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Análise
Microbiológica
Da
Água
Departamento de Engenharia Química - UFPE
Maria de Los Angeles Perez palhaAlice G. Andrade Lima
Sônia Albuquerque
2004
3
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA POTÁVEL
1-Introdução
Embora possa parecer que a água constitui uma reserva natural inesgotável, isso não
representa a realidade, já que 95% da água do planeta é salgada, sendo imprópria para o
consumo humano e dos 5% restantes, 4,7% estão sob a forma de geleiras ou em regiões
subterrâneas de difícil acesso, o restante apto ao consumo humano, encontra-se em lagos,
rios e lençóis subterrâneos.
Particularmente para o Brasil, a aparente abundância é falsa, uma vez que 80%
encontra-se no Amazonas onde vivem apenas 5% da população. O nordeste com 1/3 da
população do país dispõe de apenas 3,3% das reservas hídricas do país. No mundo inteiro há
países ou regiões com graves problemas de abastecimento: ora devido a seca crônica, ora a
má distribuição dos recursos hídricos, ora a contaminação desses recursos. A água
contaminada é responsável por cerca de 70% das internações hospitalares, são pacientes
vítimas de doenças de origem hídrica (tabela1), como disenteria, hepatite, febre tifóide,
cólera e, indiretamente leptospirose e dengue (Macedo, 2001)
Além da contaminação microbiana, o desenvolvimento industrial, a ocupação
inadequada do solo e o uso de fertilizantes vêm comprometendo as águas disponíveis para o
consumo humano, recreação e agricultura, aumentando consideravelmente o risco de
transmissão de doenças de origem hídrica (figura 1). Segundo a Organização Mundial de
Saúde (OMS), 80% das moléstias que ocorrem nos países em desenvolvimento são
ocasionadas por contaminação da água: 15 milhões de crianças de 0 a 5 anos morrem devido
a enfermidades contraídas por conta da falta ou ineficiência dos sistemas de tratamento de
águas e esgotos. Apenas 30% da população utiliza água tratada, o restante faz uso de águas
de poços, rios, lagos, estando, portanto passíveis à contaminações (Macedo, 2001).
Desta forma se faz necessária a vigilância rotineira da qualidade química e
particularmente, microbiológica das águas por parte das autoridades sanitárias, órgãos de
saneamento, indústrias, clínicas de hemodiálise, hospitais, entre outros. A pesquisa de
patógenos nem sempre é fácil ou econômica para que seja feita rotineiramente. Assim, é
imprescindível o uso de microrganismos indicadores de contaminação fecal.
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Tabela 1 - Microrganismos patogênicos encontrados intermitentemente em fezes humanas e transmissores comprovados de doenças através da água.
Microrganismo Patógeno DoençaBactérias Vibrio cholerae
Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei
Salmonella typhiSalmonella paratyphi Salmonella enteridisSalmonella choleraesuis
Cólera
Disenteria Bacilar
Febre tifóide ou entéricas
Vírus Vírus da hepatite tipo ARotavírusAdenovírus poliovírus
HepatiteGastroenterites em criançasGastroenteritespoliomielite
Protozoários Entamoeba histolyticaGiardia lamblia
Disenteria amebiana
Helmintos Ascaris lumbricoidesTrichuris trichiura
Verminoses
Figura 1- Principais vias de Transmissão de patógenos (Sanchez, 1999)
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Fezes Humanas
Água de drenagem Esgotos Fossas
Oceanos e estuários
Rios e lagos Água subterrânea
Fertilização e irrigação
Moluscos Águas recreacionais
Suprimento de água potável
potável
Produtos agrícolas
Aerossóis
Homem
2. Microrganismos indicadores
Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de organismos, que quando
presentes em um produto, fornecem informações sobre a ocorrência de contaminação de
origem fecal, presença de patógenos, manipulação e/ou tratamento inadequada, assim como
deterioração potencial de bens de consumo. Os indicadores microbianos servem para avaliar
as condições sanitárias a que o produto foi submetidas. O uso de Escherichia coli como
indicador de contaminação de origem entérica em águas e alimentos foi proposto em 1892,
uma vez que esse microrganismo é encontrado nos intestinos do homem e de animais de
sangue quente, sendo o mais utilizado por preencher alguns requisitos, tais como:
Ser um microrganismo que prevalece em esgotos e é excretado pelo homem e
outros animais (50 milhões de células/g de dejetos humanos).
Ocorrer em número muito alto e em relação direta ao grau de contaminação fecal.
Ser incapaz de se multiplicar em ambiente aquático.
Apresentar alta resistência ao ambiente extra-enteral.
Ser detectado por técnicas rápidas, simples, precisas e econômicas.
As bactérias do grupo coliforme fazem parte da flora normal do intestino, onde não
causam doenças, na realidade são fundamentais ao funcionamento normal desse órgão. No
entanto, esses microrganismos mostram-se patogênicos quando fora do trato intestinal,
colonizando outros tecidos, como trato urinário, peritônio, meninges, entre outros e,
dependendo das condições de defesa do indivíduo, podem causar doenças e morte.
No caso de águas minerais, além dos indicadores de contaminação fecal
(Coliformes totais e fecais), é recomendada a pesquisa Streptococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosa e Clostridium perfrigens.
Não existe um indicador ideal ou universal, que reúne todos os requisitos necessários,
de modo que a sua ausência ateste uma água de puríssima qualidade. Assim, vários autores
preconizam a pesquisa de bactérias do gênero Pseudomonas aliada à bactéria E. coli, uma
vez que essa bactéria, em determinadas concentrações, inibe o crescimento da Escherichia,
no entanto segundo portaria publicada no Diário Oficial em vigor (Nº518 - 25/03/2004), esse
cuidado não é necessário.
