Aula_1_bio_mol

UC: Biologia Molecular - 2 sem 2014

Coordenadores:

Prof. Julio Cezar Franco de Oliveira: Cincias Biolgicas Integral 4 termo [email protected]

Profa. Ileana Rubio : Farmcia e Bioqumica Integral 4 termo

Profa. Lcia Armelin Correa: Farmcia e Bioqumica Noturno 6 termo

Facebook: Monitoria Biomol

Monitores: Mariana, Carolina, Filipe

Pelo Facebook cadastrem-se no grupo dos monitores

Cronograma

BioMol Biologia - sextas 14-18hs Florestan

Data Bio TEMAS DE AULAS

15/ago Julio Abertura da UC_TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 1

22/ago Julio TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2

29/ago Marcelo

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 3

12/set Julio TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 4

19/set Julio PRTICA: EXTRAO DE DNA / DIGESTO DE DNA

26/set Julio PRTICA: PCR / ELETROFORESE

03/out Julio PROVA 1

10/out Julio REGULAO DA EXPRESSO GNICA

17/out Julio CONSTRUO DE BIBLIOTECAS

24/out Lcia

O CNCER UMA DOENA GENTICA

31/out Julio INFORMAO GENMICA

07/nov Julio ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE

14/nov Julio SEMINRIOS

21/nov Julio Prova 2

28/nov Julio Prova Sub

05/12/2014 Julio EXAME

Avaliao

2 Provas tericas (P1 e P2)

Seminrios (S)

P1+P2+S / 3 = Mdia

Mdia:

>= 6,0 aprovao direta

3,0 a 5,9 Exame

0 a 2,9 reprovao automtica

Prova Substitutiva (fechada)

Exame

Frequncia

A frequncia importante? SIM ela FUNDAMENTAL !!!

Mnimo de 75% de frequncia, ou seja:

At 4 faltas Aprovado na frequncia

5 faltas Reprovao AUTOMTICA na UC !

A frequncia responsabilidade Do Aluno !

Seminrios

Que rea da Biologia interessa mais ao grupo ?

Sugesto aos grupos: Escolham Temas que despertem no grupo INTERESSE !

O que te motivou a escolher o curso de Cincias Biolgicas ?

Qual a vantagem (e a perda) em ser aprovado nesta UC

sem levar em considerao as questes acima ?

Que atuao Profissional como BILOGO voc poderia almejar ?

-Metilao do DNA

-TRANSGNICOS

-Engenharia gentica aplicada nanobiotecnologia: caracterizao

sntese e aplicaes da Spider Silk, Introduo biomecnica molecular

-Modificao do morango para uma melhor adaptao aos impactos

diversos das mudanas climticas.

-Determinao da presena de AKT no ncleo de clulas de melanoma e

sua interao com substratos envolvidos na regulao da sobrevivncia

celular.

-Investigao Forense

-Utilizao da PCR-TR no diagnstico de meningite

-Biologia Forense

-Sequenciamento genmico para conservao da biodiversidade

Temas de seminrios de outras turmas

No basta escrever........

... preciso que o Professor

consiga ler!!!!!!

Bibliografia 1- Biologia Molecular da Clula - Alberts cols (2009)

2- Gentica - Um Enfoque Conceitual , Pierce, Benjamin A.

3- Biologia Molecular do Gene - 5 Ed. 2006 , Watson, James D.; Baker, Tania A.; Bell, Stephen P.

4- Introduo Gentica - 8 Edio 2006 , Gelbart, William M.; Lewontin, Richard C.; Anthony J. F. Griffiths.

5- Genes VII - Tratado de Gentica Molecular, Benjamin Lewin

6- Gene VIII, Benzamin Lewin (2004) (disiponvel na internet) A Cincia do DNA, Micklos, David A, & Freyer, Greg A.

7- DNA Recombinante - Genes e Genomas, James D. Watson; Richard M. Myers; Amy A. Caudy; Jan A. Witkowski

8- Molecular biology of the cell Alberts (2003) (disiponvel na internet)

Livros disponveis na biblioteca

Consultem e estudem pelos livros !!!

