AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS DE …biq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/000435914.pdf · Orientada: Cristiana Schmidt de Magalhães Orientador: ... meu muito obrigado. Aos

i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS

DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PLANTAS

MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS E QUANTIFICAÇÃO

DE METAIS ASSOCIADOS A ESSAS PROTEÍNAS

Orientada: Cristiana Schmidt de Magalhães Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda

CAMPINAS – SP OUTUBRO DE 2008

ii

v

Dedico esta Tese de Doutorado ao meu

marido Maurício, ao meu filho João Pedro e

meus pais Hélio e Ulda por todo amor e

apoio durante mais esta etapa da minha

vida.

vii

“Àquele que foi manifestado na carne,

foi justificado em espírito, contemplado

por anjos, pregado entre os gentios, crido

no mundo, recebido na glória.”

(I Carta de Paulo a Timóteo 3:16).

ix

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Campinas, em especial ao Departamento de

Química Analítica, pela oportunidade oferecida para a realização deste trabalho.

À Universidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, e ao Departamento de

Ciências Exatas pelo incentivo, suporte e apoio durante os anos de afastamento da

docência.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e

ao Programa de Qualificação Institucional (PQI) pela concessão de bolsa de estudo e

auxílio financeiro.

Ao professor Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda, pela orientação, apoio e amizade

durante esses anos.

Ao professor Dr. Pedro Orival Luccas, pela amizade e valiosos conselhos.

À professora Dra. Maria Elisa Pereira Bastos de Siqueira, por coordenar o

Programa de Qualificação Institucional (PQI) e pela amizade.

À professora Dra. Helenice Aparecida de Carvalho do Departamento de

Farmácia da UNIFAL-MG por disponibilizar o seu laboratório e equipamentos para a

realização das medidas de Kjeldhal.

Ao Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pelo suporte dado para a

execução dos experimentos na linha de fluorescência de raios-X, em especial ao Dr.

Carlos A. Pérez.

À todos amigos do Grupo de Espectrometria, Preparo de Amostras e

Mecanização (GEPAM): Adílson, Aline Lopes, Alessandra, Ana Christi, Eduardo,

Eraldo, Herbert e Marcelo pelo agradável convívio, meu muito obrigado.

Aos colegas e ex-alunos do laboratório Aline Klassen, Américo, André, Araceli,

César, Edenir, Fabíola, Geraldo, Jerusa, Joselito, Luciana, Marcel e Madson, pela

amizade.

Aos funcionários do Instituto de Química, especialmente a Sílvia, Rodrigo e Bel,

por sempre atenderem prontamente meus pedidos.

x

Aos meus pais, por sempre me acolherem com tanto amor e carinho em

Campinas.

Aos meus irmãos da Igreja Batista Ágape, pelas orações, pela amizade e

carinho em todos os momentos.

Ao meu marido, Maurício, por tanta compreensão nas minhas ausências,

apoio, amor e cuidado comigo nestes anos.

Ao meu filhinho, João Pedro, pela alegria que sempre me proporciona.

Enfim, a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste

trabalho.

Muito Obrigada!

xi

SÚMULA CURRICULAR

1. DADOS PESSOAIS

Nome: Cristiana Schmidt de Magalhães Data de Nascimento: 16 de Abril de 1967 Naturalidade: São Paulo - SP Filiação: Hélio Schmidt e Ulda de Souza Moraes Schmidt Endereço eletrônico: [email protected]

2. FORMAÇÃO ACADÊMICA

2003 – 2008 Doutorado em Ciências

Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP Título: Avaliação comparativa de procedimentos de extração de proteínas em plantas medicinais e fitoterápicos e quantificação de metais associados a essas proteínas.

1991 – 1994 Mestrado em Física

Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP Título: Fotoluminescência estacionária em Carbeto de Silício amorfo hidrogenado. 1987 – 1991 Graduação em Física

Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP 3. PRODUÇÃO CIENTÍFICA

Artigos publicados, aceitos e submetidos

• Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Sample preparation for metalloprotein analysis: A case study using horse chestnuts, Talanta, 71(2007)1958. • Garcia, J. S., Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1. • Figueiredo, E. C., Souza, L. R., Magalhães, C. S. Wisniewski, C., Luccas, P. O., A home-made autosampler/injector commutator for flow injection analysis, Journal of Automated Methods & Management in Chemistry, 2006(2006)1. � Magalhães, C. S., Perez, C. A., Arruda, M. A. Z., Qualitative Evaluation of Metal Presence in Phytomedicine Proteins Through X-Ray Fluorescence, Activity Report, 2005. • D´andréa, E. D., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Semaan, F. S., Artérias e veias simuladas no laboratório, Ciência Hoje, 36(2005) 72. • Rodrigues, J. L., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Flow injection

xii

spectrophotometric determination of Al in hemodialysis solutions, Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis, 36(2005)1119. • Moreira, L. N., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Emprego de sistema e análise em fluxo contínuo com biossensor potenciométrico para determinação de adrenalina em medicamentos, Infarma, 16(2005)59. • Louzada, E. S., Luccas, P. O., Magalhães, C. S., Construção e caracterização de um biossensor potenciométrico para determinação de pirogalol, Analytica, 2(2004)52. • Semaan, F. S., Vieira, A. L. N., Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Construção de eletrodo tubular de cobre revestido íon seletivo a cloreto para uso em sistema de análise em fluxo contínuo, Revista da Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas, 23(2002). • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence, Disorder and Localization in Hydrogenated Amorphous Silicon Carbon Alloys, Brazilian Journal of Physics, 24(1994)416. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence Studies on Silicon Carbon Alloys, Journal of Non-Crystalline Solids, 1027(1993)164. • Magalhães, C. S., Alvarez, F., Properties of Amorphous Silicon-Carbon Alloys with Very Low Densities of States, Journal of Physics Condensed Matter, 5(1993). • Novellino, R. A., Vazquezlópes, C., Bernussi, A. A., Schmidt, C., Cerdeira, F., Motisuke, P., Pollak, F. H., Ploog, K., On the origin of Franz-Keldysh oscillations in AlGaAs/GaAs modulation-doped heterojuctions, Journal of Applied Physics, 70(1991)5570.

Capítulo de Livro

• Magalhães, C. S., Garcia, J. S., Lopes, A. S., Figueiredo, E. C., Arruda, M. A. Z., Strategies for sample preparation focusing biomolecules determination/characterization, In: Marco Aurélio Zezzi Arruda (Ed.) Trends in Sample Preparation, 1st ed., Nova Science, New York, 2006.

Principais trabalhos apresentados em eventos

• Magalhães, C. S., Arruda, M A. Z., Identificação e Quantificação de Metais em Proteínas de Folha de Sene (Cássia Angustifólia vahl). XLVI Congresso Brasileiro de Química – ABQ, 2006, Salvador. • Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Evaluation of Protein Extraction Procedures from Phytomedicines and their Separation by SDS-PAGE, apresentação oral. 7th International Symposium on Advances in Extraction Technologies, 2005, Campinas. • Magalhães, C. S., Pérez, C. A., Arruda, M. A. Z., Metalômica Quali e Quantitativa de Proteínas de Castanha da Índia in natura, apresentação oral. 13o. Encontro Nacional de Química Analítica, 2005, Niterói. • Magalhães, C. S., Arruda, M A Z., Evaluation of protein extraction procedures in phytotherapic medicines. Trends in Sample Preparation 2004, 2004, Seggau –

xiii

Castle/ Styria, Austria. • Magalhães, C. S., Luccas, P. O., Arruda, M. A. Z., Determination of Pb, Cd and Cu in Phytotherapics by ETAAS and TS-FF-AAS after Microwave-Assisted Digestion. 8th Rio Symposium on Atomic Spectrometry, 2004, Paraty, RJ. • Magalhães, C. S., Perez, C. A., Arruda, M. A. Z., Avaliação Qualitativa da presença de Metais em Proteínas de Fitoterápicos por Fluorescência de Raios-X. XIV Reunião anual de Usuários do LNLS, 2004, Campinas. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Estudo do comprimento de Localização em a-SiC:H e a-Si:H através da fotoluminescência dependente da temperatura, apresentação oral. Oficina de Propriedades de Materiais de Camada Fina para Aplicações Fotovoltáicas, Microeletrônicas e Recobrimentos, apresentação oral. 1994, Campinas. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence Studies on Silicon Carbon Alloys, apresentação oral. XV International Conference on Amorphous Semiconductors: Science and Technology, 1993, Cambridge. • Magalhães, C. S., Bittencourt, C., Alvarez, F., Photoluminescence, Disorder and Localization in Hydrogenated Amorphous Silicon Carbon Alloys, apresentação oral. 6th Brazilian School of Semiconductor Physics, 1993, São Carlos. • Magalhães, C. S., Alvarez, F., Properties of Amorphous Silicon-Carbon Alloys with Very Low Densities of States, apresentação oral. SLAFS-7-70, Simposio Latinoamericano de Fisica de Superficies, 1992, Bariloche.

Total de trabalhos em eventos internacionais: 7 Total de trabalhos em eventos nacionais:41 Participações em eventos científicos: 23

• HISTÓRICO PROFISSIONAL • Professor Assistente, Dedicação Exclusiva

- Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL-MG Disciplina de Física

Período: 1999 – atualmente

• Pesquisa e Desenvolvimento - Fundação Centro Tecnológico para Informática – CTI Projeto: Pesquisa e Desenvolvimento de TFT´s – Transistores de Filmes Finos – através de Pulverização Catódica “Sputtering”

Período: 1994 – 1995

xv

RESUMO

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE

PROTEÍNAS EM PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS E QUANTIFICAÇÃO

DE METAIS ASSOCIADOS A ESSAS PROTEÍNAS

Autora: Cristiana Schmidt de Magalhães

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda

Este trabalho de Tese apresenta os resultados da avaliação de onze

procedimentos de extração de proteínas nas plantas medicinais ginkgo biloba (Ginkgo

biloba L.) e castanha da Índia (Aesculus hippocastanum) e no fitoterápico Espirulina

(Spirulina maxima). Os procedimentos variaram desde a simples agitação até àqueles

onde se somavam várias etapas, tais como agitação, maceração, sonicação e

centrifugação. A avaliação foi feita em termos da comparação da concentração de

proteínas totais extraídas por meio de cada procedimento, utilizando-se o método de

Bradford e de Kjeldhal. Os procedimentos contendo mais etapas se mostraram mais

eficientes na extração de proteínas. Também foi feito o mapa protéico da castanha da

Índia (Aesculus hippocastanum) e avaliada a influência dos procedimentos de

extração de proteínas no perfil protéico da referida amostra. Para isso foi feita a

separação das proteínas presentes nos extratos protéicos utilizando-se eletroforese

SDS-PAGE. Esta separação (para as proteínas desnaturadas e sob condição não-

redutora) permitiu identificar, em termos de massa molar, quais proteínas compunham

os extratos protéicos, onde se verificou uma banda mais expressiva (MM = 33,2 ± 0,9

kDa), independentemente do procedimento de extração usado, fato que foi

relacionado à mobilidade da proteína. Quando a separação ocorria sob condições

redutoras, a banda mais expressiva apresentava MM = 23,5 ± 0,5 kDa. Com a

finalidade de se fazer uma investigação mais detalhada, as proteínas da castanha da

Índia que foram extraídas pelo procedimento de maceração e centrifugação, foram

também separadas por eletroforese bidimensional, na qual houve o desdobramento

xvi

da banda mais expressiva em pelo menos nove bandas protéicas. Estas bandas

foram decompostas tripticamente e foram analisadas por espectrometria de massas,

com a obtenção de várias seqüências peptídicas que se repetiam em várias bandas

diferentes. Estes resultados sugerem que estas proteínas se tratam de isoformas.

Finalmente, foi proposta a identificação de quais íons metálicos estariam ligados às

proteínas, o que foi possível por meio do mapeamento das bandas protéicas

utilizando-se a fluorescência de raios-X com radiação Síncrotron. Foram identificados

4 íons metálicos, os quais foram investigados quantitativamente. As bandas

separadas por SDS-PAGE e por 2D-PAGE foram decompostas por radiação

microonda e a determinação das concentrações dos íons metálicos foi obtida por

ETAAS e FAAS. Para as bandas separadas por 2D-PAGE observou-se uma

interessante distribuição não homogênea dos íons metálicos, sugerindo que algumas

se trataram de metaloproteínas, enquanto outras não. Assim, estas proteínas podem

ser de origem citosólica e de armazenamento, e que, embora sejam apenas

coadjuvantes na ação medicinal da castanha, participariam ativamente nos processos

germinativos e metabólicos da planta.

xvii

ABSTRACT

COMPARATIVE EVALUATION OF PROTEIN EXTRACTION PROCEDURES IN

MEDICINAL PLANTS AND PHYTOMEDICINES AND QUANTIFICATION OF

ASSOCIATED METALS TO THESE PROTEINS

Author: Cristiana Schmidt de Magalhães

Adviser: Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda

This work presents the evaluation of eleven protein extraction procedures using

ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.), horse chestnut (Aesculus hippocastanum) medicinal

plants, and also using the phytomedicine Spirulina (Spirulina maxima). The

procedures varied since the agitation only until the addition of several steps, such as

agitation, maceration, sonication, and centrifugation. This evaluation was made by

comparing the total extracted proteins through Bradford and Kjeldhal methods. The

more efficient protein extraction procedures were those whose steps were added. The

influence of protein extraction procedures was also evaluated in the protein map of

horse chestnut (Aesculus hippocastanum). The proteins present in extracts were

separated by SDS-PAGE. This separation (for denatured and non-reduced proteins)

allowed identifying the more expressive protein band (MM = 33.2 ± 0.9 kDa)

independently of the used procedure. When the separation was carried out under

reduced and denatured conditions, the more expressive protein band had MM = 23.5

± 0.5 kDa. This difference in MM was attributed to protein mobility. The horse chestnut

proteins extracted by maceration and centrifugation were also separated by two-

dimensional electrophoresis in order to obtain a more detailed protein profile. Through

this separation, the more expressive band was folded in, at least, nine protein bands.

These bands were triptically decomposed and analysed by mass spectrometry.

Several peptide sequences that repeated in different protein bands were obtained.

These results suggested to deal of isoforms. Finally, the identification of metallic ions

bonded to proteins, using Sincrotron radiation- X-ray fluorescence was also proposed.

xviii

Four metallic ions were identified, which were quantitaively investigated. The protein

bands separated by SDS-PAGE and by 2D-PAGE were decomposed using

microwave radiation, and metallic ion concentrations were determined by ETAAS and

FAAS techniques. For 2D-PAGE bands an interesting non-homogeneous metallic ion

distribution was observed, suggesting that some proteins can be metalloproteins or

metal-binding proteins. Therefore, these studied proteins probably present a citosolic

origin and storing function. However, they may be coadjuvants at medicinal action,

and much probably participate in germinating and metabolic processes.

xix

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS...................................... xxv

LISTA DE QUADROS.......................................................................... xxix

LISTA DE TABELAS............................................................................ xxx

LISTA DE FIGURAS............................................................................ xxxii

INTRODUÇÃO .................................................................................... 01

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................... 02

Capítulo 1 - Preparo de Amostras e Procedimentos de Extração de Proteínas de Plantas Medicinais e Fitoterápicos.............................

05

1. OBJETIVOS..................................................................................... 07

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................ 07

2.1 Procedimentos de extração de proteínas.................................. 07

2.1.1 Rompimento celular.................................................................... 08

2.1.2 Inativação ou remoção de interferentes...................................... 10

2.1.3 Solubilização de proteínas.......................................................... 12

2.2 Plantas medicinais e fitoterápicos ............................................. 14

2.2.1 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos–Definições ..... 15

2.2.2 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos -Perspectivas.........................................................................................

15

2.2.3 Espirulina, Ginkgo biloba e Castanha da Índia............................ 16

2.3 Determinação de proteínas totais.............................................. 21

xx

2.3.1 Método de Bradford..................................................................... 22

2.3.2 Método de Kjeldahl...................................................................... 23

3. PARTE EXPERIMENTAL................................................................ 24

3.1 Equipamentos e acessórios....................................................... 24

3.2 Reagentes e soluções................................................................. 25

3.3 Preparo das amostras................................................................ 26

3.4 Extração das proteínas................................................................ 27

3.5 Determinação da concentração de proteínas totais............... 30

3.5.1 Método de Bradford..................................................................... 30

3.5.2 Método de Kjeldahl...................................................................... 30

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................... 31

5. CONCLUSÕES PARCIAIS.............................................................. 38

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................ 39

Capítulo 2 – Mapa Protéico da Castanha da Índia............................... 47

1. OBJETIVOS..................................................................................... 49


2.1 Proteínas – Aspectos gerais....................................................... 49

2.1.1 Proteínas em plantas................................................................... 50

2.2 Eletroforese................................................................................... 52

xxi

2.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida em uma dimensão (1D PAGE) ................................................................................................

54

2.2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões (2D PAGE) ..................................................................................................

55

2.3 Espectrometria de massas.......................................................... 56

2.3.1 Digestão tríptica ......................................................................... 56

2.3.2 MALDI-TOF-MS .......................................................................... 57

2.3.3 Espectros de massas.................................................................. 58


3.1 Equipamentos e acessórios....................................................... 60

3.2 Reagentes e soluções.................................................................. 60

3.3 Separação eletroforética em uma dimensão (SDS-PAGE)..................................................................................................

62

3.3.1 Preparo das amostras para a separação eletroforética baseada em SDS-PAGE .....................................................................

62

3.3.2 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)..................................................................

63

3.4 Separação eletroforética em duas dimensões (2D-PAGE)..................................................................................................

64

3.4.1 Otimização da metodologia para a separação por 2D-PAGE...................................................................................................

64

3.4.2 Separação bidimensional de proteínas por eletroforese com focalização isoelétrica e em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)..................................................................................................

65

3.5 MALDI-TOF-MS............................................................................. 66

3.5.1 Digestão tríptica dos spots de proteínas..................................... 66

3.5.2 Caracterização de proteínas por MALDI-QTOF-MS................... 66

xxii

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 68

4.1 Géis SDS-PAGE............................................................................ 68

4.1.1 Determinação de massa molar e de massa de proteína por densidade óptica..................................................................................

69

4.2 Géis 2D-PAGE............................................................................... 73

4.3 MALDI-TOF-MS............................................................................. 77

5. CONCLUSÃO PARCIAL................................................................. 87


Capítulo 3 - Determinação e Quantificação de Metais Associados às Proteínas..............................................................................................

91

1. OBJETIVOS..................................................................................... 93


2.1 Metaloproteínas e proteínas de metal ligante............................ 93

2.2 Fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)...............................................................................................

95


3.1 Equipamentos e acessórios........................................................ 97

3.2 Reagentes e soluções.................................................................. 98

3.3 Mapeamento dos metais ligados às proteínas nas bandas por fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)...............................................................................................

99

3.4 Decomposição ácida sob radiação microonda......................... 100

3.5 Determinação de metais por ETAAS e FAAS nas bandas SDS-PAGE e 2D-PAGE.......................................................................

101

xxiii

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 102

4.1 Avaliação qualitativa dos metais ligados às proteínas nas bandas por SRXRF.............................................................................

102

4.2 Avaliação quantitativa dos metais ligados às proteínas nas bandas separadas por SDS-PAGE e 2D-PAGE utilizando as técnicas ETAAS e FAAS....................................................................

104

5. CONCLUSÃO PARCIAL.................................................................. 111


CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ...................................... 115

Apêndice 1........................................................................................... 117

Apêndice 2.......................................................................................... 119

Apêndice 3........................................................................................... 121

Apêndice 4........................................................................................... 123

Apêndice 5........................................................................................... 133

xxv

LISTA DE ABREVIATURAS E ACRÔNIMOS

1D Uma Dimensão

1D - PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em uma dimensão (do

inglês, One Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

2D Duas Dimensões

2D-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida em duas dimensões (do inglês, Two Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

AAS Espectrometria de Absorção Atômica (do inglês, Atomic Absorption Spectrometry)

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ATP Adenosina Tri-Fosfato (do inglês, Adenosine Tri-Phosphate)

BCA Ácido Bicinchonínico

BPFC Boas Práticas de Fabricação e Controle

CE Eletroforese Capilar (do inglês, Cappilary Electrophoresis)

Da Dalton (1 Da = 1,661x10-24 g)

Electrospray-MS do inglês, Electrospray Ionization Mass Spectrometry

ESI Ionização por Eletro Spray (do inglês, Electro Spray

Ionization)

ETAAS Espectrometria de Absorção Atômica com Atomização Eletrotérmica (do inglês, Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry)

FAAS Espectrometria de Absorção Atômica com Chama (do inglês, Flame Atomic Absortion Spectrometry)

g Gravidades

GeV Gigaeletronvolts

xxvi

HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (do inglês, High Performance Liquid Chromatography)

HPGe Detector de Alta Pureza de Ge (do inglês, High Purity Ge

Detector)

ICP-MS Espectrometria de Massas com Fonte de Plasma Acoplado Indutivamente (do inglês, Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)

IEF Focalização Isoelétrica (do inglês, Isoelectric Focussing)

K Lisina

LC Cromatografia Líquida (do inglês, Liquid Chromatography)

LC-MS Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês, Liquid Chromatography – Mass Spectrometry)

LD Limite de Detecção

LDI+ Modo íon positivo

LQ Limite de Quantificação

LNLS Laboratório Nacional de Luz Síncroton

MALDI Dessorção/Ionização de Matriz Assistida por Laser (do inglês, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)

MALDI-TOF-MS Espectrometria de Massas por tempo de Vôo acoplada à Ionização dessortiva de Matriz assistida por Laser (do inglês, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)

MCP do inglês, Microchannel Plate

MM Massa Molar

MG Minas Gerais

MS Espectrometria de Massas (do inglês, Mass Spectrometry)

MSDB Banco de Dados (do inglês, Mass Spectrometry Data Bank)

MTs Metalotioneínas

ng Nanogramas (1x10-9 g)

xxvii

OMS Organização Mundial de Saúde

P Prolina

pg Picogramas (1x10-12 g)

PAF Fator Ativador de Plaquetas

PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (do inglês, Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

P prolina

pI Ponto Isoelétrico

ppm partes por milhão

PTM Proteínas modificadas pós translacionalmente (do inglês, Post Translationally Modified Proteins)

QTOF-MS Espectrometria de Massas assistida por Quadrupolo com Tempo de Vôo (do inglês, Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry)

REBLAS Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde

R Arginina

R2 Coeficientes de correlações lineares

SDS-PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio (do inglês, Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

SPE Extração por Fase Sólida (do inglês, Solid Phase Extraction)

spot Banda 2D de proteínas

SR Radiação Síncrotron (do inglês, Sincrotron Radiation)

SRXRF Fluorescência de Raios-X por Radiação Síncrotron (do inglês,

Sincrotron Radiation X-Ray Fluorescence)

TOF Tempo de Vôo (do inglês, Time Of Flight)

Unifal-MG Universidade Federal de Alfenas

UV Ultra Violeta

xxviii

UV/Vis Ultra Violeta/ Visível

XRF Fluorescência de Raios-X (do inglês, X-Ray Fluorescence)

W Watts

xxix

LISTA DE QUADROS

Quadro 1.1 Procedimentos de extração de proteínas para as diferentes amostras......................................................................................

29

Quadro 3.1 Exemplos de algumas metaloproteínas....................................... 95

xxx

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 Concentrações de proteínas totais ± desvio padrão (em mg g-1) nas amostras determinadas pelo método de Bradford (N=3) para os diferentes processos de extração de proteínas....................................32

Tabela 2.1 Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4...............................................70

Tabela 2.2 Massas estimadas de proteína (em µg) a partir das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4.......................................71

Tabela 2.3 Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.6...............................................72

Tabela 2.4 Dados estimados dos spots, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0..............................................................................75

Tabela 2.5 Valores estimados das massas de proteínas (em µg) em cada spot, com os respectivos valores de porcentagens, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0..................................................76

Tabela 2.6 Dados estimados dos spots protéicos do gel 2D-PAGE da Figura 2.8, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0................79

Tabela 2.7 Razões m/z e as sequências peptídicas identificadas para as proteínas dos spots B a Q, provenientes dos espectros MS/MS...................................................................................................83

Tabela 3.1 Contagens relativas de metal das emissões Kα de íons metálicos. Os dados da intensidade média (contagens de íons de metal) foram calculados a partir dos três pontos mapeados, bem como foram descontadas as diferenças entre as intensidades das contagens das amostras e dos brancos analíticos......................................................102

Tabela 3.2 Concentrações de metais nas proteínas separadas por SDS-PAGE (média ± desvio padrão, n=3). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS.......................................................................105

Tabela 3.3 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) obtidos experimentalmente nas amostras de bandas protéicas usando as técnicas de ETAAS e FAAS................................................................105

Tabela 3.4 Concentrações de metais nos spots de proteínas do gel 2D-PAGE da castanha da Índia (vide Fig.2.7, Capítulo 2). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS (média ± desvio padrão, n=3).....................................................................................................108

xxxi

Tabela 3.5 Estimativa das quantidades de metal nas proteínas identificadas........................................................................................109

Tabela 3.6 Estimativa dos números de moléculas de proteínas e números de átomos de cada metal em cada spot..................................................110

xxxii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Espirulina (Spirulina máxima)..................................................................17

Figura 1.2 Folhas de Ginkgo biloba. Foto extraída do site: http://www.xs4all.nl/~kwanten/thetree.htm..............................................18

Figura 1.3 Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum). Ilustração extraída de http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Illustration_Aesculus_hippocastanum0.jpg.........................................................................................................20

Figura 2.1 Uma proteína típica: Diagrama de ligações peptídicas e N e C terminais..................................................................................................49

Figura 2.2 Anatomia de uma célula de planta. Ilustração adaptada de [5]..............51

Figura 2.3 Ilustração dos processos que ocorrem durante a MALDI. Adaptada de Nyman [16]..............................................................................................58

Figura 2.4 Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos, nos quais foram utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares. Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm..........................................................................................................69

Figura 2.5 Variação das densidades ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do padrão protéico (linha azul) e do extrato bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha).............70

Figura 2.6 Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos diluídos com tampão dissociante, nos quais foram utilizados os procedimentos 1 (sem diluição), 4, 5, 8 e 9 (diluídos com tampão dissociante) e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares (em kDa). Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm...............................................................72

Figura 2.7 Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de MM de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão denominados de A a I, da esquerda para direita. No destaque, à direita superior, estão as bandas protéicas em três dimensões...............................................................................................74

Figura 2.8 Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5

xxxiii

(amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de massa molar de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão destacados em vermelho e denominados de A a Q, da esquerda para direita.....................................................................78

Figura 2.9 Espectros de massas em duplicata para as proteínas dos spots A e H..............................................................................................................80

Figura 2.10 Espectros de massas gerados para os spots protéicos B, C, G, I e N........................................................................................................................81

Figura 3.1 Configuração do sistema utilizado para a aquisição dos dados referentes ao mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas.................................................................................................99

Figura 3.2 Espectros de raios-X adquiridos na análise por SRXRF: (a) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 33,0 kDa extraída por procedimento 1 (—); (b) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 33,0 kDa extraída por procedimento 2 (—); (c) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 23,5 kDa extraída por procedimento 8 (—) (d) branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—) e proteína de 23,5 kDa extraída por procedimento 9 (—). As contagens relativas das emissões Kα de íons variaram de 0 a 3000......................................................................................................102

Tese de Doutorado Introdução Cristiana S. de Magalhães

1

INTRODUÇÃO

Esta Tese foi preparada em três Capítulos distintos, mas interligados, visando

uma melhor compreensão e clareza do assunto proposto.