2.1 Grupo Coliforme6
As bactérias pertencentes ao grupo coliforme são encontradas normalmente nos
intestinos do homem e demais animais de sangue quente, sendo expelidas em grande
quantidade, através de seus dejetos, podendo também estar presentes em vários setores do
meio ambiente como esgotos, águas superficiais, solos, vegetação, insetos, entre outros.
Verifica-se, dessa maneira, que o risco de transmissão de moléstias infecciosas através da
água está estreitamente vinculado as doenças infecciosas intestinais. ( tabela 1.0).
Uma água destinada ao consumo público, deve estar isenta de bactérias ofensivas ao
organismo humano. É portanto a pureza bacteriológica que condiciona a potabilidade de
uma água, sendo inclusive, fator mais importante do que qualquer outro requisito de ordem
físico-química.
O grupo Coliforme é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, são
bastonetes Gram negativos, não formadores de esporos, anaeróbios facultativos ou aeróbios,
são capazes de fermentar um grande número de carbohidratos (Pelczar Jr. et al, 1997). Essa
família engloba vários gêneros destacando-se entre outros:
1. Escherichia: E. coli2. Proteus: P. vulgaris3. Klebsiella: K.pneumoniae4. Citrobacter:5. Serratia: S. marcescens6. Enterobacter : E. aerogenes7. Salmonella: S. typhi8. Shigella: S. sonnei
Alguns microrganismos entéricos, por ex.: Escherichia coli, fazem parte da flora
normal do intestino e, acidentalmente causam doenças, enquanto outros, Salmonella e
Shigella, são sempre patógenos aos seres humanos. Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella,
além de serem encotrados nas fezes, também encontram-se em vegetais e solo, onde
persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal. A E. coli é o
subgrupo mais importante, sendo escolhido como microrganismo indicador. Consegue
hidrolizar o dissacarídeo lactose e, conseqüentemente, fermentar este açúcar com produção
de gás, quando incubado a 35-37ºC, por 48h.. Espécies relacionadas, fermentadoras da
lactose também são encontradas no solo e em desenvolvimento sobre plantas e material
vegetal. O E. aerogenes, principal representante desse subgrupo, também fermentador da
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lactose, é encontrado tipicamente no solo e em plantas. Pode ocorrer igualmente no trato
intestinal do homem e de animais de sangue quente, não parecendo, contudo, ser ali seu
habitat regular, por isso se atribui pouca importância à sua presença na água. Não obstante, a
presença de qualquer tipo de organismo coliforme na água potável sugere, um tratamento
inadequado ou acesso de material indesejável à água, após o tratamento.
A velocidade de morte de uma população de Escherichia coli em água, em geral,
acompanha a taxa de mortalidade das bactérias patogênicas como S. typhi nesse mesmo
meio. Os outros membros do grupo coliforme, como o E. aerogenes, têm resistência um
pouco maior.
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3. Análise Microbiológica da água
As técnicas de análise tradicionalmente utilizadas para pesquisa de bactérias em água
são as de tubos múltiplos e a de membrana filtrante. Novos métodos têm sido adotadas nos
últimos anos, em particular o de presença / ausência, além de outros que fazem uso de
reativos cromogênicos de alta sensibilidade. A escolha da metodologia adequada, desde que
respeite as normas vigentes, será função do tipo de água, da finalidade da mesma, da infra-
estrutura do laboratório, da capacitação pessoal e dos recursos financeiros disponíveis.
3.1 COLETA DA AMOSTRA
Frasco de Amostragem
Dá-se preferência a frascos com capacidade para recolher pelo menos 100 ml de água
deixando espaço para o ar, tornando possível a homogeneização da amostra. Os mais
indicados são frascos de vidro transparente, incolor, com capacidade nominal de 250 ml
dotados tampa de vidro esmerilhada.
Os frascos devem ser lavados e esterilizados. Para a coleta de água clorada, deve-se
adicionar ao frasco 0,1ml de solução de tiossulfato de sódio a 10%. Esta solução tem a
função de eliminar a ação do cloro residual na amostra. No entanto, este teor não tem
qualquer ação nociva aos germes porventura existentes.
Na preparação do frasco coloca-se entre a tampa e o gargalo uma tirinha de papel
alumínio, para permitir a saída livre do ar e circulação do vapor saturado durante a
esterilização no autoclave. Protege-se ainda a tampa do frasco com um papel ou folha
metálica e autoclava-se a 120ºC durante 20 minutos.
Técnica de Coleta Procedimento:1. Não tocar o interior ou a tampa do frasco; o papel deve ser afrouxado, devendo o
operador segurar a tampa, para abri-lo, sem remover o papel deixando entretanto cair a tirinha inserida no gargalo por não ser mais necessária.
2. Para a coleta de amostras na rede de distribuição de água, escolhe-se uma torneira e lava-se a mesma e o encanamento próximo com detergente. Alguns autores indicam a assepsia com etanol a 70%. Abre-se e deixa-se a água fluir em jato forte durante 3 a 5 minutos.
9
3. Em seguida com a torneira aberta moderadamente, colhe-se a amostra até o volume de 2/3 do frasco, de modo a permitir a sua homogeneização.
