Avaliação de alterações da matriz extracelular em cultura de células após laserterapia

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DE SÃO PAULO

MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA

AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES DA MATRIZ

EXTRACELULAR EM CULTURA DE CÉLULAS APÓS

LASERTERAPIA

SÃO PAULO

2013

MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA

AVALIAÇÃO DE ALTERAÇÕES DA MATRIZ

EXTRACELULAR EM CULTURA DE CÉLULAS APÓS

LASERTERAPIA

SÃO PAULO

2013

Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica, Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientador: Profa. Dra. Maria Aparecida da Silva Pinhal

Almeida, Maria Carolina Leal Avaliação de alterações da matriz extracelular em cultura de células após Laserterapia / Maria Carolina Leal Almeida - São Paulo, 2013. – 68 f. Dissertação de Mestrado – Universidade Federal de São Paulo. Campus São Paulo. Programa de Pós graduação em Ciências Biológicas (Biologia Molecular). Orientador: Maria Aparecida da Silva Pinhal 1. Laserterapia 2. Matriz extracelular 3. Glicosaminoglicanos

Aos meus pais, Vitor e Telma por sempre

apoiarem e respeitarem as minhas escolhas,

mesmo diante das dificuldades, sempre

servindo de exemplo e inspiração para que eu

pudesse me tornar alguém melhor e que

lutasse pelos meus sonhos. Amo vocês!!!

A toda minha família, em especial a

minha madrinha Maria, minha avó

Hilda, minha irmã Ana, minha

sobrinha Isadora e meu primo

Vinicius, pelos momentos de alegria,

descontração, carinho, amizade,

preocupação e paciência. Amo vocês!!!

E por fim e não menos importante dedico

este trabalho a Professora Cida, pelo

exemplo de paixão e dedicação à

pesquisa, pela honestidade, ética e

sinceridade.

Obrigada pelo voto de confiança,

amizade, conselhos, puxões de orelha e

por toda a atenção dispensada para que

este projeto fosse realizado.

Muito obrigada!!!!

AGRADECIMENTOS

Vamos lá no decorrer desses quatro anos de faculdade conheci muita gente boa, pessoas que

indiretamente ou diretamente fizerem parte dessa história:

Ao nosso grupo de trabalho orientado pela professora Cida, Teka, Juan, Dr. Leandro, Dr.

Luciano, Cintia, Eloah, Carina e Bethania, não tenho palavras para descrever o quanto sou

grata por ter conhecido vocês e pelo convívio diário no laboratório, regado de muitas risadas

e conversas, possibilitando uma experiência única, Obrigada!!!

As amigas Eliete, Risa, Thama, Teka, Carina, Bethania, Tati, Eloah, e a Maria Alice por

sempre estarem comigo nos momentos bons, mas principalmente nos momentos difíceis,

quando minha vontade era desistir.

Aos professores do departamento, profa. Giselle Zenker Justo por me ceder às células

HaCaT, prof. Hugo Pequeno Monteiro por ceder às células A431, prof. João Roberto Martins

por ceder as enzimas condroitinases AC e ABC, prof. Ivarne Tersariol, profa. Yara Michellaci

e profa. Leny Toma.

Aos meus colegas da bio mol do Laboratório da Faculdade de Medicina do ABC e da Unifesp

à galera do quinto andar em especial à Tatiana (Tati), sempre com seus conselhos sábios,

aos técnicos do laboratório pela ajuda prestada, a todos que direta ou indiretamente

contribuíram para a realização deste trabalho e pela convivência diária, pelas pipocas,

lanchinhos da tarde, festas de aniversários e risadas e lágrimas!

Aos meus colegas de plantão que eu adotei como parte da minha família Sandra, Beth, Maria

Alice (mais uma vez), ao pessoal da enfermagem. Muito obrigada por fazerem parte de mais

2 anos da minha vida!!!

A Lilian pela amizade, pela paciência e por toda a ajuda que você me deu, me ensinando a

cultivar células e por fazer praticamente todos os experimentos deste projeto comigo! Muito

obrigada!

Aos meus amigos da Gakkai pelo apoio, pelas palavras de incentivo e por entenderem a

minha dificuldade de participar das atividades.

Á Profa. Dra. Helena Nader pela oportunidade de fazer parte da equipe de biologia

molecular.

À Universidade Federal de São Paulo e Faculdade de Medicina do ABC.

Agradeço o apoio das agências de fomento que possibilitou o desenvolvimento deste

trabalho, CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CAPES –

Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela bolsa de mestrado,

FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa de Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro

concedido ao laboratório na forma de Auxílios à Pesquisa.

Muitíssimo obrigada a todos,

Carol

“A causa da derrota não se encontra no obstáculo ou no rigor das circunstâncias;

está no retrocesso na determinação e na desistência da própria pessoa. Se falasse

em dificuldades, tudo realmente era difícil. Se falasse em impossibilidades, tudo

realmente era impossível. Quando o ser humano regride em sua decisão os

problemas que se erguem em sua frente acabam parecendo maiores e confundem-

no como uma realidade imutável. A derrota encontra-se exatamente nisso...

Somente o conhecimento não é suficiente. Somente quando o conhecimento alia-se

a sabedoria é que uma pessoa pode atingir a vitória na vida.“

Daisaku Ikeda

Resumo

A pele corresponde ao órgão de maior exposição a radiação por diferentes tipos de luz.

Alguns estudos demonstram o efeito de terapias de luz laser de baixa intensidade em

determinadas afecções da pele como manchas, processos inflamatórios e em diferentes

tipos de tumores. O laser de baixa potência tem sido utilizado na prática clínica há

aproximadamente 20 anos. A laserterapia quando utilizada em tecidos e células provoca

efeitos fotoquímicos, fotofísicos e/ou fotobiológicos, sem a produção de calor, estimulando a

proliferação celular, ativação de linfócitos e mastócitos, promove aumento na geração ATP

entre outros efeitos. Poucos artigos relacionam a laserterapia com as alterações de

componentes da matriz extracelular em cultura celulares. Portanto, o presente estudo tem

por objetivo investigar as possíveis alterações de componentes da matriz extracelular em

células HaCaT (queratinócitos humanos) e A431 (carcinoma epidermóide humano), que

representam dois tipos distintos de linhagens celulares da pele. Dentre os componentes da

matriz extracelular foram analisados glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), ácido

hialurônico, enzimas que participam da degradação de heparam sulfato (heparanase) e

enzimas envolvidas na degradação e biossíntese de ácido hialurônico (hialuronidases e

ácido hialurônico sintases), respectivamente. As alterações dos componentes da matriz

extracelular foram avaliados comparando-se células submetidas ao tratamento com

laserterapia de baixa potência e células não tratadas (controle). A viabilidade celular de

células HaCaT e A431 também foi avaliada. Os GAG sulfatados foram analisados por

marcação metabólica utilizando sulfato radioativo, degradação enzimática e eletroforese. O

ácido hialurônico foi quantificado por método de ELISA indireto. Ensaios de PCR em tempo

real foram realizados para análise da expressão das enzimas HAS (ácido hialurônico

sintases) HYAL (Hialuronidases) e HPSE-1 (Heparanase). Os resultados obtidos no

demonstraram diminuição significativa na viabilidade celular em ambas as linhagens (HaCaT

e A431), após laserterapia. Houve alteração no perfil de GAG após tratamento com luz no

comprimento de onda associado (470 e 660 nm), sendo que as células HaCaT

apresentaram aumento significativo de heparam sulfato e condroitim sulfato. O ácido

hialurônico aumentou na fração celular, após laserterapia em células HaCaT, enquanto, não

foi observado alteração nas células A431. A analise por qPCR demonstrou diminuição da

expressão em células HaCaT e das células A431. Os resultados obtidos em nosso estudo

demonstraram que o tratamento com laserterapia de baixa intensidade altera componentes

da matriz extracelular e tais alterações diferem com relação ao tipo celular (células não

neoplásicas ou células de carcinoma epidermóide humano), e o comprimento de onda

utilizado.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

A431 – Linhagem estabelecida de carcinoma epidermóide humano

AH – Ácido hialurônico

ATP – Adenosina Trifosfato

AU - Ácido Urônico

BSA – Albumina sérica bovina

C - Carbono

CBC – Carcinoma basocelular

CEC – Carcinoma espinocelular

CO2 - Gás Carbônico

CS – Condroitim sulfato

Da – Dalton

DMEM – Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DMSO - dimetilsulfóxido

DS - Dermatam sulfato

EBSS – Solução salina balanceada de Earl sem cálcio e sem magnésio

EGF – Fator de crescimento epidérmico

F-12 – Meio de cultura contendo mistura de nutrientes com L-glutamina e sem

bicarbonato de sódio

FGF – Fator de crescimento de fibroblastos

FGF-2 - Fator de crescimento básico de fibroblastos

FGF-7 - Fator de crescimento de queratinócitos

GAG – Glicosaminoglicano

Gal – Galactose

GlcNac:N-acetilglucosamina

GlcUA: ácido glucurônico

GPI - glicosilfosfatidilinositol

GTP - guanosina trifosfato

HaCaT – Linhagem estabelecida de queratinócitos humano

HAS - Ácido Hialurônico Sintase

HCl – Ácido Clorídrico

HEP – Heparina

HPSE - Heparanase

HS – Heparam sulfato

Hx – Hexosamina

HYAL - Hialuronidase

J - Joule

KDa – Kilodalton

KS – Queratam sulfato

LASER – Amplificação da luz por emissão estimulada de radiação

MEC - Matriz Extracelular

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NaCl – Cloreto de sódio

nm – Nanômetro

PBS – Tampão Fosfato-Salino

PCR - polymerase chain reaction

PDA – 1,3-Diaminopropano-acetato

PDT – Terapia Fotodinâmica

PG - Proteoglicanos

PGHS – Proteoglicanos de heparam sulfato

PGKS – Proteoglicanos de queratam sulfato

RNA – Ácido ribonucléico

ROS – Espécies reativas de oxigênio

RT-PCR - reverse transcriptase polymerase chain reaction

SFB – Soro Fetal Bovino

TGF-β - Fator de Crescimento Transformante Beta

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 1

1.1. LASERTERAPIA OU TERAPIA COM LUZ LASER DE BAIXA INTENSIDADE .............................................. 1

1.1.1. Efeitos da laserterapia nos tecidos biológicos ....................................................................... 2

1.2. PELE .................................................................................................................................................. 4

1.3. MATRIZ EXTRACELULAR .................................................................................................................... 8

1.3.1. Proteoglicanos ............................................................................................................................ 8

1.4. GLICOSAMINOGLICANOS.................................................................................................................... 9

1.4.1. Ácido Hialurônico ...................................................................................................................... 10

1.4.2. Condroitim Sulfato, Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato .............................................. 13

1.4.3. Heparam Sulfato ....................................................................................................................... 14

2. OBJETIVOS .........................................................................................................................................17

3. MATERIAIS ..........................................................................................................................................18

3.1. LINHAGEM CELULAR ........................................................................................................................ 18

3.2. CULTURA DE CÉLULAS ..................................................................................................................... 18

3.3. ENZIMAS .......................................................................................................................................... 18

3.4. LÍQUIDO DE CINTILAÇÃO .................................................................................................................. 19

3.5. RADIOISÓTOPO ................................................................................................................................ 19

3.6. REAGENTES GERAIS E OUTROS MATERIAIS .................................................................................... 19

3.7. EQUIPAMENTOS ............................................................................................................................... 20

4. MÉTODOS ............................................................................................................................................22

4.1. CULTURA DE CÉLULAS ..................................................................................................................... 22

4.1.1. Descongelamento de células .................................................................................................. 22

4.1.2. Manutenção das células .......................................................................................................... 22

4.1.3. Subcultivo das células ............................................................................................................. 22

4.1.4. Contagem das células em Câmara de Neubauer ............................................................... 23

4.2. TRATAMENTO DA CULTURA DE CÉLULA COM RADIAÇÃO A LASER ................................................... 23

4.3. QUANTIFICAÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS SINTETIZADOS POR CÉLULAS. ........... 25

4.3.1. Marcação metabólica ............................................................................................................... 25

4.3.2. Extração de GAG marcados metabolicamente .................................................................... 25

4.3.3. Eletroforese em gel de agarose com tampão PDA ............................................................. 26

4.3.4. Análise e quantificação dos GAG marcados metabolicamente ........................................ 26

4.3.5. Dosagem de proteínas por método de Coomassie Blue .................................................... 27

4.4. DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA .............................................................................................................. 27

