Aula

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Ensaios Toxicológicos

e de Inocuidade

Profas. Yraima Cordeiro e Ana Luisa P. de Miranda

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Bibliografia

� CONTROLE BIOLÓGICO DE QUALIDADE DE PRODUTOS FARMACÊUTICOS, CORRELATOS E COSMÉTICOS - 3ª EDIÇÃO - 2010

� Kaneko, Telma Mary; Pinto, Terezinha de Jesus Andreoli; Pinto, Antonio Carlos F.

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Ensaios Toxicológicos e de

Inocuidade

� Toxicidade é a capacidade de certas substâncias causarem danos a seres vivos

Medidas de Toxicidade Estimar o potencial de dano

Função da biodisponibilidadeda substânciaSEGURANÇA

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Testes de Toxicidade� Avaliações efetuadas nas formulações em desenvolvimento.

� Candidatos potenciais aos testes: MP e produto acabado dos produtos de higiene pessoal, cosméticos, perfumes, fármacos e materiais de acondicionamento, além de correlatos (implantáveis ou não).

AGUDA SUB-CRÔNICA CRÔNICA

24 h 21 dias-6 meses

LONGA DURAÇÂO

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Toxicidade Anormal - Inocuidade

� Detectar eventuais elementos tóxicos, estranhos que possam estar presentes na amostra, ou seja, detectar impurezas tóxicas ou co-produtos. Não avalia a toxicidade inerente ao fármaco.

� Material a ser testado:� MP fonte natural (processo de purificação)

� Produto acabado (verificar pureza do processo de produção)

� Material plástico de correlatos e de acondicionamento de parenterais

� Produtos a serem avaliados� antimicrobianos, injetáveis, oftálmicos, cosméticos, imunoterápicos,

correlatos (equipos de infusão e transfusão)

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Avaliação da Toxicidade Aguda

com Efeito Sistêmico

� Principais vias de absorção sistêmica: ingestão oral, inalação de vapores ou pós, absorção percutânea

� Testes realizados:� Administração oral

� Aplicação Dérmica ou Percutânea

� Inalação

Produtos aplicados diretamente sobre a pele, bem como aqueles ingeridos, podem ser absorvidos e distribuídos via sistema circulatório

através de todo o corpo

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� Teste limite (única dose) - oficial

� Dose letal aproximada (doses gradativas em um único animal, aumentadas até resultar em morte)

Objetivo: Conhecer a inocuidade do composto, e não caracterizar a substância mediante a determinação da DL50

DosagemConcentração maior

Concentração menor

Indicadores:Peso > ou <Mortalidade

Condição clínica

Avaliação da Toxicidade Aguda

com Efeito Sistêmico

*ensaio LD50 oral banido pela OECD (diretiva 401) em 2001

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Toxicidade Aguda com Efeito Local

� Irritabilidade Cutânea

� Irritabilidade Ocular

� Sensibilidade Cutânea

� Fototoxicidade e Fotossensibilidade

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Ensaios de Irritabilidade

� Os produtos cosméticos e de higiene corporal são destinados a melhorar o conforto, bem-estar e qualidade de vida dos usuários.

� Garantir ausência de risco para o consumidor – INOCUIDADE

� Avaliação do Risco – condições de uso/áreas de contato

� IRRITAÇÃO: agressão à integridade de tegumentos ou mucosas traduzida por lesões mais ou menos importantes da epiderme. Por definição, uma irritação não é mediada por mecanismos imunológicos. Reações restritas à área de contato com o produto.

� SENSIBILIZAÇÃO: reação imunológica, imediata ou tardia(hipersensibilidade)

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Ensaios de Irritabilidade

PRODUTO

INTERAÇÃO COM A PELE

MODIFICAÇÕES BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS

COSMÉTICOS Aplicação tópica à pele ou ocular

MEDICAMENTOSCORRELATOSCOSMÉTICOS

Injeção intradérmica ou subcutâneaAplicação intravaginal e intranasalAplicação na superfície interna da cavidade oral

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Ensaios de Irritabilidade Cutânea

Friedenwald e cols. (1944); Draize e cols. (1944): Transformar observações qualitativas de efeitos fisiológicos em medidas objetivas quantitativas. Modificado por Kay e Calandra em 1962.

Draize, J.H., Woodard, G. & Calvery, H.O. (1944) Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. and Exp. Therapeutics. 82, 377–390.