4. Registro de dados: Devem ser anotados: Data e hora da coleta Temperatura e pH da água Localização da tomada de amostra
Sempre que possível medir o teor residual de cloro no momento da coleta. Deve-se
considerar as condições sanitárias do local onde foi feita a amostragem, anotando-se
detalhes como profundidade do poço, tempo de funcionamento, proximidade de fossas,
matadouros, curtumes.
Cuidados: Na tomada de amostras de rede do abastecimento público, não efetuar a coleta em
torneiras que não estejam ligadas diretamente ao sistema distribuidor.
Na coleta de amostras de uma fonte superficial como rio, açude, etc, a amostragem
deverá ser feita em um ponto que esteja o mais próximo possível da estação de
tratamento.
Poços com bombas manuais são operados de maneira semelhante, bombeando-se por
5 minutos antes da tomada da amostra. Se o poço não tem bomba, faz-se descer o
frasco esterilizado, ligado a um peso e com um dispositivo que permita abri-lo
debaixo d’água. Existem frascos e dispositivos especiais para a coleta de amostras de
água abaixo da superfície, a profundidade desejada.
3.2 TRANSPORTE E TEMPO DE ESPERA
Tanto quanto possível manter a temperatura da amostra próxima à da ocasião da sua
retirada. Os métodos modernos de análise não mais recomendam o seu resfriamento pois
consideram desprezíveis as alterações em tipos e números de bactérias durante a
conservação, no entanto deve ser guardada a uma temperatura que oscile entre 0 e 10ºC. O
exame deve começar de preferência dentro de 1 hora após a coleta e no máximo decorrido
24 horas.
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3.3 TÉCNICA DO EXAME:
Os métodos de exame bacteriológico da água são padronizados e a metodologia deve ser seguida regiamente. Os processos de rotina para água potável consiste em:
Contagem padrão de bactérias heterotróficas em placa Testes que revelem a existência de bactérias do grupo coliforme
3.3.1Técnica dos tubos múltiplos
Princípio do método
Consiste no inóculo de volumes decrescentes da amostra, em meio de cultura
adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado
em uma série de tubos (série de 05 ou de 03). Para análises de águas, têm sido utilizado
preferencialmente o fator 10 para diluição, sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de
1ml da amostra, usando-se, geralmente, as séries de 5 tubos para cada volume a ser
inoculado. Os resultados são avaliados através da tabela de Hoskins (anexo 1), que permite a
obtenção de uma estimativa da densidade original das bactérias pesquisadas, através da
aplicação de cálculos de probabilidade (N.M.P.: número mais provável) que é expressa
como NMP por 100 ml . O exame completo se processa através de três ensaios
consecutivos:
a) Ensaio presuntivo
b) Ensaio confirmativo
c) Ensaio completo ou diferencial
No entanto, são de realização obrigatória para todos os tipos de amostras de água o
ensaio presuntivo e confirmativo. A contagem padrão em placas e o ensaio presuntivo são
feitos paralelamente.
1º Etapa:
ENSAIO PRESUNTIVO
Geralmente são usadas três séries de 5 tubos grandes dotados dos respectivos tubos
de Durham ou ampolas de injeção ( para recolher os gases). A primeira série contém, cada
tubo, 10 ml de meio de caldo lactosado em concentração dupla(CLD). As duas outras,
compostas de 10 tubos menores, também com tubos de Durham, contêm em cada, 10 ml de
caldo lactosado em concentração simples (CLS) (figura - 2).
11
Técnica:
Com pipeta estéril de 10 ml, inocular cada um dos 5 tubos grandes ( C.L.D.) com 10 ml da amostra;
Com uma outra pipeta de 1 ml estéril, inocular 1 ml da amostra em cada um dos 5 tubos menores com caldo lactosado simples
Transferir 1 ml da amostra para um tubo de diluição com 9 ml de água destilada estéril ou água tamponada estéril. Desta diluição (1/10), inocular 1 ml em cada um dos 5 tubos com caldo lactosado simples restantes.
Agitar os tubos cuidadosamente e incubá-los a 35ºC por 24/48h.
Após 24 horas de incubação, se houver formação de gás em qualquer quantidade,
em qualquer tubo, o ensaio presuntivo é positivo. Se não houver gás esperar por mais 24
horas.
Se após 48h não houver formação de gás em qualquer tubo, o ensaio é negativo e a
análise está encerrada quanto a coliformes. Havendo formação de gás, anota-se o número de
tubos positivos e negativos e prossegue-se o ensaio (ensaio confirmativo).
CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS EM PLACAS
Este ensaio constitui um dos indicadores da qualidade da água e da eficácia do
tratamento. Visa determinar a densidade de bactérias que são capazes de crescer na presença
de compostos orgânicos contidos em meio de cultura apropriado sob condições pré-
determinadas. Com a finalidade de se conseguir uma maior confiabilidade nos resultados,
costuma-se além da inoculação da amostra original, efetuar diluições decimais que vão
desde 1/10 (para águas sabidamente boas) até 1/105 para contagem de mesófilos
heterotróficos (figura-2). Essas diluições são feitas em frascos ou tubos contendo águas
tamponadas (com KH2PO4) ou água estéril. A amostra deve ser agitada vigorosamente antes
de se iniciar as diluições.
Técnica:
Faz-se a primeira diluição (1:10) colocando 1 ml da amostra em 9 ml de água estéril ;
agita-se bem e transfere-se 1 ml desse tubo para outro contendo 9 ml de água estéril
(1/100) e assim, sucessivamente até que se tenha todas as diluições desejadas.
