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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE Caesalpinia echinata Lam.
FABACEAE - CAESALPINIOIDEAE USOS E RISCOS
Elisangela Christhianne Barbosa da Silva
RECIFE 2006
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Elisangela Christhianne Barbosa da Silva
AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE Caesalpinia echinata Lam.
FABACEAE - CAESALPINIOIDEAE USOS E RISCOS
RECIFE 2006
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Avaliação e Obtenção de Produtos Bioativos e Naturais. Orientador: Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza
Silva, Elisangela Christhianne Barbosa da
Avaliação biológica de Caesalpinia echinata Lam. Fabaceae- Caesalpinioideae : Usos e riscos / Elisangela Christhianne Barbosa da Silva. – Recife : O autor, 2006. Xii, 114 folhas : il., fig., tab., graf.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS.Ciências Farmacêuticas, 2006.
Inclui bibliografia .
1. Caesalpinia echinata – 2. Pau-brasil -toxicidade aguda. – 3. Matéria médica vegetal – 4. Atividade antineoplásica. 5. Atividade antiinflamatória I. Título.
615 CDU (2.ed.) UFPE 615.321 CDD (22.ed.) CCS/UFPE
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Celso Pinto de Melo
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Jane Sheila Higino
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Samuel Daniel de Souza
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Miracy Muniz de Albuquerque
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
DEDICO
OFEREÇO
Ao Professor Roldão de Siqueira Fontes (in memorian) (UFRPE) por sua incansável luta a fim de resgatar aos brasileiros o pau-brasil como símbolo nacional.
As mulheres guerreiras de minha família, que me ensinaram a não esmorecer mesmo diante das maiores adversidades.
“É muito melhor arriscar coisas grandiosas, alcançar triunfos e glórias, mesmo expondo-se a derrota, do que formar fila com os pobres de espírito que nem gozam muito nem sofrem muito, porque vivem nessa penumbra cinzenta, de quem não conhece vitória nem derrota.”
Theodore Roosevelt
AGRADECIMENTOS
Acima de tudo e todos, a Papai do Céu, meu Senhor, fiel guardador e mantenedor. Porque, quando diante de mim o mar não se abriu, TU me fizeste andar sobre as águas. A minha mãe Acidália, pelo apoio, investimento, incentivo e compreensão durante toda minha vida. Eu não teria palavras para te agradecer tudo que você fez por mim, teria que dedicar toda dissertação a esse fim, vou tentar resumir em uma frase muito significativa: EU TE AMO. Também ao meu pai Jeová, apesar da distância você também é parte fundamental na minha vida. A minha linda e amada avó Antônia (in memorian), meu passarinho, pelos ensinamentos e gestos de carinho. À minha prima Cristiane, por ter estado presente em todos os momentos, me ajudando e incentivando, você sempre vai morar em meu coração. À minha irmã Jannyere e meu cunhadão Alex, obrigada pelo apoio e pelas orações. E aos dois pequenos Sóis que trouxeram um brilho novo para nossas vidas: Guilherme e Fernanda. Ao meu irmãozinho Janieikcson, tenho fé que um dia Deus lhe dará juízo. As minhas tias Cleonice (Tia Nice) obrigada pelo carinho, pela alegria contagiante e pelo apoio que sempre me deu, e Severina (Tia Biu), obrigada pelo exemplo de honestidade, bondade, amor ao próximo, você lutou para criar uma pessoa do bem, espero nunca decepcioná-la. Aos meus tios: Geraldo (in memorian), Nilbam de Mello (in memorian), obrigada por terem feito parte da minha vida, o fofíssimo e mui amado Tio Issinho (Wilson), você se foi cedo demais, e meu anjinho da guarda Osmar (Mazinho), por seu carinho e atenção. As minhas primas Viviane e Liliane, e ao meu primo Max, vocês são muito especiais para mim, são parte de minha vida. A todos os meus familiares pelo apoio e incentivo, vocês são o meu alicerce, foi através de vocês que eu me tornei o que sou hoje, obrigada por TUDO que me deram. Ao meu amor Joabe Antônio Gomes (meu Bebê), por todos os domingos e feriados em que me acompanhou na realização dos experimentos, seu apoio e carinho foram fundamentais para a conclusão desse trabalho. À minha professora e ORIENTADORA Ivone Antônia de Souza. Parafraseando Ayrton Senna, “acho que a base do sucesso em qualquer atividade está primeiro em se ter uma oportunidade, que geralmente
aparece não porque você cria o momento, mas porque alguém chega e lhe abre uma porta”, você abriu esta porta para mim, me deu a oportunidade de crescer e acreditou em mim quando nem eu mesma acreditava. Muito obrigada pela paciência, confiança e por ter estado presente em todos os momentos. A meu amigo Aldo César pela ajuda sincera e desinteressada, por todas as “brigas”, pelo companheirismo e o amor fraterno que sempre me dedicou. Você sempre será meu irmão grandão. As amigas: Karen, Laurimar, Wyldenyra, Ítala, Patrícia Magalhães pelo enorme auxílio na elaboração do trabalho e companheirismo no dia-a-dia. Aos amigos André Luis Menezes por seus grandes conhecimentos farmacotécnicos, que me ajudaram numa fase essencial de meu trabalho, Thompson Oliveira e Frederico Duarte, mãos amigas chegadas no momento exato. À equipe do laboratório de farmacognosia: Janaina Melo, José Guedes, Evani Lemos, Jovita Braga, Luciana Ramos e Marcos Saraiva. Aos professores Antônio Camarotti, Haroudo Satiro Xavier, Rosa Galdino, Jane Sheila Higino, Fálba Bernadete, Diógenes L. Motta, Carlos Eduardo, Ana M. França, Arquimedes Melo e Edeltrudes de Oliveira Lima pela orientação e apoio na realização do trabalho. Aos meus amigos da graduação e da Pós-Graduação em Ciências Farmacêutica. A Fátima e Iguacy pelo valioso apoio administrativo. A todos os professores e amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE. Enfim, a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para que este trabalho se tornasse uma realidade.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................
V
LISTA DE TABELAS...................................................................................
VI
LISTA DE FIGURAS...................................................................................
VII
LISTA DE GRÁFICOS................................................................................
IX
RESUMO..................................................................................................
XI
ABSTRACT................................................................................................
XII
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................
1
2. REVISÃO DA LITERATURA.................................................................. 6
2.1. ESTUDOS SOBRE CAESALPINIA ECHINATA LAM..........................................
7
2.1.1. BOTÂNICO................................................................................................ 7
2.1.2. FITOQUÍMICO............................................................................................... 10
2.1.3. FARMACOLÓGICO.................................................................................... 11
2.1.4. TOXICOLÓGICO....................................................................................... 14
2.2 ESTUDOS TOXICOLÓGICOS PRÉ-CLÍNICOS DE PLANTAS
MEDICINAIS............................................................................................. 14
2.2.1. TOXICIDADE AGUDA................................................................................ 16
2.3. INFLAMAÇÃO........................................................................................... 17
2.3.1. AGENTES ANTIINFLAMATÓRIOS.............................................................. 20
2.3.2. TESTES ANTIINFLAMATÓRIOS................................................................. 21
2.4. CÂNCER................................................................................................... 22
2.4.1. CARCINOGÊNESE.................................................................................... 23
2.4.2. CARCINOMA............................................................................................. 25
2.4.3. SARCOMA................................................................................................. 25
2.4.4. PRODUTOS NATURAIS E A TERAPIA ANTICÂNCER.................................. 26
2.5. AGENTES ANTIMICROBIANOS.................................................................. 27
3.0
OBJETIVOS........................................................................................ 30
3.1. OBJETIVO GERAL........................................................................................... 31
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................ 31
4.0. PERFIL FITOQUÍMICO DO CERNE DE CAESALPINIA ECHINATA
LAM....................................................................................................
32
INTRODUÇÃO........................................................................................ 33
MATÉRIAIS E MÉTODO.......................................................................... 34
LOCAL DE TRABALHO........................................................................... 34
IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO........................................... 34
OBTENÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO.................................................. 34
RESULTADOS....................................................................................... 35
DISCUSSÃO........................................................................................... 36
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 38
5.0.
ARTIGO I: AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO
DA CL50 E DA DL50 DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO DE
CAESALPINIA ECHINATA LAM.
(FABACEAE/CAESALPINIOIDEAE)....................................................
40
RESUMO............................................................................................... 41
ABSTRACT............................................................................................. 42
INTRODUÇÃO........................................................................................ 42
METODOLOGIA..................................................................................... 43
MATERIAL BOTÂNICO........................................................................... 44
OBTENÇÃO DO EXTRATO..................................................................... 44
OBTENÇÃO DA CL50.............................................................................. 44
ANIMAIS................................................................................................ 44
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA
DL50....................................................................................................... 45
RESULTADOS........................................................................................ 45
DETERMINAÇÃO DA CL50...................................................................... 45
TOXICIDADE AGUDA E DETERMINAÇÃO DA DL50................................ 45
ADMINISTRADO POR VIA INTRAPERITONEAL....................................... 46
ADMINISTRAÇÃO POR VIA ORAL........................................................... 47
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.................................................................. 47
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 50
6.0.
ARTIGO II: ESTUDO PRELIMINAR DA PROPRIEDADE
ANTIIFLAMATÓRIA DO EXTRATO BRUTO DE CAESAPINIA ECHINATA
LAM.
(FABACEAE/CAESALPINIODEAE).....................................................
55
RESUMO...............................................................................................
56
ABSTRACT............................................................................................. 57
INTRODUÇÃO........................................................................................ 57
METODOLOGIA...................................................................................... 58
ANIMAIS................................................................................................. 58
MATERIAL BOTÂNICO............................................................................ 58
OBTENÇÃO DO EXTRATO...................................................................... 58
EDEMA DE PATA INDUZIDO POR CARRAGENINA.................................. 59
TRATAMENTO DOS ANIMAIS................................................................ 59
ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................... 59
RESULTADOS........................................................................................ 60
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.................................................................. 61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÀFICAS......................................................... 63
7.0.
ARTIGO III: ESTUDO DA PROPRIEDADE ANTICANCERÍGENA DA
CAESALPINIA ECHINATA LAM..........................................................
67
RESUMO................................................................................................ 68
ABSTRACT............................................................................................. 69
INTRODUÇÃO........................................................................................ 70
METODOLOGIA...................................................................................... 70
ANIMAIS................................................................................................. 70
MATERIAL BOTÂNICO............................................................................ 71
OBTENÇÃO DO EXTRATO...................................................................... 71
TRANSPLANTE DOS TUMORES.............................................................. 71
TRATAMENTO DOS ANIMAIS................................................................. 71
ESTUDO HISTOLÓGICO......................................................................... 72
ANÁLISE ESTATÍSTICA.......................................................................... 72
RESULTADOS......................................................................................... 72
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO................................................................... 74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 78
8.0.
ARTIGO IV: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO BRUTO DA
CAESALPINIA ECHINATA LAM..........................................................
85
RESUMO................................................................................................ 86
ABSTRACT............................................................................................. 87
INTRODUÇÃO......................................................................................... 87
MATÉRIAS E MÉTODO........................................................................... 88
LOCAL DE TRABALHO........................................................................... 89
ENSAIOS MICROBIOLÓGICOS............................................................... 89
MATERIAL BOTÂNICO............................................................................ 89
METODOLOGIA...................................................................................... 89
RESULTADOS......................................................................................... 89
DISCUSSÃO........................................................................................... 90
CONCLUSÃO.......................................................................................... 91
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 93
9.0.
CONCLUSÕES........................................................................................
96
10.0.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................
98
V
LISTA DE ABREVIATURA/SIGLAS AA – Ácido Araquidônico
BrCCl3 – Tetracloreto de Bromo.
CCDA – Cromatografia de Camada delgada Analítica. CCEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal.
COX – Ciclooxigenases. COX2 – Ciclooxigenases 2. EE – Extrato Etanólico EEB – Extrato Etanólico Bruto EMB – Extrato Metanólico Bruto EMCb – Extrato Metanólico de C. bonducella EECe – Extrato Etanólico de C. echinata GABA – Ácido Gama-Aminobutírico LIPOX – Lipoxigenases LT – Leucotrienos OMS – Organização Mundial da Saúde PGs – Prostaglandinas PLA2 – Fosfalipases A2 SNC – Sistema Nervoso Central TXA – Tromboxanos vip – Via Intraperitoneal vo – Via Oral
VI
LISTA DE TABELAS
Perfil Fitoquímico
Tabela 1 Metabólitos, sistemas de eluição, reveladores e referências bibliográficas utilizadas para a investigação fitoquímica de Caesalpinia echinata Lam........................
35 Tabela 2 Metabólitos encontrados no EMB do cerne de
Caesalpinia echinata Lam. .............................................. 38
Artigo I
Tabela 1 Sinais clínicos da toxicidade observada em camundongos albinos swiss machos, tratados com diferentes doses do EE da C. echinata, por via intraperitoneal.................................................................
52
Tabela 2 Sinais clínicos da toxicidade observada em camundongos albinos swiss machos, tratados com diferentes doses do EE da C. echinata, por via oral.................................................................................
53
Tabela 3 Classificação da toxicidade relativa dos agentes químicos de acordo com a DL50.......................................
54
Artigo IV
Tabela 1 Ação antibacteriana do extrato de Caesalpinia echinata Lam. em diferentes concentrações contra bactérias de origem clínica e diversa ..............................
90
Tabela 2 Teste de atividade antifúngica do extrato de Caesalpinia echinata Lam. em diferentes concentrações contra fungos leveduriformes e filamentosos de origem clínica e diversa..............................................................
91
VII
LISTA DE FIGURAS
Revisão da Literatura
Figura 1 Caesalpinia echinata Lam. A: vista parcial de um individuo adulto; B: detalhe de um ramo mostrando folhas e fruto; C: detalhe contendo flor em vista frontal, com sépala abaxial, que é verde e pétala adaxial, que possui uma mancha vermelha escura; D: corte transversal do lenho.........................................................................
8
Figura 2 Formula estrutural da brasilina e da brasileína........................................................................
9
Figura 3 INICIAÇÃO: dano ao DNA; indução de mutação em genes alvos críticos; ativação de protooncogenes; inativação de genes supressores de tumor; replicação celular e fixação da mutação..........................................................................
24
Figura 4 PROMOÇÃO: expansão clonal de células tronco; desenvolvimento de tumor benigno (células pré-neoplásicas)....................................................................
24
Figura 5 PROGRESSÃO: expressão enzimática alterada; proteólise; adesão; invasão; migração e metástase.......................................................................
25
Artigo III
Figura 1 Fotomicrografia do córtex de rim de camundongo macho, portador de carcinoma de Ehrlich, tratado com EECe (50 mg/kg). Corpúsculo renal (1), congestão glomerular (2), corado com HE. Obj. 20x.........................
82
Figura 2 Fotomicrografia do fígado de camundongo macho, portador de carcinoma de Ehrlich, tratado com EECe (50 mg/kg). Vasos congetionados (1), hepatócitos vacuolizados (2), corado com HE. Obj. 20x.................................................................................
82
Figura 3 Fotomicrografia do pulmão de camundongo macho, portador de carcinoma de Ehrlich, tratado com EECe (50
VIII
mg/kg). Alvéolos congestionados (1), corado com HE. Obj. 20x..........................................................................
83
Figura 4 Fotomicrografia do pulmão de camundongo macho, portador de Sarcoma 180, tratado com EECe (50 mg/kg). Pontos de inflamação (1), corado com HE. Obj. 20x.................................................................................
83
Figura 5 Fotomicrografia do fígado de camundongo macho, portador de Sarcoma 180, tratado com EECe (50 mg/kg). Inflamação perivascular (1), Sinusóides aparentemente normais (2). Corado com HE. Obj. 20x................................................................................. 84
Figura 6
Fotomicrografia do rim de camundongo macho, portador de Sarcoma 180, tratado com EECe (50 mg/kg). Áreas de inflamação (1), Glomérulo de morfologia preservada (2). Corado com HE. Obj. 20x.................................................................................
84
IX
LISTA DE GRÁFICOS
Artigo I
Gráfico 1 Curva Dose-Resposta da toxicidade da C. Echinata Lam................................................................................
54
Artigo II
Gráfico 1 Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratos machos tratados por VIP, com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), indometacina 10 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student)..........................................................................
65
Gráfico 2 Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratas fêmeas tratados por VIP, com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), indometacina 10 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).........................................................................
65
Gráfico 3 Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratos machos tratados por VO, com o EE de C. echinata nas dose de 100mg/kg (▲), 150mg/kg (♦), 200mg/kg (■), indometacina 20 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. *Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).........................................................................
66
Gráfico 4 Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratas fêmeas tratados por VO, com o EE de C. echinata nas dose de 100mg/kg (▲), 150mg/kg (♦), 200mg/kg (■), indometacina 20 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-).
X
Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. *Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).....................................................................
66
Artigo III
Gráfico 1 Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos machos, portadores de carcinoma de Ehrlich, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Metotrexato (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student)..........................................................................
80
Gráfico 2 Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos fêmeas, portadores de carcinoma de Ehrlich, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Metotrexato(♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student)..........................................................................
80
Gráfico 3 Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos machos, portadores de Sarcoma 180, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Genuxal 2,5mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student)..........................................................................
81
Gráfico 4 Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos fêmeos, portadores de Sarcoma 180, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Genuxal 2,5mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student)..........................................................................
81
XI
RESUMO Caesalpinia echinata Lam., conhecida popularmente como pau-brasil, é uma árvore da família Fabaceae, subfamília Caesalpinioideae típica da mata atlântica. Foi intensamente explorada do período do descobrimento devido ao pigmento vermelho encontrado em seu lenho, a brasileína, além do uso na construção naval, civil e mobiliário. Atualmente é utilizado na arborização de ruas e parques e na confecção de arcos de violino. A medicina popular atribui a este vegetal algumas propriedades farmacológicas, sendo o extrato de seu lenho utilizado como: adstringente, cicatrizante, odontoálgico e tônico. Em nossa revisão bibliográfica, constatamos carência de informações toxicológicas e farmacológicas detalhadas sobre a espécie. Nesse sentido, o trabalho teve como objetivo avaliar a composição fitoquímica e a ação biológica (toxicológica, microbiológica e farmacológica) do extrato etanólico bruto (EEB) de espécie Caesalpinia echinata Lam. A análise fitoquímica foi realizada através de análise cromatográfica utilizando diversas fases móveis e reveladores específicos, apontando os flavonóides como constituintes majoritários desta parte do vegetal. Traços de taninos catéquicos e cumarinas também foram encontrados. Os testes de toxicidade aguda foram realizados por via oral e intraperitoneal em camundongos machos com observações das respectivas alterações comportamentais para cada dose administrada. As doses utilizadas foram 250 a 2000 mg/Kg para via intraperitoneal, e 250 a 4000 mg/Kg para via oral. Na administração por via intraperitoneal, foram observados efeitos estimulantes nos primeiros 15 minutos após administração do EEB, em seguida foram observados efeitos depressores, o valor de sua DL50 foi de 995,57mg/kg o que permite sua classificação quanto a toxicidade em moderadamente tóxico. A administração por via oral, apresentou efeitos estimulantes que duraram cerca de 30 minutos após administração do EEB, em seguida foram observados curtos períodos de depressão acompanhados por intervalos de agitação, quando administrado por esta via o EEB pode ser considerado atóxico, visto não ter provocado óbito em nenhuma das doses testadas. A avaliação da atividade antiinflamatória utilizou o método de edema de pata induzido por carragenina (Winter et al. 1962). O edema apresentou inibição significativa (p<0,05) em todas as doses administradas por via intraperitoneal para ambos os sexos; por outro lado ao ser administrado por via oral não foi observada inibição significativa. A avaliação antitumoral do EEB de C. echinata Lam frente ao Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich por via intraperitoneal (50, 75 e 100 mg/kg) apresentou significativa redução dos pesos médios dos tumores dos grupos tratados. Na análise microbiológica não houve resultados significativos. Palavras chave: Caesalpinia echinata, pau-brasil, toxicidade aguda, ação antiinflamatória, atividade antineoplásica, atividade antimicrobiana, avaliação histológica..