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Ensaios de Irritabilidade Cutânea in vivo1- Teste de Irritação Primária da pele

(Método de Draize)

� Patch test – Pele tricotomizada de coelhos albinos, intacta e após abrasão

� N=6

� Área: 6,0 cm2

� Substância teste: 0,5 mL ou 500 mg

� Coberto por 2 camadas de gaze

� Envolver região com material impermeável

� Leituras: t=24h e 72h

� Atribuição de pontuação conforme tabela

1 2

3 4

1/3 – CONTROLE2/4 - TESTE

ERITEMA E EDEMA ÍNDICE DE IRRITABILIDADE

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Avaliação da Toxicidade Aguda com Efeito

Local Irritação Primária – Método de Draize

Resposta da Pele Valor

Formação de Eritema e EscarasSem eritema 0Eritema muito leve 1Eritema bem definido 2Eritema moderado a severo 3Severo eritema (vermelho beterraba) a formação de escara (injúrias em profundidade) 4

Formação de EdemaSem edema 0Edema muito leve (pouco perceptível) 1Edema leve (bordas de área bem definida, elevação definida) 2Edema moderado (Elevação de ~ 1mm) 3Edema severo (elevação > 1mm ao redor da área exposta) 4

∑(Er-Esc) p. int 24h, (Er-Esc) p. int 72h, (Er-Esc) p. abr 24h, (Er-Esc) p. abr 72h, (Ed) p. int 24h, (Ed) p. int 72h, (Ed) p. abr 24h, (Ed) p.abr 72h

∑/8=Índice de Irritação

Índice Avaliação0 Sem irritação0,04 a 0,99 Pouco perceptível1,00 a 1,99 Leve2,00 a 2,99 Branda3,00 a 5,99 Moderada6,00 a 8,00 Severa

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pH < 2 e > 11.5;

pH < 2 e > 11.5; subst. ↑ ↑ tóxicas

Não especif.

pH < 2 e > 11.5; subst. ↑

tóxicas

pH < 2 e > 11.5; subst. ↑ ↑ tóxicas

Substâncias excluídas

NãoNãoNãoNãoSimCritério de classificação definido

0.5, 24, 28, 72h +

0.5, 24, 28, 72h +

0 e 48h0.5, 24, 28, 72h +

0.5, 24, 28, 72h +

Intervalo de tempo para observação

Min. 3, máx. 14 dias


3 diasMin. 3, máx. 14 dias


Período de observação

4h4h24h4h4hTempo de exposição

recomendado

Não especif.

Não especif.SimNão especif.Não especif.Pele com abrasão

SimSim SimSimSimPele intacta

≥ 6≥ 6≥ 6≥ 3≥3Número de animais

0.5mL ou 500mg

0.5 mL ou 500 mg

0.5 mL ou 0.5g

0.5 mL ou 500 mg

0.5 mL ou 500 mg

Dose

Coelho albino

Coelho albinoCoelho albino

Coelho albinoCoelho albino

Espécie recomendada

JapanMAFF (1985)

US EPA (1989)

US FDA(1980)

OECD (1981)

Requerimentos de várias autoridades

EEC (1984)

Especificação dos pré-requisitos

Comparação de diretrizes para teste de irritação dérmica

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� Ensaios in vitroCorrositex

(barreira – membrana colágena)InVitro international

Episkin (Imedex/L´Oréal)

EpiDerm (MatTek)

SkinEthic


Ensaios de Irritabilidade Cutânea

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Episkin

Episkin®: IMEDEX e L’OREAL In-Vitro Reconstructed Human Epithelium

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Epitélio humano reconstruído

http://www.rsc.org/chemistryworld/News/2007/July/24070701.asp

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Célula de Franz

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Necessidade de harmonizar os ensaiosFevereiro de 2008: diversas agências americanas sugeriram um

desvio de investigação primária in vivo para ensaios in vitro, e ensaios in vivo com organismos inferiores e avaliação in silico para avaliação

de toxicidade.

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3Rs

Estatística da EU:

Avaliação toxicológica regulatória: ~ 10% de todos os animais

utilizados;

Avaliação de vacinas: ~ 15%;Desenvolvimento e controle de qualidade de medicamentos: ~

45%;

Pesquisa básica: ~ 30%.

<http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/reports_en.htm>.

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Irritabilidade ocular

FDA, 1933

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Teste de Irritação Ocular

� Metodologia

� Coelhos albinos n=6

� Instila-se 0,1 mL ou 100 mg no saco conjuntival inferior de um olho de cada animal. As pálpebras são fechadas e a seguir, liberadas (não lavar o olho);

� Leituras em t=1h, 24h (lavagem dos olhos com NaCl 0,9%), 48h, 72h após instilação – pode prosseguir até 7 dias.