É bem conhecido que o preparo de amostras é freqüentemente o passo mais

problemático na seqüência analítica por ser bastante trabalhoso, com etapas

complexas e tediosas, consumir muito tempo, bem como ser o responsável, muitas

vezes, por erros aleatórios e sistemáticos nos resultados finais produzindo

informações (bio)químicas inadequadas [1]. Outro problema a ser considerado

relaciona-se à instabilidade do analito, principalmente quando se trata de análise de

biomoléculas [2]. Assim, é importante que exista um compromisso entre o preparo das

amostras e os procedimentos adequados para a manutenção da integridade dos

analitos [3]. No primeiro Capítulo, foram sugeridos vários procedimentos de preparo

de amostras e de extração de proteínas em algumas plantas medicinais e

fitoterápicos. Estas amostras foram escolhidas pelo grande interesse tanto no aspecto

científico, quanto no aspecto comercial. Para a avaliação comparativa entre os

procedimentos propostos foram utilizados métodos analíticos já bem estabelecidos na

literatura [4 - 6], definindo-se a castanha da Índia como amostra de estudo.

É impossível estudar o comportamento dos sistemas biológicos enfocando

exclusivamente o genoma, pois são as proteínas, e não os genes, que determinam o

fenótipo de um organismo. Por exemplo, em resposta a um estímulo interno ou

externo, a síntese de algumas proteínas pode ser estimulada ou inibida; estas

proteínas podem sofrer modificações pós-transducionais ou podem ser degradadas

ou, ainda, ser realizadas em diferentes locais da célula [7]. A proteômica estuda os

processos biológicos através da análise sistemática das proteínas expressas nas

células ou tecidos, em conseqüência direta das condições externas e do estado do

organismo em um determinado momento. Obter o proteoma de uma célula ou

organismo é como fazer uma “fotografia instantânea” das proteínas expressas

naquele determinado momento. Pode-se afirmar, portanto, que cada genoma,

potencialmente, pode originar um número infinito de proteomas [7, 8].


2

Têm sido realizados esforços e avanços para se entender as metaloproteínas,

principalmente no que concerne à estrutura e funções dos sítios metálicos, bem como

das implicações biológicas das suas interações. O processo analítico para a

identificação e quantificação de uma metaloproteína inclui pelo menos três etapas: (i)

uma etapa seletiva, na qual é necessário que se use uma técnica de separação (tais

como LC, CE, 2DE ou 2D-PAGE) para o isolamento da metaloproteína da matriz; (ii)

uma etapa estrutural, na qual se tem por objetivo uma caracterização mais exata das

biomoléculas em estudo (onde podem ser usadas técnicas como, por exemplo,

MALDI-TOF-MS ou QTOF-MS) e (iii) uma etapa quantitativa, para a quantificação das

espécies metálicas (utilizando-se técnicas como, por exemplo, ICP-MS ou AAS).

As primeiras duas etapas foram exploradas no Capítulo 2 desta Tese, em que

se caracterizaram as proteínas da amostra castanha da Índia por meio de técnicas

analíticas de eletroforese, em uma e duas dimensões, e de MALDI-TOF-MS.

No terceiro Capítulo, objetivou-se a investigação da presença de metais nas

estruturas das proteínas caracterizadas e a influência da preservação dos mesmos,

ao se utilizar os diversos processos de extração de proteínas sugeridos no Capítulo 1.

Foram utilizadas as técnicas SRXRF, para a identificação e AAS, para a quantificação

das espécies metálicas ligadas às proteínas.

Desta maneira, buscou-se interligar as informações obtidas em todos os

Capítulos, fornecendo um panorama do proteoma e do metaloproteoma da amostra

em estudo, enfatizando os cuidados com a manipulação da amostra neste tipo de

estudo.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Sample preparation for metalloprotein analysis: A case study using horse chestnuts, Talanta, 71(2007)1958. [2] Magalhães, C. S., Garcia, J. S., Lopes, A. S., Figueiredo, E. C., Arruda, M. A. Z., Strategies for Sample Preparation Focusing on Biomolecules Determination/Characterization, In: Marco Aurélio Zezzi Arruda (Ed.) Trends in Sample Preparation, 1st ed., Nova Science, New York, 2006.


3

[3] Garcia, J. S., Magalhães, C. S., Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1. [4] Zaia, D. A. M., Zaia, C. T. B. V., Lichtig, J., Determinação de Proteínas Totais via espectrofotometria: Vantagens e Desvantagens dos Métodos Existentes, Química Nova, 21(1998)787. [5] Bradford, M. M., Rapid And Sensitive Method For Quantitation Of Microgram Quantities Of Protein Utilizing Principle Of Protein-Dye Binding, Anal. Biochem. 72(1976)248. [6] Cecchi, H. M., Fundamentos Teóricos e Práticos em análise de alimentos, Cap. 6, ed. Unicamp, Campinas, 1999, 60. [7] Pereira, A. S., Bicalho, B., Lília, S., De Nucci, G., Desafios da Química analítica frente às necessidades da indústria farmacêutica, Química Nova, 28(2005)S107. [8] Graves, P. R., Haystead, T. A. J., Molecular biologist's guide to proteomics, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66(2002)39.

5

CAPÍTULO 1

Procedimentos de Preparo de Amostras e

de Extração de Proteínas em Plantas

Medicinais e Fitoterápicos

Tese de Doutorado Capítulo 1 Cristiana S. de Magalhães

7

1. OBJETIVOS

• Propor procedimentos de extração de proteínas para algumas plantas

medicinais e fitoterápicos, levando em conta a dificuldade no preparo deste tipo

de amostra vegetal;

• Avaliar alguns procedimentos de extração de proteínas em termos de eficiência

de extração, através da determinação de proteínas totais utilizando-se os

métodos de Kjeldhal e Bradford;

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Procedimentos de extração de proteínas

Existem vários procedimentos descritos na literatura para a extração de

proteínas. Esses procedimentos estão relacionados com o objetivo da extração, ou

seja, para qual fim a proteína estará sendo extraída, como, por exemplo, para se

medir a sua concentração, ou a atividade enzimática, para separação por técnicas

como eletroforese ou cromatografia, para se estabelecer a seqüência de aminoácidos

ou se determinar a estrutura tridimensional de uma proteína. Entretanto, algumas

recomendações gerais devem ser seguidas. As etapas de extração devem ser as

mais simples possíveis para garantir a reprodutibilidade dos resultados e as

modificações nas estruturas das proteínas devem ser minimizadas para evitar

modificações químicas nas determinações. Os três passos fundamentais no preparo

de amostras de proteínas são rompimento celular, inativação ou remoção de

interferentes e solubilização das proteínas [1 - 5]. Assim, serão descritos, nos

próximos itens, alguns procedimentos comumente utilizados para extração de

proteínas.


8

2.1.1 Rompimento celular

O rompimento celular pode ser obtido tanto por procedimentos químicos como

físicos, dependendo da natureza da amostra e do tipo de análise que se deseja

utilizar. As células de microorganismos ou de tecidos de plantas geralmente requerem

condições mais drásticas para a lise celular, devido à robustez da parede celular

deste tipo de amostras. Já amostras mais delicadas, como células de mamíferos ou

organelas celulares (como mitocôndrias) exigem procedimentos mais amenos [6].

Vários procedimentos de lise (destruição celular por rompimento das células

devido à destruição da membrana celular [7]) podem ser utilizados, como, lise

osmótica (quando a célula é suspensa em um meio hipotônico e seu volume sendo

aumentado até ocorrer a lise da membrana [8]), lise por detergentes e lise enzimática

da parede celular. Além desses, também se utilizam a agitação, a maceração a várias

temperaturas (ambiente, a zero grau Celsius ou com nitrogênio líquido). Em amostras

sólidas, geralmente, emprega-se a maceração manual sob nitrogênio líquido para

transformar a amostra em um pó fino. Pode ser usada também a trituração com sonda

de aço, capaz de promover a homogeneização do material, além de cortá-lo em

pequenos pedaços. Para amostras líquidas, utiliza-se ultra-som (ou sonicação) para

homogeneizar o material e romper as células [9], além da centrifugação [10]. As

ondas ultra-sonoras de alta potência (< 1 W a milhares de W cm-2) causam

permanente mudança física e química porque produzem cavitação e microfluidos nos

líquidos, aquecimento e ruptura de sólidos e instabilidade na superfície da interface de

sistemas líquido-líquido e líquido-gás [11]. A propagação das ondas ultra-sonoras no

meio reacional cria uma variação de pressão, a qual é responsável pela cavitação,

que pode ser definida como a formação e implosão de microbolhas de gás no centro

de um líquido. A variação de pressão cria, num ponto do líquido, momentos de

compressão e descompressão alternados. A cavitação acústica envolve três estágios:

formação de núcleos de cavitação, crescimento das bolhas e violentas implosões. No

momento da implosão, há formação de ondas de choque e na fase final esperam-se,

no centro da bolha, temperatura e pressão muito elevadas, da ordem de 10000 K e

1000 atm. Nos sistemas heterogêneos, nas interfaces sólido-líquido, a natureza da


9

destruição das bolhas se apresenta diferente. A destruição se faz de forma não

simétrica, dando origem a um jato de líquido dirigido para a superfície sólida. Além

disso, micro-fluxos de líquido são formados devido à absorção de grande quantidade

de energia vibracional dentro de pequeno volume, com pouco ou nenhum

aquecimento associado. Isto favorece o transporte de massa entre a fase líquida e as

superfícies sólidas, contribuindo para a aceleração da velocidade da reação. Assim, a

eficiência da extração de um analito depende das variáveis que influenciam no

processo no processo de cavitação (temperatura, viscosidade, presença de partículas

sólidas, altura da coluna de água, freqüência e posição dos frascos dentro do banho).

Tão logo as condições experimentais estejam otimizadas, o processo de ultra-som é

bastante eficiente para a extração sólido-líquido [11, 12].

Como exemplo de estudo de procedimentos de rompimento celular, Chan et al.

[13] otimizaram as condições de preparo de amostras para análise por eletroforese

em duas dimensões de Prorocentrum triestinum, um dinoflagelado. Eles

reconheceram que o primeiro passo do preparo da amostra era o rompimento celular

para a liberação de todo o conjunto de proteínas do organismo. Na amostra em

estudo, seriam necessários métodos mais vigorosos de rompimento celular, uma vez

que os dinoflagelados são encapsulados por paredes celulares robustas. Para isso,

eles propuseram o uso da sonicação e da agitação vigorosa com o uso de lâminas de

vidro num agitador de vidro. Foi tomada aproximadamente uma massa de 150 mg de

células de P. triestinum, previamente centrifugada e homogeneizada num tampão

Tris-HCl resfriado (4oC), que foi submetida à agitação com as lâminas de vidro ou à

sonicação. Ao se compararem os resultados pelos dois métodos, os autores

obtiveram aumento de 5% quando utilizaram a sonicação na extração de proteínas

por peso úmido de amostra em relação à extração quando utilizaram as lâminas de

vidro. Considerando que os resultados mostraram padrões similares ao se

compararem os géis de eletroforese em duas dimensões, os autores elegeram a

sonicação como o método mais efetivo de rompimento celular para os dinoflagelados.


10

2.1.2 Inativação ou remoção de interferentes

Durante ou após o rompimento celular, vários compostos interferentes como

enzimas proteolíticas (proteases), sais, ácidos nucléicos, polissacarídeos, fenóis e/ou

proteínas muito abundantes precisam ser removidos ou inativados. Em material

vegetal podem ser incluídos, também, as ligninas, os pigmentos e os alcalóides.

Desses, os mais importantes interferentes, ou seja, os que mais causam

interferências ou erros nas determinações são os sais e as proteases.

As proteases devem ser inativadas para impedir a degradação das proteínas.

Inibidores de proteases são usualmente adicionados, mas podem modificar as

proteínas, causando erros nas análises [6]. Outras alternativas são levar a amostra ao

ponto de ebulição num tampão com dodecil sulfato de sódio (SDS / sem uréia) ou

inativar as proteases com valores de pH baixo (por exemplo, precipitando com ácido

tricloroacético – TCA). Porém, deve-se levar em conta a dificuldade de se inativar

completamente todas as proteases [14].

A precipitação das proteínas com ácido tricloroacético/acetona (TCA/AC) é

muito útil para minimizar a degradação destas e remover compostos interferentes, tais

como sais ou polifenóis. Entretanto, é importante ressaltar que podem ocorrer perdas

de proteínas devido à precipitação ou re-solubilização incompleta. Além disso, pode-

se obter um conjunto completamente diferente de proteínas extraídas com um tampão

de lise, dependendo se foi utilizada uma etapa prévia de precipitação ou não [15]. A

remoção de sais pode ser obtida pela diálise ou, como já dito acima, pela precipitação

de proteínas com TCA ou solventes orgânicos (por exemplo, acetona a zero grau

Celsius). Outra alternativa seria utilizar kits de limpeza ou a diluição da amostra para

que a concentração de sais fique abaixo do nível crítico (<100 mmol L-1) [16].

Grandes quantidades de lipídeos podem interagir com proteínas da membrana

e consumir detergentes. A remoção de lipídeos pode ser realizada pela extração com

solventes orgânicos (por exemplo, etanol ou acetona a zero grau Celsius). Neste

caso, podem ocorrer perdas significativas de proteínas se estas forem solúveis em

solventes orgânicos ou porque elas nem sempre se re-solubilizam [6].


11

Alternativamente, pode ser empregada a centrifugação a alta velocidade [17], seguida

da remoção da camada lipídica.

Polissacarídeos e ácidos nucléicos podem interagir com anfólitos e proteínas.

Além disso, estas macromoléculas podem aumentar a viscosidade das soluções. Um

procedimento comum para remoção é a precipitação das proteínas com acetona ou

TCA/acetona. Outras recomendações para remoção dos ácidos nucléicos é a

digestão com uma mistura de RNAses e DNAses (livres de proteases) ou por

ultracentrifugação e adição de uma poliamina básica [6].

Fenóis estão presentes em materiais vegetais, principalmente em folhas de

plantas e podem interagir com proteínas. Compostos polifenólicos podem ser

removidos pela adição de polivinilpolipirrolidona ou, também, pela precipitação com

TCA e subsequente extração de fenóis com acetona a 0ºC [18 - 20].

Wang et al. [21] propuseram um protocolo para extrair proteínas de tecidos de

plantas recalcitrantes (folhas e frutos). Foram utilizadas amostras de folhas de bambú

(Bambusa vulgaris), de uva (Vitis vinifera), de iris (Iris pseudacorus), de oliva (Olea

europea), de limão (Citrus limonum), de pinheiro (Pinus nigra), de sequóia (Sequoia

sempervirens), de cana de açúcar (Saccharum officinarum) e de tabaco (Nicotiana

tabacum) e frutas maçã, banana, grape, kiwi, azeitona, laranja, pêra e tomate. O

protocolo foi ajustado para processar pequenas quantidades de tecidos, em

microtubos, no intervalo de 1 h, podendo ser expandido para escalas maiores (cerca

de 1 a 5 g de tecido, em tubos de 30 a 50 mL). No protocolo proposto, a amostra era

macerada manualmente em nitrogênio líquido até se obter um pó fino e lavada com

TCA/acetona, metanol e, por fim, com acetona. A amostra era seca à temperatura

ambiente até a remoção de todo resíduo de acetona, para se então proceder a

extração e a precipitação das proteínas e do fenol. Os autores adicionaram entre 0,4

a 0,8 mL da amostra a um tampão contendo SDS e fenol na proporção de 1:1.

Misturaram e deixaram incubar por 5 min, centrifugando logo a seguir a 16000 g por 3

min. Transferiram a parte superior da fase fenólica a um novo microtubo, que continha

solução metanólica de acetato de amônio a 0,1 mol L-1, o qual era armazenado em

refrigerador a –20oC durante toda a noite. A seguir, a amostra era novamente


12

submetida à centrifugação, a 16000 g por 5 min (4oC) e então o sobrenadante era

descartado. A pastilha (contendo as proteínas) era lavada com metanol (PA) e

novamente lavada com acetona 80% (v/v). A seguir, a pastilha era seca e utilizada na

análise de proteínas (quantificação, PAGE ou IEF, etc). Os autores afirmaram que

utilizando o protocolo proposto foi possível extrair um número maior de proteínas e

com menos interferentes. Isto foi demonstrado por meio das imagens dos géis

eletroforéticos, tanto em uma como em duas dimensões, onde foi obtido um número

maior de spots de proteínas.

2.1.3. Solubilização de proteínas

Após o rompimento celular e a remoção dos compostos interferentes, os

polipeptídeos devem ser solubilizados e, dependendo da finalidade da análise,

desnaturados e reduzidos para romper as interações intra e inter-moleculares. A

solubilização da amostra é geralmente realizada com um tampão contendo

compostos caotrópicos (uréia ou tiouréia), detergentes não-iônicos ou zwitteriônicos

(por exemplo, Triton X-100), agentes redutores, anfólitos e, dependendo do tipo de

amostra, inibidores de protease. O tampão de solubilização mais popularmente usado

é o de O´Farrell [22], tal qual descrito ou com algumas modificações [22].

Dentre os compostos caotrópicos, a uréia é bastante eficiente na ruptura das

ligações de hidrogênio. Ela desnatura as proteínas pelo rompimento das ligações não-

covalentes e iônicas entre os resíduos de aminoácidos [3], levando ao desdobramento

e desnaturação da proteína. Em contraste, a tiouréia é muito adequada para a quebra

das interações hidrofóbicas, aumentando a solubilização de proteínas de membranas

hidrofóbicas [23, 24]. Atualmente, a solução mais indicada para solubilização de

proteínas hidrofóbicas é um tampão com uma combinação de 5 a 7 mol L-1 de uréia e

2 mol L-1 de tiouréia, com os detergentes apropriados.

Os detergentes são utilizados para impedir as interações hidrofóbicas entre os

domínios de proteínas hidrofóbicas, evitando a perda destas devido à agregação e

precipitação. A solubilização de proteínas em solução contendo o detergente aniônico

SDS, à temperatura de ebulição, tem sido recomendada [25, 26]. Entretanto, a


13

concentração crítica para o uso do SDS é abaixo de 0,2% (m/v), tornando, assim,

recomendável a troca desse detergente por outro não-iônico, como NP-40 ou Triton

X-100 (apesar de não serem tão efetivos para a solubilização de proteínas

hidrofóbicas de membrana como o SDS) ou por detergentes zwitteriônicos, como

sulfonato de 3-[(3-cloroamidopropil)dimetilamonio]-1-propano (CHAPS) ou

sulfobetainas (SB 3-10 ou ASB 14) [6]

Os agentes redutores promovem a redução e a prevenção da re-oxidação das

pontes dissulfeto. Eles são necessários na clivagem das pontes intra e

intermoleculares dissulfeto para se obter um desdobramento completo da proteína.

Os redutores mais comumente usados são o 1,4 ditiotreitol (DTT), o ditioeritritol

(DTE) e o 2-mercaptoetanol [27]. Existem outras indicações de redutores como: a

tributilfosfina (TBP) [28] e o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) [29], mas a escolha do

DTT e DTE é predominante [30].

Chan et al. [13] também testaram várias combinações do uso de uréia e

tiouréia como agentes caotrópicos para a solubilização das proteínas do P. triestinum.

Eles usaram tampões com concentrações de 9,5 mol L-1 de uréia, 8 mol L-1 de uréia e

as combinações de 2 mol L-1 de tiouréia com 5 mol L-1 de uréia e, por último, 2 mol L-1

de tiouréia com 7 mol L-1 de uréia. Também estudaram os efeitos da adição de três

redutores (DTT, TBP e TCEP) nos tampões de re-hidratação (64 mmol L-1 de DTT, 2

mmol L-1 de TBP e 4 mmol L-1 de TCEP) e de equilíbrio, com ou sem o agente

alquilante iodoacetamida (0,26 mol L-1). Eles observaram um aumento no número de

spots nos géis de eletroforese ao se utilizar uréia e um aumento ainda maior ao se

utilizar a combinação de uréia e tiouréia, atribuindo esses aumentos ao efeito de

solubilização da uréia e da tiouréia. Quanto aos agentes redutores, eles observaram

que o gel onde utilizaram o tampão com TCEP apresentou melhor resolução em

comparação com os outros agentes e desaconselharam o uso do tampão com

iodoacetamida na última etapa de equilíbrio, por provocar a perda de proteínas de

baixa massa molar.


14

2.2 Plantas medicinais e fitoterápicos

A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção

de doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. No

início da década de 90, a Organização Mundial de Saúde (OMS) divulgou que 65 a

80% da população dos países em desenvolvimento dependiam das plantas

medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde [31].

É cada vez mais freqüente o uso de plantas das medicinas tradicionais hindú e

chinesa, completamente desconhecidas dos povos ocidentais. Estas plantas

comercializadas são apoiadas em propagandas que prometem “benefícios seguros, já

que se trata de fonte natural”. Muitas vezes, entretanto, as supostas propriedades

farmacológicas anunciadas não possuem validade científica, por não terem sido

sequer indicadas no uso tradicional, ou por não terem tido suas ações farmacológicas

comprovadas em testes pré-clínicos ou clínicos [31].

Os fitoterápicos importados de países asiáticos são um grande risco para a

população, uma vez que as formulações são bastante diferentes das preparadas no

ocidente, contendo metais potencialmente tóxicos em concentrações que, muitas

vezes, ultrapassam os valores seguros para o consumo. Na medicina tradicional

indiana a importância de metais como ouro, cobre, estanho, chumbo, mercúrio, ferro,

prata e zinco é enfatizada. Assim, esses metais são utilizados geralmente junto com

extratos de plantas medicinais.

Estudos multidisciplinares envolvendo etnobotânicos, químicos, farmacólogos e

agrônomos (neste caso, no cultivo de ervas medicinais) são necessários para que

sejam ampliados os conhecimentos sobre as plantas medicinais: como agem, quais

são seus efeitos tóxicos e colaterais, como seriam suas interações com os

medicamentos alopatas e quais estratégias mais adequadas para o controle de

qualidade e produção de fitoterápicos, atendendo às novas normas das agências

reguladoras, como as resoluções da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA).


15

No Brasil, resoluções recentes da ANVISA, de 16 de março de 2004 [32], visam

a normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. A resolução-RDC número

48 determina que todos os testes referentes ao controle de qualidade de fitoterápicos

devem ser realizados em rede credenciada no sistema REBLAS (Rede Brasileira de

Laboratórios em Saúde) ou por empresas que possuam certificado de BPFC (Boas

Práticas de Fabricação e Controle) [32].

2.2.1 Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos - Definições

A OMS define planta medicinal como sendo “todo e qualquer vegetal que

possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins

terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos” [33]. A diferença

entre planta medicinal e fitoterápico reside na elaboração da planta para uma

formulação específica, o que caracteriza um fitoterápico. Segundo a Secretaria de

Vigilância Sanitária, em sua portaria número 6 de 31 de janeiro de 1995, fitoterápico é

todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente

matérias-primas vegetais, com finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de

diagnóstico, com benefício para o usuário. É caracterizado pelo conhecimento da

eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de

sua qualidade. É o produto final acabado, embalado e rotulado. Na sua preparação

podem ser utilizados adjuvantes farmacêuticos permitidos na legislação vigente. Não

podem estar incluídas substâncias ativas de outras origens, não sendo considerado

produto fitoterápico quaisquer outras substâncias ativas, ainda que de origem vegetal,

isoladas ou mesmo suas misturas. Neste último caso, encontra-se o fitofármaco, que

por definição “é a substância ativa, isolada de matérias-primas vegetais, ou mesmo,

mistura de substâncias ativas de origem vegetal” [32].

2.2.2. Plantas medicinais, fitoterápicos e fitofármacos - Perspectivas

Com o aumento da expectativa de vida, o número de doenças crônicas está

crescendo, e as respostas da medicina convencional não têm sido satisfatórias. Além

disso, muitos pacientes recusam-se a ingerir um número cada vez maior de


16

medicamentos sintéticos que geralmente apresentam efeitos colaterais consideráveis

e estão almejando por alternativas menos agressivas. Na Europa, essa tendência em

relação à medicina natural tende a continuar crescendo. Isso se aplica principalmente

ao campo da fitoterapia bem documentada, que tem se tornado cada vez mais aceita

e apreciada, não somente pelos pacientes como também pelos médicos. Na Ásia,

ambos os métodos de terapia, convencional e tradicional, são praticados igualmente,

sendo que nenhuma das duas é classificada como universal. Os fitoterápicos

apresentam diversos efeitos fisiológicos exatamente por conterem maior número de

substâncias, tornando sua pesquisa mais complexa. Relativamente poucas pesquisas

clínicas estão sendo conduzidas com plantas. Os motivos são principalmente

econômicos: as plantas não podem ser patenteadas; portanto, não existem incentivos

para se gastar grandes somas de dinheiro para provar que uma planta é segura e

efetiva, de acordo com os padrões exigidos para aprovação de um novo

medicamento. Apesar dessas dificuldades, são necessárias maiores contribuições

científicas, tanto da Farmacognosia como da Medicina para que a fitoterapia ocupe

definitivamente seu espaço na cura, prevenção e manutenção da saúde [34].

2.2.3. Espirulina, Ginkgo biloba e Castanha da Índia

Para o estudo sistemático dos procedimentos de extração de proteínas foram

escolhidas as amostras de fitoterápicos tradicionais, ou seja, plantas medicinais de

uso alicerçado na tradição popular, sem evidências, conhecidas ou informadas, de

risco à saúde do usuário, cujas eficácias são validadas por meio de levantamentos

etnofarmacológicos, documentações tecnocientíficas ou publicações indexadas [32].