XII
ABSTRACT Caesalpinia echinata Lam., known popularly as brazilwood, is a Fabaceae families’s tree, subfamily typical Caesalpinioideae of the atlantics forest. It was been explored since of the period the Brazil’ s discovery due to red pigment found in the heartwood, “the brasilein”, beyond the use in the naval, civil and furniture’s construction. Actually It’s been used in the arborization of streets and parks and in the confection of violin’s arcs. The popular medicine attribute to this vegetable some pharmacological properties, being the extract of its used as: adstringent, healing, analgesic and tonic. In our bibliographical revision, we evidence lack of detailed toxicological and pharmacological information on this species. This work had an objective to evaluate the phytochemical composition and the biological action (toxicological, microbiological and pharmacological) of the crude ethanol extract (EEB) of species Caesalpinia echinata Lam. The phytochemistry analysis was carried through to chromatographic analysis using diverse specific mobile and revealing phases, and It was demonstrated that the flavonoids as the bigger constituent of this part on this vegetable. Traces of tannins barks and coumarins had been also found. The tests of acute toxicities had been realized by oral and intraperitoneal administration in male adult mice with comments of the respective alterations on the physical and behavioral for each managed dose. The doses that were used 250 mg/Kg to 2000 mg/kg for intraperitoneal administration and 250 mg/kg to 4000 mg/Kg for oral administration. By the intraperitoneal injection It was been observed stimulants effects at the first 15 minutes after administration of the EEB. Following It was observed depressors effects. The value of LD50 was 995,57mg/kg that allowed to classificate the extract in moderately toxic. The oral administration of the EEB presented stimulant effects that during about 30 minutes, after this It was been observed short periods of depression followed by agitation. The results of the EEB showed no death in none of the tested doses so It can be considered no toxic. The evaluation of the anti-inflammatory activity used the carrageean-induced paw edema (Winter et al. 1962). The edema presented significant inhibition (p<0,05) in all the doses managed by intraperitoneal administration for male and female mice; In the other hand, the oral administration was not observed significant inhibition. The antitumoral activity of the EEB of C. echinata Lam on Sarcoma 180 and Carcinoma of Ehrlich by intraperitoneal injection (50, 75 and 100 mg/kg) showed significant reduction of the average weights on the tumors of the treated animals. In the microbiological analysis it had not significant results. Words key: Caesalpinia echinata, wood-Brazil, acute toxicity, anti-inflammatory action, antitumour activity, antimicrobial activity, histological evaluate.
1
DDDDA \ÇàÜÉwâ†ûÉA \ÇàÜÉwâ†ûÉA \ÇàÜÉwâ†ûÉA \ÇàÜÉwâ†ûÉ
2
1. INTRODUÇÃO
O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas é tão
antigo quanto à civilização humana. O homem tem buscado na
natureza o suprimento para suas necessidades básicas, retirando dela
alimentos, abrigo, vestuário, meios de transporte, temperos e perfumes,
e finalmente, remédios (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000).
Os vegetais lançaram, há milhares de anos, as bases da medicina
moderna (BREVOORT, 1998). Pode-se dizer que a fitoterapia modificou-
se durante o curso de sua história, passando por épocas de esplendor e
épocas de obscuridade (GOLBERG, 2001). Os primeiros escritos, em
linguagem cuneiforme, vêm da região Mesopotâmica e datam de cerca
de 2600 a.C. (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000). O rei da Babilônia
Mardu Kapalidine II mandou construir um jardim onde cultivou 64
espécies de plantas medicinais, muitas das quais ainda utilizadas na
medicina popular (CARVALHO, 1999).
A medicina egípcia destacou-se com o melhor registro
farmacêutico da época, o “Papiro de Ebers” (1550 a.C.), este documento
abriga cerca de 700 drogas de origem vegetal, animal e mineral, e inclui
formulações, tais como: infusões e pomadas, e os veículos utilizados
nessas preparações, entre eles temos a cerveja, o leite, o vinho e o mel
(NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000).
A civilização indiana desenvolveu a Ayurveda, considerada a mais
antiga ciência da saúde, originada há mais de 5 mil anos. O
Atharvaveda (cerca de1200 a.C.), Charak Samhita e o Sushrut Samhita
(1000–500 a.C.) (BHAGAVAN; SHARAMA, 2001) estão os principais
escritos clássicos da medicina ayurvédica, e descrevem detalhadamente
cerca de 700 ervas.
Nesta mesma época, ainda na civilização oriental desenvolvia-se a
medicina clássica chinesa, que constitui uma das primeiras doutrinas
médicas da humanidade. As práticas terápicas citadas no Huang Di Nei
Jing (Cânon interno do imperador amarelo) possuem raízes deitadas há
mais de 5.000 anos antes da era cristã. Um dos primeiros relatos que
3
trata da medicina interna "Huang Di Nei Jing", foi escrito na dinastia
Han, por volta de 3000 a C. Este tratado listava 13 fórmulas de
fitocompostos incluindo pílulas, pós, emplastos, chás e outros (BEAU,
1974). A Matéria Médica chinesa foi amplamente documentada durante
os séculos, com o primeiro registro datando de 1100 a.C. (Wu Shi Er
Bing Fang, contendo 52 prescrições), seguido por outros trabalhos,
como o Shennong Herbal (ano 100 a.C., 365 drogas) e o Tang Herbal
(659 d.C., 850 drogas) (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000). A obra do
Imperador Cho-Chin-kei, o “Hipócrates chinês”, é a mais notável na
farmacognosia chinesa antiga (MELLO; FILHO, 2000).
Na cultura ocidental, os gregos contribuíram substancialmente
para o desenvolvimento racional do uso das drogas vegetais. Teofrasto
(370-286 a.C.), sucessor de Aristóteles na escola de Atenas, em seu
“History of Plants” detalhou peculiaridades e qualidades médicas das
ervas. Dioscórides, médico grego (ano 100 d.C.), descreveu cerca de 500
plantas medicinais no seu tratado “Matéria Médica”. Galeno (130-200
d.C.), praticou e ensinou farmácia e medicina em Roma, ficou conhecido
por suas prescrições complexas e fórmulas utilizadas na composição
das drogas (NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000; TESKE; TRENTINI,
1995).
Durante a idade média, as ciências sofreram um longo período de
estagnação. Do século V ao XII, os monastérios de países como
Inglaterra, Irlanda, França e Alemanha preservaram as sobras do
conhecimento ocidental. Entretanto, foram os árabes que se
responsabilizaram pela preservação de grande parte da sabedoria greco-
romana, e sua expansão através do mundo. O farmacêutico, físico e
filósofo persa Avicenna, muito contribuiu para as ciências farmacêutica
e médica através da elaboração de trabalhos como o Canon Medicinae,
considerado como “a codificação final de toda medicina Greco-Romana”
(NEWMAN; CRAGG; SNADER, 2000).
No Brasil, as informações sobre plantas utilizadas com fins
medicinais têm sua história ligada à cultura dos povos indígenas e dos
4
africanos que foram trazidos ao Brasil como escravos (CARVALHO,
1999).
Com a revolução industrial e o advento da síntese química o uso
de plantas medicinais foi posto de lado, período em que foi considerada
simples superstição religiosa sem valor farmacológico, dando-se
preferência aos produtos sintéticos. Entretanto, com a descoberta da
penicilina, obtida de um microorganismo, e o desenvolvimento da
terapia anti-infecciosa, a imensa importância dos produtos naturais foi
reconhecida (RATES, 2001).
Atualmente a estimativa é de que cerca de 40% dos fármacos
empregados na terapêutica, são provenientes de fontes naturais, sendo
25% de plantas. Este percentual aumenta ainda mais se nos
restringirmos apenas aos fármacos anticancerígenos e antibióticos
(YUE-ZHONG SHU, 1998). Das 252 drogas, consideradas básicas pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são exclusivamente de
origem natural e um número significante destes são drogas sintéticas
obtidas de precursores naturais (RATES, 2001).
Apesar dos milhares de anos, o número de plantas medicinais
estudadas sob a óptica da farmacologia e toxicologia com o intuito de
comprovar o seu uso popular e segurança, respectivamente, ainda é
muito pequeno. Estima-se que das 250 a 500 mil espécies de plantas
existentes no planeta, apenas um pequeno percentual foi investigado
fitoquímicamente, da mesma forma muito pouco foi estudado em
termos de propriedades farmacológicas; em muitos casos apenas o
“screening” farmacológico foi realizado (PAYNE e cols, 1991).
Nos anos recentes, houve um crescente interesse pelas terapias
alternativas e pelo uso terapêutico de produtos naturais, especialmente
naqueles derivados de vegetais (GOLDFRANK e cols, 1982; MENTZ;
SCHENKEL, 1989; VULTO; SMET, 1988). Este fato encontra-se
associado ao crescimento do interesse da indústria farmacêutica pelo
uso da biodiversidade como fonte de novos medicamentos (CORDELL,
1995). O mercado mundial de fitoterápicos movimenta cerca de U$ 20
bilhões anuais (CALIXTO, 2000). No Brasil, o mercado de medicamentos
5
fitoterápicos tem apresentado crescimento na ordem de 15% ao ano.
Em 2001, este mercado movimentou R$ 270 milhões, cerca de 5,90 %
do mercado brasileiro de medicamentos, maior do que a comercialização
de medicamentos genéricos, que foi de R$ 226 milhões, no mesmo ano
(ABIFITO). Atualmente, as maiores indústrias farmacêuticas mundiais
possuem programas de pesquisa na área de produtos naturais
(CALIXTO, 2003).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% da
população mundial façam uso de plantas medicinais para o tratamento
de doenças (CRAGG; NEWMAN, 1999). Considerando que o acesso a
medicamentos pela população é baixo e que o Brasil é detentor de uma
megadiversidade, presume-se que o consumo de plantas com fins
medicinais seja bastante elevado, visto que esta alternativa constitui
uma opção de tratamento eficaz e de baixo custo. Com isso, as
preparações farmacêuticas contendo extratos padronizados de uma ou
mais plantas, conhecidas como medicamentos fitoterápicos, ganham
uma enorme importância.
Nesse contexto, a avaliação do potencial toxicológico e
farmacológico das plantas medicinais e de seu metabólitos secundários
mostra-se de fundamental importância para obtenção de novos
fármacos que apresentem eficácia associada a uma margem de
segurança satisfatória.
6
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7
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Estudos sobre Caesalpinia echinata Lam.
2.1.1. Botânico
A família Fabaceae, também conhecida como Leguminosae,
pertence à ordem das Fabales, que contém aproximadamente 650
gêneros e cerca de 18000 espécies (OLIVEIRA; PAIVA, 2005). É a
terceira maior família das angiospermas (CHAPPILL, 1995), muitas
delas possuindo importância econômica (TUCKER, 2003).
Sistematicamente, o gênero Caesalpinia pertence à família
Fabaceae, subfamília Caesalpinioideae, tribo Caesalpineae. Trata-se de
um gênero importante devido ao seu alto interesse histórico, econômico,
ecológico (ZAIA, 2004) e biológico.
Caesalpinia echinata Lam. (Figura 1), ou “pau-brasil”, é uma
árvore nativa das partes mais secas da floresta pluvial atlântica,
ocorrendo desde o Rio de Janeiro (23ºS), até o estado do Rio Grande do
Norte (05º45’S) (CARVALHO, 1994), e possuindo maior abundância no
sul do estado da Bahia (REZENDE e cols., 2004). Sua estatura varia de
mediana até 30 metros de altura (CORRÊA, 1978); possui tronco de 40
a 70 cm de diâmetro. Sua copa é irregular; os ramos mais novos e as
cascas de espécimes mais jovens são repletos de acúleos. Seu cerne
muito duro e pesado varia de coloração castanha alaranjado ao
vermelho escuro e foi alvo da primeira grande exploração econômica de
recurso natural em território brasileiro desde a colonização portuguesa.
O alburno é amarelo-claro. Suas folhas são compostas, bipinadas, de
10 a 15 cm de comprimento (CORREA, 1984). Suas inflorescências
localizam-se nos ramos terminais, com flores amarelas muito
perfumadas. Seus frutos são do tipo vagem, possuindo deiscência
explosiva e são totalmente recobertos por acúleos que se formam logo
após a floração (CARVALHO, 1994).
8
FIGURA 1 – Caesalpinia echinata Lam. A: vista parcial de um individuo adulto; B: detalhe de um ramo mostrando folhas e fruto; C: detalhe contendo flor em vista frontal, com sépala abaxial, que é verde e pétala adaxial, que possui uma mancha vermelha escura; D: corte transversal do lenho.
Sua denominação botânica é derivada do latim e trata-se de uma
homenagem a um grande médico e botânico do século XVI – Andréa
Cesalpino. A palavra “echinata” é a forma latina do adjetivo “equinado”,
que nada mais quer dizer do que “vegetal com espinhos” (FONTES,
1995).
No Brasil, a planta é conhecida popularmente como pau-brasil,
ibirapitanga, ibirapiranga, ibirapita, muirapiranga, orabutã, brasileto,
paurosado e pau-de-pernambuco (CORRÊA, 1978).
Foi a primeira espécie arbórea a ser explorada comercialmente
(CORREIA, 2003). Sua exploração teve início quando Pedro Álvares
Cabral descobriu uma nova terra chamada inicialmente Santa Cruz, e
posteriormente Brasil devido a uma árvore de madeira vermelha que
florescia ao longo da linha costeira. O nome brasilium ou brasyll era a
denominação empregada para um tipo de corante vermelho-púrpura
brilhante, extraído de uma espécie arbórea asiática, Caesalpinia sappan
(DEPHILIPS, 1998), este corante, extraído durante a idade média era
A C
9
considerado exótico e muito caro, e seu transporte da Ásia para Europa
muito difícil (ARMSTRONG, 1994). A descoberta da nova espécie de
madeira vermelha na América do Sul, “árvore brasilia”, iniciou uma
intensa exploração, e entre os anos de 1501 e 1652 as florestas
brasileiras foram devastadas, e o pau-brasil levado para Europa
(SOUZA, 1945), acabando por levar a espécie para lista de plantas sob
alto risco de extinção (BRASIL, 1992).
Já no mercado europeu sua madeira de grande resistência era
utilizada na construção de móveis e de navios (FAUSTO 2002), e na
produção de arcos para instrumentos de corda (RIZZINI, 1971), porém,
sua principal utilidade foi, sem dúvida, na fabricação de tinta de
escrever e para tingimento de tecidos (AGUIAR; PINHO, 1986). Esta
coloração deve-se a brasileína (6a, 7-dihydro-3,6a, 10-trihydroxy-
benz[b]indeno[1,2-d]pyran-9(6H)-one (Zhao et al, 2006) (Figura 2)
pigmento de coloração vermelha, conhecido como brasileína (Figura 2),
que é obtida após a oxidação da brasilina [7,11b-
dihydrobenz[b]indeno[1,2-d]pyran-3,6a,9,10(6h)-tetrol] (OLIVEIRA e
cols., 2002; REZENDE e cols., 2004).
FIGURA 2 – Formula estrutural da brasilina e da brasileína.
Muitos químicos importantes se debruçaram sobre a matéria
corante do lenho do pau-brasil. Um dos pioneiros foi o francês Michel
Eugène Chevreul (1786-1889). William Henry Perkin (1838-1907), foi
outro que se dedicou ao estudo do corante do vegetal. Mas, coube a
Robert Robinson, Prêmio Nobel de Química de 1947, o privilégio de
Brasileína
10
chegar à estrutura química da substância responsável pela cor
vermelha do pau-brasil. Robinson, que foi estudante de Doutorado de
Perkin, em Manchester, investigou esta substância de 1906 a 1974
quando publicou seu último artigo sobre a brasilina, nome que deu à
substância extraída de C. echinata (PINTO, 2002).
2.1.2. Fitoquímico
Rezende e cols. (2004) em estudo de identificação dos
componentes químicos das flores e folhas do pau-brasil, encontrou o Ε-
beta-ocimeno como constituinte majoritário (57,2%) das flores, e o (Ε)-
3– hexeno- 1- ol (30,8%), como principal componente das folhas. Dessa
forma a classe de metabólitos mais bem representada foi a dos
compostos fenólicos. Isoprenóides são freqüentemente encontrados na
composição do aroma floral de diversas espécies, inclusive como
constituintes majoritários, este fato pode estar ligado à presença de
sinalizadores químicos específicos no processo de polinização
(REZENDE e cols, 2004). Derivados fenólicos C6-C3 e furanoditerpenos
são os metabólitos secundários mais observados em espécies do gênero
Caesalpinia (REZENDE e cols, 2004).
A análise das sementes do pau-brasil realizada por Oliveira e cols.
(2002) evidenciou a presença de pelo menos dois inibidores de tripsina
com massas moleculares de 19,5 e 10 kDa. A extração dos ramos do
vegetal revelou a presença de um diterpeno com esqueleto labdânico, o
ácido daniélico, anteriormente isolado de uma Caesalpineae africana
(SOUZA e cols, 2004).
O estudo fitoquímico da casca do vegetal demonstrou abundante
presença de taninos (SILVA, 2001). A investigação do lenho do vegetal
demonstrou a presença de ligninas, polímero de três álcoois: p-
coumaril, siringil e sinapil, este polímero está presente em 20-30% da
parede celular da madeira e lhe confere rigidez e durabilidade, e pode
ser responsável pelas propriedades vibracionais da madeira, explicando
seu emprego na fabricação de arcos de violino (FUKUSHIMA; FUZETO,
11
2003). Contudo, o principal constituinte do extrato bruto desta parte do
vegetal é sem dúvida a brasilina (OLIVEIRA e cols, 2002). Como
mencionado anteriormente a brasilina pode transformar-se em
brasileína através do contato com o ar ou com a luz, devido a um
processo de oxidação no qual a hidroxila da brasilina se torna um grupo
carbonila. Ambas pertencem à família dos homoflavonóides (XU;
YADAN, 1996), são compostos tetracíclicos com dois anéis aromáticos,
uma pirona, provavelmente originada da via do acetato, e um anel de
cinco membros procedente da via do ácido shiquímico (OLIVEIRA e cols,
2002).
Flavonóides constituem um grupo de substâncias naturais
originados nos vegetais, através dos aminoácidos fenilalanina, tirosina e
malonato (HARBONE, 1986). Sua estrutura básica é formada pelo
núcleo flavânico, constituído por quinze átomos de carbono distribuídos
em três anéis (C6-C3-C6). Existem naturalmente numa grande
variedade de alimentos de origem vegetal, presente em abundância no
grupo das angiospermas, fazendo parte integral da dieta humana
(YUNES; CALIXTO, 2001). Mais de 4.000 variedades destes compostos
fenólicos foram identificadas, muitos deles têm sido indicados por
possuir um amplo espectro de efeitos bioquímicos e farmacológicos (KIM
e cols., 1999; MATSUDA e cols, 2003). A quercertina, o kampferol e a
myricetina possuem efeito antimutagênico e anticancerígeno in vitro e in
vivo (HERTOG e cols., 1995). Estudos epidemiológicos apresentaram a
importância da ingestão de flavonóides na prevenção de doenças
cardíacas coronarianas, diminuindo a aterogênese (GROO; RAUEN,
1998). Vários outras atividades biológicas são conferidas a esta classe
de metabólitos, como ação antibacteriana, antifúngica, antiviral,
antiinflamatória, antiaalérgica e anticancerígena (MIDDLETON, 1998).
