, porém, um maior tempo é necessário para se atingir

a temperatura dentro do tubo de reação. Seria desejável a monitoração da temperatura dentro

do tubo de reação utilizando uma sonda térmica de medida exata. A desnaturação incompleta

reduz a possibilidade hibridização entre o DNA alvo e os “primers”, diminuindo o rendimento do

produto do PCR. Por outro lado, a desnaturação por longo tempo ou alta temperatura leva a

perda de atividade da Taq polimerase, que é maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas

temperaturas de 92,5; 95 e 97,5C, respectivamente.

8. Número de ciclos.

O número de ciclos dependerá da quantidade de DNA inicial, quando todos os

parâmetros estão optimizados. Um erro comum que se comete é um excesso de número de

ciclos. Segundo Kary Mullis “Se você tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples

cópia de gene, existe alguma coisa seriamente errada com o seu PCR”. Muitos ciclos pode

aumentar a quantidade e a complexidade de produtos não específicos. Obviamente, um

número muito baixo dará um baixo rendimento do produto desejado.

9. Iniciadores (“Primers”)

A concentração dos “primers” entre 0,1 a 0,5 mM são, na maioria das vezes,

satisfatórios. Concentrações maiores podem promover “mispriming” e acúmulo de produtos não

específicos e podem aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do

“template” denominado de “primer-dimer”(dimerização de primer). Produtos não específicos e

dimerização de “primer” são por si só substratos para o PCR e competem com o produto

desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo rendimento do produto

desejado.

Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam:

de 18 a 28 nucleotídeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua

composição. A temperatura de “melting” (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para

esse propósito, pode-se usar a regra da prática de 2C para o A ou T e 4C para o G ou C.

Dependendo da aplicação, o Tm entre 55C e 80C são os recomendados. Deve também evitar

a complementaridade na porção 3’ do par de "primers", pois isso pode promover a formação de

artefatos de dimerização de primers e reduzir a produção do produto desejado. Outra

observação é evitar três ou mais C+G na porção 3’ dos primers que pode promover

“mispriming” na sequência rica em G+C. Deve-se evitar, quando possível, a presença de

sequências palindrômicas dentro dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a

falhar, é salutar então tentar outro par de primers. Uma razão menos óbvia para alguns primers

falharem é a presença de estrutura secundária no DNA “template”. Neste caso, substituir com

7-deasa-2’deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers para propósitos especiais

também podem ser elaborados tais como a adição de sítios de enzimas de restrição, mutação

in vitro, ATG “start codon”, e outros.

10. Efeito Plateau

O termo efeito plateau é usado para descrever a atenuação exponencial da

taxa de formação de produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR

concomitantemente com o acúmulo de 0,3 a 1 pmol do produto desejado. Dependendo das

condições da reação e da ciclagem térmica, um ou mais parametros podem ser afetados:

1)utilização dos substratos (dNTP ou “primers”),

2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas),

3)inibição por produto formado(pirofosfato,DNA duplex),

4)competição por reagentes pelos produtos inespecíficos ou dimerização de primers,

5) “reannealing” de produto específico na concentração acima de 10-8 (pode diminuir a

eficiência da extensão ou o processamento da Taq DNA polimerase ou causar subdivisão na

migração das cadeias e deslocamento de primers) e

6) incompleta desnaturação dos “templates” ou DNAs formados ou separação do

produto em alta concentração.

Um importante fator que determina o aparecimento do efeito plateau é a

presença inicial de baixas concentração de produtos desejado com presença de produtos não

específicos resultantes de eventos de “mispriming” que podem continuar a ser amplificados

preferencialmente. A optimização do número de ciclos de amplificação é a melhor maneira de

evitar a amplificação de produtos indesejáveis.

ESCOLHA DOS INICADORES PARA PCR

A. Protocolo básico para desenhar um iniciador (“primer”) 5’para 3’( sense)

Regras gerais:

Determinar a prioridade da utilização(clonar, PCR, hibridizar, outros)

Se for para clonar: analisar a sequência do cDNA estudando as enzimas de restrição

do DNA alvo e seguir o protocolo a seguir:

1. Copiar a sequência e região desejada do cDNA de interesse (não mais que 6

aminoácidos

ou 18 bp)

2.Adicione no início 6 bases aleatórias

3.Adicione a sequência a enzima de restrição desejada (Hind III, EcoRI, etc)

4. Acrescentar a sequência que codifica o início da síntese de aminoácido(metionina -

ATG)

5. Checar a sequência em voz alta e verificar a porcentagem de Base C+G, que não

deve

ultrapassar 50%

Caso o primer for utilizado para outras finalidades como: hibridização, PCR diagnóstico

etc, omita as etapas 2, 3, 4. e acrescente mais pares de base para ajustar a relação C+G se

necessário(não > 30).

