AULA-TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS-2011

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ESCOLA SENAI HORÁCIO AUGUSTO DA SILVEIRA

TÉCNICO DE ALIMENTOS

MICROBIOLOGIA DEALIMENTOS

Profª. Érica Helena dos Santos



CRESCIMENTO E CULTIVO MICROBIANO



Crescimento microbiano é usualmente caracterizado pelo temporequerido para duplicar massa celular ou número de células.

Crescimento de Bactérias por divisão simples :

Crescimento microbiano

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Crescimento de Levedura normalmente por brotamento:

Crescimento de mofos:Os mofos caracteristicamente crescem por alongar e/ou ramificar,

formando um micélio.



No laboratório de análise:

O microbiólogo utiliza técnicas específicas paraestudar os microrganismos.



Isolamento e Cultivo de Culturas Puras

Uma população microbiana, sob condições naturais,contém muitas espécies diferentes.

Os microbiologistas devem ser capazes de isolar,enumerar, e identificar os microrganismos em umaamostra, para então classificá-los e caracterizá-los.



Isolamento e Cultivo de Culturas Puras

Os microrganismos na natureza normalmente existemem cultura mistas, com muitas espécies diferentesocupando o mesmo ambiente.

Ao determinar as características de um microrganismo,ele deve estar em cultura pura, ou seja, em que todasas células na população são idênticas no sentido deque elas se originaram de uma mesma célula parental.



Em laboratório, os microrganismos são cultivados oudesenvolvidos em material nutriente denominado meio de

cultura.

O tipo de meio utilizado depende de vários fatores:

considerações sobre a origem do material a ser analisado;

a espécie que se imagina estar presente nesta amostra;

as necessidades nutricionais dos organismos.

Meios de cultura



Meios de cultura

Devemos sempre considerar:

Estado físico dos meios de cultura

1. Líquido2. Sólido3. Semi-sólido



Meios de cultura


Composição química dos meios de cultura

1. Meios sintéticos2. Meios complexos



Meios de cultura


Classificação funcional dos meios de cultura

1. Meio seletivo2. Meio diferencial3. Meio de enriquecimento



Meios de cultura

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Técnicas de isolamento de microrganismos

Técnica 1: Meio líquido

Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na culturabacteriana que lhe é apresentada.

Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com omeio de cultivo e agite a alça (fig.3)

Figura 3: Semeadura em meio líquido




Técnica 2: Meio semi-sólido

Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na culturabacteriana que lhe é fornecida.

Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias

no meio de cultivo semi-sólido (fig. 4).

Figura 4: Semeadura em meio semi-sólido




Técnica 3: Meio sólido (ágar inclinado)

Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacterianaque lhe é apresentada.

Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano

inclinado e suba fazendo estrias na superfície do agar (fig. 5)

Figura 5: Semeadura em meio sólido




Técnica 4: Esgotamento por meio de estrias superficiais

A amostra é semeada na superfície do meio solidificado comuma alça de semeadura para esgotar a população, assim emalgumas regiões do meio, células individuais estarão

presentes (fig. 6).

Figura 6: Esgotamento com estrias feitas com alça




Técnica 5: Semeadura em superfície

Uma gota da amostra diluída é colocada na superfície do ágare com o auxílio de uma alça de semeadura de vidro (alça de

Drigalsky) esta gota é espalhada sobre o meio (fig. 7).

Figura 7: Semeadura em superfície




Técnica 6: Método de pour-plate

A amostra é diluída em tubos contendo meios liquefeitos(45o C). Após homogeneização são distribuídos em placas dePetri; e após a solidificação dos meios as placas são

incubadas. As colônias se desenvolverão tanto acima quantoabaixo da superfície (internas), (fig. 8).




Técnica 6: Método de pour-plate

Figura 8: Diluição seriada e plaqueamento



Conservação de culturas puras

Para armazenar por um período curto, as culturaspodem ser mantidas à temperatura de refrigeração(4 a 10 oC). Para armazenar por um período longo,

as culturas são mantidas em nitrogênio líquido (-196 oC) ou em freezers (-70 a -120 oC), ou aindacongeladas, e então desidratadas e fechadas àvácuo em um processo denominado liofilização.