Nestas amostras, as proteínas não são, na maioria das vezes, os princípios ativos,

mas coadjuvantes.

No presente trabalho os fitoterápicos escolhidos como amostras foram:

espirulina (Spirulina maxima), folhas de ginkgo biloba (Ginkgo biloba L.) e castanha

da Índia (Aesculus hippocastanum).

A espirulina, ou alga azul, pertence a um grupo de mais de mil e quinhentas

espécies de plantas aquáticas microscópicas. É uma cianobactéria. As duas espécies


17

mais comumente usadas para consumo humano são Spirulina maxima (Figura 1.1) e

Spirulina platensis . Elas são cultivadas em alguns lagos nas Américas Central e do

Sul e na África. Ela é um suplemento alimentar popular no Japão, Israel, França e

também é comercializada nos Estados Unidos [35, 36].

Figura 1.1. Espirulina (Spirulina máxima).

A espirulina é uma fonte rica em proteínas (de 50 a 65% m/m), com todos os

oito aminoácidos que são nutricionalmente requeridos. Entretanto, possui uma baixa

concentração de metionina, em relação aos outros aminoácidos presentes [37, 38].

Ela também possui em sua composição clorofila, carotenóides, minerais, ácido gama-

linoléico e alguns pigmentos específicos. Esses pigmentos, chamados de ficobilinas,

incluem a ficocianina e a aloficocianina. Os pigmentos dão à espirulina a cor de azul

ou verde intenso. As ficobilinas têm estruturas similares aos pigmentos da bile, tais

como a bilirrubina. Na célula da espirulina, as ficobilinas são ligadas às proteínas e o

complexo ficobilina-proteína é chamado ficobiliproteína [39].

Além do uso como suplemento alimentar, estudos preliminares in vitro e in vivo

têm apresentado algumas indicações de efeitos antivirais. Existem também algumas

evidências de que ela pode afetar favoravelmente algumas funções imunoprotetoras e

de que tenha capacidade hepatoprotetora. Além disso, em estudos recentes, existem

possibilidades de inibição de algumas reações alérgicas e efeitos hipocolesterômicos

[40, 41]. Ainda, é utilizada na alimentação de microcrustáceos, moluscos e peixes nos


18

primeiros estágios de desenvolvimento e no processo de purificação de águas,

removendo nitratos, fosfatos e outros elementos em grandes quantidades [37].

Com relação ao ginkgo biloba (vide Figura 1.2), tem havido um crescente

interesse pelo seu uso nos últimos anos, tanto no uso popular, quanto em termos

científicos. Uma prova desse crescente interesse é o grande número de citações

(quase 2 milhões) que se pode observar em sites de busca como o Google.

Chamada pelos japoneses pelo carinhoso nome de Yin- Kuo, fruto de prata, o

ginkgo (com nome científico de Ginkgo biloba L.), da família das Ginkgoáceas, é

considerado sagrado pelos budistas, sendo as suas árvores plantadas nas entradas

de todos os templos. Descrita pela primeira vez por volta de 1690 pelo médico alemão

Engelbert Kaelmpter, foi levada para a Europa somente no ano de 1727, sendo

considerada como um fóssil vivo [42].

O ginkgo, que faz parte do milenar arsenal terapêutico chinês, adapta-se muito

bem às características urbanas e ao clima temperado, não sendo exigente com os

solos. Resiste muito bem à poluição pesada, insetos, fungos, bactérias e vírus. As

partes utilizadas são as folhas, frutos e sementes, sendo as folhas a parte mais

comumente empregada [43].

Figura 1.2. Folhas de ginkgo biloba. Foto extraída do site: http://www.xs4all.nl/~kwanten/thetree.htm


19

A composição química das folhas de ginkgo é constituída por ácido butanóico,

ácido ginkgólico, ácidos graxos, alcanos, antocianina, asoginkgetina, benzenóides,

bioflavonóides, caferol, carboidratos, carotenóides, catequina, diterpenos

ginkgolídeos, ésteres de ácido cumárico, esteróis, fenilpropanóides, ginol, glicosídeos

flavonóides (principalmente ginkgobilina, quercetina e isoamnetina), kaempferol,

lactona bilobalida, lipídeos, minerais, quercetina, sitosterol e triterpenos. Nos frutos

também são encontrados ácidos ginkgólicos e ginol.

As suas folhas são consideradas adstringentes, antifúngicas, anti-helmínticas,

antiblenorrágicas, antiinflamatórias, antioxidantes, antiplaquetárias, bactericidas,

cardiotônicas, digestivas, estimulantes da circulação periférica, fungicidas,

rejuvenescedoras, revigorantes, tônicas, vasodilatadoras periféricas. Assim, as

indicações são inúmeras, tais como prevenir angiopatias, ansiedade e asma, para o

tratamento de deficiências de audição, inibir o crescimento de bactérias, promover a

sensação de bem-estar geral, bronquite, ajudar a combater câncer, recuperar a

capacidade intelectual, inibir a hiperpermeabilidade mediada pela bradicinina e

histamina (nos vasos capilares), cefaléia, combater a peroxidação lipídica das

membranas, ativar o metabolismo energético e no tratamento profilático do

envelhecimento das células, para o tratamento de irrigação deficiente no cérebro,

isquemia, distúrbios arteriais, má-circulação sangüínea, para melhorar a

concentração, para inibir o crescimento de fungos, furúnculos, prevenir infecções,

inibir o PAF (fator ativador de plaquetas), labirintite, melhorar ou recuperar a perda de

memória de pessoas idosas, em nível cerebral- aumentar o consumo de glicose e

oxigênio, facilitando a síntese de ATP, para combater radicais livres, reduzir vertigens

e zumbidos, entre outras [42].

No que se refere à castanha da Índia (Aesculus hippocastanum, Figura 1.3), a

sua árvore é nativa da Ásia e norte da Grécia. As primeiras indicações de uso datam

de 1565 e muitos anos depois seu uso cresceu por toda Europa. No leste da Europa,

ela foi usada durante muito tempo como alimento para cavalos e gado. A árvore

produz frutos dentro de cápsulas com espinhos, contendo de uma a três grandes

sementes, conhecidas como as castanhas da Índia. Tradicionalmente, várias partes


20

aéreas da árvore, incluindo as sementes, as folhas e a casca são usadas em

preparações medicinais [43].

Figura 1.3. Castanha da Índia (Aesculus hippocastanum). Ilustração extraída de

http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Illustration_Aesculus_hippocastanum0.jpg

As sementes têm em sua composição química saponinas, responsáveis pelo

sabor acre e amargo, taninas, d-catecol, pectina, leucoantocianina, potássio, óleos

voláteis, cálcio, fósforo, entre outros. Os princípios ativos mais importantes são os

flavonóides derivados, saponinas triterpênicas (escina, proescina e escigenina) e

aminoácidos (adenina, adenosina, guanina, lisina e triptofano) [44]. Devido à presença

da escina, a castanha é usada para promover a circulação nas veias [45]. A escina

força o tônus normal nas paredes das veias, promovendo o retorno do sangue para o

coração. Portanto, ela é usada para o tratamento de insuficiência venosa crônica e,

numa menor extensão, no tratamento de veias varicosas. Ela também possui


21

propriedades anti-inflamatórias e tem sido usada para a redução de edemas após

traumas, particularmente usada após traumas de esportes e cirurgias [45, 46].

2.3 Determinação de proteínas totais

Muitos métodos ao longo dos anos têm sido propostos para a determinação de

proteínas totais, mas não existe uma metodologia considerada de uso universal para

todos os meios [47]. Dentre os métodos espectrofotométricos, os mais utilizados

geralmente, são:

Biureto [48], que se baseia na reação do reativo do biureto, uma mistura de

cobre e hidróxido de sódio com um complexante (tartarato de sódio) que estabiliza o

cobre em solução. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um

complexo quadrado planar com a ligação peptídica; o de Lowry [49], que se baseia

numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, que sofre uma redução

quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II) e produz um

composto com absorção máxima em 750 nm; o de Bradford [50] e de Smith ou BCA

(ácido bicinchonínico, 4,4´-dicarboxi-2,2´-biquinolina) [51], se baseia na reação do

cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um

complexo com BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm; e de

espectrofotometria de absorção no ultravioleta [52]. Além desses, também são muito

utilizados métodos que fazem a determinação de proteínas totais por meio do carbono

total ou do nitrogênio total (método de Kjeldahl) [53]. Cada um deles possui suas

vantagens e limitações e são mais aplicados a tipos de amostras específicas. Outra

consideração que se deve fazer quanto à escolha do método a ser utilizado diz

respeito ao meio em que as proteínas estão e se esse meio pode ser considerado

como um interferente, alterando os resultados finais. A seguir, serão apresentados

dois métodos que foram escolhidos para serem aplicados na determinação de

proteínas totais neste trabalho de Tese.


22

2.3.1 Método de Bradford

O método de Bradford, proposto por Marion M. Bradford e publicado em 1976

[50] é considerado, dentre os métodos espectrofotométricos para a determinação de

proteínas totais, como um dos mais sensíveis e rápidos [47]. Ele tem sido utilizado

para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro

sanguíneo [54, 55], líquor [56 - 58], saliva humana [59], produtos alimentícios, leite

humano [60, 61], tecidos de plantas [62], suspensões de células [63, 64] e outros.

Este método é baseado na interação entre o corante Coomassie brilliant blue

BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais

básicas ou aromáticas. No pH da reação, a interação entre a proteína de alta massa

molar e o corante BG-250, provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a

forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm [65].

Apesar de suas vantagens, este método apresenta algumas limitações tais

como, a variação da absortividade específica para diferentes proteínas, devido à

baixa solubilidade [66, 67] ou baixa massa molar das mesmas, e fornecimento de

resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG-250,

que varia conforme a procedência. Por isso é recomendável a padronização das

condições de reação para cada lote de corante adquirido.

Para tornar mais uniforme a absortividade específica, algumas alternativas são

sugeridas, tais como aumentar a concentração do corante ou aumentar a

solubilização das proteínas que vão reagir com o corante usando detergentes [68, 69],

hidróxido de sódio [70] ou fenol [71], ou aquecer com uréia e 2-mercaptoetanol [72].

Existem algumas substâncias citadas na literatura que produzem interferências

no método de Bradford. Elas normalmente reagem com as proteínas, impedindo a

reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na

absorbância. Os interferentes mais comuns são tolbutamida, uréia, cloreto de sódio

ou potássio, detergentes (Triton X-100, SDS, Tween-20), ciclodextrinas, polifenóis e

polifenóis oxidases, 2-mercaptoetanol mais guanadina, glicerol, lipídeos,

cloropromazina e fluoreto [47]. Os métodos de eliminação destes interferentes variam

conforme o caso, existindo informações disponíveis na literatura.


23

2.3.2 Método de Kjeldahl

O método foi proposto por Johan Kjeldahl em 7 de março de 1883 na

Sociedade de Química da Dinamarca [73], quando estudava proteínas em grãos. O

método original sofreu várias modificações, mas continua sendo, ainda, muito

utilizado para a determinação de proteínas totais em alimentos [53]. Além disso, este

método tem sido utilizado como um método padrão de análise de nitrogênio para

água, fertilizantes e combustíveis fósseis [73].

Este método determina nitrogênio orgânico total, isto é, o nitrogênio protéico e

não protéico orgânico. Porém, na maioria dos alimentos, o nitrogênio não protéico

representa muito pouco no total. A razão entre o nitrogênio medido e a proteína

estimada depende do tipo de amostra e de outros fatores. Por exemplo, no trigo esta

razão é afetada pelas condições de crescimento e quantidade e tipo de fertilizante

utilizado. Para converter o nitrogênio medido para proteína, deve-se multiplicar o

conteúdo de nitrogênio por um fator arbitrário, que representa um fator médio para o

material em estudo, que é 5,7 para o trigo, e 6,25 para alimentos em geral [53].

O método de Kjeldahl para determinação de nitrogênio amoniacal é composto

de três passos distintos, que são digestão, destilação e titulação. O propósito da

digestão é quebrar a estrutura ou as ligações químicas de substâncias complexas em

substâncias ou estruturas químicas mais simples. Especificamente, proteínas são

quebradas e convertidas em amônio [73]. Para isso, se aquece a amostra com ácido

sulfúrico para digestão até que o carbono e hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio

da proteína é liberado e transformado em sulfato de amônio.

A destilação envolve a separação do amônio do digerido. Isto é realizado pelo

aumento do pH adicionando-se hidróxido de sódio, possibilitando ocorrer a mudança

do íon NH4+ para amônia (NH3). Aquece-se a solução para a liberação da amônia

dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de

amônio.

A determinação da quantidade de nitrogênio no frasco condensado pode ser

realizada de várias maneiras. A mais comum é a titulação com uma solução padrão

de ácido clorídrico na presença de uma mistura de indicadores (verde de bromocresol


24

e vermelho de metila) [73]. Existe uma segunda maneira de recolher a amônia, em

solução ácida (H2SO4 padrão) em excesso e depois titular o ácido que não reagiu com

a amônia, com uma solução básica padronizada (NaOH). Esta segunda maneira tem

a desvantagem de necessitar de duas soluções padronizadas e também de fazer a

determinação indiretamente [53].

Algumas modificações foram sugeridas, como a adição de catalisadores. Em

1885, Wilforth [53] sugeriu a adição de óxidos de metais de mercúrio, cobre, ferro, etc.

para acelerar a digestão da amostra. Praticamente todos os metais da tabela

periódica foram testados na digestão da amostra, porém, mercúrio, cobre e selênio

foram os que apresentaram melhores resultados. Atualmente é utilizada uma mistura

dos três catalisadores, pois assim não apresentariam problemas na pequena

concentração em que são utilizados na mistura. Outra modificação foi a adição de

sulfato de potássio, sugerida por Gunning em 1889. A adição deste reagente tinha por

objetivo aumentar a temperatura do ponto de ebulição da mistura na digestão,

acelerando o processo. No entanto, o excesso de sulfato de potássio pode causar

decomposição por excesso de aquecimento, com perda da amônia. Verificou-se que a

temperatura deve ficar entre 370 e 410oC.

No método, a amônia liberada é recolhida em ácido padronizado. Na

modificação, o recolhimento é feito em excesso de ácido bórico. O borato de amônio

formado é que vai ser titulado com um ácido padronizado. Esta modificação é

vantajosa no sentido de que é necessária somente uma solução padronizada. Nem a

quantidade (cerca de 50 mL), nem a concentração (cerca de 4% m/v) de ácido bórico

necessitam ser exatas [53].

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1 Equipamentos e acessórios

Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o desenvolvimento

desta parte do trabalho:


25

• Agitador por efeito vortex, marca Thermolyne, modelo M-37600;

• Balança analítica, marca Mettler, modelo AE200;

• Banho maria, marca Marconi, modelo MA127;

• Centrífuga, marca Nova Técnica, modelo NT 811;

• Cuba de sonicação, marca Ultrasonik, modelo Unique 1400;

• Destilador de Nitrogênio, marca Marconi, modelo MA036;

• Digestor de micro-Kjeldahl, marca Gerhardt, modelo KB40;

• Espectrofotômetro UV/Vis, marca Micronal, modelo B582;

• Estufa Spencer, com ventilação forçada, marca Marconi;

• Membrana para diálise, marca Spectrum Laboratories Inc., modelo MWCO: 6-

8000;

• Ultracentrífuga refrigerada, marca BioAgency, modelo Bio-Spin-R;

• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo Quantum TM cartridge;

• Vidrarias apropriadas.

3.2 Reagentes e soluções

Todos os reagentes usados são de grau analítico, sendo as soluções preparadas com

água desionizada. A seguir, são listados todos os reagentes/soluções empregados

nesta parte do trabalho:

• Ácido bórico PA, H3BO3 , MM = 61,83 g mol-1 (Synth);

• Ácido clorídrico 38%, HCl, MM = 36,46 g mol-1 (J. T. Baker);

• Ácido fosfórico 85% (m/m), H3PO4, MM = 98,00 g mol-1 (Merck);

• Ácido sulfúrico 95 – 97% (m/m), H2SO4, MM= 98,02 g mol-1 (Merck);

• Albumina de soro bovino (Merck);

• Azul de Coomassie G-250, C47H50N3NaO7S2, MM = 854,03 g mol-1 (J.T. Baker);

• Etanol 95%, C2H6O, MM = 46,07 g mol-1 (J. T. Baker);


26

• Sulfato de potássio, K2SO4, MM = 174,27 g mol-1 (Isofar);

• Sulfato de cobre, CuSO4, MM = 159,63 g mol-1 (Isofar);

• Hidróxido de Sódio, NaOH, MM = 40,00 g mol-1 (Nuclear);

• Vermelho de metila, C15H14N3O2Na, MM = 291,29 g mol-1 (Isofar);

• Verde de bromocresol, C21H14Br4O5S, MM = 698,02 g mol-1 (Vetec);

• O reagente de Bradford consistiu em uma mistura de azul de Coomassie G-250

a 0,01% (m/v), 5% (v/v) de etanol e 10% (v/v) de ácido fosfórico. Após 5 min de

reação, foi determinada a absorbância das amostras em 595 nm, por

espectrofotometria UV/Vis.

• Os indicadores foram preparados numa solução alcoólica de vermelho de

metila a 0,2% (m/v) e de verde de bromocresol a 0,2% (m/v).

3.3 Preparo das amostras

As folhas de ginkgo biloba foram colhidas da árvore plantada no campus da

Universidade Federal de Alfenas – Unifal-MG [Apêndice 1] nos dias 28 de outubro de

2003 e 28 de fevereiro de 2004 (primavera e verão, respectivamente). Foram

escolhidas folhas que apresentavam tamanho e cor de folhas adultas, mas não

aquiescentes. As folhas foram lavadas com água destilada e secas com ventilação

forçada, à 45oC por 12 h, até massa constante. Observou-se uma perda de 65% na

massa das folhas, devido à perda da água.

As amostras de espirulina (em pó) foram gentilmente cedidas pela farmácia de

manipulação Musgo (Alfenas, MG), cuja origem e informações químicas, físico-

químicas e microbiológicas estão disponíveis no laudo do fornecedor da amostra

[Apêndice 2]. Estas amostras não sofreram qualquer tipo de manipulação, uma vez

que já estavam secas e em pó.

As amostras de castanha da Índia (in natura) foram adquiridas no mercado

local (Alfenas, MG) e não se obtiveram informações quanto à origem ou idade das

castanhas, entretanto foram identificadas pelo Prof. Dr. Geraldo Alves da Silva do

Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoterápicos da Universidade Federal de Alfenas,


27

MG [Apêndice 3]. Estas amostras foram manualmente descascadas, retirando-se a

casca marrom e a película que envolvia as castanhas, picadas e também secas à

45oC em estufa Spencer, com ventilação forçada durante 10 h, até massa constante.

Observou-se nessas amostras uma perda de apenas 3% na massa devido à perda de

água. Portanto, considerou-se esse valor desprezível e assumiu-se que o

procedimento de secagem não seria utilizado para este tipo de amostra.

3.4 Extração das proteínas

Onze procedimentos de extração foram propostos, sempre realizados em

triplicata. Para cada extração foram utilizados 500 mg das amostras (peso seco). Em

seguida, foram adicionados 5 mL de água desionizada ou de tampão composto por

1,0 mol L-1 de Tris-HCl, pH 6,8. Estes meios extratores foram escolhidos por não

apresentarem interferência nas medidas espectrofotométricas para a determinação da

concentração de proteínas (Método de Bradford) [50]. Após a adição dos meios

extratores, as amostras eram processadas, ou seja, eram submetidas aos

procedimentos, conforme descritos no Quadro 1.1.

A estratégia para a escolha dos procedimentos de extração de proteínas

baseou-se inicialmente em procedimentos físicos que favorecessem o rompimento

das membranas celular e das organelas e de outras estruturas das células. Estes

procedimentos variavam desde a simples agitação da amostra no meio extrator, a

simples maceração manual da amostra no mesmo meio, até a combinação de vários

procedimentos aplicados consecutivamente. Também foi proposta a utilização de

procedimentos com diálise, onde além de se provocar a lise osmótica das estruturas

celulares, também se procederia a uma limpeza nos extratos protéicos. Os

procedimentos 1 a 9 foram realizados à temperatura ambiente, enquanto os

procedimentos 10 e 11 foram realizados à 40oC. Nestes últimos, as amostras eram

processadas em banho-maria, com a temperatura controlada.

Após a adição do meio extrator, a amostra era agitada manualmente por cerca

de 5 min. Para a maceração, a amostra, após a pesagem, era colocada em um


28

almofariz de porcelana com o meio extrator e era macerada à temperatura ambiente,

ou à 40oC durante 15 min. Para a diálise, a amostra, depois de sofrer agitação ou

maceração, era inserida num envoltório de celofane (Membrana MWCO: 6-8000,

Spectrum Laboratories Inc., EUA), que era amarrado a um bastão de vidro e

colocados dentro de um béquer contendo 2 L de água desionizada à temperatura

ambiente, sob agitação magnética. Procedeu-se a troca de água a cada 6 h,

totalizando em um período de 42 h de diálise.

Para a sonicação, foi inicialmente realizada uma calibração do aparelho de

ultra-som [74]. Para isso, foram escolhidas duas posições na região central da cuba

do equipamento, onde foram colocados dois tubos de ensaio contendo a amostra

espirulina adicionada de água desionizada. Também foram avaliados os tempos de

sonicação das amostras. Assim, as amostras foram sonicadas nas duas posições

escolhidas (em relação ao centro da cuba), durante 5, 10 e 15 min. Com a otimização,

verificou-se que a melhor posição era no centro da cuba e o melhor tempo de

sonicação de 10 min. Desta forma, as amostras após serem agitadas, maceradas ou

dialisadas, eram submetidas à sonicação, à temperatura ambiente ou a 40oC.


29

Quadro 1.1: Procedimentos de extração de proteínas para as diferentes amostras.

Procedimento Descrição

1 Amostras* manualmente agitadas em água por cerca de 5 min;

2 Amostras* manualmente agitadas em tampão** por cerca de 5 min;

3 Amostras agitadas e dialisadas em água***, por 42 h;

4 Amostras* manualmente maceradas em água***, em um almofariz, por 15 min;

5 Amostras* manualmente maceradas em tampão**, em um almofariz, por 15 min;

6 Amostras* maceradas e dialisadas em água, por 42 h;

7 Amostras* agitadas em água***, por 5 min, e submetidas à sonicação por 10 min;

8 Amostras* manualmente maceradas em água***, em um almofariz, e sonicadas por 10 min;

9 Amostras* manualmente maceradas em tampão**, em um almofariz, e sonicadas por 10 min;

10 Amostras* preparadas de acordo com procedimento 8, mas à 40oC;

11 Amostras* preparadas de acordo com procedimento 9, mas à 40oC;

* 0,5 g da amostra espirulina ou gingko biloba ou castanha da Índia; ** 5,0 mL de tampão 1,0 mol L-1 de Tris-HCl, pH 6,8; *** 5,0 mL.

Após finalizar cada procedimento, as amostras foram centrifugadas por 5 min à

8500 g e à temperatura ambiente. Apesar da alta porcentagem de gordura presente

na amostra de castanha da Índia (em torno de 5%) [75, 76], não foram adicionados

detergentes na água ou no tampão de Tris-HCl durante as extrações, devido à

possibilidade de interferência nas determinações das proteínas totais [50]. A gordura

foi separada das soluções sobrenadantes durante a centrifugação, sendo removida

manualmente. As soluções sobrenadantes foram consideradas como os extratos

protéicos e foram armazenados em frascos Eppendorf® e congelados à -18oC.


30

3.5 Determinação da concentração de proteínas totais

3.5.1. Método de Bradford

A determinação da concentração de proteínas totais presentes nos extratos

protéicos das amostras de espirulina, castanha da Índia e gingko biloba foi feita

utilizando o método de Bradford [50], em triplicatas. Para isso, as amostras foram

diluídas a um volume final de 5 mL com tampão Tris-HCl a 1 mol L-1 (pH 6,8) ou com

água desionizada. O fator de diluição para qualquer extrato protéico foi sempre de 10

vezes, ou seja, para cada 500 mg de amostra obteve-se um volume de 5 mL de

extrato protéico.

A concentração protéica total presente nos extratos foi expressa utilizando a

albumina de soro bovino como padrão. Para isso, foi feita a curva analítica de

calibração na faixa de concentração entre 1 a 6 mg L-1, com o mesmo tampão usado

nas diluições das amostras ou com água desionizada.

Para as medidas espectrofotométricas, pipetaram-se, em cubetas de plástico,

100 µL do extrato protéico diluído apropriadamente. Em seguida, foram adicionados

900 µL da solução denominada reagente de Bradford.

3.5.2. Método de Kjeldahl

Foram pesados 100 mg da amostra espirulina (seca) utilizando-se papel

manteiga, que foram transferidos para o tubo de Kjeldahl, sempre em triplicata.

Adicionaram-se ao tubo 600 mg de K2SO4, 300 mg de CuSO4 e 4 a 6 mL de

H2SO4. A seguir foi feita a digestão ácida em bloco digestor, à 350oC, até a amostra

se tornar incolor e o tubo foi adaptado ao aparelho de micro-Kjeldahl, colocando-se o

erlenmeyer (contendo 10 mL da solução de ácido bórico saturada mais indicadores)

na sua posição para receber o destilado. Foi misturada 1 parte da solução de

vermelho de metila com 5 partes de solução de verde de bromocresol.

Adicionaram-se de 15 a 20 mL da solução de NaOH 50% (m/v) lentamente,

recebendo o destilado no erlenmeyer e coletando cerca de 50 mL do destilado. A cor

passou de rosa para azul esverdeada. Titulou-se com a solução fatorada de HCl

0,02mol L-1 até o aparecimento de cor violeta ou rosa.


31

Para determinar a quantidade de nitrogênio total na amostra seca e transformar

em porcentagem de proteína utilizou-se a fórmula:

Nitrogênio (%) = V x M x 14 x 100/A,

onde, V é o volume de HCl 0,02 mol L-1 gasto na titulação (volume utilizado na

titulação da amostra menos o volume utilizado na titulação do branco), M é a

concentração molar exata da solução de HCl (0,02 mol L-1) e A é a quantidade da

amostra utilizada (em mg).