4.5. ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR ................................................................................................... 28

4.6. DOSAGEM DE ÁCIDO HIALURÔNICO ................................................................................................. 28

4.7. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL ............................................................................................................. 30

4.7.1. QUANTIFICAÇÃO DO RNA TOTAL .................................................................................................... 31

4.7.2. OBTENÇÃO CDNA A PARTIR DO RNA TOTAL ................................................................................. 31

4.8. ANÁLISE DA EXPRESSÃO POR PCR EM TEMPO REAL (QPCR) ....................................................... 31

4.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................................................... 32

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..........................................................................................................33

5.1. VIABILIDADE CELULAR EM CÉLULAS HACAT E A431 ............................................................................... 33

5.4. DOSAGEM DE ÁCIDO HIALURÔNICO ................................................................................................ 42

5.5. EXPRESSÃO GÊNICA POR PCR EM TEMPO REAL DAS ENZIMAS DE BIOSSÍNTESE E DEGRADAÇÃO

DO ÁCIDO HIALURÔNICO ............................................................................................................................... 44

ÍNDICE

6. CONCLUSÕES ....................................................................................................................................47

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................................48

ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Esquema que ilustra o poder de penetração dos diferentes tipos de luz em função do

comprimento de onda ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3

Figura 2: Espectro de absorção dos cromóforos da pele. ----------------------------------------------------------- 4

Figura 3. Representação esquemática das camadas estruturais da pele ----------------------------------- 5

Figura 4: Processo de diferenciação de queratinócitos -------------------------------------------------------------- 6 Figura 5. Sitio de clivagem da heparanase e mecanismos de ação dos oligossacarídeos

gerados na MEC ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------15 Figura 6. Representação esquemática do ensaio fluorimétrico para quantificação de ácido

hialurônico --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------30

Figura 8. Perfil de GAG sulfados sintetizados por HaCaT e A431 ----------------------------------------------36

Figura 11. Expressão relativa de Heparanse-1 (HPSE-1). -----------------------------------------------------------41

Figura 12. Quantificação de Ácido Hialurônico --------------------------------------------------------------------------43 Figura 13. Expressão relativa de Ácido Hialurônico Sintases (HAS1-3) e Hialuronidases

(HYAL1-2) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------45

ÍNDICE

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Proteoglicanos presentes no tecido epitelial. ......................................................................10

Tabela 2. Características estruturais dos glicosaminoglicanos ........................................................11

Tabela 3. Parâmetros de Irradiação .........................................................................................................24

Tabela 4. Sequências de Oligonucleotídeos iniciadores ....................................................................32

INTRODUÇÃO

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Laserterapia ou Terapia com luz laser de baixa intensidade

A laserterapia de baixa potência é investigada e utilizada na prática clínica há

aproximadamente 20 anos, Theodore H. Maiman construiu o primeiro emissor de

laser de rubi em 1960 e, em 1965, Sinclair e Knoll adaptaram esta radiação à prática

terapêutica. Um dos pioneiros na aplicação do laser de baixa intensidade nas áreas

biomédicas foi Endre Mester no início da década de 70, na Europa (FUKUDA T Y,

2008; LIN et al., 2010; MESTER; TOTA, 1967).

A palavra laser advém da abreviação de seu próprio significado (Light

Amplification by Stimulated Emisson of Radiation), ou seja, amplificação da luz por

emissão estimulada de radiação. Assim definimos laser como onda eletromagnética

não ionizante com características especiais (KARU, 1987; LIN et al., 2010; TANZI;

LUPTON; ALSTER, 2003). As características especiais do laser diferenciam

totalmente da luz natural e é definida como luz coerente, monocromática e paralela

(TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003).

Os lasers são classificados em duas famílias, conforme sua potência e

capacidade de interação com os tecidos. O tratamento com laser de baixa

intensidade de energia (LILT ou Low Intensity Level Treatment) causa efeitos como

bioestimulação, analgesia, apresentam ação anti-inflamatória e podem diminuir o

edema. Por outro lado, o tratamento com laser de alta intensidade de energia (HILT,

Hight Intensity Laser Treatment) pode causar desnaturação de proteínas, são

utilizados para acelerar processos de coagulação sanguínea e causam vaporização

devido à produção de calor. Portanto, a literatura sugere que lasers de baixa

intensidade de energia são estimulatórios, enquanto os de alta intensidade de

energia possuem efeito inibitório e grande parte de sua utilização são para fins

terapêuticos (HARRIS, 1988; LIN et al., 2010).

Outro fator importante diz respeito aos conceitos físicos de irradiância, fluência

e energia depositada, pois como pode ser verificadas em diversos estudos as doses

utilizadas no tratamento deve levar em consideração estas propriedades físicas a fim

de padronizar e obter resultados satisfatórios do tratamento, visto que, a irradiância

influência no efeito biológico. Defini-se Irradiância como sinônimo de densidade de

INTRODUÇÃO

2

potência (DP) e esta define a potência óptica útil do laser e expressa em watts (W),

dividida pela área irradiada, expressa em centímetros quadrado (cm2). Então temos:

Irradiância = potência óptica laser (W) / Área irradiada (cm2). Enquanto a fluência

define a taxa de energia aplicada no tecido biológico, é expressa por: Irradiância (W

/ cm2) x tempo de exposição = densidade de energia (fluência) ou dose de energia

(DE) expressa em joule (J / cm2). Estes dados refletem de forma direta o efeito da

irradiação em tecidos biológicos, pois a irradiância vai determinar se há dano térmico

ou não. (LOPES, [S.d.]).

1.1.1. Efeitos da laserterapia nos tecidos biológicos

Há um crescente interesse tem sido demonstrado na utilização do laser.

Entretanto, ainda existe muita divergência com relação aos resultados obtidos de

diferentes estudos que descrevem os efeitos da utilização do laser. Os dispositivos

da bioestimulação estão sendo usados sem o conhecimento suficiente dos

mecanismos de ação do tipo de luz em cada tecido. Ainda, existe também

deficiência nos métodos de padronização para utilização da laserterapia, como por

exemplo intensidade da luz, tempo de aplicação e distância. Existem inúmeros

relatos sobre a eficácia da laserterapia no efeito analgésico, antiinflamatório e de

regeneração tecidual (HARRIS, 1988; LIN et al., 2010; TANZI; LUPTON; ALSTER,

2003), porém, muitos dos relatos são controversos por diferenças significativas na

metodologia aplicada.

Na área dermatológica os lasers mais utilizados vão de 308 (UV-B) até 10,600

(infravermelho) (CARROLL; HUMPHREYS, 2006), o protocolo de tratamento de pele

típico envolve a irradiação do local afetado com a luz laser de baixa intensidade e o

efeito da luz aparentemente cumulativo é repetido em intervalos de dias, podendo

ser absorvida, refletida, transmitida ou espalhada (HARRIS, 1988; TANZI; LUPTON;

ALSTER, 2003). A Figura 1 ilustra o poder de penetração das diferentes camadas

que compõem a pele, utilizando diferentes tipos de luz de acordo com o seu

comprimento de onda.

Quando a luz interage com as células e tecidos, é necessário observar que

lasers no espectro visível possuem pouca penetração nos tecidos, sendo de grande

importância a utilização de uma dose adequada, onde certas funções celulares

INTRODUÇÃO

3

podem ser estimuladas, tais como ativação de linfócitos, ativação de mastócitos,

aumento na produção de ATP mitocondrial, proliferação celular e apoptose. Também

foi observado efeito da luz sobre componentes da matriz extracelular como estimulo

da proliferação de fibroblastos, estímulo da síntese de fibras elásticas e colágenas,

aumento da migração celular de queratinócitos, estímulo da liberação do fator de

crescimento de fibroblastos (FGF) e estímulo no processo de cicatrização de feridas

(BASSO et al., 2012; GAO; XING, 2009; HOPKINS et al., 2004; LIN et al., 2010;

LOPES, [S.d.]; TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003).

Figura 1: Esquema que ilustra o poder de penetração da radiação em função do comprimento

de onda. (LOPES, [S.d.])

A utilização de lasers no comprimento de onda de 470 nm (luz azul), apresenta

ação importante no processo bactericida e antifúngico. A utilização da luz azul pode

ser realizada em associação com fotossensibilizadores, causando fotoexcitação de

porfirinas endógenas de bactérias fotossensíveis e posterior produção de espécies

reativas de oxigênio (LUCCA; WILLIAMS; BHATNAGAR, 2012)

A laserterapia promove estresse nos tecidos por promover a formação de

espécies reativas de oxigênio e também induz diversas respostas como proliferação

celular e processos de cicatrização (GROSSMAN et al., 1998).

INTRODUÇÃO

4

A formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) causado pela laserterapia

induz proliferação, produção de moléculas inflamatórias e aumento na produção de

ATP (CHEN; HUNG; HSU, 2008; FUJIMOTO et al., 2012; GAO; XING, 2009).

Lasers de baixa potência são frequentemente empregados no tratamento de

patologias, sendo associados a diferentes técnicas, como por exemplo, Terapia

Fotodinâmica (PDT), onde se utiliza fotossensibilizador capaz de absorver a luz em

comprimento de onda específico (CASTRO et al., 2007; WAGNER et al., 2012),

sendo assim a laserterapia difere da PDT por utilizar cromóforos endógenos. Na a

pele, os principais cromóforos endógenos são a riboflavina, bilirrubina, melanina,

protoporfirina e hemoglobina, como demonstrado na Figura 2 (MAHMOUD et al.,

2008).

Figura 2: Espectro de absorção dos cromóforos da pele. Adaptado de (MAHMOUD et al., 2008)

1.2. Pele

A pele é o maior órgão do corpo humano e representa 16% do peso corpóreo,

está dividida em camadas denominadas epiderme, derme e hipoderme, como

representado na Figura 3.

INTRODUÇÃO

5

Figura 3. Representação esquemática das camadas estruturais da pele. Adaptado de (“Cancer

Information,” [S.d.]).

A epiderme representa a camada mais superficial da pele e é composta de

camadas estratificadas denominadas estrato basal, estrato espinhoso, estrato

granuloso e estrato córneo (Figura 4).

A estrutura e função da pele dependem de um equilíbrio entre a proliferação e

diferenciação de queratinócitos, que sofrem alterações morfológicas e bíoquímicas

importantes, conferindo rigidez e força ao tecido epitelial, bem como proteção contra

a invasão de patógenos, agressões físicas e químícas. A integridade e resistência

da pele se deve à presença de uma extensa camada de filamentos de actina no

citoesqueleto dos queratinócitos e interações célula-célula (desmossomos) e célula-

matriz (hemidesmossomos) (SIMPSON; PATEL; GREEN, 2012).

INTRODUÇÃO

6

Figura 4: Processo de diferenciação de queratinócitos. Adaptado de PROKSCH; BRANDNER;

JENSEN, 2008.

Os queratinócitos representam cerca de 90% da epiderme e são as células

responsáveis pela produção da queratina, num processo denominado queratinização

(KANITAKIS, 2002). O estrato basal representa a porção mais interna da epiderme

em contato com a membrana basal. Neste estrato estão presentes queratinócitos

com aspecto cubóide, melanócitos responsáveis pela síntese de melanina e células

de Merkel, responsáveis pela sensação do tato. A camada basal germinativa garante

a renovação dos queratinócitos e renovação da pele, que ocorre em até 21 dias.

As camadas suprabasais da epiderme subdividem-se em estrato córneo, que

compreende a camada mais externa, constituída por células anucleadas, achatadas

e queratina, responsável por formar uma barreira de proteção que surge a partir da

INTRODUÇÃO

7

diferenciação específica dos queratinócitos da camada espinhosa e granulosa. No

estrato granuloso, além de queratinócitos com formato mais achatado encontram-se

células de Langerhans, que participam das reações imunológicas da epiderme.

Em diferentes situações patológicas, como lesão da epiderme, queratose

actínica, hiperpigmentação e sarda (lentigo), inicia-se um programa complexo de

reestruturação que promove reepitelização, migração e proliferação intensa de

queratinócitos. Tais processos são coordenados pela interação de fatores de

crescimento, como fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores de crescimento

de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento transformante β (TGF-β) (IRIYAMA et

al., 2011; NASHAN; MEISS; MÜLLER, 2013; SADOWSKI et al., 2003; SEPPÄNEN-

PASONEN et al., 2003).

