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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 1. INTRODUÇÃO

A capacidade de sobrevivência ou de multiplicação dos microorganismos que estão presentes em um alimento depende de uma série de fatores. Entre estes fatores estão aqueles relacionados com as características próprias do alimento (fatores intrínsecos) e os relacionados com o ambiente em que o alimento se encontra (fatores extrínsecos).

Intrínsecos:

a) atividade de água (Aa; Wa);

b) acidez (pH);

c) potencial de oxi-redução (Eh);

d) composição química;

e) fatores antimicrobianos naturais;

f) interações entre micro-organismos presentes.

Extrínsecos:

a) umidade;

b) temperatura ambiental;

c) composição gasosa do ambiente.

Importante: estes fatores podem ter efeito interativo.

O crescimento bacteriano é influenciado por vários fatores ambientais, destacando-se o alimento, a temperatura, a umidade, o pH e o oxigênio. Cada um destes fatores é importante e pode limitar o crescimento, determinando o desenvolvimento bacteriano. A presença de alguns organismos, sejam outras bactérias ou determinados fungos pode levar a alterações do crescimento das populações bacterianas, quer pela competição por alimento e espaço quer pela produção de compostos químicos inibidores do seu crescimento.

Quando uma determinada bactéria é semeada num meio líquido de composição apropriada e incubada em temperatura adequada, o seu crescimento segue uma curva definida e característica.

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Curva de Crescimento Bacteriano

Fase lag (A): esta fase de crescimento ocorre quando as células são transferidas de um meio para outro ou de um ambiente para outro. Esta é a fase de ajuste e representa o período necessário para adaptação das células ao novo ambiente. As células nesta fase aumentam no volume total em quase duas ou quatro vezes, mas não se dividem. Tais células estão sintetizando DNA, novas proteínas e enzimas, que são um pré-requisito para divisão. Fase exponencial ou log (B): nesta fase, as células estão se dividindo a uma taxa geométrica constante até atingir um máximo de crescimento. Os componentes celulares como RNA, proteínas, peso seco e polímeros da parede celular estão também aumentando a uma taxa constante. Como as células na fase exponencial estão se dividindo a uma taxa máxima, elas são muito menores em diâmetro que as células na fase Lag. A fase de crescimento exponencial normalmente chega ao final devido à depleção de nutrientes essenciais, diminuição de oxigênio em cultura aeróbia ou acúmulo de produtos tóxicos. Fase estacionária (C): durante esta fase, há rápido decréscimo na taxa de divisão celular. Eventualmente, o número total de células em divisão será igual ao número de células mortas, resultando na verdadeira população celular estacionária. A energia necessária para manter as células na fase estacionária é denominada energia de manutenção e é obtida a partir da degradação de produtos de armazenamento celular, ou seja, glicogênio, amido e lipídeos. Fase de morte ou declínio (D): quando as condições se tornam fortemente impróprias para o crescimento, as células se reproduzem mais lentamente e as células mortas aumentam em números elevados. Nesta fase o meio se encontra deficiente em nutrientes e rico em toxinas produzidas pelos próprios micro-organismos.

As bactérias, bolores e leveduras são os micro-organismos de maior destaque como agentes potenciais de deterioração e como eventuais patógenos ao homem. Na grande maioria das situações, as bactérias são os micro-organismos numericamente predominante nos alimentos, principalmente por :

• apresentarem um tempo de geração bastante reduzido; • serem capazes de utilizar uma diversidade de substratos; • apresentarem ampla variação de comportamento dos diferentes gêneros frente a

fatores ambientais.

O conhecimento dos fatores (intrínsecos e extrínsecos) que favorecem ou inibem a multiplicação dos micro-organismos é essencial para compreender os princípios básicos que regem tanto a alteração como a conservação dos alimentos.

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2. FATORES INTRÍNSECOS 2.1. ATIVIDADE DA ÁGUA – Aa

O crescimento e o metabolismo microbiano exigem a presença de água numa forma disponível. Água ligada a macromoléculas por forças física não está livre para agir como solvente ou para participar de reações químicas e, portanto, não pode ser aproveitada pelos microorganismos. A Aa é um índice desta disponibilidade para utilização em reações químicas e crescimento microbiano

A adição de solutos a um líquido puro irá causar uma redução na pressão de vapor da

solução e consequentemente diminuir a Aa. Essa redução varia em função da natureza da(s) substância(s) adicionada(s), da quantidade adicionada e da temperatura.