De cada diluição transfere-se então 1 ml para Placa de Petri estéril (deve-se fazer
duplicatas ou triplicatas) e adiciona-se de 10 a 15 ml de meio de Agar-glicosado (GA)
fundido e resfriado a 42-45ºC.
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Agitam-se as placas com movimentos circulares nos sentidos horário e anti-horário,
evitando-se sujar a tampa da placa. Deixa-se solidificar e incuba-se em estufa a 35ºC
durante 24/48h horas.
Após incubação examina-se as placas escolhendo-se para contagem as que tenham
entre 30 a 500 colônias* (evidentemente se a placa inoculada com 1ml da amostra não
diluída tiver um número inferior a 30 colônias, esse número será registrado). Para auxiliar na
contagem é utilizado um aparelho especial munido de lupa, o Contador de Colônias tipo
Quebec.
Se as placas escolhidas forem originadas de qualquer das diluições não se deve
esquecer que o resultado final será a média do número de colônias nas placas (das
duplicatas ou triplicatas), multiplicado pela recíproca da diluição. O resultado obtido é
expresso em unidades formadoras de colônias de bactérias heterotróficas por mililitro
(UFC/ml). Contar somente as colônias que apresentarem as seguintes características:
a)colônias circulares lisa e rugosas
b)colônias ovaladas, lisas, rugosas e estreladas;
c)colônias brancas, amarelas, azuis, etc.
* O número máximo permitido de unidades formadoras de colônias por placa varia de
acordo com a finalidade da água.
13
14
1
11 ml
1 ml
1 ml
10 mlAmostra
Tubos contendo 10 ml de CLD
Tubos contendo 10 ml de CLS
1 ml
1 ml
1 ml
9 ml de água estéril
9 ml de água estéril
10-2
10-2
1 ml
1 ml
1 ml10-1
10-1
Tubos contendo 10 ml de CLS
Figura 2 – Esquema de inoculação para ensaio presuntivo e contagem em placas
Amostra
1
11 ml
1 ml
1 ml
10 mlAmostra
Tubos contendo 10 ml de CLD
Tubos contendo 10 ml de CLS
1 ml
1 ml
1 ml
9 ml de água estéril
9 ml de água estéril
10-2
10-2
1 ml
1 ml
1 ml10-1
10-1
Tubos contendo 10 ml de CLS
Figura 2 – Esquema de inoculação para ensaio presuntivo e contagem em placas
Amostra
2º Etapa:
ENSAIO CONFIRMATIVO
Um ensaio presuntivo positivo, não indica necessariamente a presença de coliformes;
alguns germes da flora normal de água e de solo, principalmente bacilos Gram-positivos,
esporulantes, anaeróbios, do gênero Clostridium são capazes de fermentar a lactose com
produção de gases. Também a ação sinérgica de 2 espécies diferentes de bactérias pode
resultar no aparecimento de gases. Nesta hipótese, uma das espécies seria capaz de
hidrolizar a lactose liberando glicose e galactose; a glicose é um açúcar facilmente
fermentável, sendo atacada pela 2ª espécie. O ensaio confirmativo tem assim por finalidade
afastar essas duas possibilidades.
Meios de Cultura Utilizados:
Os meios de cultura empregados inibem as bactérias Gram-positivas, permitindo o
desenvolvimento das Gram-negativas. Podem ser usados os meios líquidos como o caldo
Lactosado adicionado de verde-brilhante ou de fucsina ou de cristal violeta, adicionado de
bile a 2% ou ainda meios sólidos igualmente adicionados de substâncias inibidoras. Esta
etapa reduz a possibilidade de ocorrência de falsos-positivos, decorrentes da atividade
metabólica de bactérias esporulantes Gram-positivas fermentadoras da lactose.
Ensaio Confirmativo para coliformes totais
De cada um dos tubos positivos usados no ensaio presuntivo transferir com alça estéril,
após agitação, uma gota para um tubo com caldo verde brilhante lactose bile, igualmente
dotado de tubinhos de Durham. Assim serão usadas tantos tubos de caldo verde brilhante
bile quantos forem os tubos positivos no ensaio presuntivo.
Incubar todos os tubos por 483 horas a 35ºC .
Proceder a leitura, considerando como teste confirmativo positivos para coliformes totais
todos os tubos que apresentarem formação de gás nos tubinhos de Durham
Anotar os resultados obtidos e calcular, recorrendo-se à tabela de HOSKINS, o número
mais provável de coliformes existentes em 100 ml da amostra.
15
ENSAIO CONFIRMATIVO EM MEIO SÓLIDO
Pode-se partir de um tubo ou mais fermentados do ensaio presuntivo ou de dos tubos
positivos usado no ensaio confirmativo em meio líquido. Neste ensaio pode ser utilizado os
meios de EMB (eosina azul de metileno), ENDO, Mac Conkey entre outros.
Técnica:
Com uma alça de platina espalhar uma gota do líquido (do tubo positivo) na
superfície do meio solidificado pela técnica de esgotamento na placa.(ver figura - 3).
Figura 3- Técnica de espalhamento de uma gota
de líquido na superfície de meio sólido
Incuba-se a placa em estufa a 35ºC durante 48 horas. Observa-se, para determinar se
houve ou não crescimento de colônias; o não crescimento indica que o ensaio confirmativo é
negativo, ou seja, não há presença de germes coliformes. Esta possibilidade refere-se ao uso
direto de um tubo de caldo lactosado do ensaio presuntivo para inocular a placa de meio
confirmativo.