A pele está sujeita a diferentes tipos de estresse, como, por exemplo, a

frequente exposição à luz UV, e sua alteração pode facilmente progredir ao

aparecimento de tumores classificados como melanomas malignos e tumores não-

melanomas, este último inclui o carcinoma espinocelular (CEC) e carcinoma

basocelular (CBC), que representam respectivamente 25% e 70% dos casos de

câncer de pele não-melanoma (“INCA,” [S.d.]; LUKIC D et al., 2012; PROKSCH;

BRANDNER; JENSEN, 2008; WU et al., 2012).

O carcinoma espinocelular (CEC) é uma lesão das células epiteliais originada a

partir da transformação de queratinócitos, e o segundo câncer não-melanoma mais

frequente na população branca. Sua principal origem é a presença de queratose

actínica causada pela exposição solar, sendo classificado de acordo com grau o

diferenciação dos queratinócitos e a invasão epidérmica (KIM; ARMSTRONG, 2012).

O crescimento do tumor é controlado pela interação das células tumorais com o

microambiente, envolvendo ativação de fibroblastos, células endoteliais e

inflamatórias e interações com diversos componentes da matriz extracelular,

promovendo proliferação celular, angiogênese, inibição de apoptose e invasão

tumoral (RODUST; FECKER; STOCKFLETH, 2012; WILLHAUCK et al., 2007).

O estudo com células HaCaT demonstra um grande potencial na investigação

da fisiologia e patologias da pele, visto que as células HaCaT possuem a

capacidade de se diferenciar in vitro, reproduzindo todas as camadas constituintes

da epiderme. Cumpre ser observado que trabalhos recentes demonstram

claramente que o meio de cultura é importante para o processo de diferenciação das

diversas camadas da epiderme. Dentre as diferentes variáveis do meio de cultura

INTRODUÇÃO

8

celular, a concentração ideal de cálcio e tempo de cultura permitem a presença de

todas as camadas epidérmicas em cultura de células HaCaT, em média 13 dias para

chegar ao estágio final de diferenciação (BORANIC et al., 1999; DEYRIEUX;

WILSON, 2007).

A linhagem não neoplásica de queratinócitos humanos imortalizada (HaCaT),

bem como células de carcinoma epidermóide humano (A431), são frequentemente

utilizadas como modelo in vitro de estudos (DEYRIEUX; WILSON, 2007; HSIEH; YU;

LYU, 2010).

1.3. Matriz Extracelular

1.3.1. Proteoglicanos

A matriz extracelular (MEC) é constituída por uma rede complexa de

macromoléculas composta por colágenos, glicoproteínas, fibras elásticas,

proteoglicanos (PG) e ácido hialurônico (AH) (KRESSE; SCHÖNHERR, 2001;

SCHONHERR; HAUSSER, 2000). A MEC desempenha diversas funções como

participação em mecanismos de sinalização celular, reservatório para fatores de

crescimento, citocinas e modulação de processos como proliferação, adesão e

migração celular (BAUER; JACKSON; JIANG, 2009; KRESSE; SCHÖNHERR,

2001; SCHONHERR; HAUSSER, 2000).

Os proteoglicanos são macromoléculas constituídas por um esqueleto protéico

ligado a cadeias de glicosaminoglicanos e encontram-se presentes na superfície

celular, em grânulos intracelulares e na MEC. Os proteoglicanos modulam a ação de

citocinas, fatores angiogênicos e fatores de crescimento. Os efeitos dos

proteoglicanos em vários mecanismos celulares em geral são modulados por

interações com as cadeias de glicosaminoglicanos (GAG) ou por interações entre o

esqueleto protéico dos proteoglicanos. Os proteoglicanos também possuem

importante papel na organização de fibras de colágeno e participam de fenômenos

biológicos como diferenciação, manutenção e organização da MEC (SCHONHERR;

HAUSSER, 2000).

No tecido epitelial são frequentemente encontrados proteoglicanos de

superfície celular, como PG da família dos sindecans, glipicans, família do CD44 e

proteoglicanos de MEC (versicam) e lâmina basal (perlecam). Os PG de baixo peso

molecular, ricos em resíduos de leucina como decorim, biglicam e fibromodulina

INTRODUÇÃO

9

também são característicos da MEC da pele. A Tabela 1 evidencia os diferentes

tipos de PG encontrados na pele.

1.4. Glicosaminoglicanos

Os glicosaminoglicanos (GAG) são heteropolissacarídeos lineares, formados

por unidades dissacarídicas repetitivas, constituídos por um resíduo de hexosamina

(glucosamina ou galactosamina), ligada a um resíduo de açúcar não aminado, que

pode ser ácido urônico (D-ácido glucurônico ou L-ácido idurônico) ou D-galactose. A

massa molecular dos glicosaminoglicanos pode variar entre 10-100 kDa. Com

exceção do ácido hialurônico, todos os GAG encontram-se ligados a um esqueleto

protéico formando os proteoglicanos, já mencionados (GANDHI; MANCERA, 2008;

RADEMACHER; PAREKH; DWEK, 1988).

Os GAG podem interagir com proteínas distintas, incluindo quimiocinas,

citocinas, fatores de crescimento, enzimas e moléculas de adesão, promovendo a

regulação de diversas funções biológicas (GALLO, 2000; GANDHI; MANCERA,

2008)

Os GAG participam de mecanismos de sinalização em vários processos

fisiológicos e patológicos como angiogênese, crescimento axonal, progressão de

tumores, metástases tumorais e mecanismos de coagulação.

Os GAG sulfatados incluem o condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS),

queratam sulfato (KS), heparina (HEP) e o heparam sulfato (HS). Enquanto o ácido

hialurônico (AH) representa a classe de GAG não sulfatado, a Tabela 1 representa a

nomenclatura proposta por Jeanloz e unidades dissacarídicas constituintes

(JEANLOZ, 1960).

A pele apresenta grande quantidade de ácido hialurônico, dermatam sulfato,

heparam sulfato e queratam sulfato, que modulam processos de adesão, migração e

proliferação celular (GALLO, 2000; MALMSTRÖM et al., 2012; ZHAO et al., 2013).

INTRODUÇÃO

10

Tabela 1. Proteoglicanos presentes no tecido epitelial*.

Proteoglicano GAGProteína

(KDa)Tecido Atividade

Sindecam CS 31

HS 82-88

Glipicam HS 62

Perlecam CS/HS 400

Versicam CS 265

Decorim CS/DS 36

Colágeno XVIII HS 150

Adesão celular

Fibromodulina KS 42 ConjuntivoAdesão celular,

fibrilogênese

CD44

CS

facultativo 32-38

Epitélio e

fibroblasto

Membrana basal

Fibroblasto

Conjuntivo

Membrana basal,

epitélio

Epitélio e

linfócitos

Morfogênese, adesão

celular

Endocitose

Estrutural

Adesão celular,

fibrilogênese

Interação célula-célula

Suporte mecânico,

migração celular

Epitélio e

fibroblasto

* Adaptada de (ESKO, 1991; SARRAZIN; LAMANNA; ESKO, 2011)

1.4.1. Ácido Hialurônico

O ácido hialurônico (AH) é um GAG não sulfatado, formado por unidades

repetidas de β-D-1,3-N-acetilglicosamina e β-1,4-ácido D-glucurônico, com peso

molecular que varia entre 105 a 107 Da (BRIMACOMBRE; WEBER, 1964; MEYER,

1958).

Na MEC o ácido hialurônico encontra-se associado à proteoglicanos como o

agrecam e versicam, formando agregados unidos por domínios de ligação,

conhecidos como proteína de ligação ou link protein, proporcionando estabilidade à

molécula e dificultando a degradação do AH (RODRIGUEZ; ROUGHLEY, 2006;

SEYFRIED et al., 2005).

INTRODUÇÃO

11

O AH encontra-se altamente expresso em células epiteliais, desempenha

importante papel no remodelamento, reparo e regeneração do tecido, participando

também em processos patológicos como inflamação e desenvolvimento tumoral

(FRENKEL, 2012; KASTNER; THOMAS; JENKINS, 2007; NEUMAN et al., 2011;

PAIVA et al., 2005).

Tabela 2. Características estruturais dos glicosaminoglicanos

Açúcar não Ligação Hexosamina Ligação *Sulfato (s)

nitrogenado glicosídica (Hx) glicosídica

Ácido β-D- β (1-3) β-D-N- β (1-4) -

Glucurônico Acetilglucosamina

Ácido β-D- β (1-3) β-D-N- β (1-4) C4 ou C6

Glucurônico Acetilgalactosamina (Hx)

α-L-idurônico β (1-3) β-D-N- β (1-4) C4

Ácido β-D-Glucurônico α (1-3) Acetilgalactosamina (Hx)

β-D- β (1-4) β-D-N- β (1-3) C6 (Hx)

Galactose Acetilglucosamina C6 (Gal)

Ácido β-D- β (1-4) α-D-N- α (1-4) C6 (Hx)

Glucurônico Acetilglucosamina

α-D-Glucosamina

N-Sulfato

α-L- α (1-4) α-D-Glucosamina α (1-4) C6 (Hx)

idurônico N-Sulfato C2 (AU)

GAG

Ácido

Hialurônico

Condroitim

sulfato

Dermatam

sulfato

Queratam

sulfato

Heparam

sulfato

Heparina

*Posições de sulfatação: GAG, glicosaminoglicanos; Hx, Hexosamina; AU, Ácido urônico; N,

grupamento amino; C, carbono; Gal, galactose.

O AH apresenta-se distribuído no estrato basal e espinhoso da epiderme,

enquanto, os estratos granular, córneo, bem como a membrana basal são negativos

para a marcação do AH (TAMMI et al., 1988).

A associação do AH com diferentes tipos de receptores, como por exemplo na

superfície de células tronco e em células neoplásicas apresenta correlação com a

progressão de tumores. Dentre os receptores de AH encontramos CD44, RHAMM e

ICAM (BOURGUIGNON et al., 2012).

Três isoformas de enzimas participam da biossíntese do AH, denominadas

ácido hialurônico sintases (HAS-1, HAS-2 e HAS-3). As ácido hialurônico sintases

encontram-se ancoradas na membrana plasmática, onde o AH é sintetizado e

liberado para o espaço extracelular, em geral são pouco expressas, mas produzem

INTRODUÇÃO

12

uma grande quantidade de AH (KOSUNEN et al., 2004). As HAS-1 e HAS-2

produzem AH de alto peso molecular, entre 2-4 x106 Da, enquanto, a HAS-3 produz

fragmentos de AH de baixo peso molecular, entre 0,4-2,5 x 105 Da (AVERBECK;

GEBHARDT; VOIGT, 2006).

Os genes que codificam as diferentes ácido hialurônico sintases humanas

estão presentes em diferentes cromossomos, porém, possuem homologia entre si. O

gene da enzima HAS-1 está localizado no cromossomo 19q13.3-q13.4. O gene da

HAS-2 encontra-se no cromossomo 8 e o gene da HAS-3 encontra-se no

cromossomo 16q22.1 (NOBLE; LIANG; JIANG, 2011; NYKOPP et al., 2009).

Estudos mostram que a inibição de HAS-2 na fase embrionária causa

letalidade e/ou anormalidades no desenvolvimento embrionário (CAMENISCH et al.,

2000). Já as enzimas HAS-2 e HAS-3 são importantes no processo de diferenciação

e proliferação da epiderme (SEPPÄNEN-PASONEN et al., 2003).

As enzimas que participam da degradação do AH são denominadas

hialuronidases (HYAL). Existem seis isoformas conhecidas, HYAL1-4, PH 20/SPAM1

e HYALPI, sendo que as isoformas HYAL1 e HYAL2 são mais expressas em células

somáticas. A HYAL1 apresenta atividade em pH ácido e pode degradar AH de alto

ou baixo peso molecular, gerando tetra- e hexassacarídeos. A HYAL2 cliva

moléculas de AH de alto peso molecular, sendo encontrada em baixas

concentrações (CSOKA; FROST; STERN, 2001; GEORGE; STERN, 2004). A

HAYL3 apresenta-se expressa na medula óssea e testículo, enquanto a HAYL4 é

encontrada no músculo esquelético e placenta (CSOKA, ANTONEI BENJAMIN

SCHERER STEPHEN; STERN, 1999). A enzima PH 20/SPAM1 localiza-se no

cromossomo 7q31 e encontra-se expressa nos testículos (JONES et al., 1995;

PRIMAKOFF; HYATT; MYLES, 1985). A presença e ação das HAYL apresenta um

importante papel tanto na fisiologia quanto em processos patológicos e conforme

descrito na literatura sua presença é tecido-dependente.

