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Aula de Bioquímica II
Tema:
Transcrição
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Dogma central da Biologia
Ácidos Ribonucléicos - RNA
Participam diretamente da síntese de proteínas
Ácidos Ribonucléicos - RNA
Tipos de RNA
Tipo de RNA Tamanho Função
RNA ribossômico (rRNA) Variado Síntese de proteínas; Conta com a ajuda de
proteínas ribossomais
RNA de tranferência
(tRNA) Pequeno
Transportar aminoácidos para os Ribossomos –
Funciona como um adaptador
RNA mensageiro
(mRNA) Variável Codifica a síntese de proteínas
Pequenos RNAs nucleares
(SnRNAs) Pequeno
Maturação do mRNA; transporte de proteínas;
outras
Transcrição – DNA RNA
Síntese de RNA dirigida pela complementaridade com o DNA
Fita molde 3‟ 5‟ Não-codificante
Fita codificante 5‟ 3‟
Ambas as fitas do DNA podem ser “Codificantes”
Transcrição
Síntese de RNA dirigida pela complementaridade com o DNA
A fita molde para a síntese de RNA é a 3‟ 5‟ ou não-codificante
- Fita codificante no DNA é correspondente ao RNA T U
Transcrição – DNA RNA
Reação de polimerização catalisada pelas RNA polimerases
RNA Polimerase DNA Dependente
- Síntese segue a direção 5‟ 3‟
- Similar às DNApol sem similaridade estrutural Evolução convergente
Síntese do RNA
Síntese dirigida por complementaridade com o DNA
RNA-polimerase DNA-dependente
Coordenada da Reação
Síntese do RNA
Síntese dirigida por complementaridade com o DNA
RNA-polimerase DNA-dependente
Reação de
Polimerização
Adição contínua de
NTPs livres na
extremidade 3‟ da fita
crescente nucleotídeo
livre está ativado
Especificidade requer pareamento complementar;
Envolve dois íons metálicos, usualmente Mg2+;
- Um ativa o grupo 3‟OH do ribonucleotídeo incorporado para o
ataque nucleofílico ao grupo fosfato alfa do NTP que entra;
- O outro orienta e estabiliza eletrostaticamente o grupo trifosfato
(grupo abandonador)
Transcrição
RNA polimerase DNA dependente RNApol
- Síntese dirigida pela complementaridade com a fita do DNA não-codificante
Fita molde = fita não-codificante
1º Fase: Iniciação
2º Fase: Elongação
3º Fase: Terminação
RNA polimerase (RNApol): holoenzima (subunidades)
RNA polimerase
O cofator 70 participa do complexo de iniciação - Ele varre o DNA à procura do promotor do gene
RNA polimerase
Transcrição RNA polimerase DNA dependente RNApol
RNA polimerase
Estrutura do complexo
Transcrição Elongação
A RNApol abre a dupla-hélice do DNA e a desespiraliza a sua frente
- A RNApol forma uma bolha de síntese duplex RNA-DNA
substratos são os NTPs hidrólise das ligações fosfodiéster fornece a energia necessária
dirige a termodinâmica da Reação
A fita de RNA sintetizada se
desliga do DNA molde e este se
hibridiza novamente com a sua
fita complementar
A RNApol segura o DNA pelos dois
lados da bolha de síntese
Transcrição
A RNApol possui alta processividade
- Polimeriza 20-50 ribonucleotídeos por segundo
Possui taxa de erro maior do que no DNA 1 base em 1000
os danos de erros da RNApol são limitados ao seu produto
Pode ocorrer a síntese de vários mRNAs
a partir de um mesmo Gene
Várias RNApol no mesmo gene molde
em intervalos regulares
Transcrição – Iniciação
Sinais de início e fim da transcrição de um gene no DNA
- flanqueiam a região a ser transcrita Fator sigma
Apresentam sequências consenso existe heterogeneidade
O início da transcrição é um ponto de regulação importante
- diferenças estão relacionadas com a “força e freqüência” da ativação do promotor
- ajuste fino evolutivo à necessidade do produto gênico
São sequências
assimétricas apenas uma
das fitas de DNA deve ser
reconhecida!!!
