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ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO
ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp.
FORTALEZA – CEARÁ
2010
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
1
ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO
ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp.
FORTALEZA-CE 2010
FORTALEZA – CEARÁ 2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves
Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro
Co-orientadora: Profª. Drª. Regina Célia Bressan Queiroz de Figueiredo
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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A663a Araújo, Adjanna Karla Leite Aspectos morfológicos do processo de cicatrização
induzido por Ouratea sp. / Adjanna Karla Leite Araújo – Fortaleza, 2010.
177 p. ; il. Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes
Pinheiro. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. 1. Ouratea sp. 2. Batiputá. 3. Óleos vegetais. 4. Pele. 5.
Cicatrização. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.
CDD: 636.089
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO
ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp.
Aprovada em: ____/____/_______.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________
Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro (Orientadora) Universidade Estadual do Ceará – UECE
__________________________________________________________
Profª. Drª. Virgínia Cláudia Carneiro Girão Universidade de Fortaleza – UNIFOR
__________________________________________________________
Profª. Drª. Érika Freitas Mota Universidade Federal do Ceará – UFC
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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“Aos inesquecíveis animais utilizados nos experimentos, que olham questionando o que ocorre,
que sentem dor, medo e não compreendem, que não entendem a dor, a perda da liberdade,
que lambem as mãos do algoz confundindo-o com um amigo”.
Dedico este trabalho.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
5
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fundação Instituto Oswaldo Cruz- PE.
À Professora Doutora Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro.
À Professora Doutora Regina Célia Bressan Queiroz de Figueiredo.
Aos colaboradores.
À banca examinadora.
À minha família.
Aos amigos.
...
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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Resumo
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do óleo de Ouratea sp. (Batiputá) sobre a
cicatrização de feridas cutâneas em modelos experimentais in vivo. O óleo vegetal foi
adquirido comercialmente em Fortaleza, Ceará, Brasil, e analisado química e
microbiologicamente. As feridas cutâneas foram induzidas no dorso de camundongos
distribuídos em três grupos: Grupo I tratado com NaCl a 0,9%; Grupo II tratado com
óleo de Helianthus annus (grupo de referência) e Grupo III tratado com óleo de Ouratea
sp. Todos os animais receberam 100 µL de cada tratamento aplicado na lesão,
diariamente, por 12 dias consecutivos. Fragmentos das lesões foram coletados nos dias
2, 7 e 12 para avaliações histológicas e morfométricas. As avaliações dos parâmetros
macroscópicas e a mensuração da área da lesão foram realizadas diariamente. O óleo de
Ouratea sp. apresentou como principais constituintes os ácidos linoléico (40,88%) e
oléico (28,29%). O óleo de Ouratea sp. apresentou efeito cicatrizante semelhante ao
óleo de H. annus (p>0,05) e induziu inflamação em relação ao Grupo tratado com NaCl
a 0,9% (p<0,05). O óleo de Ouratea sp. iniciou o processo de retração da área da lesão
no 4º dia, enquanto que o óleo de H. annus e NaCl a 0,9% iniciaram o processo de
retração da área da lesão no 7º e 6º dia, respectivamente (p<0,05). O tratamento com o
óleo de Ouratea sp. apresentou uma colagenização mais acentuada quando comparado
aos outros tratamentos (p<0,05). Estes efeitos podem estar associados aos altos níveis
de ômega-6 e ômega-9 presentes nesse óleo. Concluiu-se que o óleo de Ouratea sp.
auxiliou e acelerou o processo de cicatrização, mostrando potencial terapêutico sobre as
lesões cutâneas, comprovando, desta forma, o seu uso popular como agente cicatrizante.
Palavras-chave: Ouratea sp., Batiputá, Óleos vegetais, Cicatrização, Pele.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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Abstract
The aim of this study was to evaluate the oil effects of Ouratea sp. on skin healing in
experimental models in vivo. The vegetable oil was purchased commercially in
Fortaleza, Ceará, Brazil, and analyzed chemically and microbiologically. The wounds
were induced on the backs of mice divided into three groups: Group I treated with NaCl
0.9%; Group II treated with oil of Helianthus annus (reference group) and Group III
treated with oil of Ouratea sp. All animals received 100 µL of each treatment applied to
the lesion daily for 12 consecutive days. Lesion fragments were collected on days 2, 7
and 12 for histological and morphometric evaluations. The evaluations of the
macroscopic parameters and the measurement of lesion area were performed daily.
Ouratea sp. oil presented as the main constituents linoleic (40.88%) and oleic (28.29%).
Ouratea sp. oil showed healing effect similar to oil of H. annus (p> 0.05), and induced
inflammation in relation to the group treated with NaCl 0.9% (p <0.05). Ouratea sp. oil
began the process of shrinkage of the lesion area on day 4, while the H. annus oil and
NaCl 0.9% started the process of shrinkage of the lesion area in the 7th and 6th,
respectively (p <0.05). The treatment with Ouratea sp. oil showed a more marked
collagen when compared to other treatments (p <0.05). This effect may be associated to
the high levels of omega-6 and omega-9 present in this oil. It was concluded that
Ouratea sp. oil presents a great therapeutic potential in a model of cutaneous wound
healing.
Keywords: Ouratea sp., Batiputá, Vegetables oils, Wound healing, Skin.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Fatores de crescimento envolvidos no processo cicatricial de lesões
cutâneas.
Tabela 2 Composição química qualitativa e quantitativa do óleo de Ouratea sp.
Tabela 3 Avaliação macroscópica durante os dias de tratamento.
Tabela 4 Avaliação histológica comparativa do efeito cicatrizante dos
tratamentos administrados nas feridas – Aspectos qualitativos.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Camadas e estruturas da pele.
Figura 2 Cadeias polipeptídicas - Formação da fibra colágena.
Figura 3 Esquema de uma lesão cutânea.
Figura 4 Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas.
Figura 5 Fases sequenciais do processo de cicatrização.
Figura 6 Evolução do nº relativo de células nas fases da cicatrização.
Figura 7 Ouratea sp.
Figura 8 Procedimento cirúrgico para realização da lesão.
Figura 8A Molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm).
Figura 8B e C Divulsionamento da pele.
Figura 8D Ferida realizada.
Figura 9A Bancada para Microtomia.
Figura 9B e C Visão em detalhes do processo histológico.
Figura 9D Processo de coloração das lâminas.
Figura 10A Equipamento utilizado para realização da morfometria.
Figura 10B e C Visão em detalhes do software utilizado.
Figura 11 Paquímetro Digital.
Figura 12 Cromatograma de íons totais (TIC) do óleo de Ouratea sp.
Figura 13 Aspectos Macroscópicos das lesões.
Figura 14 Avaliação microscópica das lesões, Coloração H/E.
Figura 15 Efeito dos tratamentos sobre a área da lesão (cm2) ao longo dos dias.
Figura 16 Porcentagem da deposição de colágeno durante o tratamento.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
EGF Fator de crescimento epidérmico FGF Fator de crescimento de fibroblastos TGF-β Fator de crescimento transformante beta TGF- α Fator de crescimento transformante alfa TNF-α Fator de necrose tumoral alfa VEGF Fator de crescimento endotelial vascular PGDF Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta KGF Fator de Crescimento de Queratinócitos IL1α Interleucina 1alfa IL2 Interleucina 2 ILβ Interleucina beta PMN Polimorfonucleares FC Fator de crescimento NO Óxido Nítrico C3a Complemento 3a C5a Complemento 5a RLO Radicais livres de oxigênio MAF Fator ativador de macrófagos MBP Proteína Básica Principal CL células de Langerhans kg Quilograma g grama L Litro m Metro mg Miligrama min Minuto mL Mililitro µL Microlitro mm Milímetro µm Micrômetro h Hora IM Intramuscular He Gás hélio µg Micrograma p.o. pós-operatório PBS Solução salina fosfato- tamponada M Molar pH Pontes de Hidrogênio H/E Hematoxilina/Eosina TM Tricrômico de Masson ANOVA Análise de variância TIC Cromatograma de íons totais SPU Sistema de Protocolo Único COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CPqAm Centro de pesquisas Aggeu Magalhães FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz PADETEC Parque de desenvolvimento Tecnológico
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
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2.REVISÃO DE LITERATURA 14 2.1 Morfologia e Fisiologia da Pele 14 2.1.1 Epiderme 14 2.1.2 Derme 16 2.1.3 Colágeno 18 2.2 Processo de Cicatrização 19 2.2.1 Fase Hemostática 22 2.2.2 Fase Inflamatória 23 2.2.3 Fase Proliferativa 24 2.2.4 Fase de Remodelação 25 2.3 Plantas Medicinais 27 2.3.2 Ouratea sp.
29
3. JUSTIFICATIVA
31
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
32
5. OBJETIVOS 33 5.1 Objetivo Geral 33 5.2 Objetivos Específicos
33
6. MATERIAL E MÉDOTOS 34 6.1 Óleo Vegetal 34 6.1.1Análise Fitoquímica 34 6.2 Animais 34 6.2.1 Procedimento cirúrgico 35 6.2.2 Tratamento da lesão 36 6.2.3 Análises Histológicas 36 6.2.4 Análise Morfométrica 37 6.2.5 Análise Macroscópica 37 6.2.6 Contração da área da lesão 37 6.3 Análise Estatística
38
7. RESULTADOS 39 7.1 Análise química do óleo de Ouratea sp. 39 7.2 Avaliação Macroscópica 40 7.3 Análises Histopatológicas 41 7.4 Contração da Área da Lesão 43 7.5 Análise Morfométrica
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8. DISCUSSÃO
45
9. CONCLUSÃO 49
10. PERSPECTIVAS
50
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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1 INTRODUÇÃO
A pele exerce funções consideradas vitais para os animais, tais como: proteção
mecânica contra a entrada de micro-organismos, a regulação térmica e proteção contra a
perda corpórea de água, eletrólitos e macromoléculas. Neste sentido, as dermatopatias
assumem papel importante na clínica médica veterinária e estão inseridas entre as
principais patologias que acometem os animais.
