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7/25/2019 Apostila_Biotecnologia_ufsc.pdf

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As biotecnologias em seu sentido mais amplo compreendem a manipula-o de microorganismos, plantas e animais, objetivando a obteno de proces-

sos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a apli-

cao dos conhecimentos de fisiologia, bioqumica e gentica, considerada

como tcnica biotecnolgica. Em seu senso mais restrito as biotecnologias es-

to associadas ao emprego das tcnicas modernas de biologia molecular e ce-

lular. Outros conceitos de biotecnologias: a) a utilizao de sistemas celulares

para a obteno de produtos e desenvolvimento de processos (CNPq); b) a a-

plicao dos princpios cientficos e de engenharia para o processamento de

materiais por agentes biolgicos proporcionando produtos ou servios (FAO,

1989); c) o uso das tcnicas de regenerao in vitroe do DNA recombinante

(Fernandes, 1987).Uma das principais caractersticas das biotecnologias modernas sua a-

brangncia ampla e seu carter multidisciplinar. Sua insero em pases com

padres desiguais de desenvolvimento deve ser baseada no conceito de biotec-

nologias apropriadas ou pertinentes, proposto pela FAO. Assim, biotecnolgias

apropriadas seriam aquelas que contribuem com o desenvolvimento sustent-

vel por: a) serem tecnicamente factveis no atual contexto de desenvolvimento

tecnico-cientfico do pas; b) proporcionarem benefcios mensurveis aos des-

tinatrios; c) serem ambientalmente seguras, socio-economicamente e cultural-

mente aceitveis no atual estgio de desenvolvimento do pas.

Dentre as muitas aplicaes destas tcnicas, destacam-se aquelas relaciona-das com a transferncia de genes de organismos diferentes para a incorporao

de caractersticas como a resistncia de pragas e patgenos e a estresses abiti-

cos, no genoma de uma determinada planta. Outras aplicaes visam o aumen-

to da eficincia fotossinttica ou a produo de metablitos e constituintes im-

portantes do ponto de vista nutricional e farmacutico . Estas tcnicas, quando

associadas com procedimentos de cultura de tecidos, permitem a propagao

rpida e massal de gentipos superiores estveis e isentos de doenas.

Novas estratgias para a propagao clonal, para a fixao de ganhos gen-

ticos e novas abordagens para gerar variao gentica so requisitos funda-

mentais para o melhoramento de plantas. Desta maneira, um dos maiores be-

nefcios das tcnicas de cultura de tecidos vegetais para o melhoramento de

plantas perenes, refere-se possibilidade de capturar e fixar os componentes

aditivos e no aditivos da varincia gentica atravs da propagao clonal.

Desta maneira estas tcnicas, baseadas que so na totipotencialidade de ex-

plantes, podem se tornar ferramentas poderosas para a propagao massal de

gentipos superiores.

A possibilidade de manipulao de sistemas in vitro para a clonagem de

gentipos superiores de espcies vegetais dependente de uma srie de fato-

res. A compreenso e domnio de conceitos bsicos em fisiologia do desen-

volvimento de fundamental importncia para a aplicao deste conhecimen-

to. Um dos objetivos do presente texto a apresentao e a discusso sucintados principais tpicos pelos quais possvel extrair-se respostas morfogenti-

cas orientadas quando correlaes morfolgicas, fisiolgicas, genticas e bio-

qumicas, existentes em uma planta intacta so rompidas e sistemas de culturas

de tecidos clulas e rgos so utilizados para "orientar" novos padres morfo-

genticos.

Introduo ao conceito de

Biotecnologia

ApostiladeBiotecn

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AP OS TI L A DE BI OT ECN OL OG I A CC A/ UF SC MP GU ERR A & RO NO DA RI ; ED I O DA ST EI NM AC HE R (2 006 )

1.1 Cultura de tecidos desorganizadosCalos Cultivo e manuteno de massas celulares desorganizadas que se originam da proliferao

desordenada a partir de tecidos ou rgos cultivados in vitro.Suspenses Proliferao de clulas isoladas ou pequenos aglomerados dispersos em um meio lqui-

do, sob agitao.

1.2 Cultura de estruturas organizadasCultura de rgos Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro.

Inclui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdios e segmentos foliares. Paraos propsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so:

a)Cultura de meristemas pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo umou dois primrdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares.

b) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregadapara estabelecer culturas que originam multgemas, gemas, eixos ou brotaes caulinares mlti-plos.

c)Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples oumltiplas.d) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem

plntulas.e) Cultura de razes isoladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando

novas razes.

1.3 Quanto a rota morfogentica1. Organognese direta Gemas ou primrdios de gemas pr-existentes que so induzidas prolife-

rao.2.Organognese indireta Novas gemas e eixos caulinares so induzidos e formados a partir de teci-

dos no organizados (calos) originados de explantes de diferentes origens.

2. BASE CONCEITUALpice caulinar:segmento do pice do caule, composto pelo meristema apical (0,05 a 1,0 mm) junta-

mente com os primrdios foliares e folhas em desenvolvimento. Porm, no deve ser confundidocom o meristema, que o conjunto de clulas indiferenciadas e de caractersticas embrionrias.

At ivao:processo que favorece a reentrada ao novo ciclo bioqumico oi fisiolgico de rgo ou tecido. muito comum referir-se a ativao de gemas. Para ocorrer a ativao necessria a existnciade rgo ou tecido pr formado ou formado.

Clulas indiferenciadas:refere-se ao estado caracterizado por clulas isodiamtricas, com pouco ounenhum vacolo e grande ncleo. Geralmente esto localizadas no meristema e mantm as ca-ractersticas embrionrias.

Ciclo celular:processo ou fases celulares de divi-so padro. Enquadra-se em dois grandesgrupos: meiose e mitse, que em um organis-mo diplide pode originar respectivamente u-ma nova clula haplide, quando ocorre a sa-da do ciclo celular no final de G2 (sem a dupli-cao dos cromossomos) ou diplide, quandodo completo processo de diviso celular (cdc).

Figura 01 Diagrama representativo do ciclo de diviso celular (cdc)

de uma clula diplide.(Adaptado de George, 1993).

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MicropropagaoDiferentes rotas morfogenticas para a obtenode plantas in vitro


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Clones: Independente da origem e sob o aspecto aplicado, as tcnicas de cultura de tecidos vegetaispermitem a propagao clonal massal de gentipos superiores. Segundo o Cdigo Internacionalde Nomenclatura de Plantas Cultivadas,clone uma das categorias bsicas da cultivar e designaum conjunto geneticamente uniforme de indivduos, derivados originalmente de um individuo sim-ples por propagao assexuada (enxertia, estaquia, mergulhia, apomixia ou micropropagao). Oconceito de propagao clonal implica na seleode gentipos com graus variados de heterozigo-se e sua fixaonas geraes subseqentes (Kester, 1983). Clones so empregados no melhora-mento de plantas para capturar os componentes aditivos e no-aditivos da varincia gentica. Oscomponentes aditivos da varincia gentica baseiam-se no efeito independente dos alelos, en-quanto que os efeitos no-aditivos, muitas vezes perdidos nos cruzamentos sexuais, baseiam-sena interao dos alelos, dentro ou entre locus (Durzan, 1988). Uma das maiores vantagens da pro-pagao clonal a possibilidade de se explorar a varincia gentica total, ao invs dos componen-te aditivo apenas. Muitos dos programas de melhoramento gentico de plantas perenes e estabe-lecidos no hemisfrio norte, a partir da dcada de 50, foram baseados na seleo recorrente. Nes-tes programas a seleo feita aps cadagerao de intercruzamentos de materiaisselecionados para proporcionar a recombi-nao gentica. Enquanto que o melhora-mento convencional permite a fixao dos

ganhos genticos nas geraes subse-qentes, a micropropagao permite a ex-plorao da variao gentica em uma ge-rao, atravs da clonagem de gentipossuperiores (Figura 2). Apesar dos benef-cios dos clones para a agricultura, a con-centrao de uma produo em larga esca-la de apenas um gentipo ou de poucosgentipos de origem comum pode tornartodas as plantas igualmente vulnerveis pragas e molstias ou estresses abiticos epode tambm diminuir o interesse na ma-

nuteno de uma diversidade mais amplanos bancos de germoplasma existentes,resultando no estreitamento da base gen-tica.

Crescimento desorganizado:Quando, tecidos formados in vitro, no apresentam estruturas claramen-te definidas e contm um nmero limitado de clulas especializadas e diferenciadas. Uma cluladiferenciada aquela que desenvolveu forma especializada (morfologia) ou funo especializada(fisiologia). Um tecido organizado a agregao de clulas diferenciadas (ex. xilema ou epiderme).Por outro lado estruturas indiferenciadas podem ocorrer na induo de calos que so agregadoscelulares desorganizados que se originam da proliferao desordenada a partir de tecidos ou r-gos cultivados in vitro e por meio de suspenses celulares que so a proliferao de clulas isola-

das ou pequenos aglomerados de clulas dispersos em um meio lquido, sob agitaoCrescimento organizado Tecido ou rgo de crescimento determinado em produzir um novo rgo

(desenvolvimento) de forma a resultar novas estruturas vegetais. Crescimento ps meristemtico.

Competncia celular:Capacidade das clulas reagirem a sinais (que podem ser reguladores de cresci-mento) especficos de desenvolvimento. Diz respeito capacidade das clulas em expressar umpotencial inerente. Esta habilidade da clula pode se dar por: a) Ativao que pode ser definidacomo a mudana na competncia envolvendo a rediferenciao de determinadas clulas (modelosdiretos); b) Induo: que pode ser definida como a iniciao de uma resposta particular de diferen-ciao a partir da desdiferenciao celular (modelos indiretos). A induo est associada proces-sos de desdiferenciao, que pode ser definida como a (re)entrada no ciclo celular. Buvat (1944)demonstrou que a desdiferenciao celular consiste de dois estgios: regresso capacidade de

diviso e retorno estrutura citolgica de clula meristemtica (embrionria)

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Figura 02 Explorao da variao gentica em uma gerao, atravs da

clonagem de gentipos superiores.