2.1.3. Farmacológico
Pouco se sabe da ação farmacológica do pau-brasil, alguns dados
da literatura relatam que a planta possui propriedades medicinais,
12
sendo o lenho adstringente, corroborante e secante, odontoálgico e
tônico (SILVA, 2001; XAVIER, 1995).
Em 2001, Alencar e cols. isolaram uma galactose/lactose ligada à
lecitina, das folhas do pau-brasil, a avaliação da atividade biológica do
composto evidenciou que a lecitina extraída da C. echinata é capaz de
induzir a migração de neutrófilos dependentes e independentes das
células residentes (macrófagos, mastócitos e linfócitos), apresentando,
desse modo, atividade pró-inflamatória. Estudos realizados na
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) demonstraram que o
extrato do cerne de C. echinata foi capaz de inibir o desenvolvimento de
câncer em 75,37% dos camundongos do experimento, bem como
impedir o desenvolvimento de microrganismos patogênicos, tais como E.
coli, P. mirabilis, P. vulgaris e B. cereus (Freire, 2004). A espécie também
apresentou potencial antifúngico, o extrato de seus ramos foi capaz de
inibir o crescimento de colônias de fungos da espécie Cladosporium
cladosporioides e C. sphaerospermum (SOUZA e cols, 2004).
Várias outras espécies do gênero Caesalpinia têm sido descritas
por apresentarem ações medicinais, muito embora no Brasil seu uso
não seja difundido em outros países já se conhece há bastante tempo
suas atividades e emprego no uso medicinal.
Em 2005, Rao e cols. apresentaram cinco novos flavonóides
isolados da C. pulcherrima com significativa capacidade de inibir
mediadores da inflamação. Gupta e cols. (2003) demonstraram que o
extrato metanólico das folhas da C. bonducella (EMCb) possui atividades
antiinflamatória, analgésica e antipirética. Um ano depois foi apontado
o potencial antitumoral do mesmo extrato (EMCb) contra o carcinoma
ascítico de Ehrlich em camundongos albinos Swiss. Este estudo
também demonstrou o potencial antioxidante do vegetal (GUPTA e cols.,
2004). A comunidade chinesa conhecida por sua medicina milenar
relata a espécie C. sappan por possuir atividade antioxidante (PAN
YINGMING, et al., 2004), além disso, é utilizada ainda como agente
antiinflamatório (HIKINO et al., 1977), hipocolestêmico (SAITOH e cols.,
1986), imunomodulatório (CHOI; MOON, 1977). Kim e cols. (2004)
13
avaliaram a atividade do extrato do lenho da C. sappan contra cepas
metaciclina-resitentes de Stafilococcus aureus obtendo inibição do
crescimento bacteriano em todas as amostras testadas. A pesquisa, em
busca de novos agentes antivirais, de Chiang e cols. (2003) revelou que
diferentes partes da C. pulcherrima apresentam forte atividade contra o
adenovírus (ADV-8) e herpesvírus (HSV).
Uma espécie nacional bastante estudada é a Caesalpinia ferrea,
em 1996, Carvalho e cols. analisando o extrato de seu fruto
comprovaram que o mesmo é detentor de atividade analgésica e
antiinflamatória. A espécie também é capaz de agir como regulador
positivo da hematopoiese, conforme estudos realizados por Queiroz e
cols. em 2001. Um ano depois Nakamura e cols. (2002), isolaram dois
constituintes, ácido gálico e metil galato, extraídos do fruto do vegetal,
que demonstraram possuir ação quimiopreventiva do câncer ao inibir a
ativação do vírus Epstein-Barr e o desenvolvimento do carcinoma
eptelial.
A brasilina, isolada da C. sappan, e também o maior constituinte
da C. echinata (OLIVEIRA e cols., 2002), tem ação hipoglicemiante em
animais de experimentação portadores de diabetes, efeito este
decorrente do aumento no metabolismo de glicose (MOON e cols.,
1993). Além disso, a brasilina demonstra também muitos outros efeitos
farmacológicos, incluindo atividade antimicrobiana (XU; LEE, 2004),
inibição da proteína quinase C e do receptor da insulina em estômago
de rato (KIM e cols., 1998); proteção da toxicidade induzida por BrCCl3
em cultura de hepatócitos (MOON et al., 1992). Em 2000, Xie e cols.
demonstraram que a vasodilatação induzida pela brasilina poderia ser
inibida pela NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), sugerindo que o
mecanismo de ação pelo qual o composto causa o relaxamento dos
vasos pode ser endotélio-dependente. Três anos após o estudo, Hu e
cols. (2003) confirmaram a veracidade do mecanismo de ação proposto.
A brasileína, exibe uma ação inotrópica positiva em tecido
cardíaco isolado, é capaz de inibir a atividade da Na+ K+-ATPase in vitro,
e apresenta atividade antioxidante tanto in vivo quanto in vitro (YAN e
14
cols., 2005). Zhao e cols. (2006) observaram que o eletrocardiograma
dos animais tratados com a substância não evidenciava arritmias
ventriculares, efeito comum do deslanosídeo, propondo que a brasileína
apresenta um menor efeito adverso e um índice terapêutico mais
elevado, mostrando-se superior aos glicosídeos cardíacos. Por
conseguinte, a brasileína, uma molécula com esqueleto não-esteroidal,
capaz de produzir aumento da contração do músculo cardíaco, através
da inibição da Na+,K+-ATPase, poderia gerar o desenvolvimento de novas
drogas. Além destes efeitos, a molécula constitui um importante
imunossupressor, sendo capaz de eliminar a resposta humoral bem
como a resposta celular, provavelmente, através da indução da
apoptose dos linfócito do timo e do baço dos camundongos, e da
inibição da proliferação linfocítica (MIN YE e cols., 2005).
2.3.4. Toxicológico
Desde tempos remotos as plantas vêm sendo utilizadas pela
medicina popular para o tratamento de várias doenças (REBECCA e
cols., 2002), e ao longo deste tempo desenvolveu-se a idéia de que estes
remédios são eficazes e seguros, isentos de efeitos colaterais, ou
qualquer tipo de toxicidade. Porém a planta medicinal é um xenobiótico
e, como todo corpo estranho, os produtos de sua biotransformação são
potencialmente tóxicos (LAPA e cols., 2000). Destarte, a idéia geral de
que as drogas vegetais são seguras e livre de efeitos colaterais é falsa
(DIMECH, 2003). De fato, não há razão para crer na inocuidade dos
vegetais, uma vez que desse reino são obtidas substâncias
extremamente tóxicas como a estricnina, digitoxina, tubocurarina,
cocaína, entre outras. (LAPA e cols., 2004). Por outro lado, segundos
estudos clínicos controlados, a incidência de efeitos colaterais é menor
com produtos fitoterápicos do que com drogas sintéticas (DREW;
MYERS, 1997).
A cultura popular brasileira apresenta o extrato etanólico do
lenho de pau-brasil como sendo capaz de interromper a gestação, este
15
efeito ainda não possui comprovação científica. Em nossa revisão de
literatura nos deparamos com a escassez de pesquisas que indicassem
o potencial tóxico deste vegetal.
2.2. Estudos toxicológicos pré-clínicos de plantas
medicinais
A toxicidade de uma substância pode ser definida como a
capacidade de causar dano grave ou morte a um dado organismo
(DRAIZE; WOODARD; CALVERY, 1944). Para que o dano ocorra é
necessário, em primeiro lugar, que o organismo seja exposto, em
segundo que este interaja com o agente intoxicante (PEÑA; CARTER;
AYALA-FIERRO, 2001).
De fato, toda substância pode ser considerada um agente tóxico,
esta condição irá depender das condições nas quais ocorrerá a
interação do agente químico com o organismo, como tempo e freqüência
de exposição, dose administrada ou absorvida, e via pela qual se deu a
administração (CASTRO, 1993).
Como discutido anteriormente a idéia de inocuidade dos
fitoterápicos é amplamente difundida, esta concepção tem resultado
numa série de acidentes por intoxicação ocasionados pela ingestão de
plantas como alimento ou como terapia para alguma doença. Nestes
casos a toxicidade pode ser resultante de altas doses ingeridas ou do
estado de conservação das plantas e formas de uso (RATES, 2001).
Deve-se ter em mente que uma planta medicinal ou fitoterápico não tem
somente efeitos imediatos relacionados à sua ingestão, mas que estes
podem se instalar a longo prazo e de forma assintomática, como os
carcinogênicos (HIRONO e colbs., 1978).
Os testes toxicológicos são realizados para se ter dados sobre as
condições em que as entidades químicas produzem efeitos tóxicos, qual
a natureza desses efeitos e quais os níveis seguros de exposição
(LOOMIS; HAYES, 1996).
16
Devido a questões legais e éticas os dados toxicológicos obtidos na
espécie humana são muito limitados (WHO, 1993). Dessa forma os
testes que visam indicar o grau de segurança a ser depositado em um
medicamento devem ser efetuados em uma etapa pré-clínica, onde são
utilizadas três espécies de mamíferos, sendo uma delas não roedora
(LAPA e cols, 2004).
No Brasil, as plantas medicinais são utilizadas em ambas as
áreas rural e urbana. Muitas são utilizadas de acordo com a tradição
popular, na forma de chás, decoctos, tinturas, etc., e menos
frequentemente como cápsulas e pílulas (MATOS, 1997; MENTZ;
SCHENKEL, 1989). Por considerar crítica a situação do mercado de
fitoterápicos no Brasil, a Secretária Nacional de Vigilância Sanitária, em
1995, estabeleceu uma série de regras para o registro dos
fitomedicamentos (Portaria n° 6 de 24.01.95, SVS-MS, Brasil, 1995a) e
para regulamentar a avaliação da toxicidade destes produtos (Portaria
n° 116 de 08.08.96, SVS-MS, Brasil, 1996).
Atualmente as regras, que norteiam os registros e alguns ensaios
de toxicidade aguda, subcrônica e crônica, com medicamentos
fitoterápicos, estão descritos na Resolução n° 90, de 16/03/2004
(Brasil, 2004).
2.2.1. Toxicidade aguda
Toxicidade aguda é definida como os efeitos adversos que ocorrem
dentro de um período curto após a administração de uma dose única ou
doses múltiplas administradas dentro de um período de 24 horas, tendo
como objetivo determinar a sintomatologia a curto prazo após a
administração de um composto, bem como o binômio dose-efeito letal,
que é estimada por um parâmetro denominado dose letal 50%, mais
conhecida como DL50 (BARROS ; DAVINO, 2003).
17
O teste da DL50 foi introduzido por J.W. Trevan em 1927,
atendendo a finalidade de estimar o potencial tóxico de substâncias
para uso humano tais como digitalis e insulina, ele sugeriu que se
considerasse como dose letal aquela que matasse 50% dos animais
injetados. Isto porque os valores em torno da DL50 variam menos que
aqueles ao redor da DL1 ou da DL99.
Este valor é um parâmetro estatístico onde o cálculo da dose letal
média seria obtido através de um gráfico, no qual se encontra nas
ordenadas a percentagem de animais mortos e nas abscissas as doses
empregadas, obtendo-se uma curva dose-resposta, representada,
teoricamente, por uma curva Gaussiana (BARROS; DAVINO, 2003;
BOTHAM, 2003; SCHLEDE et al, 2005).
Os ensaios de toxicidade aguda são comumente realizados em
camundongos e ratos, embora em certos casos também sejam utilizados
animais maiores, como coelhos e cães. Recomenda-se a mesma via de
administração utilizada no homem, sendo a via oral a mais comum
(KLAASSEN; AMDUR; DOULL, 1996).
2.3. Inflamação
Há cerca de 3500 anos a.C., foi encontrado um curioso símbolo
hieroglífico em um papiro egípcio, representado por um braseiro, um
pouco mais tarde, por volta de 2000 anos atrás, a civilização grega
utilizou o termo phlogosis enquanto os Romanos usaram a palavra
inflammation, todos possuíam o mesmo propósito, designar o fenômeno
atualmente conhecido como inflamação. O termo inflamação deriva do
latim eflamare que significa “atear fogo” (SIQUEIRA; DANTAS, 2000;
ALMEIDA; MENEZES, 2002).
Não obstante, foi um escritor romano do século I d.C., Aulus
Cornelius Celsus, o primeiro a citar os quatro sinais cardinais da
inflamação: rubor, calor, tumor e dor. Desde então esse processo tem
sido descrito de diversas maneiras. Functio laesa, ou perda de função,
18
foi o quinto sinal acrescentado posteriormente por Virchow
(MONTENEGRO; FRANCO, 1995).
Na Idade Média, pensava-se que a inflamação fosse ocasionada
por um acúmulo de calor advindo do coração, seguido por fluxo
sangüíneo, mucoso, e biliar; esta era a teoria da inflamação humoral.
Já no século XVIII esta idéia foi substituída pela teoria vascular
(ALMEIDA, MENEZES, 2002; SIQUEIRA, DANTAS, 2000). No final desta
época, o escocês John Hunter notou que a inflamação não se tratava de
uma doença, mas sim, uma resposta orgânica a uma agressão
(MONTENEGRO; FRANCO, 1995).
No século XIX com a descoberta das células, houve um grande
avanço no conceito da inflamação. Neste mesmo período o biólogo
russo, Eli Metchinikoff descobriu o processo da fagocitose. Julius
Cohnhein foi o primeiro a utilizar microscópio para visualizar vasos
sangüíneos em tecidos inflamados, subseqüentemente a inflamação
passou a ser vista como sendo precedida por uma injúria celular ou
tecidual, e que este processo envolvia modificações no leito vascular,
incluindo migração de leucócitos como evento secundário (BOGLIOLO,
1976; COLLINS, 2000; MOVAT, 1971). Este movimento dos leucócitos
do leito para a periferia vascular é chamado de rolagem (“roleux”)
(CHIEN, 1982).
A inflamação é fundamentalmente uma resposta protetora cujo
objetivo final é livrar o organismo da causa inicial da lesão celular e das
conseqüências dessa lesão (COLLINS, 2000).
A capacidade de gerar uma inflamação é fundamental para
sobrevivência e consiste na primeira linha de defesa do organismo. Seu
objetivo é basicamente, localizar a região afetada, eliminar o agente
agressor e remover os tecidos degenerados, preparando a região
acometida para a reparação. Entretanto, em algumas situações e
doenças, a resposta inflamatória torna-se exagerada, persistindo sem
qualquer benefício aparente (SILVA; CARVALHO, 2004; SIQUEIRA;
DANTAS, 2000;).
19
Os eventos inflamatórios envolvem mudanças microvasculares
com aumento da permeabilidade vascular, fluxo exudativo, que inclui
proteínas plasmáticas, e amplificação de mediadores químicos
endógenos (CIRINO, 1998).
Thomas Lewis definiu o conceito de que substâncias químicas,
como a histamina, são mediadores das alterações vasculares da
inflamação. Estes mediadores químicos são responsáveis pelo controle
da intensidade da resposta inflamatória, assim como por seu
desencadeamento. Podem ser detectados no plasma sob forma de pré-
enzimas estocados no interior de células ou ser sintetizados durante o
processo inflamatório (COLLINS, 2000; MONTENEGRO; FRANCO,
1995).
As duas aminas, histamina e serotonina (5-HT), são
especialmente importantes porque estão disponíveis em reservas pré-
formadas; estão entre os primeiros mediadores a serem liberados. Estas
liberações ocorrem através da desgranulação de mastócitos, basófilos e
plaquetas. A histamina induz rapidamente a liberação de selectina-P
(TONNEL e cols., 1996) que vai determinar o rolamento de leucócitos,
dando inicio ao processo de migração. Diversos fenômenos da resposta
inflamatória são mediados por três fatores derivados do plasma e inter-
relacionados: os sistemas do complemento, da coagulação e das
cininas. Este último gera peptídeos vasoativos, resultando na liberação
final do nonapeptídeo bradicinina, responsável pelo aumento da
permeabilidade vascular na inflamação aguda com conseqüente
migração de células (polimorfonucleares) (COLLINS, 2000; DUGALD;
FRANCIS; WILLIAM, 1994).
De modo semelhante, quando as células são ativadas por
diferentes estímulos, os lipídeos das suas membranas são rapidamente
remodelados para gerar mediadores lipídicos biologicamente ativos que
servem como sinais intra e extracelulares. Estímulos mecânicos,
químicos, físicos e outros, são capazes de mobilizar fosfolipídeos das
membranas celulares, através da atuação de lipases do tipo fosfolipase
20
A2 (PLA2), liberando um ácido graxo de 20 carbonos denominado ácido
araquidônico (AA). Duas classes principais de enzimas: ciclooxigenases
(COX) e lipoxigenases (LIPOX) atuam sobre o AA, produzindo as
prostaglandinas (PGs) e tromboxanos (TXA), e os leucotrienos (LT) e
lipoxinas, respectivamente. (FOEGH; RAMWELL, 2003; COLLINS,
2000).
As prostaglandinas, tais como as prostaciclinas provocam
vasodilatação, inibição da agregação plaquetária e dor. Os tromboxanos
(A2) promovem a agregação plaquetária e vasoconstricção. Os
leucotrienos, gerados a partir da LIPOX são potentes agentes
quimiotáticos, ativam as respostas funcionais dos neutrófilos, como
agregação e aderência dos leucócitos ao endotélio venular, também são
potentes vasoconstrictores, promovendo broncoespasmos e aumento da
permeabilidade vascular (BRIGHMAN, 1989; PHILIPS, MURRAY,
CROCKER, 1995; STEWART, 1989).
A inflamação divide-se em padrões agudo e crônico. A resposta
em sua fase aguda, que ocorre no máximo em 72 horas, implica em
eventos exsudativo ou supurativo bem como eventos microvasculares e
celulares. A fase crônica inclui eventos proliferativos e alterações
histológicas, diferente da fase aguda, é caracterizada por migração
celular e mitose intensa, também nota-se a presença de fibroblastos,
angioblastos e a necrose tecidual. Seu tempo de duração é mais longo e
é decorrente da persistência do agente agressor, que não é eliminado
pelos mecanismos da inflamação aguda (SOSA e cols,, 1997;
MONTENEGRO; FRANCO, 1995).
O processo flogístico pode ser fisiológico ou patológico, por vezes
ele apresenta-se de maneira exacerbada e constante, quando se torna
deletéria para o tecido onde está atuando, é o caso das doenças auto-
imunes, como a artrite reumatóide, em que a inflamação crônica produz
dor e resulta em destruição do osso e da cartilagem, podendo causar
grave incapacidade. De acordo com Almeida e Menezes (2002) a
21
inflamação pode ser apontada como um importante agente causador de
morbidade e mortalidade humana.