R$29,61 : submarino, americanas

Sugesto de leitura

FUNPEC-Editora

Biologia Molecular - Definio

O objetivo da Biologia Molecular encontrar, na estrutura de

macromolculas, interpretaes

para os fundamentos da vida

Jacques Monod 1910 - 1976

pela descoberta do controle gentico da sntese das enzimas

Nobel de Fisiologia ou Medicina - 1965

Cincia Multi-disciplinar

Gentica Bioqumica

Microbiologia Bioinformatica

Ecologia

Paleontologia

Biologia Molecular

Que molcula contm e transmite as caractersticas hereditrias nos seres vivos?

Frederick Griffith (1879 - 1941)

1928: Estudando uma vacina contra a pneumonia na pandemia de gripe

espanhola aps a 1 Guerra Mundial

Streptococcus pneumoniae

Cepa lisa virulenta (S)

Cepa rugosa no-virulenta (R)

Griffith, F., The significance of pneumococcal types (1928) J. Hyg. 27, 113-159.

O princpio transformante O experimento de Griffiht havia mostrado que cepas

bacterianas no-patognicas podem se tornar infecciosas

quando misturadas com uma cepa virulenta inativada por calor

(Princpio Transformante)

Oswald Avery 1877 - 1955

Colin McLeod 1909 - 1972

Maclyn McCarty 1911 - 2005

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

1944: Identificaram o principio transformante

O princpio transformante

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

Martha Chase (1930 - 2003) Alfred Hershey (1908 - 1997)

1952: Durante a infeco viral, apenas o material gentico

viral transferido para a clula

hospedeira e promove a

produo de novas partculas

virais

Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.

Experimento de Hershey e Chase


35S Protenas

O Experimento do Liquidificador


35S Protenas 32P DNA

Experimento de Hershey e Chase O Experimento do Liquidificador


Usando marcadores radioativos, mostraram que o DNA de um vrus, e no suas protenas, que programam

as clulas infectadas para fazer cpias do vrus



1952: Experimento do Liquidificador


pela descoberta do mecanismo de replicao e da estrutura gentica dos vrus


Erwin Chargaff (1905 - 2002)

1948: A razo molar A-T e G-C sempre a mesma em diferentes

organismos estudados

Organismo A T G C A/T G/C

Mycobacterium

tuberculosis 15.1 14.6 34.9 35.4 1.03 0.99

Ourio-do-mar 32.8 32.1 17.7 18.4 1.02 0.96

Levedura 31.3 32.9 18.7 17.1 0.95 1.09

Rato 28.6 28.4 21.4 21.5 1.00 1.00

Homem (fgado) 30.3 30.3 19.5 19.9 1.00 0.98

Valores em porcentagem (%)

Desoxypentosenuclease in Yeast and Specific Nature of Its Cellular Regulation, (1948) Science, 108(2814):628-629.

Maurice Wilkins (1916 - 2007) Rosalind Franklin (1920 1958)

1952: Wilkins e Franklin obtm excelente imagem da molcula de DNA (difrao de raio-X)

Revelando uma repetio regular de blocos moleculares correspondendo aos nucleotdeos e estrutura compatvel com

uma alfa-hlice (Repeties de 34 ngstroms e Largura de 20 ngstroms )

Wilkins, M.H.F., Stokes, A.R., and Wilson, H.R. (1953) Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171:738-740.

Franklin, R. and Gosling, R.G. (1953) Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. Nature 171:740-741.

Francis Crick (1916 - 2007) James Watson (1928)

1953: Propuseram um modelo para a estrutura do DNA

Watson and Crick, Molecular structure of nucleic acids, (1953) Nature 171::737-738.

Watson, J.D. and Crick, F.H.C. (1953) Molecular structure of nucleic acids. Nature 171::737-738.