Ex 5’ AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3’

GAT ATG CAT ATG AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3’

random NdeI+iniciador

B. Protocolo básico para desenhar um iniciador (“primer”) 3’para 5’ (anti-sense)

Regras gerais:

Determinar a prioridade da utilização

Se for para clonagem seguir os mesmos critérios acima para o “sense primer”

1. Copiar a sequencia da região desejada do cDNA de interesse( não mais que 6

aminoácidos ou

18 bp)

2. Adicione a sequência que codifica o “stop codon” no final da sequência(TAG

TAA)

3. Adicione a sequênicia da enzima de restrição

4. Adicione 6 bases aleatoriamente(acertar a relação C+G)

5. Faça a complementar dessa sequência

6.Copie a sequencia complementar em direção oposta ou seja do 5’ para o 3’(pois o

sintetizador

sempre iniciado 5’)

7. Checar a sequência em voz alta, calcular a relação C+G, não deixando ultrapassar

50%

(aceite com as base aleatórias acrescidas).

8. Se não usar para clonagem apenas copie a sequencia desejada, faça a

complementariedade e

copie a sequencia inversa, checando a sequencia em voz alta.

Ex. 5’ CGC AAA GCT CAG ATT GGT 3’

5’CGC AAA GCT CAG ATT GGT TAG TAA AAG CTT AGA AGC

STOPSTOPHindIII bases aleatórias

3’ GCG TTT CGA GTC TAA CCA ATC ATT TTA GAA TCT TCG 5’

5’GCT TCT AAG ATT TTA CTA ACC AAT CTG AGC TTT GCG 3’

Recomenda-se avaliar o primer desenhado em um programa de computador, para

avalia-los adequadamente antes de requerer a síntese.

TRANSCRIPTASE REVERSA

A Transcriptase reversa (RT, do inglês Reverse transcriptase, também conhecida como

DNA polimerase RNA-dependente), é uma enzima que como o seu nome indica, realiza um

processo de transcrição ao contrário em relação ao padrão celular. Essa enzima

polimeriza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA, exatamente o oposto do que

geralmente ocorre nas células, nas quais é produzido RNA a partir de DNA.

MECANISMO DE AÇÃO

Por possuir essa enzima, que atua "ao reverso", que o HIV e outros vírus semelhantes

são chamados de retrovírus. Após a entrada do retrovírus na célula hospedeira, a transcriptase

reversa utiliza os nucleotídeos presentes no citoplasma para montar uma fita de DNA senso

negativo a partir de sua fita de RNA senso positivo, utilizando comoprimer um tRNA presente

no nucleocapsídeo, associado ao genoma. Após a síntese do duplex RNA/DNA,

uma ribonuclease (RNAse H) é incumbida de degradar a fita de RNA viral por hidrólise, a partir

da extremidade 3', deixando a fita simples de (-) DNA solta nocitoplasma. A transcriptase

reversa completa essa fita de DNA, tornando-a uma dupla hélice de deoxinucleotídeos. Esta

dupla fita de DNA viral, denominada provírus, poderá ser integrada ao DNA da célula

hospedeira com auxílio da enzima integrase. O processo de cópia do genoma do HIV, que

envolve transcrição reversa, está sujeito a uma frequência de mutação equivalente a um erro a

cada 104 bases adicionadas. Tento em vista que o HIV possui um genoma de

aproximadamente 104 bases, isso representa um erro a cada transcrição reversa do genoma,

ou seja, é um processo impreciso, que gera um grande número de mutações, benéficas ou

maléficas aos vírus.

 O isolamento desta enzima permitiu a adaptação da tecnologia da PCR, que é

destinada a amplificação a partir de moldes de DNA, para permitir a amplificação a partir de

moldes de RNA, chamada RT-PCR (transcrição reversa - PCR)

RT-PCR (transcrição Reversa)

O RT-PCR é uma reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da

polimerase . Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A

partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar

(chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.

É necessária ligação ao RNA e a ligação da transcriptase reversa a uma "cadeia"

de poli T, pois sempre ao final da cadeia de mRNA existe uma "cauda" de poli A.

A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma

vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica,

é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para

produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo:

células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares, por exemplo.

SEQUENCIAMENTO DE DNA

Antes de 1975, pensar em tentar seqüenciar cromossomos era praticamente

inconcebível. Na melhor das hipóteses, era uma tarefa trabalhosa requerendo muitos anos de

trabalho. No final de 1976, o cromossomo inteiro do fago X174, de 5.387 nucleotídeos tinha

sido seqüenciado. Hoje é possível obter as seqüências de nucleotídeos de genes de

cromossomos eucarióticos inteiros, e estes dados são armazenados em bancos de dados em

computadores para referência posterior.

Foi desenvolvido nesta época, quase que simultaneamente, duas técnicas que

promoveram uma revolução na "arte" de seqüenciar DNA. O desenvolvimento de outras

técnicas, como a descoberta de enzimas de restrição (uso na preparação de segmentos

específicos de cromossomos); o aperfeiçoamento da eletroforese em gel até o ponto em que

fragmentos de DNA que diferem em comprimento por um único nucleotídeo pudessem ser

resolvidos, e o desenvolvimento de técnicas de clonagem de genes (preparação de grandes

quantidades de um determinado gene ou seqüência de DNA de interesse) viabilizaram o

seqüenciamento.