Sendo 1 o valor de Aa obtido na água pura, os valores de Aa oscilarão entre 0 e 1. O exemplo abaixo representa uma relação existente entre o valor de Aa e a adição de

compostos com sal, açúcar e glicerol, que quando adicionados causam redução no valor de Aa.

Exemplo 1 Aa = 0.995 → um meio com 0.88% de NaCl; 8,52% de sacarose; e 4,45% de glicose

Exemplo 2 Aa = 0.860 → um meio com 18.18% de NaCl; 68,60% de sacarose; e 58,45% de glicose

A Aa de um alimento pode também ser reduzida através da remoção de água

(desidratação) e do congelamento. Na maioria dos alimentos frescos, a Aa é superior a 0,95. Os microorganismos têm um

valor mínimo, um valor máximo e um valor ótimo de Aa para sua multiplicação. Considerando que a Aa da água pura é 1,00 e que os microorganismos não se multiplicam em água pura, o limite máximo para o crescimento microbiano é ligeiramente menor que 1,00. O comportamento dos microorganismos em relação à Aa mínima e ótima é bastante variável. Em geral, as bactérias requerem Aa mais alta que os fungos. As bactérias Gram-negativas são mais exigentes que as Gram-positivas em relação à Aa necessária. A maioria das bactérias deteriorantes não se multiplica em Aa inferior a 0,91, enquanto que os fungos deteriorantes podem fazê-lo em Aa de até 0,80.

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Tabela 1 – Atividade de água de alguns alimentos e suscetibilidade à deterioração

FAIXA DE Aa

MICROORGANISMOS CAPAZES DE

SE DESENVOLVER

ALIMENTOS COM AA NA FAIXA

INDICADA

1,00 – 0,95

Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Shigella, Klebsiella, Bacillus, Clostridium perfringens e algumas leveduras.

Alimentos muito perecíveis (frutas frescas, vegetais, carnes, peixe), lingüiças, salsichas e pães cozidos, alimentos contendo até 40% de sacarose e 7% de sal.

0,95 – 0,91

Salmonella, V. parahaemolyticus, C. Botulinum, Serratia, Lactobacillus, Pediococcus, alguns fungos, Rhodotorula, Pichia.

Alguns queijos (cheddar, suíço, provolone), carnes curadas (presunto), concentrado de frutas, alimentos contendo até 55% de sacarose ou 12% de sal.

0,91 – 0,87

Muitas leveduras (Candida, Torulopsis, Hansenula), Micrococus.

Embutidos fermentados (salames), bolos confeitados, queijos desidratados, margarina, alimentos contendo até 65% de sacarose ou 15% de sal.

0,87 – 0,80

A maioria dos fungos, Staphylococcus aureus, a maioria das Saccharomyces spp., Debaryomyces.

Concentrados de frutas, leite condensado, xaropes de chocolate e frutas, farinha, arroz, granulados contendo 15 a 17% de umidade, bolos de frutas, presuntos caseiros, foundies e confeitos açucarados.

0,80 – 0,75 A maioria das bactérias halófilas. Geléias, marmeladas, marzipã, glacê de frutas e marshmallow.

0,75 – 0,65

Fungos xerofílicos (Aspergillus chevalieri, A. candidus, Wallemia sebi), Saccharomyces bisporus.

Flocos de aveia contendo 10% de umidade, cremes para recheio, geléias, marshmallow, melaço, caldo de cana de açúcar, algumas frutas secas e castanhas.

0,65 – 0,60

Leveduras osmofílicas (Saccharomyces rouxii), poucos fungos (Aspergillus echinulatus, Monascus, Monascus bisporus).

Frutas secas contendo de 15 a 20% de umidade: algumas balas, caramelos e mel.

0,50

Sem proliferação microbiana. Macarrão e massa similares, contendo 12% de umidade, temperos com 10% de umidade.

0,40 Sem proliferação microbiana. Ovo em pó com 5% de umidade. 0,30 Sem proliferação microbiana. Biscoitos e torradas com 3-5% de

umidade.