25-04-1953

Contriburam para o modelo..... Erwin Chargaff

Quantificou as bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e guanina) em diferentes organismos e demonstrou existir uma

razo constante entre A-T e C-G (Evidncia para pareamento entre as bases nas duas fitas de DNA)

Linus Pauling Descreveu a estrutura de alfa-hlice para protenas

(Mostrou que estrutura de alfa-hlice era possvel)

Rosalind Franklin e Maurice Wilkins Realizaram estudos de difrao de raios-X com DNA

(Seus dados foram fundamentais proposio da estrutura da

dupla-hlice)

por suas descobertas a respeito da estrutura molecular dos cidos nuclicos e sua significncia para a transferncia da informao nos seres vivos


Wilkins Crick Watson Steinbeck Perutz Kendrew

Ligao Fosfodiester: 3-hidroxila da desoxirribose (nt 1) + grupo fosfato (nt 2)

Esqueleto

Acar-Fosfato

O Modelo de Watson e Crick A estrutura molecular do DNA


Dupla-fita complementar A T

C G


As fitas so anti-paralelas

Tcnicas de Biologia Molecular 1

PURIFICAO DE DNA/RNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO

DNA LIGASE

ELETROFORESE

Mutaes, nmero de

cpias do gene: DNA

Pergunta do projeto/seminrio:

o que vou estudar?

Dogma Central da Biologia

Expresso gnica: RNAm Protena Localizao celular: protena

Atividade biolgica: protena

Cultura de clulas (bacteriana- clulas humanas- levedura etc).

Amostra tecidos fresco e congelado

Amostra de tecidos em blocos de parafina

Sangue perifrico

Material a ter DNA/RNA/Protenas extrados

Programa

PURIFICAO DE DNA e RNA


DNA LIGASE

ELETROFORESE

Relevncia

Geralmente, a extrao de DNA o primeiro passo de uma anlise molecular:

Testes forenses

Identificao de organismos

Diagnstico de doenas

(identificao de mutaes)

Isolar genes = clonagem

Sequenciamento

Extrao de RNA:

- Determinar expresso gnica (RNAm)

- Isolar genes = clonagem

- Regulao da expresso gnica (microRNAs)

Consideraes Iniciais

Natureza/Origem do cido nuclico

DNA ou RNA

Procarioto ou eucarioto

Nuclear ou de organela

Genmico ou plasmidial

Quantidade (ilimitada/limitada)

Pureza/qualidade (baixa, alta)

DNA

Cromatina

RNAm

RNAr

RNAt

DNA

O DNA e RNAs esto localizados no interior das clulas

Envolto por todas as estruturas celulares

necessrio isol-lo do contedo celular

DNA

cromossmico

RNAr

RNAm

RNAt

Membrana plasmtica

Parede celular

Cpsula

Citoplasma

Procarionte Eucarionte

DNA

Plasmidial

Estratgias de extrao de DNA

1- Desintegrao dos tecidos e/ou lisar as clulas

2- Extrao e Solubilizao do DNA

3- Processo de purificao

Extrao com solventes orgnicos

(fenol/clorofrmio); ou

Processos cromatogrficos Troca inica

Filtrao em gel

Afinidade

Precipitao

1-Desintegrao dos tecidos Aumento da superfcie de contato

Usar foras mecnicas para romper a integridade do tecido e expor as clulas

Quanto menor o tamanho dos fragmentos do tecido, maior ser a

superfcie de contato

e a exposio ao

tampo de extrao

Logo, mais eficiente ser a extrao

2- Extrao e solubilizao do DNA

Tampo de Extrao

Tem a funo de solubilizar os cidos nuclicos

Pode auxiliar na lise das clulas, ncleos e organelas

Pode ocorrer simultaneamente ou no desintegrao (adio de Tampo de Extrao antes ou aps a desintegrao)

Tampo de Extrao

Principais constituintes

Substncias tamponantes (pH=8)

Detergentes

Inibidores de nucleases (quelantes

de ctions - inibe as DNAses)

Proteases


Tampo de Extrao

Detergentes

Dissolvem os lipdios das membranas (celular e nuclear)

Dissociam as protenas dos cidos nuclicos

Inibem ao das nucleases (desnaturao)

Triton X-100 ou Nonidet P-40

n = 9 - 10

CH -C-CH -C3 2

CH3|

CH3

|

CH3

|

| |

CH3|

O(CH -CH 0) H2 2 n

brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamnio

(cetil = hexadecil) CTAB

CH - (CH ) - 3 2 15 N - CH3

CH3

|

CH3|+

-Br

deoxicolato de sdio

CH3

CH3

HO

HO

O- Na+

O

-

=

dodecil sulfato de sdio

lauril sulfato de sdio

SDS

Na+CH -(CH )3 2 11-O-S-O-

O

=

O

=

lauril

CH - (CH ) - 3 2 10 C - N - CH - C2

CH3

|

O

|O- Na+

=

O

=

lauroil sarcosinato de sdio

sarcosil

lauroil sarcosina

aninico No inico Regio hidrofbica


Tampo de Extrao

Proteases

Clivam as protenas que se ligam ao DNA e enzimas que degradam DNA e outras protenas, inativam nucleases.