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Cultura de rgos:Formas organizadas de crescimento podem ser mantidas continuamente in vitro. In-clui o isolamento assptico de estruturas definidas como primrdios e segmentos foliares. Para ospropsitos da micropropagao, os mais importantes tipos so:

f) Cultura de meristemas:pices meristemticos consistindo do domo apical isentos ou contendo um oudois primrdios foliares. Originam eixos unipolares caulinares.

g) Cultura de pices caulinares Iniciada a partir de pices caulinares ou gemas laterais. Empregadapara estabelecer culturas que originam multgemas, gemas, eixos ou brotaes caulinares mltiplos.

h) Culturas de segmentos nodais Contm segmentos caulinares que carregam gemas simples oumltiplas.

i) Cultura (ou resgate) de embries Embries zigticos so excisados e cultivados para dar origem plntulas.

j) Cultura de razes iso ladas Razes cultivadas sem conexo com os eixos caulinares, originando no-vas razes.

Diferenciao: processo de diversificao das caractersticas bioqumicas, anatmicas, morfolgicas efisiolgicas, ocorrida nas clulas, nos tecidos ou rgos durante o desenvolvimento a partir do esta-

do meristemtico ou juvenil para o adulto. As clulas do embrio meristema apical so exemplos deestado indiferenciado, as quais ganham novas competncias se tornando diferenciadas.

Desdiferenciao celular:retorno de clulas diferenciadas ao estado meristemtico no diferenciado.

Determinao celular:Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma clula torna-se limita-do a uma rota especfica (Christianson,1985). A determinao celular diz respeito a uma canaliza-o progressiva no desenvolvimento.

Epignese:Ativao seletiva e diferencial de genes (reprogramao celular). Um exemplo comumentecitado como representativo em uma planta intacta a transio da fase juvenil para a fase adulta.

Epistasia: refere-se inativao de um (trans)gene (o supressor) sobre um outro (trans)gene.

Induo: o desencadeamento de um processo morfogentico pela exposio do explante a um estmu-lo fsico, qumico ou biolgico. A induo envolve o controle da expresso gnica, embora no sejaum fenmeno gentico, pois no ocorre ganho ou perda gentica (modificao allica ou genotpi-ca). Refere-se somente a expresso dos genes pr existentes. Em cultura de tecidos, a sinaliza-o por um fitormnio a uma resposta especfica a nvel celular.

Haplide:indivduo que apresenta o nmero de cromossomoss igual ao do gametfito ou da haplofase(n). de maneira mais especfica, plantas haplides so aquelas com carga cromossmica no dupli-cada, monoplides.

Hormnios vegetais:No presente contexto este trmo define uma das classes de compostos que regu-lam processos de desenvolvimento (morfognese) em plantas, sendo, provavelmente, os mais im-portantes mediadores na transduo de sinais. Os hormnios so molculas regulatrias de ocor-

rncia natural que agem como sinais qumicos para regular o crescimento e o desenvolvimento(morfognese). Fitorreguladores ou reguladores de crescimento so substncias sintticas que mi-metizam os efeitos dos hormnios no metabolismo celular.

Meristema:tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido com sntese protoplasmtica e for-mao de novas clulas por diviso mittica. Sem especificao, o termo refere-se normalmente aomeristema apical do caule (regio localizada numa depresso central que d origem aos mais novosprimrdios foliares de tamanho varivel entre espcies vegetais, normalmente formado por uma por-o de 60 a 100 clulas isodiamtricas indiferenciadas, que mantm permanentemente as caracte-rsticas embrionrias primrias.

Micropropagao:Propagao clonal massal de um gentipo selecionado por tcnicas de cultura in vi-tro. Este trmo, utilizado primeiramente por Hartman e Kester (1975), passou a ser empregado paradefinir os processos de propagao vegetativa na cultura de tecidos vegetais.

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Morfognese: Integrao entre crescimento (mudanas quantitativas) e diferenciao (alteraes quali-tativas), mediada por diviso e especializao celular. A morfognese o resultado de um complexocontrole hormonal mltiplo, espacial e temporal, atravs da regulao e expresso de sistemas gni-cos mltiplos. A morfognese na planta intacta mediada pela ao correlativa dos meristemas ede seus produtos. Na cultura de tecidos vegetais, ao se romper as correlaes endgenas os teci-dos ficam sujeitos s condies exgenas, representadas no caso pelos fitorreguladores adiciona-dos ao meio de cultura. A morfognese in vitro passa ento a ser modulada pelo balano de fitorre-guladores adicionados ao meio de cultura. Isto foi comprovado experimentalmente por Skoog e Mil-ler (1955) e cujos resultados so sumarizados na figura 03.

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Figura 03- Morfognese in vitro modulada pelo balano de fitorreguladores adicionados ao meio de cultura.

Totipotencialidade: Princpio biolgico creditado ao fisiologista vegetal alemo Haberlandt, que em1902, enunciou que cada clula vegetal possua o potencial gentico para reproduzir um organismointeiro. Como corolrio, este fisiologista elaborou previses de que tecidos, clulas e rgospoderiam ser mantidas indefinidamente em cultura. De certa forma o conceito de totipotencialidade jera inerente teoria celular de Schleiden e Schwan (1838 apud Vasil et al., 1979) ao postularem quealgumas clulas eram capazes de serem separadas do organismo e continuar a crescer

3. MECANISMOS REPRODUTIVOS E PADRES DE DESENVOLVIMENTO ENTRE ANIMAIS EPLANTAS

Plantas e animais apresentam similaridades na natureza de seu material gentico e nos mecanismospelos quais a informao gentica processada e utilizada. Nos outros nveis as diferenas sobvias e considerveis:

A) Plantas no estabelecem uma linhagem germinativa especfica, no havendo distino entre clulasque formam o organismo e as clulas reprodutivas. Em animais os gametas so produzidos apenas

por clulas-filhas descendentes de uma linhagem germinativa. Todas a clulas vegetais nucleadas,possuem, em princpio, a capacidade de produzir um novo individuo (totipotencialidade) e apossibilidade de uma clula produzir gametas apenas uma funo de sua localizao noorganismo.

B)Plantas se reproduzem tanto sexuada como assexuadamente.

C) O ciclo de vida de uma planta mais elaborado e complexo do que em animais. Neste a reproduoresulta da produo direta de gametas como resultado da meiose na linhagem de clulasgerminativas. O ciclo de vida das plantas envolve duas geraes alternantes. A gerao dominante a esporoftica e inicia com a fertilizao do ovo e culmina com o desenvolvimento e maturao. Agerao gametoftica, atravs da microsporognese e megasporognese gera respectivamenteplen e saco embrionrio. Um dos ncleos da clula espermtica masculina fecunda o ovo para

formar o zigto, marcando o fim da gerao gametoftica e o incio da esporoftica. A embriognese acompanhada pela formao da semente. que , em ltima anlise, uma estrutura complexa paranutrir o embrio.


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O desenvolvimento animal pode ser confundido comdesenvolvimento embriolgico, uma vez que nestafase so formados os rgos componentes do seuorganismo. Possivelmente isto confere maiordeterminao (canalizao de desenvolvimento) sclulas vegetais e o retorno ao estado embrionrio deuma clula animal adulta somente ocorre por meio datransferncia nuclear que gerou a clonagem da

ovelha Dolly (Fig. 4). Ao contrrio, nodesenvolvimento embrionrio de plantas superiores amaior parte dos sistemas de tecidos e rgos noesto presentes. Estes somente so formados depoisda germinao e a longo da vida da planta atravs dadiferenciao de uma linhagem de clulasembrionrias mantidas nos meristemas. Outroaspecto que diferencia a morfognese animal davegetal que na primeira, as clulas, tornam-sedirecionadas para um caminho particular e especficode desenvolvimento, enquanto que nas clulasvegetais este direcionamento pode ser reversvel.Toda a clula nucleada, mesmo diferenciada, podeser induzida uma re-entrada no ciclo mittico, desdeque ativada com o sinal adequado. Em clulasanimais, portanto, a totipotencialidade encontra-serestrita a uma fase especfica e limitada dodesenvolvimento embrionrio. A migrao celular componente importante da morfognese animal.Clulas animais possuem motilidade e migram emdirees definidas de acordo com as informaesrecebidas de outras clulas. Por sua vez, a rota dedesenvolvimento de uma clula vegetal

determinada pela sua posio na estrutura da planta.No apresentando mobilidade, a posio das clulasvegetais determinada pelos planos de diviso daclula-me. Mesmo considerando que as interaesentre as clulas tm papel fundamental namorfognese animal e vegetal, a natureza dasinformaes trocadas mais limitada em plantas doque em animais.

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Figura 04 Processo de obteno de clones animais

4 MEIOS DE CULTIVO

4.1. INTRODUO

Meios de cultivo so combinaes de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidratos, vitaminas ereguladores de crescimento. Podem ser slidos (adicionando-se gar ou outro agente para geleificao)ou lquidos, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos utilizados para asculturas fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grandeparte, o padro do desenvolvimento in vitro (Torres, 1998). A constituio do meio baseada nas exign-cias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender em necessida-des especficas. Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apre-senta baixo nvel de nitrognio e de potssio, restringindo o seu uso para muitas clulas; entretanto, esta

formulao com baixa concentrao em sais, usada em muitas situaes. O meio MS (Murashige eSkoog, 1962) foi uma das primeiras formulaes melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas,apresentando altos nveis de nitrato, potssio e amnio.


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4.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios nutritivos so formados por mltiplos componentes, sendo bastante variveis em funo da es-pcie vegetal e da origem do explante. constitudo de componentes essenciais e opcionais. Os es-senciais compreendem a gua, os sais inorgnicos, a fonte de carbono e energia, vitaminas e subs-tncias reguladoras de crescimento. Entre os componentes adicionais esto includos os aminocidose amidas, cidos orgnicos e substncias naturais complexas. Os principais componentes de usomais freqente nos meios de cultura so:

4.2.1 gua o componente em maior quantidade do meio de cultura. A qualidade da gua muito importante emcultura de tecidos vegetais. Pode ser uma fonte potencial de impurezas. Para melhor controle deve-se usar gua destilada, bidestilada e deionizada. A utilizao de gua de torneira pode comprometero desenvolvimento da cultura.

Em alguns explantes como calos de fumo a quantidade de gua pode ser limitante para o desenvolvimen-to normal (Linsmaier & Skoog, 1965; Torres, 1998).