O AH também pode ser degradado de forma não enzimática por mecanismo

que envolve radicais livres, em presença de agentes redutores, como ácido

ascórbico, tióis e íons cobre (STERN; MAIBACH, 2008).

INTRODUÇÃO

13

1.4.2. Condroitim Sulfato, Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato

O condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS) pertencem à classe de

galactosaminoglicanos, pois a hexosamina constituinte é a galactosamina. O CS é

composto por unidades dissacarídicas repetitivas de ácido D-glucurônico e N-

acetilgalactosamina unidas por ligações β1-4 e β1-3. O CS pode ser sulfatado na

posição C6 ou C4 dos resíduos de N-acetilgalactosamina. O DS difere do CS por

apresentar resíduos de ácido L-idurônico, além de ácido D-glucurônico

(BRIMACOMBRE; WEBER, 1964; MALMSTRÖM et al., 2012).

O padrão de sulfatação, desacetilação e epimerização cria uma diversidade de

famílias de CS com funções específicas de acordo com sua estrutura. Em

mamíferos, a unidade mais frequente de galactosamina é a forma monosulfatada, na

posição C4, também denominada CS-A ou CS-C quando apresenta sulfatação em

C6. Outras formas de CS têm sido descritos, tais como CS-D e CS-E, ambos

dessulfatados (MALMSTRÖM et al., 2012).

O condroitim ocorre em processos de crescimento, ossificação e manutenção

da cartilagem normal (MICHELACCI et al., 1979; MOURÃO et al., 1976).

Estudos em diversos tecidos neoplásicos mostram um aumento de CS na

matriz extracelular, principalmente do condroitim-6-sulfato (DIETRICH et al., 1980).

O DS é o GAG mais abundante na pele e talvez seja o principal GAG

associado ao colágeno, estando inclusive envolvido com a organização e

fibrilogênese. O DS também participa de processos de cicatrização, através da

interação com o cofator II da heparina e ativação de fatores de crescimento, como

FGF-2 e fator de crescimento de queratinócitos (FGF-7) (TAYLOR; RUDISILL;

GALLO, 2005; TOLLEFSEN, 1994).

O queratam sulfato (KS) é composto por D-galactose, ligada a N-

acetilglucosamina por ligação do tipo β1-4 e β1-3 (BRIMACOMBRE; WEBER, 1964).

O KS é um componente importante de vários tecidos ricos em colágeno e

representa um dos principais GAG presentes na córnea (HAYASHIDA et al., 2006).

Os proteoglicanos de queratam sulfato (PGKS), como lumicam, keratocam e

osteoglicina, apresentam um papel regulador na manutenção da estrutura córnea

em um grande número de espécies. Acredita-se que os PGKS formam a arquitetura

da córnea através de interações com as fibras colágenas (BLOCHBERGER et al.,

1992; CORPUZ et al., 1996; FUNDERBURGH et al., 1997).

INTRODUÇÃO

14

Na pele, o lumicam desempenha um papel central no colágeno da pele

fibrilogênese e cicatrização de feridas (YEH et al., 2010), e sua presença foi

detectada em células de melanoma humano, mas não em células de melanócitos

normais. (BRÉZILLON et al., 2007; SIFAKI et al., 2006).

1.4.3. Heparam Sulfato

O heparam sulfato (HS) foi descoberto há 50 anos por Jorpes e Gardell, no

entanto, suas funções biológicas até hoje são alvo de extensiva investigação. O HS

é amplamente distribuído no reino animal, possuindo as mais variadas funções e

interações na MEC (DIETRICH et al., 1998).

O HS faz parte dos GAG sulfatados e ocorre geralmente associado a um

esqueleto protéico formando proteoglicanos (PGHS). Os PGHS ligam-se

especificamente a uma variedade de proteínas (IOZZO, 2001).

A estrutura do HS é composta por resíduos de ácido L-idurônico e ácido D-

glucurônico ligados a N-acetilglicosamina (ligação β1-4) (NADER et al., 1987, 1989).

O padrão de sulfatação do HS influencia a interação e consequente modulação e

ativação de diferentes proteínas. Algumas funções biológicas do HS envolvem o

reconhecimento célula-célula, interação com componentes da MEC, tais como

laminina, fibronectina e colágeno, adesão e migração celular, além da ativação de

enzimas (IRIE et al., 2008; PARISH, 2006; PORCIONATTO; NADER; DIETRICH,

1999).

O HS participa do processo de divisão celular de duas maneiras diferentes:

como modulador positivo ou negativo, ou como responsável por estímulos

mitogênicos. Sua ação como modulador positivo da proliferação celular deve-se à

capacidade de ligar-se e agir como um co-receptor para fatores de crescimento

(PORCIONATTO; NADER; DIETRICH, 1999). As células não podem responder ao

fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) na ausência de HS. Somente a

presença de um receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGF) funcional na

célula não basta, o complexo só se torna ativo quando o HS está presente (ORNITZ;

WILEY, 2000).

Observou-se que a epiderme e membrana basal apresentam respectivamente

sindecam-1, sindecam-4 e perlecam (BEHRENS et al., 2012; JUNG et al., 2012). O

INTRODUÇÃO

15

HS parece ser essencial na constituição do complexo de ancoragem entre derme e

epiderme (IRIYAMA et al., 2011).

O heparam sulfato é degradado endogenamente pela enzima heparanase

(HPSE-1), uma endo-beta-glucuronidase que cliva cadeias intrassacarídicas do

heparam sulfato, propiciando a formação de oligossacarídeos que apresentam alta

afinidade por fatores de crescimento, citocinas e fatores angiogênicos. Os

oligossacarídeos gerados por ação da heparanase participam, portanto, de

processos biológicos como proliferação celular, inflamação, vascularização,

angiogênese e invasão tumoral, como mostra o esquema da Figura 5 (VLODAVSKY

et al., 1999; ZCHARIA et al., 2005).

Figura 5. Sitio de clivagem da heparanase e mecanismos de ação dos oligossacarídeos

gerados na MEC. Adaptado de (VLODAVSKY; FRIEDMANN, 2001).

Estudos recentes evidenciam o importante papel da heparanase na fisiologia

da pele e demonstra que a ativação desta enzima induz hiperplasia da epiderme,

angiogênese e rugas (IRIYAMA; MATSUNAGA; AMANO, 2010). A hiperpigmentação

da pele em humanos causada por exposição solar é induzida por heparanase, sendo

tal fato decorrência da perda de heparam sulfato essencial para a junção derme-

epiderme (IRIYAMA et al., 2011).

Foi evidenciado que a exposição à luz UV promove aumento na expressão e

atividade da enzima heparanase (KURDYKOWSKI et al., 2012). Pacientes com

INTRODUÇÃO

16

melanoma, bem como cultura de células de melanoma, demonstraram aumento na

expressão da heparanase (CHEN et al., 2012; WAGNER et al., 2012).

É evidente o papel dos glicosaminoglicanos e da enzima heparanase

(HSPE1) para a integridade e manutenção das funções da pele. Sabemos que a

laserterapia ou aplicação do laser de baixa frequência é bastante utilizada em

tratamentos de pele com a finalidade de remover manchas em geral e acne. Diante

do exposto resolvemos investigar possíveis alterações do perfil de

glicosaminoglicanos e da expressão da heparanase causadas pela irradiação com

laser de baixa freqüência (laserterapia) em modelo experimental in vitro. Em tais

estudos decidimos utilizar a linhagem celular característica de queratinócitos

humanos (HaCaT) e comparar os possíveis efeitos da laserterapia com células

neoplásicas de carcinoma epidermóide humano (A431). Este estudo poderá

elucidar o efeito da laserterapia em células não neoplásicas e células tumorais da

pele, auxiliando o entendimento dos efeitos e alterações moleculares

proporcionados por este tipo de terapia.

OBJETIVOS

17

2. OBJETIVOS

Avaliar o efeito da irradiação de baixa frequência (laserterapia) na

viabilidade celular em células não neoplásicas (HaCaT),

comparativamente com linhagem tumoral (A431).

Analisar possíveis alterações do perfil de GAG em queratinócitos humanos

(HaCaT) e em células de carcinoma epidermóide humano (A431) após

irradiação de baixa frequência (laserterapia).

Investigar possíveis alterações da expressão gênica da heparanase, ácido

hialurônico sintases e hialuronidases em células HaCaT e A431 após a

utilização de irradiação de baixa frequência (laserterapia).

MATERIAL E MÉTODOS

18

3. MATERIAIS

3.1. Linhagem celular

Para a realização deste trabalho foram utilizadas linhagens de células

estabelecidas de queratinócitos humanos (HaCaT), gentilmente cedida pela Profa.

Dra. Giselle Zenker Justo e de Carcinoma epidermóide humano (A431), gentilmente

cedida pelo Prof. Dr. Hugo Pequeno Monteiro.

3.2. Cultura de células

- Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) baixa glicose da Nutricell,

Campinas SP, Brasil;

- Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) alta glicose da Nutricell,

Campinas SP, Brasil;

- PBS (tampão fosfato salino) 0,1M, contendo NaCl 137 mM, Na2HPO4 4,3 mM,

KH2PO4 1,8 mM e KCL 2,7 mM em água destilada e filtrada em sistema Milli-QTM

(Millipore®, Billerica, MA, EUA);

- Placas para cultura de poliestireno P35 (35x10 mm) e P60 (60x10 mm)

falcon® (Lincon Park, New Jersey, EUA);

- Solução EBSS (solução salina balanceada de Earl sem cálcio e sem

magnésio), NaCl 116 mM; KCl 5 mM; Na2HPO4 8 mM; KH2PO4 1,46 mM; NaH2HPO4.

1H2O 1 mM; NaHCO3 8 mM (Merck®, Darmstadt, Alemanha); D-glucose 1% e

vermelho de fenol 0,01% (Sigma Chemical Co.®, St. Louis, MO, EUA) em um litro de

água destilada e deionizada em sistema Milli-QTM (Millipore®, Billerica, MA, EUA);

- Soro fetal bovino (SFB) da Cultilab® (Campinas, SP, Brasil);

- Tampão para proteólise, Tris-HCl 50 mM, contendo 3,5 M uréia, pH 7,4;

- Antibióticos: Estreptomicina e Penicilina.

3.3. Enzimas

- Maxatase (protease alcalina P126) foi adquirida da Biocon do Brasil Indústria

Ltda.® (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);

- Tripsina 2,5% da Cultilab® (Campinas, SP, Brasil);

MATERIAL E MÉTODOS

19

- Condroitinase AC e ABC da Sigma Chemical Co.® (St. Louis, MO, EUA);

- Transcriptase Reverse - kit ImProm-IITM Reverse Transcription System

(Promega, Madison, Wisconsin);

- Oligo (dT)12-18 da Invitrogen® (Life Technologies™ Corporation).

3.4. Líquido de cintilação

- Ultima Gold™ (PerkinElmer Life And Analytical Sciences®, Inc.; Wellesley,

MA, USA).

3.5. Radioisótopo

- Sulfato de sódio (Na2[35S]O4) do Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares (IPEN, São Paulo, SP, Brasil);

3.6. Reagentes gerais e outros materiais

Todos os reagentes foram utilizados de acordo com as normas técnicas:

- Agarose da Bio Laboratories (Richmond, CA, EUA);

- Albumina sérica bovina (BSA) da Sigma Chemical Co.® (St. Louis, MO, EUA);

- Azul de toluidina da Fisher Scientific Co.® (Fair Lawn, NY, EUA);

- Solução de Coomassie Brilliant Blue G, contendo corante Coomassie Brilliant

Blue G 117μM (Sigma Chemical Co.®, St. Louis, MO, EUA), etanol 4,8% e ácido

fosfórico 8,5% (Merck®, Darmstadt, Alemanha).