Em 1975, F. Sanger e colaboradores desenvolveram um método enzimático com

terminadores de cadeia específicos, para gerar quatro populações de fragmentos que terminam

em As,Gs, Cs e Ts, respectivamente.

O método de Sanger utiliza de terminadores de cadeia chamados de 2'3'-

didesoxinucleotídeos trifosfatos. As DNA polimerases necessitam de um OH- 3' livre na fita de

DNA iniciadora. Se um 2' 3' didesoxinucleotídeo é adicionado à extremidade de uma cadeia,

ele irá bloquear a extensão subseqüente desta cadeia, uma vez que os 2' 3' -

dideoxinucleotídeos possuem um grupo OH- 3' trocado por um H.

O seqüenciamento é feito da seguinte maneira: Quatro reações são feitas em paralelo,

cada uma delas contendo um dos quatro terminadores de cadeia 2', 3'-didesoxi: ddGTP,ddATP,

ddCTP e ddTTP. As quatro reações contêm: uma fita molde (simples fita), a seqüência de

nucleotídeos a ser determinada, uma fita iniciadora com uma hidroxila 3’ livre (normalmente

obtida por síntese química), os quatro precursores de DNA: dGTP, dATP, dTTP e dCTP, um

deles pelo menos radioativo (32P -dCTP ), e o "fragmento Klenow"da DNA polimerase I de E.

Coli. O "fragmento Klenow"representa 2/3 DNA polimerásica I de E.Coli produzido por clivagem

com enzima proteolítica tripsina. O fragmento possui as atividades polimerásica 5' 3' e

exonucleásica 3' 5' da DNA polimerase I, mas não possui atividade exonucleásica 5' 3'. Esta

atividade exonucleásica 5' 3' é critica para a técnica, pois se esta atividade estiver presente,

ela irá reduzir a fita iniciadora a partir da extremidade 5'.

O importante nesta técnica de seqüenciamento é usar a relação correta do

didesoxirribonucleosídeo trifosfato normal (por exemplo, dGTP na reação 1) e de

didesoxirribonucleosídeo trifosfato terminador (por exemplo ddGTP na reação 1),de modo a

obter uma população de cadeias nascentes terminando em todas as posições de nucleotídeos

possíveis (por exemplo,em todos os Cs de fita-molde na reação 1). A relação de 100

desoxirribonucleosídeos trifosfatos para 1 didesoxirribonucleosídeo trifosfato normalmente dá a

frequência de terminação desejada em cada sítio potencial de terminação.

Os produtos das quatro reações são então separados por eletroforese em gel de

poliacrilamida e as posições dos produtos de reação radiativos (cadeias nascentes de DNA)

são determinadas por autorradiografia. Uma vez que as cadeias menores migram distâncias

maiores no gel, a seqüência de nucleotídeos definida pelas cadeias nascentes é dada pela

leitura na direção 5’ 3’ , a partir da parte de baixo (anodo) até o topo (catodo) do gel.

Atualmente não são utilizados nucleotídeos radioativos. Os didesoxinucleotídeos são

marcados com substâncias fluorescentes que emitem em comprimentos de onda diferentes.

Desta forma, os fragmentos que incorporam estes nucleotídeos podem ser identificados após

excitação com laser e identificação de cada fluorescência. Isso possibilita que a reação seja

feita em um único tubo. Além disso, são utilizadas enzimas termoestáveis em substituição à

Klenow e à T7 DNA polimerase. A reação, que não é uma amplificação, apenas extensão, é

realizada de forma cíclica. Isso faz com que possam ser obtidas seqüências a partir de uma

quantidade menor de DNA e também auxilia no seqüenciamento de regiões que possuem

estruturas que, em temperaturas mais baixas, impedem a ação das polimerases. A utilização

de temperaturas mais altas (70oC) evita este problema. Atualmente são utilizados

sequenciadores automáticos que permitem a realização de seqüências em larga escala.

Estudo dirigido: Valor 20 pontos

Obs: Realizar o estudo dirigido em grupos de no máximo 4 alunos até a data da

prova.

- Complementar com figuras cada tópico abordado (Estrutura DNA,

RNA; PCR, Eletroforese; RT-PCR e Sequenciamento).

- Adicionar a descrição metodológica da técnica de RT-PCR.

- Adicionar o método de seqüenciamento químico (degradação química).

- Responder o questionário abaixo.

Questionário

01) Defina em poucas palavras o que é biologia molecular?

02) O que é PCR (do inglês, Reação em Cadeia da Polimerase)? Quais são os

seus componentes essenciais?

03) A técnica de RT-PCR (transcriptase reversa) é amplamente utilizada para

verificar a expressão gênica, uma vez que consegue amplificar o RNA

produzido pelas células. Contudo, existem tipos diferentes de RNA produzidos

pela células, como os RNAs transportadores, mensageiros e ribossômicos.

Como pode ser feito a construção dos iniciadores para essa técnica, sendo que

o objetivo é amplificar todos os RNA mensageiros produzidos pela célula em

análise? Justifique sua resposta.

04) O que é Gene constitutivo (HOUSEKEEPING) e qual a sua importância

para as técnicas moleculares?