Quando, no entanto, partindo-se de um tubo fermentado do ensaio confirmativo ou
de um tubo positivo do ensaio presuntivo aparecem colônias, estas devem ser escolhidas e
transferidas cada uma para dois tubos, um contendo meio de AN (agar-nutritivo) e outro
caldo lactosado. A escolha das colônias baseia-se no conhecimento prático do operador, que
determinará a colônia típica do grupo coliforme a ser transferida. Algumas características
dessas colônias podem ser observadas na tabela 2.
16
12
3
Tabela. 2 - Diferenciação entre a E.coli e o E. aerogenes em placas de EMB
Colônias E. coli E. aerogenes
Tamanho Colônias bem isoladas, com 2 a 3 mm
de diâmetro.
Colônias bem isoladas, porém
maiores do que as da E. coli;
4 a 6 mm de diâmetro ou mais.
Aglutinação As colônias vizinhas mostram pouca
tendência para a aglomeração
As colônias vizinhas se aglomeram
facilmente
Altura As colônias apresentam pouca altura,
têm a superfície plana ou levemente
côncava; raramente são convexas
As colônias são consideravelmente
elevadas e acentuadamente
convexas; ocasionalmente,
aparecem depressões no centro das
colônias.
Aspecto à luz transmitida Os centros são escuros, quase negros, e
se estendem por mais de ¾ do diâmetro
da colônia; é difícil distinguir a
estrutura interna da parte escura central.
Os centros são de cor marrom, mas
não tão escuros como os da E. coli e
menores em relação ao resto da
colônia. A estrutura interna, nas
colônias novas, é habitualmente,
estriada.
Aspecto à luz refletida Colônias escuras, em forma de botão.
Regra geral: semelhantes a anéis
concêntricos com brilho metálico
esverdeado.
Mais claras do que as do E. coli.
Não se observa brilho metálico,
exceto, ocasionalmente, nas
depressões do centro das colônias,
quando elas existem.
Os tubos de AN e caldo lactosado inoculados a partir de colônias típicas ou em falta
destas, de uma colônia rósea, clara, atípica, serão incubados a 35ºC durante 24 / 48 horas. Se
após 48 h não houver fermentação no tubo com caldo lactosado, este ensaio confirmativo
será negativo.
Caso haja formação de gás, faz-se uma coloração de Gram, partindo-se da cultura em
AN. Tratando-se de bastonetes Gram negativo, não esporulantes, o ensaio confirmativo é
positivo.
17
3º Etapa:
ENSAIO DIFERENCIAL PARA COLIFORMES FECAIS
Geralmente os testes referidos são suficientes para determinar a espécie de coliforme
presente. Entretanto, muitas vezes deseja-se separar os componentes de origem fecal dos
provenientes de outras fontes. Estas determinações de coliformes fecais são aplicáveis às
estimativas do grau de poluição das águas brutas submetidas a processo de depuração, ou a
estudos de poluição dos cursos de água, ou ainda à interpretação de dados sobre coliformes
totais cuja significação seja duvidosa.
Técnica:
Este ensaio é realizado a partir dos tubos positivos do ensaio presuntivo.
De cada tubo positivo, inocula-se um tubo com meio EC dotado de tubo Durham.
Incubando-se em seguida em banho-maria a 44,5º 0,5ºC durante 24 2 horas.
A produção de gás dentro de 24 horas é considerada positiva para a presença de
coliformes fecais e sua densidade numérica é calculada pela tabela do NMP.
Quando o ensaio confirmativo for efetuado paralelamente ao teste diferencial para
coliformes fecais, considerar a dupla confirmação (caldo lactosado-verde brilhante-bile e
Meio EC) como teste completo positivo
Se a finalidade for o exame completo, prosseguir a partir dos tubos com caldo lactosado-
verde brilhante-bile com resultado positivo no ensaio confirmativo
4º Etapa:
ENSAIO COMPLETO OU DIFERENCIAL (opcional)
Partindo-se da cultura de coliforme em Agar-nutritivo (AN) obtida a partir do ensaio em
meio confirmativo sólido (EMB), inocula-se:
a) um tubo de caldo-peptona ou caldo-triptona, para o teste de Indol.
Caso se use peptona dá-se preferência a de caseína ou faz-se teste, usando-se uma
cultura conhecida de E. coli, para verificar a presença de triptofano na peptona utilizada (Se
a bactéria Escherichia coli típica não produzir Indol, a peptona não deve ser usada).18
b) Um tubo com caldo glicosado-fosfatado (meio de Clark Lubs), para os testes de
vermelho de metila e de Acetilmetilcarbinol ou de Voges-Proskauer.
c) Um tubo com meio citrato (o citrato de Koser) para a prova de utilização de citrato.
Pode-se também usar um meio de citrato sólido ( o meio de citrato de Simmons)
Esses testes são conhecidos pela sigla da língua inglesa I.M.Vi.C. (Indol, Methyl red,
Voges-Proskauer, Citrate). Após o semeio, os tubos serão incubados a 35ºC por tempos
variáveis.
Teste de Indol: Após incubação durante 18 a 24 horas, juntar à cultura crescida 0,2 a
0,3 ml do reagente de Kovac’s.
Aparecimento de anel sobrenadante vermelho intenso indica a presença de Indol,
teste positivo.
Se a cor do reagente permanecer inalterada: teste negativo.
Teste de Voges-Proskauer: Após incubação por 48 horas, retira-se com pipeta estéril
1ml da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6 ml de solução de -
naftol e 0,2 ml de KOH a 40%. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa
a 35ºC. Observa-se a partir de 15 minutos até o máximo de 4 horas:
Aparecimento de coloração cereja que se estende da superfície para o fundo do
tubo indica teste VP positivo.
