QBQ 0316 Farmcia Noturno

Protenas: molculas essenciais para a vida Amostras biolgicas so misturas complexas com milhares de protenas So protenas: enzimas, anticorpos, fatores de coagulao, hormnios, citocinas, entre outros. A purificao de protenas uma etapa importante nos processos de produo de frmacos, insumos alimentares e industriais.

Recuperao da atividade enzimtica Um bioqumico submete 2 ml de um lisado contendo 50 mU/ml de

uma enzima a um processo de purificao, obtendo 10 ml de um lisado contendo 8 mU/ml Lisado inicial Lisado aps a purificao 2 ml x 50 mU/ml = 100 mU 10 ml x 8 mU/ml = 80 mU

Recuperao (%) = (final/inicial)x100 = (80 / 100) x 100 = 80%

RECUPERAO indica qual a percentagem de enzima ativa

(atividade enzimtica) recuperada aps o procedimento de purificao

Enriquecimento

Um bioqumico submete 2 ml de um lisado contendo 50 mU/ml de uma enzima e 10 mg/ml de protena a um processo de purificao, obtendo no final 10 ml de um lisado contendo 8 mU/ml e 0,5 mg/ml de protena 2 ml x 50 mU/ml = 100 mU 2 ml x 10 mg/ml = 20 mg de protena Atividade Especfica = 100/20 = 5 mU/mg

Lisado inicial

Aps a purificao 10 ml x 8 mU/ml = 80 mU 10 ml x 0,5 mg/ml = 5 mg de protena Atividade Especfica = 80/5 = 16 um/mg

Enriquecimento = (Atv.Esp final/Atv.Esp. inicial) = (16/ 5) x 100 = 3,2 vezes

ENRIQUECIMENTO indica o aumento da atividade especfica aps

um procedimento de purificao

importante otimizar o nmero de etapas de purificao de um processo..

Recuperao de 90% em cada etapa!

Purificao de protena por cromatografia lquidaUma mistura de protenas em soluo colocada em contato com uma fase slida estacionria e eluda desse suporte com uma fase mvel. A purificao depende da afinidade da protena pela fase estacionria e fase mvel. As propriedades exploradas numa cromatografia de fase lquida so: Tamanho (massa molecular) Carga inica (pI) Polaridade (hidrofobicidade) Afinidade qumica

Purificao de protena por cromatografia lquidaFase mvel

Purificao de protena por cromatografia lquida

Concentrao

Volume

Existem diversas fases estacionrias (gel) para diferentes tamanhos moleculares

As dimenses dos poros do gel determinam a faixa de peso molecular das protenas que podem ser separadas na cromatografia

Existem diversas fases estacionrias (gel) para diferentes tamanhos moleculares

Clculo do peso molecular de uma protena utilizando filtrao em gel

ve

ve= volume de eluio da amostra (protena de interesse)

Clculo do peso molecular de uma protena utilizando filtrao em gelvo= volume morto ou void Volume no qual so eludas as protenas totalmente excludas dos poros das resinas. Corresponde ao volume externo aos gros da resina e pode ser medido usando macromolculas muito grandes, em geral bluedextran (ordem de milhes de Daltons)

vo "void"

Clculo do peso molecular de uma protena utilizando filtrao em gel

vt

vt= volume total da coluna Pode ser calculado a partir das dimenses da coluna.

Clculo do peso molecular de uma protena utilizando filtrao em gelA razo de eluio (Kav) : Kav = (Ve Vo) / (Vt Vo)

Log (PM)

Kav

Cromatografia de troca inicaAminocidos possuem cadeias laterais ionizveis; Protenas possuem terminais COOH e NH2 ionizveis.

pI (ponto isoeltrico)= pH no qual o nmero total de cargas positivas igual ao nmero total de cargas negativas. Logo, a protena no tem carga lquida!

Carga lquida:Se o pH > pI, a carga lquida da protena negativa Se o pH < pI, a carga lquida da protena positiva

Cromatografia de troca inicaSoluo tampo (fase mvel)

Cromatografia de troca inicaProtena retina na coluna

Soluo tampo (fase mvel)

Protena eluda da coluna

Cromatografia de troca inicaSoluo tampo contendo NaCL (fase mvel)

Protena eluda da coluna

NaCl

Cromatografia de troca inicaSoluo tampo contendo NaCL (fase mvel)

1. protena eluda da coluna

2. protena eluda da coluna

NaCl

Cromatografia de troca inica

Soluo tampo pH = 6 (fase mvel)

Tipos de resinas para troca-inicaDEAE-Sepharose -O-CH2CH2-NH+(C2H5)2

CM-SepharoseQ-Sepharose SP-Sepharose

-O-CH2COO-CH2-N+(CH3)3 -CH2SO3-

Cromatografia de hidrofobicidade

A solubilidade de protenas depende de um balano entre os resduos polares/carregados e os resduos hidrofbicos. Sais, competem pela solvatao dos resduos carregados, alterando a solubilidade de uma protena.

Srie de HofmaisterAnions: SO42- > H2PO4- > CH3COO- > Cl- > Br- > I- > CLO4- > SCNEfeito solubilizante

Efeito precipitanteCtions: NH4+ > Cs+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+ > guanidina

Cromatografia de hidrofobicidade

Cromatografia de hidrofobicidade

Protena se liga a coluna

Sal (p.ex., (NH4)2SO4Utilizado em concentraes que no precipitam a protena

Cromatografia de hidrofobicidade

Protena se liga a coluna

Sal Concentrao de sal reduzida

[Sal]Protena eluda da coluna