O tecido epitelial que constitui a pele apresenta uma grande coesão entre suas
células, mas é sensível a solução de continuidade, que pode ocorrer devido a algum tipo
de acidente tais como: mordeduras de animais, cortes produzidos por objetos,
intervenções cirúrgicas, queimaduras, ou ainda aqueles provocados por enfermidades
como alergias (picada de pulgas) e endocrinopatias (hipotireoidismo), expondo o tecido
conjuntivo subjacente (Nitz et al., 2006).
O processo de cicatrização é caracterizado pela sucessão complexa de eventos
celulares e moleculares que interagem e se sobrepõem para a reconstrução tecidual em
resposta à lesão. Este processo envolve os eventos da inflamação, proliferação celular,
deposição de matriz extracelular, remodelação do tecido, colagenização e epitelização
(Carvalho et al., 2002). No entanto, os mecanismos moleculares e bioquímicos
envolvidos na regulação da reparação tecidual ainda não estão completamente
elucidados (Carvalho, 2002; Park e Barbul, 2004; Mendonça, 2009).
Com as possibilidades de uma solução de continuidade de qualquer origem,
infeccionar, desenvolver excesso de tecido conjuntivo, gerar uma contratura da pele ou
até mesmo tornar-se uma ferida crônica, é de grande importância uma cicatrização
rápida e controlada, diminuindo os possíveis efeitos negativos que possam acometer o
paciente, bem como o tempo de morbidade desse indivíduo (Smith et al., 2000). Neste
sentido, protocolos terapêuticos são utilizados para favorecer o processo cicatricial,
como resultados de intensas pesquisas para desenvolver os melhores agentes
promotores da cura.
A fitoterapia acompanha a humanidade desde os tempos primitivos e, o homem
durante toda sua evolução, utilizou-se de plantas para a cura dos seus males e injúrias,
mesmos que empiricamente. Acredita-se que 70% dos medicamentos derivados de
plantas tenham sido desenvolvidos com base no conhecimento folclórico (Garcia et al.,
2003). Algumas pesquisas científicas que têm como base a comprovação da identidade
botânica, composição química de compostos vegetais e análises de princípios ativos,
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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tem tornado possível a identificação e caracterização de vários princípios químicos que
representam não apenas um novo grupo de substâncias, mas a descoberta de novas
intervenções terapêuticas, inclusive nas doenças de origem cutânea como feridas , cortes
ou queimaduras (Ferreira, 2008; Govindrajan et al., 2007).
Entre as plantas utilizadas pelas populações por possuírem efeito cicatrizante
destacam-se: Amburana cearensis (Allemão) A. C. Sm. (Cumarú), Kalanchoe
brasiliensis Cambess (Courama), Cajanus cajan (L.) Millsp (Feijão cuandu), Ximenia
americana L. (Ameixa), Astronium urundeuva (Allemão) Engl. (Aroeira-do-sertão),
Helianthus annus Linné (girassol).
Plantas pertencentes ao gênero Ouratea, apresentam propriedades
antimicrobiana e anti-inflamatória e, têm sido utilizadas na medicina popular no
tratamento de doenças da pele. Apesar do seu uso tradicional, esta planta, ainda não
possui sua eficácia comprovada cientificamente. Neste sentido, o presente trabalho tem
tem como objetivo avaliar o potencial de cicatrização do óleo de Ouratea sp. em
modelo experimental murino, e espera-se contribuir para aumentar os conhecimentos
sobre a ação farmacológica observada na utilização empírica do óleo de Ouratea sp. no
tratamento das afecções cutâneas.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Morfologia e Fisiologia da pele
O tecido epitelial, a depender do órgão no qual se localiza, desempenha várias
funções no organismo, tais como: proteção do corpo, absorção e secreção de substâncias
do meio e percepção de sensações. Os tecidos epiteliais são classificados em dois tipos
principais: epitélio glandular e epitélio de revestimento. O epitélio glandular é
especializado na produção e eliminação de secreções e, o epitélio de revestimento tem
como principal função a proteção das estruturas internas do organismo (Kumar et al.,
2005).
Dentre os tecidos epiteliais de maior importância encontra-se a pele, considerada
o maior órgão do corpo, recobrindo toda a sua superfície externa. A pele pode ser
considerada como primeira linha de defesa do organismo, constituindo uma barreira
mecânica, promovendo proteção imunológica, termorregulação e secreção. Esta
estrutura é dividida em duas camadas distintas, a epiderme e a derme que estão
firmemente unidas entre si (Santos et.al., 2000). A camada subcutânea adiposo
subcutânea, situada abaixo da derme também conhecido como hipoderme também tem a
mesma origem embrionária da derme, porém não faz parte dela (Fig.1). A hipoderme
aumenta o isolamento da pele e é responsável pela união da pele com os órgãos
adjacentes e a protege das lesões causadas por pressão ou estiramento (De Almeida,
2009).
2.1.1 - A epiderme
A epiderme é constituída por um epitélio estratificado pavimentoso,
queratinizado caracterizado por células dispostas em várias camadas. A epiderme serve
como barreira que protege o organismo contra o estresse ambiental, tais como: invasão
por micróbios, perda de água e injúrias mecânicas e térmicas. Para desempenhar esse
papel, a epiderme conta com uma variedade de apêndices, incluindo unhas, folículos
pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas (De Almeida, 2009).
A epiderme é subdividida em cinco camadas ou estratos. A partir da camada
mais interna para a superfície encontram-se: o estrato basal, o estrato espinhoso, o
estrato granuloso, o estrato lúcido e o estrato córneo. Estes estratos refletem a
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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progressão das células germinativas, encontradas na base, para células corneificadas
diferenciadas, presentes na superfície (De Almeida, 2009).
O estrato basal também chamado de germinativo é uma camada contínua de
célula e pode ser considerado como um local onde as células são diferenciadas e
altamente proliferativas. Suas células são prismáticas ou cúbicas e repousam sobre a
membrana basal a qual separa a epiderme da derme. O estrato espinhoso é formado por
células poligonais cúbicas ou ligeiramente achatadas – células de Malpighi, as quais
possuem mais queratina do que as da camada basal. As células de Malpighi formam
junções celulares ricas em desmossomos e ao migrarem para a camada espinhosa
tornam-se progressivamente mais achatadas e começam a produzir grânulos
intracelulares. Possuem pequenas expansões citoplasmáticas que contem tonofibrilas as
quais propocionam resistência ao atrito. O estrato granuloso é formado por células
achatadas que possuem grânulos de queratina e como substância extracelular, lipídeos e
proteínas (colágeno). Algumas células do estrato granuloso possuem grânulos
revestidos por membrana denominados corpos lamelares que são revestidos
principalmente por lipídeos, os quais conferem a impermeabilidade da pele. O estrato
lúcido é constituído por uma camada acidófila, cujas células não mais possuem
organelas e apresentam núcleo picnótico, não é visível em toda região do corpo e está
presente apenas em áreas nas quais a pele é mais espessa, como as regiões palmo-
plantares. O estrato córneo é a camada mais externa constituídas por células mortas e
achatadas e citoplasma repleto de queratina (De Almeida, 2009).
A epiderme deve se renovar constantemente ao longo de sua vida para manter a
homeostase e para reparar danos após ferimentos. A capacidade regenerativa do epitélio
e sua homeostase dependem do balanço entre a proliferação e diferenciação/apoptose de
seu principal tipo celular, os queratinócitos (Pincelli e Marconi, 2010), os quais
produzem a queratina, uma proteína resistente e permeável responsável pela proteção
(barreira física). Tradicionalmente essas células têm sido consideradas constituintes
inertes das camadas múltiplas da epiderme, no entanto estudos atuais têm reconhecido o
papel ativo destas células na renovação epidérmica desempenhado também papel chave
na defesa imune da pele, sob condições de homeostase, acredita-se que células
progenitoras dos queratinócitos se dividem e terminam por diferenciar-se e construir as
camadas sobrepostas da epiderme. Em oposição a esse processo coordenado de
equilíbrio estão os sinais de ferimentos e inflamação. Ambos alteram o destino dos
queratinócitos e sua resposta ao ambiente através de alterações nas suas moléculas de
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
16
adesão e receptores de superfície, disparando uma resposta inflamatória imediata em
termos de secreção de citocinas e peptídeos antimicrobianos. Quando não controladas
essas respostas podem levar a lesões severas da pele, incluindo as desordens
inflamatórias crônicas (Suter et al. 2009).
Entre outras células presentes na epiderme temos as células de Langerhans (CL),
as quais são células dendríticas residentes da epiderme nas mucosas e na pele. Na pele
as CL funcionam como sentinelas, com função de captar, processar e apresentar
antígenos aos linfócitos T. Estes últimos quando ativados multiplicam-se e produzem
citocinas e outros mediadores responsáveis pela defesa do organismo contra essas
invasões (Cunningham et al. 2010). Os melanócitos são células dendríticas encontrados
na camada basal da epiderme e são responsáveis pela produção de melanina, substância
pigmentar que é produzida e armazenada em estruturas citoplasmática denominadas
melanossomas. Os melanossomas maduros acumulam-se na periferia celular, e são
subsequentemente transferidos via processos dendríticos aos queratinócitos vizinhos,
onde desempenharão papel importante na fotoproteção contra os raios ultravioletas,
conferindo também cor a pele, aos pelos e cabelos (Schiaffino, 2010). Menos
abundantes na epiderme, estão as células de Merkel as quais formam terminações
nervosas livres e especializadas conhecidas como corpúsculo de Merkel. Estas células
estão em íntima associação com as terminações nervosas e possuem vesículas
citoplasmáticas que funcionam como mecano-receptores (Dângelo et. al. 1988).