2.3.1. Agentes Antiinflamatórios
Atuando em algumas das fases da resposta inflamatória, inibindo
a ação dos mediadores químicos, ou inativando os componentes do
sistema complemento, assim como, impedindo a ação e a resposta
celular; os fármacos portadores dessas ações consistem, atualmente,
em armas mais ou menos eficientes para controlar os múltiplos sinais e
sintomas desencadeados pela resposta inflamatória (MOTA, 1982).
No presente, o mecanismo de ação das drogas antiflogísticas foi
definido como sendo dependente da inibição das enzimas produtora do
ácido araquidônico, fosfolipase A2 (PLA2), caso dos antiflamatórios
esteroidais, ou impedindo a liberação de seus metabólitos, como
prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e outros, devido à
inativação da enzima ciclooxigenase (COX) (MYGIND, 1993; VANE;
BAKHLE; BOTTING, 1998). Além das diversas atividades terapêuticas
em comum, os agentes antiinflamatórios podem apresentar vários
efeitos colaterais. Vários estudos estão sendo realizados na tentativa de
descobrir novos medicamentos contra a inflamação, mais eficazes e com
menos efeitos colaterais (SILVA; CARVALHO, 2004).
Uma das primeiras substâncias consagradas por sua ação
antiinflamatória foi, sem dúvida, a salicina, um glicosídeo oriundo de
várias espécies de Salix e Populus (CLAUSS; TYLER, 1970), ela deu
origem a múltiplos compostos: os salicilatos, destacando-se o ácido
acetilsalicílico ou aspirina, obtido por acetilação do ácido salicílico. A
aspirina é um inibidor não-seletivo das duas isoformas da COX, esta
inibição é irreversível e ocorre devido à transferência do grupo acetil
para a proteína (FURST; MUNSTER, 2003).
22
Vários metabólitos secundários advindos dos vegetais tem sido
descritos por sua capacidade de inibir o processo inflamatório. Os
taninos têm sido repetidamente descritos por sua atividade
antiflogística, alguns deles foram ativos em testes in vitro envolvendo a
COX. Outros atuam por intervirem no mecanismo de reação
imunológica, é o caso dos triterpenos, sesquiterpenos e esteróides.
Os flavonóides, assim como o ácido salicílico, foram introduzidos
na terapêutica antes de serem testados sobre a atividade metabólica
das prostaglandinas (CARVALHO, 2004). Esta classe de compostos
apresenta ampla margem de segurança, não produzindo efeitos
colaterais tal como ulcerogenicidade (ALCARAZ; CARVALHO, 2004).
2.3.2. Testes Antiinflamatórios
Entre os muitos métodos utilizados para “screening” de drogas
antiinflamatórias, o edema de pata de rato, produzido por injeção de um
agente flogístico é o mais freqüente.
Este agente flogístico pode ser a carragenina, dextrana, kaolin,
etc. A carragenina é um polissacarídeo sulfatado extraído de uma alga
marinha, Chondrus chrispus (DAYRENS et al, 1980). O edema induzido
pela carragenina é capaz de demonstrar o papel dos leucócitos no
desenvolvimento da reação inflamatória aguda (GARCIA LEME, 1977).
O método descrito por Winter et al, 1962, utiliza a carragenina
como agente edematogênico, a formação do edema tem sido descrita
como um evento bifásico com vários mediadores atuando em seqüência
para produzir a resposta inflamatória (VINEGAR; SCHEIRBER; HUGO,
1969). A fase inicial (0-1h) tem sido atribuída à liberação de histamina,
serotonina e bradicinina, a fase seguinte (1-6h) tem sido correlacionada
com a elevada produção de prostaglandinas (DI ROSA; GIROUD;
WILLOUGHBY, 1971) e com a ativação da COX-2 (SEIBERT e cols.,
1994). A ativação e infiltração local dos neutrófilos também contribuem
23
para a formação da resposta inflamatória (BOUGHTON-SMITH e cols.,
1993; VINEGAR; TRUAX; SELPH, 1973), produzindo vários outros
mediadores com radicais livres derivados do oxigênio e radicais
hidroxilas (LIMA, 1999).
2.4. Câncer
Os primeiros relatos da ocorrência de câncer em seres humanos
foram encontrados nos papiros do Egito antigo por volta de 1500 a.C., e
são referentes à descrição de úlceras cutâneas resistentes a
tratamentos (COWDRY, 1955). O médico e filósofo grego Hipócrates de
Cós, 460 a 375 a.C., descreveu algumas das diversas manifestações
clínicas do câncer (FLOREY, 1977). No ano 150 da nossa era, Galeno
propôs um sistema de classificação para os tumores que os dividia em
benignos e malignos, e estes como fenômenos “contrários à natureza”
(COWDRY, 1955). Além do sistema de classificação, Galeno foi o
primeiro a empregar o termo câncer (do latim karkinos = caranguejo), ao
descrever um tumor maligno de mama. O órgão apresentava as veias
superficiais túrgidas e ramificadas, lembrando patas de caranguejo
(FILHO, 2000).
Segundo Baracat e cols. (2000) o câncer consiste em uma
proliferação local de clones celulares atípicos cuja reprodução foge ao
controle normal, e que tendem para um tipo de crescimento autônomo e
progressivo, e para a perda de diferenciação. Tal autonomia celular se
deve, basicamente, as alterações genéticas encontradas nestas células.
A capacidade de invadir tecidos, assim como de migrar pelo organismo
provocando metástase, sem dúvida alguma, são as grandes
responsáveis por levar o individuo a óbito.
Admitia-se, até o inicio do século XIX, que o câncer ocorria em
seres humanos, entretanto a natureza desse processo ainda era uma
incógnita, não se sabia se era de origem celular ou infecciosa (DUNN,
24
1962). Este questionamento só seria elucidado em 1838, quando
Johannes Muller demonstrou que os tumores eram constituídos por
células, a partir de então, passou-se a estudá-los também sob o ponto
de vista histológico (DAGLI, 1989).
Em 1858, o veterinário Leblanc apresentou evidências da
existência de neoplasias em animais, e que estes eram semelhantes as
dos humanos (DAGLI, 1989). Quarenta e seis anos após, Bashford e
Muray (1904) estabeleceram que as neoplasias eram processos que se
desenvolviam em animais selvagens e domésticos, provavelmente
presente em todos os vertebrados. Hoje se sabe que tais processos estão
presentes não só em vertebrados, mas também em cefalocordados,
urocordados, hemicordados e em inúmeras espécies de invertebrados
(DAGLI, 1989). Indo mais além, o câncer é um fenômeno onipresente
em todos os organismos pluricelulares (EVAN, 1992) tanto de origem
animal quanto vegetal.
2.4.1. Carcinogênese
As neoplasias, tanto benignas quanto malignas, são doenças
genéticas cujas mutações que lhes dão origem podem ser
hereditariamente transmitidas pela linhagem germinativa ou adquiridas
nos tecidos somáticos (ISSELBACHER, 1995). Resultam de uma
mudança pleiotrópica do estado celular a partir do acúmulo de
alterações genéticas e epigenéticas, que desorganizam os eventos
celulares normais (JONES; LAIRD, 1999; KAWAMURA, 1999).
Com base em estudos experimentais realizados em roedores a
carcinogênese consiste em um processo de múltiplas etapas, que tem
sido tradicionalmente dividido em três estágios: iniciação (Fig. 3),
promoção (Fig. 4) e progressão (Fig. 5) (HARRIS, 1991; HURSTING e
cols., 1999; TENNANT e cols., 1997).
A iniciação resulta da exposição de uma população de células a
uma dose apropriada de agente carcinogênico (iniciador), que pode ser
25
químico, físico ou biológico (vírus), o DNA danificado produz mutações
genéticas tornando-se apropriada a originar um tumor (JAKÓBISIAK;
LASEK; GOLAB, 2003). Entretanto somente esta etapa não é suficiente
para formação de tumor, para que este processo se estabeleça é
necessário que as células alteradas por carcinógenos sofram pelo menos
um ciclo de proliferação, de modo que a alteração no DNA se torne fixa
ou permanente (CONTRAN, KUMAR; COLLINS, 2000).
Figura 3 – INICIAÇÃO: dano ao DNA; indução de mutação em genes alvos críticos; ativação de protooncogenes; inativação de genes supressores de tumor; replicação celular e fixação da mutação.
A promoção é o segundo estágio da carcinogênese, pode ser
definida como um processo de expansão clonal de células iniciadas que
resultam na formação de células pré-neoplásicas produzindo nódulos,
pólipos ou papilomas (JAKÓBISIAK; LASEK; GOLAB, 2003).
Figura 4 – PROMOÇÃO: expansão clonal de células tronco; desenvolvimento de tumor benigno (células pré-neoplásicas).
O estágio de progressão é caracterizado pela transformação de
células pré-neoplásicas em tumor maligno invadindo tecidos vizinhos e
formando metástases (JAKÓBISIAK; LASEK; GOLAB, 2003). Nesse
estágio o câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das
Promoção
Danos ao DNA
26
primeiras manifestações clínicas da doença. (CONTRAN, KUMAR;
COLLINS, 2000).
Figura 5 – PROGRESSÃO: expressão enzimática alterada; proteólise; adesão; invasão; migração e metástase.
2.4.2. Carcinoma
As neoplasias malignas que se originam de células epiteliais,
derivadas de qualquer uma das três camadas germinativas, são
denominadas carcinomas (CONTRAN, KUMAR; COLLINS, 2000).
O tumor de Ehrlich, introduzido por Paul Ehrlich em 1896, e
descrito em 1906. Trata-se de neoplasia originária de carcinoma
mamário de camundongos fêmeas, transplantada inicialmente na forma
sólida. Somente em 1932, com Lowenthal e Jahn, foi convertido para
forma ascítica, através da passagem seriada de fluído ascítico de
animais inoculados intraperitonealmente com células tumorais (DAGLI,
1989).
Pode-se dizer que o carcinoma de Ehrlich, por ser um dos
primeiros tumores transplantáveis conhecido, é um dos mais
extensamente utilizados para experimentação (DAGLI, 1989).
2.4.3. Sarcoma
Refere-se a neoplasias malignas do tecido mesenquimal, a palavra
deriva do grego sar que significa carnoso, visto que possuem pouco
Progressão
27
estroma de tecido conjuntivo e, portanto, são carnosos (CONTRAN,
KUMAR; COLLINS, 2000).
O sarcoma 180, a princípio conhecido como tumor de Crocker, é
um tumor indiferenciado, foi descoberto em 1914 no Godcer Laboratory
(Columbia University, NY). Foi encontrado inicialmente como uma
massa sólida localizada na região axilar de um camundongo albino
(SUGIURA, 1965).
No ínicio foi classificado como carcinoma mamário, mas após
vários transplantes subcutâneos, observou-se que suas características
morfológicas e seu comportamento eram peculiares de um tumor
sarcomatoso, passando, então a ser chamado Sarcoma 180 (1919),
desde então sua nomenclatura não sofreu alterações (SUGIURA, 1994).
Suas células são de fácil obtenção, sendo utilizadas em vários
centros de pesquisa e, após a inoculação o tumor desenvolve-se em 90 a
100% dos casos (BUCHI, 2002).
2.4.4. Produtos Naturais e a Terapia Anticâncer
O câncer hoje constitui uma das principais causas de óbito da
humanidade, atualmente morrem no mundo cerca de 7 milhões de
pessoas, por ano (BOIK, 1996). Embora exista atualmente um vasto
arsenal terapêutico, somado a novas técnicas cirúrgicas, que tem
aumentado a expectativa de vida dos pacientes, ainda existe a clara
necessidade de continuar o desenvolvimento de novas drogas
anticâncer.
Os agentes anticâncer em uso atualmente incluem drogas de
origem microbiana como Doxorubicina, Dactomicina, Bleomicina
(MUKHERJEE e cols., 2001), e um grande número de moléculas
retiradas de vegetais, entre estas se encontram os alcalóides da vinca:
vimblastina e da vincristina, obtidos da Catharanthus roseus, o taxol
(paclitaxel) diterpenóide retirado da Taxus brvifolia, o alcaóide
28
camptotecina, da árvore ornamental chinesa Camptotheca acuminata, e
muitos outros (MONGELLI; COUSSIO; CICCIA, 2005).
Desde 1955 o Instituto Nacional do Câncer (NCI) dos Estados
Unidos vem realizando triagens pré-clinicas de compostos e materiais,
que incluem extratos de origem natural. Mais de 400.000 compostos, de
origem sintética e natural foram testados para avaliar atividade
anticâncer, incluindo 180.000 derivados de microorganismos e 114.000
extratos vegetais. Entre os anos de 1990 e 1996, aproximadamente,
vinte agentes anticancerígenos, os quais incluem produtos naturais
puros ou modificações semi-sintéticas de material natural, foram
aprovados para o mercado. Entre eles estão o Docetaxel/Taxotere
(1995), Idarubicina (1990), Paclitaxel/Taxol (1993), Topotecan (1996),
Formestano (1993), Fosfato de Fludarabina (1991), Porfimer sodium
(1993), Raltitrexed (1996), muitos destes de origem vegetal
(MUKHERJEE e cols., 2003).
A fitoterapia tem desenvolvido, freqüentemente, importante papel
na terapia anticâncer e os mecanismos de interação entre fitocompostos
e células neoplásicas vem sendo extensivamente estudado
(MUKHERJEE e cols., 2001). Atualmente uma grande quantidade de
laboratórios internacionais se encontra engajados na tarefa de buscar
novos agentes terapêuticos anticancerígenos a partir de fontes naturais
(BOYD; PAULL, 1995).
2.5. Agentes Antimicrobianos
O homem convive com microrganismos desde seu aparecimento
na Terra. A possibilidade da existência de entidades vivas invisíveis ao
olho humano e que seriam a causa das doenças infecciosas remonta à
Antiguidade.
Hipócrates, médico grego, estabeleceu alguns conceitos de doença
que influenciaram a prática até a Idade Média e vários conceitos sobre
as doenças infecciosas ainda datavam da era a. C. No século XVI, o
29
monge e médico italiano Girolamo Fracastoro (1483-1553) publica o
livro "De contagione et contagionis" no qual especulava que doenças
contagiosas eram causadas por "germes vivos" que se transmitiam, de
alguma forma, de pessoa a pessoa. Entre os séculos XVII e XVIII, foram
descritos os primeiros relatos da observação de seres microscópicos.
Mas foi no século XIX, com estudos de pesquisadores eminentes como o
químico francês Louis Pasteur (1822-1895) e o médico alemão Robert
Koch (1834-1910) que o estudo dos microorganismos teve real avanço.
Neste período já se admitia a ligação destes seres com o aparecimento
de várias moléstias, e era objetivo de vários estudiosos encontrar
maneiras de combatê-los (GREENWOOD, 1997).
O termo “antibiose” foi utilizado pela primeira vez por Vuillemin
em 1889, e era definida como o antagonismo dos seres vivos em geral.
Quase meio século depois, em 1942, Waksman utilizou a palavra
antibiótico definindo-a como substância, produzida por
microorganismos, antagonista ao desenvolvimento ou à vida de outros
microorganismos em altas diluições no meio bioquímico do nosso corpo
(GREENWOOD, 1997).
Os primeiros registros de tratamento bem sucedido contra
infecções datam do século XVII, quando se utilizou o extrato da
cinchona no tratamento da malária (CLARK, 1996), e a raiz de
ipecacuanha para cura da disenteria amebiana. Esta fase ficou
conhecida como era dos alcalóides, porquanto durante muito tempo
estes extratos formaram o único grupo de recursos terapêuticos
conhecidos (CHAMBERS; SANDE, 1996).
A segunda fase, conhecida como era dos compostos sintéticos, foi
marcada pela descoberta do salvarsan por Paul Ehrlich (Alemanha) em
1909 para o tratamento de tripanossomas e outros protozoários.
Alexander Fleming, em 1928, deu um grande passo ao descobrir
acidentalmente, uma nova substância, a partir de um fungo da espécie
Penicillium notatum, capaz de inibir o crescimento de bactérias, e que
mais tarde daria origem a mais utilizada classe de antibióticos: os β-
30
lactâmicos (MATELES, 1998). Alguns anos mais tarde, foi anunciada a
descoberta de um novo composto antibacteriano, as sulfonamidas,
sintetizada por Klarer e Meitzsch em 1932.
A terceira fase, conhecida como a era moderna dos antibióticos,
foi marcada pelo controle das infecções por estreptococos e
pneumococos com o uso da sulfonamidas. Porém no final da década de
40 surgiram os primeiros casos de resistência bacteriana, com isso
houve a necessidade de partir em busca de novos compostos ativos. Em
1944, Selman Waksman e seu aluno Albert Schatz, isolaram a
estreptomicina, primeira droga efetiva contra o Mycobacterium
tuberculosis, causador da tuberculose, a partir de uma cepa de
Streptomyces griseus (NEWMAN,; CRAGG; SNADER, 2000). Brotzu, em
1948, investigando a espécie fúngica Cephalosporium acremonium,
conseguiu isolar o terceiro antibiótico conhecido: cefalosporina C,
estável na presença da penicilinase.
A descoberta e o uso de antibióticos consistiram em uma das
maiores realizações da ciência no século XX. Durante a “época de ouro”,
período que compreende de 1945 a 1970, um grande número de
estruturas, altamente eficazes, foi descoberto ou desenvolvido (GALE e
cols., 1981). Neste período as infecções bacterianas foram consideradas
contidas, e algumas foram tidas como erradicadas, é o caso do cólera e
da sífilis (NEU, 1992). Entretanto durante a década de 80 houve um
decréscimo no número de novos agentes antibacterianos introduzidos
na clínica (CULOTTA, 1994; OMURA, 1992). Neste mesmo período, com
a redução taxa de introdução de novos agentes, houve um alarmante
aumento da resistência bacteriana às drogas existentes, resultando em
uma séria ameaça para a saúde pública global (COHEN, 1992; NEU,
1992; KUNIN, 1993).
O problema da resistência bacteriana demanda que novos
esforços sejam empregados na procura de novos agentes contra as
bactérias patogênicas resistentes aos antibióticos atualmente em uso.
31
FA bu}xà|äÉáFA bu}xà|äÉáFA bu}xà|äÉáFA bu}xà|äÉá
32
3. OBJETIVO
3.1. Geral
Contribuir para o estudo toxicológico e farmacológico da espécie
Caesalpinia echinata Lam.
3.2. Específico
Realizar a classificação botânica do vegetal
Verificar a presença dos diversos grupos fitoquímicos no extrato
etanólico (EE) do vegetal.
Estimar o valor de DL50 em camundongos por via oral e intraperitoneal.
Investigar o efeito do extrato etanólico (EE) da Caesalpinia echinata em
modelo de inflamação.
Determinar o efeito da administração do EECe, quanto à inibição de
neoplasias malignas (Carcinoma de Ehrlich e sarcoma 180), em
camundongos.
Estudar as alterações morfológicas nos tecidos dos órgãos de animais
tratados com extrato etanólico de C. echinata.
Avaliar o efeito inibitório do EE da C. echinata sobre o crescimento de
cepas bacterianas e fúngicas.
33
GA cxÜy|GA cxÜy|GA cxÜy|GA cxÜy|Ä Ä Ä Ä Y|àÉÖâ•Å|vÉY|àÉÖâ•Å|vÉY|àÉÖâ•Å|vÉY|àÉÖâ•Å|vÉ
34
Perfil fitoquímico do cerne de Caesalpinia echinata Lam.