- Cetavlon (brometo de cetiltrimetilamônia da Merck®, Darmstadt, Alemanha);

- Cloreto de Sódio (Merck®, Darmstadt, Alemanha);

- DMSO (dimetilsulfóxido) da Aldrich Chemical Company, Inc. (Millwaukee, WI,

EUA);

- Garrafas de cultura, 75, 100 ou 150cm2 da Corning Laboratory Sciences Co.®

(Corning, NY, EUA);

- Placas “multiwell” para cultura com 96 poços da Falcon® (Lincon Park, New

Jersey);

- Tris da Gibco® (Grand Island, NY, USA);

- Uréia ultra pura da Sigma Chemical Co.® (St. Louis, MO, EUA);

MATERIAL E MÉTODOS

20

New Jersey, EUA);

- TRIzol da Invitrogen® (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA);

- Maxima ® SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (Fermentas®, Life Sciences)

3.7. Equipamentos

- Agitador Vortex-Genie 2 modelo G250, Scientific Industries® (Bohemia, NY,

EUA);

- Autoclave vertical e horizontal da FABBE® (São Paulo, SP, Brasil);

- Banhos de temperatura constante FANEM Ltda.® (São Paulo, SP, Brasil);

- Câmaras para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por

Jaques e col. (1968), manufaturado pela Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP,

Brasil)

- Contador de cintilação Micro Beta Jet® da Perkin Elmer, Inc. (Fremont, CA,

EUA);

- Cyclone™ Sistema de estoque de fósforo, da Packard Instrument Company

(Meriden, CT, EUA), com software OptiQuant™, para análise de imagem;

- Espectrofotômetro modelo Spectronic 2000, da Bauch&Lomb® (Rochester,

NY, EUA);

- Filmes radiossensíveis Multipurpose (12,5 x 19,2; 12,5 x 25,2 e 12,5 x 43,0)

da Packard Instruments Co.® (Meriden, CT, EUA);

- Fluxo Laminar vertical da Vecco® (Campinas, SP, Brasil);

- Incubadora de CO2, modelo 315, acoplada a torpedos de CO2 pelo Gás Guard

modelo 3030 da Forma Scientific® (Marietta, OH, EUA);

- Leitor de Elisa modelo ELX 800 (Universal microplate reader) da Bio-tek

instruments Inc. (Highland Park, WI, EUA);

- Microcentrifuga 14.000 rpm modelo 5415, Eppendorf® (Hamburg, Alemanha);

- Microscópio invertido de campo claro e contraste de fase, modelo TE-100,

com câmera fotográfica digital acoplada, modelo Coolpix 990, ambos da Nikon,

Nippon Kogakuk® (Tóquio, Japão);

- Microplacas de 96 poços MaxiSorp/FluoroNunc™.

- NanoDrop® 1000 Spectrophotometer da Thermo Fischer Scientific INC

- pHmetro modelo 420ª da Orion Research Incorporated® (Boston, MA, EUA);

MATERIAL E MÉTODOS

21

- Purificador de água Milli-Q™ ZD2- 115 84 da Millipore Corporation® (Bedford,

MA, EUA);

- Termociclador ABI Prism 7500 da Applied Biosystems (Life Technologies

Corporation, Carlsbad, CA)

MATERIAL E MÉTODOS

22

4. MÉTODOS

4.1. Cultura de células

4.1.1. Descongelamento de células

Para o descongelamento das células, o fluxo laminar vertical foi previamente

limpo com álcool 70% e tratado com luz ultravioleta por 20 minutos seguido por

equilíbrio da ventilação por 10 minutos. As células, armazenadas em nitrogênio

líquido, foram descongeladas em banho-maria a 37ºC, ressuspensas em 5 mL de

meio de cultura estéril e centrifugadas para eliminação dos eventuais resíduos dos

reagentes de congelamento. O sobrenadante desta centrifugação foi descartado e

as células foram ressuspensas em 1mL de meio DMEM baixa glicose com 10% de

SFB para a linhagem estabelecida HaCaT e DMEM alta glicose com 10% de SFB

para a linhagem estabelecida A431 e plaqueadas em garrafas plásticas específicas

para cultura.

4.1.2. Manutenção das células

A linhagem estabelecida de queratinócito (HaCaT) e Carcinoma epidermóide

(A431) foram cultivadas em garrafas/placas de cultura, contendo meio de cultura

estéril DMEM. Este meio foi preparado acrescentando-se 10% de SFB e antibióticos

(100 μg/mL de estreptomicina e 100 Ul/mL de penicilina).

A cada dois dias o meio de cultura foi trocado, por aspiração com o auxilio de

uma pipeta Pasteur acoplada à bomba de vácuo. O meio de cultura contém o

indicador de pH vermelho de fenol que apresenta coloração vermelha em pH neutro

e amarela em pH ácido. Devido ao metabolismo celular o pH tende a acidificar,

tornando o meio de cultura amarelo, indicando, portanto, a necessidade de trocar o

meio. O pH ideal para o cultivo das células é neutro, próximo a 7,4.

4.1.3. Subcultivo das células

Quando as células apresentaram semi-confluência, o meio de cultura foi aspirado

e a placa foi lavada com tampão EBSS para remover qualquer resíduo de SFB, para

MATERIAL E MÉTODOS

23

que este não inative a enzima proteolítica utilizada na remoção das células na placa.

Para a remoção das células utilizou-se da enzima tripsina. A tripsina diluída 1:10 foi

adicionada a cada placa, mantendo-se a placa na estufa a 37ºC, por

aproximadamente 10 minutos, para que as células aderidas se soltassem da

garrafa/placa de cultura. Após essa etapa as células foram removidas da placa e

colocadas em tubo de plástico de 15mL contendo 3 mL de meio DMEM com 10%

SFB. O SFB apresenta inibidores de proteases e foi usado para inativar a tripsina, e

assim, evitar lise celular. Este tubo foi centrifugado a uma velocidade de 2.500 rpm

por 5 minutos e o sobrenadante descartado. As células foram ressuspensas em 5

mL de meio de cultura para serem plaqueadas novamente.

4.1.4. Contagem das células em Câmara de Neubauer

A contagem foi realizada para determinar a quantidade de células a ser

distribuída em cada placa (2,0x105 células/placa). A contagem foi feita em câmara

de Neubauer, a partir das células ressuspensas e homogeneizadas em 5 mL de

DMEM com 10% de SFB, colocou-se 10 μl do volume total de células na câmara. A

câmara de Neubauer é composta de quatro quadrantes laterais maiores, que são

subdivididos em dezesseis quadrantes cada. A contagem foi feita com o auxílio do

microscópio óptico invertido. Foram contados os quatro quadrantes e foi calculada a

média de células por quadrante. Este resultado foi multiplicado por 1,0x104 e o

resultado final correspondeu ao número de células por mililitro de suspensão de

células. As células foram incubadas a 37ºC, contendo 5% de CO2 até tornarem-se

70% confluentes.

4.2. Tratamento da cultura de célula com radiação a laser

O equipamento utilizado para a irradiação foi o Quasar Esthétique (DMC

equipamentos Ltda., Brasil), utilizado comumente no tratamento de acne, manchas

na pele, olheiras e marcas de expressão. Este equipamento utilizado para irradiar

nas diferentes células em cultura apresenta as seguintes especificações: Tensão de

Operação 90V ~ 240V; Emissor Visível comprimento de Onda 460 – 480 nm; Diodo

Laser Vermelho 660 – 685 nm; Potência Útil 70 mW.

MATERIAL E MÉTODOS

24

O equipamento possui um feixe de LED no comprimento de onda de 470 nm,

com 180 mW de potência, área do feixe de 78,5 cm2, sendo a aplicação da luz de

470 nm em cultura de células, foi realizada a 10 cm de distância da cultura celular,

por 3 minutos, numa densidade de energia de 0,417 J/cm2.

O feixe de diodo no comprimento de onda de 660 nm, foi aplicado nas

culturas celulares com 112 mW de potência, área do feixe de 78,5 cm2, aplicação a

10 cm de distância da cultura celular, por 1 minuto numa densidade de energia de

0,0856 J/cm2.

Para o tratamento associado, utilizando ambos os comprimentos de onda

(470 nm por 3 minutos e 660 nm por 1 minuto), os parâmetros utilizados foram os

mesmos descritos anteriormente, numa densidade de energia de 0,4983 J/cm2 . As

células foram submetidas a 2 aplicações diárias, seguindo as condições de

irradiação para cada comprimento de onda descritas na Tabela 3, considerando um

intervalo de 5 horas entre cada aplicação, totalizando 6 aplicações no período de 3

dias. Após a irradiação as células foram submetidas aos testes e incubadas por 18

horas a 37ºC, em estufa umidificada contendo 5% de CO2. A Tabela 3 esquematiza

os parâmetros de irradiação utilizados para o tratamento das diferentes linhagens

celulares (HaCaT e A431) em cultura.

Doses de 0,05-10 J/cm2 ocasionam estímulo, no entanto densidades acima 10

J/cm2 disto exercem efeito oposto, e a potência abaixo de 400 W/cm2. (HARRIS,

1988), ajudam a identificar os efeitos não-térmico da laserterapia.

Tabela 3. Parâmetros de Irradiação

PARÂMETROS DE IRRADIAÇÃO

Comprimento de onda 470 nm 660 nm 470 + 660 nm

Potência 180 mW 112 mW 180 + 112 mW

Densidade de energia total 2,4762 J/cm2 0,5136 J/cm

2 2.9898 J/cm

2

Área do feixe 78,5 cm2 78,5 cm

2 78,5 cm

2

Distância da cultura 10 cm 10 cm 10 cm

Tempo Total 18 minutos 6 minutos 18 min + 6 min

MATERIAL E MÉTODOS

25

4.3. Quantificação de glicosaminoglicanos sulfatados sintetizados por

células.

4.3.1. Marcação metabólica

As culturas de células de queratinócitos (HaCaT) e Carcinoma epidermóide

(A431) foram submetidas ao crescimento até atingirem aproximadamente 70% de

confluência e foram subcultivadas em placa de 6 poços (35 mm), em meio DMEM

com 10% de soro fetal bovino. As células foram incubadas por 18 horas a 37ºC em

estufa umidificada contendo 5% CO2. As células foram submetidas à irradiação com

laser a 470 nm, 660 nm e 470 nm + 660 nm, conforme descrito na metodologia (item

4.2). Após o terceiro dia de tratamento das culturas celulares nas diferentes

condições, foram adicionados 200 µCi/mL de [35S]-sulfato ao meio de cultura em

meio F12 na ausência de soro fetal bovino (SFB). Este ensaio permitiu a marcação

das moléculas de GAG sintetizadas e secretadas pelas células. A incubação foi

realizada durante 18 horas, 37ºC, em estufa sob atmosfera de 5% de CO2.

4.3.2. Extração de GAG marcados metabolicamente

Após o período de incubação das células irradiadas, contendo sulfato radioativo,

o meio de cultura foi removido e uma alíquota de 500 μl foi submetida à proteólise e

outra alíquota de 500 μl foi armazenada para posterior análise de ácido hialurônico.

Às células aderidas foram adicionados 500 μl do tampão Tris HCl 25 mM,

contendo uréia 7 M, pH 7,5, e com auxílio de um “scrapper”, esfregou-se o fundo da

placa para remoção das células e matriz extracelular. A fração celular (células +

matriz extracelular), foi homogeneizada e dividida em dois tubos contendo 250 μl

cada.

A proteólise da fração celular e meio de cultura foi realizada com adição de 125

μl de Maxatase (1 mg/mL) em presença de Tris-HCl 0,05 M e NaCl 0,15 M pH 8,0

(alíquota do meio de cultura e fração celular) e incubando-se o material a 60ºC por

24 horas em banho-maria, seguindo eletroforese em gel de agarose em tampão

PDA.

MATERIAL E MÉTODOS

26

4.3.3. Eletroforese em gel de agarose com tampão PDA

Finalizada a proteólise, uma alíquota de 5 µL do meio de cultura e da fração

celular, foi submetida à eletroforese em gel de agarose 0,55% em tampão 1,3-

diaminopropano acetato (PDA) 0,05 M, pH 9,0. Em seguida, o gel foi submetido à

eletroforese (100 V), durante 1 hora em câmara refrigerada a 4°C. Após a corrida

eletroforética, os GAG foram precipitados por imersão do gel em solução de cetil-

trimetilamônio (Cetavlon®) 0,1% por 2 horas. Em seguida, o gel foi totalmente

desidratado sob calor e ventilação. Após a secagem, o gel foi corado com azul de

toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol 50%, por 15 minutos. O excesso de

corante foi removido com uma solução descorante contendo ácido acético 1% e

etanol 50%.

4.3.4. Análise e quantificação dos GAG marcados metabolicamente

A lâmina de eletroforese marcada radioativamente foi posicionada para

impressão em filme radiossensível (Multipurpose, Packard Instruments Co).