4.2.2 Nutr io mineral

Os nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmo estabelecidos para a nutrio mineral b-sica das plantas no campo. So eles:

a) Nitrognio:pode ser acrescentado aos meios na forma orgnica (prontamente disponvel as culturas)

ou na forma mineral. Na forma pode estar disponvel como amnio (ction) ou nitrato, nitrato (nion),ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo do material em cultura (George, 1993). constituinte de aminocidos, nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia na sntese protica. A toxi-dez do amnio s clulas diminui ou desaparece quando ele usado como nica fonte de nitrogniona forma de sal de um cido orgnico, de preferncia um cido tricarboxlico (ciclo de Krebs), comocido ctrico ou cido alfa-cetoglutarico (Torres, 1998). A glutamina (precursora de vrios aminoci-dos) a mais utilizada como fonte de nitrognio orgnico. Meios enriquecidos com nitrognio so fun-damentais para a embriognese somtica, bem como diferenciao de parte area (Amirato, et. al.1983).

b) Fsforo: adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio monobsico (H2PO4-), pois a forma que absorvido(George, 1993). O fosfato monobsico no meio MS utilizado na concen-trao de 1,25 mM. Algumas fontes orgnicas podem ser utilizadas quando existem restries aosfosfatos minerais (Torres, 1998). Atua no metabolismo energtico, na regulao de processos enzi-mticos e na ativao de enzimas (Santiago, 20010). Necessrio para a sntese do ATP e na organo-gnese est envolvido na diferenciao da parte area, pois reverte o efeito das auxinas.

c) Potssio: usado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de vrias enzimas do metabolismode carboidratos e protenas. Uma das mais importantes a quinase do piruvato, enzima envolvidanos processos de gliclise e respirao (Santiago, 2001). necessrio para a embriognese somti-ca (Ammirato, 1983). A deficincia de potssio pode conduzir a hiperhidricidade e decrscimo na taxade absoro de fosfato.

d) Enxofre:utilizado na forma de sulfato ou na forma de aminocidos (cistina, cistena e metionina). En-volvido no metabolismo energrtico na formao do fosfosulfato de adenosina, constituinte da tiami-na, biotina e coenzima A. Sua absoro relacionada assimilao do nitrognio e, independente-

mente, do pH (Santiago, 2001).e) Clcio:usado na forma de nitrato ou cloreto. Est envolvido na diviso celular, uma vez que um dos

componentes da lamela mdia o pectato de clcio. Mantm a integridade da membrana celular e importante para a germinao de gros de plen (George, 1993). um agente quimiotrfico para odirecionamento do tubo polnico. Altas concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para con-trole da necrose do pice caulinar.Pode ter limitaes na translocao entre as clulas.

f) Magnsio:usado na forma de sulfato de magnsio. um dos componentes da clorofila; co-fator impor-tante para vrias reaes enzimticas que atuam sobre substratos fosforilados.

g) Carbono: uma fonte importante de energia a forma o esqueleto de todos os compostos orgnicos.A suplemenao gralmente pela adio de acar na forma de sacarose, glicose, frutose e outras.

h) Ferro:est numa faixa intermediria entre os macros e micronutrientes. adicionado ao meio na for-ma quelato Fe-EDTA. Envolvido nas reaes de oxi-reduo nos organismos vivos. Essencial para asntese da clorofila, integrante do grupo protico (heme) das porfirinas.

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j) Molibidnio: adicionado na forma de molibidato de sdio (Na2Mo04). Co-fator da redutase do nitrato.

k) Cobre: usado como sulfato de cobre. um ction que em dose acima do normal fitotxico s cultu-ras. Constituinte da enzima plastocianina que importante componente do transporte de eltrons.

l) Cloro: essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao de Hill.

m) Zinco:sulfato de zinco. Importante nas reaes de oxi-reduo das plantas. Co-fator de enzimas ani-drase carbnica.

n) Mangans:sulfato de mangans. Essencial no metabolismo para a reao de Hill na fotossntese,

quando a molcula de gua quebrada produzindo eltrons e oxignio.o) Cobalto: usado como cloreto de cobalto e est envolvido na expanso foliar.

4.2.3. Consti tuintes orgnicos

Os compostos orgnicos importantes so os carboidratos, substncias reguladoras de crescimento, vita-minas, aminocidos e amidas, certas purinas e pirimidinas, hexitis e cidos orgnicos.

a) Carboidratos

As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no encontram condies adequadas de iluminao econcentrao de CO2 e, as vezes, no apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotos-sntese (Torres, 1998). Muitas vezes, acares que no so efetivos na manuteno do crescimentodo calo, sustentam a iniciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica.

Os carboidratos mais usados nos meios de ciultura so a sacarose, a glicose e a frutose nos nveis de2% a 5% (p/p) (George, 1993). A concentrao de 3% a mais usada. Concentraes de sacaroseentre 6% a 12% podem ser usadas em cultura de embries, frutos e anteras, enquanto que o nvel de1,5% usado em cultura de protoplastos.

Pode ocorrer a caramelizao do acar quando exceder o tempo de autoclavagem e a sua degradaopode ocorrer a formao de hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2-metilfurano, 2,5-dimetilfuranoe maltol (Ammirato et. al. 1983). Estes compostos formam meladoidinas que so compostos de colo-rao amarronzada, de alto peso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O acar purifica-do com acetato, para precipitar impurezas e pode conter alto nvel de zinco que txico para o teci-do.

Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio.

b) Aminocidos e amidasA suplementao pode ser realizada pela incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeitobenfico pode ser avaliado pela substituio desta protena por uma mistura de aminocidos e ami-das. Os aminocidos e amidas tm importncia na amplificao das respostas morfogenticas, pro-porcionando maior crescimento e facilitando a diferenciao no sentido da regenerao. As formas"L" dos aminocidos so de ocorrncia natural. A tirosina apresenta influencia na iniciao de partearea em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries haplidesmediante o cultivo de micrsporo. As amidas L-glutamina e L-aspagarina so benficas na obtenode embries somticos, e a cistena includa, s vezes, como agente redutor.

c) Vitaminas

Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes, desempenham funes reguladoras

catalticas no metabolismo celular. A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos a tia-mina (B1). A tiamina solvel em gua. Outras vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B3) epiridoxina (B6). Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da autoclavagem, a esteriliza-o a frio recomendada.

Vitamina A:no utilizada nos meio pois, ainda no foi ainda encontrada nas plantas.

Riboflavina (Vit. B2):componente da coenzima FMN (Flavina mononucleotdeo) e o FAD (Flavina-adenina-dinucleotdeo) que atuam em oxidaes biolgicas. Na fotossntese FMN participa do trans-porte de eltrons (George, 1996).

Tiamina (Vit. B1):atua no metabolismo celular devido funo como coenzima na descarboxilao doscetocidos. Ex: Piruvato e cetoglutarato (George, 1996).

c ido pantotnico: um dos componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo

de lipdios.

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c ido nicotn ico (Niacina ou Vitamina B3): um componente das coenzimas NAD e NADP importan-tes na transferncia de hidrognio.

Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B6): Fazem parte de coenzima metablicas deaminocidos. Estas vitaminas tm papel importante nas reaes de transaminao e descarboxilao(George, 1996).

Biotina: atua no metabolismo do cido asprtico, e nas reaes do ciclo de Krebs que levam forma-o deste cido (Ammirato, 1983).

cido ascrbico (vi tamina C):Catalisador de fosforilizao fotossinttica devido ao poder de oxidar ereduzir facilmente (Santiago, 2001).

d) Outros suplementos orgnicos

- Misturas complexas:

So preparaes obtidas de produtos naturais, de composio indefinida, que servem para enriquecer omeio de cultivo. A composio destes produtos de difcil determinao e de uso restrito a algumasculturas e de difcil repetio experimental, quando as tentativas de adequao no forem suficientespara promover determinado processo morfogentico. Em trabalhos de rotina, estas preparaes po-dem ser usadas caso estimulem respostas desejadas.

Protenas hidrolisadas:a mais comum a casena hidrolisada, por ser importante fonte de aminoci-

dos. Outras tambm so utilizadas: lacto-albumina hidrolisada, triptona, peptona, etc.Suco de laranja, tomate e outros:contm cido ctrico e outras substncias de crescimento no identi-

ficadas.

Leite de coco: o endosperma de Cocus nucifera na fase lquida ou gelatinosa. um suplemento bas-tante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio.

Extrato de leveduras: fonte de aminocidos e vitaminas.

Polpa de Banana: usada na suplementao do meio de cultura de orqudeas.

- Hexitis:

Os hexitis so compostos cclicos com grupos OH em todos os seis carbonos. O mais usado o inosi-tol, myo-inositol a forma inativa e i-inositol a ativa. O meso-inositol uma mistura das formas d e l.

O inositol considerado estimulador de processos de crescimento in vitro e pode servir como fontede carboidrato. Desempenha papel importante na biossntese do ciclitol, no armazenamento de com-postos polihdricos como reserva, na germinao de sementes, no transporte de acar, na nutriomineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de membranas, formao de parede celular,homeostase de hormnios e no estresse fisiolgico (Santiago et. al. 2001).

- Compostos fenlicos:

So compostos derivados de fenlicos (mono-OH) e atuam em processos que promovem o desenvolvi-mento areo enquanto que os derivados fenlicos (bi-OH) esto envolvidos com a iniciao de razes(George, 1996). Estas substncias atuam na degradao oxidativa do AIA. Por outro lado, compostosfenlicos (bi-OH) inibem a degradao oxidativa do AIA, tendo efeito benfico no enraizamento(Santiago et. al. 2001).

-cidos orgnicos:A adio de cidos de compostos intermedirios do ciclo de Krebs, tais como malato ou citrato, comum

em meio destinado cultura de protoplastos (Santiago, 2001). Estes compostos parecem estar envol-vidos na minimizao do efeito inibitor da amnia. Por serem solues antioxidantes so preparadasusando uma mistura de 100 mg de cido ascrbico e 150 mg de cido ctrico, dissolvido em 1litro degua e sua esterilizao feita em filtro bacteriolgico de 0,22 ou 0,45 micras (Ammirato, 1983; San-tiago, 2001). O cido ascrbico e o cido ctrico so usados para prevenir o escurecimento de tecidosexcisados de plantas.

- Purinas e Pirimidinas:

A concentrao mais usada varia de 40 a 160 mg/L. As bases nitrogenadas citosina e guanina podemtambm promover o crescimento de cultura de calo. A adenina ou o sulfato de adenina estimulam o

crescimento de brotaes in vitro.