(Pronase E ou Protenase K)

Inibidores de nucleases

DNases A grande maioria depende de Mg2+ como cofator

EDTA quelante Mg2+ e inibe ao das DNases

RNases Muito estveis

Resistem a desnaturao trmica

No requerem cofatores

Inibidores extremamente potentes DEPC (cancergeno)

Resultado: uma sopa formada pelos restos celulares,

cidos nuclicos e

contedo

citoplasmtico

2- Extrao

3- Purificao do DNA Solvel (DNA) vs. Insolvel

O extrato fracionado em material solvel (DNA) e material

insolvel (restos celulares)

Centrifugao

Filtrao

3- Purificao de DNA DNA vs. outros solutos

Solventes orgnicos

Fenol (pH8,0) / Clorofrmio

Desnatura e extrai as protenas

DNA na fase aquosa

Protenas na fase orgnica

Dificuldades

Demorado

Trabalhoso

Txico

Perde material

3- Purificao de DNA Precipitao

Adio de sal (NaCl, NaOAc, NH4OAc, KOAc)

Os ctions monovalentes se ligam aos grupamentos fosfato do DNA, neutralizando suas cargas eltricas

Minimiza a repulso eletrosttica entre as molculas de DNA, permitindo que elas se agreguem e precipitem

Adio de lcool (etanol, isopropanol)

O lcool promove a retirada das molculas de gua que revestem os cidos nuclicos, provocando a compactao das molculas (grau de compactao: 9X)

Maior compactao, maior agregao

Incubao a -20C

Diminui agitao das molculas

Facilita agregao

Centrifugao (30 min, 10.000 rpm, 4C) DNA pellet

3- Purificao de DNA Colunas de Troca Inica (tipo aninica - matriz com carga +)

Slica ou DEAE

DNA se liga a slica

Lavagens sucessivas removem as impurezas

DNA eludo da coluna

Comparao

Mais rpido

DNA mais puro

Mais caro

Eluio

O DNA (pellet ou coluna) deve ser dissolvido/eludo em uma soluo de baixa fora inica (gua,TE)

Esta soluo pode conter RNase para destruir o RNA presente

3- Purificao de DNA

Extrao de RNA

Controle da contaminao com Rnases

Exgena Manipulao: uso de luvas

Solues: tratamento com dietil-pirocarbonato (DEPC)

Vidraria: queimar por 3 horas a 250C

Plsticos: descartveis e livres de RNase

Endgena Adio de Inibidores de Rnases

H2O DEPC

Extrao de RNA Lise Celular: com Trizol: fenol e sais de guainidina:

iniben RNAases.

Tecidos: mecnica

Sangue: agitao

Separao de fases: RNA em fase aquosa, DNA na interfase, protenas na fase orgnica

Precipitao do RNA: com isopropanol

(lcool)

Quantificaco e pureza dos acidos nuclicos

Leitura da absorbncia a 260nm (A260)

DO260 = 1 50ng/uL DNAds

40ng/uL RNA

Desvantagens: no diferencia DNA de RNA

Interferncia com compostos contaminantes da extraco

Quantificaco e pureza dos acidos nuclicos

DNA relao 260/280

A260 /A280 = 1,75 1,8 DNA de boa qualidade

A260 /A280

Hora do Recreio

Programa

PURIFICAO DE DNA


DNA LIGASE

ELETROFORESE

SOUTHERN BLOT

Enzima de Restrio-tesouras moleculares

1968: Arber descreve a presena das enzimas de restrio em extratos de E. coli

1970: Smith descreve a primeira enzimas de restrio que corta o DNA em um stio especfico

1971: Nathans obtm o primeiro mapa de restrio

Smith, H. O. and K. W. Wilcox, A restriction enzyme from Haemophilus influenzae: Purification and general properties (1970) J. Mol. Biol. 51: 379-391.