A revelação do filme radiosensível foi realizada em câmara escura, no

equipamento Cyclone® (Storage Phosphor System, Packard Instr.). As bandas

correspondentes à migração dos GAG tiveram como referência a migração de GAG

padrão. Os dados foram analisados utilizando-se o software OptiQuanti.

As bandas referentes aos GAG foram recortadas do gel desidratado, com o

auxílio de uma pinça e quantificadas em 5 mL de solução de líquido de cintilação,

Ultima Gold™. Esta solução intensifica a radiação emitida pelo sulfato radioativo e

permite a quantificação dos GAG expressa em cpm (contagem por minuto). A

quantificação de cada GAG foi corrigida por proteína total, dosada em cada

experimento antes da proteólise pelo método convencional de Coomassie Blue.

Assim, foi obtido a quantificação dos GAG sintetizados pelas linhagens estabelecida

de queratinócitos e de carcinoma epidermóide mantidas em cultura, em valores

expressos em cpm/µg de proteínas totais.

MATERIAL E MÉTODOS

27

4.3.5. Dosagem de proteínas por método de Coomassie Blue

Este método utiliza um reagente que apresenta afinidade por proteína e possui

diferente intensidade de coloração dependendo da quantidade de proteínas

presentes. O reagente contém 117 μM de Coomassie Blue G250, 4,8% de etanol e

8,5% de ácido fosfórico preparado em nosso laboratório.

A dosagem foi realizada diluindo-se 5 e 10 μl de cada amostra da fração celular

sem proteólise das células irradiadas, em 100 μl do tampão Tris-HCl 25 mM com

uréia 3,5M, pH 7,5 e adicionou-se 2,9 mL do reagente Coomassie Blue. Cada

mistura foi homogeneizada e a leitura foi efetuada em espectrofotômetro com

comprimento de onda ajustado a 595 nm. A leitura da absorbância é proporcional a

quantidade de proteínas presente na fração celular. A quantificação relativa à leitura

das amostras foi determinada por equação da reta de uma curva padrão de

albumina.

A dosagem de proteínas da fração celular de cada placa foi realizada com o

intuito de corrigir a quantidade de proteínas produzidas pela célula, assim o

resultado apresentado demonstra apenas a influência da irradiação na síntese e

secreção dos GAG.

4.4. Degradação enzimática

O ensaio de degradação enzimática foi realizado para certificar-se que as

bandas marcadas no pulso de sulfato correspondiam aos GAG condroitim sulfato e

dermatam sulfato.

A condroitinase AC é uma enzima que atua degradando condroitim 4,6-

sulfatado, produzindo dissacarídeos insaturados 4- e 6- sulfatados (ΔU-GalNAc,4S e

ΔU-GalNAc,6S) e dissacarídeo insaturado não sulfatado (ΔDi-0S), uma vez que esta

enzima quebra, especificamente, ligações glicosídicas do tipo β(1-4), entre resíduos

de N-acetil-hexosamina que podem ou não apresentar sulfatação em C-4 ou C-6 e

resíduos de ácido glucurônico (GlcUA). A condroitinase B é uma enzima que

degrada ligações glicosídicas do tipo β(1-4), envolvendo N-acetil-hexosamina e

ácido-L-idurônico degradando dermatam sulfato, gerando dissacarídeos insaturados

4- e 6- sulfatados (ΔU-GalNAc,4S e ΔU-GalNAc,6S) (MICHELACCI; HORTON e

POBLACIÓN, 1987). A condroitinase ABC é uma liase que atua por meio de uma

MATERIAL E MÉTODOS

28

reação de β-eliminação, sobre sulfato de condroitim-4-sulfato (C4S), condroitim-6-

sulfato (C6S) e dermatam sulfato (DS) (ROBAT et al., 2012).

O teste foi realizado com as amostras de proteólise do pulso de sulfato. Em

diferentes tubos colocou-se 20 μl da enzima condroitinase AC e condroitinase ABC e

acrescentou-se 5 μl de cada amostra. Incubou-se as amostras em banho Maria a 37ºC

por 24 horas. Após esse período foi feita eletroforese em gel de agarose e impressão do

gel em filme conforme já descrito.

4.5. Ensaio de viabilidade celular

O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando-se o “kit Vybrant MTT Cell

Proliferation Assay”, de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O ensaio

de redução do MTT (brometo de 3-(4,5)-dimetiltialzolil-2,5-difeniltetrazólio) é um

ensaio colorimétrico para medir a atividade da redutase mitocondrial em células

vivas. Esta metodologia baseia-se na redução do sal de tetrazólio em cristais de

formazan por células metabolicamente ativas.

As células foram subcultivadas em uma microplaca de 96 poços, sendo que cada

amostra foi semeada em nove poços e incubada por 24 horas, a 37ºC, em estufa

umidificada contendo 5% de CO2. Após a incubação as células foram submetidas ao

tratamento com irradiação a laser com luz de 470 nm, 660 nm ou a associação (470

+ 660 nm), sendo utilizado como controle do ensaio células não tratadas com

laserterapia. O sobrenadante foi removido e adicionado 100 μL de MTT. A

microplaca foi protegida por papel alumínio e incubada por 3 horas, em estufa a

37°C, e 5% de CO2. Em seguida, a solução foi removida e foram adicionado 50 μL

de DMSO em cada poço. Após incubação de 10 minutos, a leitura foi realizada em

espectrofotômetro no comprimento de onda de 540 nm. O ensaio de viabilidade

celular foi determinado pela média da absorbância, seguida de desvio padrão.

4.6. Dosagem de ácido hialurônico

Utilizamos um método fluorimétrico para a determinação do AH, que se utiliza de

sondas de ligação do AH. A sonda corresponde à proteína de ligação, isolada de

cartilagem nasal bovina. A proteína de ligação compreende à porção globular da

proteína que promove a ligação do agrecam (proteoglicano de queratam sulfato e

MATERIAL E MÉTODOS

29

condroitim sulfato) ao AH. A proteína de ligação é imobilizada em microplacas de 96

poços MaxiSorp/FluoroNunc™.

Em cada poço da placa contendo a sonda adsorvida foram adicionados 100 μl de

solução de diferentes concentrações de AH padrão (0 a 500 μg/L), diluídas no

tampão de ensaio Tris-HCl 0,05 M, pH 7,75 e BSA 1% (albumina bovina sérica), ou

alíquotas de meio de cultura celular e fração celular, diluídas 1:100 no mesmo

tampão. Cada ensaio foi realizado em triplicata. A incubação foi realizada a 4°C, por

12 horas, seguindo três lavagem consecutivas com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH

7,75. Em seguida, à cada poço foram adicionados 100 μl da proteína de ligação

(1mg/ml) conjugada com biotina. Após a adição da proteína de ligação conjugada

com biotina foi realizada agitação por 2 horas, seguindo lavagens exaustivas com

tampão de lavagem. Após lavagem, foram adicionados 100 μl de estreptavidina

marcada com európio (diluição 1:10000) em tampão de ensaio durante 30 minutos.

Como a estreptavidina tem afinidade pela biotina conjugada à proteína de ligação

forma-se um complexo (sanduíche). Após várias lavagens foi adicionado uma

solução de “enhancement” (280 μl em cada poço) e, após agitação por cinco

minutos, o európio foi deslocado do complexo com estreptoavidina. A fluorescência

emitida pelo európio livre foi quantificada em um fluorímetro. A Figura 6 representa o

esquema das etapas descritas. A quantificação de ácido hialurônico de cada

amostra foi determinada em valores expressos por ng de AH / ug de proteína total.

MATERIAL E MÉTODOS

30

Figura 6. Representação esquemática do ensaio fluorimétrico para quantificação de ácido

hialurônico. A - Placas 96 poços MaxiSorp/FluoroNunc™ foram revestidas com a proteína de ligação

(proteína ligante de proteoglicanos ao ácido hialurônico); B - As amostras da fração celular e meio de

cultura de células HaCaT e A431 ligada a proteína de ligação; C – Adição de biotina conjugada com a

proteína de ligação; D – Revelação com estreptavidina marcada com európio E - Após a liberação do

európio com solução "enhancement" a fluorescência final foi quantificada em fluorímetro. Este método

foi padronizado por Martins e colaboradores (MARTINS et al., 2003).

4.7. Extração de RNA total

As células foram cultivadas e plaqueadas em placas de 60 mm e tratadas

conforme metodologia já descrita . Após incubação de 18 horas, as células foram

removidas com tripsina. O sobrenadante foi aspirado utilizando a bomba a vácuo e

ao precipitado foi adicionado 1 mL de TRIZOL® e homogeneizado por 5 minutos em

temperatura ambiente. A amostra foi transferida para um eppendorf de 1,5 mL e foi

adicionado 0,2 mL de clorofórmio, misturando gentilmente por 3 minutos em

temperatura ambiente. O clorofórmio promove a extração do RNA na fase aquosa.

Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x g, 4ºC, durante 15 minutos.

A solução contendo RNA foi transferida para outro tubo e acrescentou-se 0,5 mL de

isopropanol para a precipitação do RNA. As amostras foram incubadas por mais 10

A

D C

B

E

MATERIAL E MÉTODOS

31

minutos, temperatura ambiente e, em seguida, centrifugadas a 4ºC, a 10.000 x g, por

10 minutos. O precipitado obtido foi lavado com 1 mL de etanol 75%,

homogeneizado e centrifugado a 7.500 x g, 4ºC, por 5 minutos. O etanol foi

desprezado e as amostras submetidas a banho seco (55°C por 3 minutos). As

amostras de RNA foram solubilizadas em 25 µL de água milliQ tratada com DPEC

(livre de RNAse). Finalmente, o RNA total foi quantificado por espectrofotometria.

4.7.1. Quantificação do RNA Total

A dosagem foi realizada por espectrofotometria, em aparelho NanoDrop,

previamente calibrado. Os valores obtidos foram expressos em ng / μl.

4.7.2. Obtenção cDNA a partir do RNA Total

A obtenção do cDNA foi realizada utilizando-se o kit de RT Improm II®. Na

primeira etapa da reação foi adicionado de 1 μg de RNA total e 10 μM de Oligo dT

ou oligonucleotídeo iniciador (incubação 70°C, por 5 minutos e 4°C por 5 minutos).

Em seguida, foi adicionado ao tubo 10 μM de dNTPs (desoxirribonucleotídeos

trifosfatados), 2,4 μl de MgCl2 (25 mM), 4 μl do tampão de reação 5X e 1 μl da

enzima transcriptase reversa. A reação de transcrição reversa ocorreu a 42°C, por

60 minutos. As reações foram armazenadas à -20°C para posterior amplificação do

cDNA com oligonucleotídeos iniciadores específicos.

4.8. Análise da expressão por PCR em tempo real (qPCR)

A expressão do RNAm da heparanase (HPSE), ácido hialurônico sintases (HAS1,

HAS2 e HAS3) e hialuronidases (HYAL1 e HYAL2) foram realizadas em amostras

coletadas das culturas de células HaCaT e A431, após o tratamento com irradiação

a laser, comparando-se com o controle (células não submetidas ao tratamento). A

partir do cDNA obtido pela reação de transcrição reversa, anteriormente descrito,

aproximadamente 1μg/μL das amostras de cDNA foram incubadas com

oligonucleotídeos iniciadores sense e antisense (1,5 μM), 6 μl da enzima DNA

polimerase SYBR Green® e 0,025 μl de Rox (normalizador de fluorescência para

reação de qRT-PCR). As amostras foram homogeneizados em tubos cônicos de 0,2

MATERIAL E MÉTODOS

32

mL específicos para qPCR. As amostras foram submetidas à reação de qPCR numa

ciclagem de 95ºC por 10 minutos iniciais e 40 ciclos (95ºC, 15 minutos; 60ºC, 60

segundos). Todos os oligonucleotídeos iniciadores utilizados apresentavam

temperatura de desnaturação (Tm), entre 60ºC a 95ºC. Os genes endógenos

utilizados como controle foram da enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase

(GAPDH) e da subunidade 60S da proteína ribossomal L13A (RPL13A). Os

oligonucleotídeos iniciadores utilizados no presente estudo estão mostrados na

Tabela 4.

Os resultados obtidos da reação de qRT-PCR representam valores relativos

obtidos por média geométrica considerando a expressão de ambos os genes

endógenos constitutivos, GAPDH e RPL13A, (-ΔCt). Os valores foram expressos em

2-ΔΔCt.