Introdução
Caesalpinia echinata Lam., é uma espécie arbórea nativa das
partes mais secas da floresta pluvial atlântica ocorrendo desde o Rio de
Janeiro até o Ceará (REZENDE e cols., 2004). Conhecida vulgarmente
como pau-brasil, é uma árvore ornamental, própria para arborização
urbana, mas de crescimento muito lento. O odor floral é intenso e
agradável, geralmente floresce nos meses de janeiro a fevereiro
(CORRÊA, 1984). Foi a primeira espécie brasileira a ser comercializada
em larga escala, possuindo grande importância econômica no período
de colonização, notadamente devido a um corante existente em sua
madeira que era utilizado no tingimento de tecidos (GIUDICE-NETO e
cols., 2004).
Em suas flores já foram descritos a presença de terpenos, sendo o
Ε-beta-ocimeno seu constituinte majoritário, e alguns compostos
nitrogenados como o indol e o antranilato de metila (REZENDE e cols.,
2004). As cascas do vegetal, com abundante presença de taninos
(SILVA, 2001), são úteis na cicatrização de feridas. Seu cerne, muito
duro, pesado e de grande resistência era utilizado na construção de
móveis e de navios (FAUSTO, 2002), e na produção de arcos para
instrumentos de corda (RIZZINI, 1971), varia de coloração castanho-
alaranjado ao vermelho escuro (CORRÊA, 1984). Dele se extrai a
substância conhecida por brasilina, um homoflavonóide formado por
dois anéis aromáticos, uma pirona e um anel de cinco membros. Entre
suas propriedades farmacológicas podemos citar sua ação
hipoglicemiante (MOON e cols., 1993), como inibidor da peroxidação
lipídica (MOON e cols., 1992) e imunomodulador (CHOI; MOON, 1997),
algumas delas resultantes do poder antioxidante do seu núcleo
catecólico (REZENDE e cols., 2004). Derivado por oxidação da brasilina
temos a brasileína, igualmente um homoflavonóide, conhecido por sua
capacidade imunomoduladora (MIN YE e cols., 2005), antioxidante e por
35
exibir uma ação inotrópica positiva em tecido cardíaco isolado (YAN e
cols., 2005).
O presente trabalho compreende um perfil fitoquímico do cerne
de Caesalpinia echinata através do emprego de cromatografia em
camada delgada empregando reveladores específicos para cada classe
de metabólitos. Isto se torna imprescindível como abordagem
introdutória a estudos mais aprofundados tais como: isolamento e
caracterização de moléculas, definição de extratos ou frações para
ensaios farmacológicos.
Materiais e Método
2.1. Local de Trabalho
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de
Farmacognosia do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro
de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco.
2.2. Identificação do Material Botânico
A exsicata da espécie vegetal foi identificada pela Drª. Marlene
Barbosa, botânica do Herbarium Geraldo Mariz, UFPE, e armazenada
neste herbarium sob número 41.764.
2.3. Obtenção do Material Botânico
O material vegetal foi coletado no campus da UFPE,
compreendendo cerne que foi seco em estufa com circulação de ar
(45°C) durante 24 horas. Para a execução dos ensaios fitoquímicos
cerca de 5 g do cerne pulverizado foram submetidos à infusão
metanólica durante 30 minutos. Alíquotas deste extrato (10 µL) foram
submetidas a cromatografia em camada delgada analítica (CCDA),
empregando-se como fase estacionária placas cromatográficas prontas
36
de gel de sílica (Merck-Alemanha, art. 105554), diversas fases móveis e
reveladores consoante a classe de compostos a analisar (Tabela 1).
Esta investigação fitoquímica coloca em evidências os principais
tipos de metabólitos secundários: alcalóides, terpenóides
(monoterpenóides, sesquiterpenóides diterpenóides, triterpenóides,
esteróides, iridóides, saponósidos), e polifenóis (cumarinas, derivados
cinâmicos, fenilpropanoglicosídeos, flavonóides, proantocianidinas).
Tabela 1 – Metabólitos, sistemas de eluição, reveladores e referências bibliográficas utilizadas para a investigação fitoquímica de Caesalpinia echinata Lam.
METABÓLITO SISTEMA DE ELUIÇÃO REVELADOR REFERÊNCIA
Alcalóides AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 11: 11: 26 v/v Dragendorf Wagner (1996)
monoterpenóides,
sesquiterpenóides e
diterpenóides
Tolueno-AcOEt
97 : 3
Vanilina
Sulfúrica Wagner (1996)
triterpenóides,
esteróides
Tolueno-AcOEt
90 : 12
Libermann-
Burchard Wagner (1996)
Iridóides AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 11: 11: 26 v/v
Vanilina
Sulfúrica
Harborne
(1998)
Saponinas - Afrogenicidade
Schenkel,
Gosmann,
Athayde (2000)
Cumarinas AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 11: 11: 26 v/v U.V. Wagner (1996)
Derivados Cinâmicos AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 11: 11: 26 v/v NEU Wagner (1996)
Fenilpropanoglicosídeos AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 11: 11: 26 v/v NEU Wagner (1996)
Flavonóides
AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 2: 2: 2 v/v e
AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 3: 3: 3 v/v
NEU
Markham
(1982)
Harborne
(1998)
Proantocianidinas
condensadas e
Leucoantocianidinas
AcOEt–HCOOH–AcOH-H2O
100 : 11: 11: 26 v/v
Vanilina
clorídrica
Robertson
(1956)
37
Resultados
Conforme demonstrado na tabela 2, a abordagem fitoquímica da
espécie C. echinata Lam. realizada com extrato metanólico bruto (EMB)
do cerne do vegetal, indicou a marcante presença de flavonóides.
Cumarinas e taninos catéquicos estiveram presentes em quantidades
muitos pequenas.
Tabela 2 - Metabólitos encontrados no EMB do cerne de Caesalpinia echinata Lam.
METABÓLITOS EMB
Alcalóides -
monoterpenóides, sesquiterpenóides e
diterpenóides -
triterpenóides, esteróides -
Iridóides -
Saponinas -
Glicosídeos Cardíacos -
Cumarinas +
Derivados Cinâmicos -
Fenilpropanoglicosídeos -
Flavonóides +++
Proantocianidinas condensadas e
Leucoantocianidinas +
Expressão dos resultados: (+) = positivo; (-) = negativo; (+++) = fortemente positivo.
Discussão
A presença de polifenóis está de acordo com os dados obtidos na
literatura, que aponta os derivados fenólicos C6-C3 como os metabólitos
mais observados em espécies do gênero Caesalpinia (REZENDE e cols.,
2004). Entre os metabólitos encontrados destaca-se a classe dos
flavonóides como constituinte majoritário deste extrato. Esta é
conhecida por suas inúmeras propriedades medicinais, destacando-se
seu poder antioxidante (BOHM e cols., 1998; GROOT; RAUEN, 1998);
38
antiinflamatório; (FERRANDIZ; ALCARAZ, 1991); antitrombótico
(PIETTA, 2000); antimicrobiano (RUSSO e cols., 2000); antialérgico
(RUSSO e cols., 2000); antitumoral (HIRONO, 1987); antiasmático
(HIRONO, 1987) e inibidor de enzimas como a transcriptase reversa,
proteína quinase C, tirosina quinase C, calmodulina, ornitina
decarboxilase, hexoquinase, aldol redutase, fosfolipase C e
topoisomerase II (GROOT; RAUEN, 1998; FORMICA ; REGELSON;
OLIVEIRA, 1995).
Oliveira et al (2002) apontou a brasilina e seu derivado brasileína,
como constituintes majoritários do cerne de C. echinata, ambos
homoflavonóides, ratificando os resultados encontrados em nosso
estudo.
39
Referências Bibliográficas
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41
HA TÜà|zÉ HA TÜà|zÉ HA TÜà|zÉ HA TÜà|zÉ I Artigo a ser submetido ao Journal of Ethnopharmacology.
42
Avaliação da toxicidade aguda e determinação da CL50 e da DL50 do extrato etanólico bruto de Caesalpinia echinata
Lam. (Fabaceae/Caesalpinioideae).
Elisangela C.B. Silvaa*; Aldo César P. Silvaa; Karen P. S. Cavalcantib; Antônio Camarottic; Arquimedes F. M. Meloa; Jane S. Higinoa; Ivone A.
de Souzad.
a Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco –
UFPE. Recife-PE, Brasil.
b Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. Recife-PE,
Brasil.
c Universidade Católica de Pernambuco – UNICAP. Recife-PE, Brasil.
d Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. Recife-PE, Brasil.
Resumo
O extrato etanólico bruto do cerne de Caesalpinia echinata Lam., família Fabaceae-Caesalpinioideae, foi avaliado quanto a suas propriedades tóxicas através de dois bioensaios. Inicialmente avaliou-se a concentração letal 50% (CL50) em larvas de Artemia salina, em seguida determinou-se a dose letal 50% (DL50) em camundongos albinos Swiss, utilizando duas vias de administração: via oral (V.O.) e via intraperitoneal (V.I.P.). A CL50 encontrada foi de 705,615 µg/mL. O estudo da toxicidade aguda apontou uma DL50 de 995,57 mg/Kg quando administrado por via intraperitoneal, enquanto a via oral não apresentou óbito até a dose de 4g/Kg. Dos resultados obtidos pode-se verificar que o extrato etanólico do cerne de C. echinata possui toxicidade moderada quando utilizada por via parenteral, não obstante quando se emprega uma via enteral sua toxicidade torna-se pouco pronunciada.
Palavras-chave: Caesalpinia echinata Lam.; pau-brasil;; Leguminosae-
Caesalpinioideae, toxicidade aguda, DL50, CL50.
*Contato com o autor: Email: [email protected] Tel: (81) 3429-1887 Fax: (81) 2126-8510
43
Abstract The crude ethanolic extract of Caesalpinia echinata Lam.’s heartwood that belongs to the Fabaceae-Caesalpinioideae family, was been evaluated for its toxic properties as two differents bioassays. In the first part, the clinical trials were determined by lethal concentration 50% (LC50) in Artemia salina’s larvae. After this, the lethal dose 50% (LD50) was made in albino Swiss mice and used two way bioassays: oral via (V.O.) and intraperitoneal injection (.I.P.). The LC50 was 705, 615 µg/mL. The acute toxicity study of LD50 made by IP was 995, 57 mg/kg while the oral via did not present death until the dose of 4g/Kg. The present results indicated that the ethanolic extract of C. echinata’s heart-wood has moderate toxicity when used for parenteral via, in the other hand for a enteral via, its effect did not showed significant toxicity.
Keywords: Caesalpinia echinata Lam.; brazilwood; Leguminosae-Caesalpinioideae, acute toxicity; LD50, LC50.
1. Introdução
Sabe-se que desde a antiguidade o homem tem feito uso de ervas
e produtos naturais como remédio para várias doenças. Relatos de mais
de três mil anos a.C. mostraram que as mais antigas civilizações já
encontravam na natureza a cura de suas doenças. Recentemente
cientistas e profissionais da saúde demonstraram interesse no campo
da fitoterapia, reconhecendo a importância de seus benefícios para
saúde, e por representar um avanço na terapia medicamentosa, através
do descobrimento de novas moléculas com propriedades terapêuticas, e
lançando fármacos menos nocivos como alternativas para os já
existentes, melhorando assim, a qualidade de vida da população.
Embora exista uma crença popular de que produtos naturais não
possuem nenhum tipo de toxicidade, sabe-se, no entanto, que não
existe tal segurança na utilização destes produtos, por isso faz-se
necessário à avaliação de seus efeitos tóxicos. Nesta pesquisa foram
empregados dois bioensaios para avaliação da toxicidade do extrato
etanólico (EE) do cerne de C. echinata Lam.
No ensaio preliminar foi determinada a concentração letal 50%
(CL50), este ensaio tem como característica encontrar a toxicidade sobre
44
a Artemia salina e se destaca por ser um método que combina baixo
custo, rapidez, confiabilidade e simplicidade (Siqueira e cols., 2001). Em
seguida foi realizado o ensaio para determinação da toxicidade aguda,
que é definido como os efeitos adversos que ocorrem dentro de um
período curto após a administração de uma dose única ou doses
múltiplas administradas dentro de um período de 24 horas (Barros;
Davino, 2003). A investigação da toxicidade aguda tem por objetivo
determinar a sintomatologia em curto prazo após a administração de
um composto, bem como o binômio dose-efeito letal, que é estimada por
um parâmetro denominado dose letal 50%, mais conhecida como DL50
(Litchfield; Wilcoxon, 1949). O valor da DL50 é uma derivada estatística
definida como a dose capaz de causar efeito letal em 50 % dos animais
após uma administração aguda da substância, em ratos ou
camundongos.
A determinação da DL50 para o estudo de novos medicamentos é
um dos requisitos a ser atendido para avaliação tóxica de novos
fármacos (Melo, 2004), pois a partir dela é que poderemos verificar a
propedêutica utilizada na forma farmacêutica acabada.
Caesalpinia echinata Lam. (Fabaceae-Caesalpinioidae),
popularmente conhecida com pau-brasil, é uma espécie arbórea
característica da Mata Atlântica (Correa, 1931). O pau-brasil apresenta
propriedades medicinais, sendo o lenho adstringente, corroborante e
secante, odontálgico e tônico (Silva, 2001; Xavier, 1995).
Apesar de mais de 500 anos de uso pela humanidade, a avaliação
do potencial tóxico da Caesalpinia echinata é inexistente. Dessa forma,
este estudo visou analisar as propriedades tóxicas do vegetal através da
determinação da CL50, bem como caracterizar a relação dose/resposta
que conduz ao cálculo da DL50, em camundongos, quando administrado
pela via intraperitoneal.
2. Metodologia
2.1. Material Botânico
45
Amostras de diferentes partes de Caesalpinia echinata Lam. foram
coletadas no ano de 2004, no município de São Lourenço da Mata,
Brasil. A exsicata da espécie vegetal foi identificada pela botânica Drª.
Marlene Barbosa, e depositada no herbário Geraldo Mariz da
Universidade Federal de Pernambuco, sob número 41.764.
2.2. Obtenção do Extrato
O material botânico utilizado foi constituído pelo pó do lenho da
Caesalpinia echinata Lam. sob a forma de extrato etanólico (EE) obtido
após maceração, concentrado a secura em rotaevaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico.
2.3. Obtenção da CL50
Neste ensaio biológico foram utilizadas larvas de Artemia salina
Leach, obtidas a partir da incubação de cerca de 20 mg de cisto de
Artemia salina, sob luz artificial por 48 horas. Grupos de 10 a 13
metanáuplios foram expostos a diferentes concentrações (50 µg/mL a
1000 µg/mL) de extrato etanólico de C. echinata (EECe) e as
percentagens de mortalidade determinadas após 24 horas de contato.
Cada ensaio foi repetido três vezes. Os dados foram plotados em
gráficos e com isto foi interpolada a CL50.
2.4. Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss, Mus musculus,
adultos (25 e 30g), machos, provenientes do Biotério do Departamento
de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais
foram mantidos em gaiolas de polipropileno, sob condições controladas
de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro) e temperatura (25 + 2oC), e
livre acesso à água e alimento. O protocolo experimental foi aprovado
pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE,
46
processo n° 23076.014521/2005-89.
2.5. Avaliação da Toxicidade Aguda e Determinação da DL50
Grupos com seis animais (n=6/machos) foram privados de ração,
recebendo água ad libitum (25 + 3oC) por 12 horas, em seguida
receberam o EEB por via intraperitoneal, nas doses de 250 a 2000
mg/Kg, e por via oral nas doses de 250 a 4000 mg/Kg. Os
camundongos foram observados durante 48 horas após administração
do EEB. O número de óbitos durante o período de estudo foi anotado
para cada grupo, subseqüentemente o valor da DL50 foi calculado
segundo o método proposto por Karber e Behrens (1964).
3.0. Resultados
3.1. Determinação da CL50
A análise comportamental da Artemia salina Leach nas
concentrações de 750 µg/mL e 1000 µg/mL revelou uma diminuição na
sua movimentação em relação àquelas selecionadas no controle,
mostrando que a exposição às maiores taxas de concentração da
amostra de C. echinata tem influência sobre a movimentação do
organismo estudado.
Após 24 horas de exposição da A. salina Leach, observou-se que
houve moderado número de óbitos na maioria das concentrações
utilizadas da amostra de C. echinata.
Desta forma, através de todos os fatos observados foi comprovado
experimentalmente que a amostra selecionada apresentou valores de
CL50 na faixa de 705,6 µg/mL.
3.2. Toxicidade Aguda e Determinação da DL50
3.2.1. Administrado por Via Intraperitoneal
47
Como demonstrado na tabela 01, o tratamento com EEB de C.
echinata por via intraperitoneal (VIP), apresentou inúmeros sinais
clínicos de toxicidade, os mais pronunciados foram os das atividades
motoras.
Nos primeiros minutos os animais mostraram efeitos
estimulantes como movimentos circulares, reação de fuga, piloereção e
espasmos, logo em seguida começaram a apresentar distúrbios de
movimentação. Tremor, perda da coordenação motora, marcha ebriosa,
espasticidade, e hemiplegia (750 mg/kg) são alguns dos mais
freqüentes. Nas doses de 1500 e 2000 mg/kg permaneceram em estado
de catatonia. Convulsões parciais e generalizadas estiveram presentes
nas doses de 750, 1000 e 2000 mg/kg.
Seguidos aos distúrbios de locomoção foram detectados outros
sinais, dentre eles destacaram-se alterações visuais: fotofobia,
lacrimejamento, miose, irritação da conjuntiva (750 mg/kg) após 24 h.
Dentre os sinais respiratórios se destacam: dispnéia e apnéia nas doses
mais elevadas; na pele foi percebido edema e cianose, aqui vale destacar
o aparecimento de cianose testicular em pelo menos 70% dos animais
submetidos ao tratamento. Nos sinais gastrointestinais o que mais
chamou a atenção foi a brusca diminuição na excreção fecal e da
diurese, com total ausência em algumas doses (1000, 2000 mg/Kg),
contudo nas dose de 750 mg/kg, houve aparecimento de diarréia após
24h da administração. Espasmos e contorções abdominais também
foram verificados.
A taxa de mortalidade do EEB de C. echinata cresceu
progressivamente com o aumento da dose (gráfico 1): a taxa de
mortalidade de 0% com 600 mg/kg elevou-se gradualmente para 100%
com 2000 mg/kg, a maior dose estudada. A dose em que não foram
observados efeitos adversos (NOAEL) foi de 250 mg/kg, enquanto que a
menor dose que apresentou efeitos adversos (LOAEL) foi de 600 mg/ kg.
A partir dos dados encontrados, foi calculada a DL50, que resultou
em 995,57 mg/kg de peso do animal.
48
3.2.2. Administração por Via Oral
A análise por via oral demonstrou ação estimulante em todas as
doses averiguadas, os animais apresentaram sinais de intensa agitação,
com elevada deambulação, movimentos estereotipados e circulares,
tremores, saltos e convulsões (tabela 2).
Os efeitos depressores foram mais intensos a partir da dose de
200mg/kg. Pôde ser verificada, ainda, a diminuição da coordenação
motora, nas doses mais elevadas, bem como espasticidade. Outros
sinais, como irritação da conjuntiva e espasmos, também foram
visualizados (tabela 2).
Não foi verificado óbito em nenhuma das doses testadas até 4000
mg/kg.