2.1.2 – Derme
A derme está localizada logo abaixo da epiderme conferindo e permitindo uma
base firme para sua sustentação. Apresenta uma complexa organização, com um tecido
conjuntivo rico em vasos, glândulas sebáceas e sudoríparas, folículos pilosos e
corpúsculos tácteis. O controle do fluxo sanguíneo dos plexos vasculares presentes na
derme é feito por estímulos oriundos do hipotálamo e das fibras nervosas simpáticas, e
além da nutrição, proporcionam o mecanismo de termorregulação. As terminações
nervosas sensoriais mantêm o indivíduo em contato com o meio ambiente (Arnold et al.,
2002).
A derme pode ser dividida em duas camadas: a camada papilar/subepitelial mais
superficial, na qual são encontradas as papilas dérmicas, as fibras conjuntivas frouxas e
as fibras elásticas que estão perpendiculares à junção dermoepidérmica, sendo esta
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
17
camada bastante vascularizada. E a camada reticular que é mais profunda, mais densa,
na qual são encontradas as fibras conjuntivas não-remodeladas e as fibras elásticas em
plexos. Feixes de fibras colágenas e elásticas estão localizados na substância
fundamental amorfa a qual é constituída por glicosaminoglicanas formando o tecido
conjuntivo dérmico (De Almeida, 2009).
Diferentes tipos celulares compõem a derme, tais como: fibroblastos e fibrócitos,
células imunológicas - macrófagos, mastócitos e leucócitos sangüíneos, particularmente
neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos (Arnold et al., 2002).
Os fibroblastos são células fusiformes, com núcleo oval e que participam da síntese
dos componentes da matriz extracelular permitindo e promovendo a formação do tecido
de granulação, levando a reepitelização, garantindo a manutenção da integridade do
tecido conjuntivo. Portanto são as principais células envolvidas no processo de
cicatrização (Carvalho, 2002; Amadeu et al., 2003; Pagnano et al., 2008). Os
fibroblastos são capazes de sintetizar fibras colágenas, elastina, fibronectina,
glicosaminoglicanas e proteases, sendo também responsáveis pelo debridamento e
remodelamento fisiológicos da célula (Hildebrand et al., 2005).
Os fibrócitos são encontrados em vários tecidos, tanto em condições fisiológicas
quanto patológicas (Bucala et al., 1994). Eles são considerados importantes no processo
cicatricial por contribuírem no mecanismo de formação do granuloma, na atividade
antigênica, na produção de colágeno e da matriz extracelular. Participam também na
remodelagem da pele e nos processos inflamatórios, através da produção de fatores de
crescimento e fatores angiogênicos, (Abe et. al.; Metz, 2002; Quan, 2004). Estas células
são derivadas de precursores da medula óssea e contribuem para a presença de
miofibroblastos no tecido cicatricial (Mori et al., 2005).
A hipoderme é a camada mais profunda do tecido epitelial e composta
principalmente por células adiposas (tecido conectivo gorduroso). É um depósito de
gordura de reserva, um isolante térmico e protege o organismo mecanicamente (Harris,
2005).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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2.1.3 – Colágeno
Os colágenos pertencem a uma família de proteínas da matriz extracelular
(MEC) que desempenha um papel importante na manutenção da estrutura de vários
tecidos e também possuem outras importantes funções, como por exemplo: adesão
celular, quimiotaxia, migração (Heino et al., 2009).
A relação dinâmica entre as células e o colágeno regula a remodelagem do
tecido durante o crescimento, diferenciação, morfogêneses e cicatrização bem como
estão envolvidos em várias patologias (Heino et al., 2009). Todas as moléculas de
colágenos consistem em três cadeias polipeptídicas chamadas cadeias α, e contém no
mínimo um domínio composto por sequências repetitivas de gly–X–Y. A presença de
glicina (gly–X–Y) é essencial para empacotamento dessa estrutura helicoidal (Fig 2). O
X e o Y pode ser qualquer aminoácido, porém a prolina é normalmente encontrado na
posição X enquanto a posição Y é frequentemente ocupada pela 4-hidroxiprolina. Estas
últimas são particularmente importante para estabilidade da proteína. Os colágenos são
uma das mais abundantes proteínas no corpo, constituindo 30% de massa protéica. As
superfamílias dos colágenos podem ser subdividas com base na forma de associação ou
outras características sendo numeradas de I a XXVII de acordo com sua ordem de
descobrimento. Alguns colágenos são restritos em determinados tipos de tecido: por
exemplo, tipo II e X e XI são exclusivamente encontrado nas cartilagens; a família do
tipo IV nas membranas basais; e tipo XVII nos hemidesmossomas da pele. Por outro
Fig1: Camadas e estruturas da pele. Fonte: Banco de Imagens Free (Stock.Xchng version 6.00, 2010).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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lado, alguns tipos de colágenos são encontrados na maioria das MECs. As fibrilas do
colágeno frequentemente consistem de mais que um tipo de colágeno (Myllyharju et. al.
2004).
2.2 Processo de Cicatrização
A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a organização de
células, sinais químicos e remodelamento MEC com objetivo de reparar tecido
lesionado. Por sua vez, o tratamento de feridas busca o fechamento rápido da lesão de
forma a restabelecer a integridade do tecido lesionado. Diante disso é imprescindível a
compreensão do processo biológico da cicatrização de feridas e regeneração tecidual
(Mendonça, 2009). Com o rompimento tecidual nos animais vertebrados logo se inicia o
processo de reparo ou cicatrização (Potter e Perry, 2003; Ferreira et al., 2008).
Uma ferida pode ser definida como qualquer lesão que leve a uma
descontinuidade cutânea (Fig 3), existindo várias causas, entre as quais as mais
frequentes são: o trauma (mecânico, físico ou químico), a isquemia, a pressão no local e
devido a procedimentos cirúrgicos (Strodtbeck, 2001). Baseado na natureza do processo
de reparação, as feridas podem ser classificadas como agudas ou crônicas. Sua
classificação constitui importante forma de sistematização necessária para o processo de
avaliação. Feridas agudas são injúrias causadas por corte ou incisão cirúrgica que
completam o processo de cicatrização dentro do tempo esperado. Em contraste, estão às
feridas crônicas que são injúrias teciduais aonde a cicatrização ocorre de forma lenta
Fig.2: Cadeias polipeptídicas - Formação da fibra colágena. Stock.Xchng version 6.00, 2010).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
20
devido a repetidos insultos ao tecido e também a um processo patológico secundário
que interfira na organização e duração do processo cicatricial. (Strodtbeck, 2001,
Blanes, 2002). Outra classificação refere-se às estruturas comprometidas, e consiste na
descrição anatômica da profundidade da ferida, que engloba: a ferida superficial
(limitada à epiderme), a ferida com perda parcial (limitada à epiderme e porção superior
da derme) e a ferida com perda total (quando há destruição da epiderme, derme, tecido
subcutâneo, podendo invadir músculos, tendões e ossos). Este sistema é adotado para
estadiar alguns tipos de feridas crônicas, como as úlceras por pressão e as queimaduras
(Santos, 2000).
O processo de cicatrização é didaticamente dividido nas seguintes fases: a)
hemostática; b) inflamatória; c) proliferativa ou de granulação e d) de remodelação
da matriz extracelular (Fig 4 e 5). Diferentes tipos de células, matriz extracelular,
proteínas e seus receptores estão envolvidos no processo biológico da cicatrização,
o qual é mediado por citocinas e fatores de crescimento (Tabela 1). A liberação de
vários fatores de crescimento na ferida, como fator de crescimento derivado
plaqueta-PDGF, fator de crescimento epidérmico-EGF, fator de crescimento básico
de fibroblastos-FGF, fator de crescimento transformante beta-TGF-β1, e o fator de
crescimento transformante alfa-TGF-α, afetam o recrutamento, a ativação, a
migração e a diferenciação de células no leito da ferida (Ferreira et al., 2008). Entre
as proteínas da matriz envolvidas neste processo estão a fibronectina, laminina,
tenascina e colágeno. Estas proteínas são de extrema importância por estarem
envolvidas na fase inicial da cicatrização das feridas, pois interagem entre si e
apoiam a adesão de fibroblastos com as células endoteliais (Pereira et al., 2005).
Fig. 3: Esquema de uma lesão cutânea. Fonte: Banco de Imagens Free (Stockxchng version 6.00, 2010).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
Fig. 4: Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. in Molecular Medicine
Fig. 5: Fases sequenciais do processo de cicatrihttp://patologiafacil.blogspot.com
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. Fonte: Experts Reviews olecular Medicine©.
Fases sequenciais do processo de cicatrização em função do tempo em dias. http://patologiafacil.blogspot.com , 2010.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
21
Experts Reviews
em função do tempo em dias. Fonte:
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
22
2.2.1 Fase Hemostática
Esta fase inicia-se no momento da injúria e permanece por algumas horas. A
primeira resposta dos vasos sanguíneos à lesão é a vasoconstricção mediada por
componentes vasoativos (catecolaminas), limitando, desta forma, a hemorragia e o
subsequente extravasamento de fluido e proteína. A vasoconstricção é seguida por uma
fase de vasodilatação e um aumento da permeabilidade vascular, onde se acredita que a
histamina seja o mediador bioquímico responsável (Mandelbaum et al., 2003).
Com o aumento da permeabilidade vascular, há o extravasamento de fluidos e
proteínas para o espaço extravascular. Consequentemente ocorre a diapedese de células.
Neste ponto, fatores de coagulação liberados pelas células lesadas, ativam a via
extrínseca da coagulação e da agregação plaquetária, expondo o colágeno da pele lesada
o qual ativará a via intrínseca da coagulação (Theoret, 2004).
