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Microbiologia

Aula Prática 4 – Pesquisa para bactérias do grupo coliformes técnica do NMP – número mais

provável - tubos múltiplos

MATERIAL UTILIZADO: VIDRARIA: Tubos de ensaio estéreis; Tubos de Durhan; Placas de Petri estéreis; Pipetas bacteriológicas de 2 e 5 mL; Lâminas de Vidro para microscopia MEIOS DE CULTURA: Caldo Lauril Triptose Sulfato (concentração dupla e simples); Agar EMB (Eosine Metilene Blue); Provas Bioquímicas Caldo BHI (Brain Heart Infusion – com cepas controle); Reagentes para Coloração de Gram EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS: Estufa Bacteriológica – 35/37º C; Bico de Bunsen; Alça de Platina; Agulha de Platina; Cuba para descarte de material contaminado.

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METODOLOGIA: Coliformes Totais – Enriquecimento 1- Semear: 10 mL da amostra em 5 tubos contendo 10 mL de Caldo Lauril Triptose Sulfato (concentração dupla); 1 mL da amostra em 5 tubos contendo 10 mL de Caldo Lauril Triptose Sulfato (concentração simples); 0,1 mL da amostra em 5 tubos contendo 10 mL de Caldo Lauril Triptose Sulfato (concentração simples);

10 mL 1 mL 0,1 mL Incubar a 35º C por 48 horas. Proceder à leitura e contagem dos tubos positivos (bolhas de ar).

2) Consultar a tabela do NMP (número mais provável). Exemplo: Tubos Positivos: 5/10 mL – 5/1 mL – 4/0,1 mL Tabela NMP – 5-5-4 = 1600 coliformes em 100 mL de amostra.

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Coliformes Totais e Termotolerantes – Isolamento 1) Isolar com a alça de platina ou palito os tubos positivos em caldo EC.

Incubar a 44,5ºC por 48 horas. Proceder à leitura e contagem dos tubos positivos (bolhas de ar).

2) Isolar com alça de platina uma gota de cada tubo positivo (Caldo Lauril com bolha) para

placas de Ágar (EMB)

. tubo pos EMB EMB semeado Incubar a 35º C por 24 horas. 3) Proceder a leitura do EMB Agar e verificar a diferenciação das UFC’s (Unidade Formadora de Colônias) que se desenvolveram. Os coliformes são Lactose + = fermentam a lactose, produzem acido lático e baixam o pH do meio de 7,6 para 6,4, precipitando os corantes eosina amarela e azul de metileno (indicadores da viragem do pH), produzindo colônias escuras. As E. coli produzem pigmentos verdes brilhante.

Coliformes Totais – Lactose Positiva Coliformes Termotolerantes – E. coli – Lactose Neg. com brilho Bactérias Lactose Neg. (enterobactérias ou ñ fermentadoras)

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Coliformes Totais e Termotolerantes – Identificação 4) Repicar, com agulha de platina, as UFC’s características de bactérias do grupo coliformes (lactose negativas) nas provas bioquímicas

EMB Inoculado 5) Incubar a 35º C por 24 horas

BIBLIOGRAFIA - ACUFF, G.R. Media, Reagents, and Stains. In: Compendium of Method for the Microbiological Examination of Foods, American Public Health Association. 3ª ed., Washington DC. Carl Vanderzant & Don F.Splittsoesser, 1992, p. 1093-1208 - BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicos para alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2ª revisão. 136p. - Aula de Físico-Química – FACENS - Manual do instituto Adolfo Lutz- Setor de Bromatologia - Elaboração – Heloisa Gimenes Gil Dias, Modificado – Rosângela C. Alves Leal. - Legislação – ANVISA - INMETRO - CETESB

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