Discussão e Conclusão
Caesalpinia echinata tem sido utilizada na medicina popular há
pelo menos 500 anos para o tratamento de várias doenças (Côrrea,
1978), apresentando inclusive, resultados promissores na pesquisa
contra o câncer (Silva, 2006). Entretanto, a literatura examinada
indicou que a sua toxicidade não havia sido avaliada. A avaliação da
toxicidade é essencial, nos casos em que o extrato é utilizado por
humanos, para o estabelecimento de uma dose segura (Balliga e cols,
2004).
As reações comportamentais observadas na administração do
EECe tanto por via oral quanto por via intraperitoneal, são
características de drogas que alteram o equilíbrio que existe entre as
vias inibitória e excitatória do SNC, visto que foi observado um período
inicial de estimulação seguido por uma fase depressiva. Efeito
semelhante pode ser observado durante o consumo de etanol. Estudos
realizados sobre o consumo agudo e crônico do etanol revelaram que o
mesmo é um depressor do SNC, exercendo seu efeito tanto pelo
49
aumento da neurotransmissão inibitória (GABA), quanto pelo
antagonismo da neurotransmissão excitatória (glutamina) (Fleming e
cols., 2001; Lee; Becker, 1989). Inicialmente, em doses mais baixas
percebe-se ligeira euforia, resultante da depressão dos sistemas
inibitórios. Com o aumento da dose observa-se depressão, diminuição
do equilíbrio, grande alteração motora e perda do controle físico
(Figueira, 2002).
O efeito inibitório sobre a atividade motora apresentada, tanto
em Artemia salina Leach, quanto nos camundongos, sugere a ação do
extrato em nível do sistema nervoso central. Os efeitos observados -
diminuição da motilidade, espasticidade, tremores, marcha ebriosa, etc.
– também podem ser decorrentes de uma ação depressora mediada por
um desequilíbrio na relação entre neurotransmissores responsáveis
pela regulação do movimento no córtex motor e no cerebelo.
De acordo com a DL50, baseados na classificação de
Schuartsman (1980) (tabela 3), o EE de C. echinata quando
administrado por via I.P., pode ser considerado moderadamente tóxico,
resultado corroborado com o valor da CL50 (705,61 µg/mL) obtido. Na
avaliação da DL50 por via oral, não verificamos óbito até a dose limite de
4000 mg/kg, indicando que quando administrado por esta via o EE
apresenta baixa toxicidade. Resultados semelhantes foram descritos por
Bacchi e cols. (1995), no estudo onde avaliou a ação antiulcerogênica e
a toxicidade do extrato hidroalcoólico de Styrax camporum e Caesalpinia
ferrea.
Esta ausência de letalidade pode estar relacionada aos
mecanismos farmacocinéticos de absorção e/ou biotransformação, que
possivelmente diminuíram os níveis séricos necessários para provocar
efeito letal nos indivíduos, no entanto sinais clínicos de toxicidade
foram observados.
A determinação de uma dose terapêutica segura é de suma
importância para o uso de uma droga. Através da DL50, é possível
calcular o índice terapêutico de uma substância, fornecendo alguma
idéia da margem de segurança no uso da mesma (Dale; Rang; Ritter,
50
2001).
A permanência dos sintomas após 24h da administração e o
aparecimento de novos efeitos adversos, demonstraram que a droga
possui reações cumulativas.
O presente estudo demonstrou que o extrato etanólico de C.
echinata Lam. apresentou uma toxicidade moderada quando utilizada
uma via parenteral. Na administração oral concluímos que o vegetal
possui toxicidade muito baixa. Esses dados nos fornecem um
parâmetro para o estabelecimento de uma margem terapêutica segura,
e nos permite a continuidade da pesquisa, agora na determinação da
atividade farmacológica do vegetal, a partir de novos protocolos
experimentais com perspectivas de novos resultados sugestivos para a
ampliação de atividades terapêuticas relevantes.
51
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53
TABELA 01 - Sinais clínicos da toxicidade observada em camundongos albinos swiss machos, tratados com diferentes doses do EE da C. echinata, por via intraperitoneal.
Dose (mg/Kg) Parâmetros 600 (D1) 700 750 1000 1500 2000 (D2)
Estimulantes
↑ Freqüência respiratória ++ ++ + - + + Agitação ++ ++ + ++ ++ +++ Piloereção +++ +++ +++ +++ +++ + Movimentos estereotipados + ++ + +++ +++ + Movimentos circulares ++ ++ + ++ +++ +++ Movimentos de vibrissas + + ++ + + +++ Convulsão - + - - + +++ Convulsão clônica + - - - - - Tremores finos/grosseiros +++ +++ +++ +++ +++ +++ Ereção de cauda ++ + + + + ++ Postura de ataque + + - - - - Saltos + - + +++ +++ - Irritabilidade - - - - - - Levantamento de trem posterior
- - - - - +
Arrastamento de trem posterior
+ ++ ++ +++ ++ ++
Depressores
Abaixamento de trem posterior
- - - - - -
Dispnéia + + ++ +++ +++ +++ Sonolência + - - - - + ↓ Freqüência respiratória + +++ +++ + + +++ Prostração - + ++ ++ ++ ++ Alteração de marcha + +++ +++ +++ +++ +++
Outros
Excreção fecal - + - + + - Contorções abdominais +++ ++ ++ ++ ++ - Reação de fuga ++ ++ + + + +++ Espasmos + ++ + + + - Elevação de trem anterior - - - - - - Diarréia - - - - - - Refluxo - + - + - - Palidez - + + ++ + - Distensão abdominal - - - - - - Agressividade - - - - - - Diurese ++ + - + + + Irritação da conjuntiva - - ++ ++ + + Espasticidade + +++ ++ +++ +++ +++ Cianose - ++ ++ ++ ++ +++ Edema de focinho - + + - - + Petéquias - - - - - -
- = sem efeito + = efeito leve ++ = efeito moderado +++ = efeito acentuado
54
TABELA 02 - Sinais clínicos da toxicidade observada em camundongos albinos swiss machos, tratados com diferentes doses do EE da C. echinata, por via oral.
Dose (mg/Kg) Parâmetros
250 500 1500 2000 3000 4000
Estimulantes ↑ Freqüência respiratória ++ ++ - + ++ - Agitação + +++ + ++ +++ ++ Piloereção ++ ++ ++ +++ +++ +++ Movimentos estereotipados ++ +++ +++ +++ +++ +++ Movimentos circulares ++ ++ - + ++ +++ Movimentos de vibrissas + + + ++ +++ Convulsão - - - + - - Convulsão clônica + - - + - - Tremores finos/grosseiros ++ +++ +++ +++ +++ +++ Ereção de cauda ++ + - +++ + +++ Postura de ataque ++ +++ ++ ++ ++ +++ Saltos - + - +++ ++ ++ Irritabilidade - - - - - - Levantamento de trem posterior
- - - - + ++
Arrastamento de trem posterior
- - + - - +
Depressores
Abaixamento de trem posterior
- - - ++ + +
Dispnéia + - - +++ + + Sonolência - - + - + ↓ Freqüência respiratória + + +++ +++ + +++ Prostração - - - + + ++ Alteração de marcha - + + ++ +++ +++
Outros
Excreção fecal - + - - + - Contorções abdominais - - - - - - Reação de fuga ++ +++ + +++ ++ ++ Espasmos + ++ ++ +++ ++ ++ Elevação de trem anterior - - - - - - Diarréia - - - - - - Refluxo - + + - + - Palidez - - - + + + Distensão abdominal - - - - - + Agressividade - - - - - - Diurese - + + - - - Irritação da conjuntiva + - + +++ ++ ++ Espasticidade - - - - - - Cianose - - - - - + Edema de focinho + - + - - - Petéquias - - - - - +
- = sem efeito + = efeito leve ++ = efeito moderado +++ = efeito acentuado
55
0%
20%
40%
60%
80%
100%
2,7 2,78 2,85 2,86 2,87 3 3,17 3,3
Log da Dose
Letalidade (%)
Gráfico 1- Curva Dose-Resposta da toxicidade da C. Echinata Lam.
TABELA 03 – Classificação da toxicidade relativa dos agentes químicos
de acordo com a DL50.
Grau de
toxicidade Categoria DL50 em ratos
6 Supertóxico < 5 mg/kg
5 Extremamente tóxico 5-50 mg/kg
4 Muito tóxico 50-500 mg/kg
3 Moderadamente tóxico 0,5-5 g/kg
2 Pouco tóxico 5-15 g/kg
1 Praticamente Atóxico > 15 g/kg
56
IA TÜà|zÉIA TÜà|zÉIA TÜà|zÉIA TÜà|zÉ II
Artigo a ser submetido ao Journal of Ethnopharmacology.
57
ESTUDO PRELIMINAR DA PROPRIEDADE ANTIIFLAMATÓRIA DO
EXTRATO BRUTO DE CAESAPINIA ECHINATA LAM.
(FABACEAE/CAESALPINIODEAE)
Elisangela C. B. Silvaa*, Aldo C. P. Silvaa, Laurimar T. Rochaª, Karen P. Cavalcantib, Ivone Antônia de Souzac
aDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco –
UFPE. Recife-PE, Brasil.
bHospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. Recife-PE,
Brasil.
cDepartamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco – UFRPE. Recife-PE, Brasil.
Resumo
A avaliação da atividade antiinflamatória do extrato etanólico do lenho
da C. echinata foi realizado em ratos Wistar adultos, de ambos os sexos
e por duas vias de administração. O método utilizado foi o edema de
pata induzido por carragenina, descrito por Winter et al. (1962). O
edema apresentou inibição significativa (p < 0,05) em todas as doses
administradas por via intraperitoneal para ambos os sexos; por outro
lado ao ser administrado por via oral não foi observada inibição
significativa.
Palavras-chave: Caesalpinia echinata Lam.; pau-brasil; atividade antiinflamatória;
Leguminosae-Caesalpinioideae.
*Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP:50.740-521 , Recife-PE, Brasil. Tel:(81) 34291887 Email: [email protected]
58
Abstract For examine the antiinflammatory activity of the C. echinata ‘s ethanolic extracts were studied in Wistar rats thus in male and female using two ways of administration. The method utilized was the paw edema induced by subcutaneous injection of carrageenian, described for Winter et al. (1962). Edema presented significant inhibition (p<0,05) in all the doses managed by intraperitoneal injection for both sexs; In comparison to the oral via it had not observed significant reduction in paw edema. Keywords: Caesalpinia echinata Lam.; brazilwood; anti-inflammatory activity; Leguminosae-Caesalpinioideae.
1. Introdução
A inflamação é uma resposta protetora imediata, ocorrendo nos
tecidos circunjacentes sempre que há uma lesão ou destruição celular.
O processo inflamatório envolve uma série de fenômenos que podem ser
desencadeados não só por agentes infecciosos, como também por
agentes físicos (radiação, queimaduras, traumas), químicos
(substâncias cáusticas), isquemia e interação antígeno-anticorpo. Cada
estímulo provoca um padrão característico de resposta que, apesar da
diversidade e complexidade dos mediadores químicos, apresenta
variação relativamente pequena (Silva; Carvalho, 2004).
A reação inflamatória em sua fase aguda é regida por uma série
de modificações nos mediadores intracelulares, verificando-se aumento
da liberação de citoquinas, espécies oxigenadas e nitrogenadas, e
eicosanóides (Rao; Fang; Tzeng, 2005).
A utilização de extratos herbais como alternativa ou
complementando a terapia tradicional das doenças inflamatórias é bem
documentada na Ayurveda, e vem sendo praticada a cerca de 5000 anos
(Dahanukar; Kulkarni; Rege, 2000). Hoje, um grande e heterogêneo
grupo de fármacos é conhecido por sua habilidade em deter os efeitos
lesivos da inflamação, contudo a busca por novas moléculas com efetivo
potencial antiinflamatório ainda não foi interrompida.
59
Caesalpinia echinata Lam. (Fabaceae-Caesalpinioideae), é uma
espécie arbórea endêmica brasileira típica da floresta ombrófila densa
(Giudice-Neto; Sebbenn; Kageyama, 2004). Intensamente explorada no
inicio da colonização deste país, devido a um pigmento rubro que pode
ser extraído de seu lenho. As informações das propriedades
antiinflamatórias do extrato do lenho do pau-brasil são inexistentes,
entretanto outras espécies do gênero já possuem atividade comprovada
(Rao; Fang; Tzeng, 2005; Gupta e cols., 2003; Carvalho e cols., 1996).
Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a ação do
extrato etanólico (EE) do cerne de Caesalpinia echinata na reversão da
fase aguda do processo inflamatório em roedores.
2. Metodologia
Animais
Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus, com três meses
de idade, de ambos os sexos, provenientes do Biotério do Departamento
de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais
receberam água e ração ad libitum e foram mantidos em condições
controles (ciclo 12h claro/escuro) e temperatura (25 ± 2°C). O protocolo
experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal (CEEA), UFPE, processo n° 23076.014521/2005-89.
Material Botânico
Amostras de Caesalpinia echinata Lam., foram coletadas foram
coletadas no ano de 2004, no município de São Lourenço da Mata,
Brasil. A exsicata da espécie vegetal foi identificada pela botânica Drª.
Marlene Barbosa, e depositada no herbário Geraldo Mariz da
Universidade Federal de Pernambuco, sob número 41.764.
Obtenção do extrato
60
Para obtenção do extrato, o cerne triturado de Caesalpinia
echinata Lam. foi submetido à maceração em solvente etanólico, em
seguida concentrado até a secura em rotaevaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico.
2.4. Edema de Pata Induzido por Carragenina
O edema foi induzido de acordo com o modelo descrito por Winter
e cols. (1962). A inflamação aguda foi obtida por administração
subplantar de 0,1 mL de solução de carragenina (0,1% p/v) na pata
posterior esquerda. O volume (mL) do edema induzido foi medido com
auxílio de um pletismômetro (Ugo Basile Itália Modelo 7150). A medição
foi realizada no momento anterior à indução e trinta minutos depois.
Após a administração das drogas, o volume da pata de cada animal
continuou sendo medido em intervalos constantes de uma hora por um
período de seis horas.
Tratamento dos Animais
Para cada ensaio, cinco grupos de ratos (n=6/6 macho/fêmea)
foram privados de ração por doze horas, em seguida tratados por via
oral com EE nas doses de 0,2; 0,15 e 0,1 g/kg, dose única. O grupo
seguinte recebeu por via intraperitoneal 0,1; 0,075; 0,05 g/kg, dose
única. As doses foram estabelecidas com base na DL50 do extrato. Os
grupos controle e padrão receberam solução fisiológica (0,9%) e
indometacina (20 mg/kg por via oral e, 10 mg/kg por via i.p.),
respectivamente.
Análise Estatística
Os valores foram expressos como média ± erro padrão médio
(epm). As diferenças entre os grupos foram analisadas através da
61
análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste t de Student. O nível
de significância para rejeição da hipótese de nulidade foi sempre ≥ a
5%.
3.0. Resultados
Como esperado, a injeção de carragenina induziu edema na pata
dos ratos dos grupos C, P, T1, T2 e T3, atingindo seu pico entre a
segunda e a terceira hora, para ambos e sexos e vias de administração.
Os resultados estão representados nos gráficos adiante abaixo e
expressam o desenvolvimento do edema de pata (ml), para os grupos
tratados com EE de C. echinata em relação aos grupos padrão e
controle, durante as seis horas de experimento.
Como pode ser observado no gráfico 1, o EE na dose de 100
mg/kg, em ratos machos, tem sua ação antiedematogênica iniciada a
partir da primeira hora (42,9% de redução), superando o efeito da
indometacina, que começou reduzir, significativamente, a partir da
segunda hora (50,51%). Os resultados apresentaram um percentual de
inibição do edema nas doses de 71,3% e 82,07% respectivamente para
5ª e 6ª hora contra 73,31% e 79,21% de inibição do fármaco padrão,
resultados significantes quando comparado ao grupo controle. A dose
de 75mg/kg mostra ação antiflogística a partir da segunda hora
(55,67%), acompanhando o efeito da indometacina. O efeito do extrato
na redução do processo inflamatório cresceu progressivamente
atingindo pico de 77,53% e 82,07% na quinta e sexta hora,
respectivamente, superando a ação do padrão utilizado. A menor dose
(50mg/kg) administrada inibiu o crescimento do edema em 41,69% a
partir da primeira hora, chegando a 49,5% na terceira hora, e 77,6%
sexta hora. Os resultados apresentados são estatisticamente
significativos (p < 0,05) em comparação com o grupo controle.
A análise do gráfico 2 demonstrou que a administração
intraperitoneal do EE, em ratas fêmeas, na dose de 100mg/kg
apresentou atividade antiinflamatória a partir da segunda hora,
alcançando seu pico de inibição (84,1%) na quinta hora, este resultado
62
superou a ação da indometacina cuja ação inibitória iniciou a partir da
5ª h (56,83%), com inibição de 70,96% na sexta hora. O extrato de C.
echinata na dose de 75mg/kg mostrou-se ativo na 1ª h (49,09%),
apresentando resultados significativos também na 3ª h (60,72%) e na 6ª
h (74,18%). Para a dose de 50mg/kg observou-se redução significativa
na quinta hora (56,91%). Os resultados para a indometacina não foram
estatisticamente significativos. Os demais resultados apresentaram
diferença significativa (P < 0,05) em comparação com o grupo controle.
O tratamento, por via oral, de ratos machos não apresentou
redução significativa para as dose de 200 e 150 mg/kg, entretanto a
administração de 100 mg/kg do EE de C. echinata, exibiu inibição
significativa de 46,80 e 54,54% na quarta e quinta horas (Gráfico 3). O
grupo tratado com indometacina apresentou diminuição do edema
(42,54%) na quinta hora.
O gráfico 4 representa a redução do edema de pata após a
administração do extrato etanólico por via oral em ratas fêmeas.
A dose de 200 mg/kg não apresentou redução significativa do
edema. Até a sexta hora o extrato foi capaz de inibir o aumento da
inflamação em apenas 32,92%. O mesmo pode ser observado para a
dose intermediária (150 mg/kg) que apresentou discreta regressão de
29,95% durante a - sexta hora. A dose de 100mg/kg (V.O.) também
apresentou índice de inibição insuficiente, com redução do edema
inexpressiva (37, 64%) durante a quinta hora, alcançando inibição
máxima de 42,32% que não apresentou diferença significativa. O grupo
padrão também não foi capaz de inibir o processo inflamatório até a
sexta hora do experimento.
4.0. Discussão e Conclusão
O edema de pata induzido por carragenina tem sido utilizado
como modelo para avaliação da atividade de diversas substâncias sobre
a inflamação aguda (El-Shenawy e cols., 2002). A reação inflamatória
induzida por este modelo pode ser dividida em duas fases: a fase
63
primária (0-1h) é resultante da liberação de histamina, serotonina e
bradicinina, enquanto a fase tardia (1-6h) está associada com a
liberação de prostaglandinas (Di Rosa e cols., 1971; Ogonowski e cols.,
1997).
O EE da C. echinata apresentou atividade significativa (p < 0,05)
para inibição do edema de pata induzido por carragenina, quando
administrado por via intraperitoneal, em ambos os sexos, para todas as
doses testadas. Os resultados mais expressivos foram observados a
partir da segunda hora, sugerindo que a atividade antiinflamatória do
EECe seja decorrente de uma inibição na síntese, liberação ou atuação
de mediadores da inflamação, em especial das prostaglandinas. É
possível que os efeitos tardios sejam produzidos a partir da
vasodilatação induzida pelas prostaglandinas nos demais leitos
vasculares (vasos cutâneos e veias superficiais) o que levou a regressão
do processo inflamatório, com diminuição do edema.