O aparecimento de coloração acobreada ou mesmo de coloração vermelha após 4
horas de observação indica teste VP negativo.
Teste de vermelho de metila: a cultura inoculada em meio de caldo glicosado-fosfatado
deve permanecer incubada por 4 a 5 dias a 35ºC. No fim desse período, junta-se
algumas gotas do indicador vermelho de metila:
Cor vermelha: teste positivo
Cor amarela: teste negativo.
Teste de citrato: a amostra de coliforme é inoculada no meio de citrato de Koser, de
preferência com a alça em forma de agulha, levando-se o mínimo possível de material.
Incuba-se o tubo em estufa a 35ºC por 72 / 96 horas.
Teste positivo: crescimento visível (o meio fica turvo);
Teste negativo: ausência de crescimento (o meio permanece límpido)
19
Quando realizado em meio de Simmons uma virada de indicador azul de
bromotimol, de verde para azul indica: citrato positivo. A tabela-3 apresenta o teste IMViC
para alguns microrganismos presentes na flora intestinal. Como exemplo, escolheu-se duas
colônias que após terem sido submetidas aos ensaios bioquímicos (IMViC) apresentou os
resultados a seguir:
Tubo 1: + + - -
Tubo 2: - - + +
Consultando-se a tabela 3, pode-se concluir que no tubo 1 foi encontrado a bactéria
Escherichia coli variedade 1 e no tubo 2, Enterobacter aerogenes.
Tabela 3.0 – Interpretação das reações IMViC
Microorganismos IndolVermelhodeMetila
VogesProskauer
Citrato
Escherichia coli
Variedade I
Variedade II
+
+
+
Citrobacter freundii
(intermédiarios)
Variedade I
Variedade II
+
+
+
+
Enterobacter aerogenes
Variedade I
Variedade II
+
Na figura 4 são apresentadas, de forma esquemática, todas as etapas necessárias a
pesquisa de coliforme em uma amostra de água. Dependendo da finalidade ou da suspeita
sobre a qualidade da água, outros microrganismos devem ser pesquisados, tais como:
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus, clostridium, Vibrio cholerae, vírus,
cianobactérias, entre outros.
20
Figura 4 - Todas as etapas necessárias à pesquisa de coliforme em uma amostra de água
21
PRESENÇA DE GÁSColiformes presentes
AUSÊNCIA DE GÁSProva negativa
Coliformes ausentes
ENSAIO CONFIRMATIVOCaldo verde brilhante lactose bile
35ºC - 24/48 2h
MEIO DE EC44,5 0,5ºC -24 2h
AUSÊNCIA DE GÁSProva negativa
coliformes ausentes
PRESENÇA DE GÁS Prova positiva
PRESENÇA DE GÁS Prova positiva
Coliformes fecais presentes
MEIO CONFIRMATIVO SÓLIDOMeio EMB, ENDO.35º 0,5ºC / 24 2h
ENSAIO PRESUNTIVOCaldo lactosado – 24/48 2h / 35ºC
AMOSTRAVolumes Decimais Adequados
CALDO LACTOSADO24/48 2h 35º 0,5ºC
Ensaio completoou diferencial
AGAR NUTRITIVO24/48 2h 35º 0,5ºC
Colônias típicas de coliformes
Ausência de Colônias.Coliformes ausentes
Colônias atípicas
Teste de GramAUSÊNCIA DE GÁSColiformes ausentes
5. PESQUISA DA BACTÉRIA Pseudomonas aeruginosa
Como já foi comentado anteriormente, a legislação em vigor considera a bactéria
Escherichia coli , os coliformes fecais e a contagem de heterotróficas como indicadores de
contaminação fecal. No entanto, a ausência desses indicadores não determina a sanidade da
água analisada, uma vez que bactérias como Pseudomonas aeruginosa podem interferir na
detecção desses microrganismos. Embora não haja microrganismos com características de
indicador universal, vários autores advogam a necessidade da adição às análises rotineiras, a
pesquisa da bactéria Pseudomonas aeruginosa como indicador de contaminação hídrica.
O gênero Pseudomonas é amplamente distribuído na natureza, sendo comum em
ambientes hospitalares. Compõem-se de várias espécies, destacando-se a espécie
Pseudomonas aeruginosa, por ser saprófita em seres humanos, provocando doenças
naqueles cujas defesas estejam alteradas. São bacilos Gram-negativos, móveis, aeróbios
estritos, não apresentam grandes exigências nutricionais, crescem a 40º 5ºC e toleram pH
altos. Algumas linhagens produzem pigmentos fluorescentes e toxinas como a exotoxina A,
que é responsável por necrose de tecidos e pode ser letal quando injetada na forma
purificada.
ENSAIOS PARA DETERMINAÇÃO DA BACTÉRIA Pseudomonas aeruginosa
Utiliza-se a técnica de tubos múltiplos (5tubos), onde as amostras são inicialmente
inoculadas em caldo-asparagina (3 alçadas consecutivas) e, confirmadas em caldo-
acetamida, incubadas a 35o C por 24-48h. Os resultados são expressos em NMP (número
mais provável de P. aeruginosa em 100mL da amostra). Para isolar culturas dessa bactéria
ou impedir a possibilidade de ocorrência de resultados falsos-positivos, inóculos oriundos
dos tubos positivos em caldo acetamida são inoculados em meio de agar- leite a 35ºC por
48h .