0,20 Sem proliferação microbiana. Leite em pó (2 – 3% umidade), vegetais

desidratados (5% umidade), flocos de milho (5% umidade), sopas desidratadas.

Atividade de água, temperatura e disponibilidade de nutrientes são interdependentes. Assim, a qualquer temperatura, a capacidade de micro-organismos multiplicarem-se abaixa quando a Aa abaixa. Quanto mais próxima da temperatura ótima de multiplicação, mais larga é a faixa de Aa em que o crescimento bacteriano é possível. A presença de nutrientes também é importante, pois amplia a faixa de Aa em que os micro-organismos podem multiplicar-se.

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A Aa limitante para o crescimento de determinado organismo depende ainda de outros fatores intrínsecos que podem agir simultaneamente, como o pH do meio, o potencial de óxido-redução e a presença de substâncias antimicrobianas naturais ou intencionalmente adicionadas, entre outros. De modo geral, quando esses fatores provocam um afastamento das condições ótimas para a multiplicação de determinado micro-organismo, mais alto será o valor de Aa necessária. O efeito da diminuição de Aa a um valor inferior ao considerado ótimo para um micro-organismo é o aumento da fase lag do crescimento microbiano e a diminuição da velocidade de multiplicação e do tamanho da população microbiana final. Este efeito ocorre devido à alterações em todas as atividades metabólicas, uma vez que todas as reações químicas das células são dependentes de água. Alguns micro-organismos, como o Staphylococcus aureus, têm multiplicação quase normal, mesmo em baixa Aa. 2.2. POTENCIAL HIDROGENIÔNICO – pH

O pH (potencial hidrogeniônico) é uma escala logarítmica que varia de 0 a 14, e nos indica quão ácida ou alcalina é uma substância. Valores abaixo de 7,0 são ácidos e acima são alcalinos. O valor 7,0 é neutro.

pH = - log { H+ } ; Quanto > H+, <pH, e consequentemente mais ácido o alimento.

Assim como ocorre com a atividade de água, os micro-organismos têm valores de pH mínimo, ótimo e máximo para sua multiplicação. Verifica-se que pH em torno da neutralidade, isto é, entre 6,5 e 7,5, é o mais favorável para a maioria dos micro-organismos. Alguns micro-organismos são favorecidos pelo meio ácido, como as bactérias láticas, certamente porque há inibição da microbiota de competição. Os bolores e leveduras mostram maior tolerância ao pH, sendo que os bolores podem multiplicar-se em valores de pH mais baixos que as leveduras, sendo estas, por sua vez, mais tolerantes que as bactérias a valores baixos de pH. Entre as bactérias verifica-se que as patogênicas são as mais exigentes quanto ao pH.

Tolerância a valores baixos de pH: bolores > leveduras > bactérias

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Alimentos como frutas, refrigerantes, vinhos e vinagres apresentam pH inferior àquele em que a proliferação bacteriana é possível. Esses alimentos normalmente deterioram-se devido ao crescimento de bolores e leveduras, uma vez que estes toleram pH inferior a 3,5. De acordo com o pH, os alimentos são subdivididos em três grandes grupos: os alimentos de baixa acidez, quem têm pH superior a 4,5; os alimentos ácidos, que têm pH entre 4,0 e 4,5, e os alimentos muito ácidos, que tem pH inferior a 4,0. Esta classificação está baseada no pH mínimo para multiplicação e produção de toxina de Clostridium botulinum (4,5) e no pH mínimo para multiplicação da grande maioria das bactérias (4,0). Dessa forma, alimentos de baixa acidez (pH > 4,5) são os mais sujeitos a multiplicação microbiana, tanto de espécies patogênicas quanto de espécies deteriorantes. Já nos alimentos ácidos (pH entre 4,0 a 4,5), há predominante de crescimento de leveduras, de bolores e de algumas poucas espécies bacterianas, principalmente bactérias láticas e algumas espécies de Bacillus. Nos alimentos ácidos (pH < 4,0), o desenvolvimento microbiano fica restrito quase que exclusivamente a bolores e leveduras.