Fator de Crescimento Fonte Efeito Fator de Crescimento de
Fibroblastos (FGF) 1, 2 e 4
Macrófagos, cél. endoteliais
Proliferação dos fibroblastos e angiogênese
Fator de Crescimento Transformante-α (TGF-α)
Macrófagos, queratinócitos
Reepitelização
Fator de Crescimento Transformante- β1 e β2 (TGF-β1 e β2)
Plaquetas, macrófagos
Quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos; síntese da MEC; secreção de inibidores da protease
Fator de Crescimento Epidermal (EGF)
Plaquetas Reepitelização
Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta (PGDF), isoformas AA,
AB e BB
Plaquetas, macrófagos, queratinócitos
Quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos, proliferação de fibroblastos
e síntese da MEC
Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF)
Fibroblastos da derme
Proliferação de queratinócitos
Interleucina 1α e β (IL1α e ILβ) Neutrófilos
Ativa a expressão do FC em macrófagos, queratinócitos e Fibroblastos
Tabela 1: Fatores de crescimento (FC) envolvidos no processo cicatricial de lesões cutâneas (Aukhil, 2000).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
23
A indução das plaquetas pela trombina resulta na liberação, por degranulação de
uma variedade de fatores de crescimento e substâncias vasoativas, tais como: PDGF,
TGF- α e β, FGF, EGF e VEGF, tromboglobulina, fator plaquetário-4, serotonina,
bradicinina, prostagladinas, prostaciclinas, troboxanos e histamina. A degranulação das
plaquetas também inicia a cascata do complemento com a formação de C3a e C5a,
potentes anafilotoxinas que promovem a liberação da histamina pelos basófilos e
mastócitos. Além de glicoproteinas adesivas como a fibronectina e trombospondina, as
quais são importantes constituintes da matriz extracelular provisória (Strodtbeck, 2001;
Mandelbaum et al., 2003; Midwood et al., 2004).
Com a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea formam um coágulo de
células e fibrina que promovem a hemostasia, forma-se um selo temporário sobre o sítio
da injúria e prevenindo a eventual entrada de microrganismos, além de formar um
suporte para a migração celular a qual é na realidade uma matriz extracelular provisória
sobre a qual fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos ingressam na ferida. Esta
matriz é composta por proteínas adesivas como: fibrina, fibronectina, trombospondina,
vitronectina e fator de Willebrand, fornecendo resistência limitada à ferida (Stashak,
2004; Theoret, 2004).
Com o passar do tempo, essa matriz provisória é substituída por um tecido de
granulação rico em fibronectina que fornece um leito vascularizado para deposição de
colágeno (Midwood et al., 2004). Isto serve como processo inicial e amplificador para a
próxima fase da cicatrização (Ferreira et al., 2007).
2.2.2 Fase Inflamatória
A fase inflamatória é caracterizada pela resposta vascular e celular, cuja
intensidade depende da gravidade da injúria. O início da fase inflamatória e sua
intensidade estão correlacionados com a boa irrigação e perfusão sanguínea (Theoret,
2005). Seu início se dá pela liberação de vários mediadores a partir de células e
capilares danificados (plaquetas ativadas, citocinas e fatores de crescimento) que
possibilitam a passagem de células para o local da lesão. Os principais componentes
celulares de uma ferida são os leucócitos polimorfonucleares (PMN) e os macrófagos
(Strodtbeck, 2001).
Os neutrófilos fornecem proteção à ferida contra a contaminação por meio da
fagocitose de detritos celulares e bactérias (Midwood et al., 2004). Quando ativados,
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
24
secretam radicais livres de oxigênio (RLO) e enzimas lisossômicas como proteases,
colagenases e elastases que ajudam a combater uma possível infecção. Além de sua
função fagocitária, os neutrófilos possuem ação pró-inflamatória exercida através da
liberação de citocinas que ativam fibroblastos e queratinócitos. Caso a ferida não esteja
severamente infectada, em poucos dias o número de neutrófilos diminui devido à
fagocitose por macrófagos. Depois de um ou dois dias, monócitos teciduais infiltram-se
no local da lesão e se diferenciam em macrófagos finalizando a fase inflamatória
(Werner e Grose, 2003; Martin, 2005).
Uma vez no local da lesão os macrófagos realizam intenso processo de
debridamento. De maneira similar aos neutrófilos exercem atividade microbiana através
da fagocitose e da liberação de oxigênio, de óxido nítrico (NO) e de peróxido de
hidrogênio (Halper et al., 2003). Os fatores mitogênicos e citocinas sintetizadas e
liberadas pelos macrófagos são: PDGF, FGF, VEGF, TGF-α e β e o fator-1 de
crescimento insulina-like que são necessários para estimular a formação do tecido de
granulação e, podem influenciar as fases tardias da cicatrização, como:
neovascularização, granulação, fibroplasia e epitelização (Santos, 2000).
Quanto aos linfócitos, o seu papel na cicatrização ainda não está bem definido e
permanece controverso. Aproximadamente seis a sete dias após a injúria, o número de
linfócitos que aparece na ferida é desproporcionalmente menor que na circulação. Os
linfócitos secretam linfocinas importantes, incluindo: IL-2, MAF (Fator de Ativação de
Macrófagos) e fatores quimiotáticos, além de aumentar o estágio inicial da cicatrização
através da estimulação de macrófagos, células endoteliais e fibroblastos. Entretanto,
sugere-se que os linfócitos T podem regular a atividade fibroblástica exuberante a qual
poderia, caso esta regulação não existisse, ocorrer tardiamente na reparação cicatricial
(Mencia-Huerta, 1993).
A participação de eosinófilos no processo cicatricial está, aparentemente,
associada à produção da Proteína Básica Principal (MBP) a qual age na degradação do
tecido (Mencia-Huerta, 1993).
2.2.3 Fase Proliferativa
Na reparação do tecido conjuntivo ocorre a formação do tecido de granulação,
com proliferação endotelial e de fibroblastos (fibroplasia). Estes últimos são atraídos
por estímulos químicos em direção ao leito da ferida, produzindo matriz extracelular e
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
25
angiogênese. Estas células são as principais células envolvidas na cicatrização e surgem
por volta do segundo ou terceiro dia após o trauma. Esses eventos são necessários para
permitir e promover a reepitelização, no entanto paralelamente a esta fibroplasia, ocorre
intensa proliferação vascular (Desmoulière et al, 2005).
Macroscopicamente o tecido de granulação apresenta-se com aspecto granuloso
e avermelhado. Muitos fibroblastos adquirem alguns aspectos morfológicos e
bioquímicos de células musculares lisas, onde essas modificações darão origem aos
miofibroblastos (Desmoulière et al, 2005). Estes produzem MEC a qual fornecerá a
força mecânica para atividade contrátil, responsável pelo fechamento das feridas após as
lesões, processo conhecido como contração da ferida (Tomasek et al., 2002; Gabbiani
2003).
Nas feridas, quando ocorre perda total da derme, a epitelização se faz apenas das
suas margens, pois não há anexos cutâneos remanescentes. A atividade mitótica do
fibroblasto praticamente desaparece em torno do 15º dia, passando a secretar as
proteínas presentes no tecido de granulação, produzindo componentes da substância
fundamental e o colágeno. A substância fundamental é formada por água, eletrólitos e
glicosaminoglicanos, com aspecto semelhante a um gel estando distribuído entre fibras
do tecido conjuntivo (Carvalho, 2002).
A formação do epitélio é outro fenômeno que ocorre na fase de proliferação, na
qual a epitelização faz-se pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das
células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo
subjacente (Carvalho, 2002). Adicionalmente, ocorre a fibrose com intensa participação
dos fibrócitos. (Abe et al., 2001; Metz, 2002; Quan, 2004). Durante a cicatrização, os
fibrócitos podem ser recrutados do tecido adjacente não lesado revertendo-se para o
estado de fibroblasto e reativando sua capacidade de síntese (Mori et al., 2005).
2.2.4 Fase de Remodelação ou Maturação
Nesta fase ocorrem eventos importantes, como: deposição, agrupamento,
remodelação do colágeno e regressão endotelial, ocorre também a diminuição de todos
os elementos celulares, inclusive as células inflamatórias (Fig 6). A maturação da ferida
tem início durante a terceira semana e caracteriza-se por um aumento da resistência,
sem aumento na quantidade de colágeno. A remodelação do colágeno inicia-se na
formação do tecido de granulação e mantém-se por meses após a reepitelização. Nessa
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
26
fase ocorre uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal e, alterações dos
elementos da matriz extracelular (Singer, et. al., 1999; Toscano, et. al., 2004).
Ocorre, concomitantemente, reorganização da matriz extracelular, que se
transforma de provisória em definitiva, cuja intensidade fenotípica, observada nas
cicatrizes, reflete a intensidade dos fenômenos que ocorreram, bem como o grau de
equilíbrio ou desequilíbrio entre eles. (Gabbiane, et. al., 2003). No entanto, se ocorrer o
desequilíbrio desta relação favorecerá o aparecimento de cicatrizes hipertróficas e
quelóides. Com a diminuição progressiva dos vasos neoformados, a cicatriz torna-se-á
menos espessa, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (Tazima et al,
2008).
Durante a fase inflamatória a liberação de fatores de crescimento por
fibroblastos, macrófagos e neutrófilos ativam os queratinocitos localizados nas margens
e no interior do leito da ferida. Os eventos dessa fase são regulados por três principais
agentes: fatores de crescimento, integrinas e metaloproteases (Santoro et. al., 2005).
Dentre os fatores de crescimento destacam-se o PDGF, que induz a proliferação de
fibroblastos com consequente produção da matriz extracelular durante a contração da
ferida e reorganização da matriz. O KGF7, que é considerado o principal regulador da
proliferação dos queratinócitos, assim como o TGF-β, principal responsável pelo
estímulo inicial da migração das células epiteliais (Santoro et. al., 2005).
