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Procedimentos de Análises Microbiológicas - PAM

Aula Prática – Análise de água por membrana filtrante.

MEMBRANA FILTRANTE Este método é especialmente empregado para amostras com baixa contagem microbiana. Embora,

relativamente grande volume de água (100 mL) pode ser passado pela membrana sem obstruí-la, somente

pouca amostra de diluente homogeneizado de certos tipos de alimentos podem ser usados para uma

membrana simples.

As membranas utilizadas são de celulose, com poros de tamanhos capazes de reter bactérias (geralmente

0,45m), mas permitem que água ou diluentes passem por ela.

MEMBRANA FILTRANTE - PESQUISA DE COLIFORMES

MATERIAL UTILIZADO: VIDRARIA: Placas de Petri estéreis; Lâminas de Vidro para microscopia

MEIOS DE CULTURA: Agar Endo; Tríplice Agar Modificado (IAL); Caldo BHI (Brain Heart Infusion – com cepas controle); Reagentes para Coloração de Gram

EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS: Estufa Bacteriológica – 35/37º C; Bico de Bunsen; Alça de Platina; Agulha de Platina; Cuba para descarte de material contaminado.

HOLDER KITASSATO

MEMBRANA FILTRANTE

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TÉCNICA: - Coletar a amostra de água a ser analisada em frascos de vidro (previamente esterilizado);

- Ligar o Bico de Bunsen;

- Montar o Holder (previamente esterilizado);

- Lavar o Holder com água destilada estéril, sem colocar a membrana.

- Flambar a pinça;

- Montar o Holder com a membrana filtrante (0,45m);

- Colocar 100 mL da água coletada;

- Ligar a bomba a vácuo;

- Após a filtração de 100 mL da amostra, a membrana é transferida para a superfície do meio Agar Endo;

- Descartar a água que foi filtrada;

- Lavar o Holder com 150 mL de água destilada estéril;

- Incubar as placas a 35ºC/24hs

- Após esse período, efetua-se a contagem das colônias típicas de coliformes (com coloração vermelho-

escura e/ou com brilho metálico superficial);

- Para confirmação da presença de E. coli e outros coliformes na amostra, repica-se algumas colônias

características Endo Agar para as provas bioquímicas;

- Incubar os tubos das provas bioquímicas a 35ºC/24hs.

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PROVAS BIOQUÍMICAS PARA CONFIRMAÇÃO DE COLIFORMES FECAIS - IMVC

Produção de Indol

Princípio - O teste visa a habilidade de um organismo produzir Indol a partir de triptofano. Organismos produtores de triptofanase degradam o triptofano produzindo indol mais ácido pirúvico mais amônia. O indol reage com paradimetilbenzaldeído presente no reagente de Kovacs, formando uma cor vermelha na camada de álcool. O HCL presente no reagente de Kovacs serve apenas para acelerar a reação. Procedimento - Transferir colônia suspeita para tubo de ensaio contendo água triptonada ou caldo triptofano (5mL). Incubar 35ºC/24 h. Adicionar 5 gotas do reagente de Kovacs e agitar levemente. Observar se há formação de um halo vermelho violeta na superfície do meio de cultura (teste positivo), ou se o anel permanece na cor amarela do reagente (teste negativo). E. coli pode ser + ou-.

Utilização do Citrato Teste usado para determinar se o microrganismo é capaz de utilizar citrato como única fonte de carbono para o metabolismo, resultando em alcalinidade. Um organismo que é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono, também utiliza sais de amônia presente no meio como única fonte de nitrogênio. Os sais de amônia são quebrados para dar amônia, resultando em alcalinidade. A utilização do citrato (reação positiva), resulta numa reação alcalina e o indicador muda de verde para azul. Não havendo crescimento o citrato não é utilizado e a cor permanece verde. Procedimento - Repicar as colônias para o meio Ágar citrato de Simmons. Incubar a 30ºC /24-48 h. E.coli citrato(-) negativo

Teste de Vermelho de Metila

Princípio - O vermelho de metila é usado para testar a produção de ácido orgânico, formado durante a fermentação da glicose. O teste se baseia fundamentalmente na fermentação da glicose por certos organismos para produção de diferentes quantidades de ácidos: ácido acético, ácido lático, ácido fórmico, além de CO2, H2 e etanol. Procedimento - Em tubos contendo caldo-glucose-fosfato, inocular pequena quantidade da colônia suspeita e incubar a 35ºC/96 h. Após o período de incubação, adicionar gotas da solução de vermelho de metila a cada 2,5 mL de cultura, observando imediatamente a coloração vermelha do meio (teste positivo) ou amarela (teste negativo). E. coli é VM positiva.

Teste de Voges Proskauer

Princípio - O teste de VP consiste em se detectar a presença de acetilmetilcarbinol ou acetoína, produzido pelo metabolismo de certos organismos. Durante o processo de fermentação da glicose, determinados organismos produzem acetilmetilcarbinol ou acetoína, produto originário da condensação de 2 moléculas de ácido pirúvico seguido de descarboxilação. A reação de VP é atribuída à oxidação atmosférica da acetoína que é transformada em diacetila, que reagindo com KOH e com a peptona constituinte do meio, produz coloração rósea ou vermelho. A reação de VP se processa muito lentamente e pode ser acelerada pela adição de certos catalisadores, como por exemplo, o α- naftol. Procedimento - Em tubos contendo caldo glucose fosfato, inocular colônias suspeitas e incubar a 30ºC por 24/48 h. Adicionar ao meio previamente inoculado, 0,5 mL de uma solução de naftol 5% mais 0,5 mL de hidróxido de potássio a 40%. Agitar vigorosamente o tubo. O aparecimento de uma cor vermelha ou rósea, usualmente dentro de 20 min. a 1hora indica VP positivo. E. coli é VP negativa. Resultado: IMVC Indol- positivo ou negativo Vermelho de metila- positivo E. coli Voges Proskauer- negativo Citrato- negativo