Acredita-se que o pH adverso afeta principalmente a respiração dos micro-organismos, por ação em suas enzimas e no transporte de nutrientes para dentro da célula microbiana. Tal como acontece com a Aa, também o pH desfavorável provoca um aumento na fase Lag da multiplicação microbiana. Quando os micro-organismos estão em pH diferente do pH neutro, sua capacidade de multiplicação depende da sua capacidade de modificar o pH adverso. Quando em pH ácido, as aminoácidos-descarboxilazes de muitos micro-organismos são ativas (pH ótimo próximo de 4,0), resultando na produção de aminas, que aumentam o pH. Por outro lado, em pH alcalino, ocorre a ativação de aminoácidos-descarboxilazes (pH ótimo próximo de 8,0), que produzem ácidos orgânicos, cujo efeito é a redução do pH.

Os diferentes ácidos podem exercer um efeito inibitório ou letal sobre a célula microbiana, pela concentração hidrogeniônica (nível de H+ livre) ou pela toxicidade do ácido não dissociado. Os ácidos podem causar sobre os micro-organismos, os seguintes efeitos:

� maior gasto de energia para manter o pH intracelular; � desnaturação de proteínas, DNA; � alteração da atividade das enzimas responsáveis pelas atividades vitais da célula; � menor velocidade de crescimento.

O pH intracelular (em condições normais em torno de 7.0) é bastante afetado pelas

variações externas. A acidificação no interior da célula pode ser devido : • a migração dos íons H+ do meio externo para o meio interno • dissociação das moléculas dos ácidos que penetram através da membrana • ácidos orgânicos fracos na forma não dissociada, os quais são facilmente solúveis na

membrana celular, interferindo assim na sua permeabilidade, o que leva a afetar o transporte de substrato e a fosforilação oxidativa, inibindo o transporte de elétrons e causando a acidificação do interior da célula

pH > 4.5 Alimentos de baixa acidez

predominância de crescimento bacteriano - em face do menor tempo de geração (patôgenos, esporângicas ou não, aeróbios ou anaeróbios, mesófilos ou termófilos)

pH entre 4.5 e 4.0 Alimentos ácido

predominância de leveduras oxidativas ou fermentativas e de bolores (em aerobiose). Algumas bactérias esporogênicas e não esporogênicas.

pH < 4.0 Alimentos muito ácidos

fica restrito a quase que exclusivamente às leveduras e bolores. Bactérias acéticas, e Zymomonas (esta até pH 3.7)

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• alguns ácidos ao se dissociarem liberam ânions que podem ser metabolizados e alguns tem atividade inibitória.

2.3. POTENCIAL DE OXIDO-REDUÇÃO – Eh

Os processos de oxidação e redução estão relacionadas com a troca de elétrons entre compostos químicos. O potencial de oxi-redução pode ser definido como sendo a facilidade com que determinado substrato ganha ou perde elétrons.

oxidação - liberação ou perda de elétrons

redução - o composto recebe elétrons

Quando ocorre a transferência de elétrons de um composto para outro, estabelece-se um diferença de potencial entre os mesmos, a qual pose ser medida com instrumentos apropriados, sendo expressa em volts (V) ou milivolts (mV).

Tabela 1 – Potencial de oxi-redução de alguns micro-organismos

Micro-organismos Eh de crescimento (em mV)

Aeróbios (bolores, leveduras oxidativas e muitas bactérias – causadoras de

deterioração dos alimentos) + 350 a + 500

Anaeróbios (bactérias deteriorantes patogênicas – Clostridium botulinum)

+ 30 a - 250 (melhor = -150) • na ausência de O2 toleram substrato com Eh

elevado (+ 370) • na presença de O2 este limite cai para + 100

Anaeróbios Facultativos (família Enterobacteriaceae) + 100 a + 350

A determinação do valor de Eh de um alimento é bastante difícil porque ocorre a interação da tensão de oxigênio que envolve o alimento com a presença de compostos químicos que agem sobre o valor de Eh. De modo geral, alimentos de origem vegetal têm valores de Eh entre +300 e +400mV, o que explica a deterioração desses produtos por bactérias aeróbias e bolores. Carnes em grandes pedaços têm Eh em torno de -200mV, enquanto que nas moídas o valor de Eh pode subir para até +200mV. O músculo do animal, imediatamente após sua morte, tem Eh de +250mV, porém, decorridas cerca de 300 horas, esse valor pode cair para -250mV, dando condições para a multiplicação da microbiota anaeróbia da carne. Queijos têm valores de Eh bastante variáveis: dependendo das condições de fabricação, esses valores podem variar de -20 até -200mV. 2.4. COMPOSIÇÃO QUÍMICA Para que a multiplicação microbiana seja possível, é necessário que estejam disponíveis os seguintes nutrientes:

� água; � fonte de energia; � fonte de nitrogênio; � vitaminas � sais minerais.