Além disso, o efeito antiflogístico dose-dependente, produzido pela
administração do EECe, pode, também, ser devido a inibição da
permeabilidade microvascular, demonstrada em diferentes estágios da
inflamação, são sugestivos de propriedades anti-histamínica, anti-
bradicinina e anti-serotonina.
A administração do extrato por via oral não induziu inibição do
processo inflamatório, essa ausência de atividade por via oral pode estar
relacionada à baixa absorção de vários constituintes do EE pelo trato
gastrintestinal dos animais, impedindo que os níveis séricos necessários
para produção do efeito antiinflamatório, sejam atingidos.
Com base nos resultados obtidos é possível afirmar que a espécie
Caesalpinia echinata é possuidora de um expressivo potencial
antiinflamatório, mesmo quando comparada, a fármacos considerados
padrões para esta atividade. Futuras investigações, com aplicação de
novos protocolos experimentais, desenvolvidos a partir de novos estudos
pré-clínicos, poderão viabilizar um produto com potencial terapêutico
obtido a partir deste vegetal, bem como seus mecanismos de ação.
64
Agradecimentos
Agradecemos ao professor Antônio Camarotii (UNICAP), pelo
fornecimento do material botânico.
Referências Bibliográficas
CARVALHO, J.C.T.; TEIXEIRA, J. R.M.; SOUZA, P.J.C.; BASTOS, J.K.; FILHO, D.S.; SILVIO, J. S. 1996. +Preliminary studies of analgesic and anti-inflammatoryproperties of Caesalpinia ferrea crude extract. Journal of Ethnopharmacology 53, 175-178. DAHANUKAR, S.A., KULKARNI, R.A., REGE, N.N. 2000.Pharmacology of medicinal plants and natural products. Indian Journal of Pharmacology 32, 81–S118. DI ROSA, M.; GIROUD, J.P.; WILLOUGHBY, D.A. 1971.Studies of the mediators of the acute in¯ammatory response induced in rats at diferent sites by carrageenan and turpentine. J. Pathol. 104, .15-29. EL-SHENAWY, S.M.; ABDEL-SALAM, O.M.; BAIUOMY, A.R.; EL-BATRAN, S.; ARBID, M.S. 2002. Studies on the Anti-inflammatory and antinociceptive effects of melatonin in the rat. Pharmacol Res. 46, 235-243. GIUDICE-NETO, J.D.; SEBBENN, A.M.; KAGEYAMA, P.Y. 2004. Herança e ligação em locos isoenzimáticos de Caesalpinia echinata L. (Pau-brasil). Rev. Inst. Flor., São Paulo, 16 (2), 101-110. GUPTA, M.; MAZUMDER, U.K.; KUMAR, R.S.; KUMAR, T.S. 2003. Studies on Anti-inflammatory, Analgesic and Antipyretic Properties of Methanol Extract of Caesalpinia bonducella leaves in Experimental Animal Models. Iranian Journal Of Pharmacology & Therapeutics 2, 30-34.
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65
SILVA, M.C.; CARVALHO, J.C.T. 2004. Inflamação. In: CARVALHO, J.C.T. Fitoterápicos Antiinflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Ribeirão Preto, SP: Ed. Tecmed, 49ª ed., pp.49-67. WINTER, C.A., RISLEY, E.A., NUSS, G.W. 1962. Carrageenan-induced o edema in hind paw of the rat as an assay for anti-inflammatory drugs. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine Society for Experimental Biology and Medicine 111, p.544–547. OGONOWSKI, A.A.; MAY, W.S.; MOOR, A.B.; BARRET, L.T.; BRYANT, C.L.; POLLOCK, S.H. 1997. Anti-i nflammatory and analgesic activity of an inhibitor of neuropeptide amidation. J Pharm Exp Ther. 280, 846-853.
66
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0+ 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Tempo (horas)
Volume do Edema (ml)
C: controle P: indometacina T1: EE 50mg/kg" T2: EE 75mg/kg" T3: EE 100mg/kg"
Gráfico 1 – Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratos machos tratados por VIP, com o EE de C.
echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), indometacina 10 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0+ 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Tempo (h)
Volume do Edem
a (ml)
C:controle P:indometacina T1:EE 50mg/kg T2: EE 75mk/kg T3: EE 100mg/kg
Gráfico 2 – Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratas fêmeas tratados por VIP, com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), indometacina 10 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
67
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0+ 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Tempo (h)
Volume do Edem
a (ml)
C: controle P: indometacina T1: EE 100mg/kg T2: EE 150mg/kg T3: EE 200mg/kg
Gráfico 3 – Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratos machos tratados por VO, com o EE de C.
echinata nas dose de 100mg/kg (▲), 150mg/kg (♦), 200mg/kg (■), indometacina 20 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. *Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0+ 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Tempo (h)
Volume do Edema (ml)
C:controle P: indometacina T1: EE 100mg/kg T2: EE 150mg/kg T3: EE 200mg/kg
***
Gráfico 4 – Comparação do desenvolvimento do edema de pata por injeção subplantar de carragenina, em ratas fêmeas tratados por VO, com o EE de C. echinata nas dose de 100mg/kg (▲), 150mg/kg (♦), 200mg/kg (■), indometacina 20 mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. *Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
68
JAJAJAJA TÜà|zÉ TÜà|zÉ TÜà|zÉ TÜà|zÉ IIIIIIIIIIII
Artigo a ser submetido a Revista Brasileira de Farmacognosia
69
ESTUDO DA PROPRIEDADE ANTICANCERÍGENA DA CAESALPINIA
ECHINATA LAM.
E.C.B. Silva1, A.C.P. Silva1, L.T. Rocha 1, K.P.S. Cavalcanti2, C.E.
Pacheco3, D.L. Mota3, F.B. Anjos 3, I.A. Souza 4 1Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Departamento de Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, Recife-PE, Brasil..
2Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. Recife-PE,
Brasil.
3Departamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco –
UFPE. Recife-PE, Brasil.
4Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco – UFRPE. Recife-PE, Brasil.
Resumo
A investigação do potencial anticancerígeno do extrato etanólico do cerne de Caesalpinia echinata Lam. (Fabaceae/Caesalpinioideae), foi realizada contra duas linhagens de tumorais: sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich, ambos em sua forma sólida. No ensaio foram utilizados camundongos albinos Swiss, Mus musculus, adultos, machos e fêmeas. Os resultados demonstraram que o referido extrato foi capaz de inibir o crescimento de tumores carcinomatosos em até 90%, enquanto a análise dos tumores sarcomatosos apresentou inibição significativa de até 70%. A avaliação histológica demonstrou que a administração do EE de C. echinata provoca discretas alterações nos tecidos hepático, renal e pulmonar, quando comparados com os animais dos grupos controle e padrão.
Palavras chave: atividade antitumoral, morfologia, câncer, pau-brasil,
Caesalpinia echinata.
70
PROPERTY ANTITUMOUR STUDY OF THE CAESALPINIA ECHINATA LAM.
Abstract The investigation of the antitumour activity of the ethanolic extract of Caesalpinia echinata Lam.’s heartwood (Fabaceae/Caesalpinioideae), been evaluated against two lines cancer: sarcoma 180 and carcinoma of Ehrlich, both in solid form. The assay used albino mice Swiss, Mus musculus, adults, males and females. The results demonstrated that referred him extract was capable to inhibit the growth of carcinoma tumor in up to 90%, while the analysis of the sarcoma tumor presented significant inhibition of up to 70%. the histological evaluation demonstrated that the acute administration of EE of C. echinata induce discreet alterations in the hepatic, renal and lung tissue, when compared with the animals of the groups control and standard.
Keywords: antitumour activity, morphology, cancer, brazilwood,
Caesalpinia echinata.
71
1. Introdução
Nos últimos séculos grandes avanços foram alcançados na terapia
antineoplásica (Kroeff, 2004), contudo o câncer ainda figura como uma
das maiores causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo,
sendo responsável por cerca de seis milhões de óbitos por ano (Guerra
et al., 2005). Na busca por substâncias com potencial antineoplásico os
produtos de origem natural se destacam como principal fonte destas
moléculas.
Caesalpinia echinata Lam. é uma árvore da família Fabaceae,
subfamília Caesalpinioideae, nativa da floresta pluvial atlântica (Polhill;
Vidal, 1981). No Brasil ocorre desde o sul do Rio de Janeiro, até o
Ceará, possuindo maior abundância ao sul do estado da Bahia
(Rezende et al, 2004). Desde sua descoberta a C. echinata Lam. tem sido
intensamente explorado devido à qualidade de sua madeira, por suas
propriedades acústicas (Matsunaga et al., 2000) e, especialmente,
devido à extração de um pigmento rubro muito valioso (Cardoso et al,
1998).
O uso deste vegetal na medicina popular brasileira é bastante
restrito. Segundo Xavier (1995) e Silva (2001) o lenho costuma ser
utilizado como adstringente, corroborante e secante, odontoálgico e
tônico. Porém sabe-se que sua madeira encerra um homoflavonóide
conhecido por seu alto poder antioxidante, a brasileína (Yan et al,
2005). Comprovações da atividade antitumoral de compostos desta
classe de polifenóis (Mukherjee, 2001; Ginter, 1995) nos levaram a
investigar a atividade anticancerígena do extrato etanólico bruto do
cerne de C. echinata Lam.
2. Metodologia
Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss, Mus Musculus,
72
adultos, ambos os sexos, pensando entre 25 e 30 g, provenientes do
Biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de
Pernambuco. Os animais receberam água e ração ad libitum e foram
mantidos em condições controles (ciclo 12h claro/escuro) e temperatura
(23 ± 2°C). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE, processo n°
23076.014521/2005-89.
Material Botânico
Diferentes amostras de Caesalpinia echinata Lam. foram
coletadas no ano de 2004, no município de São Lourenço da Mata,
Brasil. A espécie vegetal foi identificada pela botânica Marlene Barbosa,
e a exsicata do mesmo foi depositada no herbário Geraldo Mariz, da
Universidade Federal de Pernambuco, sob número 41.764.
Obtenção do extrato
Para obtenção do extrato, o cerne triturado de Caesalpinia
echinata Lam. foi submetido à maceração com solvente etanólico, em
seguida concentrado até a secura em rota evaporador sob pressão
reduzida para eliminação do solvente orgânico. O material obtido foi
ressuspenso em solução fisiológica, para posterior administração.
Transplante dos Tumores
Nos experimentos foram utilizadas duas linhagens de células
tumorais: Sarcoma 180 (forma sólida) e Carcinoma de Ehrlich (forma
sólida). Um fragmento de cerca de 3 mm de diâmetro foi introduzido na
região axilar do animal receptor por via subcutânea (Sugiura; Stock,
1954).
2.5. Tratamento dos animais
73
Ao grupo tratado foi administrado extrato de Caesalpinia
echinata, durante 8 dias. A quimioterapia experimental foi iniciada 48
horas após o transplante dos tumores. Ao término do tratamento todos
os animais foram pesados e sacrificados por deslocamento cervical. Os
tumores foram extirpados, dissecados e pesados.
Ao grupo controle foi administrado o veículo empregado na
diluição do extrato, enquanto o grupo padrão recebeu o fármaco de
referência para o tratamento das respectivas linhagens tumorais –
ciclofosfamida para o Sarcoma 180 e metotrexate para o Carcinoma de
Ehrlich.
2.6. Estudo Histológico
Os animais sacrificados foram colocados em decúbito dorsal e
submetidos a toracolaparotomia mediana. Em seguida, foram
perfundidos via transcardíaca por uma solução salina (0.85%) e depois
com uma solução fixadora de formol (10%).
Fígado, rins e pulmão foram retirados, cortados em pequenos
fragmentos e imersos em líquido de formol, no qual permaneceram em
temperatura ambiente durante 24 horas, segundo a metodologia
adaptada de Santiago (1991).
Após fixação as peças foram lavadas e processadas para inclusão
em parafina, em seguida cortadas com 7 µm de espessura, e coradas
pela técnica de Hematoxilina-Eosina (Michealany, 1980), e observadas
em microscopia óptica.
Análise Estatística
Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média
(epm). As diferenças entre os grupos foram analisadas através da
análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste t de Student. O nível
de significância para rejeição da hipótese de nulidade foi sempre p <
5%.
74
3.0. Resultados
Como demonstrado no gráfico 1, o extrato etanólico de C. echinata
(EECe), administrado por via intraperitoneal, foi capaz de inibir
significativamente, em 90,40%, o crescimento do tumor sólido de
Ehrlich, em camundongos machos na menor dose obtida (50 mg/Kg)
quando comparado com o grupo controle. Para as demais doses, 75
mg/Kg e 100 mg/Kg, foram verificadas inibições de 82,43% e 61,33%,
respectivamente.
Em camundongos fêmeas portadoras do Carcinoma de Ehrlich, a
inibição mais expressiva (91,35%) foi verificada na maior dose (100
mg/Kg) empregada, enquanto as outras doses apresentaram redução do
tumor na ordem de 84,44% (75 mg/Kg) e 60,55% (50 mg/Kg), como
observado no Gráfico 2.
O fármaco padrão, metotrexato (10 mg/kg), foi capaz de inibir
100% do crescimento tumoral (Gráficos 1 e 2).
Para o Sarcoma 180, o tratamento com EE de C. echinata por via
intraperitoneal, em camundongos machos apresentou índice de inibição
de crescimento tumoral de 73, 65% para a menor dose testada (50
mg/kg), quando comparado com o grupo controle. As doses de 75
mg/Kg e 100 mg/Kg apresentaram inibição de 51,35%, e 54,39%,
respectivamente.
O tratamento em camundongos fêmeas, portadoras de sarcoma
180, apresentou índice de inibição máximo (71,62%) na maior dose
obtida (100 mg/Kg). A dose de 75 mg/kg apresentou redução 68,96%,
enquanto a de 50 mg/kg não demonstrou inibição significativa, como
apresentado no gráfico 4.
O fármaco padrão utilizado para este tumor, genuxal, atingiu
índices de inibição na ordem de 72, 64% para camundongos machos, e
70,63% para camundongos fêmeas (Gráfico 3 e 4).
A análise microscópica dos grupos controles dos ensaios frente ao
Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich: hepatite multifocal, ativação de
células de Kupffer, necrose hepática disseminada, congestão nos rins,
75
glomerulite proliferativa membranosa, atrofia glomerular renal,
enfisema e congestão pulmonar, metástases no pulmão, fígado, rins e
baço.
Os grupos tratados com ciclofosfamida e metotrexato
apresentaram degeneração gordurosa difusa, presença de células de
Kupffer ativadas, metástases no fígado, pulmões, rins e baço, depleção
de polpa branca com figuras de apoptose nos centros germinativos no
baço, congestão renal, glomerulite e atrofia glomerular nos rins,
presença de congestão e metástases nos pulmões, miocardiose e
necrose de coagulação no coração.
No estudo histológico de camundongos machos portadores de
carcinoma de Ehrlich, na dose de 50 mg/kg, foram avaliadas as regiões
cortical e medular do rim, no qual o corpúsculo renal apresentou
glomérulo compacto, maciço e muito congesto possivelmente
comprometendo a função renal. No fígado evidenciaram-se hepatócitos
extremante vacuolizados com vasos congestionados e sinusóides,
quando comparado ao grupo controle (Figura 1 e 2). Os pulmões
desses animais também apresentaram congestão vascular, não
havendo, contudo, extravasamento sangüíneo nos alvéolos e
bronquíolos.
Na maior dose testada a morfologia destes órgãos mostrou-se
preservada, quando comparada aos grupos controle e padrão.
Os animais portadores do sarcoma 180, tratados com o EE em
todas as doses testadas, apresentaram órgãos com morfologia normal,
quando comparado aos portadores do carcinoma de Ehrlich.
4.0. Discussão e Conclusão
O câncer se caracteriza pela mutiplicação e disseminação
descontrolada de células anormais no organismo (Foon, 1989;
Goldenberg, 1989). Muitos esforços têm sido dispensados na busca de
terapias capazes de deter o desenvolvimento das neoplasias malignas.
Como estratégias mais usadas no combate a esta doença, destacam-se
76
as excisões cirúrgicas, agentes quimioterápicos, modificadores da
resposta biológica, tais como interleucina-2, interferon, e outros.
A natureza tem sido uma das principais fontes de origem de
substâncias farmacologicamente ativas para terapias medicamentosas
por milhares de anos. Atualmente, da mesma forma, o sistema de busca
por novas moléculas bioativas retiradas dos vegetais, continua
desempenhado papel fundamental no tratamento de saúde básico de
pelo menos 80% da população mundial (Chabner, 1990; Nakanishi,
1999).
Modelos experimentais, como de câncer espontâneo em animais,
proporcionam ensejo para estudos que propiciam o desenvolvimento de
novas substâncias bioativas.
O extrato etanólico de C. echinata foi avaliado contra duas
linhagens tumorais, sarcoma 180 e tumor de Ehrlich, apresentado
inibição significativa do crescimento tumoral, nos dois tipos de
neoplasia estudados.
Como demonstrado nos resultados, o EE apresentou maior
atividade quando utilizado no tratamento do carcinoma de Ehrlich,
considerado, segundo a literatura, um tumor de crescimento rápido e
comportamento agressivo (Ajith; Janardhanan, 2003, Kaneno, 2004).
A atuação do extrato contra a linhagem sarcomatosa mostrou-se
menos ativa. O sarcoma 180 é uma linhagem tumoral de crescimento
rápido e consistente, amplamente empregado em testes para avaliação
de agentes quimioterápicos (Levi-Montalcini, 1986).
Em ambos os tipos tumorais é possível perceber que em
camundongos fêmeas as maiores inibições só foram atingidas nas doses
superiores, mostrando claramente que atuação do EE, nesse caso é
dose-dependente. Ao contrário do comportamento apresentado pelos
camundongos machos, onde é possível observar que as doses inferiores
foram capazes de apresentar maior índice de inibição, característica
semelhante à de fármacos que apresentam dose limiar. Com relação ao
comportamento apresentado em camundongos fêmeas, este pode estar
ligado a interferência no mecanismo de inibição do crescimento
77
tumoral, pela variação hormonal apresentada no ciclo estral destes
animais.
Os resultados morfológicos obtidos revelaram que os animais
tratados com EE de C. echinata apresentaram melhor resposta, do tipo
dose-dependente, a ação lesiva dos tumores do que os animais controle.
Dentre os efeitos mais observados a hemorragia e a congestão
vascular predominaram em todos os tecidos.
O quadro instalado nos animais demonstrou a íntima relação
entre estes órgãos investigados e o sistema circulatório, uma vez que, o
controle vascular funciona como um grande aliado para a manutenção
da saúde.
Talvez o EE de C. echinata procure reajustar o sistema vascular,
prevenindo a queda inicial da pressão e possivelmente levando ao
estreitamento reflexo de um grande número de vasos de pequeno
calibre (vasoconstricção) em regiões tais como: membranas mucosas,
intestino, e outras porções do organismo. Assim sendo, o vegetal aja
mantendo o retorno venoso adequado, débito cardíaco, pressão
sanguínea arterial e aumento da resistência periférica.