a identificação da
orientação para a Síntese
pela RNApol na direção
5‟3‟
Transcrição – Terminação
região rica em AT que precedida de uma sequência Palindrômica
- região AT forma interações DNA-RNA fracas
- forma grampos de RNA autocomplementar
efeito estérico na RNApol liberação do DNA
Efeito total dissociação simultânea do DNA-RNA-RNApol
- sequências consenso mais variáveis do que as de iniciação
Existem enzimas que catalisam a terminação
Dissociação DNA-RNA
Fator Rho: helicase que desenrola DNA-RNA separando o último do molde
Polimerização em procarioto
A RNApol liga fracamente ao DNA e desliza sobre ele antes de dissociar
- a RNApol reconhece o promotor por contatos deste com o Fator Sigma
O fator sigma ajuda a RNApol “abrir” a fita dupla de DNA na região do promotor sem
gasto de ATP
mudanças conformacionais na RNApol ativa a polimerização
- início da polimerização pela ligação de dois NTP complementares adjacentes
Após ~10 bases polimerizadas
Mudanças conformacionais e a progressão da RNApol saída do fator sigma
RNApol sofre outras pequenas mudanças conformacionais que permitem a progressão da
polimerização Elongação
- O desligamento do fator sigma “cria” um túnel de saída de RNA transcrito
- mudanças conformacionais adicionais garantem que a RNApol não se dissocia do DNA
antes do terminador
A polimerização prossegue até a RNApol encontrar o sinal de terminação
A RNApol dissocia-se do DNA e se liga novamente ao fator sigma
Polimerização em procarioto
Inibidores:
- Rifampicina é um antibiótico que inibe a elongação da cadeia
de RNA por se ligar na RNApol antes da iniciação;
- actinomicina D se intercala na dupla fita de DNA
Polimerização em procariotos
Muitas substâncias inibem a RNApol de bactérias
Polimerização em eucarioto é diferente de procarioto
A complexidade estrutural dos eucariotos impõem necessidades
Polimerização em Eucariotos
Complexidade da Transcrição em eucariotos
3 tipos de RNApol transcrição de diferentes tipos de RNA
- RNApol I e III muitos tRNAs, rRNAs e vários snRNAs
- RNApol II muitos genes codificadores de proteínas
Necessitam dos Fatores Gerais de Transcrição
- Transcription Fator for Polimerase II TFIIA, TFIIB, etc
- Identificam o promotor e forma uma placa-suporte para a RNApol
- Desempacotamento do DNA e outras estruturas da cromatina
- Ajudam a posicionar a RNApol corretamente no promotor
- Separação das fitas de DNA TFIIH (atividade helicase) gasto de ATP
- Liberam a RNApol no modo de extensão
- Complexo de iniciação de transcrição reunião de mais de 8 TFII
Polimerização em Eucariotos
Polimerização em Eucariotos
TATA-box ~ 30 bases a “upstream” do sítio de início do transcrito
- principal sequência consenso da RNApol II existem outras
Eucariotos contam com ativadores e repressores localizados a grandes distâncias da
sequência promotora
Polimerização em Eucariotos
Fatores Gerais de Transcrição
TFIID identifica o TATA-box – TATA-Binding protein = TBP
- 25 bases a upstream do sítio de início da transcrição
A ligação distorce o DNA dupla fita na região de ligação
- Marco físico para a transcrição
Sítio de “hospedagem” para outros fatores
Polimerização em Eucariotos
Fatores Gerais de Transcrição
Fosforilação da cauda da RNApol pelo TFIIH
(atividade kinase) ativação da RNApol no
modo extensão
Ligação de outras proteínas evita o
Desligamento da RNApolII do DNA a ser
transcrito fatores de extensão
Os TFII estão livres do complexo de iniciação
de transcrição para ativarem outro gene
Ligação na Cauda da RNApolII de fatores de
processamento do RNA transcrito
Polimerização em Eucariotos
Polimerização em Eucariotos
Fatores de extensão
- evitam a dissociação da RNApolII do DNA a ser transcrito
- auxiliam na superação de regiões muito compactas da cromatina complexos
remodeladores de cromatina
-Topoisomerases eliminam as supertorção gerada pelo avanço da RNApolII na extensão do
DNA.
Ativadores transcricionais
- ligam especificamente ao DNA e ajudam a atrair a RNApol II para o complexo de iniciação
de transcrição
- superar o empacotamento do DNA
- recrutamento dos mediadores
- recrutamento de enzimas modificadoras de cromatina remodeladores de cromatina e
acetilases de histonas
- aumento do acesso ao DNA na cromatina
Aumentam a taxa de síntese de mRNA
Síntese do RNA
O RNAs são editados ou sofrem processamento!!!
mRNAs
O mRNAs são editados de duas formas
Modificações no 5‟
Introdução do Cap
Reduz exposição à
Nucleases e
fosfatases Cap:
mRNA de eucarioto possui
um „cap‟ de 7-metilguanosina
adicionado ao nucleosideo 5‟ inicial
via uma ponte 5‟-5‟ trifosfato
mRNAs
O mRNAs são editados de duas formas:
Modificações no 3‟
Poliadenilação
- Estabiliza tradução
- Aumenta o tempo de vida do mRNA
Processamento de mRNA Genes de eucariotos consistem de sequências que são expressas (éxons) e que não são
expressas (introns) e que se alternam.
Processamento de mRNA Genes de eucariotos consistem de sequências que são expressas (éxons) e que não são
expressas (introns) e que se alternam.
Processamento do mRNA
O mRNAs podem ser processados de forma que as proteínas codificadas por eles podem ser
diferentes
Introns e Éxons
“Differential Splicing” Processamento Alternativo
- Permite o controle combinatório aumenta a diversidade protéica
Processamento do mRNA
O mRNAs podem ser processados de forma que as proteínas codificadas por eles podem ser
diferentes
SnRNAs
O papel dos pequenos RNAs nucleares (snRNA) na edição do RNA
snRNA < 300 pb Contém proteínas
Complexos snRNPs – Small nuclear ribonucleoproteins Particles “snurps”
Interação dos smRNAs com os RNAs levam à formação do Spliceossomo
SnRNAs
O papel dos pequenos RNAs nucleares (snRNA) na edição do RNA
Identificação e alinhamento do local de corte e catálise
A interação dos snRNA-RNA
ocorre por complementaridade
de bases
SnRNAs
O papel dos pequenos RNAs nucleares (snRNA) na edição do RNA
Identificação e alinhamento do local de corte e também Catálise
Mecanismo de Catálise