Foi demonstrado que o nitrogênio corresponde a 16% da composição das

proteínas [73], para os alimentos em geral. Portanto, dividindo 100 por 16, obtém-se o

fator de conversão de nitrogênio para proteína igual a 6,25. Para a transformação em

porcentagem de proteína, o valor de nitrogênio (%) determinado foi multiplicado por

esse fator.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os resultados das concentrações de proteínas totais dos extratos protéicos são

apresentados na Tabela 1.1, sendo que as curvas analíticas obtidas usando o método

de Bradford apresentaram coeficientes de correlações lineares (R2) entre 0,986 e

0,996.


32

Tabela 1.1: Concentrações de proteínas totais ± desvio padrão (em mg g-1) nas amostras determinadas pelo método de Bradford (n=3) para os diferentes processos de extração de proteínas.

Procedimento / Amostra

Número Castanha da

Índia (mg g-1)

Espirulina

(mg g-1)

Ginkgo biloba

(mg g-1)

1 Agitação em água 18,1±0,6 99±4 4,3±0,3

2 Agitação em tampão 15,1±0,6 58±4 2,6±0,5

3 Agitação e diálise em água 12,2±0,4 55±2 3,8±0,2

4 Maceração em água 30,4±0,8 133±5 3,6±0,4

5 Maceração em tampão 35,9±0,2 132±4 2,7±0,3

6 Maceração e diálise em água 17,4±0,8 74±5 1,4±0,1

7 Agitação em água e

sonicação

23,1±0,4 66±1 0,79±0,02

8 Maceração em água e

sonicação

33,8±0,9 92±4 4,4±0,6

9 Maceração em tampão e

sonicação

55±1 222±4 2,7±0,2

10 Idem procedimento 8, à 40oC 48±2 125±4 ND

11 Idem procedimento 9, à 40oC 38±2 95±4 ND

ND – não detectado

Estes resultados não forneceram informações sobre o tipo de proteínas

extraídas, isto é, por meio desses resultados não foi possível saber se houve alguma

proteína que foi extraída em maior quantidade do que outra, ou se algumas foram

extraídas ou não dependendo do procedimento utilizado. Nem mesmo foi possível

determinar quais proteínas estavam sendo extraídas, ou se elas estavam intactas (ou


33

não) após a extração. Para isso seria necessário se utilizar outros métodos de

caracterização, sendo um assunto a ser abordado no Capítulo 2 dessa Tese, onde

será tratada a caracterização das proteínas. Assim, o que se pode inferir apenas a

respeito das proteínas, é que se tratavam de proteínas hidrossolúveis, devido aos

meios extratores utilizados. Apesar dessas limitações, os resultados apresentados na

Tabela 1.1 foram utilizados para a comparação da eficiência relativa de extração.

Com relação aos meios extratores, estes foram escolhidos por não

apresentarem interferência na determinação de proteínas totais, de acordo com a

literatura [47, 50]. Foi tomado o cuidado de se extrair as proteínas apenas com água

ou com tampão Tris-HCl, sem a adição de qualquer concomitante. Entretanto, não se

pode ignorar que na composição da própria amostra, principalmente após a

maceração e quando existir a liberação de substâncias fenólicas, existam

concomitantes que possam alterar os resultados. Para uma provável minimização

destes concomitantes, deveria se proceder a uma etapa de limpeza, talvez

precipitação e re-solubilização das proteínas num meio sem concomitantes, para

finalmente se realizar a determinação por Bradford.

Por outro lado, sabe-se que a cada etapa adicionada, principalmente de

limpeza, corre-se o risco de perdas de proteínas, ou seja, no resultado final se teria

também uma alteração na concentração de proteínas totais. Finalmente, optou-se por

não adicionar mais nenhum passo ou procedimento de limpeza, mas apenas tomar-se

os cuidados já citados.

Inicialmente pode-se observar, a partir dos resultados da Tabela 1.1, que os

procedimentos mais eficientes para a extração (aqui se utiliza esse termo no sentido

de maior concentração de proteínas extraídas) foram os procedimentos 8 e 9 para

todas as amostras, ou seja, os procedimentos onde se utilizou a maceração manual

seguida de sonicação, para os dois meios extratores. Para a amostra de ginkgo biloba

se alcançou uma concentração de proteínas totais de 4,4 ± 0,6 mg g-1 ao se utilizar o

procedimento 8. Já para as amostras de castanha da Índia e espirulina obtiveram-se

concentrações de proteínas totais de 55 ± 1 e 222 ± 4 mg g-1, respectivamente,

utilizando-se o procedimento 9. Estas concentrações de proteínas representam,


34

respectivamente, 0,4%, 5,5% e 22% m/m da composição das amostras de ginkgo,

castanha e espirulina.

Ao se compararem os valores obtidos com a literatura, é possível verificar que

as concentrações obtidas para a castanha da Índia estão em concordância com os

valores publicados (concentrações entre 0,4 e 11,0% m/m) [75 - 77]. Gumilevskaya et

al. [78] observaram que as castanhas da Índia não acumulam grandes quantidades de

proteínas de armazenamento e que a quantidade total de proteínas não excederia

7,5% em peso seco. Portanto, o resultado obtido do procedimento 9 representando

5,5% da concentração de proteínas totais está em concordância com os valores

esperados.

Já para a ginkgo biloba, os máximos valores obtidos (4,4 ± 0,6 mg g-1, que

corresponderiam a 2,2 mg de proteínas em 500 mg de amostra, ou seja, 0,44% m/m)

foram abaixo dos apresentados pela literatura (em torno de 9% m/m) [79], o mesmo

ocorrendo para a espirulina. Para esta última amostra, o máximo valor obtido (222 ± 4

mg g-1, corresponderiam a 111 mg de proteínas em 500 mg de amostra, ou seja,

22,2% m/m) foi menor que o apresentado pelo laudo de análise (61,6% m/m)

[Apêndice 2] e também menor do que os valores apresentados pela literatura (de 55 a

70% m/m) [80].

Devido à discrepância entre os valores obtidos e os apresentados pela

literatura para a concentração de proteínas totais das amostras ginkgo biloba e

espirulina, houve a preocupação em se determinar a concentração de proteínas totais

por meio de outro método, que não fosse espectrofotométrico. Para isso, foi escolhida

a espirulina uma vez que essa amostra possui um laudo de análise, cujas

especificações foram determinadas de acordo com a British Herbal Pharmacopeia

(1996) e a World Health Organization – Geneva (1978). Assim, foi determinada a

concentração de proteínas totais da espirulina por meio do método de Kjeldahl [53],

obtendo-se o valor de 554 ± 5 mg g-1 de proteínas totais. Esse valor corresponde a

55,4% (m/m) da composição da amostra, que comparado ao valor do laudo de análise

(61,6% m/m) se mostrou menos discrepante do que aquele obtido pela análise

espectrofotométrica. Isto nos sugere que, possivelmente, os valores apresentados


35

pela literatura sejam obtidos por métodos não espectrofotométricos, como, por

exemplo, o de Kjeldahl.

Diante de resultados tão diferentes obtidos por esses dois métodos, vale a

pena algumas considerações. O método de Kjeldahl é muitas vezes considerado

como um método para validação [81], onde se considera que a contribuição do

nitrogênio não orgânico ou o orgânico proveniente de outras estruturas é desprezível

frente à parcela do nitrogênio orgânico proveniente da composição das proteínas.

Entretanto, na composição da amostra espirulina as proteínas contribuem com 50 a

70% (m/m) da composição e os aminoácidos essenciais livres com 30% (m/m) [43].

Essa contribuição dos aminoácidos essenciais livres é significativa, ou seja,

influenciaria significativamente no resultado da determinação de nitrogênio orgânico

na amostra e, conseqüentemente, no resultado da concentração de proteínas totais

pelo método de Kjeldahl, trazendo dúvida quanto à exatidão dos resultados deste

método.

Por outro lado, o método de Bradford, apesar de suas vantagens, tem se

mostrado altamente dependente do grupo de proteínas que compõem a amostra,

representando o maior problema para o uso indiscriminado deste método [81]. Como

exemplos, Keller e Neville [59] compararam os métodos do biureto, do BCA (ácido

bicinchonínico, 4,4´-dicarboxi-2,2´-biquinolina) [51], de Lowry e de Bradford para a

determinação de proteínas em leite humano. Nestes estudos, o valor para a

concentração de proteínas obtidas pelo método de micro-Kjeldahl foi utilizado como

padrão. Enquanto os resultados fornecidos pelos métodos do biureto, de Lowry e do

BCA superestimaram a concentração de proteínas, o de Bradford subestimou o valor

da concentração de proteínas. Fountoulakis e colaboradores [66] compararam o

método de Bradford, do BCA e de Lowry para um conjunto de proteínas glicosiladas e

não-glicosiladas. Para as proteínas não-glicosiladas os três métodos forneceram

valores consistentes com aqueles obtidos por análise quantitativa de aminoácidos.

Porém, para as proteínas glicosiladas o método de Bradford forneceu valores mais

baixos, enquanto que os de Lowry e do BCA forneceram valores acima do obtido pela

análise de aminoácidos. Quanto à composição da amostra espirulina, conforme já foi


36

descrito no item 3.2.3 deste capítulo, existem algumas proteínas que possuem

corantes ligados às suas estruturas. Estas são conhecidas como ficocianinas ou

ficobiliproteínas. Na estrutura de uma ficobiliproteína, o cromóforo linear tetrapirrólico

(bile) se liga covalentemente via uma ou duas ligações tiól-éter aos resíduos de

cisteína de uma apoproteína [82].

É interessante também verificar o mecanismo de interação entre o corante

coomassie e a proteína. Sedmark e Grossberg [83] sugeriram que a ligação do

corante à proteína seria mediada pela interação com grupos amina protonados na

proteína. Além deles, de Moreno et al. [84] demonstraram a importância dos grupos

amina nas proteínas, sugerindo que os grupos sulfônicos no corante formariam um

par iônico com os resíduos de lisina e arginina. Assim, somente as espécies

desprotonadas (ionizadas) do corante coomassie se ligariam à proteína (resíduos

lisina e arginina) [85, 86]. Portanto, pode-se supor que, apesar do coomassie e da bile

se ligar a resíduos diferentes na proteína, a bile provocaria dificuldades ou

impedimento estérico para o coomassie se ligar à proteína, levando a resultados

subestimados fornecidos pelo método de Bradford para a concentração de proteínas

totais para esta amostra. Com isso, entende-se que a amostra espirulina possui um

conjunto de proteínas na sua composição que não é adequado para a determinação

pelo método de Bradford.

Pelos argumentos apresentados acima, escolheu-se para a continuidade do

trabalho da Tese a amostra de castanha da Índia, uma vez que essa apresentou

resultados diretamente concordantes com a literatura, os quais passarão a ser

discutidos.

A partir dos resultados da amostra castanha da Índia na Tabela 1.1 e

considerando o valor máximo obtido para a concentração de proteínas totais

(castanha da Índia: 55 mg g-1, quando o meio extrator era o tampão Tris HCl à 1,0 mol

L-1, pH 6,8) como valor de referência (100%), foram comparados os procedimentos de

extração:

Observaram-se diminuições de 34,7% na quantidade de proteínas extraídas

entre os procedimentos 5 (quando a amostra era macerada no meio extrator) e 9, e


37

de 72,5% entre os procedimentos 2 (quando a amostra era agitada no meio extrator)

e 9, ou seja, entende-se que os procedimentos de agitação e maceração não foram

tão eficazes na extração das proteínas.

Quando a água foi utilizada como meio extrator, houve uma diminuição de 10%

na quantidade extraída de proteínas totais entre os procedimentos 4 (quando a

amostra era macerada no meio extrator) e 8, e de 46,4% entre os procedimentos 1

(quando a amostra era agitada no meio extrator) e 8. Assim, verificou-se que quanto

maior o número de passos adicionados aos procedimentos de extração das proteínas,

isto é, a agitação seguida da maceração e sonicação, se aumentava o rompimento

celular liberando mais proteínas das membranas e organelas celulares vegetais e se

aumentava a concentração das proteínas extraídas.

Os menores valores das concentrações de proteínas totais foram obtidos

naqueles procedimentos onde foi utilizada a diálise (o que já se esperava, uma vez

que a diálise pode ser considerada um procedimento bastante ameno comparado aos

outros procedimentos utilizados e levando-se em conta o tipo de amostra bastante

complexa): diminuições de 48,5% entre os procedimentos 6 (quando a amostra era

macerada em água e submetida à diálise) e 8, e de 64% entre os procedimentos 3

(quando a amostra era submetida à diálise em água) e 8. Apesar deste procedimento

“limpar” as amostras, ou seja, partículas e fragmentos de proteínas ou proteínas

menores do que 8 kDa passarem pela membrana, entende-se que as proteínas,

dentro de membranas ou organelas, provavelmente não foram extraídas, ou ainda,

que apenas ao se usar a agitação seguida de diálise as proteínas não tenham sofrido

total desnaturação. Isso poderia dificultar o acesso ou a ligação do corante coomassie

à proteína, justamente pelo enovelamento (estrutura terciária) da proteína.

Portanto, em termos de concentrações de proteínas totais, os procedimentos mais

eficientes foram aqueles onde era utilizada a agitação seguida de maceração,

sonicação e centrifugação, à temperatura ambiente ou à 40oC (procedimentos 8, 9, 10

e 11) e os menos eficientes (sob as condições analisadas) foram aqueles onde a

diálise foi utilizada (procedimentos 3 e 6).


38

5. CONCLUSÕES PARCIAIS

Este capítulo confirma a influência do preparo de amostras, tanto dos

procedimentos de extração como dos meios extratores nos resultados de proteínas

totais nas amostras estudadas.

Quanto ao preparo de amostras, foram levantadas informações relevantes

quanto aos procedimentos, reagentes e cuidados a serem tomados a fim de que os

analitos em questão (as proteínas) sejam adequadamente preservados e possam ser

até quantificados. Sob este ponto de vista, onze procedimentos diferentes de extração foram propostos, testados e comparados entre si, em termos da eficiência relativa,

para a extração de proteínas totais.

Verificou-se que nem todos os valores encontrados para a concentração de

proteínas totais pelo método de Bradford eram concordantes com os fornecidos pela

literatura para as amostras estudadas. Assim, conclui-se que o método de Bradford

para determinação de proteínas totais não é o mais adequado para to presente

estudo, especialmente no caso da espirulina. Para esta amostra foi feito um estudo

comparativo dos valores obtidos com este método e o de Kjeldahl, tomado como

padrão. Após várias considerações, entende-se que a diferença de concentração

obtida pelos dois métodos, para esta amostra, pode ser devida a um possível

impedimento estérico provocado pelo corante tetrapirrólico que se liga à cisteína da

cadeia da proteína dificultando a ligação do corante coomassie para a reação de

Bradford e, finalmente, subestimando o valor fornecido por este método para a

concentração de proteínas totais.

A castanha da Índia foi escolhida, dentre os fitoterápicos tradicionais

investigados neste Capítulo, por ter suas proteínas eficientemente extraídas e

apresentar concentrações de proteínas totais dentro do intervalo fornecido pela

literatura.

Dentre os procedimentos sugeridos, observou-se que aqueles onde se

somavam várias etapas, tais como agitação, maceração, sonicação e centrifugação

foram os mais eficientes, em termos de extração de proteínas para a castanha da


39

Índia, tanto à temperatura ambiente, como à 40oC para os meios extratores utilizados.

Acredita-se que a seqüência de etapas no procedimento promove uma maior ruptura

celular ou das estruturas celulares e também a desnaturação das proteínas.

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47

CAPÍTULO 2

Mapa Protéico da Castanha da Índia


49

1. OBJETIVOS

• Caracterizar as proteínas da amostra castanha da Índia, cujas extrações já

foram otimizadas no Capítulo anterior, por meio de técnicas analíticas de

eletroforese, em uma e duas dimensões, e de MALDI-QTOF-MS.


2.1 Proteínas – Aspectos gerais

Proteínas são polímeros lineares de aminoácidos (macromoléculas) de massa

molar (MM) variando desde centenas até milhares de Daltons (1 Da = 1,661x10-24 g).

Apenas em torno de 20 aminoácidos são encontrados em proteínas de plantas e

animais e estes são combinados em incontáveis maneiras para formar uma grande

variedade de diferentes proteínas.

As moléculas de proteínas consistem de uma “espinha dorsal”, formada por um

grande número de peptídeos, da qual se projetam cadeias laterais de resíduos de

aminoácidos. A natureza destas cadeias laterais de aminoácidos é responsável pelas

diferentes propriedades das proteínas.

Um aminoácido possui um grupo carboxílico e um grupo amino e nas

moléculas de proteínas eles são responsáveis pela formação das ligações peptídicas,

com exceção dos C e N terminais da proteína [4], como mostrado na Figura 2.1.

Figura 2.1. Uma proteína típica: Diagrama de ligações peptídicas e N e C terminais.


50

Cada aminoácido tem duas constantes de ionização (expressos como valores

de pKa), os quais representam as constantes de ionização dos grupos 1-amino e 1-

carboxílico do aminoácido livre. Entretanto, alguns têm mais do que dois valores de

pKa, pelo fato de terem outros grupos ionizáveis nas suas cadeias. A carga líquida de

uma molécula de proteína numa solução aquosa depende da constante de ionização

das cadeias laterais dos aminoácidos constituintes e do pH da solução. Para valores

de pH baixos, os grupos carboxílicos não são ionizados e os aminos são protonados,

tendo a proteína uma carga líquida positiva. Para valores de pH altos, os grupos

carboxílicos são ionizados e os aminos não são protonados, tendo a proteína uma

carga líquida negativa. Para valores intermediários de pH somente alguns grupos da

cadeia são protonados, dependendo dos valores de pKa. Existe um pH particular para

cada molécula de proteína no qual esta não tem carga líquida. Isto acontece porque

ela possui um número igual de grupos carregados positiva e negativamente. Este pH

é chamado de ponto isoelétrico da proteína e é designado por pI. O valor de pI é

característico de cada proteína. Para valores menores que o pI a proteína tem carga

líquida positiva, enquanto que para valores maiores que o pI ela terá carga negativa.

Portanto, para um dado valor de pH, proteínas diferentes terão cargas líquidas

diferentes por causa dos seus valores de pI característicos [4].

2.1.1 Proteínas em plantas

As proteínas em plantas se distribuem nas células, que conforme suas

localizações podem ter funções específicas. Por exemplo, numa célula de folha

ocorrerá a fotossíntese e para essa função existirá um maquinário incluindo organelas

e proteínas diferentes de uma célula da raiz da planta. A célula básica de uma planta

partilha de uma estrutura típica de uma célula eucariótica, mas não possui centríolos,

lisossomos, filamentos intermediários, cílios ou flagelos, como as células de animais.

Ela tem, entretanto, uma estrutura especializada, incluindo uma parede celular rígida,

vacúolo central, plasmodesmata e cloroplastos (Figura 2.2) [5].


51

Figura 2.2. Anatomia de uma célula de planta. Ilustração adaptada de [5].

As proteínas se distribuem numa célula de planta entre as diversas organelas e

terão funções específicas. Como exemplos, na parede celular pode ser encontrada

uma pequena quantidade de proteínas e parte delas consistem de enzimas, que

iniciam reações de formação, remodelamento ou quebra da estrutura da parede. Já o

cloroplasto possui uma membrana dupla e na camada externa dessa membrana

existem proteínas de transporte de membrana. Uma célula típica de planta poderá ter

até mais do que 20000 espécies diferentes de polipeptídeos, enquanto que em um gel

típico 2D-PAGE poderão se observar uma resolução máxima de 3000 spots protéicos

[6]. Portanto, a análise proteômica de uma espécie é muito difícil de realizar, mesmo

lançando mão dos recursos tecnológicos existentes atualmente. Muitas vezes, até a

análise de órgãos ou tecidos se torna muito complexa, mas é o caminho inicial para

se construir um panorama proteômico de uma dada espécie.

Um estudo realizado por Komatsu et al. [6, 7] em tecidos de arroz, ilustrou a

dificuldade citada acima. Neste estudo, foram observados um total de mais de 10000

spots de proteínas em géis 2D-PAGE. Deste número, foram selecionados 1220 spots

para análise e 358 foram identificados pelas respectivas seqüências. Koller et al. [8]

desenvolveram o mais detalhado estudo do proteoma desta planta, no qual 2582


52

proteínas únicas, ou seja, proteínas de tecidos de folhas, raízes ou sementes de arroz

foram identificadas utilizando uma combinação de técnicas como 2D -PAGE e LC-

MS/MS [6, 8].

Em alguns casos, o foco inicial de estudo é um tecido, mas na tentativa de se

reduzir a complexidade dos sistemas, e como análise subseqüente, passa-se ao

estudo de uma organela, de um processo metabólico, de um conjunto ou até mesmo

de apenas uma proteína [6].

Como exemplo de estudo proteômico de uma organela, tem-se o cloroplasto, já

descrito em algumas revisões tais como a de Taylor et al. [9] e de van Wijk [10]. Tanto

a bioquímica quanto o genoma do cloroplasto já são bastante estudados [6] e estima-

se que nesta organela existam de 2100 a 3600 proteínas, sendo que esta organela é

composta de vários compartimentos e cada um possui seu sub-conjunto de proteínas.

Para se estudar cada sub-proteoma é necessário se utilizar diferentes estratégias

experimentais [10].

Também têm sido realizadas análises proteômicas com sementes, várias delas

devido ao interesse comercial, tais como trigo ou soja [6,11]. Como era de se esperar,

foram desenvolvidos estudos com as sementes de Arabidopsis, levando-se em conta

a vantagem de se ter disponível o seu genôma completo. Em um desses estudos [12],

conseguiu-se estabelecer os perfis protéicos dos extratos de proteínas das sementes

em vários estágios de germinação e submetidas a diferentes tratamentos utilizando-

se a 2D-PAGE. Foi possível observar 1300 proteínas de sementes nos géis 2D,

sendo 74 mais abundantes e identificando-se 67 delas por MALDI-TOF MS.

2.2 Eletroforese

Em 1930, Arne Tiselius introduziu a eletroforese [4]. Este é um método de

separação considerado relativamente simples e altamente seletivo [3].

A eletroforese envolve a separação de espécies carregadas eletricamente, sob

a influência de um campo elétrico aplicado. Nas proteínas, as espécies carregadas

podem ser produzidas pelas reações de dissociação de grupos carboxílicos ou


53

aminos ou pelo envolvimento das proteínas com um surfactante aniônico, tal como

dodecil sulfato de sódio (SDS). As espécies carregadas eletricamente se movem em

um meio líquido, o qual é suportado por uma substância inerte, onde a velocidade de

migração é um fator importante. O líquido serve como um meio condutor para a

corrente elétrica gerada. Do ponto de vista da eletroforese, as propriedades mais

importantes das proteínas são o tamanho (isto é, seu raio) e a carga. Assim, as

proteínas terão velocidades de migração diferentes, dependendo das condições

eletroforéticas e serão separadas umas das outras por esta técnica [4].

O campo elétrico deve ser mantido constante para manter a amostra em

solução. Aumentos na força iônica levam a aumentos na condutividade com

conseqüentes aumentos de temperatura, que podem produzir aumento nas taxas de

difusão iônica, da mobilidade iônica e diminuição da viscosidade do meio. Em

contraste, um campo elétrico baixo gera uma separação com baixa resolução.

A eletroforese em gel é um poderoso método de separação para proteínas

inseridas em matrizes complexas, por exemplo, cultura de células e tecidos. Um

suporte para matriz muito comum é a poliacrilamida. Ela é obtida por meio da

polimerização da acrilamida monomérica, usando N,N`-metil bisacrilamida e fatores

como tipo de iniciador, concentrações, pureza dos reagentes e temperatura, bem

como a concentração de monômero e a de oxigênio e porosidade devem ser

considerados [13]. A escolha apropriada da concentração de acrilamida é

fundamental para se obter uma boa resolução no gel. Outros fatores como pH e tipo

de tampão também são importantes para a resolução.

Géis de poliacrilamida podem ser preparados em bastão ou em placas. No

primeiro caso, o gel é polimerizado dentro de tubos cilíndricos de vidro com cerca de

5 mm de diâmetro interno e de 70 a 100 mm de comprimento. Géis em placa (de

espessura entre 0,5 a 1,5 mm) são geralmente preferidos. Sua principal vantagem é

que várias amostras podem ser separadas ao mesmo tempo e sob condições

idênticas, permitindo uma comparação direta entre as bandas de diferentes amostras,

um tempo menor para a preparação, além da facilidade da dissipação do calor

durante a corrida eletroforética. A eletroforese em gel de poliacrilamida – PAGE tem


54

sido utilizada para resolver o problema de resolução na separação de proteínas.

Portanto, um grande número de protocolos para géis e tampões, bem como de

condições de separação têm sido empregado. Somando-se a isso, alguns outros

fatores podem ser considerados para se obter proteínas separadas em zonas

distintas ou bandas. A otimização de condições freqüentemente requer um grande

número de corridas preliminares, que tem por objetivo estudar a influência de cada

fator.

2.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida em uma dimensão (1D -

PAGE)

A eletroforese em uma dimensão (1D) em gel de poliacrilamida é relativamente

simples. Estes sistemas, dependendo das condições de extração de proteínas,

podem ser classificados como dissociantes ou não-dissociantes.

Nos sistemas não-dissociantes as proteínas são estudadas na sua forma nativa

ou in natura, de forma que não existam alterações na atividade biológica,

conformação, entre outros. As proteínas in natura são separadas em relação aos

parâmetros de tamanho ou carga se utilizada a eletroforese com focalização

isoelétrica (IEF). Durante a IEF, um gradiente de pH é formado e as espécies

carregadas na amostra (sob o campo elétrico) se movem através do gel, até que

eventualmente alcancem uma posição no gradiente de pH em que a somatória de

suas cargas se torne nula, ou seja, no seu pI. A IEF pode ter alta resolução e é capaz

de separar macromoléculas que difiram no seu pI de até 0,001 unidades de pH.

Em sistemas dissociantes, as proteínas são solubilizadas em um tampão

contendo SDS, o qual é o agente dissociante mais comumente usado. O SDS

circunda uniformemente a proteína, formando uma micela. A interação entre o SDS e

as proteínas produz cargas negativas para todas as proteínas e a magnitude dessas

cargas dependerá da MM das proteínas. Todas as proteínas migrarão em direção ao

eletrodo positivo durante a eletroforese e a separação será baseada apenas na MM

das proteínas.


55

As proteínas de menor MM se movem mais rapidamente através do gel do que

as maiores. Este tipo de eletroforese é geralmente conhecido como SDS-PAGE,

devido à combinação do tratamento das proteínas com SDS e a eletroforese em gel

de poliacrilamida (PAGE) [14].