Werner Arber 1929

Daniel Nathans 1928 - 1999

Hamilton O. Smith 1931

pela descoberta das enzimas de

restrio e suas

aplicaes nos

problemas de

gentica

molecular

Nobel de Fisiologia ou

Medicina - 1978

A Guerra Natural

Bactrias vs. Fagos (bacterifagos)

Durante a infeco viral, para se defender, as bactrias precisam destruir o DNA invasor dos fagos sem afetar o seu prprio DNA

A Guerra Natural

As bactrias desenvolveram um sistema de defesa contra DNAs invasores

Duas poderosas Armas As Enzimas de Restrio

As Enzimas de Modificao

Enzimas de Restrio

Enzimas que se ligam ao DNA e o cortam em stios especficos (stios de restrio)

Tambm chamadas de endonucleases porque cortam o DNA internamente

Enzimas de Restrio Cada espcie de bactria tem a sua enzima de

restrio que reconhece um stio especfico

Mais de 3.000 enzimas de restrio j foram identificadas

EcoRI enzima da Escherichia coli corta em 5--- G-A-A-T-T-C ---3 3--- C-T-T-A-A-G ---5

BglII enzima da Bacillus globiggi corta em 5--- A-G-A-T-C-T ---3 3--- T-C-T-A-G-A ---5

HindIII enzima da Haemophilus influenzae corta em 5--- A-A-G-A-T-T ---3 3--- T-T-C-G-A-A ---5

Exemplo: EcoRI

Gnero: Escherichia

Espcie: coli

Cepa: R

Enzimas de Modificao

Para garantir que apenas o DNA viral (invasor) ser

degradado, a bactria

modifica o seu prprio

DNA nos stios que

seriam atacados pela

enzima de restrio

Sistema de Metilao (A ou C)

Enzimas de Modificao

Enzimas de Modificao A bactria destri o DNA no-modificado com as enzimas de.

Restrio,

enquanto o seu prprio DNA esta protegido por ao de enzimas de modificao

Stios de Restrio

Tamanho: 4 a 8 pares de base

4

5

6

7

8

Recombinant DNA, Watson e col.

Stios de Restrio

Freqncia em que ocorrem:

onde n o nmero de pares de base no stio de restrio

4-base cutter: 44 = 256 bp

6-base cutter: 46 = 4,096 bp

8-base cutter: 48 = 65,536 bp

4n

Stios de Restrio

So repeties invertidas (Palndromes- Maioria) (comerciais)

socorram me em marrocos subi no onibus

5----- G - A - A - T - T - C ----3

3----- C - T T - A - A - G ----5

Stios de Restrio

Por que um palndrome ?

As enzimas de restrio

so dmeros formados por

2 subunidades idnticas

O eixo de simetria da

enzima o mesmo da

seqncia do DNA

Stios de Restrio

Stios de Restrio

As enzimas de restrio cortam cada fita do DNA na mesma posio do palndrome

Stios de Restrio Os cortes das enzimas de restrio podem produzir

Extremidades abruptas (bunt-ends)

Extremidades coesivas (stick-ends)

Stios de Restrio As extremidades coesivas podem ser

5- protuberantes (5- overhangs) P- 3- protuberantes (3- overhangs) -OH

5- protuberante 3- protuberante

BamHI

5.ACTGTACGGATCCGCTA.3 3.TGACATGCCTAGGCGAT.5

BamHI

BamHI

5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 3.TGACATGCCTAG GCGAT.5

BamHI

extremidades coesivas (extremidades 5 protuberantes)

Extremidades Compatveis


BamHI

5.TGCTAGCG GATCCAATC.3 3.ACGATCGCCTAG GTTAG.5

BamHI

5.ACTGTACGGATCCAATC.3 3.TGACATGCCTAGGTTAG.5

BamHI

Extremidades Compatveis


BamHI

5.TGCTAGCA GATCTAATC.3 3.ACGATCGTCTAG ATTAG.5

BglII

5.ACTGTACGGATCTAATC.3 3.TGACATGCCTAGATTAG.5

BamHI

BglII x

EcoRV

5.ACTGTACGATATCGCTA.3 3.TGACATGCTATAGCGAT.5

Extremidades Abruptas

5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3 3.TGACATGCTA TAGCGAT.5

EcoRV



extremidades abruptas (Podem se ligar com outras molculas

de DNA com extremidades abruptas)