A ativação de receptores de integrinas pelos queratinócitos permite a interação
com uma variedade de proteínas da matriz extracelular na margem e no leito da ferida.
Por outro lado, a expressão e ativação de metaloproteases promovem a degradação e
modificação das proteínas da matriz extracelular no sitio da ferida, facilitando a
migração celular. A própria atividade proteolítica dessas enzimas pode liberar fatores de
crescimento ligados a matriz extracelular, de forma a manter constante o estímulo a
proliferação e migração dos queratinocitos, acelerando o processo de reepitelização
(Santoro et. al., 2005). Esta fase de maturação perdura por toda a vida da ferida, embora
o aumento da força tênsil se estabilize, após um ano, em 70 a 80% da pele intacta
(Tazima et al, 2008).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
2.3 Plantas Medicinais
As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada
medicina tradicional em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que
utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é
adquirido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com
a natureza, observando-a de perto no seu dia
mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante
(Hamilton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido
estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma
Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população
mundial utiliza essas plantas ou preparações delas
as mais diversas enfermidad
No Brasil, cerca de um quinto da população consome 63% dos medicamentos
disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural
especialmente nas plantas, a única fonte de recurso terapêutico.
privilegiado neste aspecto,
aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (
2007). Destas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no
Figura 6: Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais da cicatrização. Fonte: Biologia da ferida e cicatrização, 2008.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada
em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que
utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é
rido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com
a de perto no seu dia-a-dia, e explorando suas potencialidades,
mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante
lton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido
estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma
Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população
ntas ou preparações delas como única fonte de tratamento para
as mais diversas enfermidades (Silva, 2003).
No Brasil, cerca de um quinto da população consome 63% dos medicamentos
disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural
especialmente nas plantas, a única fonte de recurso terapêutico. O Brasil é
privilegiado neste aspecto, pois abriga 55 mil espécies de plantas, compreendendo
aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (
tas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no
Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais da cicatrização. Fonte: Biologia da ferida e cicatrização, 2008.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
27
As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada
em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que
utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é
rido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com
dia, e explorando suas potencialidades,
mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante
lton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido
estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma-
Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população
única fonte de tratamento para
No Brasil, cerca de um quinto da população consome 63% dos medicamentos
disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural,
O Brasil é um país
abriga 55 mil espécies de plantas, compreendendo
aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (Di Stasi,
tas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no
Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
28
mercado mundial de produtos farmacêuticos, cosméticos e agroquímicos, perspectivas
de altos ganhos na economia (Guarrera e Marignoli, 2005).
Diante da carência financeira, a fitoterapia é uma alternativa viável para a
maioria da população. Se por um lado existe a necessidade de intensificação de estudos
potenciais em botânica, visando a descoberta ou comprovação de plantas usadas
popularmente, por outro é preciso reverter os conhecimentos adquiridos em benefícios
das pessoas e, obter um maior envolvimento da classe médica. Desta forma, diante da
importância da fitoterapia e da escassez de pesquisas em Medicina Veterinária, torna-se
necessário estudar e aprofundar os efeitos terapêuticos das plantas inseridas no contexto
agro-ecológico e social da população (Joshi e Joshi, 2000).
A fitoterapia tem sido aplicada há séculos empiricamente, mas atualmente vem
recebendo maior atenção dos campos acadêmicos e em estudos científicos. Diversas
enfermidades são tratadas ou aliviadas pela utilização de plantas, dentre elas destacam-
se as doenças de pele, incluindo-se as feridas. Sendo assim, é de suma importância que
novos trabalhos na área sejam desenvolvidos, a fim de aperfeiçoarem os recursos e
tecnologias existentes no tratamento de feridas, como também para torná-los mais
baratos e acessíveis, principalmente para a classe econômica menos favorecida (Dos
Santos, 2009).
Assim, apesar da predominância de substâncias sintéticas no arsenal
terapêutico, nos últimos anos tem-se verificado a retomada e valorização de práticas
terapêuticas consideradas por muitos profissionais de saúde como populares ou não-
científicas, inclusive a lenta reincorporação das ervas medicinais como alternativa ou
complemento terapêutico. Sendo vários os fitoterápicos testados e usados no processo
de cicatrização de feridas cutâneas que se mostraram promissores (Dos Santos, 2009).
Muitas plantas contendo óleos fixos são relatadas por suas propriedades
cicatrizantes relacionadas a ácidos graxos insaturados como, ômega-3, ômega-6 e
ômega-9 presentes em sua constituição (Oliveira et al., 2010; da Silva Quirino et al.,
2009). Habeeb et. al, 2007 demonstraram, por exemplo que os óleos fixos de Aloe vera
(babosa) apresentam atividade cicatrizante, sendo atribuída as seus polissacarídeos. Este
óleo também favorece a formação do colágeno fornecendo força e integridade a derme.
A fração glicoprotéica é o maior componente do Aloe vera que está envolvida com a
cicatrização por promover a proliferação celular, a migração e o crescimento dos
fibroblastos da derme (Eshghi et al., 2010). O óleo de Helianthus annus (girassol)
também tem se mostrado uma alta atividade cicatrizante. Esta planta é rica em ácido
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
29
linoléico (ômega- 6) o qual é um ácido graxo essencial e precursor do ácido aracdônico,
atuando indiretamente, nas prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos
os quais são importantes mediadores inflamatórios e essenciais no processo de
cicatrização das feridas (Eurides, 2006). Além do H. Annus,pode-se citar a Rosa aff.
Rubiginosa (rosa mosqueta) com grandes quantidades de ácido linoléico e seus
derivados (Eggers et. al., 2000), possuindo atividade cicatrizante substancial.
(Szentmihályi et al., 2002).
Assim, a importância da utilização de plantas no tratamento é evidenciada por
estes estudos e pela necessidade de se buscar alternativas para a cicatrização de lesões
na pele, já que os curativos disponíveis, sintéticos ou biossintéticos, utilizados são
bastante onerosos (Di Stasi, 2007).
2.3.2 Ouratea sp.
A família Ochnaceae pertence à ordem Theales e compreende cerca de 28
gêneros e 400 espécies de ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais de todo
o mundo. No Brasil, são conhecidos aproximadamente 9 gêneros com um total de 105
espécies (Jolly, 1988). São plantas essencialmente arbóreas ou arbustivas e, recebem
denominações específicas dependendo da região: angelim (Ouratea vaccinoides),
coração de bugre (Ouratea parviflora) e caju bravo (Ouratea floribunda e Ouratea
salicifolia), sendo estas últimas empregadas em ornamentação urbana. No Nordeste, as
espécies desse gênero são conhecidas popularmente por batiputá (Fig.7) (Barroso,
1986).
As espécies de Ochnaceae mais competentes em biossintetizar flavonóides e
biflavonóides, é representada pelo gênero Ouratea, sendo a frequência e a diversidade
estrutural dos biflavonóides nas espécies desse gênero utilizadas como marcadores
taxonômicos (Tih et al., 1992).
As espécies de Ouratea, são utilizadas pela população como tônicas e
adstringentes (O. castanaefolia, O. parviflora), como anti-inflamatório e em doenças da
pele (O. parviflora) e no tratamento de doenças gástricas (O. spectabilis) (Corrêa, 1975;
Paulo et al., 1986; Felício et al., 2004). Estudos tem demonstrado que extratos e frações
obtidas de plantas pertencentes a estes gênero possuem ação vaso-dilatadora e anti-
hipertensiva (Cortes et al., 2002), antitumoral (Sampaio et al., 1975; Oliveira et al.,
2002; Carvalho et al., 2002; Grynberg et al., 2002). O óleo extraído do extrato hexânico
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
30
dos frutos de O. parviflora apresentou atividades antibacteriana e antifúngica (Marcol et
al., 1988).
Além dos flavonóides e biflavonóides, esse gênero são bioprodutores de outras
classes de metabólitos como: triterpenos, diterpenos, depsídeos, ésteres graxos e
triglicerídeos, aos quais se atribuem suas importantes propriedades biológicas. Entre
essas classes de substâncias, os biflavonóides recebem destaque, devido à frequência e
abundância com que são encontrados nesse gênero, e cuja diversidade estrutural é
devida, principalmente, aos diferentes padrões de ligações entre seus monômeros
(Velandia et al., 2002; Felicio et al., 2004).
Fig. 7: Ouratea sp. Fonte: http://www.ulf-mehlig.de/jpg/dunes/duouratea-1-0.html
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
31
3 JUSTIFICATIVA
O uso de plantas medicinais como agentes terapêuticos tem despertado interesse
junto aos pesquisadores devido os seus mais diferentes efeitos, dentre eles o de promover a
cicatrização de feridas, ocasionadas por doenças de pele ou traumas. Entretanto, o uso
potencial dessas plantas como fontes de substâncias cicatrizantes em Medicina
Veterinária ainda é insignificante.
O número e a variedade de preparações tópicas obtidas a partir de plantas
medicinais para a cicatrização de feridas é relativamente significante, sendo, na sua
maioria, eficientes estimulando a cicatrização. Em contrapartida, mais estudos são
necessários, mediante a vastidão de plantas existentes, para que haja a comprovação
científica do efeito cicatrizante de fitoterápicos, evitando assim o uso indevido de
determinados produtos que são prejudiciais à cicatrização, por serem irritativos ou
estimularem a formação de um tecido de granulação exuberante (White, 1995).