Quando a SDS-PAGE não fornece resolução ótima ou uma determinação exata

da MM, detergentes catiônicos como brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) ou cloreto

de N-cetilpiridínio (CPC) são usados na SDS-PAGE [15].

2.2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida em duas dimensões (2D

- PAGE)

A maioria das pesquisas em proteomas de plantas utiliza a eletroforese em gel

de poliacrilamida com SDS em duas dimensões (2D - PAGE) para a separação de

proteínas [6].

Na separação por 2D - PAGE, as proteínas são inicialmente separadas por

focalizaçao isoelétrica (IEF), já descrita acima no item 2.2.1. A eletroforese por

focalização isoelétrica (IEF) tem geralmente dois modos de separação. Um deles é o

tradicional sistema baseado no transporte de anfólitos e o segundo é baseado na

preparação de imobilização de gradientes de pH. A maior vantagem do sistema IPG é

a disponibilidade de fitas pré-preparadas, proporcionando uma técnica de 2D mais

fácil de se usar. Por outro lado, o sistema de anfólitos é utilizado principalmente

quando grandes quantidades de proteínas são usadas ou proteínas básicas são

separadas.

Após a corrida, as proteínas contidas nas fitas são desnaturadas e envolvidas

por SDS, adquirindo cargas negativas. A fita é então aplicada em um gel de

poliacrilamida, no qual ocorre a segunda dimensão da separação. Geralmente, a

segunda dimensão separa proteínas baseada nas suas massas molares em géis com

SDS [13].

Um interessante conjunto de fontes e informações sobre a eletroforese 2D

estão disponíveis na Internet. Uma lista atual pode ser obtida no endereço

http://www.lecb.ncifcrf.gov/EP/. Entretanto, uma revisão cuidadosa da Internet revela


56

algumas diferenças entre os bancos de dados para a identificação de spots de

proteínas [13].

2.3 Espectrometria de massas

A espectrometria de massas tem se tornado uma ferramenta essencial nas

ciências biológicas modernas, não apenas pela alta sensibilidade, mas, também,

devido ao conteúdo total de informações derivadas dessa técnica [6].

A espectrometria de massas tem sido largamente usada na análise de

proteínas após a introdução do MALDI e da ionização por Eletrospray. Existem muitas

opções para analisadores de massas, sendo as mais comuns o tempo de vôo – TOF

conectado ao MALDI e ao quadrupolo triplo, quadrupolo-TOF ou ao analisador de ion

trap acoplado ao ESI [16].

Na análise proteômica, as proteínas separadas eletroforeticamente podem ser

identificadas por espectrometria de massas pela técnica chamada de “impressão

digital” (fingerprint) de peptídeos ou, após a digestão dos peptídeos in gel, estes são

fragmentados no espectrômetro de massas produzindo seqüências parciais de

aminoácidos. Após isso, são realizadas buscas em bancos de dados usando tanto a

massa molar quanto as informações dessas seqüências.

A seguir, será apresentado o princípio de funcionamento da técnica MALDI-

TOF-MS e fingerprint de peptídeos [16].

2.3.1 Digestão tríptica

A amostra de proteínas, que geralmente foi separada por um processo

eletroforético e está inserida em um gel, é digerida por uma enzima específica, muitas

vezes tripsina, quando são gerados peptídeos com massas molares dentro da faixa

de massas dos espectrômetros [6].

A tripsina cliva as ligações peptídicas de proteínas após os grupos carbonila

dos resíduos de lisina (K) e arginina (R), exceto quando estas ligações são com

prolina (P), ou seja, ligações K-P ou R-P. A tripsina é o reagente mais utilizado nos


57

experimentos de seqüenciamento por espectrometria de massas por ter um custo de

produção relativamente baixo, por possuir uma alta atividade proteolítica, por produzir

peptídeos pequenos (na faixa de 600 a 2500 Da) e por ser covalentemente

modificada, de modo a minimizar os processos de autodigestão ou autólise [17].

Quando as proteínas são separadas eletroforeticamente em gel, por técnicas

como SDS-PAGE ou 2D-PAGE, a digestão é feita na proteína ainda contida em uma

banda do gel. Esta proteína encontra-se imobilizada no gel de poliacrilamida por

precipitação, que ocorre durante a etapa de fixação do procedimento de coloração do

gel. Por causa desta imobilização, a proteína não pode difundir do gel durante as

etapas do protocolo de digestão até que ocorra a digestão tríptica, quando os

peptídeos formados poderão se difundir do gel de poliacrilamida devido ao tamanho

pequeno, em relação aos poros do gel de poliacrilamida. O protocolo de digestão

consiste de seis etapas que são: Retirada da banda protéica do gel e lavagem,

secagem das bandas, digestão com tripsina, extração dos peptídeos e lavagem,

captura dos peptídeos em uma coluna C18 e eluição da amostra [17].

Após a eluição dos peptídeos, estes são misturados a uma solução de matriz e

a mistura será depositada numa placa para a análise por massas.

2.3.2 MALDI-TOF-MS

Para a análise por MALDI, a amostra de proteínas, geralmente um spot de

interesse que está inserida em um gel, é digerida por uma enzima específica, muitas

vezes tripsina conforme citado no item 2.3.1, e este conjunto de peptídeos é

misturado a uma solução de matriz. Esta solução de matriz é uma solução ácida

concentrada ou saturada de baixa massa molar e absorvedora de radiação ultra-

violeta (especificamente para o MALDI). Aproximadamente 1 µL desta mistura de

amostra e matriz é colocada sobre a placa de MALDI, e conforme o solvente da

mistura seca, a matriz se cristaliza sendo que as moléculas de peptídeos ficam

incluídas nestes cristais.

Quando o LASER incide sobre os cristais de matriz/amostra, a matriz

absorvedora de UV e que deve estar em excesso em relação à amostra, absorve


58

energia e a transfere para a amostra de uma maneira suave, de forma que o processo

de ionização não fragmente os peptídeos. Dessa forma, a energia do LASER produz

uma pluma de matriz que carrega os íons de analito numa forma gasosa [6]. Na

Figura 2.3 é apresentada uma ilustração do princípio mencionado acima.

Figura 2.3. Ilustração dos processos que ocorrem durante a MALDI. Adaptada de Nyman [16].

Os íons de peptídeos são, então, separados pelo analisador de tempo de vôo

(TOF), no qual os íons são acelerados de uma posição inicial e voam através do tubo

TOF. Os íons mais leves (aqueles com menor relação massa/carga) voam mais

rápido através do analisador que os íons mais pesados (com maior relação

massa/carga), de forma que o tempo de vôo para alcançar o detector pode ser usado

para a determinação da relação massa/carga dos íons [6].

2.3.3 Espectros de massas

Para cada pulso de LASER é produzido um espectro de massas que conterá

íons provenientes dos peptídeos da proteína digerida, juntamente com os íons da


59

matriz (estes com relação massa/carga abaixo de 500 Da), além de alguns peptídeos

originados da autólise da protease usada para a digestão da proteína-amostra.

O primeiro passo em um experimento de fingerprint de peptídeos é a de-

isotopagem do espectro de massas produzido, que é realizada por um programa de

processamento de dados. A de-isotopagem identificará os picos isótopos, que

causam identificações falsas de proteínas e os removerá. A seguir, é obtida uma lista

de massas dos picos mais intensos dos valores massa/carga que são comparados a

um filtro (outro programa computacional) que reconhecerá e removerá qualquer pico

originado da autólise da protease utilizada para a digestão. A lista de picos é, então,

submetida a um banco de dados, que comparará as massas dos peptídeos do

espectro com aqueles de proteínas teoricamente digeridos e produzirá uma lista de

possíveis combinações (matches) e um mecanismo de pontuações (scores) para a

correta identificação.

Antes da lista de picos ser submetida ao banco de dados, várias informações

relevantes devem ser consideradas e especificadas, tais como a espécie da qual a

proteína é originada, o pI e a massa molar aproximada da proteína, a protease usada

na digestão, quaisquer modificações ocasionadas na proteína e a tolerância de

massa. Destas variáveis, a protease utilizada e a tolerância de massa são as mais

importantes. A protease usada especificará com qual lista de proteínas teóricas

digeridas se fará as comparações dos espectros produzidos. Já a tolerância de

massa, especificará o quão próximo (medida em partes por milhão, ppm) a massa do

peptídeo submetido e a massa do peptídeo teórico poderão estar para o matching.

Uma descrição mais detalhada sobre a interpretação do espectro de massas, bem

como dos vários métodos para se obter maior exatidão de massas para os peptídeos

e identificação de proteínas pode ser obtida na revisão de Newton et al. [6].


60


3.1 Equipamentos e acessórios

Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o

desenvolvimento deste Capítulo:

• Agitador por efeito vortex, marca Thermolyne, modelo M-37600;


• Centrífuga, marca Nova Técnica, modelo NT 811;

• Cubas para eletroforese do tipo SDS-PAGE, marca Permatron;

• Estufa, marca Quimis;

• Espectrômetro de massas do tipo MALDI-QTOF, marca Waters -Micromass,

modelo PremierTM ;

• Fonte de corrente contínua, marca Pharmacia Biotech, modelo EPS 1001;

• Mesa agitadora, marca Quimis, modelo Q225M;

• Placa aquecedora, marca Quimis;

• Potenciômetro, marca Digimed, modelo DM20;

• Scanner, marca GE Healthcare, modelo ImageScannerTM II;

• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo Quantum TM cartridge;

• Sistema para eletroforese 2D-PAGE, marca GE Healthcare, modelo EttanTM

Daltsix;

• Ultracentrífuga refrigerada, marca BioAgency, modelo Bio-Spin-R;


3.2 Reagentes e soluções

Todos os reagentes usados foram de grau analítico, sendo as soluções

preparadas com água desionizada. A seguir são listados todos os reagentes/soluções

empregados nesta parte do trabalho


61

� 2-Mercaptoetanol, HSCH2CH2OH, MM = 73,18 g mol-1 (J. T. Baker);

� Acetato de amônio, C2H7NO2, MM = 77,08 g mol-1 (Mallinckrodt);

� Acetona P.A., (CH3)2CO, MM = 58,08 g mol-1 (Synth);

� Acetonitrila, C2H3N, MM = 41,05 g mol-1 (Merck);

� Ácido acético glacial, CH3COOH, MM = 60,05 g mol-1 (J. T. Baker);

� Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, C10H7NO3, MM = 189,16 g mol-1 (Sigma-

Aldrich);

� Ácido clorídrico 37% m/v, HCl, MM = 36,46 g mol-1 (J. T. Baker);

� Ácido fosfórico 85%, H3PO4, MM = 98,00 g mol-1 (Merck);

� Ácido tricloroacético, C2HCl3O2, MM = 163,39 g mol-1 (Synth);

� Ácido trifluoroacético, C2HF3O2, MM = 114,03 g mol-1 (Mallinckrodt);

� Acrilamida, MM = 71,08 g mol-1 (BioAgency);

� Agarose grau biologia molecular (BioAgency);

� Albumina de soro bovino (Merck);

� Anfólitos, pH de 3 a 10 (Amersham Biosciences);

� Azul de bromofenol, C19H9Br4NaO5S, MM = 691,94 g mol-1 (BioAgency);

� Azul de Coomassie G-250, C47H50N3NaO7S2, MM = 854,03 g mol-1 (J.T. Baker);

� Cloreto de potássio, KCl, MM = 74,55 g mol-1 (Merck);

� Ditiotreitol, DTT, (CHOHCH2SH)2, MM = 154,24 g mol-1 (Amersham

Biosciences);

� Dodecil sulfato de sódio, SDS, C12H25NaO4S, MM = 288,28 g mol-1 (Synth);

� Etanol 95%, C2H6O, MM = 46,07 g mol-1 (J. T. Baker);

� Glicerol 87%, HOCH2CH(OH)CH2OH, MM = 92,09 g mol-1 (Amersham

Biosciences);

� Glicina, NH2CH2COOH, MM = 75,07 g mol-1 (Amersham Biosciences);

� Iodoacetamida, C2H4INO, MM = 184,96 g mol-1 (Amersham Biosciences);

� Kit para digestão tríptica dos géis In-Gel DigestZP Kit (Millipore);

� Metanol P.A., CH3OH, MM = 32,04 g mol-1 (Ecibra);

� N,N’-metilenobisacrilamida, C7H10N2O2, MM = 154,17 g mol-1 (Amersham,

Biosciences);


62

� N,N’,N,N’-tetrametiletilenodiamina, TEMED, C6H16N2, MM = 116,20 g mol-1 (J.

T. Baker);

� Óleo mineral, (Amersham Biosciences);

� Padrão protéico de massa molar, 116,0–14,4 kDa (MBI, Fermentas);

� Peróxido de hidrogênio, H2O2 30% (m/m) (Merck);

� Polioxietileno(10) isooctilfenil éter, Triton X-100, (J. T. Baker);

� Uréia, NH2CONH2, MM = 60,06 g mol-1 (BioAgency).

3.3 Separação eletroforética em uma dimensão (SDS-PAGE)

3.3.1 Preparo das amostras para a separação eletroforética

baseada em SDS-PAGE

Após a avaliação da concentração de proteínas totais (Capítulo 1), foi escolhida

a amostra castanha da Índia para separação eletroforética. Esta escolha se deveu às

concentrações de proteínas totais determinadas por Bradford no Capítulo anterior

estarem dentro do intervalo apresentado pela literatura. As condições empregadas

para tal separação foram otimizadas após alguns testes.

Para cada canaleta de gel foram utilizadas alíquotas de 20 µL dos extratos

protéicos (o volume máximo para cada canaleta no gel era de 25 µL, sem que

houvesse o transbordamento de extrato para a canaleta vizinha), diluídos (ou não),

aquecidos à 100oC num banho-maria por 10 min para completar o processo de

desnaturação das proteínas. As amostras preparadas foram resfriadas à temperatura

ambiente e inseridas nas canaletas do gel. Nos géis, sempre uma canaleta era

reservada para padrões de proteínas de massas molares conhecidas [18].

Os extratos protéicos obtidos dos procedimentos 1 e 2 (onde a amostra só foi

processada com a agitação manual em água e tampão, respectivamente) não foram

diluídos, uma vez que as concentrações de proteínas totais estavam abaixo do valor

otimizado de 2,2 mg g-1. Aqueles obtidos dos procedimentos 4 e 8 (amostra macerada

em água e macerada em água e sonicada, respectivamente) foram diluídos com água

e aqueles obtidos dos procedimentos 5 e 9 (amostra macerada em tampão e


63

macerada em tampão e sonicada, respectivamente) foram diluídos em tampão Tris-

HCl, 1,0 mol L-1, a pH 6,8. Em todos os procedimentos onde houve diluição dos

extratos protéicos, foi mantida a concentração de 2,2 mg g-1 de proteínas (ca. de 4,4

µg de proteína por canaleta). Portanto, os extratos protéicos dos procedimentos 1, 2,

4, 5, 8 e 9 foram separados em condições desnaturantes e não-redutoras. Entretanto,

para efeito de comparações, os extratos provenientes dos procedimentos 4, 5, 8 e 9

(amostra macerada em água ou tampão, respectivamente, e macerada em água ou

tampão e sonicada, respectivamente) foram diluídos com um tampão dissociante,

misturando-se 38 µL de tampão Tris-HCl à 0,5 mol L-1, pH 6,8, 60 µL de SDS 10%

(m/v), 15 µL de 2-mercaptoetanol (conc.), 30 µL de glicerol (conc.) e 158 µL de H2O.

Assim, estes extratos foram separados em condições desnaturantes e redutoras [18].

3.3.2 Separação de proteínas por eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE)

Para a separação foi utilizado um gel composto de acrilamida (12,5% m/v) e

N,N´-metil bisacrilamida (0,4% m/v), a pH 8,8, contendo 10% (m/v) de dodecil sulfato

de sódio (SDS), 0,1% (m/v) de N,N´,N,N´-tetrametiletilenodiamina (TEMED) e 10%

(m/v) de persulfato de amônio. Foi usado o tampão Tris-HCl (1,0 mol L-1) para ajuste

de pH. As dimensões do gel foram 10,0 cm (altura) por 10,5 cm (largura) e o tampão

de Tris-glicina (pH 8,3) foi usado nos reservatórios da cuba [14, 19]. As correntes

inicial e final foram 25 e 15 mA, respectivamente, a voltagem foi fixada em 100 V, e o

tempo de corrida aproximado de 3 h.

Após a corrida eletroforética, as bandas protéicas foram coloridas por 2 h com

uma solução 0,15 g de Azul Brilhante de Coomassie G-250, 90 mL de metanol, 30 mL

de ácido acético glacial e 180 mL de água desionizada. A seguir, o gel foi descolorido

por cerca de 10 h na mesma solução, mas sem o Azul Brilhante de Coomassie G-250.

Os géis foram digitalizados por meio do programa Gel-Pro Analyser® 3.1, da

MediaCybernetics Inc. (Silver Spring, EUA) e as massas molares (MM) das proteínas

foram estimadas a partir do padrão de proteínas purificadas que incluía β-

galactosidase (116 kDa), albumina de soro bovino (66,2 kDa), ovalbumina (45,0 kDa),


64

lactato desidrogenase (35,0 kDa), endonuclease restrição Bsp98I (25,0 kDa), β-

lactoglobulina (18,4 kDa) e lisozima (14,4 kDa).

3.4 Separação eletroforética em duas dimensões (2D-PAGE)

3.4.1 Otimização da metodologia para a separação por 2D-PAGE

Após a separação das proteínas da amostra castanha da Índia por SDS-PAGE,

foi necessário otimizar as condições de preparo da mesma para a separação

eletroforética bidimensional.

A partir do extrato protéico proveniente do procedimento de extração 5

(amostra manualmente macerada em tampão), cuja razão da escolha será justificada

no Capítulo 3 desta Tese, foi processada uma etapa de limpeza para a eliminação de

possíveis interferentes, tais como sais e polissacarídeos, para a separação 2D. Foram

colocados 350 µL do extrato protéico (equivalente a 1,26 mg de proteínas – vide

Tabela 1.1, Capítulo 1) num tubo de ensaio (em triplicata) onde foram adicionados

1,05 mL da solução de acetona/etanol à 0oC (na proporção 3:1 v/v) em cada tubo e

levados ao freezer (-20oC), por 1 h, para precipitação das proteínas. Logo a seguir, os

tubos foram centrifugados a 1800 g, durante 3 min, e a parte solúvel foi removida.

Foram novamente adicionados em cada tubo 1,05 mL da mistura de acetona/etanol

3:1 (v/v), à 0oC, sendo a amostra agitada levemente para que as proteínas entrassem

em contato com a mistura. Cada tubo foi levado novamente a -20oC, por 1 h,

centrifugado a 1800 g, durante 3 min, descartando-se a parte solúvel. Este

procedimento de limpeza foi repetido por mais duas vezes. A seguir, esperou-se a

mistura acetona/etanol evaporar completamente (à temperatura ambiente) para serem

adicionados, em cada tubo, 300 µL de um tampão de re-suspensão das proteínas,

composto por 8 mol L-1 de uréia, 2% (m/v) de CHAPS, 0,5% (v/v) de anfólitos, 1%

(m/v) de DTT e 0,002% (m/v) de azul de bromofenol. No momento da utilização do

tampão, foram adicionados 2,8 mg de DTT para cada 1 mL do tampão. O processo de

re-solubilização levou cerca de 5 min, à temperatura ambiente, e, logo a seguir, as


65

soluções foram centrifugadas a 8500 g, por 2 min, para retirada de possíveis resíduos

sólidos.

3.4.2 Separação bidimensional de proteínas por eletroforese com

focalização isoelétrica e em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)

Após os procedimentos de preparo, efetuou-se a separação eletroforética.

Primeiramente, as proteínas foram separadas pelo ponto isoelétrico em fitas de 13

cm, com pH variando entre 3 e 10. Para isso, foram aplicados 300 µL da amostra

numa canaleta do aparato (Reswelling Tray, GE, EUA). Em seguida, as fitas foram

colocadas em contato com as amostras e cobertas com óleo mineral (2,0 mL). A re-

hidratação levou em torno de 12 h, à temperatura ambiente. Após este período, as

fitas foram levadas ao sistema focalizador (Ettan IPGphor, GE, EUA), onde foi

aplicado o seguinte programa: (1) 500 V até 500 Vh, (2) 1000 V até 800 Vh, (3) 10000

V até 11300 Vh e (4) 10000 V até 3000 Vh. No final da execução do programa, a linha

de azul de bromofenol tinha atingido o final da fita. Foram acumulados 19351 Vh no

total de 6 h e 21 min, com corrente final de 50 µA por fita.

Após a focalização, as fitas foram equilibradas, primeiro usando 10 mL da

solução composta por 6 mol L-1 de uréia, 2% (m/v) de SDS, 30% (v/v) de glicerol, 50

mmol L-1 de Tris-HCl a 1,5 mol L-1 (pH = 8,8), 0,002% de azul de bromofenol e 1%

(m/v) de DTT, sob leve agitação por 15 min, e depois usando a mesma solução,

entretanto o DTT foi substituído por 2,5% (m/v) de iodoacetamida, também sob

agitação, durante 15 min.

Para a separação na segunda dimensão, isto é, por massa molar, cada fita foi

cuidadosamente inserida sobre um gel de poliacrilamida a 12,5% (m/v) com

dimensões de 180 x 160 x 1,5 mm, onde também foi inserido um pedaço de papel de

filtro contendo 15 µL do mesmo padrão de proteínas utilizado na eletroforese SDS-

PAGE. A seguir, foi aplicada uma solução aquecida de agarose 0,5% (m/v), para fixar

a fita e o papel com o padrão de proteínas e evitar bolhas entre eles e o gel de

poliacrilamida. A segunda separação foi realizada aplicando-se 90 V e 25 mA, por gel


66

e 100 W durante 30 min e 250 V e 25 mA, por gel e 100 W durante aproximadamente

7 h.

Após a separação, cada gel foi lavado com água desionizada e as proteínas

foram fixadas no gel utilizando uma solução contendo ácido acético a 10% (v/v) e

etanol a 40% (v/v) durante 1 h. Após a fixação, cada gel foi lavado durante 10 min por

3 vezes com água desionizada, sob leve agitação, e corado com Azul Brilhante de

Coomassie G-250 coloidal [20] por 48 h. A solução corante foi removida por

sucessivas lavagens com água desionizada até se obter um bom contraste entre os

spots e o gel sem proteínas.

Os géis foram digitalizados por meio do equipamento Image Scanner e as

imagens obtidas foram tratadas pelo programa ImageMaster 2D Platinum (Genebio,

Genebra, Suíça) versão 6.0, que permitiu estimar o número de spots, os valores de pI

e as massas molares das proteínas.

3.5 MALDI-TOF-MS

3.5.1 Digestão tríptica dos spots de proteínas

Todos os spots 2D-PAGE de proteínas escolhidas foram digeridos utilizando-se

o kit para digestão tríptica In-Gel DigestZP Kit (Millipore), que continha uma placa

ZipPlate micro-SPE. Os protocolos de digestão e eluição empregados foram os

recomendados pelo fabricante e a eluição foi realizada à vácuo, utilizando-se uma

bomba de vácuo Multscreen®, do mesmo fabricante.

3.5.2 Caracterização de proteínas por MALDI-QTOF-MS

As amostras, resultantes da digestão tríptica conforme descrito no item 3.5.1,

foram aplicadas em uma microplaca de MALDI, e esta foi deixada à temperatura

ambiente por alguns minutos, de modo que o volume das gotas fosse reduzido por

evaporação. A matriz CHCA (Ácido α-cyano-4-hidróxicinâmico) foi preparada

adicionando-se 10 mg de ácido em uma mistura de água/acetonitrila 1:1 (v/v)

contendo TFA 0,1% (v/v) e, então, 2 µL desta solução foram adicionados a 2 µL


67

amostra. A mistura resultante foi aplicada na placa de MALDI e deixou-se secar à

temperatura ambiente. Todas as medidas foram realizadas no espectrômetro de

massas tipo MALDI-QTOF do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron – LNLS.

Os dados de espectrometria de massas foram coletados no modo íon positivo

(LDI+), com uma fonte fixa de íons de nitrogênio, usando os seguintes parâmetros:

taxa de pulso de LASER de 20 Hz; intervalo de massa de 880 a 3000 Da; limite

(threshold) do pico de detecção para MS-MS de 1500,0; limite (threshold) de massa

de 200,0 Da; tempo de varredura (scan) de 2 s; ajuste do multiplicador Np para 0,70;

resolução de 10.000 no modo “V”; limite (threshold) do trigger de 700; limite

(threshold) de sinal de 80 e ajuste do microchannel plate (MCP) para 2.100V.

Cada espectro de massas foi coletado após a varredura (scan) de 2 s e os

espectros foram acumulados durante aproximadamente 2 min. Foi utilizado argônio

como gás para colisão e a energia de colisão ficou entre 34 e 161 eV, dependendo do

tamanho dos íons. O equipamento foi controlado pelo programa MassLynx 4.1 e todos

os espectros de massas foram processados em uma lista de arquivos com a extensão

*.pkl, usando os programas ProteinLynxGlobalServer versão 2.2.5, da Waters

(Manchester, UK) e MASCOT Distiller com o servidor de busca de banco de dados

“in-house” do MASCOT Daemon, da Matrix Science (London, UK).

Para a identificação dos peptídeos, o programa Mascot [21], versão 2.1, foi

utilizado a partir das informações obtidas dos espectros de massas (MS e MS/MS). A

busca neste programa foi realizada usando o banco de dados MSDB, o qual contém

proteínas gerais e com seqüências não-idênticas. A pesquisa foi realizada, utilizando

os seguintes parâmetros: digestão enzimática com tripsina, peptídeos com nenhum

ou um sítio de clivagem pulado, carbamidometilação em cisteína como modificação

fixa e oxidação de metionina como modificação variável.


68

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Géis SDS-PAGE

Para explorar o “perfil” protéico dos extratos da castanha da Índia, ou seja,

investigar quais proteínas foram extraídas e se os procedimentos utilizados

influenciaram nestas extrações, foram escolhidos os extratos provenientes dos

procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9, descritos no Capítulo 1, Quadro 1.1, para a separação

de proteínas por SDS-PAGE.

Ao se efetuar a corrida eletroforética verificou-se que apenas uma banda

protéica era mais expressiva, independentemente do procedimento utilizado, ou seja,

pelo menos, aparentemente, os procedimentos de extração utilizados não

influenciaram na extração de proteínas. É interessante comentar que, embora tenham

sido obtidas diferentes concentrações de proteínas totais usando diferentes

procedimentos de extração, sempre foi obtida uma banda nos géis com tempo de

migração similar.