EcoRV




EcoRV

5.TGCTAGCCCC GGGAATC.3 3.ACGATCGGGG CCCTTAG.5

SmaI

5.ACTGTACGATGGGAATC.3 3.TGACATGCTACCCTTAG.5

EcoRV

SmaI x

1- DNA

2-Tampo ou Buffer especfico da enzima

3- Enzima de restrio

1ul DNA (1ug)

2ul Tampo2 (10X)

1uL EcoRI (1U/uL)

16ul H2O

20uL

Incubar 2hs 37oC

Reao com enzima de Restrio

Concentrao final na reao

Tampo= 1X

Enzima= mximo 10%

Programa

PURIFICAO DE DNA


DNA LIGASE

ELETROFORESE

SOUTHERN BLOT

DNA Ligase (enzima de modificao)

Quando molculas de DNA com extremidades coesivas se unem, apenas pontes de hidrognio

so formadas entre os nucleotdeos

complementares

Estas pontes de hidrognio no so estveis o suficiente para serem permanentes

A DNA Ligase une as extremidades das molculas de DNA e restabelece a ligao fosfodiester


As fitas so anti-paralelas (alfa hlice) A T

C G

DNA Ligase, cola molecular

DNA Ligase

Pareamento das bases complementares

DNA Ligase

Ligao fosofdiester refeita

DNA Ligase: qual reao mais fcil de acontecer?

5.ACTGTACGAT GGGGCTA.3 3.TGACATGCTA CCCCGAT.5

+

extremidades cegas (blunt)

extremidades coesivas

Exonuclease X Endonucleases

Enzimas de restrio: endonucleases

Que so exonucleases?

- Enzimas que digerem o DNA , fita simples ou dupla, desde a extremidade

Lambda Exonuclease : atividade 5'3' exonuclease de fita dupla: cataliza a remoo de mononucleotideos 5 mononucleotides da fita dupla de DNA

Exonuclease 1: atividade 3' 5 exonuclease de fita simples

Ex. DNA polimerase I

Mapa de restrio Representao esquemtica de uma molecula de DNA (circular o linear) indicando os

stios de corte das enzimas de restrio

Mapa de restrio

Como analisar os fragmentos gerados aps digesto de DNA com enzimas de restrio?

Programa

PURIFICAO DE DNA


DNA LIGASE

ELETROFORESE

SOUTHERN BLOT

Eletroforese

uma importante ferramenta da Biologia Molecular

Pode ser usada para:

identificar molculas especficas de DNA obtidas aps digesto com enzimas de restrio

Comparar genomas

Cincia forense

Eletroforese

Pode ser til para a avaliao da integridade de uma amostra de DNA

DNA genmico de alta qualidade

>95% alto peso molecular

Banda intacta prxima ao topo do gel

Pouca evidncia de fragmentos pequenos (smear)

Avaliar se a reao funcionou

Eletroforese Pode ser til para a avaliao da

integridade de uma amostra de RNA

Eletroforese em gel de agarose

Definio

Um mtodo usado para separar macromolculas como cidos nuclicos (DNA e RNA) e protenas

Mtodo baseado na migrao destas molculas atravs de um suporte sob influncia de um campo eltrico

a velocidade de migrao depende do tamanho, da forma e da carga eltrica total da molcula

+

-

Eletroforese

A corrente eltrica ao passar atravs do suporte cria um campo

eltrico

O DNA tem carga negativa (fosfatos) e por isso repelido do

polo negativo (anodo) e atrado

pelo polo positivo (catodo)

A corrente eltrica aplicada fora os fragmentos de cidos

nuclicos a se mover atravs do

suporte

Biologia Molecular, Turner e col.