Apesar de diversas atividades terapêuticas comprovadas, o efeito cicatrizante do
óleo de batiputá (Ouratea sp.) sobre feridas cutâneas permanece desconhecido. Por outro
lado, apesar de já ser utilizado pela população como cicatrizantes, essa atividade
terapêutica ainda necessita de comprovação científica. Desta forma, são necessárias
pesquisas que evidenciem, cientificamente, a ação dos constituintes presentes no óleo de
batiputá (Ouratea sp.) como cicatrizantes além de não causarem efeitos colaterais.
Portanto, a comprovação do potencial cicatrizante dessa planta utilizada em feridas
cutâneas em modelos experimentais irá validar seu uso, bem como contribuir para a
produção de um fitoterápico de baixo custo para uso humano e/ou veterinário.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
32
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O óleo fixo de Ouratea sp., conhecida como batiputá, possui atividade
cicatrizante em lesões cutâneas induzidas expermentalmente.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
33
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral:
Avaliar o potencial do óleo fixo de Ouratea sp. (batiputá) na cicatrização de
feridas cutâneas experimentais in vivo.
5.2 Objetivos específicos:
• Determinar a composição química do óleo fixo de Ouratea sp.;
• Avaliar os aspectos macroscópicos das lesões cutâneas em camundongos (Mus
musculus);
• Avaliar a retração da área da lesão nas feridas em cicatrização;
• Avaliar os aspectos histológicos no processo cicatricial;
• Avaliar morfometricamente a quantidade de colágeno durante o processo de
cicatrização das feridas.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
34
6 MATERIAL E MÉTODOS
6.1 Óleo Vegetal
Pesquisas realizadas com a população a respeito de tratamentos para feridas na
pele foi relatado o uso do óleo de Ouratea sp. como um dos produtos naturais mais
utilizados na região. Com base nesta pesquisa foi feita a aquisição comercial do óleo de
Ouratea sp., no Mercado São Sebastião, situado na cidade de Fortaleza, no Estado do
Ceará. O óleo foi acondicionado em frascos de vidro com as seguintes características
qualitativas: coloração amarela translúcida com consistência e odor sui generis. Os
fracos foram armazenados a 25°C, envolvidos em papel laminado a fim de proteger
contra a luminosidade excessiva.
Utilizou-se como referência para o estudo o óleo de Helianthus annus (girassol),
por já possuir sua atividade cicatrizante conhecida (Wendt, 2005). Este óleo foi obtido
comercialmente através de farmácia de manipulação.
6.1.1 Análise Fitoquímica
A análise química dos constituintes do óleo de Ouratea sp. foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa, realizada no Parque de
Desenvolvimento Tecnológico (PADETEC), em Fortaleza, Ceará. Utilizando
espectrômetro Shimadzu modelo GCMS-QP 5050 sob as seguintes condições: coluna
capilar de sílica fundida W Scientific DB-5MS (50 m x 0,25 mm); gás de arraste: He (1
mL/min); temperatura do injetor: 250°C; temperatura do detector: 200 °C; temperatura
da coluna: 35-180°C a 4°C/min e depois 250°C/15 min; espectro de massa: por impacto
eletrônico a 70 eV. A identificação dos constituintes foi feita por busca em biblioteca de
espectros de massa, tempos de retenção e comparação visual dos espectros de massa
obtidos com os publicados na literatura (Alencar et al., 1984; Adams, 1989).
6.2 Animais
Camundongos Swiss machos, com 8-10 semanas de idade, pesando 32,0 ±
2,0g foram adquiridos e mantidos no Biotério de Criação e Biotério Experimental do
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em
caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h
claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento
de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas
preconizadas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
SBCAL e os protocolos experimentais
Uso de Animais – CEUA da
6.2.1 Procedimento cirúrgico
Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo),
anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e
cloridrato de cetamina 10% (115 mg/Kg), segu
al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da
região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um
molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A
ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15
e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de
dissecção, até sua ressecção
6.2.2 Tratamento da lesão
Fig. 8: Procedimento cmetálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida realizada.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - CPqAM/FIOCRUZ, localizado
Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em
caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h
claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento
de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas
Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
experimentais foram aprovados pelos Comitês de Ética para o
da Universidade Estadual do Ceará (SPU – 09172748
6.2.1 Procedimento cirúrgico
Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo),
anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e
to de cetamina 10% (115 mg/Kg), seguindo a metodologia proposta por
al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da
região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um
lico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A
ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15
e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de
o, até sua ressecção, expondo a fáscia muscular (Fig 8 A-C).
6.2.2 Tratamento da lesão
Procedimento cirúrgico para realização da lesão. A –metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
35
CPqAM/FIOCRUZ, localizado no campus da
Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em
caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h
claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento ad libitum
de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas
Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório –
pelos Comitês de Ética para o
09172748-0).
Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo),
anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e
indo a metodologia proposta por Hall et
al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da
região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um
lico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A
ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15
e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de
– molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
Fig. 9: A- Bancada para Microtomiado processo histológico.
Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e,
lesão foi tratada diariamente até o 12º dia de
soluções testes. Os grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental
empregado: G I – animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II
animais tratados com o óleo de
óleo de Ouratea sp.(batiputá).
6.2.3 Análises Histológicas
As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes
tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e
submetidos à eutanásia em câmar
4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico
de rotina, incluídas em parafina (Fig. 9 A
microtomia com seções de 5 µm na
Em seguida as lâminas das amostras foram coradas pela
(H/E) e pelo Picrosirius. Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente
sob o microscópio de luz em magnificação de 40
aspectos histológicos (Tabela
(+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma
cega pelo mesmo investigador.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
Bancada para Microtomia. B e C- Visão em detalhes do processo histológico. D – Processo de coloração das lâminas.
Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e,
lesão foi tratada diariamente até o 12º dia de pós-operatório (p.o.) com
s grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental
animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II
animais tratados com o óleo de H. annus (girassol) e G III – animais tratados com
(batiputá).
6.2.3 Análises Histológicas
As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes
tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e
submetidos à eutanásia em câmara de CO2. Após isto, foram fixadas em formaldeído a
4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico
de rotina, incluídas em parafina (Fig. 9 A-D). O material foi então submetido
microtomia com seções de 5 µm na área logo abaixo da epiderme e formação de crostas.
Em seguida as lâminas das amostras foram coradas pela Hematoxilina
Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente
sob o microscópio de luz em magnificação de 40x e 100x e classificados quanto aos
aspectos histológicos (Tabela 3) em: ausente (-), discreto (+), moderado (++) e intenso
(+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma
cega pelo mesmo investigador.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
36
Visão em detalhes
Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e, cada
com 100 µL das
s grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental
animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II –
animais tratados com o
As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes
tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e
. Após isto, foram fixadas em formaldeído a
4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico
D). O material foi então submetido à
abaixo da epiderme e formação de crostas.
Hematoxilina-Eosina
Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente
0x e classificados quanto aos
), discreto (+), moderado (++) e intenso
(+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
6.2.4 Quantificação do colágeno para análise m
A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as
lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob
objetiva de 5x e um software
expressa em percentual (Fig. 10
6.2.5 Análise Macroscópica
Para a análise macroscópica,
foram submetidos ao procedimento cirúrgico
Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos
como: edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação
6.2.6 Contração da área da lesão
A mensuração da área da lesão foi realizada c
digital (Fig 11). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al.
(1988): A= π.R.r, onde “A” representa a área (cm²); “R”
representa o raio menor.
Fig. 10: A- Equipamento utilizado para realização da morfometria. Visão do software
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por
tificação do colágeno para análise morfométrica
A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as
lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob
software específico Qwuin (LEICA®), a quantidade de colágeno foi
expressa em percentual (Fig. 10 A-C).
6.2.5 Análise Macroscópica
Para a análise macroscópica, foram utilizados 3 grupos de 10 animais
foram submetidos ao procedimento cirúrgico como descritos a
Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos
como: edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação e reepitelização.
6.2.6 Contração da área da lesão
A mensuração da área da lesão foi realizada com o auxílio de um paquímetro
). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al.
.R.r, onde “A” representa a área (cm²); “R” representa o raio maior; “r”
Equipamento utilizado para realização da morfometria. Bsoftware utilizado.
Fig. 11: Paquímetro digital.
. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
37
A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as
lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob
), a quantidade de colágeno foi
grupos de 10 animais, os quais
como descritos anteriormente.
Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos
e reepitelização.
om o auxílio de um paquímetro
). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al.
o raio maior; “r”
B e C-
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
38
6.3 Análise Estatística
Foi realizada uma análise descritiva dos resultados obtidos. Para testar a suposição
de homogeneidade das variáveis envolvidas no estudo foi aplicado o teste de Bartlett.
Quando observado o pressuposto de homogeneidade entre as variáveis foi aplicado
ANOVA e como post hoc o teste de Tukey, e quando o pressuposto não foi observado,
utilizou-se a ANOVA para variâncias com diferenças, sendo o teste Pair wise t-test
como post hoc. E nos casos em que as observações ocorreram ao longo do tempo de
forma dependente, o teste foi aplicado levando em consideração o pareamento dos
dados. Todas as conclusões foram tomadas ao nível de significância de 5%. Os
softwares utilizados foram o Excel 2000 e o R v2.10.0.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
39
7 RESULTADOS
7.1 Análise química do óleo fixo
Os resultados da avaliação química do óleo fixo de Ouratea sp. estão
representados na tabela 2. A cromatografia gasosa acoplada em espectrômetro de massa
detectou a presença de ácidos graxos insaturados no óleo fixo de Ouratea sp. (Fig.12).
O ácido linoléico (40,88%), ácido oléico (28,29%) e o ácido palmítico (20,65%) foram
os componentes majoritários encontrados neste óleo. Além destes ácidos, foram
isolados outros constituintes em menores concentrações, tais como os ácidos esteárico,
linoléico-iso e ecosanóicos.