Como fonte de energia, os micro-organismos podem utilizar açúcares, álcoois e aminoácidos. Lipídeos também podem servir como fonte de energia, mas esses compostos são metabolizados por um numero reduzido de micro-organismos encontrados em alimentos.

Fontes de nitrogênio mais importantes para os micro-organismos são os aminoácidos, mas uma grande variedade de outros compostos nitrogenados também podem ser utilizados.

As vitaminas são importantes fatores de crescimento de micro-organismos, uma vez que fazem parte de diversas coenzimas envolvidas em várias reações metabólicas. As

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vitaminas mais importantes são as do complexo B, a biotina e acido pantotênico. Entre os micro-organismos, verifica-se que as bactérias Gram-positivas, que, juntamente com os bolores, são capazes de sintetizar todos os seus fatores de crescimento.

Embora necessários em quantidades muito reduzidas, os minerais são indispensáveis para a multiplicação microbiana, pois estão envolvidas em muitas reações enzimáticas. Entre esses minerais merecem destaque o sódio, o potássio, o cálcio e o magnésio, além do ferro, zinco, fósforo, dentre outros.

2.5. FATORES ANTIMICROBIANOS NATURAIS Algumas substâncias naturalmente presentes nos alimentos possuem a capacidade de retardar ou até mesmo impedir a multiplicação microbiana, o que confere uma maior estabilidade a esses alimentos frente ao ataque de micro-organismos. A tabela abaixo mostra alguns exemplos desses alimentos: Tabela 3 – Relação entre substâncias antimicrobianas e alguns micro-organismos

*O SLP age através da quebra de peróxido (água oxigenada, por exmplo) presentes no leite, liberando oxigênio que promove a oxidação de grupos SH de enzimas metabólicas vitais para os micro-organismos. Esse sistema depende ainda da presença de tiocianato ou outro substrato oxidável. **A lactoferrina do leite tem também atividade antimicrobiana. Trata-se de uma proteína que inibe a multiplicação através da retirada de íons ferro do leite. Entre os fatores antimicrobianos naturais devem ser incluídas as estruturas biológicas que funcionam como barreiras mecânicas para a penetração de micro-organismos. Nessa categoria estão a casca das nozes, das frutas e dos ovos, a pele dos animais e a película que envolve as sementes. Além dos fatores antimicrobianos naturalmente presentes nos alimentos, têm importante papel os compostos químicos propositalmente adicionados aos alimentos (conservantes) como recurso tecnológico para estender sua vida útil. 2.6. INTERAÇÕES ENTRE MICRO-ORGANISMOS Um determinado micro-organismo, ao se multiplicar em um alimento, produz metabólitos que podem afetar a capacidade de sobrevivência e de multiplicação de outros micro-organismos presentes nesse alimento. Por exemplo, temos o caso das bactérias produtoras de ácido lático (bactérias láticas) que podem alterar o pH do alimento de tal forma

Alimentos Substâncias Micro-organismos

Codimentos Eugenol (cravo), alicina (alho), aldeído cinâmico e eugenol (canela) e timol e isotimol (orégano).

Micro-organismos num modo em geral.

Ovo (clara) pH desfavorável (entre 9 e 10) a lizosina, a avidina, a conalbumina e outros inibidores enzimáticos.

A lizosina é ativa, principalmente, em bactérias Gram-positivas.

Leite (gado bovino) Ação específica: as imunoglobulinas, o fator complemento, os macrófagos e os linfócitos. Ação inespecífica: o sistema lactoperoxidase (SLP)* , a lactoferrina**, lisozima e a nisina.

O SLP é bactericida para bactérias Gram-negativas e bacteriostático para as Gram-positivas.

Frutas, sementes e vegetais Derivados do ácido hidroxicinêmico, os taninos, ácidos orgânicos e óleos essenciais.