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4.2.3. Reguladores do crescimento vegetal

Para ocorrer o desenvolvimento ou a entrada de atividade de um determinado possesso necessrio asinalizao especfica por reguladores de crescimento em stios regulador por kinases.

O controle qumico da diferenciao da parte area foi primeiramente observado em cultura de calo detabaco. Foi observada inibio na formao de gemas por auxinas, e reverso deste efeito estimulan-do brotaes utilizando-se adenina bem como o fosfato inorgnico. Esta foi a constatao de que oprocesso de organognese in vitro controlado por substncias hormonais sendo que o desenvolvi-

mento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano entre auxinas e citocininas.O balano de auxinas/citocininas em alto/baixo favorecem o enraizamento e o balano inverso promove aformao de parte area. Concentraes iguais promovem a produo de calos.

As auxinas nos meios variam de 0,01 a 10 mg/L. As auxinas mais usadas so AIA (cido indol-3-actico),AIB (cido indol-3-butirico), ANA, 2,4-D, 2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D bastante usadapara a induo de calos e tem o efeito de supresso da morfognese. As auxinas 2,4-D e ANA sosintticas e tm efeitos semelhantes s auxinas de ocorrncias naturais, sendo mais estveis de-gradao. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a formao de calos emmonocotiledneas (Ammirato, 1983). As auxinas so termo-estveis, no decompondo quando auto-clavadas. O AIA a auxina natural e a menos estvel, sendo destrudo em pH baixo.

A no ser o 2,4 D e ANA, as solues estoques no devem ser armazenadas por mais de uma semana.A dissoluo das auxinas feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base para dissolver 10 mg deauxina.

As citocininas so derivadas da adenina(aminopurina) e tm um papel fun-damental na diferenciao e regene-rao de plantas na maioria das es-pcies (Santiago, 2001). Induzem adiviso celular, proliferao e morfo-gnese da parte area. As citocini-nas mais usadas em cultura de teci-dos so a cinetina (CIN), benzilade-nina (BA), zeatina (Zea), isopentenil

adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ).O cido giberlico (GA3) usado, algu-

mas vezes, em cultura de meriste-mas, na recuperao de plantas li-vres de vrus. O GA3 deve ser dis-solvido em gua com pH ajustado a5,7 ou em base (NaOH 1N). As solu-es de GA3 devem ser esteriliza-das em filtro bacteriolgico uma vezque esta substncia se decompepor autoclavagem. As solues es-toques devem ser preparadas nahora.

O cido abscsico (ABA) est envolvidona dormncia e absciso de folhas efrutos. Na cultura de tecidos o papeldeste composto aest envolvidoprincipalmente na maturao de em-bries obtidos na embriognese so-mtica. Este composto termo-estvel e fotossensvel, recomenda-

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Figura 06 Estrutura qumica dos principais regulado-

res de crescimento vegetal.


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4.2.4. pHO pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais normalmente ajustado com HCl ou Na-OH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente cido, entre 5 e 6(normalmente 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulaes lquidas. Em meiosgelificados com gar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissa-

cardeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitao de sais (George, 1996). No ajustedo pH, lava-se primeiramente o eletrdo e, em seguida, faz-se a leitura em tampo 4,0. Posterior-mente lava-se o eletrdo e desta maneira o potencimetro estar calibrado para uso. O pH varia du-rante o perodo de cultura.

4.2.5. Materiais de suportea) gar

gar um polissacardeo obtido pela purificao de algas marinhas. A concentrao usada varia de0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O gar impuro constitudo de polissacardeos, aminocidos, sais, a-car, etc., devendo ser lavado em gua destilada antes de ser usado. O gar alcalino, lquido temperatura de 80C e se solidifica 40C. necessrio a aquisio de agar de boa qualidade, poispodem ser txicos em algumas condies de cultivo (Guerra, 2002).

Outros produtos gelificantes so Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). So mais puros que ogar e provenientes de fermentaes bacterianas (George, 1996). Usados na concentrao de 0,2%(2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar vitrificao em algumas espcies.Alguns laboratrios fazem o uso de polvilho de mandioca ou de milho (maizena) como gelificantes,porm apresentam restries quanto a longevidade por degradar ao longo do cultivo.

b) pontes de papelEm muitas cultura no possvel utilizar agentes geleificantes ao meio e tambm no possvel ouso em imerso em meios lquidos, nestes casos ento, usa-se pontes de papel com meios lquidos.Utilizado principalmente no resgate de embries imaturos e no cultivo de ovrios.

c) Outros produtos: poliacrilamida, slica gel e papel de filtro.

4.2.6 Carvo ativadoE um p bastante fino e de cor escura, sendo utilizado para eliminar substancias txicas produzidaspelo explante. Concentraes em torno de 0,3% so usadas quando se deseja enraizamento in vi-tro, pois auxiliam na ao das auxinas e promovem a fixao dos compostos fenlicos produzidospelo explante. Sugere-se, em alguns casos, aumento da concentrao de auxina, quando na pre-sena de carvo ativado. A pureza deste produto varivel.

4.3 PREPARAO DOS MEIOSO preparo de solues estoque tem por objetivo facilitar o preparo final dos meios de cultivo e preci-so na dosagem dos componentes.Normalmente se mantm os macronutrientes em solues estoque em concentraes 10 vezes su-perior ao da concentrao final (Torres, 1998). Para os micronutrientes as solues estoques so de

1000 vezes superior. Para o quelato EDTA F a soluo estoque de 50 vezes. As pores somantidas em geladeira e por um perodo no superior a uma semana para a maioria das soluesestoques, principalmente aquelas que apresentam precipitao.Solues estoques de vitaminas devem ser mantidas em geladeira ou em congeladores.Recomenda-se montar estoques de sais minerais (conjuntos de macrtonutrientes e micronutrientes),Fe EDTA, misturas orgnicas e reguladores de crescimento.A sacarose e o mio-inositol so pesados e preparados no momento do preparo do meio.

4.4. QUANTIDADE DE MEIOComo regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser utilizado. Devem serconsiderados principalmente as exigncias de luminosidade, temperatura, trocas gasosas e acmu-lo de produtos txicos no meio, que sero discutidas na morfognese.

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4.5. DESINFETANTES E ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURA Os desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas esto apresentados natabela 2.

Tabela 2: Desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas. (Extrado do Catlo-go da Sigma).

Tabela 3: Perodo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de tecidos de plantas.(Extrado do Catlogo da Sigma).

5. PADRES MORFOGENTICOS IN VITROA possibilidade de manipula-

o da morfognese relaciona-secom a exata compreenso dos con-ceitos enunciados anteriormente.Desta forma, tecidos, rgos ou c-lulas com intensidades variadas dedeterminao podem adquirir novascompetncias atravs da ao dedeterminados sinais quimicos

(reguladores de crescimento) queativam seletivamente determinadosgenes (epignese). A resposta final a expresso morfogentica em doisnveis bsicos: organognese e em-briognese somtica.

Uma representao esquem-tica das rotas e sistemas de regene-rao in vitro apresentada na figura7.

Desinfestante Concentrao(%) Exposio (min.)

Hipoclorito de Clcio 9-10 5-30Hipoclorito de Sdio 0,5-5,0 5-30

gua Oxigenada 3-12 5- 15

lcool etlico 70-95 5- 15

Nitrato de prata 1 5-30

Cloreto de mercrio 0,1-1,0 2-10

Volume por recipiente (ml) Tempo de autoclavagem (min.)25 20

50 25

100 28

250 31

500 35

1000 40

2000 48

4000 63

121C e 1,05kg/cm/cm2 = 105kPa

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Figura 07 Principais mtodos de micropropagao e as

rotas de crescimento vegetal dos explantes. (Adaptado de

George, 1996)


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5.1. ORGANOGENESE

A organognese relaciona-se com a obteno de eixos caulinares monopolares originados de ge-mas pr-existentes ou neoformadas. Estes eixos caulinares so induzidos ao enraizamento in vitroou ex vitro resultando em plntulas completas que podem ser ento aclimatizadas. A organognesepode ser direta ou indireta. No primeiro caso, a partir de um explante primrio h a formao de umeixo caulinar a partir de gemas apicais, laterais ou axilares. No segundo caso ocorre a desdiferenci-ao do explante, resultando na formao de calos, que podem ser definidos como a proliferao declulas no diferenciadas massas, originado meristemides (Thorpe, 1980). Para finalidades de mi-cropropagao clonal a formao de calos indesejvel uma vez que a constituio cromossmicadeste material , em geral, instvel, podendo originar variantes genticos, por meio de um processochamado variao somaclonal (Larkin & Scowcroft, 1981). Neste caso, o perodo de crescimentodesorganizado deve ser o menor possvel, ou preferencialmente eliminado (Street, 1975; Murashige,1977).

A possibilidade de manipulao da organognese depende do tipo e concentrao relativa dos regu-ladores de crescimento, como indicado pelo j clssico trabalho de Skoog e Miller (1957). Estes au-tores observaram que a relao entre a auxina e a citocinina no meio de cultura era responsvel pe-la resposta organogentica em tecidos medulares de tabaco. Desta forma meios de cultura conten-do concentraes mais elevadas de citocininas promoviam a formao de brotaes areas ou ei-xos caulinares; meios de cultura contendo nveis mais elevados de auxinas induziam a formao de

razes e em concentraes equimolares destes reguladores de crescimento verificava-se a forma-o de calos.

A seleo de uma planta matriz e de um explante adequado condio fundamental para orientaros padro de morfognese (Thorpe, 1980). Murashige (1974) discutiu os vrios fatores que devemser considerados nesta seleo, tais como o rgo da planta a ser utilizado como fonte de explante,a idade fisiolgica, a poca do ano em que feita a coleta e as condies gerais da planta doadora.

5.1.1. SISTEMAS ORGANOGENTICOS

O termo cultura de rgos usado para todos os tipos de cultura nos quais uma forma organizadade crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o isolamento assptico de estruturas defini-das como primrdio foliar, flores imaturas e frutos, e seu crescimento in vitro. Para a micropropaga-

o os mais importantes tipos de culturas de rgos so:a) Cultura de meristema

Consiste no estabelecimento do domo meristemtico apical sem os primrdios foliares. A brotaoapical tipicamente cresce, originando um nico broto.

b) Cultura de pices caulinares

o estabelecimento in vitro a partir de brotaes apicais maiores do que aquelas utilizadas para ini-ciar a cultura de meristema, tendo alguns primrdios foliares. Essas brotaes apicais podem produ-zir mltiplas brotaes.

c) Cultura de segmentos nodais

Os segmentos nodais so constitudos de gemas laterais isoladas, segmentos de caule com uma ou

mltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma nica brotao.d) Cultura de embries

iniciada a partir de embries zigticos extrados de sementes. Os embries germinam originandobrotos.