Tabela 4. Sequências de Oligonucleotídeos iniciadores

mRNA Foward Reverse

HPSE1 5' TGG CAA GAA GGT CTG GTT AGG AGA 3' 5' GCA AAG GTG TCG GAT AGC AAG GG 3'

HAS1 5' CAA GGC GCT CGG AGA TTC 3’ 5’ CCA ACC TTG TGT CCG AGT CA 3’

HAS2 5’ CAG ACA GGC TGA GGA GGA CTT TAT 3’ 5’ GGA TAC ATA GAA ACC TCT CAC AAT GC 3’

HAS3 5’ GGC GAT TCG GTG GAC TAC AT 3’ 5’ CGA TGG TGC AGG CTG GAR 3’

HAYL1 5’ TAA CCC TGC CAG TTT CTC CAT CCA 3’ 5’ ACA GCC ATC TGT GCC TGA TCT TCA 3’

HAYL2 5’ AGG ACA AAG ATG TGT ATC GCC GGT 3’ 5’ GAA CTG CTG TGC TGC GAA CTC AAA 3’

RPL13a 5´ TTG AGG ACC TCT GTG TAT TTG TCA A 3´ 5´ CCT GGA GGA GAA GAG GAA AGA GA 3´

GAPDH 5´ TCG ACA GTC AGC CGC ATC TTC TTT 3´ 5´ GCC CAA TAC GAC CAA ATC CGT TGA 3´

4.9. Análise Estatística

A analise estatística foi realizada utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0 (La

Jolla, CA, USA). Para verificar a ocorrência de diferenças significativas entre os

grupos estudados foi utilizado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis. Em todas as

foram considerados valores estastiticamente significantes p < 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

33

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Viabilidade Celular em células HaCaT e A431

O uso da laserterapia está frequentemente associado ao aumento da

proliferação celular e resposta inflamatória (GAO; XING, 2009). No presente estudo

decidimos investigar o efeito da irradiação em diferentes comprimentos de onda

sobre a proliferação de células epiteliais normais (HaCaT) e células tumorais (A431).

A escolha da dose e quantidade de aplicações foi determinada conforme o protocolo

utilizado em ambulatório médico.

Observamos na Figura 7 diminuição da viabilidade celular, após laserterapia

utilizando os comprimentos de onda 470 nm, 660 nm, bem como a associação de

ambos os tipos de luz. Em células HaCaT e A431 foi observado diminuição da

viabilidade celular de aproximadamente 32, 67 e 55 % (células HaCaT) e 35, 47 e 28

% (Células A431), respectivamente, apresentando relevância estatística nos dois

tipos celulares (* < 0,05). A viabilidade celular foi analisada utilizando o teste MTT

descrito na metodologia. O resultado encontra-se expresso em porcentagem de

células viáveis.

Resultados semelhantes ao encontrado em nosso estudo, demonstraram

diminuição da viabilidade de células HaCaT e A431, quando utilizada a luz UVB 280-

315 nm (JUAN et al., 2012). O tratamento das células HaCaT e A431 com luz UVB

evidenciou alteração do ciclo celular, aumentando o número de células em G1-S e

diminuição da viabilidade celular dose dependente (JUAN et al., 2012). Ainda, tais

efeitos sobre o ciclo celular e viabilidade celular parecem ser mediados pelo fator de

transcrição nuclear kappa-B (NF-κB), quinase dependente de ciclina 6 (CDK6) e

proteínas da família BCL-2 (JUAN et al., 2012).

A utilização de luz UVC (200-290nm), em células A431, também demonstrou

inibição da proliferação celular (TAI et al., 2012).

Outros estudos utilizando cultura primária de células epiteliais humanas,

demonstraram aumento da proliferação celular, após irradação com laser de 660 nm

e 780 nm (EDUARDO et al., 2007). Este dado contrário ao obtido no presente

estudo pode ser explicado pelo fato de que a densidade de energia utilizada em tais

estudos foi menor àquela utilizada em nossos experimentos (3 e 5 J/cm2).


34

Viabilidade Celular

CTR

470

nm

660

nm

470+

660

nmCTR

470

nm

660

nm

470+

660

nm

0

20

40

60

80

100

120

*

*

*

*

*

HaCaT A431

% d

e c

élu

las

viá

veis

Figura 7. Viabilidade Celular após laserterapia. As células HaCaT e A431 foram submetidas a seis

irradiações com diferentes comprimentos de onda, como indicado em métodos. Os valores obtidos

expressam a média e desvio padrão de ensaios realizados em quintuplicata para células HaCaT e

nonoplicatas para células A431. * representa p < 0,05 utilizando-se o teste não paramétrico Kruskal-

Wallis.

Estudos realizados com outros tipos celulares como células endoteliais

HUVEC (CHEN; HUNG; HSU, 2008), cultura primária de fibroblastos humano

(ESMAEELINEJAD; BAYAT, 2013; SEKHEJANE; HOURELD; ABRAHAMSE, 2011)

e pré-osteoblastos (PAGIN et al., 2012), evidenciaram grande diversidade nos

protocolos experimentais que utilizam laserterapia, variando a intensidade de

energia, frequência de aplicações, distância, área, potência e tempo, gerando

diferentes efeitos biológicos, que dificilmente podem ser comparados.

Vale salientar que a utilização do laser de 400-500 nm apresenta atividade

bactericida, evidenciando diminuição da viabilidade em bactérias E. coli. Efeito

oposto pôde ser observado em estudos com laser de 400-500 nm em bactérias S.

aureus (LIPOVSKY et al., 2010), mostrando também aumento na geração de

espécies reativas de oxigênio (ROS), que explica o efeito bactericida. Entretanto, em

estudos com S. aureus e utilização de laser de 500-800 nm foi observado menor


35

produção de ROS, sugerindo que o efeito bactericida é mais eficiente em

comprimentos de onda menor (LIPOVSKY et al., 2010).

5.2. Efeito da laserterapia na síntese de glicosaminoglicanos sulfatados em

células HaCaT e A431

Os glicosaminoglicanos sulfatados exercem um importante papel na

sinalização celular e no remodelamento de matriz extracelular. De acordo com o tipo

celular existe grande variabilidade estrutural dos glicosaminoglicanos sulfatados. Tal

diversidade estrutural das cadeias de glicosaminoglicanos está diretamente

relacionada com a função que desempenham (DIETRICH et al., 1998;

PORCIONATTO; NADER; DIETRICH, 1999). Alterações dos glicosaminoglicanos

sulfatados estão relacionadas com o desenvolvimento de várias doenças como

câncer, doenças inflamatórias, doenças degenerativas e em processos de

cicatrização (KOZLOWSKI; PAVÃO; BORSIG, 2011; PECCHI et al., 2012; TAYLOR;

RUDISILL; GALLO, 2005; TEIXEIRA et al., 2012).

Ainda, o estudo de componentes da matriz extracelular, como proteoglicanos,

proteínas fibrosas, glicoproteínas, metaloproteases e glicosidases, podem elucidar

alterações moleculares diretamente relacionadas com o desenvolvimento de tais

doenças (MOSCATELLO et al., 1998; PECCHI et al., 2012; THEODORO et al.,

2007).

Atualmente, são conhecidos os benefícios da laserterapia no tratamento de

processos inflamatórios e cicatrização de feridas, porém, pouco se conhece sobre os

efeitos da utilização da terapia de laser de baixa potência na matriz extracelular.

Diante de tais observações é interessante investigar se existe alteração do

perfil de glicosaminoglicanos em cultura celular, após o tratamento laserterapia.

Observamos que as células HaCaT e A431, apresentaram CS/DS e HS por

análise eletroforética (Figura 8). A confirmação dos galactosaminoglicanos

sulfatados (CS e DS), foi determinada após degradação enzimática com

condroitinase AC e condroitinase ABC (Figura 9). A análise desses resultados

demonstrou a presença de DS sintetizado e secretado para o meio de cultura de

ambas linhagens celulares, HaCaT e A431 (Figura 9).


36

Figura 8. Perfil de GAG sulfados sintetizados por HaCaT e A431. Este emsaio representa a

radioautografia da eletroforese realizada para identificação e quantificação dos GAG sulfatados. As

células HaCaT e A431 foram marcadas com [35

S]-sulfato e analisadas após 6 aplicações de

laserterapia, exceto o grupo controle (como indicado em métodos). Painel A e B análise da linhagem

HaCaT; Painel C e D análise da linhagem A431; os números 1 e 2, representam amostras não sem

tratamento (controles); os números 3 e 4, indicam amostras submetidas ao tratamento 470 nm; os

números 5 e 6, indicam amostras submetidas ao tratamento 660 nm; os números 7 e 8, representam

amostras submetidas ao tratamento 470+660 nm.

É importante ser observado que até o presente, não existem trabalhos

na literatura que caracterizem os glicosaminoglicanos sulfatados de células HaCaT e

A431. Portanto, os resultados aqui apresentados são importantes para o melhor

entendimento das alterações de tais componentes após laserterapia.

Após a eletroforese em gel de agarose, os glicosaminoglicanos sulfatados

foram quantificados e os valores obtidos estão representados na Figura 10.

É importante observar que a irradiação induz alterações cutâneas, como

fibrose, que envolvem o acúmulo de componentes da MEC, como proteoglicanos de

heparam sulfato, que sabidamente são requeridos para os mecanismos de reparo

HaCaT

A431

A B

C D


37

tecidual, visto que tais compostos interagem e modulam a função de uma variedade

de outras moléculas como exemplo fatores de crescimento.

Figura 9. Radioautografia da eletroforese após degradação enzimática dos GAG sulfados

sintetizados por HaCaT e A431. As células HaCaT e A431 foram marcadas com [35

S]-sulfato e

submetidas a seis aplicações de laserterapia, como descrito em métodos. O extrato obtido da fração

celular e meio condicionado foram submetidos à degradação com condroitinases AC e ABC, como

descrito detalhadamente em métodos. Painel A e B, Células; Painel C e D, Céçulas A431; os

números 1,4,7 e 10, indicam amostras quenão foram submetidas à degradação enzimática

(controle); os números 2, 5, 8 e 11 representam as amostras digeridas com condroitinase AC e os

números 3,6,9 e 12 representam as amostras digeridas com condroitinase ABC.

A avaliação do perfil de glicosaminoglicanos sulfatados em células HaCaT

após o tratamento com a associação de 470 nm e 660 nm, sugere um aumento do

heparam sulfato de aproximadamente três vezes, como mostra a Figura 10.

Entretanto, análises estatísticas não confirmam que tal diferença seja significativa.

Nas células tumorais A431, não foi observado alteração expressiva do heparam

sulfato após aplicação com os diferentes comprimentos de onda (Figura 10).

Considerando a linhagem tumoral A431, observamos claramente que houve

diminuição significativa do HS na fração celular em relação ao controle e o DS não

apresentou alterações. No meio de cultura não houve alterações significativas na

secreção de HS e DS após o tratamento (Figura 10).

A431

HaCaT

A B

C D


38

Considerando a quantificação do DS na linhagem HaCaT, após aplicação dos

diferentes comprimentos de onda, observamos que a associação (470 nm e 660

nm), desencadeou um aumento de aproximadamente duas e três vezes,

repectivamente para a fração celualr e meio de cultura. Novamente, análises

estatísticas não comprovam significância para este aumento (Figura 10).

Figura 10. Quantificação dos glicosaminoglicanos sintetizados por células HaCaT e A431. HS,

heparam sulfato; DS, Dermatam sulfato; Fração celular, quantificação de glicosaminoglicanos

sintetizados por células e matriz extracelular. Meio, glicosaminoglicanos secretados para o meio de

cultura; CTR, controle (células sem tratamento com laser); 470 nm, após seis aplicações do laser com

470 nm; 660 nm, após seis aplicações com laser de 660 nm; 470 + 660 nm, após seis aplicações

com associação do laser de 470 + 660 nm. Os ensaios foram realizados em triplicatas e os valores

expressam a média e desvio padão.

A avaliação da biossíntese do heparam sulfato em células HaCaT foi

investigada em estudos de transfecção que promovem a superexpresão de enzimas

A431 DS Fração Celular DS Meio

CTR

470

nm

660

nm

470+

660

nmCTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

0

10000

20000

30000

40000

cp

m/

g p

rote

ína

HaCaT DS Fração Celular DS Meio

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

0

500

1000

1500

2000

25005000

10000

15000

20000

25000

cp

m/

g p

rote

ína

A431 HS Fração Celular HS Meio

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

0

50000

100000

150000

200000

cp

m/

g p

rote

ína

HaCaT HS Fração Celular HS Meio

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 660

nm

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 660

nm

0

2000

4000

6000

8000

20000

40000

60000

80000

100000

cp

m/

g p

rote

ína


39

anti-oxidantes. Em tais estudos, foi observado que houve um aumento significativo

no nível de expressão de cinco enzimas envolvidas na biossíntese do heparam

sulfato, xilosiltransferase II, glicosiltransferase-2 (EXTL2), D-glucuronosil-C5-

epimerase, iduronosil-2-O-sulfotransferase e 6-O-sulfo transferase (NAKAYAMA et

al., 2008).