Bactérias e alguns fungos

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que o tornam ácido demais para o crescimento de muitos outros micro-organismos. Por outro lado, a formação de compostos alcalinos, como aminas, formadas por ação de descarboxilases produzidas por muitos micro-organismos, resulta no aumento do pH do alimento, tornando-o propício para a proliferação daquelas bactérias anteriormente inibidas pelo pH ácido. É o que ocorre com as leveduras que degradam o ácido lático de alimentos fermentados, tornando-os favoráveis ao crescimento e produção de toxinas por Clostridium botulinum. A tabela 4 mostra alguns exemplos de bactérias que através de seus metabólitos interferem de forma a inibir ou ser essencial no desenvolvimento de outras bactérias.

Tabela 4 – Interação entre alguns micro-organismos

Bactérias interferentes Metabólitos Bactérias que sofreram a interferência

Pseudomonas aeruginosa (+) Tiamina e triptofano Staphylococcus aureus

Estreptococos e os lactobacilos (-) Água oxigenada Pseudomonas spp., Bacillus spp. e Proteus spp.

Determinadas cepas de E. coli e algumas enterobactérias.

Bacteriocinas (colina–atividade bactericida)

E. coli

Bacteriocinas: Muitos micro-organismos são capazes de produzir determinadas substâncias com atividade bactericida, denominadas genericamente de bacteriocinas. Atualmente são conhecidas muitas bacteriocinas produzidas principalmente por Gram-positivos, patogênicas ou não, como as Nisina A, E produzida pelo Lactococcus lactis spp lactis e a Sacacina A produzida pelo Lactobacillus sake. O maior interesse na área de alimentos é pelas bactérias láticas, capazes de produzir uma ou mais bacteriocinas, como as citadas anteriormente. Algumas bacteriocinas são proteínas simples, outras têm componentes lipídicos e açúcares. São classificadas em lantibióticas e não-lantibióticas, de acordo com suas características estruturais. Apesar do seu mecanismo de ação ainda não ser suficientemente elucidado, sabe-se que a porção protérica é fundamental para a atividade. A sua produção é mediada por plasmídios, assim como é plasmidial a resistência a bacteriocinas. Bacteriocinas e bactérias produtoras de bacteriocinas em alimentos têm sido empregadas como recurso tecnológico na produção de certos tipos de alimentos, com o objetivo de controlar o desenvolvimento de micro-organismos patogênicos e/ou de micro-organismos deteriorantes nesses produtos. Por serem as bacteriocinas consideradas conservadoras “naturais”, seu emprego em alimentos é muito promissor. Exclusão Competitiva: Também há outras formas de interação entre micro-organismos que podem ser utilizadas no controle do desenvolvimento de micro-organismos patogênicos em alimentos, como a exclusão competitiva. A exclusão competitiva consiste na adição de micro-organismos inofencivos a um produto com a finalidade de estimular o processo competitivo existente entre os componentes da microbiota presente. Assim, os microrganiesmos patogênicos podem ficar desfavorecidos nessa competição e serem eliminados ou terem sua produção reduzida. Este processo vem sendo utilizado no controle de contaminação de aves com patógenos como Salmonella e Campylobacter. Promove-se a colonização da superfície epitelial do trato gastrintestinal de aves recém-nascidas com micro-organismos inóculos retirados de aves adultas saudáveis. A exclusão competitiva é particularmente interessante no caso de aves que são alimentadas com ração contendo antibióticos. Os antibióticos interferem na microbiota do trato gastrintestinal das aves, facilitando a colonização por patógenos. Estudos têm demonstrado que culturas puras de bactérias ou preparações contendo um único gênero bacteriano não são protetores.

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Micro-organismos utilizados na produção de alimentos e enzimas:

1. Produção de etanol - leveduras 2. Produção de ácidos orgânicos: produção de vinagre - Bactérias Acéticas - Acetobacter;

produção de ácido láticos - Bactérias Láticas; produção de ácido propiônico - Bactérias Propiônicas; produção de ácido cítrico; produção de ácido glucônico; produção de ácido fumárico; produção de ácido giberlinas