Na Figura 2.4 são apresentados os géis SDS-PAGE obtidos a partir dos

extratos brutos nos quais foram utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o

padrão de proteínas, com as respectivas MM. Os extratos brutos obtidos dos

procedimentos 1 e 2 não foram diluídos, enquanto os extratos brutos dos

procedimentos 4 e 8 foram diluídos com água e os obtidos dos procedimentos 5 e 9

foram diluídos com tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH=6,8). As diluições foram

realizadas de forma a se obter uma quantidade de 4,4 µg de proteínas em cada

canaleta de gel, sendo estas proteínas desnaturadas e sob condição não-redutora.


69

Figura 2.4. Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos, nos quais foram utilizados os procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares. Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm. 4.1.1 Determinação de massa molar e de massa de proteína por

densidade óptica

As massas molares das bandas dos géis foram estimadas a partir da

comparação das massas molares do padrão de proteínas, utilizando-se o programa

Gel-Pro Analyser® 3.1. Na Tabela 2.1 são apresentadas as massas molares

estimadas das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4, cuja

MM média foi calculada em 33,2 ± 0,9 kDa.


70

Tabela 2.1. Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4.

Procedimento* MM (kDa)

1 31,7

2 33,3

4 34,3

5 33,1

8 33,9

9 32,8

Média 33,2 ±±±± 0,9

MM – Massa Molar (em kDa) das bandas protéicas. * conforme Quadro 1.1, Capítulo 1

Na Figura 2.5 é apresentado, como exemplo, a variação das densidades

ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do padrão protéico (linha azul) e do extrato

bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha).

A partir dessa Figura pode-se observar nitidamente os picos das bandas protéicas do

padrão e da amostra, em torno de 33 kDa para este extrato. Podem se observar

variações nas densidades ópticas para cada triplicata para os valores abaixo de 33

kDa. Essas variações são devidas a variações na coloração dos géis e a diferenças

na calibração da densidade óptica, provocando estas flutuações.

Figura 2.5. Variação das densidades ópticas das bandas dos géis SDS-PAGE do padrão protéico (linha azul) e do extrato bruto obtido a partir do procedimento 5 (em triplicata - linhas verde, preta e vermelha).


71

A massa de proteína em cada banda foi estimada (em triplicata) pelas

diferenças de densidade óptica e por uma curva de calibração dos padrões, usando o

programa Gel-Pro Analyser® 3.1, cujos valores estão apresentados na Tabela 2.2. A

massa média de proteína estimada foi de 4,4 ± 0,6 µg, o que concorda com a

quantidade de proteínas inserida em cada canaleta de gel (item 3.3.1 deste Capítulo).

Tabela 2.2. Massas estimadas de proteína (em µg) a partir das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.4.

Procedimento m (µµµµg)

1 4,0±0,3

2 6,2±0,4

4 4,3±0,3

5 4,7±0,1

8 2,4±0,1

9 4,7±0,1

Média 4,4 ±±±± 0,6

Ao se diluir os extratos brutos com o tampão dissociante, ou seja, as proteínas

estavam desnaturadas e reduzidas, verificou-se, também, que apenas uma banda

protéica era mais expressa nos géis SDS-PAGE. Entretanto, todas apresentaram um

deslocamento na posição nos géis. Este deslocamento pode ser observado na Figura

2.6, onde são apresentados os géis SDS-PAGE para os extratos obtidos dos

procedimentos 1 (sem diluição com tampão dissociante - para comparação com os

outros géis), 4, 5, 8 e 9, cuja MM média das bandas protéicas foi de 23,5 ± 0,5 kDa.

Na Tabela 2.3 são apresentadas as massas molares estimadas, e a média calculada

(23,5 ± 0,5 kDa).


72

Figura 2.6. Géis SDS-PAGE obtidos a partir dos extratos brutos diluídos com tampão dissociante, nos quais foram utilizados os procedimentos 1 (sem diluição), 4, 5, 8 e 9 (diluídos com tampão dissociante) e o padrão de proteínas, com suas respectivas massas molares (em kDa). Géis de poliacrilamida 12,5% (m/v) com dimensões de 100 (altura) x 105 (largura) x 1,0 (espessura) mm.

Tabela 2.3. Massas molares estimadas (em kDa) das bandas obtidas dos géis SDS-PAGE apresentados na Figura 2.6.

Procedimento MM (kDa)

4 23.5

5 23,2

8 24,3 9 23,2

Média 23,5 ±±±± 0,5

MM – Massa Molar (em kDa) das bandas protéicas. O valor da MM da banda proveniente do procedimento 1 está apresentada na Tabela 2.2.

O deslocamento observado entre as bandas protéicas nos géis cujos extratos

foram diluídos com tampão dissociante e os não diluídos com este tampão pode ser

atribuído à mobilidade das proteínas e é relativamente comum quando estas são

extraídas das plantas [22 - 24].


73

Um dos maiores problemas encontrados nas extrações de proteínas e enzimas

de plantas é a presença de compostos fenólicos que podem ser liberados durante a

maceração dos tecidos. Eles são rapidamente oxidados a quinonas por enzimas das

plantas e estas, ou reagem com as proteínas, inativando as enzimas, ou mudam a

mobilidade das moléculas de proteínas. Assim, substâncias que evitem ambas

oxidação e a reação com fenóis/quinonas são fortemente recomendadas a serem

adicionadas quando as amostras são maceradas ou aos meios extratores [25, 26].

Neste contexto, o agente redutor (2-mercaptoetanol) presente no tampão dissociante

possui duas funções: evitar a modificação da estrutura e, por conseguinte, da

mobilidade da proteína no gel (Figura 2.6), ou extrair uma nova proteína com MM

diferente. A mobilidade é função, dentre outras coisas, do tamanho e da conformação

dos íons migratórios, bem como da porosidade do gel. Como não foi alterada a

porosidade do gel, existe a possibilidade da mudança do tamanho ou da conformação

das proteínas pela adição do agente redutor. Desta forma, a massa de 23,5 ± 0,5 kDa

pode ser considerada como a MM da proteína identificada. Gumilevskaya et al. [27]

também encontraram um grupo de polipeptídeos para castanha da Índia de cerca de

24 – 25 kDa, uma massa que é característica de proteínas do citosol. Estas proteínas

também foram classificadas como estáveis ao calor, compreendendo quase 30% do

total de proteínas presentes no citosol. Portanto, estas afirmações estão concordantes

com nossos resultados (Figura 2.6), uma vez que as proteínas apresentaram a MM

nos mesmos intervalos, bem como também foram aquecidas (10 min à 100oC) antes

da separação eletroforética.

4.2 Géis 2D-PAGE

Após a separação das proteínas em uma dimensão, passou-se a etapade

separação em duas dimensões (em termos dos seus valores de pI e MM). Como foi

observado, por meio da eletroforese em uma dimensão, sempre se extraia apenas

uma banda protéica, independentemente do procedimento de extração utilizado.

Assim, foi escolhido fazer a separação eletroforética em duas dimensões com o


74

extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em

tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Esta escolha deveu-se a resultados

que serão discutidos no Capítulo 3 desta Tese (item 4.2). Portanto, após realizadas

todas as otimizações no preparo da amostra castanha da Índia e na separação

eletroforética (conforme descrito nos itens 3.4.1 e 3.4.2 deste Capítulo), obtiveram-se

géis 2D-PAGE (n=3), como o apresentado na Figura 2.7.

Figura 2.7. Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de MM de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão denominados de A a I, da esquerda para direita. No destaque, à direita superior, estão as bandas protéicas em três dimensões.

kDa

116,0

66,2

45,0

35,0

25,0

18,4

14,4

B D F H

A C E G I

3,0 10,0 pI


75

Neste gel pode-se observar que a banda de MM 23,7 kDa apresentada na

Figura 2.6 (sob condição desnaturante e redutora) se repetiu, mas com o

desdobramento em, pelo menos, 9 spots. Segundo o programa ImageMaster 2D

Platinum, versão 6.0, foi possível estimar os valores de MM de cada spot, (entre 23,4

e 23,7 kDa), seus respectivos valores de pI (entre 5,6 e 7,7), porcentagem de volume

e porcentagem de intensidade. Os dados referentes aos spots (denominados de A a I)

são apresentados na Tabela 2.4.

Tabela 2.4: Dados estimados dos spots, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0.

Spot MM (kDa) pI % Volume % Intensidade

A 23,6 5,6 10,3 10,1

B 23,4 5,8 13,6 12,6

C 23,4 6,0 15,8 14,7

D 23,5 6,3 23,3 17,9

E 23,4 6,5 15,6 12,2

F 23,7 6,8 7,4 8,9

G 23,5 7,0 5,1 8,8

H 23,6 7,2 5,6 8,7

I 23,5 7,7 3,3 6,1

A massa de proteína nos spots foi estimada pelas porcentagens de volumes da

Tabela 2.4, fornecidas pelo programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0 e

considerando-se que foi inserido um total de 1,256 mg (levando-se em consideração a

Tabela 1.1, Capítulo 1 e o item 3.4.1 deste Capítulo) de proteínas no gel. Os valores

estimados da massa de proteína de cada spot estão apresentados na Tabela 2.5.


76

Tabela 2.5: Valores estimados das massas de proteínas (em µg) em cada spot, com os respectivos valores de porcentagens, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0.

Spot m (µµµµg) % Volume

A 129,4±0,5 10,3

B 170,8±0,6 13,6

C 199,4±0,3 15,8

D 292,6±0,6 23,3

E 195,9±0,3 15,6

F 92,4±0,2 7,4

G 64,0±0,1 5,1

H 70,3±0,3 5,6

I 41,4±0,1 3,3

Total 1256±1 100

A consideração de que foi inserido o total de proteínas no gel não leva em

conta as perdas de proteínas durante todo o processo de separação, como, por

exemplo, perdas durante a etapa de limpeza com acetona e metanol, durante a re-

hidratação das fitas, durante o equilíbrio das fitas e na passagem das proteínas das

fitas para o gel SDS-PAGE. De fato, é sabido que todas essas etapas provocam

perdas de proteínas [28]; entretanto, infelizmente, não existe maneira de se

quantificar essas perdas. Portanto, optou-se por fazer essa consideração.

As proteínas separadas (spots) poderiam ser interpretadas como isoformas, ou

seja, proteínas que possuem massas molares similares e valores de pI distintos

devido a pequenas diferenças na cadeia de polipeptídeos, porém, desempenhando a

mesma função, ou PTM´s (do inglês, post translationally modified proteins) [28], que

se apresentam, muitas vezes, como uma seqüência de spots na direção horizontal ou

vertical de um gel 2D-PAGE. Isto nos leva, portanto, à necessidade de análises mais

específicas (como MALDI-TOF-MS, QTOF-MS, dentre outras) para, de fato, as

identificarmos.


77

4.3 MALDI-TOF-MS

Para as medidas de MALDI-TOF-MS foi preparado um gel 2D-PAGE, seguindo

o descrito no item 3.5 deste Capítulo, mas com uma concentração maior de proteínas,

ou seja, foram utilizados 0,525 mL de extrato protéico de castanha da Índia –

procedimento 5 (vide Quadro 1.1, Capítulo 1), correspondendo a 1,88 mg de

proteínas (segundo dados da Tabela 1.1, Capítulo 1). Esta concentração maior de

proteínas permitiu que se observassem mais spots protéicos no gel. Na Figura 2.8 é

apresentado o gel utilizado na análise por MALDI, onde pode se distinguir pelo menos

17 spots protéicos, denominados de A a Q. Todos esses spots foram recortados do

gel, sofreram digestão tríptica e foram caracterizados por MALDI, conforme descrito

no item 3.5 deste Capítulo.

Na Tabela 2.6 são apresentados os valores de pI, MM, porcentagem de volume

e porcentagem de intensidade, estimados a partir da imagem do gel da Figura 2.8

utilizando-se o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Nesta Tabela verifica-

se que as posições dos pontos isoelétricos e das massas molares dos spots protéicos

A a I variaram muito pouco em relação aos valores estimados na Tabela 2.4 (quando

se utilizou uma quantidade menor de proteínas), podendo-se considerá-los

concordantes entre as duas Tabelas. Por outro lado, os valores de % de volume e %

de intensidade foram alterados, levando-se em consideração o número maior de

spots (17).


78

Figura 2.8. Gel 2D-PAGE do extrato protéico proveniente do procedimento 5 (amostra manualmente macerada em tampão Tris-HCl 1,0 mol L-1 (pH 6,8), por 15 min). Fita de 13 cm, pH de 3 a 10, padrão de proteínas de massa molar de 116,0 a 14,4 kDa. Gel com dimensões de 130 x 130 x 1,5 mm. Os spots estão destacados em vermelho e denominados de A a Q, da esquerda para direita.


79

Tabela 2.6: Dados estimados dos spots protéicos do gel 2D-PAGE da Figura 2.8, segundo o programa ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0.

Spot MM (kDa) pI % Volume % Intensidade

A 24,1 5,5 2,52 2,82

B 23,7 5,7 8,22 7,84

C 23,7 5,9 14,7 8,2

D 23,4 6,2 17,6 9,7

E 23,4 6,5 11,4 8,8

F 23,0 6,7 7,6 6,4

G 23,2 6,9 5,3 6,9

H 22,8 7,2 6,3 6,8

I 22,9 7,3 6,4 6,8

J 22,6 7,9 2,3 3,7

K 22,8 8,0 2,0 3,6

L 22,7 8,2 1,8 3,0

M 22,9 8,4 1,2 2,9

N 22,7 8,6 1,2 4,0

O 22,6 8,7 7,0 9,0

P 22,7 9,0 1,7 3,9

Q 22,7 9,2 2,8 5,8

Os espectros de MALDI-TOF-MS foram realizados em duplicata e,

aparentemente, são idênticos entre si para cada spot. Na Figura 2.9 são


80

apresentados alguns espectros dos spots A e H, em duplicata, para exemplificar essa

similaridade.

Spot A-1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100

Zezzi4_160108_Am01 1 (0.402) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:3) 1: TOF MS LD+ 1582000.0480

1999.0099

869.47171349.7225

870.4717

1229.64831033.5853

1708.87151613.9279

1483.7258 1952.0316

1711.8284

2001.0205

2015.0414

2017.01073258.4543

2057.0803 2351.26033257.5500

2379.29153260.4104

Spot A-2

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

869.47171349.7091

1060.0670870.4609

976.46061229.6483

1061.0754

1709.86191613.9279

1482.70371951.0220

1711.8589

2001.0371

2016.0012

2017.0271

3258.55932057.0471 2248.1628

3257.50762352.2788 3260.4734

Spot H-1

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0428

1349.7362

869.4717

1033.59701034.5807

1350.7247

1505.83951351.7271

1352.7300

1649.89671708.9020

1709.89251710.8984

2001.0535

2016.0342

2017.0437

3258.53832057.09692274.2041

2248.1628

2360.18583256.5618

2702.36042379.32763124.5640

3260.57893434.6914

Spot H-2

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100

Zezzi4_160108_Am16 2 (0.492) Sm (SG, 2x4.00) 1: TOF MS LD+ 3802000.0480

1999.0428

1349.7362

869.4717

1033.5970

1034.5927

1350.7382

1505.8395

1352.7300

1649.88161708.8868

1952.03161710.9136

2001.0371

2016.0342

2017.06033258.5173

2056.0442 2360.18582058.1001 2702.3408

2380.31623256.5618

3137.49022704.3335

3260.53643434.6050

Figura 2.9. Espectros de massas em duplicata para as proteínas dos spots A e H.

A seguir, são apresentados na Figura 2.10 alguns dos 34 espectros de massas

gerados para os spots protéicos A a Q (todos espectros são apresentados no

Apêndice 4).


81

Spot B Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

857.53781349.7225

1229.64831033.59701115.5988

1613.9279

1351.7271

1667.98461951.0383

1711.9045

2001.0205

2002.0264

2017.01073258.5383

2351.24222018.03702248.1975

3257.4446

2352.27883097.5190

3260.5154

Spot C

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

857.5378

1349.7225869.4717

1229.6354870.4717976.4606

1034.5927

1708.87151350.7247

1667.96951710.8679

1711.8740

2001.0371

2016.0342

2334.17212017.0603

2248.19752018.0370

3259.52663257.50762350.1882

3139.53372353.1907

3260.5154

3261.4832

Spot G

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0428

1349.7362

1229.64831033.5970857.5378 1115.5988

1350.7382

1505.8395

1488.8264

1650.8700 1708.88681710.8984

2001.0535

2002.05933258.5173

2017.0769 3257.5291

2334.18972018.0536

2039.08423098.5447

2379.3276

3260.5364

3261.52563434.5620

3274.5415

Spot I

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0592

1349.7496

869.48261033.5970 1321.6938

1350.7382

1505.8395

1351.7271

1352.7163

1649.8816

1708.90201709.8925

1710.8984

2001.0535

2016.0508

2379.30962017.07692378.3391

2018.03702248.2151

2039.0842

3258.5383

3256.56182381.34132702.36042382.3303 3097.5396

3260.4944

3261.5886 3434.6270

Spot N

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


869.4826

877.0623 1033.62071332.7166

2000.06461999.0592

1350.7382

1505.8539

1351.7542

1352.7163

1649.89671650.8998

1951.0547

1709.9227

1806.9985

2001.0701

2016.0508

2379.32762017.07692378.3391

2018.07022247.2017

2019.0304

3258.53832380.3523

3256.58282381.3232

3137.55222702.2837 2809.4473

3259.5476

3260.5999 3433.5691

Figura 2.10. Espectros de massas gerados para os spots protéicos B, C, G, I e N.


82

Na inspeção visual dos espectros de massas da Figura 2.10 e Apêndice 4

percebe-se uma certa similaridade entre as estruturas orgânicas, não permitindo

ainda uma afirmação sobre a natureza ou similaridade das proteínas.

Os programas MASCOT Distiller e MASCOT Daemon, da Matrix Science

(London, UK) escolheram os cinco picos de massa/carga mais intensos de cada

espectro MS e excluíram os picos da tripsina e dos isótopos menos abundantes. A

seguir, foram feitas as medidas MS/MS e identificadas as sequências de peptídeos.

As posições dos picos e as sequências peptídicas são apresentadas na Tabela 2.7.

Nesta Tabela são apresentados os dados obtidos tanto para as proteínas nos spots

em duplicata, como, por exemplo, spot B-01 e B-02, como para as proteínas de

diferentes spots. Infelizmente, não foi possível produzir os espectros MS/MS de

algumas proteínas como as dos spots A, J, e L. Apesar disso, pode ser observado

que vários dos picos mais intensos são concordantes para várias proteínas, tais como

os picos de razão m/z 1348,6583; 1707,7960; 1998,0422 e 2013,9718.

Também se observa que algumas sequências peptídicas se repetem para

diferentes proteínas: A sequência EVSFLSYLYTK, com razão m/z de 1348,6915 para

as proteínas dos spots D, E, F, G, H, N e O; a sequência HVRESLPHIDMR, com

razão m/z de 1504,7569 para as proteínas dos spots D, E, G, H, I e O; a sequência

IQPNYLFSRTAIAR, com a razão m/z de 1648,9049 para os spots E, F, H, I, N, O e P;

a sequência QAPAVAPDDTVLAVSELFR, com razão m/z de 1998,0422 para as

proteínas dos spots B, C, D, E, F, G, H e N e a sequência VVYGSTVPVLDGEEFTMR,

com razão m/z de 2013,9718 para as proteínas dos spots B, C, E, F, G, H e I. Esses

resultados sugerem que se trata de isoformas.


83

Tabela 2.7. Razões m/z e as sequências peptídicas identificadas para as proteínas dos spots B a Q, provenientes dos espectros MS/MS. Amostra pI MM (kDa) Razão m/z Seqüência peptídica

B-01 5,69 23,77 1348,6583 DVTNTRSPSTSGK

1611,8733 KVAWKPVEQQNSAK

1665,8980 LKSSIMTAIMVMVAR

1998,0422 QAPAVAPDDTVLAVSELFR

2013,9718 VVYGSTVPVLDGEEFTMR

B-02 5,69 23,77 1228,5625 FPNWSNDPPR

1348,7252 PLSEIFFQGRR

1707,7960 FLVSGSAMMPTAPDPR

1997,9915 EVVMIAGKGDITVCTSFR

2014,0558 GAGFGIPALVVDGMDVLEVR

C-01 5,93 23,72 1348,7061 SIPLMSQVFPSK

1611,8807 FVIPQGMNLIPIDR

1707,8259 LAPSPMPPMKAPMHR


2014,0081 EFTQTPLLSTEFTVVMR

C-02 5,93 23,72 1348,7238 SLFEADKLDLAK

1665,8297 ETQKYVFNHTMLR

1707,8805 DHVADVAAGLQRFGPR



D-01 6,21 23,44 1504,7344 QPVFQDSPTLAMR

1665,8838 KVTSLHHQAFEIEK



D-02 6,21 23,44 1348,6915 EVSFLSYLYTK

1504,7569 HVRESLPHIDMR

1665,8322 QIYAATQKAETEASR




84

E-01 6,52 23,44 1348,6915 EVSFLSYLYTK

1504,8072 QMALFISKDSPLR

1707,7999 VSCDGSGDIPAALGHPR



E-02 6,52 23,44 1348,6915 EVSFLSYLYTK


1648,9049 IQPNYLFSRTAIAR

1707,7635 GENGLPGDNGAPGPMGPR

F-01 6,7 23,06 1348,6915 EVSFLSYLYTK

1504,8548 MLAQIASLRLFSR




G-01 6,91 23,20 1348,6915 EVSFLSYLYTK

1504,7634 RSDLGGTSPEAFLR



3256,5645 TRLIFICNPNNPSGTTITQAQFDNFMEK

G-02 6,91 23,20 1228,5625 FPNWSNDPPR

1348,6915 EVSFLSYLYTK




H-01 7,17 22,79 1348,6915 EVSFLSYLYTK





H-02 7,17 22,79 1348,6915 EVSFLSYLYTK




85



I-01 7,32 22,93 1348,7285 LPSISMIRGFGR



1998,1158 VILFCMDAAVLLLLVHR


I-02 7,32 22,93 1348,6677 SGHFFFNAPLGR

1532,7517 LHGLIASLIPSPR


2013,9296 DSSFETLTLGDVATITHK

K-01 8,07 22,79 1348,6040 DLSQSASILKK

1504,7287 NEISLTGVGLHTGK

1648,7839 GEIINCSGNTTTNLR

1997,9976 KYFRPLEVDTLLGDPR

2377,2056 ARTPAWPDLGLHGGAAAVTLAPR

M-01 8,35 22,93 1348,6864 LSPLLTRNNNK

1648,8185 RSVSAATPSQLDLPK

1997,9724 ITSFFLQEEGSRVIHR

2013,8857 RGSQLGLTDINLGMAHR

2377,1736 IVEIASAEELYSRPMHPYTR

M-02 8,35 22,93 1348,7115 SLIIAEKPSVGR

1504,7555 SSLLAENQVLMER

1998,0299 TLTPPDTAAVKGAIGTLHR

2014,0135 LMQFFDVLSKYFPAHR

2377,1607 GGKLETLVLSDNFFFGSIPEK

N-01 8,61 22,70 1348,6915 EVSFLSYLYTK

1504,7287 NEISLTGVGLHTGK

1586,7375 STILGIADEKSMAR

1648,8568 YPMPSIPMILASLGK

1997,9241 EVMVSGGRAAGVVLESGER


86

N-02 8,61 22,70 1348,7061 SIPLMSQVFPSK

1504,8548 MLAQIASLRLFSR

1586,8879 IISGQETDLSKLGVK



O-01 8,74 22,60 1348,6915 EVSFLSYLYTK


1586,8879 IISGQETDLSKLGVK


1997,9976 KYFRPLEVDTLLGDPR

O-02 8,74 22,60 1348,6915 EVSFLSYLYTK


1586,8893 QSDLKLFASRPGLR


1997,9224 SPAGAAKPASNVLAPTTGTK

P-01 9,0 22,74 1348,6405 GEEMLSRDLAGR

1504,8184 RGPPPPLMSAPLTR

1586,7988 QLTFGHCLALGGSAR


1998,0299 TLTPPDTAAVKGAIGTLH

Q-01 9,2 22,74 1348,6040 DLSQSASILKK

1504,7643 RTVSLNIHFMCK

1997,9377 QFTAATPVLSDILAVHR

2013,8996 IALIGSGETTPTMVGVHR

2377,1848 HGGQTIGKPLGYLSGSLLIPLP Tolerância para Massa de peptídeos: ± 0,1 Da Tolerância para Massa de fragmentos: ± 0,1 Da

Não foi possível a identificação de nenhuma das proteínas estudadas nas

buscas dos bancos de dados Glycine Max e MSDB, ficando, ainda, a sugestão de que

se faça uma busca por homologia.


87

5. CONCLUSÃO PARCIAL

Neste Capítulo foi realizada uma investigação da influência dos procedimentos

de extração de proteínas propostos no Capítulo 1 no proteoma da castanha da Índia.

Apesar dos diferentes procedimentos propostos influenciarem na concentração

de proteínas extraídas verificou-se que na separação eletroforética em uma dimensão

(SDS-PAGE) sempre se identificava apenas uma banda protéica mais intensa de

massa molar aproximadamente 23,5 ± 0,5 kDa, ou seja, ao menos, aparentemente,

os procedimentos de extração propostos no Capítulo anterior não foram decisivos

para a extração de proteínas de MM diferentes. Este valor de MM foi considerado

para as proteínas desnaturadas e sob condição redutora. Quando se separou sob

condições não-redutoras a mesma banda protéica apresentava MM em torno de 33,2

± 0,9 kDa. Este fato interessante observado foi relacionado à mudança na mobilidade

da proteína. A presença de compostos fenólicos liberados durante a maceração pode

mudar a mobilidade das proteínas e produzir resultados incorretos quanto à massa

molar. Dessa maneira, o uso de um agente redutor (como o 2-mercaptoetanol) é

imperativo para evitar tais problemas.

Também foi possível se estimar a massa de proteínas na banda protéica a

partir da densidade óptica e da comparação com o padrão de proteínas utilizado.

Obteve-se um valor em torno de 4,4 ± 0,6 µg de proteínas para cada banda,

concordando com o valor proposto no preparo dos géis.

Ao se realizar a separação eletroforética em duas dimensões foram

identificados pelo menos 9 spots protéicos com valores de MM entre 23,4 e 23,7 kDa,

e de pI entre 5,6 e 7,7, confirmando os resultados obtidos na separação por SDS-

PAGE.