22
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• ATLAS, R.. M., 1989, Microbiology - Fundamentals and Applications. 2 ed.
New York, Macmillan Publishing Company.
• BROCK,T.D. & MADIGAN, M.T., 1991, Biology of Microorganisms. 6th ed., London,
Prentice-Hall International.
• CETESB, São Paulo. Apostila Microbiologia Ambiental, 2000
• GUILHERME, E. F. M. & SILVA, J. A M., 2000, “Pseudomonas aeruginosa, como
indicador de contaminação hídrica”, Higiene Alimentar, 11(76).
• JAWETZ, E.; MELNICK, J.L.; ADELBERG, E. A.; BROOKS, G. F.; BUTEL, J. S.;
ORNSTON, L. N., 1991, Microbiologia Médica. 18a ed., Rio de Janeiro, Guanabara
Koogan.
• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2 ed., v. 1., Rio de Janeiro. Makron Books do Brasil.
• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2 ed., v. 2, Rio de Janeiro, Makron Books do Brasil.
• MACEDO, J. A B., 2001, Águas & Águas. 1ª ed., São Paulo, Varela.
• SANCHEZ, P.S.. Apostila Atualização em Técnicas para o Controle Microbiológico
de águas minerais. 1999. São Paulo. ABINAM / Universidade Presbiteriana Mackenzie
• BRASIL, Leis , decretos, etc.... Resolução CONAMA nº 274 de 29 de novembro de
2000.
• BRASIL, Leis , decretos, etc.... Portaria nº 1469 de 29 de dezembro de 2000, Normas de
qualidade da água para consumo humano. Diário Oficial (Republica Federativa do
Brasil, 19 de fevereiro de 2001).
23
*Referência: Standard Methods 20ª Edição, 1998
24
ANEXO 1ÍNDICE DE NMP E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95%, QUANDO SÃO UTILIZADOS INÓCULOS DE 10ml, 1ml E 0,1ml EM SÉRIES DE 5 TUBOS*
10ml
0000111112222223333334444444444555555555555555555555555
111111221223353446675779
129
121215169
1020102030203040304060805070100120160100100200300600
10101311151518181720212425292429293535403845465563566567778086110140120150180170210250250300360410390480580690820940
1300200029005300
Limites de confiança de 95%
Inferior superior
Número de tubos com reação positiva, em séries de 5tubos, inóculos de:
Índice de NNP por 100ml da amostra
22242446647799
12811111414171317172126222627333423304030506050709080110140170130170220280350240300500900
16001600
0012001120011230011220011122334000111222333344444555555
0,1ml
0100010100101000101010101201010012012012012301234012345
1 ml
ANEXO 2
Meios de cultura utilizados na Análise Bacteriológica de Água
Estes meios podem ser encontrados sob forma desidratada de fabricantes como Difco,
Sigma, Merk, Oxoid, entre outros.
1- Caldo lactosado
Extrato de carne - 3,0 g
Peptona - 5,0 g
Lactose - 5,0 g
Água destilada - 1 1
PH 6,8-7,0. Autoclava-se a 120ºC, 15 min. Caso
se deseje o caldo lactosado de concentração dupla,
usa-se a metade da água destilada.
3-Glicose-agar GA
Extrato de carne - 3,0 g
Peptona - 5,0 g
Glicose -10,0 g
Agar (em pó) -10,0 g
Água destilada -1 1
PH 6,8-7,0. Autoclava-se a 120ºC, 20 min
2-Caldo de verde brilhante – lactose - bile
Peptona - 10,0 g
Lactose - 10,0 g
Bile de boi - 20,0 g
Verde brilhante - 0,0133 g
Água destilada -1 1
PH 7,2.
Autoclava-se a 115ºC, 15 min. Para adicionar o
verde brilhante pode-se preparar uma solução a
0,1% em água destilada e dela juntar 13,3 ml ao
meio de cultura
4- Endo - agar
Peptona - 10,0 g
Lactose - 10,0 g
K2HPO4 - 3,5 g
Sulfito de Sódio - 2,5 g
Fucsina básica - 0,5 g
Agar (em pó) -10,0 g
Água destilada -1 1
PH 7,4. Esterilizar 115ºC, 15 min.
7- Caldo glicose-fosfato
Peptona - 5,0 g
Glicose - 5,0 g
K2HPO4 - 5,0 g
Água destilada -1 1
Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaio e
autoclavar a 120ºCpor 15 min.
8 - Citrato de Kozer
Citrato de sódio - 3,0 g
K2HPO4 - 1,0 g
MgSO4.7H2O - 0,2 g
NaNH4HPO4.4H2O - 1,5 g
Água destilada - 1 1
Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaios e
autoclavar a 120ºC por 15 min.
25
9- Eosina-azul de metileno-agar EMB
Peptona - 10,0 g
Lactose - 5,0 g
Sacarose - 5,0 g
HK2PO4 - 2,0g
Agar -10,0 g
Coloca-se em balões de 100 ml ou 200 ml exatos.
Esterilizar a 120ºC, 30 min.
Quando for distribuir em placas, para uso, fundir o
meio, esfriar a 45ºC e juntar para cada 100 ml, 1
ml de solução aquosa estéril de Eosina a 4 g/100
ml e 1 ml de solução aquosa estéril de azul-de
metileno (0,65 g/100 ml.)
10- Citrato de Simmons
Citrato de sódio - 2,0 g
MgSO4.7H2O - 0,2 g
NH4H2PO4 - 1,0 g
NaCl - 5,0 g
Azul de bromotimol -0,08 g
Agar (em pó) - 10 g
Água destilada -1 1
Fundir, colocar em tubos de ensaio e autoclavar a
120ºC por 15 min.