3. Produção de proteína unicelular 4. Produção de aminoácidos - lisina, ácido glutâmico 5. Produção de enzimas 6. Produção de antibióticos 7. Produção de solventes 8. Produção de polissacarídeos 9. Produção de lipídeos 10. Produção de alimentos por fermentação lática : picles, azeitona, queijo, chucrute,

iogurte 3. FATORES EXTRÍNSECOS 3.1. TEMPERATURA A temperatura corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que há um aumento da temperatura, as reações químicas e enzimáticas na célula tendem a tornar-se mais rápidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular. Assim, todos os micro-organismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente, havendo registros de multiplicação a um mínimo de -35°C e um máximo de 90°C. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mínimas, ótima e máxima (temperaturas cardeais), para cada micro-organismo. A temperatura máxima provavelmente reflete os processos de desnaturação, enquanto os fatores que determinam a temperatura mínima ainda não são bem conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes níveis térmicos baixos. A tabela 5 demonstra a classificação dos micro-organismos de acordo com a temperatura ideal de multiplicação: Tabela 5 – Relação entre temperatura ideal de multiplicação e alguns micro-organismos

Micro-organismos Temperatura de multiplicação Temperatura ótima

Psicrófilos 0°C e 20°C 10°C e 15°C

Psicrotróficos 0°C e 7°C

Mesófilos Mínima: 5°C e 25°C Máxima: 40°C e 50°C

25°C e 40°C

Termófilos Mínimo: 35°C e 45°C Máximo: 60°C e 90°C

45°C e 65°C

Os micro-organismos psicrotróficos, nem sempre possuem a mesma velocidade de multiplicação, então foram propostas duas novas categorias de classificação: europsicrotrófico, referente aos que não formam colônias visíveis até o 6º – 10º dia entre 0°C e 7°C e o estenopsicrotrófico, referente aos que não formam colônias visíveis em cinco dias nessa faixa de temperatura. Ao primeiro grupo pertencem as espécies Enterobacter cloacae, Yersinia enterocolítica e Hafnia alvei, e ao segundo, Pseudomonas fragi e Aeromonas hydrophyla.

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Os micro-organismos psicrófilos e psicrotrófilos multiplicam-se bem em alimentos refrigerados, sendo os principais agentes de deterioração de carnes, pescado, ovos, frangos e outros. Os micro-organismos mesófilos correspondem à grande maioria daqueles de importância em alimentos, inclusive a maior parte dos patógenos de interesse. A maioria das bactérias termófilas importantes em alimentos pertence aos gêneros Bacillus e Clostridium, incluindo tanto espécies deteriorantes, quanto espécies patogênicas. Os fungos são capazes de crescer em faixa de temperatura mais ampla do que as bactérias. Muitos fungos são capazes de se multiplicar em alimentos refrigerados. As leveduras, por sua vez, não toleram bem temperaturas altas, preferindo as faixas mesófilas e psicrófilas. 3.2. UMIDADE RELATIVA DO AMBIENTE Há uma correlação estreita entre a atividade de água (Aa) de um alimento e a umidade relativa de equilíbrio do ambiente. Quando o alimento está em equilíbrio com a atmosfera, a umidade relativa (UR) é igual a Aa x 100. Assim, alimentos conservados em ambiente com UR superior à sua Aa tenderão a absorver umidade do ambiente, causando um aumento em sua Aa. Por outro lado, os alimentos perderão água se a umidade ambiental for inferior à sua Aa, causando uma diminição nesse valor. Essas alterações provocarão modificações na capacidade de multiplicação dos micro-organismos presentes.

� Alimento (equilíbrio) → UR = Aa x 100 � Alimento (UR > Aa) → Aa ↑ (absorção de água) � Alimento (UR < Aa) → Aa ↓ (perda de água)

O relacionamento Aa/U.R.E deve ser levado em conta para melhor adequar as condições de embalagem dos produtos alimentícios e de garantir o controle do desenvolvimento microbiano - maior prolongando o tempo de armazenagem.

3.3. COMPOSIÇÃO GASOSA DO ALIMENTO A composição gasosa do ambiente que envolve um alimento pode determinar os tipos de micro-organismos que poderão nele predominar. A presença de oxigênio favorecerá a multiplicação de micro-organismos aeróbios, enquanto que sua ausência causará predominância dos anaeróbios, embora haja bastante variação na sensibilidade dos anaeróbios ao oxigênio.

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Modificações na composição gasosa são capazes de causar alterações na microbiota que sobrevive ou que se multiplica em determinado alimento.