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� Parâmetros avaliados� Eritema

� Espessura das pálpebras e membrana nictante

� Edema

� Lacrimejamento

� Opacidade

� Danos Capilares

� Pannus (neovascularização de córnea)

� Secreção

� Atribuição de escores/pontuação para quantificação do resultado

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� Resultado:� Reação positiva (+): qq nível de ulceração ou opacidade

da córnea, inflamação da íris ou vasos sangüíneos levemente injetados ou se ocorrer quemose com eversãoparcial das pálpebras;

� Teste positivo (+): ≥ 4 animais apresentam reação positiva;

� Teste negativo (-): apenas 1 animal exibe reação positiva;� Se 2 ou 3 animais +, repetir o teste com mais 6 animais.

Será + se ≥ 6 (de 12) apresentarem reação positiva. � Repetir se 1 ou 2 animais do 2º teste +.� Positivo se qq animal apresentar reação +.

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Evolução do ensaio

� Atualmente: ensaio em 1 animal caso efeitos graves são

esperados (irritante severo); se não se espera

irritabilidade elevada, avaliar em 3 animais.

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Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) paramateriais não opacos

� Ovos brancos Leghorn fertilizados de 10 dias.

� 6 grupos teste - 3 para avaliar diferentes [produto], 2 controles + e 1 grupocontrole (veículo).


Teste de Irritação Ocular – in vitroProdutos: sabonetes, xampus, soluções de limpeza, cremes e loções, delineadores, máscaras, desinfetantes, líquidos para enxagüe bucal, substâncias químicas, pesticidas, com potencial de contato acidental com os olhos.

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BCOP: Bovine Cornea Opacity/Permeability Test Alternative Eye Irritation Model

� Utiliza corneas bovinas;

� Ensaio limite que avalia:� Mudanças na transmissão de luz

� Permeabilidade à fluoresceína


Teste de Irritação Ocular – in vitro

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Normal

Opacidade:

Inchaço células epiteliais basais

31VALIDATION OF THE BOVINE CORNEAL OPACITY-PERMEABILITY ASSAY AS A PREDICTOR OF OCULAR IRRITATION POTENTIAL. In Vitro Toxicol 1994;7(3):283-90.

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Relação entre modelos in vitro e o

tecido animal

O ideal é obtermos dados relacionados à vascularização (Het-Cam), opacidade / permeabilização (BCOP) e citotoxicidade (MTT, RBC).

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Ensaios in vitro

� Para uma predição correta:

� Mimetizar a cinética de exposição, permitir que material teste seja utilizado na mesma forma física do que no ensaio em animais;

� Utilização da mesma concentração que no ensaio animal;

� Deve permanecer em contato com o material teste pelo mesmo período de tempo;

� A relação dos resultados in vitro devem claramente refletir respostas esperadas in vivo.

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Ensaios in vitro

In vivo (Draize)EU: sistema de classificação reduzido:R36 (irritante para os olhos), e R41 (risco de dano ocular sério).

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Árvore de decisões - Irritação ocular

Não experimental- Dados históricos- Informação físico-química (pH, estrutura)

Evidência +

Possível irritante

Evidências insuficientes Sugestão de resultado negativo

Ensaios in vitro

citotoxicidade opacidadeinflamação

Resultado +

Possível irritante

Sem resposta acima do limiar

Ensaios progressivos em animais- Único animal-Anestesia-↓volume

Resultado +

“verdadeiro” irritante

“verdadeiro” negativo

-

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Fototoxicidade

Irritação não imunológica associada à luz (visível ou UV) que pode ocorrer na pele exposta à luz, juntamente com um produto químico fotoativado em quantidade adequada.

Fotossensibilidade

Dano celular provocado por fótons

Fototoxicidade

Fotoalergia

Toxicidade local/sistêmicadevido à aplicação do produto em

condições de irradiação

Sensibilização alérgica devido àaplicação do produto em

condições de irradiação. Aplicação tópica ou sistêmica

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Fotoativação

� Reação Tipo I ou Tipo II

� Ações fotodinâmicas envolvendo oxigênio molecular.

� Tipo I: não há geração de oxigênio singlete excitado; transferência de e- leva a geração de espécies reativas. Interação destas espécies com O2 leva a geração de espécies reativas de oxigênio (superóxido).

� Tipo II: geração direta de oxigênio singlete excitado a partir da transferência de e do cromóforo no estado excitado.

� Possibilidade de avaliação em ensaios in vitro.