A qualidade dos fitofármacos se mostra eficaz quando se avalia o
composto químico quanto à dosagem e forma de administração. Há
relatos de fitoterápicos usados como drogas antineoplásicas. Estes
compostos primários agem nos processos moleculares essenciais das
células cancerosas, como por exemplo, a vincristina e a vimblastina,
que atuam pertubando a atuação do fuso mitótico durante a fase de
metáfase do ciclo celular. São comuns ainda, inibidores do fuso mitótico
como o taxol, que parece ser ativo contra tumores sólidos, e ainda se
enquadra nesse grupo a etoposida (derivado semi-sintético da
mandrágora) usada contra o câncer de pequenas células do pulmão e o
carcinoma testicular (Magrath 1989; Preston e cols., 1990; Lazo;
Larner, 1997).
Newall e cols. (2002) fazem referências a plantas consideradas
imunoestimulantes que foram testadas “in vitro”, destacando-se a
calêndula, eupatório, equinácea e o palmito selvagem que foi testado “in
78
viv”o. Mencionam ainda estes autores a drosera com efeito depressor, a
eleuterococo, experimentadas em animais e seres humanos e o visco-
branco que atua como estimulante supressor nos seres humanos.
Sendo assim pode-se sugerir que o EE de C. echinata,
possivelmente aja interferindo no mecanismo de ação das neoplasias,
associados aos elementos intrínsecos celulares, inibindo a atividade
tumoral nos animais, alterando a morfologia e fisiologia dos tecidos
atingidos. Tais considerações discutidas anteriormente talvez sejam
motivos de novas pesquisas que venham esclarecer o verdadeiro
mecanismo de ação utilizado por este vegetal.
79
Referências bibliográficas
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80
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81
0 0,6 1,2 1,8 2,4 3 3,6 4,2
Média de Crescimento Tumoral
C: controle Metotrexato T1: EE 50mg/kg T2: EE 75mg/kg T3: EE 100mg/kg
Gráfico 1 – Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos machos, portadores de carcinoma de Ehrlich, tratados por VIP com o EE de C.
echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Metotrexato (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
0 0,8 1,6 2,4 3,2 4 4,8
Médias de Crescimento Tumoral
C: controle P: Metotrexato T1: EE 50mg/kg T2: EE 75mg/kg T3: EE 100mg/kg
Gráfico 2 – Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos fêmeas, portadores de carcinoma de Ehrlich, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Metotrexato(♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
82
0 0,6 1,2 1,8 2,4 3
Médias de Crescimento Tumoral
C: controle P: Genuxal T1: EE 50mg/kg T2: EE 75mg/kg T3: EE 100mg/kg
Gráfico 3 – Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos machos, portadores de Sarcoma 180, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Genuxal 2,5mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
0 0,6 1,2 1,8 2,4 3
Médias de Crescimento Tumoral
Controle P: Genuxal T1: EE 50 mg/kg T2: EE 75 mg/kg T3: EE 100 mg/kg
Gráfico 4 – Comparação das médias de crescimento tumoral em camundongos fêmeos, portadores de Sarcoma 180, tratados por VIP com o EE de C. echinata nas dose de 50mg/kg (▲), 75mg/kg (♦), 100mg/kg (■), Genuxal 2,5mg/kg (♦) e solução salina 0,9% (-x-). Os valores representam a média do volume da pata (ml) + EPM. Resultados significativos para p< 0,05 quando comparado ao grupo controle (Teste t de Student).
83
Figura 1- Fotomicrografia do córtex de rim de camundongo macho, portador de carcinoma de Ehrlich, tratado com EECe (50 mg/kg). Corpúsculo renal (1), congestão glomerular (2), corado com HE. Obj. 20x.
Figura 2- Fotomicrografia do fígado de camundongo macho, portador de carcinoma de Ehrlich, tratado com EECe (50 mg/kg). Vasos congetionados (1), hepatócitos vacuolizados (2), corado com HE. Obj. 20x.
1
2
1
2
84
Figura 3- Fotomicrografia do pulmão de camundongo macho, portador de carcinoma de Ehrlich, tratado com EECe (50 mg/kg). Alvéolos congestionados (1), corado com HE. Obj. 20x.
Figura 4- Fotomicrografia do pulmão de camundongo macho, portador de Sarcoma 180, tratado com EECe (50 mg/kg). Pontos de inflamação (1), corado com HE. Obj. 20x.
1
1
85
Figura 5- Fotomicrografia do fígado de camundongo macho, portador de Sarcoma 180, tratado com EECe (50 mg/kg). Inflamação perivascular (1), Sinusóides aparentemente normais (2). Corado com HE. Obj. 20x.
Figura 6- Fotomicrografia do rim de camundongo macho, portador de Sarcoma 180, tratado com EECe (50 mg/kg). Áreas de inflamação (1), Glomérulo de morfologia preservada (2). Corado com HE. Obj. 20x.
1
2
1 2
86
KA TÜà|zÉ KA TÜà|zÉ KA TÜà|zÉ KA TÜà|zÉ IVIVIVIV
Artigo submetido à Revista de Ciências da Saúde Nova Esperança
87
Atividade antimicrobiana do extrato bruto da Caesalpinia echinata Lam.
Elisângela C. B. Silvaa, Thompson Lopes de Oliveira a, Edeltrudes de
Oliveira Limab, Ivone Antônia de Souza c
a Farmacêutica . Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. Recife-PE, Brasil.
b Farmacêutico – Bioquímico. Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). Recife-PE, Brasil.
b Professora Adjunta do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade
Federal da Paraíba (UFPB). Doutora em Micologia.
c Professora Adjunta do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE). Doutora em Farmacologia Clínica.
Resumo
A Caesalpinia echinata (Lam), tem sido usada por povos antigos em decorrência de suas variadas propriedades medicinais, sendo utilizado na prevenção e tratamento de algumas doenças com ação cicatrizante, odontoálgico e tônica. O estudo de produtos naturais oriundos de vegetais de uso medicinal com atividade antimicrobiana vem ganhado grandes perspectivas para uma possível aplicação prática no tratamento das infecções fúngicas e bacterianas. Neste trabalho, foram realizadas avaliações da atividade antimicrobiana do extrato etanólico da Caesalpinia echinata Lam frente a espécimes de bactérias e fungos de origem clínica. Os ensaios foram realizados, através do método de difusão em meio sólido, incubados a uma temperatura de 35+/- 2°C por 24-48 horas para espécimes bacterianas, e 28-30°C durante 10-14 dias para espécies fúngicas. De acordo com os testes, não foi evidenciada nenhuma atividade antimicrobiana satisfatória dos extratos testados, diferindo de relatos na literatura que sugerem e afirmam a ação antimicrobiana desta planta.
Palavras chave: Antimicrobiano, plantas medicinais, extratos; Caesalpinia echinata
Lam.; pau-brasil; Fabaceae-Caesalpinioideae.
*Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: , Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268511, Email: [email protected]
88
Abstract
The Caesalpinea echinata (L), it has been used by old people due to your varied medicinal properties, being used in the prevention and treatment of some diseases with healing, analgesic and tonic actions. The study of natural products originating from of vegetables of medicinal use with activity antimicrob comes won great perspectives for a possible practical application in the treatment of the infections fungi and bacterial. In this work, evaluations of the activity antimicrob of the extract aqueous of Caesalpinea echinata L front to specimens of bacterials and mushrooms of clinical origin. The rehearsals were accomplished, through the diffusion method in solid middle, incubated her/it a temperature of 35+ / - 2°C for 24-48 hours for bacterial specimens, and 28-30 °C for 10-14 days for species fungi. In agreement with the tests, any activity antimicrob of the tested extracts was not verified, differing of reports in the literature that you/they suggest and they affirm to have evidenced action antimicrob of this plant. Keywords: Antimicrobial, medicinal extracts; Caesalpinia echinata Lam.; brazilwood; Anti-inflammatory; Fabaceae-Caesalpinioideae.
Introdução
A história das doenças e das suas causas de morte é tão antiga
quanto à própria espécie humana, talvez mais desconhecida. O impacto
das doenças infecciosas na evolução da espécie humana é de difícil
avaliação, tanto pela sua complexidade em si, como pela escassez de
dados e pontos obscuros (RODRIGUES e cols., 1997).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (1991), a alta
densidade demográfica somada a baixas condições de higiene
encontradas nos países em desenvolvimento, é responsável por uma
grande incidência de doenças infecciosas, causadas principalmente, por
bactérias enteropatogênicas e fungos, e esta são uma das principais
causas da morbidade e da mortalidade nestas regiões.
O pau-brasil (Caesalpinia echinata Lam.), é uma espécie arbórea
da família Fabaceae, subfamília Caesalpinioideae, originária da mata
atlântica. Algumas de suas propriedades terapêuticas têm sido
descritas, sendo seu lenho adstringente, secante, e odontoálgico
(XAVIER, 1995; SILVA, 2001). Embora pouco se saiba sobre sua
atuação como agente antibacteriano, várias substâncias com esta
89
atividade têm sido descritas em espécies do gênero Caesalpinia, como a
brasilina observada na C. sappan (KIM e cols., 2004; REDDY e cols.,
2003).
A brasilina [7,11b-dihydrobenz[b]indeno[1,2-d]pyran-
3,6a,9,10(6h)-tetrol], substância encontrada no extrato do cerne de
várias espécies do gênero Caesalpinia, apresenta inúmeras
propriedades farmacológicas incluindo um potencial inibitório contra
microrganismos patogênicos (XU e cols., 2004).
Estudos realizados na Universidade Federal de Pernambuco
(UFPE) demonstraram que o extrato de C. echinata impediu o
desenvolvimento de microrganismos patogênicos, tais como Escherichia
coli, Proteus. mirabilis, Proteus. vulgaris e Bacillus. cereus (FREIRE,
2004).
A espécie também apresenta potencial antifúngico, onde o extrato
preparado a partir de seus ramos foi capaz de inibir o crescimento de
fungos da espécie Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum
(SOUZA e cols., 2004).
Várias outras espécies do gênero Caesalpinia têm sido descritas e
estudadas por apresentarem ações medicinais, muito embora no Brasil
seu uso não seja difundido, diferente de outras partes do mundo onde
já se conhece há bastante tempo suas atividades e emprego no uso
medicinal.
Matérias e Método
Local de Trabalho
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia do
Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal da Paraíba.
90
Obtenção do Material Botânico
Os extratos liofilizados foram obtidos no Departamento de
Química da Universidade Católica de Pernambuco, conforme técnicas
adotadas no respectivo laboratório.
Ensaios Microbiológicos
Para a realização dos ensaios microbiológicos, foram selecionados
espécimes de origem clínica, registradas no Laboratório de Micologia do
Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPB, bem como cepas
padrões obtidas no Laboratório da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas - USP: Staphylococcus aureus (ATCC-25923),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC-9028), Candida albicans (ATCC-9002),
Aspergillus flavus (FCF-126), Trichophyton rubrum (ATCC-2812),
Trichophyton rubrum (LM-69), Microsporum canis (LM-003), Microsporum
gypseum (LM-002), Penicillium spp (FCP-281) e Fusarium (FCP-108).
Metodologia
Método de difusão em meio sólido: utilizado na determinação do
“screening” da atividade antimicrobiana dos extratos da Caesalpinia
echinata contra bactérias e fungos de origem clínica: em placas
esterilizadas, foi depositado 1mL da suspensão de cada microrganismo,
preparada em solução fisiológica a 0,85 %, padronizada pelo tubo 0,5
Mc Farland e ajustada para 90 % T (530nm), correspondendo
aproximadamente a 106 UFC/mL (ODDS, 1989; CASALS, 1979). Em
seguida, foi adicionado 21 mL do meio sólido fundido a 50°C,
procedendo da seguinte forma: após solidificação, foram realizadas
cavidades de 6 x 8 mm de diâmetro, onde foram depositadas alíquotas
de 50 µL de cada extrato solubilizado em concentrações diferentes.
Foram utilizados controles com antimicrobianos padrões: tetraciclina
30g para bactérias e cetoconazol a 1000µg para fungos.
91
Os ensaios foram incubados por 24-48 horas a 35+ / - 2°C para
bactérias e leveduras e a temperatura de ambiente 28-30°C durante 10-
14 dias para fungos filamentosos (BENOUDIA e cols., 1988; SHADOMY
e cols., 1985; McGINNIS, 1980; CHIN LU, 1971; VICENT; VINCENT,
1944).
Resultados
Os resultados dos ensaios de atividade antibacteriana e
antifúngica do extrato de Caesalpinia echinata Lam., estão ilustrados
através das Tabelas 1 e 2 respectivamente.
Tabela 1 Ação antibacteriana do extrato de Caesalpinia echinata Lam. em diferentes concentrações contra bactérias de origem clínica e diversa.
MICRORGANISMOS
Produto (extrato)
Sthapylococcu
s aureus ATCC-25923
Sta
phylococcu
s epiderm
idis LM
Esch
erichia coli LM
Klebsiella pneumoniae LM
Pseudomonas aeru
ginosa ATCC-9028
Enterobacter spp. LM
Salm
onella spp. LM
Bacillus spp. LM
Diluições
100mg/mL - - - - - - - -
50mg/mL - - - - - - - -
25 mg/mL - - - - - - - -
12,5 mg/mL - - - - - - - -
Controle do microrganismo + + + + + + + +
* No controle do microrganismo foi utilizada uma droga antibacteriana de largo espectro conforme metodologia descrita.
Na Tabela 1, observam-se os resultados dos testes in vitro do
extrato aquoso da planta Caesalpinia echinata Lam em diferentes
concentrações frente a bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas de
origem clínica e diversa. Entretanto, o extrato da planta mostrou-se
92
totalmente inativo contra todas as espécies bacterianas utilizadas nos
ensaios microbiológicos.
Tabela 2 Teste de atividade antifúngica do extrato de Caesalpinia echinata Lam. em diferentes concentrações contra fungos leveduriformes e filamentosos de origem clínica e diversa.
MICRORGANISMOS
Produto (extrato)
Candida albicans ATCC-9002
Aspergillus flavus FCF-126
Trichophytom rubru
m ATCC-2818
Trichophyton rubrum Lm
69
Microsporu
m canis - 003
Fusarium FCF - 108
Penicillium FCF-281
Diluições
100mg/mL - - - - - - -
50mg/mL - - - - - - -
25 mg/mL - - - - - - -
12,5 mg/mL - - - - - - -
Controle do microrganismo + + + + + + +
* No controle do microrganismo foi utilizada uma droga antifúngica conforme
metodologia descrita
Na Tabela 2, observam-se os resultados dos estudos in vitro do
extrato de Caesalpinia echinata Lam em diferentes concentrações frente
a fungos filamentosos e leveduriformes de origem clínica e diversa. No
entanto, o extrato da planta mostrou-se totalmente inativo contra todas
às espécimes fúngicas utilizadas nos ensaios microbiológicos.
Discussão
O aparecimento das infecções, em destaque as hospitalares,
estimula uma crescente necessidade em combatê-las, principalmente
devido ao surgimento de cepas resistentes ou multiresistentes as drogas
antifúngicas e antibacterianas. O que se aplica em especial a amostras
93
de fungos aparentemente inofensivos, que há alguns anos atrás como é
o caso do gênero Candida spp. não se destacava tão
predominantemente em infecções no ambiente hospitalar (LACAZ e
cols., 2002).
Mas, na atualidade, um dos parâmetros mais importantes da
microbiologia geral é a pesquisa de novos produtos naturais, sintéticos
ou semi-sintéticos, os quais possam ser mais eficientes para o
tratamento das referidas infecções e bem menos tóxicos aos pacientes
(GRAYBILL, 1992). Nesse contexto o interesse em plantas medicinais
com propriedades medicamentosas tem evoluído com amplas
perspectivas, pela possibilidade que se tem em isolar substâncias
conhecidas ou inéditas a partir das mais variadas espécies de plantas.
Portanto, a partir de alguns relatos em literatura o nosso trabalho foi
fundamentado em todos esses parâmetros.
Tratando-se da atividade antibacteriana do extrato de Caesalpinia
xechinata Lam frente a bactérias de origem clínica e diversa, os
resultados deste trabalho diferiram totalmente dos dados encontrados
por Freire, 2004, que demonstrou ter ação ótima contra bactérias, em
especial às de origem Gram-negativas como o Proteus mirabilis, Proteus
vulgaris e Escherichia coli. Várias outras espécies do gênero Caesalpinia
têm sido descritas por apresentarem ações medicinais, muito embora
no Brasil seu uso não seja difundido, em outras partes do planeta já se
conhece há bastante tempo suas atividades e emprego no uso
medicinal. Estudos realizados por Kim e cols. (2004) avaliaram a
atividade do extrato do lenho da Caesalpinia sappan contra cepas
metaciclina-resitentes de Staphylococcus aureus obtendo inibição do
crescimento bacteriano em todas as amostras testadas. Todavia, em
nosso trabalho foi demonstrado a partir da realização dos testes in vitro
que o extrato etanólico em diferentes concentrações de Caesalpinia
echinata mostrou-se ineficaz frente às bactérias e aos fungos testados,
diferindo de relatos na literatura.
É cada vez mais estudado o potencial biológico de produtos
oriundos de espécies vegetais. E sempre no sentido de determinar a
94
atividade destas substâncias contra microrganismos de característica
patogênica como as espécies participantes neste estudo, principalmente
com ênfase naquelas de origem hospitalar.
O uso constante de medicamentos de origem vegetal e a
conseqüente recuperação da saúde, a não satisfação com a eficácia e o
alto custo dos medicamentos, associado à admiração pelos produtos
naturais, conduzem milhões de pessoas no mundo inteiro ao uso dos
medicamentos de origem natural para a terapêutica das mais diversas
patologias (ROBBERS e cols., 1997).
Conclusão
Nos últimos anos, pesquisas com plantas medicinais têm sido
desenvolvidas, considerando-se aspectos farmacológicos, botânicos,
fitoquímicos com ação antimicrobiana em especial contra fungos e
bactérias.
Estes objetivos tornam-se primordiais para pesquisadores do
mundo todo, e o este estudo traz consigo estes parâmetros. Apesar do
nosso trabalho não ter atingido o objetivo primordial que seria testar e
demonstrar a eficácia deste produto de origem natural contra
microrganismos de âmbito hospitalar, novas pesquisas e com
metodologia distinta, serão empregadas em uma continuidade do
estudo para a averiguação conforme relatos em literatura das mais
diversas recomendações do uso medicinal de Caesalpinia echinata Lam.
Agradecimentos
Agradecemos ao professor Antônio Camarotii (UNICAP), pelo
fornecimento do material botânico.
95
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LA VÉÇvÄâáÆxáLA VÉÇvÄâáÆxáLA VÉÇvÄâáÆxáLA VÉÇvÄâáÆxá
98
Diante dos resultados obtidos concluímos que:
De acordo com os valores de DL50 e CL50 apresentados podemos
concluir que o vegetal estudado apresenta toxicidade moderada quando
administrado por via intraperitoneal.
O extrato etanólico de cerne de C. echinata Lam apresenta baixa
toxicidade por via oral.
A avaliação das propriedades antiinflamatórias do vegetal demonstrou
que o mesmo, quando administrado por via intraperitoneal, possui a
capacidade inibir o processo inflamatório agudo.
A administração do EE por via oral não demonstrou inibição do edema
de pata induzido por carragenina nas doses testadas.
Quanto à capacidade de inibir o desenvolvimento tumoral, o extrato
mostrou-se eficaz contra as duas linhagens tumorais testadas, sendo
mais ativo contra o carcinoma de Ehrlich.
A avaliação histológica demonstrou que o tratamento com extrato de C.
echinata não promoveu alterações teciduais relevantes.
Não foi evidenciada nenhuma atividade antimicrobiana satisfatória do
extrato etanólico de c. echinata nas concentrações testadas.
99
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