Nas análises por espectrometria de massas, foi possível a inspeção visual da

similaridade dos espectros de massas MS para todos os spots protéicos e mais ainda

nos espectros MS/MS. Foi observado que os cinco picos mais intensos dos espectros

MS coincidiam em posição para vários spots protéicos, e, ao se identificarem as


88

sequências peptídicas, estas também coincidiram para vários spots protéicos,

sugerindo que se trata de isoformas.

Não foi possível a identificação das proteínas em bancos de dados ao se

utilizarem as sequências peptídicas, ficando em aberto a possibilidade da busca por

homologia. O que se entende é que se trata de proteínas estáveis ao calor e

provavelmente de origem citosólica.


[1] Lanças, F. M., Silva, J. C. R., Bicudo, R. C. e Neto, M. B., A química analítica do proteoma, Revista Analytica, Agosto/ Setembro(2003)60. [2] Gao, Y., Chen, C., Chai, Z., Zhao, J., Liu, J., Zhang, P. e Huang, Y., Detection of metalloproteins in human liver cytosol by synchrotron radiation X-ray fluorescence combined with gel filtration chromatography and isoelectric focusing separation, Analyst, 127(2002)1700. [3] Garcia, J. S., Magalhães, C. S. e Arruda, M. A. Z., Trends in metal-binding and metalloprotein analysis, Talanta, 69(2006)1. [4] Melvin, M., Electrophoresis – Analytical Chemistry by Open Learning, 1rst ed., Ed. D. Kealy, John Wiley & Sons, London, 1987, p. 127. [5] Plantcell, disponível no site http://micro.magnet.fsu.edu/cells/plantcell.html , acessado em 19-10-2007. [6] Newton, R. P., Brenton, A. G., Smith, C. J. e Dudley, E., Plant proteome analysis by mass spectrometry: principles, problems, pitfalls and recent developments, Phytochemistry, 65(2004)1449. [7] Komatsu, S., Konishi, H., Shen, S. e Yang, G., Rice proteomics. A step towards functional analysis of the rice genome, Molecular and Cellular Proteomics, 2(2003)2. [8] Koller, A., Wasburn, M. P., Lange, B. M., Andon, N. L., Decieu, C., Haynes, P. A., Hays, L., Schieltz, D., Ulasek, R., Wei, J., Wolters, D. e Yates, J. R., Proteomic survey of metabolic pathways in rice, Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america, 99(2002)11969. [9] Taylor, S. W., Fahly, E. e Ghosh, S. S., Global organellar proteomics, Trends in Biotechnology, 21(2003)82.


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91

CAPÍTULO 3

Identificação e Quantificação de Metais

Associados às Proteínas


93

1. OBJETIVOS

• Verificar a presença de metais nas estruturas das proteínas já separadas,

conforme descrito no Capítulo 2, e a influência da preservação dos mesmos ao

se utilizarem os diversos processos de extração de proteínas sugeridos no

Capítulo 1.

• Identificar os metais ligados às proteínas usando a técnica SRXRF

• Quantificar os metais ligados às proteínas usando a AAS.


2.1 Metaloproteínas e proteínas de metal ligante

Mesmo em baixas concentrações, alguns metais exercem um papel importante

na atividade biológicaestando majoritariamente ligados a proteínas específicas ou

enzimas e exercem seus efeitos em centros ativos ou estruturais das proteínas [1].

Metaloproteínas e proteínas de metal ligante (ou metal-binding, em inglês)

representam uma grande porção do número total de proteínas [2]. Tem sido estimado

que 40% de todas as proteínas e enzimas contenham metais nas suas estruturas.

Metaloproteínas e proteínas de metal ligante são responsáveis por muitos processos

metabólicos, tais como a conversão de energia na fotossíntese e respiração, bem

como processos que governam a expressão e regulação genética. Sítios metálicos

nas estruturas de proteínas também comandam outros processos, tais como catálise,

transporte e armazenamento [3, 4]. Uma metaloproteína é formada quando uma

proteína possui o tipo e o número apropriado de ligantes. Ainda, outra característica

importante é a geometria do ligante, pois apenas com a geometria correta os ligantes

poderão envolver e ativar o metal. Proteínas naturais e teoricamente projetadas

demonstraram que uma única modelagem pode ser adaptada para acomodar uma

grande variedade de metais [3]. Peptídeos, fragmentos de proteínas de diferentes

tamanhos contém grupos funcionais nas suas cadeias laterais que podem formar


94

ligações coordenativas com metais. Cisteína e metionina ligam metais que

apresentam afinidade com enxofre. Na histidina, os átomos de nitrogênio se tornam

disponíveis para coordenação após a desprotonação induzida [5].

Metaloproteínas são consideradas diferentes de proteínas de metal ligante. As

primeiras são definidas quando o metal liga-se às proteínas com interações de alta

afinidade, os quais não são perdidos durante a manipulação da amostra (por

exemplo, isolamento ou diluição). Já nas outras, as interações metal-proteína

possuem menor afinidade sendo mais facilmente rompidas [6]. As proteínas

interagem fracamente com íons monovalentes, tais como K+ e Na+. Entretanto, íons

como Ca2+ e Mg2+ interagem moderadamente e íons de metais de transição, tais

como Cu2+, Fe2+, Mn2+ e Mo2+, devido às suas conformações (densidade, raio atômico

pequeno e interações via forças eletromagnéticas e eletrostáticas) interagem

fortemente. Estes últimos são encontrados na maioria das metaloproteínas. O Quadro

3.1 apresenta algumas metaloproteínas.

Uma classe de metaloproteínas de grande interesse são as metalotioneínas

(MTs). As MTs de mamíferos apresentam baixa massa molar (em torno 6,8 kDa) e

são caracterizadas pela alta concentração de cisteína (30%). Elas têm afinidade para

a ligação de uma grande variedade de íons metálicos de transição (especialmente

elementos como Cd, Cu e Zn) [9].


95

Quadro 3.1 – Exemplos de algumas metaloproteínas [7, 8].

Elemento Proteína

Selênio

Glutationa peroxidase. Uma enzima que catalisa a redução de peróxidos e protege a célula de danos oxidativos.

Crômio Transferrina (proteína do plasma). Transporta Cr(III) através do corpo nas células do sangue.

Cobre

Ceruloplasmina (proteína do soro humano), ascorbato oxidase (plantas e bactérias), plastocianina (plantas superiores e cianobactérias), superóxido dismutase, tirosinase, citocromo oxidase e hemocupreína (animais).

Chumbo

Em torno de 95% do chumbo total no sangue humano é ligado a eritrócitos. Na maioria dos eritrócitos, o chumbo é ligado dentro da célula à hemoglobina. Nos fluidos extracelulares, o chumbo liga-se à albumina e a algumas proteínas de alta massa molar (globulinas).

Zinco Zinco é um constituinte de mais de 200 enzimas e proteínas. Os principais exemplos são insulina e carboxipeptidase A.

Manganês

Este metal é encontrado numa variedade de enzimas tais como piruvato carboxilase e oxalacetato decarboxilase. Este elemento pode ser encontrado em proteínas tais como glutamina sintetase, β-globulina e albumina.

Ferro

Proteínas contendo ferro são classificadas em duas categorias. A primeira é a heme, onde o metal é quelado por porfirina (um ligante solúvel em água). Esta classe é constituída por hemoglobina, mioglobina e citocromos. A segunda é formada por ferro não-heme. Os principais exemplos são transferrina, ferritina, ovotrasferrina, caseína, hemosiderina e albumina.

2.2 Fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)

Existem poucos trabalhos publicados na literatura utilizando SRXRF como

técnica de detecção após a separação de proteínas por eletroforese. A radiação

síncrotron como fonte de raios-X possui propriedades superiores como alta

intensidade (de 103 a 106 vezes maior que as fontes convencionais de raios-X), além

de ser altamente colimada e polarizada linearmente no plano elétrico orbital. Esta

técnica tem atraído a atenção para as análises que requerem baixas concentrações.


96

Pode ser alcançado um limite de detecção absoluto (LD) da ordem de 10-12 a 10-15 g

g-1 e um LD relativo de µg g-1 [10] e são necessários pequenos volumes ou massas

de amostras. Como esta técnica é considerada não-destrutiva, o preparo das

amostras é geralmente simples e rápido. Além disso, pode-se processar uma análise

multielementar simultânea (desde o Na ao final da tabela periódica). Ela consome

pouco tempo e ainda apresenta a possibilidade de se medir a distribuição dos

elementos tanto na superfície como no volume da amostra [10].

Embora a SRXRF tenha tantos atrativos, às vezes seu custo não é compatível

quando comparado a outras técnicas analíticas, que apresentam a mesma (ou até

melhor) sensibilidade. Entretanto, quando se utiliza uma micro-sonda de radiação

síncrotron esta situação muda por completo, uma vez que a capacidade de medidas

em baixas concentrações de elementos chega à ordem de sub-µg g-1.

Em 2002 Gao et al. [11] propuseram um sistema para separação e detecção de

metaloproteínas no citosol de fígado humano. O procedimento incluiu uma

cromatografia com filtração em gel e separação por focalização isoelétrica de

proteínas, um passo de secagem de gel e uma análise por SRXRF dos elementos nas

bandas de proteínas. Os resultados mostraram a existência de pelo menos 2 bandas

protéicas contendo Zn, 2 contendo Cu e 11 contendo Fe no citosol de fígado humano.

Apesar desses resultados, os autores acreditam que ainda são necessários melhorias

para a determinação quantitativa de elementos em baixa concentração nas bandas

protéicas. Gao et al. [12] também detectaram metaloproteínas no citosol de fígado

humano por SRXRF após a separação por SDS-PAGE. O gel foi seco imediatamente

após a separação eletroforética e as concentrações de metais foram determinadas

em certas regiões do gel por SRXRF. Após esta análise, o gel foi corado e descorado

e mais de 35 bandas protéicas foram visualmente distinguidas. Uma série de

espectros de SRXRF foi coletada ao longo da direção eletroforética. Com esse

procedimento foram distinguidas 6 bandas protéicas que continham Zn e pelo menos

mais 4 que continham Fe e 1 que continha Cu nesta amostra.

Em 2004 Weseloh et al. [13] combinaram as técnicas de SRXRF e SDS-PAGE

para analisar metal-apoazurina (com metais não ligados covalentemente) e


97

selenoproteínas em testículos de ratos. A amostra de apoazurina foi incubada em

solução de 2 mmol L-1 de ZnCl2, de forma a trocar o íon de Cu(II) na molécula por íon

de Zn(II) e a amostra de selenoproteína foi também preparada apropriadamente.

Todas as amostras foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para uma

membrana de PVDF (blotting) e coradas com azul de Coomassie. A distribuição de

selenoproteínas foi determinada por SRXRF e comparada a selenoproteínas de

testículos de ratos marcadas com 75Se, que foram preparadas conforme descrito por

Behne et al. [14]. A distribuição de vários elementos ao longo da canaleta de gel foi

determinada na amostra de apoazurina embebida com Zn. Foram encontrados Zn e

Cl nas bandas de proteínas. Para as amostras de selenoproteínas, foi detectado

apenas um pico de selênio por SRXRF e este foi identificado como a seleno-enzima

glutationa hidroperóxido fosfolipídeo, por autoradiografia. Também foram detectados

bromo, cobre, chumbo e zinco ao longo da canaleta de gel, provavelmente por

contaminação. Os autores concluíram que a combinação dos procedimentos

propostos poderia ser aplicada para a identificação de elementos em baixa

concentração em proteínas nas quais o metal ou metalóide estivesse covalentemente

ligado ou na forma de um complexo estável. Para os casos de complexos metal-

proteínas fracamente ligados, existiria o problema da perda de metais, e assim, a

PAGE nativa (com proteínas não desnaturadas) deveria ser empregada.


3.1 Equipamentos e Acessórios

Os seguintes equipamentos e acessórios foram utilizados para o

desenvolvimento deste Capítulo:


• Chapa aquecedora, marca Marconi, modelo MA239;

• Destilador sub-ebulição, marca Marconi, modelo MA075;


98

• Espectrômetro de absorção atômica com chama, marca Perkin-Elmer, modelo

AAnalyst 300;

• Espectrômetro de absorção atômica com atomização eletrotérmica, marca

Perkin-Elmer, modelo AAnalyst 600, equipado com corretor Zeeman

longitudinal e auto-amostrador modelo AS-800;

• Espectrômetro de Fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (disponível

no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron);

• Forno de microondas tipo cavidade, marca Provecto Analítica, modelo DGT

100 Plus;

• Lâmpadas de catodo oco, marca Perkin-Elmer;

• Sistema desionizador Milli-Q, marca Millipore, modelo QuantumTM cartridge;


3.2 Reagentes e Soluções

Todos os reagentes usados foram de grau analítico, sendo as soluções

preparadas com água desionizada. Para o preparo das soluções de referência de

várias espécies químicas foi usado ácido nítrico sub-destilado 0,2% (v/v) nas

determinações por ETAAS e 2% (v/v) nas determinações por FAAS. A seguir, são

listados todos os reagentes/soluções empregados nesta parte do trabalho:

• Ácido nítrico sub-destilado, HNO3 (Merck);

• Dihidrogênio fosfato de amônio NH4H2PO4, MM = 115,03 g mol-1 (Ecibra);

• Nitrato de paládio hidratado, Pd(NO3)2H2O, MM = 230,41 g mol-1 (Aldrich);

• Nitrato de magnésio hexahidratado, Mg(NO3)2 6H2O, MM = 256,41 g mol-1 (Merck);

• Peróxido de hidrogênio, H2O2 30% (m/m) (Merck);

• Solução de lantânio 10% (m/v) preparada a partir de La2O3, MM = 325,8 g mol-1

(Sigma), em 30% (v/v) de HCl;

• Soluções de referência de Fe, Mn, Cr e Ca (TecLab).


99

3.3 Mapeamento dos metais ligados às proteínas nas bandas por

fluorescência de raios-X por radiação síncrotron (SRXRF)

Para a análise das bandas de proteínas em gel SDS-PAGE proveniente da

castanha da Índia foi utilizada a linha de radiação DB09 do Laboratório Nacional de

Luz Síncrotron (LNLS). O anel de armazenamento de elétrons operava com uma

energia de 1,37 GeV com uma intensidade de 250 mA. Para se utilizar a fonte branca

em dimensões micrométricas, o conjunto de fendas foi ajustado pela micro-sonda de

raios-X da fonte de linha. Um colimador de tântalo de 2 mm de diâmetro foi usado na

entrada do detector. O detector de alta pureza de Ge (HPGe) foi colocado no plano

orbital dos elétrons, perpendicular à fonte incidente, para coletar o sinal XRF da

amostra exposta. As bandas de proteínas foram cortadas do gel e montadas sobre

um porta-amostras que se movia nas direções cartesianas XYZ. A amostra era

ajustada quanto ao posicionamento na fonte de radiação síncrotron (SR), de

dimensões 230 x 220 µm, quando esta era ligada. Na Figura 3.1 é apresentada a

montagem dos instrumentos utilizados nesta identificação.

Figura 3.1. Configuração do sistema utilizado para a aquisição dos dados referentes ao mapeamento de espécies químicas presentes nas bandas de proteínas.


100

Cada espectro de raios-X teve a duração de 300 s. As bandas de gel eram

movidas na direção horizontal (ao longo da banda) com 2 mm de intervalo entre cada

ponto mapeado. Ao todo foram mapeados 3 pontos em cada banda. Os espectros

foram processados por meio do programa AXIL. Com este programa, foi feita a

correção das variações de intensidade do fluxo da fonte de SR e as áreas dos picos

das espécies químicas detectadas foram normalizadas pela contagem de Argônio,

que está presente no ar a uma taxa constante (0,934% v/v) [15]. As áreas de pico

normalizadas foram usadas para estimar as contagens relativas dos íons metálicos.

As médias de intensidade dos dados (de todas as espécies químicas) foram

calculadas dos três pontos mapeados, bem como foi feita a diferença entre a

intensidade do sinal das amostras e do branco analítico. O branco analítico

considerado foi a banda de proteína ovalbumina no gel.

3.4 Decomposição ácida sob radiação microonda

Para possibilitar a quantificação de possíveis metais ligados às proteínas nos

extratos protéicos, foram decompostos as bandas de proteínas de gel SDS-PAGE e

os spots dos géis de 2D-PAGE, todos em triplicata. Cada banda de gel foi recortada

cuidadosamente, com o uso de um bisturi, e seca à temperatura de aproximadamente

50oC até massa constante. As amostras foram inseridas nos frascos de Teflon com a

mistura oxidante de 5 mL de HNO3 e 1 mL de H2O2. Foi dado um intervalo de tempo

de espera de 30 min antes do início da decomposição assistida por microonda, e

utilizado o seguinte programa de decomposição: 3 min a 400 W e 6 min a 790 W [16].

Após a decomposição, os frascos foram removidos do forno de microondas e

esperou-se o resfriamento até a temperatura ambiente (cerca de 2 h). Em seguida, os

frascos foram cuidadosamente abertos e as soluções foram transferidas para

béqueres, os quais foram levados à chapa aquecedora (60 – 70oC) para evaporação

do excesso de HNO3 (até quase secura – cerca de 8 h). Finalmente, as amostras

foram filtradas e os volumes finais foram ajustados em balões volumétricos para 5 mL

com a solução de HNO3 sub-destilado 0,2% (v/v). Os brancos analíticos consistiram


101

da banda da proteína ovalbumina em gel de SDS-PAGE e 2D-PAGE, submetidos ao

mesmo processo de decomposição descrito, também em triplicata. Este branco

analítico foi escolhido pela similaridade da matriz orgânica do gel para as proteínas e

para a ovalbumina, a qual não é considerada uma metaloproteína, de acordo com

banco de dados de proteínas [17].

3.5 Determinação de metais por ETAAS e FAAS nas bandas SDS-

PAGE e 2D-PAGE

Para a quantificação de metais nas bandas de proteínas provenientes de SDS-

PAGE e 2D-PAGE, após suas decomposições conforme descrito no item 3.4, foram

utilizados os espectrômetros de absorção atômica AAnalyst 600 e AAnalyst 300,

ambos da Perkin-Elmer (Norwalk, EUA). Para determinação de Fe, Cr e Mn foi

empregada a técnica ETAAS e para a determinação de Ca foi empregada a técnica

FAAS.

Foram utilizadas, como fontes primárias de radiação, as lâmpadas de catodo-

oco (Perkin-Elmer) de Cr (λ = 357,9 nm), Fe (λ = 248,3 nm), Mn (λ = 279,5 nm) e Ca

(λ = 422,7 nm). As medidas analíticas foram baseadas nas áreas de pico. As

condições de operação, tanto para ETAAS como para FAAS, foram as recomendadas

pelo fabricante [18].

As soluções-estoque (1000 mg L-1) para Cr, Fe e Mn foram preparadas em

0,2% (v/v) de HNO3, enquanto que para o Ca foi preparada em 2% (v/v) HNO3 com

0,1% (m/v) de La2O3. Modificadores químicos, tais como 0,15% (v/v) Mg(NO3)2 e

0,05% (v/v) Pd + 0,03% (v/v) Mg(NO3)2, foram usados para as determinações de Fe e

Cr, e para Mn, respectivamente.


102

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Avaliação qualitativa dos metais ligados às proteínas nas bandas

por SRXRF

Foram avaliados qualitativamente quais metais estariam ligados às proteínas

nas bandas (SDS-PAGE). Para isso foram utilizadas as bandas de proteínas de MM =

23,5 kDa, obtidas dos procedimentos 1, 2, 8 e 9 dos extratos protéicos da castanha

da Índia. Para um melhor acompanhamento desta parte do trabalho é sugerido que se

consulte o Quadro 1.1 do Capítulo 1 desta Tese.

Na Figura 3.2 são exemplificados os espectros de raios-X adquiridos. Pode-se

observar as linhas de emissão do Ca, Cr, Fe e Mn, apesar da intensa radiação de

fundo (entre 5 e 12 keV). Esta radiação de fundo é atribuída ao efeito Compton

provocado pelo fato das proteínas estarem inseridas em um gel de poliacrilamida que

continha elevados teores de água [11, 12, 16].

Por meio das áreas dos picos normalizados dos espectros de SRXRF das

bandas, foi possível identificar e estimar (conforme seção 3.3) as quantidades

relativas de Ca (3,69 keV), Cr (5,41 keV), Mn (5,89 keV), e Fe (6,40 keV) das

emissões Kα, conforme apresentado na Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Contagens relativas de metal das emissões Kα de íons metálicos. Os dados da intensidade média (contagens de íons de metal) foram calculados a partir dos três pontos mapeados, bem como foram descontadas as diferenças entre as intensidades das contagens das amostras e dos brancos analíticos.

Procedimento* Ca (x10-3) Cr (x10-4) Mn (x10-4) Fe (x10-3)

1 5,19 6,66 2,22 9,19

2 6,82 -- 9,9 1,07

8 0,15 -- 6,78 3,65

9 1 -- 7,5 0,92

*vide Quadro 1.1, Capítulo 1.


103

Figura 3.2. Espectros de raios-X adquiridos na análise por SRXRF: Em todos os espectros são apresentados o branco analítico (proteína ovalbumina + gel) (—): (a) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 1 + gel) (—); (b) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 2 + gel) (—); (c) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 8 + gel) (—) (d) amostra (proteínas de 23,5 kDa extraída por procedimento 9 + gel) (—). As contagens relativas das emissões Kα de íons variaram de 0 a 3000.


104

4.2 Avaliação quantitativa dos metais ligados às proteínas nas

bandas separadas por SDS-PAGE e 2D-PAGE utilizando as técnicas

ETAAS e FAAS

Após as identificações das espécies metálicas por SRXRF nas bandas

protéicas de castanha da Índia separadas por SDS-PAGE, bem como no branco

analítico (banda da proteína ovalbumina), as bandas protéicas (em gel) provenientes

dos procedimentos 1, 2, 4, 5, 8 e 9 (verificar os procedimentos no Quadro 1.1,

Capítulo 1) e de ovalbumina (em gel) foram decompostas (como descrito na seção

3.4).

Em concordância com a avaliação qualitativa dos íons metálicos por SRXRF,

Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS, em triplicata. Na Tabela

3.2 são apresentadas as concentrações de metais. As concentrações dos íons

metálicos tanto para as bandas protéicas da castanha da Índia, quanto para a banda

de ovalbumina, foram obtidas em termos das massas das bandas de gel recortadas.

Portanto, quando se subtraíram os valores de branco (gel + proteína) para cada

determinação, foram obtidas as concentrações de metais nas proteínas em cada

banda de gel.


105

Tabela 3.2: Concentrações de metais nas proteínas separadas por SDS-PAGE (média ± desvio padrão, n=3). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS.

Procedimento* Ca (mg g-1) Cr (µµµµg g-1) Fe (µµµµg g-1) Mn (µµµµg g-1)

1 12,5±0,5 4,98 ±0,05 35 ±6 2,7 ±0,4

2 9,8 ±0,7 1,6 ±0,7 38 ±2 1,9 ±0,2

4 6,4 ±0,3 4,00 ±0,02 40 ±7 15 ±1

5 11,4 ±0,8 1,5 ±0,4 37 ±7 12 ±2

8 0,74 ±1 < LQ 23 ±9 < LQ

9 < LQ 1,3 ±0,1 38 ±3 1,1 ±0,4

*vide Quadro 1.1, Capítulo 1.

Os limites de detecção e quantificação nas determinações realizadas estão

mostrados na Tabela 3.3.

Tabela 3.3: Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) obtidos experimentalmente nas amostras de bandas protéicas usando as técnicas de ETAAS e FAAS.

Ca Cr Fe Mn

LD 0,05 mg g-1 0,05 µg g-1 1,0 µg g-1 0,06 µg g-1

LQ 0,15 mg g-1 0,16 µg g-1 3,0 µg g-1 0,2 µg g-1

No Capítulo 1 desta Tese se verificou que os procedimentos 8 e 9 eram os que

mais extraíam proteínas da amostra, vide Tabela 1.1. Por essa razão, nesta parte do

trabalho, se escolheu estes procedimentos como base para comparação com outros

procedimentos de extração com relação à concentração de metais ainda presentes

nas proteínas após as extrações.

Dos resultados apresentados na Tabela 3.2 o que se pode observar é que os

procedimentos 8 e 9 não foram favoráveis para a preservação dos metais Ca, Cr e


106

Mn. Os procedimentos que utilizaram água como meio extrator (ou seja, os

procedimentos 1 e 4) foram melhores para a preservação do Cr nas proteínas. Já o

Mn, apresentou resultados similares para ambos procedimentos, 4 e 5. É possível

verificar-se que, ao se utilizar o procedimento 8 (sonicação com o meio extrator água),

a concentração de Mn estava abaixo do LQ, enquanto houve um aumento de 5,5

vezes na concentração desse metal ligado às proteínas ao se comparar os

procedimentos 4 e 1. Resultados similares foram observados ao se utilizar o outro

meio extrator (tampão). Enquanto se obteve uma concentração em torno de 1,1 µg g-1

de Mn ligado a proteínas utilizando-se o procedimento 9, conseguiu-se um aumento

de 11 vezes na concentração do metal ao se utilizar o procedimento 5 e um aumento

em torno de 2 vezes ao se utilizar o procedimento 2. Em outras palavras, pode-se

resumir a discussão nos seguintes termos: Nos procedimentos 1 e 2, a ausência da

maceração implica em uma baixa extração de proteínas, inclusive as que possuem

Mn em suas estruturas. Por outro lado, os procedimentos 8 e 9 provocaram a quebra

das ligações Mn-proteínas. Já nos procedimentos 4 e 5, a maceração ajuda a extrair

as proteínas (inclusive as que possuem Mn) e a ausência de sonicação faz com que

não haja perdas do Mn por quebra das ligações Mn-proteínas.

Continuando a comparação entre os procedimentos, as concentrações de Fe

permaneceram aproximadamente constantes (levando em conta os desvios padrões),

independentemente do procedimento de extração utilizado. Isto significa que os íons

ferro são preservados nas proteínas identificadas, o que pode ser um indicativo da

presença de uma metaloproteína com ferro. O Fe é um componente chave das heme-

proteínas (catalase) [19], e como um metal de transição, ele é provavelmente ligado

covalentemente à proteína. Como exemplo, Bagnoli et al. [20] encontraram

isoenzimas catalase de classe I e III e as metaloproteínas Mn- e Fe-superóxido

dismutase nas células zigóticas e somáticas embrionárias da castanha da Índia.