A cultura de meristema e a cultura de embries so descritos com mais detalhes a seguir.

5.1.1. Cultura de meristemas apicais

Esta tcnica compreende o isolamento e a inoculao do domo apical e alguns primrdios foliares,ou do meristema (figura 5) isoladamente (0,10 a 0,20 mm de comprimento). Usualmente, a culturade meristema refere-se ao crescimento do domo apical da brotao, excluindo as folhas primordiais.O meristema no apresenta fololos, sendo constitudo por duas regies diferentes, tnica e corpus.A tnica constituda de uma a trs camadas de clulas, a mais interna forma a epiderme e as ou-

tras duas restantes do origem a folha ou somente a epiderme foliar.

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O corpus a camada mais interna, responsvel pelaformao do restante da planta. O plano de diviso datnica anticlinal e do corpus periclinal. O objetivoneste caso a produo de uma microplanta enraizadaque deve ser livre de virus, fungos e bactrias. Quantomenor for o explante mais efetiva ser a eliminao depatgenos. Esta tcnica tem obtido sucesso com mui-tas plantas herbceas exploradas economicamente,

como cravo, crisntemo, batatinha, batata-doce, mandi-oca, banana. No caso do morango a simples utilizaode mudas obtidas por cultura de meristemas propiciouum aumento na produtividade de 3 para 12 t/ha em la-vouras do RS (Peters, 1986). Atualmente com a intro-duo de tecnologias adicionais na cadeia produtiva domorango, j so obtidas produtividades de at 80 t/ha,em cultivos no RS, SC e SP. Para plantas lenhosas acultura de meristemas apresenta algumas dificuldadeshavendo a necessidade de utilizao de tcnicas auxili-ares como a microenxertia (Hartmann et al., 1990).

A histria da erradicao na cultura de tecidos de virusiniciou em 1934 quando White observou que sub-cultivos de segmentos de razes de plantas infectadaspor virus, levavam sua eliminao. Observou-se pos-teriormente que a gema apical de crescimento tambmse encontrava livre de vrus. Morel e Martin Lo, na d-cada de 40, cultivaram meristemas caulinares de plan-tas infectadas, obtendo sucesso. Hoje esta tcnica universalmente utilizada e apresenta grande impactona produo agrcola vegetal.

Em uma planta infectada, a concentrao de virus no uniforme e maior em tecidos maduros e menor em

tecidos meristemticos. Na primavera quando o cresci-mento intenso, os meristemas alongam-se rapida-mente e a concentrao de virus menor.

Estudos demonstram que plantas obtidas por cultura de tecidos esto livres de vrus. A hiptese mais a-ceita para a ausncia de vrus nestes tecidos diz que a interrupo temporal da organizao normal dotecidos meristemticos, ocasiona uma inibio da multiplicao do vrus devido a no disponibilidade deenzimas chaves. Esta hiptese do efeito da desorganizao celular foi reforada pela presena de baixasconcentraes de vrus em calos friveis de tabaco, quando comparados com calos compactos e commaiores nveis de organizao. Alm disto, a ausncia de tecido vascular na regio do meristema apical,a presena de conexes plasmodesmticas em dimenses diminutas nestas clulas e o ritmo ativo dedivises celulares nesta regio, tambm so fatores que podem explicar a baixa concentrao ou a au-sncia de vrus nesta clulas. O processo ativo de diviso celular poderia utilizar a maior parte da energiapara a formao de macromolculas e componentes celulares estruturais, deixando os vrus em condi-es pouco competitivas para a prpria multiplicao. Comprovou-se tambm que a concentrao de v-rus aumenta na regio sub-apical dos meristemas de plantas tratadas com substncias inibidoras decrescimento, as quais reduzem as taxas de diviso celular.

Em resumo, a inexistncia de vrus nos meristemas apicais pode ser atribuda aos seguintes aspectos:

a) O domo apical mantm certa distncia das terminaes vasculares e, nestas condies os virus neces-sitariam passar de clula a clula at o domo apical;

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Figura 09- Seco longitudinal do meristema apical do caule de Coleus sp.

Seta grossa = gema axilar; seta fina = protoderme; cabea de seta =

procmbio; MF = meristema fundamental; PM = promeristema. Barra =

500 mm. (Apezzato, 2003).


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b) Quando as clulas meristemticas do domo apical esto em diviso ativa, o RNA do virus no conse-gue introduzir-se no genoma destas clulas;

c) Clulas meristemticas podem ter sistemas qumicos de inativao, que podem ser potencializados emmeristemas isolados;

d) Altas concentraes de auxinas presentes nos meristemas caulinares seriam responsveis pela au-sncia de virus.

A propagao massal das plantas isentas de viroses poder ser feita atravs de outras tcnicas como as

que so descritas posteriormente.

5.5.1.1. Aplicaes da cultura de meristemaA cultura de meristemas utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores na iniciao foliar e no es-tudo do florescimento, na propagao vegetativa para obteno de plantas livres de patognos e, na mul-tiplicao clonal rpida. Os meristemas so amplamente utilizados na limpeza pois estes materiais solivres de vrus. Isto explicado plos seguintes fatos:a) Crescimento contnuo do tecido. A diviso celular intensa, o que aumenta a competio por metabli-tos e desta forma o vrus no tem energia suficiente para sua multiplicao.b) Ausncia do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. muito difcil a passagem do vrus clulaa clula (o DNA do vrus maior que o plasmodesmata).Vrios fatores so determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre estes, pode-se destacar:

Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num maior sucesso na limpeza,mais a sobrevivncia menor; Localizao do explante: explantes retirados da ponta do broto esto em um estdio mais jovem de de-senvolvimento do que explantes da base; poca de coleta: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo.

5.1.1.2. Prol iferao de gemas axilares (segmentos nodais)Esta tcnica fundamentada pela induo das gemas laterais existentes. Inclui o isolamento e a inocula-o de segmentos nodais contendo gemas vegetativas axilares, propiciando a multiplicao direta(ausncia de calo) de brotaes que podem ser separadas em microestacas para enraizamento in vitroou in vivo. Este procedimento pode originar respostas de propagao massal em progresso geomtrica.Por ser um sistema direto, apresenta menores possibilidades de gerar variantes somaclonais. Um dos

exemplos de utilizao desta tcnica a propagao clonal do abacaxi atravs da liberao das gemasaxilares. Atualmente um sistema utilizado em laboratrios junto a viveiros comerciais de espcies le-nhosas, pois fcil de fcil manipulao e de alta taxa de regenerao de explante. Alm disso, o materi-al vegetal mantm as caractersticas genticas com quase ausncia absoluta de variaes epigenticas.

5.1.2. INDUO E PROLIFERAO DE GEMAS ADVENTICIASConsiste na induo e formao direta ou indireta de meristemides a partir de discos foliares, picescaulinares ou radiculares, segmentos caulinares nodais e internodais, cotildones, hipoctilos e outrasestruturas de plntulas, segmentos de flores e inflorescncias imaturas (monocotiledneas: Gladiolus,Hemerocallis, Iris, Freesia; Dicotiledneas: Gerbera, Chrysanthemum), escamas de bulbos (tecidos me-ristemticos na placa basal). Neste modelo, a escolha do explante e o tipo e concentrao do reguladorde crescimento determinam o sucesso da iniciao das brotaes adventcias. No caso de iniciao dire-ta, algumas clulas parenquimticas epidrmicas ou sub-epidrmicas tornam-se meristemticas e gruposcelulares (meristemides) com forte reao a corantes especficos se desenvolvem. No modelo indiretoocorre a desdiferenciao das clulas parenquimticas e a organizao dos meristemides e as brota-es adventcias surgem a partir da periferia dos calos.Este modelo organogentico resulta nas maiores taxas de multiplicao, sendo de uso mais geral e co-mum em plantas hortcolas. Por outro lado ele pode originar a produo de variantes ou quimeras por es-tar baseado na formao de calos. Outro uso freqente deste modelo o co-cultivo com Agrobacteriumem tcnicas de transformao de plantas.

5.1.2. ESTGIOS E MODULAO DA ORGANOGNESEA microproagao de plantas atravs da cultura de tecidos pode ser operacionalizada em uma seqncia

laboratorial de trs estgios, cada qual apresentando objetivos, pressuposies e necessidades especfi-cas em termos de composio dos meios de cultura, tipo e balano dos reguladores de crescimento econdies fsicas como luz, temperatura, foto perodo.

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Em condies laboratoriais cada estgio deve ser identificado e as condies timas devem ser estabele-cidas (Murashige 1974). Debergh e Read (1991) propuseram a incluso do estgio 0 nesta seqncia deoperaes e, desta maneira, a induo e a expresso de respostas organogenticas in vitro deve obede-cer aos passos listados a seguir:Estgio 0 -Consiste em selecionar e cultivar a planta matriz doadora de explantes em condies ade-quadas e, eventualmente, controladas. Isto significa que pode ser necessrio modificar as condies defotoperodo e temperatura, ou aplicar a essa planta fitorreguladores do grupo das giberelinas e auxinas,alterando com isto a sua condio fisiolgica.Estgio I - Consiste no estabelecimento da cultura assptica. O objetivo deste estgio a definio dotipo de explantes a ser utilizado, o estabelecimento de culturas isentas de microorganismos contaminan-tes, a obteno de altos ndices de sobrevivncia e de rpido crescimento dos explantes. Neste estgiotorna-se necessrio monitorar e controlar as reaes de oxidao que ocorrem: a) pela oxidao de com-postos fenlicos presentes no explante, como resposta ao ferimento provocado pela exciso de um rgoou tecido e; b) pela sntese de compostos mono e polimricos por parte do explante. A incubao destasculturas na ausncia da luz por alguns dias pode inibir os processos oxidativos.Estgio II- Multiplicao: este estgio fundamentado na diviso e diferenciao celular, objetivando aobteno de uma plntula, de acordo com as diferentes rotas morfogenticas possveis. De maneira geralprocura-se promover a liberao de gemas axilares pr-formadas ou a induo de gemas adventcias.