Eletroforese

Aparato

Cuba de eletroforese

Fonte

Rack do gel (barquinha)

Pentes

Rack Pentes

Fonte

Cuba

Eletroforese

Suporte

Gel para separao dos cidos nuclicos

Agarose ou Acrilamida

Funcionam como esponjas (polmero), retardando a passagem

das molculas conforme

seus tamanhos

Agarose

Polissacardeo linear extrado de algas

Repeties de Agarobiose

D-galactose

3,6-anhydro L-galactose

Substncia gelatinosa, slida a temperatura ambiente

Precisa ser aquecida para gelificar

Temp. fuso: 66C

Temp. gelificao: 30C

D-galactose 3,6-anhydro L-galactose

Agarose

Agarose solidificada porosa, permitindo a

migrao dos cidos

nuclicos

Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (11 m)

Poli-Acrilamida Poli-Acrilamida

Acrilamida (linear)

Bis-acrilamida (cross-linker)

Possui poros menores que a agarose

Ideal par separao de fragmentos pequenos

de DNA e protenas

Eletroforese

Horizontal Vertical

Power Supply

Gel running

Gel

running

Eletroforese

Tampo de Corrida

Fornece a fora inica para passagem da corrente eltrica

Composio

Agente Tamponante (Tris-HCl)

Sal (Borato, Acetato, Glicina)

Quelante (EDTA)

Tampo TAE (Tris - Acetato - EDTA)

Tampo TBE (Tris - Borato - EDTA)

Tampo SB (Sdio - Borato)

Velocidade de migrao

A migrao dos cidos nuclicos depende apenas do seu tamanho

Molculas menores migram mais rpido que as molculas grandes

Vai depender tambm

Intensidade do campo eltrico (voltagem)

da fora inica do tampo de corrida

da concentrao do gel

(-)

(+)

Fazendo um gel de agarose

O gel de agarose preparado combinando-se agarose (p) e tampo

O tampo o mesmo que ser utilizado na eletroforese (tampo de corrida)

Normalmente se usa concentraes de 1 a 3%

p.e. gel 1% (1g de agarose + 100mL de tampo)

Agarose

Tampo


Agarose insolvel a temperatura ambiente

Precisa ser aquecida (>70C) para ser dissolvida (2min. microndas)


Esfriar o gel (~45C)

Derram-lo no rack (barquinha)

Evitar a formao de bolhas

Colocar os pentes

Os pentes devem ficar submersos no gel

Os pentes vo formar os poos onde o DNA ser aplicado


Quando fria, a agarose polimeriza (gelificao)

30-40 minutos

Os pentes devem ser retirados


Transferir o gel para a cuba de eletroforese

Cobrir o gel com o Tampo de Corrida

Preparando as amostras antes de aplicar no gel

Tampo de Amostra

Glicerol (aumenta a densidade)

permite que o DNA permanea no poo

Corante (Azul de bromofenol ou Xileno Cianol)

Permite a visualizao das amostras

Permite avaliar o tempo de corrida

Carregando o gel

As amostras so aplicadas em cada um dos poos do gel que est na cuba com tampo de corrida

Correndo a eletroforese

Ao aplicar um campo eltrico, as amostras iro

migrar em direo ao plo

positivo

Correndo a eletroforese

O corante migra junto com as amostras, permitindo a visualizao da corrida

(-)

(+)

DNA (-)

Corando o DNA no gel

Brometo de Etdio

Corante fluorescente visualizado quando excitado

por luz UV

Intercalante de DNA

Permite visualizao do DNA

Pode ser adicionado ao gel (antes da gelificao) ou o gel pode

ser corado aps a corrida

Mutagnico

Alternativas para o Brometo de Etdio

SYBR Gold

SYBR Safe

Gel Ready

Wards - QUIKView DNA Stain

Carolina BLU Stain

Vantagens

Baratos

Menos txicos

Desvantagens

Menos sensveis

Necessita maior quantidade de DNA no gel

Maior tempo de colorao / descolorao

QuikVIEW stain SYBR Gold

Corando o DNA no gel

Submergir o gel na soluo de colorao

Aguardar alguns minutos (20-30)

Remover o excesso de corante com gua

Visualizando DNA no gel

Transiluminador de Ultra Violeta (UV)

Tamanho dos fragmentos de DNA

(-)

(+)

bromophenol blue

DNA

migration

Tamanho dos fragmentos de DNA

Padro de peso molecular (DNA Ladder )

Fragmentos de DNA com tamanhos conhecidos

Permite a determinao do tamanho dos fragmentos

de DNA submetidos a

eletroforese

100

200

300

1.650

1.000

500

850

650

400

12.000 bp

5.000

2.000

(-)

(+)

bromophenol blue

DNA

migration

3.000

4.000

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