Conservação de culturas puras

Alguns dos mais usados métodos de conservação:

transferência periódica para meios novos;

sob camada de óleo mineral; liofilização;

congelamento.



Preparo dos microrganismos para a

microscopia luminosa

Técnica entre lâmina e lamínula e gotapendente

Técnicas de Coloração



Técnica entre lâmina e lamínula e gotapendente –

utiliza uma suspensão de microrganismos vivosem uma gota ou uma camada líquida.

Figura 9: técnicas de esfregaço



É possível ainda a realização de contagem de célulascom preparações a fresco utilizando-se uma placaespecial com estrias

Figura 10: Contagem de células em hemacitômetro



Técnicas de Coloração – a camada fina do espécime é seca e corada, assim

os microrganismos ficam fixados à superfície eapresentam-se corados para facilitar a visualização.



As principais etapas do preparo de um espécimemicrobiano corado para exame microscópico

são:

1. Confeccionar um esfregaço, ou uma camadafina do espécime sobre uma lâmina de vidro;

2. Fixar o esfregaço seco à lâmina, usualmentecom o calor, para fazer aderir o microrganismoà lâmina;

3. Coloração com um ou mais corantes .



Técnicas de coloração

Coloração Simples - a coloração de microrganismocom uma única solução de corante;

ex: azul de metileno para leveduras, ou bolores.

Coloração diferencial - envolve mais de uma soluçãode corante;

ex: coloração de álcool-ácido para bactéria causadora da

tuberculose; distingue esta bactéria patogênicica, pormeio da cor (vermelho, pelo corante principal), deoutras bactérias (azul, pelo corante do fundo)encontradas em amostras como saliva e escarro.




Coloração de Gram - neste processo, o esfregaçobacteriano é tratado com os reagentes na seguinteordem:

1. o corante púrpura cristal violeta,

2. a solução de iodo (substância que fixa o corante nointerior da célula),

3. o álcool (remove o corante de certas bactérias) e

4. o corante vermelho safranina (fig. 11).




Coloração de Gram

Bactérias Gram-positivas , retém o corante cristal violeta e aparecem coradas em violeta-escuro.

Bactérias Gram-negativas , perdem o cristal violeta quando tratadas com álcool, são então coradas com o corante safranina e aparecem coradas em vermelho.

http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/mb1504/capitulos/cap3.html
















Coloração de Gram



Informações utilizadas para Caracterizar os Microrganismos

Características Morfológicas - tamanho, forma e arranjo dascélulas;

Características Metabólicas - maneira pela qual o microrganismodesenvolve os processos vitais;

Características Antigênicas - os anticorpos produzidos em animaisde laboratórios podem ser usados para detectar a presença deantígenos únicos em culturas bacterianas e são usados paracaracterizar os microrganismos;

Características Patogênicas - importante determinar se o

microrganismo causa doença (patogênico) ou não causadoença (não-patogênico);



Informações utilizadas para Caracterizar os Microrganismos

Características Genéticas - a maioria dos microbiologistas contaatualmente com técnicas que permitem realizar análisesgenéticas para classificar ou identificar os microrganismos oucompreender a sua atividade.

A sonda de DNA é um exemplo de procedimento genético rápido e

amplamente utilizado - uma fita de DNA de uma espécieconhecida é misturada com uma fita de uma espéciedesconhecida.

Se os microrganismos são da mesma espécie, as duas fitas secombinarão, ou se ligarão. Esta combinação aparece como uma

fita dupla de DNA com um marcador ligado.



Questões

1. Qual é a curva característica do crescimento de bactériasnum sistema descontínuo?

2. O que são meios de cultura?

3. Como podem ser classificados os meios de cultura?

4. Em qual situação o meio de cultura complexo deve serutilizado?

5. Como é possível verificar o crescimento de uma bactériaprodutora de ácido num cultivo microbiano?

6. Quando é necessário a realização da diluição seriada?Explique como é realizada.

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