11- Meio EC
Triptose ou tripticase – 20,0 g
Lactose - 5,0 g
Mistura de sais biliares ou
Sais biliares n.º 3 -1,5 g
K2HPO4 -4,0 g
KH2PO4 -1,5 g
NaCl - 5,0 g
Água destilada - 1 1
pH 6,9
Colocar em tubos de fermentação e autoclavar a
115ºC por 15 min.
12- Preparação da água tamponada para diluições
Prepara-se uma solução “stock” dissolvendo 34,0
g de KH2PO4 em 500 ml de água destilada,
ajusta-se, com NaOH 1N, o pH a 7,2 e completa-
se o litro com água destilada.
Para preparar a água tamponada de diluição,
junta-se 1,25 ml da solução “stock” a 1 l de água
destilada. Distribui-se em frascos ou tubos
convenientemente e autoclava-se a 120ºC por 15
min.
26
Soluções corantes e reagentes
Cristal violeta ou violeta de genciana
Solução A : Cristal violeta (90% corante) - 2,0 g
Álcool etílico (95%) - 20 ml
Solução B: Oxalato de amônio - 0,8 g
Água destilada - 80 ml
Juntar as soluções A e B
Lugol
Iodo - 1 g
Iodeto de potássio - 2 g
Água destilada - 300 ml
Misturar num almofariz o iodo e o iodeto de potássio,
depois juntar a água.
Reagente indicador de vermelho de metila
Vermelho de metila - 0,1 g
Álcool absoluto - 300 ml
Água destilada - 200 ml
Reagente de Kovac’s
Para-dimetil amino benzaldeido - 5,0 g
Álcool amílico ou butílico - 75 ml
HCl concentrado - 25 ml
Reagente para a prova de Voges-Proskauer
(Método de Barrit)
Solução A: naftol - 5,0 g
Álcool absoluto - 100 ml
Solução B: KOH - 40,0 g
Água destilada - para completar 100 ml
Safranina
Safranina - 0,25 g
Álcool etílico (95%) - 10 ml
Água destilada - 100 ml
Portaria MS 518 , de 25 de março de 2004, que aprova a norma de qualidade da água para consumo humano. Publicada no Diário Oficial de 26 de março de 2004 - Revoga a Portaria 1469 GM/MS de 29/12/2000.
27
ANÀLISE BACTERIOLÒGICA
CERTIFICADO N.º - 3333/2002 AMOSTRA: 03TIPO DE AMOSTRAGEM: Água de poço (não clorada)OBSERVAÇÃO: Saída do poçoLOCAL DA AMOSTRAGEM: Escola de QuímicaTEMPO DE PERFURAÇÃO: 16 anosPROFUNDIDADE DO POÇO: 17 metrosDATA DA COLETA: 28/01/2004 HORA DA COLETA: 15:00 hSOLICITADA POR: Rachel PerezENDEREÇO: Rua da Esperança no 301, Solicitude RESPOSÁVEL PELA COLETA: O solicitante
RESULTADOS:
1. PESQUISA DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME
Coliformes totais em 100 ml da amostra:
Coliformes fecais em 100 ml da amostra:
CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS EM PLACAS:
2. PESQUISA DE Pseudomonas aeruginosa:
CONCLUSÃO:
Recife, 06 de fevereiro de 2004.
______________________________André Armando Perez y Palha
Engenheiro QuímicoCRQ 17.379375 – 1ª Região
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MINISTÉRIO DA SAÚDE
GABINETE DO MINISTRO(*)
PORTARIA Nº 518, DE 25 de MARÇO DE 2004
Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências.
0 Ministro de Estado da Saúde, INTERINO, no uso das atribuições e
considerando o disposto no Artigo 2º do Decreto nº 79.367, de 9 de março de 1977, resolve:
Art. 1º Aprovar a Norma de Qualidade da Água para Consumo Humano, na forma do Anexo desta Portaria, de uso obrigatório em todo território nacional.
Art 2º Fica estabelecido o prazo máximo de 12 meses, contados a partir da publicação desta Portaria, para que as instituições ou órgãos aos quais esta Norma se aplica, promovam as adequações necessárias a seu cumprimento no que se refere ao tratamento por filtração de água para consumo humano suprida por manancial superficial e distribuída por meio de canalização e da obrigação do monitoramento de cianobactérias e cianotoxínas.
Art. 3º É de responsabilidade da União, dos Estados, do Distrito Federal e dos Municípios a adoção das medidas necessárias para o fiel cumprimento desta Portaria.
Art. 4º 0 Ministério da Saúde promoverá, por intermédio da Secretaria de Vigilância em Saúde - SVS, a revisão da Norma de Qualidade da Água para Consumo Humano estabelecida nesta Portaria, no prazo de 5 anos ou a qualquer tempo, mediante solicitação devidamente justificada de órgãos governamentais ou não governamentais de reconhecida capacidade técnica nos setores objeto desta regulamentação.
Art. 5º Fica delegada competência ao Secretário de Vigilância em Saúde para editar, quando necessário, normas regulamentadoras desta Portaria.
Art. 6º Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicação. Art. 7º Fica revogada a Portaria nº 1469, de 29 de dezembro de
2000, publicada no DOU nº 1 – E de janeiro de 2001, Seção 1, página nº 19.
GASTÃO WAGNER DE SOUSA CAMPOS
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