� Atmosferas modificadas: correspondentes a ambientes nos quais o oxigênio é – total ou parcialmente – substituído por outros gases (oxigênio, nitrogênio e gás carbônico), são empregados como recursos tecnológicos para aumentar a vida útil dos alimentos.

� O efeito antimicrobiano do CO2 depende: da temperatura (o efeito é tanto mais intenso quanto mais baixa for a temperatura), do pH e da Aa do alimentos, dos tipos e das condições metabólicas dos micro-organismos presentes e, evidentemente, da concentração do CO2.

� O nitrogênio é um gás inerte, com pouco ou nenhum efeito antimicrobiano, exceto pela substituição do O2.

� Atmosferas contendo 10% de CO2 são utilizadas, há muito tempo, para prolongar o tempo de armazenamento de frutas, especialmente maçãs e peras.

4. CONCEITO DOS OBSTÁCULOS DE LEISTNER O conhecimento dos fatores intrínsecos e extrínsecos que agem sobre determinado alimento permite prever sua “vida de prateleira”, sua estabilidade microbiológica, bem como conhecer a capacidade de crescimento e/ou a produção de toxinas por micro-organismos patogênicos eventualmente presentes. No entanto, o conhecimento de cada uma dessas características isoladamente é pouco útil, devido aos efeitos, interativos entre elas. Esses efeitos podem ser não apenas aditivos como também sinergísticos ou mesmo antagônico.

O estudo das interações entre os vários fatores intrínsecos e extrínsecos que afetam a capacidade de sobrevivência e de multiplicação dos micro-organismos nos alimentos deu origem ao famoso conceito dos obstáculos de Leistner.

Esse conceito é ilustrado com sete exemplos representando três alimentos com diferentes fatores intrínsecos e extrínsecos atuando com intensidades diferentes no controle microbiano:

1. cada um dos fatores (Aa, pH, Eh, temperatura e conservador químico) contribui com parcela igual no retardamento do crescimento microbiano até que esse crescimento é completamente bloqueado. Esse alimento é, portanto, estável e seguro. Trata-se, no entanto de um modelo teórico, de ocorrência pouco provável.

2. os quatro fatores são suficientes para garantir a estabilidade microbiana. 3. nesse mesmo produto, um único fator intrínseco (Aa) pode ser suficiente para manter a

estabilidade de um alimento, se a carga microbiana inicial for baixa. 4. se a carga microbiana inicial for elevada, os quatro fatores serão insuficientes para

controlar o desenvolvimento microbiano. Esse produto terá vida útil curta ou poderá causar uma toxinfecção alimentar.

5. o produto é enriquecido com mais nutrientes, o que causa um efeito trampolim no crescimento microbiano. Nesse produto, a intensidade dos obstáculos deve ser aumentada para que sejam eficientes e impeçam o desenvolvimento microbiano.

6. menos obstáculos podem ser necessários, uma vez que os micro-organismos estão com seu metabolismo afetado.

7. A estabilidade é garantida por obstáculos que agem sinergisticamente.

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C = calor R = refrigeração Aa = atividade de água Eh = potencial oxi-red Co = conservador V = vitaminas N = nutrientes mc = microbiota de competição O efeito final é mais eficiente do que aquele que seria obtido se os obstáculos agissem individualmente. O conceito dos obstáculos deu origem à tecnologia dos obstáculos, que se baseia na utilização simultânea de mais de uma forma de controle microbiano nos alimentos, como salga, acidificação, processamento térmico, adição de conservadores químicos, etc. O objetivo é a obtenção de produtos alimentícios estáveis, de prolongada vida de prateleira, e seguros à saúde dos consumidores.

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Questões 1) Os fatores intrínsecos podem agir simultaneamente e são interdependentes entre si. Relacione essa interação entre esses fatores, determinado a necessidade da Atividade de Água (Aa). 2) Explique em que consiste a “exclusão competitiva” exemplificando. 3) Defina a Teoria dos Obstáculos de Leistner. 4) Conceitue potencial de óxido-redução(Eh) de um alimento e explique em que condições os micro-organismos se multiplicam. 5) Qual a importância da atividade da água (Aa) para o desenvolvimento microbiano? De que forma pode ser essa Aa manipulada para o controle de micro-organismos?