Ao se estudar o Ca, se verifica que este foi completamente perdido da estrutura

da proteína ao se utilizar o procedimento 9 (sonicação em tampão) e obteve-se uma

baixa concentração do metal (em torno de 0,74 mg g-1) ao se utilizar o procedimento 8

(sonicação em água). Ainda é possível observar que, para este metal, tanto o


107

procedimento 1 (agitação em água) quanto o procedimento 5 (maceração em tampão)

forneceram resultados similares (dentro do intervalo aceitável do desvio padrão),

indicando que procedimentos mais amenos são melhores para a preservação deste

metal.

É interessante que, apesar dos procedimentos 8 e 9 apresentarem os melhores

resultados para a extração de proteínas totais (vide Tabela 1.1, Capítulo 1), eles

foram os menos eficientes para a preservação dos metais nas estruturas das

proteínas desta amostra. Portanto, embora os procedimentos com sonicação

forneçam melhores resultados para a extração de proteínas totais, eles podem ser

considerados menos favoráveis para a preservação dos metais nas proteínas.

Os melhores resultados foram, então, obtidos com os procedimentos 4 e 5,

onde a maceração contribuiu para extrair proteínas (comparar Tabela 1.1, Capítulo 1

e Tabela 3.2, deste Capítulo), evitando a perda dos metais. O procedimento 5 foi

escolhido para a continuação do trabalho, por apresentar, de forma geral, as maiores

concentrações de metal (Ca, Fe e Mn, este dentro do desvio), ficando apenas o Cr em

menor concentração em relação ao procedimento 4.

Após a obtenção destes resultados, 8 spots, em triplicata, do gel 2D-PAGE

(Figura 2.7, Capítulo 2) do extrato protéico de castanha da Índia, utilizando-se o

procedimento 5, foram decompostos (conforme item 3.4 deste Capítulo) e neles foram

investigados a presença e as concentrações dos metais Cr, Fe, Mn por ETAAS e Ca

por FAAS. Vale explicar aqui que o spot E não foi examinado por dificuldades no

momento de se recortar o gel para a decomposição. Estes resultados estão

apresentados na Tabela 3.4. Para o cálculo das concentrações dos íons metálicos

tanto para os spots da castanha da Índia, quanto para a banda de ovalbumina, foram

consideradas as massas dos spots e das bandas de gel recortados. Portanto, quando

se subtraíram os valores de branco (gel + proteína) para cada determinação, foram

obtidas as concentrações de metais nas proteínas em cada spot de gel.


108

Tabela 3.4: Concentrações de metais nos spots de proteínas do gel 2D-PAGE da castanha da Índia (vide Figura 2.7, Capítulo 2). Cr, Fe e Mn foram determinados por ETAAS e Ca por FAAS (média ± desvio padrão, n=3).

Spot* Ca (mg g-1) Cr (µµµµg g-1) Fe (µµµµg g-1) Mn (µµµµg g-1)

A 0,7±0,4 <LQ <LQ <LQ

B <LQ <LQ <LQ <LQ

C 3,2±0,2 <LQ 102±12 1,7±0,9

D 4,3±0,2 53,8±0,8 420±20 16,4±0,2

F 3,9±0,2 8,8±0,2 681±11 6,3±0,2

G 8,1±0,4 <LQ 515±16 7,5±0,2

H 5,2±0,3 <LQ 168±12 5,3±0,5

I 0,16±0,05 <LQ <LQ <LQ

LQ: vide Tabela 3.3.; *vide Figura 2.7, Capítulo 2. É necessário ressaltar aqui que uma comparação entre as concentrações

apresentadas nas Tabelas 3.2 e 3.4 seria errônea. Por exemplo, seria errôneo

comparar as concentrações obtidas para cada metal na banda SDS-PAGE

proveniente do procedimento 5 com a soma das concentrações de todas os spots

(Tabela 3.4). Isto porque os procedimentos envolvidos para a separação SDS-PAGE

e 2D-PAGE são diferentes. A 2D-PAGE compreende muito mais passos, que

implicam em possíveis perdas de proteínas durante os procedimentos (conforme já

comentado no item 3.4, Capítulo 2), além de requerer uma quantidade muito maior de

proteínas para se obter um bom resultado (foi utilizado cerca de 56 vezes mais

proteínas do que na SDS-PAGE). Além disso, por meio da 2D-PAGE, pode-se

observar como os metais se distribuem ao longo dos diferentes spots, indicando uma

condição muito diferente daquela vista na Tabela 3.2.

Dos resultados do item 4.2, Capítulo 2, onde se estimaram as massas de

proteínas presentes nos spots e da Tabela 3.4, foram estimadas as quantidades de


109

cada metal presente nas proteínas (ver Tabela 3.5). Por exemplo, a massa estimada

de proteínas do spot A é de 129,4 ± 0,5 µg (Tabela 2.5, Capítulo 2) que multiplicada

pela concentração de Ca (0,7 ± 0,4 mg g-1) dá a quantidade de Ca presente nesta

massa de proteínas (90,6 ± 0,6 ng).

Tabela 3.5: Estimativa das quantidades de metal nas proteínas identificadas.

Spot* Ca (ng) Cr (ng) Fe (ng) Mn (ng)

A 90,6±0,6 <LQ <LQ <LQ

B <LQ <LQ <LQ <LQ

C 638,1±0,3 <LQ 20,34±0,01 0,34±0,01

D 1258,2±0,7 15,74±0,01 122,89±0,02 4,80±0,01

F 360,4±0,3 0,813±0,03 62,92±0,01 0,58±0,02

G 518,4±0,4 <LQ 32,96±0,02 0,48±0,02

H 365,6±0,4 <LQ 11,81±0,01 0,37±0,01

I 6,6±0,1 <LQ <LQ <LQ

LQ, ver Tabela 3.3. *vide Figura 2.7, Capítulo 2.

É interessante notar que a presença dos metais não foi constante para todos

os spots, ou seja, não houve indicação de presença de metais no spot B e nos A e I,

detectou-se apenas o Ca. Por outro lado, determinou-se Cr apenas nos spots D e F,

sendo estes também responsáveis por 74% do Fe e 81,9% do Mn totais

determinados. O Ca foi distribuído principalmente nos spots C, D, F, G e H,

representando 97% do total determinado.

Apesar dos resultados da Tabela 3.5 fornecer as quantidades de cada metal

nas massas de proteínas estimadas nos spots, eles por si só, não trazem muita

informação, uma vez que não se sabe ao certo de quais proteínas se tratam. Então,


110

se observarmos esses resultados sob o ponto de vista molecular, ou seja,

convertendo as massas de proteínas (conhecendo-se suas massas molares e que 1

kDa = 1,661 x 10-24 g) para número de mols de moléculas de proteínas, e convertendo

as massas de metais (Tabela 3.5) para número de mols de átomos, teremos uma

idéia de quantos átomos de metal estariam presentes em cada molécula. Esta

estimativa foi originalmente proposta por Garcia [21] e, no Apêndice 5, é apresentado

um exemplo destes cálculos:

Dessa forma, seguindo o raciocínio desenvolvido acima (exemplificado no

Apêndice 5), são apresentados na Tabela 3.6 os números de moléculas e os números

de átomos de cada metal.

Tabela 3.6: Estimativa dos números de moléculas de proteínas e números de átomos de cada metal em cada spot.

Spot nº de moléculas nº de átomos proteínas(1015) Ca (1015) Cr (1013) Fe (1014) Mn (1013)

A 3,30 1,36 (41,2%)*

___ ___ ___

B 4,39 ___ ___ ___ ___

C 5,13 9,59 (187%)*

___ 2,20 (4,29%)*

0,37 (0,07%)*

D 7,49 18,9 (252,3%)*

18,23 (2,4%)*

13,25 (17,7%)*

5,26 (0,7%)*

F 2,35 5,41 (230,2%)*

0,94 (0,4%)*

6,79 (28,9%)*

0,64 (0,27%)*

G 1,64 7,79 (475%)*

___ 3,55 (21,6%)*

0,53 (0,32%)*

H 1,79 5,49 (306,7%)*

___ 1,27 (7,1%)*

0,41 (0,23%)*

I 1,06 0,09 (8,5%)*

___ ___ ___

Massas Atômicas: Ca = 40,078 g; Cr = 51,996 g; Fe = 55,845 g e Mn = 54,938 g. * Os valores entre parênteses são as porcentagens de moléculas de proteínas com átomos da espécie metálica em sua estrutura.


111

Destes resultados pode-se ter uma idéia da proporção metal/molécula. Por

exemplo, para a proteína do spot A estimou-se que 41,2% das moléculas contenham

um átomo de Ca. Já para a proteína do spot C estima-se que cada molécula de

proteína tenha 1,87 átomos de Ca. Estes valores são estimados, e, certamente não

haverá 1,87 átomos de Ca, mas sim de 1 a 2 átomos de Ca em cada molécula de

proteína. Seguindo o mesmo raciocínio, as proteínas dos spots D, F e H podem

possuir de 2 a 3 átomos de Ca em cada molécula de proteína e as proteínas do spot

G podem possuir de 4 a 5 átomos de Ca em cada molécula.

Para as outras espécies metálicas as proporções são mais baixas, porém não

menos significativas. Por exemplo, para a proteína do spot D: 2,4%, 17,7% e 0,7%

das moléculas de proteínas (um total de 1,55 x 1015 moléculas) podem conter pelo

menos um átomo de Cr, Fe e Mn nas suas estruturas, respectivamente. Estas

estimativas são aceitáveis, uma vez que uma única metaloproteína ou proteína de

metal ligante pode apresentar vários centros ativos formados por átomos de íons

metálicos diferentes, ou ainda, mais de um átomo de um mesmo elemento químico

[22]. Por exemplo, para a Fe-superóxido dismutase purificada de tomate

(Lycopersicon esculentum) ou mostarda (Brassica campestris) a proporção de mol de

Fe/mol de enzima é de 1 – 2 [23], ou seja, próximo da proporção encontrada.

5. CONCLUSÃO PARCIAL

Neste Capítulo foi realizado um estudo sobre a influência dos procedimentos

de extração de proteínas na especiação de metaloproteínas na amostra castanha da

Índia. Embora o procedimento 9 (onde foram usados o tampão Tris-HCl, maceração e

sonicação) apresente uma alta eficiência em termos de extração de proteínas totais,

ele foi o menos eficiente em termos de preservação da ligação metal-proteína, não

sendo, portanto, recomendado para o estudo de metaloproteínas. Assim, os

procedimentos mais amenos (como 4 ou 5) produziram resultados mais apropriados,

no sentido de preservação da estrutura metal-proteína, assegurando resultados mais

confiáveis em termos de análise quantitativa de metaloproteínas.


112

Foram identificados íons Ca, Fe, Cr e Mn nas bandas protéicas SDS-PAGE,

por meio da técnica SRXRF. A quantificação desses metais por AAS, tanto nas

bandas SDS-PAGE, quanto nas da separação 2D-PAGE, mostrou a concordância

entre a identificação e a quantificação destas espécies. As quantificações de metais

nos spots 2D-PAGE forneceram uma interessante distribuição não homogênea

dessas espécies, ressaltando-se que foi identificado e quantificado Cr apenas em dois

spots (D e F), os quais também são responsáveis por 74% do Fe e 81,9% do Mn

encontrados. Foi possível fazer uma estimativa da quantidade de átomos de metal por

moléculas de proteína e verificou-se que todas as proteínas dos spots estudados,

com exceção da proteína do spot B, têm proporções átomo de metal/molécula de

proteína significativas, indicando que se trata de metaloproteínas ou proteínas de

metal ligante.


[1] Gao, Y. X., Chen, C. Y., Zhao, J. J., Zhang, P. Q., Chai, Z. F., He, W. e Huang, Y. Y., An improved method for analysis of distribution of metalloproteins in human liver cytosol by synchrotron radiation X-ray fluorescence, Chinese Journal of Analytical Chemistry, 31(2003)395. [2] Banci, L., Molecular dynamics simulations of metalloproteins, Current Opinion in Chemical Biology, 7(2003)143. [3] Kennedy, L. M. e Gibney, B. R., Metalloprotein and redox protein design, Current Opinion in Structural Biology, 11(2001)485. [4] Liu, C. e Xu, H., The metal site as a template for the metalloprotein structure formation, Journal of Inorganic Biochemistry, 88(2002)77. [5] Szpunar, J., Bio-inorganic speciation analysis by hyphenated techniques, Analyst, 125(2000)963. [6] Herald, V. L., Heazlewood, J.L., Day, D. A. e Millar, A. H., Proteomic identification of divalent metal cation binding proteins in plant mitochondria, FEBS Letters, 537(2003)96.


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[7] de la Calle Guntiñas, M. B., Bordin, G. e Rodriguez, A. R., Study of the feasibility of using a pellicular anion-exchange column for separation of transferrin isoforms in human serum by HPLC with UV detection, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 374(2002)369. [8] Hay, R. W., Bio-Inorganic Chemistry, 2nd ed., Ellis Horwood Limited, John Wiley & Sons, West Sussex, England, 1987, p.211. [9] Butcher, H., Kennette, W., Collins, O., Demoor, J. e Koropatnick, J., A sensitive time-resolved fluorescent immunoassay for metallothionein protein, Journal of Immunological Methods, 272(2003)247. [10] van Langeveld, F. e Vis, R. D., Trace-element determinations using a 15-kev synchrotron x-ray microprobe, Analytical Chemistry, 63(1991)2253. [11] Gao, Y., Chen, C., Chai, Z., Zhao, J., Liu, J., Zhang, P., He, W. e Huang, Y., Detection of metalloproteins in human liver cytosol by synchrotron radiation X-ray fluorescence combined with gel filtration chromatography and isoelectric focusing separation, Analyst, 127(2002)1700. [12] Gao, Y., Chen, C., Zhang, P., Chai, Z., He, W. e Huang, Y., Detection of metalloproteins in human liver cytosol by synchrotron radiation X-ray fluorescence after sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, Analytica Chimica Acta, 485(2003)131. [13] Weseloh, G.,Kühbacher, M., Bertelsmann, H., Özaslan, M., Kyriakopoulos, A., Knöchel, A. e Behne, D., Analysis of metal-containing proteins by gel electrophoresis and synchrotron radiation X-ray fluorescence, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 259(2004)473. [14] Behne, D., Kyriakopoulos, A., Kalcklösch, M., Weiss-Nowakp, C., Feiffer, H., Gessner, H. e Hammel, C., Biomedical and Environmental Sciences, 10(1997)340. [15] Whitemartins, disponível no site http://www.whitemartins.com.br/site/pda/pda_WM036120.jsp, acessado em 24 de agosto de 2006. [16] Verbi, F. M., Arruda, S. C. C., Rodriguez, A. P. M., Pérez, C. A. e Arruda, M. A. Z., Metal-binding proteins scanning and determination by combining gel electrophoresis, synchrotron radiation X-ray fluorescence and atomic spectrometry, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 62(2005)97. [17] Banco de dados de proteínas, disponível no site http://www.expasy.org/uniprot/P01012, acessado em 08 de agosto de 2006.


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[18] Perkin-Elmer, Analytical Methods for Atomic Absorption Spectrometry, 1994, The Perkin-Elmer Corp. (EUA). [19] Hall, J. L. e Williams, L. E., Transition metal transporters in plants, Journal of Experimental Botany, 54(2003)2601. [20] Bagnoli, F., Capuana, M., Racchi, M. L., Developmental changes of catalase and superoxide dismutase isoenzymes in zygotic and somatic embryos of horse chestnut, Australian Journal of Plant Physiology, 25(1998)909. [21] Garcia, J. S., Tese de doutorado intitulada: Avaliação do desenvolvimento de girassol por meio de análise de proteínas e metaloproteínas, defendida no Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, sob orientação do Prof. Dr Marco Aurélio Zezzi Arruda, em setembro de 2006. [22] Wind, M. e Lehamann, W. D., Element and molecular mass spectrometry – an emerging analytical team in the life sciences, Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 19(2004)20. [23] Halliwell, B. e Gutteridge, J. M. C., Free Radicals in Biology and Medicine, 3a. ed., Oxford, University Press, New York, 1999, p.114.

Tese de Doutorado Conclusões Finais e Perspectivas Cristiana S. de Magalhães

115

CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS

Este trabalho de Tese apresenta a importância das diferenças no preparo de

amostras de proteínas e análise de metaloproteínas, tanto dos procedimentos de

extração como dos meios extratores, que são importantes para preservar as espécies

nas estruturas das proteínas. No caso das plantas medicinais e fitoterápicos, os

diferentes procedimentos de preparo foram decisivos na extração de proteínas.

A partir deste trabalho fica evidente a necessidade de várias técnicas

multidisciplinares para a caracterização de um sistema complexo, como são,

geralmente, os sistemas biológicos. A castanha da Índia se apresentou como um

ótimo material de estudo, por sua manipulação fácil e seu mapa protéico bastante

simples. Como perspectivas, poder-se-iam sugerir outros procedimentos de extração,

tanto físicos, como a moagem criogênica ou a decomposição por radiação

microondas ou a combinação destes com outros procedimentos, quanto químicos,

como vários outros protocolos de extração ou meios extratores. Também se poderia

continuar a investigação do proteoma da castanha da Índia, com o aumento da

resolução da separação eletroforética (por exemplo, escolhendo-se intervalos de

valores de pI menores) o que nos daria uma informação mais precisa das bandas

protéicas. Uma perspectiva muito interessante seria a identificação das proteínas,

fazendo-se a busca por homologia nos bancos de dados, ou até utilizando-se outras

digestões enzimáticas e fazendo-se o matching para o sequenciamento das proteínas

estudadas. Outra possibilidade seria de se estimular a germinação da castanha da

Índia e estudar as modificações dos panoramas protéicos conforme o

desenvolvimento da germinação, o que se tornaria um desafiador problema de

bioanalítica.

Tese de Doutorado Apêndice 1 Cristiana S. de Magalhães

117

Apêndice 1


119

Apêndice 2:


121

Apêndice 3:


123

Apêndice 4:

Espectros de massas (MS) gerados para os spots protéicos A a Q: Spot A – 1

Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0099

869.47171349.7225

870.4717

1229.64831033.5853

1708.87151613.9279

1483.7258 1952.0316

1711.8284

2001.0205

2015.0414

2017.01073258.4543

2057.0803 2351.26033257.5500

2379.29153260.4104

Spot A - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

869.47171349.7091

1060.0670870.4609

976.46061229.6483

1061.0754

1709.86191613.9279

1482.70371951.0220

1711.8589

2001.0371

2016.0012

2017.0271

3258.55932057.0471 2248.1628

3257.50762352.2788 3260.4734

Spot B - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

857.53781349.7225

1229.64831033.59701115.5988

1613.9279

1351.7271

1667.98461951.0383

1711.9045

2001.0205

2002.0264

2017.01073258.5383

2351.24222018.03702248.1975

3257.4446

2352.27883097.5190

3260.5154

Spot B - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

857.53781349.7225

869.4717

1229.64831033.5853

1350.72471613.9427

1351.72711666.9763

1951.0220

1711.8740

2001.0371

2016.0178

2017.02713258.5383

2334.15412248.17992018.0204 3257.5500

2352.29693241.50443098.5242

3261.5042


124

Spot C - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

857.5378

1349.7225869.4717

1229.6483870.47171033.5853

1708.87151350.7111

1666.9763

1482.71791710.8679

1952.01531711.85891712.8502

2001.0371

2016.0342

3258.51732334.15412017.0271

2248.17992018.02043257.55002350.1882

2352.1895 3138.5020

3260.4944

3261.4832

Spot C - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

857.5378

1349.7225869.4717

1229.6354870.4717976.4606

1034.5927

1708.87151350.7247

1667.96951710.8679

1711.8740

2001.0371

2016.0342

2334.17212017.0603

2248.19752018.0370

3259.52663257.50762350.1882

3139.53372353.1907

3260.5154

3261.4832

Spot D - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

1349.7225

857.5378

1229.64831033.5970

1350.7247

1505.8395

1352.7163

1666.9763

1952.0153

1711.8435

2001.0371

2002.04273258.5173

3257.50762017.04372334.2078

2057.04712138.0952 2350.2595 3098.5447

3260.53643261.5042

3262.5354

Spot D - 2 Zezzi4_160108

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%

0

100


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125

Spot E - 1 Zezzi4_160108

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%

0

100


1999.0262

1349.7225

857.5378

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1350.7247

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2001.0371

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3261.52563262.4934

Spot E - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

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100


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1708.8715

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2001.0371

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Spot F - 1 Zezzi4_160108

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%

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100


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869.4717

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1999.0428

1350.7382

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1708.8868

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1711.8894

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Spot F - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

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100


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2001.0371

2016.0178

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126

Spot G - 1 Zezzi4_160108

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100


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3274.5415

Spot G - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

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100


1999.0428

1349.7225

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Spot H - 1 Zezzi4_160108

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1999.0428

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Spot H - 2 Zezzi4_160108

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%

0

100


1999.0428

1349.7362

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1350.7382

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1352.7300

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127

Spot I - 1 Zezzi4_160108

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Spot I - 2 Zezzi4_160108

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3273.5508

Spot J - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

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Spot J - 2 Zezzi4_160108

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100


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3432.5330


128

Spot K - 1 Zezzi4_160108

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%

0

100

Zezzi4_160108_Am21 2 (0.508) Sm (SG, 2x4.00); Cm (1:2) 1: TOF MS LD+ 2632000.04801349.7362

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1999.0428

1350.7382

1505.8395

1352.7300

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3262.5354

Spot K - 2 Zezzi4_160108

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%

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100


1999.0592

1349.7496

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3259.5691

3260.5574 3434.6484

3261.5676

Spot L - 1 Zezzi4_160108

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%

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100


1999.0428

1349.7362

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1351.7542

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1710.9136

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3098.5447

3259.5476

3260.5789 3434.6484

3261.5042

Spot L - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

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2378.3391

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129

Spot M - 1 Zezzi4_160108

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%

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100


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1349.7362

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1351.7136

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Spot M - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0262

855.0790

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1709.9076

1710.8831

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2016.0508

2017.0603

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Spot N - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


869.4826

877.0623 1033.62071332.7166

2000.06461999.0592

1350.7382

1505.8539

1351.7542

1352.7163

1649.89671650.8998

1951.0547

1709.9227

1806.9985

2001.0701

2016.0508

2379.32762017.07692378.3391

2018.07022247.2017

2019.0304

3258.53832380.3523

3256.58282381.3232

3137.55222702.2837 2809.4473

3259.5476

3260.5999 3433.5691

Spot N - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1349.7496

869.4826

1033.5970 1331.7346

1999.0592

1350.7516

1505.8680

1351.7542

1352.7300

1649.8967

1708.9171

1709.9076

1808.0013

2001.0535

2016.0674

2379.34522017.0603

2378.37482018.0370

2247.18412019.0637

3258.62232380.35233256.54082381.3413

2382.3123 3138.58452703.2991 2808.3733

3259.6111

3260.5789 3434.6699


130

Spot O - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


869.4826

1033.6090 1331.72121034.6163

2000.06461999.05921350.7516

1649.89671505.8539

1351.7542

1352.7434

1951.07081651.9032

1708.91711709.9227

2001.0535

2016.06742379.3452

2017.0603 2378.3210

2248.17992018.0536

3258.62232380.3342

3256.56182381.3594

2702.32182382.3123 3138.58452808.3733

3259.5476

3260.5574 3434.69143432.7053

Spot O - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1349.7496

869.4826

976.47201033.6090 1331.7212

1999.0592

1350.7516

1650.91491505.8539

1351.7542

1352.7300

1952.04771651.9181

1709.9076

2001.0701

2379.36332016.0508

2378.35672017.0769

2274.22172018.0865

2137.1238

2380.37043257.5710

3256.56182381.3232

2702.28372382.3665 3240.58152809.4277 3096.5962

3259.5901

3260.6208 3434.6699

3432.5974

Spot P - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


869.4935

1033.6090 1320.6758

1116.5961

1999.0592

1350.7516

1587.90191505.8680

1351.7542

1352.7300

1649.8967

1951.0547

1708.88681709.8925

2001.0701

2016.0674

2379.36332017.0769

2378.3210

2018.05362248.1799

2019.0801

3257.57102380.3523

3256.58282381.3594

2382.3665 2702.3408 2808.37333137.5317

3259.6531

3433.6770

Spot P - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


869.4826

1033.6090 1331.72121034.6044

2000.0646

1999.05921350.7516

1587.88711505.8539

1351.7542

1352.7571

1649.9116

1952.0477

1709.9076

1808.0013

2001.0701

2016.0840

2379.34522017.07692378.35672018.0536

2248.19752019.0637

3257.57102380.35233256.60382381.3594

2808.41242702.30272382.3484 3139.6162

3259.52663434.6050

3433.5691


131

Spot Q - 1 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1349.7496

869.4826 1033.62071331.7346

1115.5988

1350.7516

1505.8680

1351.7678

1488.8264

1649.8816 1952.0641

1708.8715

1806.9985

2001.0701

2379.34522016.0674

2378.3391

2017.0769

2018.02042248.1799

2019.0967

2380.35233258.6013

2381.3413 3256.5618

2382.40213138.60502702.3027

3259.5476

3260.5154 3433.59063272.6021

Spot Q - 2 Zezzi4_160108

m/z800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

%

0

100


1999.0592

1349.7496

869.48261033.6090 1331.7212

1115.6110

1350.7516

1505.8539

1351.7542 1649.89671952.0477

1709.9076

2001.0701

2016.0674

2379.3633

2378.35672017.0603

2018.07022274.2217

2239.1899

3257.57102380.3523

3256.54082381.3594

2382.3665 3124.58452702.3794

3259.56913260.6418 3433.6770

3261.6096


133

Apêndice 5:

Exemplo do cálculo para a estimativa do número de mols de íons Fe por número de

mols de moléculas de proteínas para o spot D.

Para o spot D e o Fe:

1) Determinação da massa da molécula de proteína:

1 Da = 1,661 x 10 -24 g

23500 Da = X g

X = 3,90 x 10-20 g

2) Determinação do número de moléculas de proteína no spot

1 molécula = 3,90 x 10-20 g

X moléculas = 292,6x10-6 g

X = 7,50x1015 moléculas

3) Determinação do número de átomos da espécie metálica (Fe)

55,845 g = 6,022x1023 átomos

122892x10-12 g = X átomos

X = 1,33x1015 átomos

4) Porcentagem de moléculas de proteínas com átomos da espécie metálica em

sua estrutura

7,50x1015 moléculas = 100%

1,33x1015 átomos = X %

X = 17,73%

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AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE PROCEDIMENTOS DE …biq.iqm.unicamp.br/arquivos/teses/000435914.pdf · Orientada: Cristiana Schmidt de Magalhães Orientador: ... meu muito obrigado. Aos