Em muitos casos estgios intermedirios de calo esto envolvidos, contudo, quando o objetivo a manu-teno da conformidade clonal, a passagem por estgios de calo deve ser evitada, tendo em vista a pos-sibilidade de ocorrncia de variaes somaclonais. Neste estgio deve-se determinar o nmero e interva-lo de sub-cultivos, bem como determinar e otimizar a taxa de multiplicao, ou seja, o nmero de gemasou de eixos caulinares que podem ser obtidos a partir de cada inculo nos sub-cultivos. Para bananeira eabacaxizeiro, partindo-se de gemas apicais e laterais respectivamente, a taxa mdia de multiplicao de 10 eixos caulinares a cada sub-cultivo realizado a cada 20 dias. A experincia adquirida com essesdois sistemas indica que podem ser efetuados cinco sub-cultivos com certa garantia de manuteno defidelidade clonal. A partir deste sub-cultivo podem aparecer mutantes ou variantes somaclonais. No Labo-ratrio de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal do Depto. de Fitotecnia do CCA/UFSC, noforam observadas alteraes morfolgicas na organognese do abacaxizeiro at o quinto sub-cultivo, apartir do qual se identificaram mutantes, na freqncia de 1 para 700.

As condies ambientais neste estgio relacionam-se com a temperatura, cuja faixa tima est entre 22 e27oC para plantas de clima temperado e tropical, respectivamente. O perodo de luz deve permanecerem torno de 16 a 18 horas em intensidades luminosas mdias de 5 W.m-2.Estgio III - Nesta fase busca-se o elongamento, a induo e iniciao radicular e a preparao para aaclimatizao. O objetivo deste estgio a preparao para a converso das condies heterotrficaspara autotrficas. As estratgias deste estgio incluem eventuais incluses no meio de cultura de: a) GA3para induzir o elongamento de eixos caulinares; b) AIB para induzir a iniciao radicular e; c) carvo ati-vado para favorecer a iniciao radicular. Redues nas concentraes dos sais e das fontes de carboi-dratos do meio de cultura podem trazer benefcios iniciao radicular, bem como facilitar o processo deaclimatizao.Tendo em vista que este estgio da cultura in vitro pode representar 30 a 60% do custo de uma plantamicropropagada, muitos laboratrios preferem promover o enraizamento ex-vitro e esta estratgia deve

ser considerada sempre que possvel. O emprego da tcnica da dupla-camada que consiste em adicionaruma pequena quantidade de AIB sobre a superfcie do meio slido, para que ocorra a induo radiculardos eixos caulinares tem gerado execelentes resultados em muitos sistemas.Estgio IV- Aclimatizaco: Neste estgio ocorre a transio da condio heterotrfica para autotrfica. Oprincipal objetivo neste estgio diminuir ao mximo as perdas que ocorrem principalmente pela desidra-tao dos tecidos da microplanta. O emprego de estufas, tneis plsticos, sistemas de nebulizao e deantitranspirantes deve ser considerado para cada situao, tendo em vista que as plantas neste estgionormalmente no apresentam estmatos funcionais e suas folhas tem reduzida capacidade de formaocutculas cerosas protetoras.Composies adequadas de substratos tambm so importantes e na maior parte dos casos o empregode areia, terra, vermiculita, casca de arroz carbonizada isoladamente ou em misturas proporcionais, re-sulta em elevados ndices de sobrevivncia.

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De maneira geral este estgio inicia com a retirada das plntulas dos frascos e a cuidadosa remoo porlavagem de resduos de meio de cultura solidificado junto ao sistema radicular. Um segundo passo con-siste em repicar estas plntulas para bandejas de isopor contendo o substrato autoclavado, cuja composi-o foi previamente determinada. O terceiro passo consiste em manter estas bandejas, por perodos deat 15 dias, em sala de cultura cuja temperatura e durao e intensidade luminosa possam ser controla-das. A manuteno de uma cmara mida sobre as bandejas pode ser feita pela utilizao de filmes pls-ticos em cobertura. Posteriormente, transfere-se esta bandeja para uma estufa com sistema de nebuliza-

o intermitente por perodos mdios de 15 a 30 dias, podendo-se aps, repicar estas plntulas para sa-cos plsticos contendo uma mistura convencional no autoclavada de solo argiloso, arenoso e matriaorgnica e mant-las em condio de ripado ou cobertura com sombrite que deixem passar em torno de50% da luminosidade. Por fim procede-se uma retirada gradual da cobertura para que as mudas sejamsubmetidas s condies normais que se verificam aps o transplante para o local definitivo. importantesalientar que determinada seqncias destas operaes podem ser eliminadas em algumas espcies.Para abacaxizeiro, por exemplo, o segundo passo anteriormente descrito pode ser eliminado e no h anecessidade de ser feita a repicagem para sacos plsticos, podendo as mudas ser comercializadas ouenviadas ao campo nas bandejas de isopor. Torna-se necessrio, portanto, estabelecer procedimentosespecficos para cada espcie a ser trabalhada em um laboratrio de micropropagao.

5.1.3. CULTURA DE EMBRIESA cultura de embries pode ser definida como o isolamento estril e crescimento de um embrio imaturoou maturo in vitro, com o objetivo de se obter uma planta vivel.Embries zigticos ou de sementes so frequentemente usados vantajosamente como explantes em cul-tura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Em cultura de embries, entretanto, os embri-es so retirados das sementes e so individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendouma planta por explante. A cultura de embries isolados pode ajudar na produo rpida de plntulas desementes que apresentam dormncia embrionria ou embrio imaturo.

5.1.3.1.Tipos de cultura de embries:a) Cultura de embrio imaturo Originado de sementes imaturas, usado para evitar o abortamento natural. mais difcil, devido a exci-so e meio de cultura mais complexo.b) Cultura de embries madurosOriginado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao de semente.

5.1.3.2. Estdios de desenvolvimento do embrioQuanto mais imaturo for o embrio maior ser o requerimento nutricional. No estdio globular h requeri-mento de meios mais complexo (fitormnios, altas concentraes de acares, gua de coco, etc.). Antesdo formato de corao, os embries so bastante heterogneos, no sintetizando fitormnio ou mobili-zando compostos de carbono.No estdios heterotrficos, os embries requerem sais, acares, vitaminas, nitrognio, citocininas, auxi-nas, gua de coco (algumas substncias podem ser opcionais). Quando aumentam de tamanho, tornam-se autotrficos e neste estdio requerem um meio mais simples.

Os embries geralmente requerem alta taxa de acar (fonte de carbono e agente osmtico), pois tmum potencial hdrico muito negativo (contedo alto de slidos). Uma alternativa para resolver a dificuldadeimposta pelo potencial hdrico do embrio fixar a sacarose e elevar o teor de manitol (agente osmtico).

5.1.3.3 Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrio1) Gentipo:em algumas espcies o embrio cresce facilmente enquanto que em outras muito difcil(h tambm diferenas entre cultivares de uma espcie).2) Estdio de desenvolvimento do embrio no isolamento: muito difcil desenvolver embrio muitopequeno in vitro.3) Condio de crescimento da planta-me. crescer a planta-me em condies controladas resultaem um melhor desenvolvimento do endosperma, portanto melhora o crescimento do embrio isolado.4) Composio do meio: embries imaturos requerem uma composio mais crtica do que embries

maturos. Em ambos (maduro e imaturo) os macro e microelementos so importantes.

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Os meios usados so slidos : MS, White e 85, em uma faixa de pH entre 5 a 6. Carboidratos(sacarose, usada na concentrao de 2-3% e 8-12% para embries maturos e imaturos, respectivamen-te) so fontes de energia e tambm agem abaixando o potencial osmtico, especialmente em embriojovens.O gar usado em concentraes entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam em inibio de crescimen-to). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininas geralmente no so usados. As vezes se utiliza

giberelina. Substncias de contribuio complexa como a gua de coco so bastante utilizadas, especial-mente para embries imaturos.5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantm-se o embrio isolado no escuro por 7 a 14 dias.6) Temperatura: a temperatura tima dependente da espcie, variando, geralmente entre 22 e 28C).

5.1.3.4. Aplicaes prticas da cultura de embriesa) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de sementeEm algumas espcies absolutamente impossvel obter a germinao in vivo devido a caractersticasgenticas ou fisiolgicas.b) Recuperao de hbridos de cruzamentos incompatveisNo melhoramento, cruzamentos interespecficos e intergenricos para transferir genes de interesse daespcie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidade gentica) podem produzir embries abortivosdevido a incompatibilidade.Isto ocorre tambm em cruzamentos onde existam barreiras pr ou ps-zigticas (sementes murchas eembries abortivos). Os embries hbridos so salvos e removidos antes que ocorra o aborto e, posterior-mente cultivados in vitro.c) Superao da dormncia das sementesEm algumas sementes ocorrem inibidores qumicos endgenos ou h requerimentos especficos de luz etemperatura ou ainda a resistncia fsica presente nas estruturas que recobrem o embrio. A cultura deembries uma alternativa para superar estes problemas.d) Superao da esterilidade das sementes.As causas de ocorrncia de sementes estreis em algumas espcies podem ser o desenvolvimento in-completo do embrio, mutaes das estruturas que cobrem o embrio ou algum tipo de dormncia recal-

citrante para a qual nenhum mtodo tem sido desenvolvido.e) Germinao de sementes de parasitas obrigatrios. Sem o hospedeiro, impossvel a ocorrncia invivo. Assim tambm a retirada dos embries e cultivo in vitro pode suprir esta necessidade, permitindo odesenvolvimento de plantas.f) Preveno do embrio abortivo que ocorre com o amadurecimento precoce de frutos carnososEm cruzamento dos frutos (pssego, ameixa, cereja) o transporte de gua e nutrientes para o embrioimaturo algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o aborto.g) Propagao vegetativaDevido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embries so excelentes explantes parapropagao clonal in vitro. Especialmente para conferas e gramneas.

