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CLONAGEM

Professor: Gonzalo

músculo pele neurônio

Conceito básico: todas as células contém o genoma completo.

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músculo pele neurônio

Identidade celular: conjunto de genes ligados/desligados.

CLONAGEM

Qualquer fragmento de DNA que contenhaum gene de interesse pode ser clonado;

Em biologia molecular clonagem tem doissentidos: Se refere ao ato de produzir várias cópias

idênticas de uma molécula de DNA –amplificação de uma sequência de DNA emparticular.

Se refere ao isolamento de uma fita de DNAespecífica, a partir do resto do DNA da célula –este isolamento é facilitado fazendo-se váriascópias do material de interesse.

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CLONAGEM

Pode ser vista de várias maneiras: A mais simplista envolve a inserção de um

fragmento de DNA particular no DNA genômicopurificado de um elemento genético que se autoreplica ( vírus ou plasmídeo);

Um fragmento de DNA, contendo um genehumano, pode ser ligado a um cromossomode vírus bacteriano, e a nova molécula deDNA recombinante pode então, serintroduzida na célula bacteriana.

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CLONAGEM

Partindo de uma molécula de DNArecombinante, que infecta uma célula, omecanismo normal de replicação do víruspode produzir mais de 1012 moléculas deDNA viral em menos de um dia.

Um vírus ou plasmídeo assim utilizado éconhecido como VETOR DE CLONAGEM, e ocDNA propagado pela inserção nele échamado CLONADO.

CLONAGEM

Para isolar um gene específico, inicia-seconstruindo uma biblioteca de DNA – umacoleção abrangente de fragmentos clonadosde DNA de uma célula, de um tecido ou deum organismo;

As bibliotecas podem ser construídas comum vetor plasmideal e estão geralmentepresentes em uma população de célulasbacterianas;

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CLONAGEM

Atualmente a maioria das clonagens érealizada em vetores plasmidiais.

O vetor plasmideal mais amplamenteutilizado para clonagem de genes sãopequenas moléculas circulares de DNA fitadupla, derivadas de plasmídeos maiores ,que ocorrem naturalmente em célulasbacterianas;

CLONAGEM

Para ser utilizado como vetor de clonagem ,os círculos de DNA plasmideal purificadossão primeiro clivados com uma nuclease derestrição para criar moléculas de DNAlinear.

As moléculas de DNA recombinantescontendo o inserto de DNA estranho,são então covalentemente ligados com aenzima DNA ligase.

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CLONAGEM

As células crescem e se dividem,duplicando em número a cada 30 minutos,os plasmídeos recombinantes tambémreplicam para produzir um enorme númerode cópias de DNA (estranho).

Tecnologia do DNA recombinante e Clonagem

Conjunto de técnicas para manipulação de ácidos nucleicos;

Clonagem de fragmentos de DNA em plasmídios de bactérias;

Seqüênciamento de DNA;

Amplificação de uma seq. Especifica de DNA pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR);

Construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs;

Vetores de expressão (procariotos e eucariotos);

Plantas transgênicas;

Animais transgênicos;

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Plasmídeos

Plasmídeos são moléculas circulares de DNA

pequenas (de 2.000 a 200.000 pares de bases)

encontradas em muitas bactérias

Enzimas de restrição

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CLONAGEM

Vários plasmídeos bacterianos carregamgenes para a resistência a antibióticos, umapropriedade que pode ser utilizada paraselecionar aquelas que foram transfectadascom sucesso;

Se a bactéria crescer na presença doantibiótico, somente as células contendo oplasmídeo sobrevivem;

Forma-se assim uma colônia de bactérias,transfecatas com um plasmídeo.

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CLONAGEM

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CLONAGEM

Por muitos anos os plasmídeos foramutilizados para transfectar fragmentos deDNA de mil a trinta mil pares denucleotídeos;

Os fragmentos maiores são mais difíceis declonar;

Devido a essa dificuldade algunspesquisadores começaram a utilizarcromossomos artificiáis de leveduras (yeast artificial chromossomes – YACs ), queconseguem lidar com pedaços grandes deDNA;

CLONAGEM

Hoje, são utilizados vetores plasmideais ,baseados no plasmídeo F de E. coli, queocorre naturalmente;

São utilizados para fragmentos de DNA de300 mil a 1 milhão de pares denucleotídeos;

O plasmídeo F e o cromossomo bacterianoartificial ( bacterial artificial chromossome– BAC ) está presente em apenas uma ouduas cópias por célula de E. coli.

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CLONAGEM

O fato dos BACs serem mantidos em tãobaixos níveis no interior das célulascontribui para manter estáveis grandessequências de DNA clonadas;

Com apenas poucos BACs é menor achance de alguns fragmentos recombinatesse misturarem pela recombinação comsequências presentes em outras cópias doplasmídeo;

CLONAGEM

Por estas habilidades de aceitargrandes insertos e por seremfacilmente manipulados, os BACs sãoagora o vetor preferido para construirbibliotecas de DNA de organismoscomplexos incluindo aquelesrepresentando o genoma humano eo de camundongo.

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ALGUMAS APLICAÇÕES DA CLONAGEM

Tecidos/Células para Terapia

Medula Óssea Neurônios Células do

Músculo Cardíaco Células do

Pâncreas

Células-Tronco

O Potencial da Clonagem Terapêutica

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Clonagem terapêutica

célula adulta

núcleoóvulo enucleado

embrião

4 células

blastocisto

células ES

diferenciação

em novo tipo celular

transplante

Célula tronco

hematopoiética

Célula tronco

pluripotente

Precursor

eritróide

Precursor

linfóide

Precursor

mielóide

eritrócitos

células Blifócitos B

lifócitos T

neutrófilos

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CÉLULAS TRONCO “ADULTAS”

cartilagemosso

adiposasmúscular

hematop.astrócitos

células tronco

mesenquimais

(medula óssea)