Figura 12: Cromatografia de Íons Totais (TIC) do óleo de Ouratea sp.
Tabela 2: Composição química qualitativa e quantitativa do óleo fixo de Ouratea sp., com respectivos tempos de retenção correspondente a cada substância.
Tempo ret. %Total Constituintes
18.280 20.65 Ácido Palmítico
20.448 40.88 Ácido Linoléico
20.521 28.29 Ácido Oléico
20.573 1.84 Ácido Elaiclico
20.814 5.67 Ácido Esteárico
20.874 2.25 Ácido Linoléico-iso
23.142 0.42 Ácido Eicosanóico
Tempo de Retenção (min.)
Intensidade
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
40
7.2 Avaliação Macroscópica
A avaliação macroscópica de cada lesão foi realizada até o 12º dia de p.o., os
seguintes aspectos foram observados: presença de edema, hiperemia, exsudato, tecido
de granulação e reepitelização (Tabela 3).
No 1º dia de p.o, foi observado exsudato sero-saguinolento, hiperemia e edema
nas feridas em todos grupos (Tab. 3 e Fig.13). As lesões presentes nos três grupos
apresentaram sinais flogísticos como: edema, hiperemia e exsudato nos primeiros dias
(0-4 dias de p.o) ( Tabela 3).
Os animais dos grupos I e II apresentaram edema, hiperemia e exudato nos 3
primeiros dias de p.o. Do dia 4 ao dia 7 a hiperemia persistiu, mas houve uma
diminuição no exudato e ausência de edema. O aparecimento de uma crosta de aspecto
granular, espessa foi observado neste período. Não houve desprendimento da crosta
neste grupo durante todo período de observação. Também não foram observados neste
grupo sinais de reepitelização (Figs 13A-C).
Os animais do grupo II (Figs.D-F) e com o óleo de Ouratea sp. (Figs 14 G-H)
apresentaram evolução semelhante ao grupo I nos períodos iniciais de tratamento (0-3
dias). Nos grupos II e III foram observados o aparecimento de uma crosta mais
precocemente do que no grupo controle (grupo I) para este mesmo período de
observação. Nos dias subseqüentes até o dia 7 o grupo II apresentou uma evolução
superior aos demais grupos, com diminuição do exudato, formação de crosta espessa,
sem hiperemia. Já no grupo III foi observado ainda a presença de exudato, embora em
menor quantidade quando comparado com os dias anteriores, uma crosta com aspecto
regular e menos espessa do que nos grupos I e II. Nos períodos de 8-12 dias de p.o. os
dois grupos tratados com os óleos apresentaram desprendimento da crosta, sendo que no
grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. o desprendimento ocorreu mais precocemente
do que no grupo tratado com o óleo de H. annus. Também foi possível observar uma
maior reepitelização no grupo III quando comparado aos demais, sendo esta
característica observada entre os dias 9-10 enquanto para o grupo II apenas a partir do
dia 11. Houve também no grupo III um desprendimento mais rápido da crosta do que os
grupos I e II. Apenas nos grupos do II e III foi observada a presença de re-epitielização
(Figs 13 F-I).
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
41
Para verificarmos a hipótese do óleo de Ouratea sp. ter sido contaminado, o que
poderia dificultar o processo cicatricial, foi realizado teste microbiológico deste. Nossos
resultados mostraram a ausência de crescimento de microrganismos, confirmando a sua
qualidade.
Ed = edema, Hip = hiperemia, Exs = exsudato, Cr = crosta, Re = re-epitelização, De = desprendimento
da crosta
7.3 Análises Histopatológicas
Para análise histopatológica as lâminas das amostras das lesões foram coradas e
analisadas segundo critérios previamente descritos na metodologia (Tabela 4). A
avaliação histopatológica dos animais do grupo I demonstrou a evolução normal do
processo reparativo. No 2º dia de p.o., o grupo I apresentou infiltrado de células
inflamatórias, principalmente linfócitos. No grupo II, há uma predominância de
Grupos Dias 0 - 4 5 - 7 8 -12 GI
GII
GIII
Ed / Exs / Hip
Ed / Exs / Hip
Ed / Exs / Hip
Hip / Cr
Cr
Exs / Cr
Cr
Re
Re / De
Tabela 3. Avaliação macroscópica durante os dias de tratamento.
NaCl 0,9%
H. annus
Ouratea sp.
Dia 2 Dia 7 Dia 12
Figura 13: Aspectos Macroscópicos das lesões durante tratadas com óleo fixo de Ouratea sp.
por 12 dias consecutivos. Observe a presença da crosta menos espessa no grupo controle (A)
no dia 2 quando comparada com os óleos de girassol (D) e do Batiputá (G) para este mesmo período. Também é possível observar o desprendimento da crosta e a presença de re-
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
42
neutrófilos sobre linfócitos, enquanto no grupo III apenas neutrófilos são observados no
dia 2 de p.o.
No 7° dia já foi possível observar nos animais dos grupos controles tecido de
granulação com padrão fibrovascular, colagenização com epitélio desorganizado nas
bordas das lesões. Estas fibras se mostraram mais organizadas no 12º dia p.o. quando
também se pode observar a presença do processo de re-epitelização. Também foi
importante observar que grupos controles não apresentavam folículo piloso durante todo
o tempo de observação. A presença de fibroblastos entre os grupos foi bastante
diversificada. Foi possível observar a presença destas células no grupo controle e nos
grupos tratados com os óleos. No entanto, elas são mais abundantes nos grupos III e II
no último dia de observação, não sendo observadas nestes grupos no 7° dia e sendo
moderados no dia 2º de p.o.
O grupo tratado com óleo de H. annus apresentou um infiltrado inflamatório
considerável no 2° dia, quando comparado ao grupo tratado com óleo de Ouratea sp.
No 12º dia p.o. o grupo tratado com NaCl a 0,9% apresentou fibras colágenas
organizadas e, os camundongos tratados com o óleo de H. annus e o óleo de Ouratea sp.
apresentaram características histopatológicas semelhantes: re-epitelização, presença de
fibroplasia e fibras colágenas (Figura 14 A-I).
Escores: ausente (-), discreto (+), moderado (++) ou intenso (+++).
PARÂMETROS HISTOLÓGICOS
GRUPO I GRUPO II GRUPO III
DIA 02
DIA 07
DIA 12
DIA 02
DIA 07
DIA 12
DIA 02
DIA 07
DIA 12
Células Inflamatórias:
Linfócitos Neutrófilos Monócitos Eosinófilos
+++ - - + - - - - - + +++ - +++ - - +++ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Edema Congestão de vasos Hemácias Tecido de granulação Angiogênese Fibroblasto Fibras colágenas Epitélio desorganizado Epitélio em organização Reepitelização Queratina Glândula sebácea Folículo piloso
- - - + + + + ++ - - - - -
- - - ++ - - + ++
- - - + - - ++ +++ - + - - - - - - + + - - - - - +++ + + - - - - - +++ ++ ++ ++ - +++ ++ - +++ - + +++ - +++ +++ - - ++ ++ - + + - - - - - +++ - - +++ - - - ++ +++ - ++ +++ - - - - ++ - - - - - - - - - - - - - - - +++ - - +++ - -
Tabela 4: Aspecto qualitativo da avaliação histológica do potencial de cicatrização do óleo fixo de Ouratea sp.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
43
7.4 Contração da Área da Lesão
A evolução macroscópica do processo cicatricial foi acompanhada pela
mensuração das lesões ao longo dos 12 dias p.o. (Fig. 15). A partir do 6º dia p.o. o
grupo tratado com NaCl a 0,9% iniciou uma contração significativa da área da lesão, o
grupo tratado com o óleo de H. annus teve uma contração significativa da área da lesão
a partir do 7º dia p.o. e o grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. reduziu
significativamente a área da lesão a partir do 4º dia p.o.
NaCl 0,9%
H. annus
Ouratea sp.
Dia 2 Dia 7 Dia 12
Figura 14: Avaliação microscópica (H&E) dos tecidos tratados à base de óleos vegetais em diferentes dias sobre a cicatrização cutânea: Grupo I: NaCl 0,9% (A=D2, B=D7; C=D12) –; Grupo II: H. annus (D=D2; E=D7; F=D12); Grupo III: Ouratea sp.(G=D2; H=D7; I=D12). Legenda: c= crosta; q= queratina; ep= epitélio; vs= vaso sanguíneo; tg= tecido de granulação; ci= células inflamatórias; fb= fibroblastos.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
44
7.5 Análise Morfometria
A análise morfométrica da quantidade de colágeno demonstrou que em todos os
grupos houve uma tendência ao aumento da deposição de colágeno sendo que a partir
do 2º dia um aumento mais pronunciado foi observado no grupo tratado com solução de
NaCl 0,9%, quando comparados aos demais grupos analisados. No decorrer dos dias de
tratamento, o grupo controle apresentou uma redução gradativa quanto ao conteúdo de
colágeno depositado. Todavia, os grupos tratados com os óleos H. annus e Ouratea sp.
comportaram-se de forma oposta ao grupo controle, pois com o decorrer dos dias de
tratamento o percentual de colágeno apresentou-se em maiores quantidades (Fig. 16).
Figura 15: Tratamento com o óleo fixo de Ouratea sp. sobre a área da lesão
Fig. 16: Porcentagem da deposição de colágeno durante o tratamento.
Percentual de C
olágeno (%)
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
45
8 DISCUSSÃO
A cicatrização é um processo complexo e dinâmico de restabelecimento das
estruturas celulares e, consequentemente, das camadas do tecido epitelial. Este processo
é realizado a fim de estabelecer uma reepitelização mais próxima do seu estado normal
(Kumar et al., 2006). Algumas plantas são medicinais utilizadas de maneira empírica
como o óleo Ouratea sp., popularmente conhecido por batiputá, que é utilizado como
agente para diversas afecções da pele, inclusive, como cicatrizante para feridas
cutâneas.