5.1.4. MICROENXERTIA

Esta tcnica (figura 10) consiste em excisar de uma planta matriz uma gema apical ou o meristema pro-priamente dito que enxertado sobre uma plntula porta-enxerto que foi obtida em condies asspticas.Sua principal aplicao a eliminao de viroses e de outros microorganismos de natureza sistmica quetendem a se acumular em plantas propagadas vegetativamente, quando da impossibilidade de se usar atcnica de cultura de meristemasNa citricultura esta tcnica tem sido empregada rotineiramente nos laboratrios de micropropagao por-que no sistema tradicional baseado na propagao de clones nucelares de espcies poliembrinicas, otempo necessrio para a superao da juvenilidade muito longo. Alm disto, em espcies monoembri-nicas ocorre variabilidade gentica uma vez que o embrio pode ser resultante de um processo de fecun-dao cruzada.A termoterapia tambm pode ser empregada para a limpeza de virus em plantas de propagao vegetati-va, contudo nem todas as plantas apresentam-se isentas dos vrus aps serem submetidas a este pro-

cesso.

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5.2. EMBRIOGNESE SOMTICA

Uma das mais claras demonstraes da totipotencialidade em clulas de plantas superiores a obtenode estruturas embrionrias bipolares em sistemas in vitro. De maneira geral este modelo morfogenticoinicia com a seleo e ativao de clulas embriogenticas competentes (modelo direto) ou com a indu-o destas clulas (modelo indireto) e progride atravs de seqncias idnticas aquelas observadas paraa embriognese zigtica. Na definio de Haccius (1978) embriognese somtica ou adventcia o pro-cesso pelo qual novos indivduos se originam a partir de clulas simples, que no so produto da fusode gametas e que no apresentam conexes vasculares com os tecidos maternos.A iniciao e o desenvolvimento de embries somticos em sistemas in vitro foi obtida quase simultanea-mente por Steward et al. (1958) e por Reinert (1959) em Daucus carota. No final dos anos 70, a ocorrn-cia deste padro morfogentico j era relatada para 32 famlias, 81 gneros e 132 espcies vegetais.Existem claras evidncias de que a ocorrncia da ES in vitro favorecida por uma adequada manipula-o de uma auxina forte no meio de cultura. O 2,4-D parece ser esta auxina na maior parte dos sistemasexperimentais. Segundo Vasil (1982), a competncia embriogentica aparentemente adquirida duranteo perodo inicial em cultura na presena de altos nveis desta auxina. Contudo a expresso da embriog-nese somtica somente ocorre na presena de baixos nveis deste regulador de crescimento.

5.2.1. EMBRIOGENESE SOMTICA ADVENTICIAOcorre a partir de clulas ou calos originados em aparatos reprodutivos. As clulas que iniciam o proces-so (clulas-mes) so proembriogeneticamente determinadas (PEDC). Exemplos ilustrativos deste siste-ma incluem a regenerao a partir do tecido nucelar em citros (Button & Kochba, 1977), de vulos imatu-ros de mamo (Litz, 1987) e de videira (Mullins, 1987). Embries adventcios podem ter origem direta apartir de clulas simples localizadas na epiderme dos embries zigticos, via alterao nos planos de di-viso, como o caso do palmiteiro (Guerra e Handro, 1988), ou indireta a partir de calos de embries zi-

gticos de cacau (Pence et al., 1979).5.2.2. POLIEMBRIOGNESE SOMTICA uma forma de multiplicao que captura o processo natural de reconstituio do embrio zigtico. Iniciacom o transplante para culturas in vitro de massas suspensor-embrionrias, que so massas celularesderivadas dos primeiros estgios da embriognese zigtica. A correta manipulao deste sistema permitea clonao em larga escala destas clulas em um ciclo repetitivo. A alterao das condies de culturapermite a progresso destes pr-embries para estgios subseqentes (ciclo de maturao) e a obtenode um grande nmero de embries somticos que podem ser encapsulados em cpsulas de hidrogel pa-ra armazenamento ou semeadura (sementes artificiais ou sintticas). Este processo distinto daqueleverificado para a embriognese somtica adventcia porque os estgios de desenvolvimento ocorremsem a necessidade de se excisar um tecido, induzir a desdiferenciao e a posterior rediferenciao celu-

lar, o que implica dizer que na poliembriognese somtica no h formao de calos.

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Figura 10 Microenxertia da cultivar de ma

Gala sobre porta enxerto Marubakaido. LFDGV.

Fitotecnia. UFSC/CCA, 2002.


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Alm disto, algumas das clulas transplantadas podem dividir-se sem a necessidade da adio de regula-dores de crescimento ao meio de cultura. Este fenmeno atribudo a superioridade gentica e aos altosnveis endgenos de fitorreguladores nestas clulas.A poliembriognese somtica de ocorrncia ampla nas gimnospermas, mas pode ocorrer tambm emangiospermas. Revises completas sobre o assunto so encontradas nos artigos de Gupta e Durzan(1986) e Durzan e Gupta (1988) e no livro "Plant Morphogenesis" de Sinnot (1960).

5.2.3. EMBRIOGNESE SOMTICA INDUZIDA

Este modelo resulta de calos e suspenses celulares depois que o tecido matriz (explante) submetido atratamentos que induzem competncia embriogentica (detalhes na figura 12). Isto significa que neces-srio que ocorra a desdiferenciao e posterior rediferenciao celular atravs de uma reprogramaogentica (epignese) cujos determinantes bsicos so o estgio fisiolgico do explante e o tipo e concen-trao do regulador de crescimento que atuar como sinal qumico para a ativao gnica diferencial. Demaneira geral, a perspectiva de sucesso em extrair resposta embriogentica neste modelo depende dautilizao de explantes juvenis ou embrionrios e da manipulao adequada de uma auxina forte, como o2,4-D. Esta auxina atua como indutora do processo (efeito "pulse"), contudo sua presena no meio decultura depois da induo pode causar anormalidades ontogenticas. Portanto, neste modelo em particu-lar e na embriognese somtica em geral, a ativao ou induo desencadeada pelo uma auxina fortecomo o 2,4-D mas a expresso desta rota morfogentica somente ocorrer em meios de cultura isentosou com baixas concentraes deste regulador de crescimento.

Exemplos ilustrativos deste modelo foram obtidos e/ou citados para o cafeeiro por Sondahl et al. (1981),para palmeiras por Tisserat et al. (1979), para gramneas por Vasil (1982), para soja por Christianson(1985) e para cenoura por Litz et al. (1985), cujos artigos ampliam e aprofundam detalhes sobre este mo-delo.

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Figura 12- Ciclos da embriognese somtica e a seqncia de eventos celulares da desdifenciao e diferenciao (Adaptado de Durzan, 1988)


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5.2.4. SUSPENSES CELULARESSuspenses celulares consistem de clulas e agregados celulares dispersos em meios lquidos em agita-o. O crescimento celular baseia-se nas mudanas das taxas de diviso em fases definidas. No incio asclulas dividem-se lentamente (lag fase), posteriormente ocorrem fases de rpido crescimento(exponencial e linear) e por fim, as clulas tendem a taxas menores de diviso por efeito de competio(fase estacionria). Neste momento, atravs da subcultura de uma amostra destas clulas, possvel rei-niciar a cultura e este procedimento pode ser mantido indefinidamente (Street, 1977).Suspenses celulares podem ser iniciadas pela inoculao de calos friveis ou outros tecidos que pos-

sam originar linhagens celulares organogenticas ou embriogenticas. Uma suspenso celular de primei-ra passagem contem uma mistura de clulas vivas, mortas e resduos. Filtragem seletiva, uso de pipetasou seringas auxiliam na obteno de culturas puras e homogneas.A possibilidade da manipulao e do cultivo de clulas em escala comercial pode exigir o uso de biorrea-tores. Estes equipamentos foram desenvolvidos originalmente para o cultivo de microorganismos e outrasclulas vivas para propsitos de fermentao e/ou para a produo de produtos secundrios para usoindustrial. Para suspenses celulares vegetais, os meios de cultura so praticamente idnticos aquelesexigidos para a obteno de calos e incluem os macro e micronutrientes, sacarose, vitaminas e um ade-quado balano de reguladores de crescimento.De maneira geral a maior utilidade dos biorreatores relaciona-se com a obteno de um grande nmerode clulas ("scale-up") em ciclos repetitivos de diviso celular e para a obteno de metablitos secund-rios. Para efeitos de micropropagao, as clulas obtidas so plaqueadas e manipuladas para a ativao

de processos regenerativos nas rotas de organognese ou embriognese somtica. A induo/ativaode linhagens celulares embriogenticas atravs de suspenses em meios lquidos pode propiciar a obten-o de uma relao direta (1 clula pr-embrionria/ 1 plntula) e parece ser o melhor sistema pelo qualtecnologias de encapsulamento em hidrogel possam gerar sementes sintticas. Alm disto, o estabeleci-mento de linhagens celulares embriogenticas a maneira mais elegante de se manipular e modular aembriognese somtica para a propagao massal de gentipos superiores. Suspenses celulares sotambm as melhores fontes para a obteno de protoplastos para propsitos de fuso, transformao eintroduo de organelas.

5.2.4.1. Aplicaes da suspenso celular: usada para obteno de sementes sintticas (embriognese somtica isolamento de protoplastos, iso-lamento de mutantes, obteno de resistentes certos elementos (Alumnio, toxinas, herbicidas, sal), pro-duo de metablito secundrios e nos processos de transformao de plantas.

5.2.4.2. Mtodos mais uti lizados para medir o crescimento celular:Para quantificar o crescimento de clulas em suspenso, so utilizado:principalmente os mtodos baseados no nmero de clulas, peso de matria seca peso de matria fres-ca, volume de clulas e protena total da clula.Um calos tpico iniciado de um explante passa por trs estgios de desenvolvimento, que compreende ainduo da diviso celular, um perodo de diviso celular ativa durante o qual as clulas diferenciadasperdem a; caractersticas especializadas para tornarem-se desdiferenciada e um perodo no qual a divi-so celular reduzida ou mesmo cessa, iniciando ento a especializao celular. Esses estdios podemser acompanhados numa curva de crescimento caracterizadas por seis fases (figura 13).

Fase lag: caracterizada por no ter ganho em nmero de clulas, pelo inicio da mobilizao de meta-blitos sem ocorrer qualquer diviso celular, pela sntese de protenas e sntese de metablitos especfi-cos. A ateno deve ser dada densidade do incuo que afeta o comprimento da fase lag. Quanto menoro peso do calos utilizado, maior a fase lag. Fase exponencial: caracterizada por diviso celular intensa, aumento no nmero de clulas, pormclulas de tamanho pequeno com formao de agregados de clulas. Fase linear,a fase exponecial seguida pela fase linear. O crescimento celular ativo e as clulas ad-quirem competncia para proceder a repicagem. Fase de desacelerao: ocorre uma reduo na diviso celular. no final dessa fase que se deve inici-ar o processo de repicagem. Fase estacionria: a repicagem deve ser terminada ainda no inicio dessa fase quando no h divisocelular. As culturas no podem ser mantidas nessa fase por um perodo longo.