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Fototoxicidade

BaixaAltaQuantidade do fotossensibilizador

Variável, incluindo eritema, edema,

formação de vesículas

Similar à queimadura solar

Resposta observada

SIMNÃOTempo de latência após 1ªexposição

NÃOSIMOcorre após 1ª exposição

FotoalergiaFototoxicidadeCaracterísticas

Diferenças entre fototoxicidade e fotoalergia

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Psoralenos

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Psoralenos

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Psoralenos x

DNA

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Produtos da indústria química que no geral causam

reações de fotossensibilização:

Corantes, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, antimicrobianos.

Fotoirritação/ Fototoxicidade: ambas respostas não imunológicas à um composto fotoativado.

Fotoirritação: observada após exposição tópica.Fototoxicidade: após exposição sistêmica.

Exemplos de fotoalergenos em humanos: prometazina, benzocaína, e ácido p-aminobenzóico;

Composto fotoativado pode ser o fármaco em si, ou um excipiente do produto farmacêutico, ou ainda um metabólito, impureza ou produto de degradação.

Importância da avaliação do produto acabado.

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Quando realizar o ensaio

� Estudos distribuição: encontrado em [significativa] na pele e/ou olhos?

� Composto absorve luz UVA ou UVB?

� Aplicação tópica?

� Possibilidade de exposição ao sol?

UVA – 320 a 400 nmUVB – 320 a 280 nm

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Fototoxicidade

� Parâmetro mais utilizado: irritação primária da pele em coelhos albinos, camundongos e cobaias;

� Após 1ª investigação, avaliar no HOMEM;

� Fatores que podem influenciar: concentração, duração da exposição da substância à luz, escolha do veículo.

O veículo pode alterar a penetração percutânea da substância teste

� Métodos com injeção intradérmica da substância;

� Desvantagens: cuidado ao extrapolar à via real de uso;

� É possível que alguns materiais não fototóxicos possam ser convertidos a materiais tóxicos por metabolização de determinados indivíduos.

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Considerações gerais para avaliação

� Para a maioria dos fármacos, avaliar a substância sem os excipientes;

� Para produtos de aplicação tópica: produto acabado e não somente o princípio ativo deve ser avaliado;

� Veículos aplicados topicamente podem alterar as propriedades ópticas da pele humana, como:

� • Veículos farmacêuticos (e.g., cremes, géis, loções ou soluções) podem reduzir a quantidade de luz refletida, espalhada ou absorvida pela pele ou aumentar a absorção percutânea do composto.

� Veículos podem aumentar ou reduzir as foto-propriedades adversas ou foto estabilidade de determinado composto.

� Podem aumentar os efeitos de outros componentes da formulação e ainda influenciar a solubilidade e estabilidade geral do princípio ativo.

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Espécies utilizadas e condições

empregadas

� Rato, camundongo, porco da Índia, coelho;

� Controle positivo: 8-MOP, 0,005% em 95% (w/w) EtOH.

� Aplicação 0,025 mL/cm2

� Intervalo entre aplicação e irradiação:30 a 50min (dependendo da taxa de absorção do composto)

� Observação clínica e pontuação: (4h), 24 a 48h após irradiação.

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Fototoxicidade e Fotossensibilidade Cutânea

Escuro

Escuro Luz

Luz

UVA (320 – 400 nm) - 116 min

Controle + metoxipsoraleno (1/2)

Leituras: 24h, 48h, 72h, 96h,

SINAIS: Edema e Eritema

Peso: 96h

Pontuação: Draize.Ensaio in vivo

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Claro

Escuro

controle (+)100 µµµµg

S. Teste controle (+)100 µµµµg

S. Teste

Ensaio de Fototoxicidade:

in vitro e in vivo

Observação de eritema e edema

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In vitro

Animal 1 Animal 2claro

0,5 mg

2 mg

5 mg

8-metoxi-psoraleno

0,5 mg

2 mg

5 mg

escuro

8-metoxi-psoraleno

Saccharomyces cereviseae

Halo de inibição do crescimento da levedura

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Avaliação do potencial fototóxico

� Metodologia (3T3 NRU): Linhagem de fibroblasto de camundongo.� Resposta tóxica após primeira exposição da célula a agentes químicos,

e posterior exposição à irradiação. � A citotoxicidade é expressa na determinação da dose dependente que

reduz o crescimento celular utilizando-se um corante vital, vermelho neutro.

� 1º teste para toxicidade in vitro experimentalmente validado (1998) para fins regulatórios. Teste aceito e publicado em 2000 para avaliação de fototoxicidade (3T3 NRU PT) no anexo V da Diretiva 67/548 da EEC.

Fotoalergia: carece de ensaios in vitro, avaliação clínica.

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