Devido a sua disponibilidade no Nordeste Brasileiro e, mais especificamente, no
interior do Estado do Ceará, as espécies de Ouratea sp., são bastante utilizadas pela
população como tônicas e adstringentes (O. castanaefolia, O. parviflora), como anti-
inflamatório e em doenças da pele (O. parviflora) e no tratamento de doenças gástricas
(O. spectabilis) (Corrêa, 1975; Paulo et al., 1986; Felício et al., 2004).
No presente trabalho nós analisamos o potencial cicatrizante do óleo do Batiputá
e utilizamos o óleo de H. annus, o girassol, como tratamento de referência. Este óleo já
é bastante utilizado em feridas abertas promovendo um menor desconforto doloroso ao
indivíduo (Eurides et. al., 2006). Quando observadas as respostas cicatriciais das feridas
cutâneas, nos tratamentos utilizados, estas podem ser atribuídas ao fato de tanto o óleo
de girassol quanto o de Batiputá apresentarem como componentes mais abundantes os
ácidos linoléico (ômega 6) e oléico (ômega 9). Segundo De Nardi et al. (2004), estes
ácidos tem importante função no processo inflamatório, na proliferação e modulação do
crescimento celular. Desta forma, os efeitos superiores destes óleos tanto na qualidade
quanto no tempo da reepitelização da lesão pode ser atribuído a ação conjunta destes
ácidos. No entanto, não se pode descartar a hipótese de outros constituintes encontrados
em menor quantidade possa estar agindo sinergicamente potencializando sua ação
cicatrizante. O ácido linoléico em alta concentração no óleo de girassol foi aplicado em
lesões escamosas e dermatose por Van Dorp, 1974 e Prottey et al., 1975 onde
observaram a reversão e a cura dessas lesões. Hartop Prottey, 1976 também mostrou
que, quando aplicado via cutânea, ambos os ácidos (linoléico e iso-linoleico), restaurada
a permeabilidade da epiderme na pele de ratos. De acordo com Glasgow e Eling, 1990,
o ácido linoléico é essencial para a regulação de eventos bioquímicos que precedem a
mitogênese fibroblástica uma vez que estimula alguns fatores de crescimento celular e ,
segundo Moch D. et al., 1990 por ser um poderoso mediador pró-inflamatório (ácido
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
46
linoléico) provoca a migração de granulócitos e macrófagos, bem como mudanças
importantes no tecido da granulação.
A avaliação histopatológica mostrou um maior acúmulo de células inflamatórias
no grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. Sabe-se que a fase inflamatória é uma etapa
das mais importantes no processo de cicatrização. É nesta fase que células como
neutrófilos, responsáveis pela fagocitose de restos celulares e agentes estranhos,
proliferam no sítio da lesão, ativados pela permeabilidade vascular e pela ação de
substâncias quimiotáticas, como fatores do crescimento, citocinas, fatores plaquetários
entre outros. Esses dados corroboram com os dados encontrados por Ribeiro et al.,
2009, que observaram a presença de infiltrado inflamatório severo, predominantemente
neutrofílico. E segundo Gurmel et al. 1998, as feridas dos animais tratados com
curcumina demonstraram reepitelização, neovascularização, aumento da migração de
várias células, incluindo fibroblastos, miofibroblastos e macrófagos no leito da ferida, e
um maior teor de colágeno. Macrófagos também estão presentes nos sítios da lesão
auxiliando os neutrófilos na fagocitose secretando sinalizadores de fibroblastos os quais
são os responsáveis pela síntese do colágeno (Guidugli-Neto, 1992). Assim, embora
nossos resultados sejam aparentemente paradoxais com relação ao aumento da atividade
inflamatória no óleo do Batiputá em relação ao grupo controle, esta atividade
aumentada pode contribuir para uma maior resposta destas células e por conseguinte,
aumentar a eficiência do processo cicatricial. Por outro lado, a hipótese que uma
eventual contaminação dos óleos com micro-organismos pudesse estar afetando e
exacerbando a resposta inflamatória local também deveria ser considerada. Desta forma
realizamos teste bacteriológico destes óleos. Os resultados negativos quanto a presença
de microrganismos nos óleos analisados refutaram esta hipótese.
Durante todo o estudo, a mensuração da área ferida foi realizada, sendo
observada a redução da lesão em todos os grupos. Embora não tenha havido diferenças
significativas entre os grupos com relação a este parâmetro no decorrer do período total
de observação, nossos dados mostraram que a retração da lesão se dá de maneira mais
precoce no grupo do Batiputá. Um importante fator de morbidade de uma ferida é o
tempo que esta leva para completar o processo de cicatrização. Assim a possibilidade de
que uma ferida pode infeccionar é tanto maior quanto maior for a área comprometida
(Branon, 2002; Clark, 2003). Desta forma, o Batiputá apresentaria uma vantagem em
relação aos demais, uma vez que o tratamento com este óleo favorece a contratura
significativa da lesão em um espaço mais curto de tempo diminuindo as chances de uma
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
47
eventual contaminação. Segundo Madison e Gronwal, 1992 o processo de contração das
feridas ocorre em três fases: uma fase inicial, na qual as bordas da ferida apresentam
retração centrífuga e a área da lesão aumenta; a seguir, um período de contração rápida
em direção ao centro da lesão, e finalmente, quando a ferida está praticamente
cicatrizada, o processo torna-se mais lento, deixando a curva de cicatrização na forma
de platô. O aumento da área das lesões registrado logo após o traumatismo se deve,
segundo Barber, 1990 à associação da perda da tensão ao edema da pele. Segundo
Kumar et al., 2006, os animais tratados com a casca da uva em pó da Cabernet
Sauvignon, exibiram aumentos significantes nas a taxa de contração da ferida, a taxa de
epitelização. Corroborando com os resultados de Baie e Sheikh, 2000 que trataram ratos
com o óleo de peixe, e até ao final de doze dias obtiveram 80% de contração da ferida.
O tecido de granulação formado na penúltima parte da fase proliferativa é
composto principalmente de fibroblastos, colágeno (tipo III), células inflamatórias,
fibronectina e novos pequenos vasos sanguíneos. Colágeno, o principal componente
estrutural de granulação tecidos, fortalece e apóia matriz extracelular tecidos, e
eventualmente substitui a fibronectina temporária matriz. Este é considerado o principal
componente que fortalece e suporta o tecido extracelular, pois é composto de
aminoácidos dentre eles a hidroxiprolina, e tem sido usado como um marcador
bioquímico tecidual (Kumar et al., 2006). Tomariz et. al., 2002 demonstraram que a
deposição de colágeno recém-sintetizado no local da ferida, amplia a concentração deste
por unidade de área e, portanto, aumenta a resistência à tração do tecido, interferindo
positivamente na contração da área lesionada. Para verificarmos os efeitos dos
tratamentos com os óleos sobre a deposição de colágeno, foi realizada a análise
morfométrica através da quantificação desta proteína. Nossos resultados demonstraram
um aumento significativo da quantidade de colágeno em todos os grupos testados, sendo
que no decorrer do tratamento, o grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. foi o que
apresentou aumento significativo na quantidade da proteína (p=0,04) em relação ao
grupo controle, no 12º dia. Estes dados corroboram tanto as nossas análises histológicas
quanto macroscópicas. Consistentemente, nossos achados revelam que apenas o grupo
tratado com os óleos de batiputá e do girassol apresentaram uma repitelização eficiente
e sugerem que o bom resultado de repitelização alcançado pelos óleos se deva a uma
deposição eficiente do colágeno nestes grupos em relação ao controle. Segundo
Schumacher et al., 1992 e D’utra Vaz 1995 características clínicas semelhantes foram
observadas para lesões cutâneas em equinos avaliadas nos primeiros dias após a
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
48
indução, que foram associadas ao pico da fase inicial do processo inflamatório. De
acordo com Marques et. al., 2004 Ao sétimo dia após a excisão, as feridas tratadas com
ácidos graxos essenciais, apresentaram-se evoluídas macroscopicamente que as feridas
do grupo controle devido a um grande desenvolvimento do tecido de granulação,
contração na borda exterior das fronteiras e da ausência de secreção. Por outro Por outro
lado, as feridas controle apresentaram extensas áreas de hiperemia, crosta e edema.
Nossos dados sugerem o óleo fixo de Batiputá como alternativa terapêutica no
tratamento de feridas. No entanto, maiores estudos ainda se fazem necessário para uma
melhor compreensão do papel deste óleo sobre a fisiologia da cicatrização de lesões da
pele.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
49
9 CONCLUSÕES
O óleo fixo de Ouratea sp. apresentou os ácidos linoléico (40,88%), oléico
(28,29%) e palmítico (20,65%) como componentes majoritários;
O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu re-epitelização a partir do oitavo
dia e retração da área da lesão mais evidente a partir do quarto dia;
O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu migração neutrofílica, proliferação
de fibroblastos e aumento de fibras colágenas;
O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu maior percentual de colágeno.
Portanto, concluiu-se que óleo fxo de Ouratea sp. auxilia e acelera o processo de
cicatrização, mostrando potencial terapêutico sobre as lesões cutâneas, comprovando,
desta forma, o seu uso popular como agente cicatrizante.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
50
10 PERSPECTIVAS
Como as lesões de pele, particularmente as feridas, possuem grande importância
clínica em função da alta frequência com que ocorrem entre os animais domésticos, este
estudo aponta perspectivas para a utilização do óleo de Ouratea sp. em ferimentos
cutâneos.
Além do mais, novos protocolos com o intuito de verificar a concentração ideal
do óleo fixo de Batiputá para sua utilização em ferimentos cutâneos devem ser
avaliados em animais de diferentes espécies.
ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.
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