Fase de declnio: as clulas comeam a morrer, culminando com a lise celular.

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5.2.4.3. Importncia da dinmica de crescimento

A curva de crescimento de calos calculada com o objetivo de se obter a poca de repicagem(subcultura), para determinar onde h a maior produo de metablitos (quando o estudo objetiva o me-tabolismo secundrio). Esta fase de desacelerao, pois os metablitos secundrios no constituemprioridade no metabolismo celular.

5.2.5 .BIORREATORES

Os biorreatores so equipamentos usados para micropropagao clonal e massal de plantas, cujo objeti-vo a imerso temporria ou permanente de cultura de clulas ou tecidos vegetais ao meio de cultivolquido. Tem propsito fundamental de facilitar o trabalho rotineiro e melhorar as condies ambientais easpticas para as culturas, produzindo em larga escala..Historicamente, os biorreatores foram mais conhecidos por fermentadores e estavam direcionado para ocultivo de clulas ou microrganismos, com vistas a produzir metablicos secundrios, alcalides, antibiti-cos, entre outros (Barruetto, 2002). O nome fermentador est relacionado etimologicamente com fermen-tao que, na sua raiz latina, deriva de fermentare, cujo significado ferver, isto , produzir bolhas de ar,numa aluso ao fato de os fermentadores serem destinados a processos fermentativos como, por exem-plo, a produo de lcool, onde as leveduras regeneram NAD a partir de sua forma reduzida NADH, comproduo de etanol e C02, na qual este ltimo, pela apario de bolhas, d a idia de fazer ferver o meiolquido nutritivo (Leveau & Bouix,1985).Inicialmente, e pelo fato de serem destinados a usos industriais, esses fermentadores foram de grandecapacidade: de 20 a 4.000 mil litros de meio lquido nutritivo. Em decorrncia disso, esses fermentadoresdevem ter acurados sistemas de oxigenao, agitao mecnica do meio lquido, monitoramento do pH,

da temperatura e da formao de espuma, tudo o que os converte em verdadeiras obras da engenharia eda automatizao, que asseguram parte bitica (microrganismos) sobreviverem nesse ambiente abiti-co artificial, visando aumentar seus rendimentos (biomassa, metablicos secundrios, antibiticos, etc.),porm com altos custos de instalao.Paralelamente biotecnologia da fermentao, a cultura de tecidos vegetais vinha desenvolvendo seutrabalho biotecnolgico de manipulao de clulas, tecido e rgos com vistas a propagar material clonalpara uso comercial.Os primeiros biorreatores adaptados para plantas datam de, aproximadamente, 26 anos atrs (Levin etal., 1988) De l para c, muitos tipos tm sido propostos, isso porque um biorreator concebido em fun-o do tipo de processo que se deseja obter. Assim, para embriognese somtica, se requer um tipo debiorreator, mas, para micropropagar atravs de organogense, gemas, o desenho mais eficiente pode seroutro (Merchuk, 1990).

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Figura 13 Dinmica de crescimento de

uma suspenso celular.(Adaptado de Geor-

ge, 1993).


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5.2.5.1. Sistemas de b iorreatoresBiorreatores de imerso temporria; Consiste geralmente de um conjunto de dois recipientes com capaci-dade de 1 a 5 litros. Um que contm o meio de cultivo lquido (menos de 20% da capacidade do frasco),outro que comporta os explantes. Em tempo pr-determinado ocorre a transferncia do meio de cultivopara o frasco que contm os explantes por um breve perodo (de 1 a 3 minutos). Depois o meio sugadopara o depsito em mesmo nvel ou escoado em depsito com nvel inferior. Este ciclo repetido a cadahora, ou ento, conforme as exigncias do explante. Sua utilizao efetiva tem sido para sistemas morfo-gnicos, j que uma das dificuldades a fixao de pequenos explantes (figura 14).

Biorreatores de imersso permanente; Em geral so os biorreatores utilizados para a micropropagaomassal de plantas, mais especificamente para a cultura de clulas isoladas, calos ou de protoplastos.Tem pequena capacidade (1 a 5 litros), e, no caso de serem desenhados para multiplicao de clulas ouembries somticos.

Devem possuir um sistema de oxigenao, um outro de agitao mecnica, por meio de ps giratrias ouum sistema vibratrio para produzir a turbulncia necessria homogenizao e homeostase no interiordo biorreator, e ainda, sensores de pH, temperatura, 02 e espuma (Preil et al. 1988; Takayama & Akita,1994). Tambm outra opo so bales volumtricos com depresses laterais, os quais so rotacionadosem sentido orbital (figura 14).

Biorreatores de tipo air-lift; No tocante propagao de plantas atravs de gemas, existem os biorrea-tores de imerso temporria (Alvard et al.,1993) e os de borbulhamento contnuo ou imerso permanente(BIPER) tipo air-lift (George, 1993-96) Nos de imerso temporria, as gemas a serem multiplicadas ficamexpostas a ciclos de imerso, evitando a presena de dispositivos de agitao e arejamento e, portanto,simplificando o desenho do biorreator. Este biorreator, basicamente um sistema de engenharia simplese barata. Consta de um recipiente de vidro com capacidade de 500 a 1000 ml, cuja tampa apresenta dois

furos, um para a entrada do ar e outro para sada, sendo que, em ambos os casos, esses orifcios estoprovidos de dutos de ao inox com filtro Millipore (0,2 m de poro) a fim de evitar a contaminao interna.

O ar provido atravs de um microcompressor (aproximadamente 3 litros/ minuto), e conduzido ao fundodo recipiente atravs de uma mangueira de silicone, de onde sai, atravs de um tubo poroso, formandobolhas que agitaro o meio lquido. Com exceo da borracha que liga o filtro de entrada ao compressor,todos os componentes do sistema so autoclavveis (120C e 20 minutos) (figura 14).

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Figura 14 Tipos de biorrteatores

e sistemas de funcionamento


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AP OS TI L A DE BI OT ECN OL OG I A CC A/ UF SC MP GU ERR A & RO NO DA RI ; ED I O DA ST EI NM AC HE R (2 006 ) Pgina 24

Figura 15- Culturas de bromlia cultivada em processos de biorreatores de imerso temporria e a seqncia de formao, determinao e

regenerao dos explentes. LFDGV, Fitotecnia, UFSC/CCA, 2001.


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5.2.5.2. Inoculao dos explantes feita a autoclavagem, o frasco, contendo o meio nutritivo. Depois em cmara de fluxo laminar abertopara a inoculao de brotos, suspenses celulares ou calos. O meio lquido normalmente constitudo domeio SP (Barrueto Cid et al., 1999) complementado com diferentes concentraes de BAP (6-benzilamino purina) segundo se trate de orqudeas (Ionopsis ochlereuca), abacaxi (Ananas comosus L.cv. Perola) caf (Coffea arabica), mamo (Carica papaya L. cv Tainug), lamo (Populus tremula x P. al-ba). As touceiras contendo um nmero variado de brotos so previamente obtidas em meio slido e u-ma precondio ter seu protocolo de multiplicao estabelecido, antes de iniciar os trabalhos com o bior-

reator. Os explantes em geral podem ser de origem do prprio sistema dos biorreatores, dando a possibi-lidade de processar cultivos seqncias de explantes em escalas comercias, as biofbricas.

5.2.6. PROTOPLASTOSProtoplastos so a parte viva das clulas vegetais. Contm o ncleo, citoplasma, vacolo e outros com-ponentes celulares circundados por uma membrana semi-permevel. A clula vegetal, em contraste coma clula animal, circundada por uma parede celular constituda de celulose, hemicelulose e materiaispcticos. Protoplastos podem ser obtidos a partir de clulas em suspenso ou diretamente a partir de c-lulas do mesfilo foliar.A obteno de protoplastos foi possvel a partir da descoberta de que a parede celular das clulas vege-tais poderia ser removida por enzimas que a digerem (Cocking, 1960). Preparaes enzimticas comerci-ais so baseadas em misturas de celulase e pectinase. A manuteno de uma presso osmtica adeuqa-

da necessria para prevenir a ruptura da membrana celular e para contrabalanar a remoo da paredecelular. A utilizao de alguns corantes tais como carmin actico, azul de Evans e compostos de reaode fluorescncia pode indicar a viabilidade ou no dos protoplastos obtidos.As aplicaes das tcnicas de isolamento e regenerao de protoplastos podem ser vistas sob dois ngu-los. Do ponto de vista do conhecimento bsico possvel o estudo dos aspectos relacionados com a for-mao da parede celular e com a ontognese de processos regenerativos a partir de clulas simples. Doponto de vista aplicado torna-se possvel a utilizao de tcnicas de transformao como a fuso de pro-toplastos de espcies no aparentadas, rompendo com isto os limites impostos pela propagao sexual.A fuso de protoplastos de gentipos distintos gerando a combinao de dois ncleos e citoplasmas chamado de hibridizao somtica ou parasexual. Alm disto, protoplastos so considerados como o ma-terial ideal para a utilizao de tcnicas de transformao direta atravs de metodologias envolvendoDNA recombinante.

5.2.7. CULTURA DE POLN E ANTERASA cultura de anteras uma tcnica para a obteno de plantas haplides a partir de plantas normalmentediplides. A descoberta que o gro de plen poderia desenvolver embries foi feita por acaso na dcadade 60. Atualmente, muitas plantas so produzidas a partir do gro de plen imaturo ou calo que desenvol-ve a partir do micrsporo.A cultura de anteras tem grande potencial para o melhoramento de plantas e usada para a obteno deplantas haplides. A palavra haplide refere-se a plantas que possuem o nmero gametoftico de cromos-somos em seus esporfitos, ou seja, so originrias de um esporfito e contm metade do nmero decromossomos da espcie.Plantas haplides podem ser obtidas in vivo atravs de polinizao com plen irradiado, polinizao com

plen abortivo (estril), tratamento do plen com choques trmicos, hibridao distante. In vitro pode serobtido pelo desenvolvimento da oosfera no fertilizada, pela cultura de anteras e ou gros de plen(diretamente por embriognese e indiretamente v

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Apostila_Biotecnologia_ufsc.pdf