Deve ser lembrado que heparina e heparam sulfato compartilham a mesma

via de biossíntese e também apresentam semelhança estrutural. Portanto, a

diminuição do heparam sulfato presente na fração celular em células A431, após o

tratamento com laserterapia, pode explicar a diminuição acentuada na viabilidade de

células A431 (Figura 7). Um dado que corrobora com esta hipótese foi descrito na

literatura demonstrando um efeito anti-proliferativo em células A431 mediado por

heparina (VANNUCCHI et al., 1991).

O perlecam é um proteoglicano de HS de membrana basal conhecido por

impedir a difusão descontrolada de diversos fatores da epiderme para a derme e sua

degradação pode afetar a junção dermo-epidérmica, promovendo o aumento da

ligação de fatores de crescimento, como fator de crescimento de hepatócitos (HGF),

fator de crescimento de queratinócitos (KGF) e fator de crescimento de fibroblastos

(FGF-2), transferindo e estimulando a melanogênese (processo bioquímico de

formação do pigmento de melanina) (IRIYAMA et al., 2011).

Foi observado em estudo de biópsias de pele humana que ocorrem

alterações na síntese de HS e perlecam até 72 horas após a exposição com luz UV,

evidenciando diminuição da expressão de perlecam (JUNG et al., 2012). A análise

de carcinoma espinocelular oral bem diferenciado, demonstrou baixa intensidade de

marcação de heparam sulfato (MORI et al., 1998).

É importante observar que além das alterações na quantidade de heparam

sulfato, alterações da estrutura de tal composto também pode estar relacionada com

o desenvolvimento de tumores. Foi demonstrado em carcinoma epidermóide de

pulmão que as cadeias de heparam sulfato apresentam diferenças estruturais no

padrão de dissacarídeos, comparativamente com tecido não tumoral (NACKAERTS

et al., 1997). Mais uma vez fica evidente a importância do heparam sulfato na

organização da estrutura da pele e no potencial metastático após sua clivagem.

O presente estudo claramente mostra aumento do HS com o tratamento de

laserterapia, quando se associa comprimentos de onda (470 e 660 nm). O aumento

da síntese de heparam sulfato, após laserterapia pode favorecer a adesão estrutural


40

dermo-epidérmica e ainda, podemos sugerir que o aumento do heparam sulfato,

após laserterapia poderia estar relacionado com menor probabilidade de

desenvolvimento de carcinoma epitelial.

Estudos sobre a importância do DS associado ao FGF-10 (Fator de

crescimento fibroblástico-10), demonstram que a presença de 10 ou 20

dissacarídeos, contendo ácido idurônico, estimulam o receptor de FGF-10,

promovendo aumento da migração e proliferação de queratinócitos e aceleram o

processo de reparo de feridas (RADEK; TAYLOR; GALLO, 2009).

No entanto, outros estudos demonstraram em carcinoma de células

escamosas de esôfago que a alta expressão de CS/DS e das enzimas epimerase-1

(DS-epi1), 6-O- e 4-O-sulfotransferases estavam significativamente aumentadas

nestes tumores. Com a finalidade de investigar melhor o papel do ácido idurônico

em células tumorais, este grupo estudou células deficientes em dissacarídeos de DS

que continham ácido idurônico em sua estrutura, e foi observado que houve uma

diminuição da capacidade de migração e invasão tumoral in vitro, associada à

redução da ligação com fatores de crescimento de hepatócitos (HGF) (THELIN et al.,

2012).

Os dados obtidos em nosso estudo demonstram estímulo da síntese de DS

em queratinócitos normais (HaCaT), somente após o tratamento associado (470 nm

+ 660 nm), o que pode sugerir que a laserterapia pode efetivamente desempenhar

um papel importante na diferenciação de tais células, devido ao estímulo da

quantidade de dermatam sulfato.

5.3. Expressão gênica por PCR em Tempo Real da HPSE-1

Após o tratamento à laser, foi observado diminuição significativa da expressão

de HPSE-1 em células HaCaT, comparativamente com o controle de células HaCaT

não tratadas. Porém, tal diminuição não foi estatisticamente significante quando foi

avaliada a expressão de HPSE-1 em células tumorais A431, comparativamente com

o controle de células A431 não tratadas (Figura 11).

Podemos observar na que a expressão relativa de HPSE-1 é maior nas

células A431, comparativamente às células HaCaT, visto que os ensaios foram

realizados nas mesmas condições (mesma quantidade de RNA total e cDNA nas

reações de amplificação, como descrito em métodos). Estes resultados corroboram


41

com dados da literatura, que evidenciam aumento da HPSE-1 em células tumorais,

comparativamente com células não neoplásicas (BRUN et al., 2009; VLODAVSKY et

al., 2012).

qPCR - HaCaT e A431

CTR

470

nm

660

nm

470+

660

nm

0.0

0.1

0.2

0.3

0.8

1.0

1.2 HaCaT

A431

*

HPSE-1

Ex

pre

ss

ão

Re

lati

va

**

Figura 91. Expressão relativa de Heparanase-1 (HPSE-1). CTR, Controle, células HaCaT e A431

sem tratamento; Barras brancas indicam a expressão do RNA mensageiro da HPSE-1 em células

HaCaT e Barras pretas indicam a expressão de RNA mensageiro em células A431, tratadas com seis

aplicações do laser de baixa potência como descrito em métodos. Os valores expressos são

referentes a média e desvio padrão, obtidos em ensaios realizados em triplicatas. * p < 0,05.

É evidente a menor quantidade de heparam sulfato, da fração celular em

células A431, comparativamente com células HaCaT (Figuras 8 e 9).

Consequentemente, este dado poderia ser explicado por maior expressão de

HPSE-1 na linhagem tumoral A431 (Figura 10), após laserterapia.

Sabe-se que a HPSE-1 está frequentemente aumentada em tumores, e

confere um caráter invasivo e metastático a essas células. Sabendo-se que a

irradiação com luz UVB é prejudicial à pele e sua ação pode desencadear o

aparecimento de câncer de pele, demonstrou-se aumento da expressão e atividade

da HPSE-1 em cultura de queratinócitos (KURDYKOWSKI et al., 2012). Outro

estudo que utilizou aplicação tópica de heparanase recombinante, demonstrou que a

HPSE-1 acelerou significativamente a cicatrização de feridas, devido à epitelização e

maturação dos vasos sanguíneos, aumentando a angiogênese da ferida,


42

possivelmente por gerar oligossacarídeos de heparam sulfato que apresentam alta

afinidade por fatores angiogênicos e intensificam sua ação. Consequentemente, a

maior intensidade de angiogênese no processo de reparação do tecido sugere um

efeito direto mediado por ação da HPSE-1 (ZCHARIA et al., 2005).

Ainda, a ativação da HPSE-1 na pele induz hiperplasia da epiderme, aumento

dos vasos linfáticos e formação de rugas, sendo que tais mecanismos são mediados

pela degradação das cadeias de heparam sulfato presentes na pele (IRIYAMA;

MATSUNAGA; AMANO, 2010).

5.4. Dosagem de Ácido Hialurônico

A análise da dosagem de ácido hialurônico (AH) em células HaCaT

demonstrou aumento na fração celular e na secreção deste composto, após os

diferentes tratamentos com laserterapia (Figura 12A). É importante ser observado

que a administração concomitante dos comprimentos de onda 470 e 660 nm

promoveu um aumento de aproximadamente 3 vezes na secreção de ácido

hialurônico em células HaCaT, comparativamente ao controle (sem tratamento).

As células A431 não apresentaram alterações na concentração de AH

presente na fração celular e secretado para o meio de cultura, independente do

comprimento de onda utilizado (Figura 12B).

Um resultado bastante interessante de ser observado foi o fato de que células

não neoplásicas (HaCaT), sintetizam e secretam quantidades maiores de AH,

comparativamente com células tumorais A431 (Figura 12).

Foi descrito na literatura que a redução do AH em amostras de biópsias de

pacientes com carcinoma oral espinocelular está diretamente relacionada a um

prognóstico desfavorável. A diminuição da imunomarcação de AH mostrou uma

correlação direta com menor sobrevida dos pacientes (KOSUNEN et al., 2004).

Portanto, a diminuição da quantidade de AH em células A431,

comparativamente com células não neoplásicas HaCaT, corrobora com a hipótese

de que células menos diferenciadas apresentam menor quantidade de AH.


43

Figura 10. Quantificação de Ácido Hialurônico. A, células HaCaT; B, células A431. O ácido

hialurônico foi quantificado na Fração celular (células e matriz extarcelular), bem como no meio de

cultura. A dosagem de ácido hialurônico está expressa em ng/μg de proteína total. Os valores

representam a média e desvio padrão de ensaios realizado triplicata para células HaCaT e

nonoplicata para células A431.

O aumento na quantidade de AH, após laserterapia, observado somente nas

células não neoplásicas (HaCaT), pode sugerir que o tratamento favoreça

mecanismos de diferenciação celular e manutenção da homeostase celular,

associado ao aumento do ácido hialurônico nas células HaCaT, porém, tais

mecanismos celulares não são afetados em células tumorais.

A concentração de AH foi avaliada em ratos, após sofrerem injúria no fêmur.

Os resultados mostraram que após laserterapia, utilizando laser diodo de 660 nm

(100 mW, 240 J/cm-2), ocorre aumento de AH no tecido ósseo (DE SOUZA MERLI et

al., 2012). Estes resultados corroboram com a análise do nosso experimento em

células HaCaT, reforçando a teoria de que laserterapia poderia contribuir com

mecanismos de reparo e cicatrização da pele mediada pelo aumento de AH.

O ácido hialurônico é o componente mais abundante da pele e possui um

turnover de 1-2 dias no conteúdo epidermal (AVERBECK; GEBHARDT; VOIGT,

2006). A constante síntese e degradação do AH é mediada por ação de ácido

hialurônico sintases e hialuronidases.

Dosagem de Ácido Hialurônico em células A431 Fração Celular Meio de Cultura

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

0

20

40

60

80

100200

250

300

350

400

AH

ng

/g

pro

teín

a t

ota

l

Dosagem de Ácido Hialurônico em células HaCaT Fração Celular Meio de Cultura

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

CTR

470

nm

660

nm

470

+ 66

0 nm

0

200

400

600

8001000

1200

1400

1600

1800

2000

AH

ng

/ug

pro

teín

a t

ota

l

*

*

B A


44

Diante dos resultados obtidos até o momento decidimos investigar a

expressão das ácido hialurônico sintases e hialuronodases em células HaCaT e

A431.

5.5. Expressão gênica por PCR em Tempo Real das enzimas de biossíntese e degradação do ácido hialurônico

A análise por PCR em tempo real demonstrou diferenças na expressão de

ácido hialurônico sintases e hialuronidases entre as células HaCaT e A431, após

laserterapia. No entanto estatisticamente só pode ser observado significância nas

células HaCaT na expressão do gene HAS2 durante o tratamento de 660 nm e no

gene HAS3, nos tratamentos de 470 nm e associado.

Nas células HaCaT, foi observado diminuição da expressão de RNAm de

ácido hialurônico sintases e hialuronidases, independente do tipo de tratamento com

laserterapia (Figura 13A). O fato da quantidade de ácido hialurônico ter aumentado

em células HaCaT, após laserterapia, mesmo com diminuição da taxa de transcrição

das enzimas envolvidas com a síntese e degradação do AH, reflete que

possivelmente, em células não neoplásicas (HaCaT), a atividade das sintases

encontra-se significativamente aumentada. Esta hipótese pode justificar a

necessidade de altos níveis de ácido hialurônico em queratinócitos não neoplásicos

para manutenção da viscosidade, resiliência e permeabilidade, funções essenciais

na manutenção do epitélio.

Curiosamente o tratamento com laser promoveu aumento da expressão das

ácido hialurônico sintases em células A431, como mostra a Figura 13B.

Com relação às hialuronidases (HYAL), verificamos que a expressão da

HYAL-2 aumentou após os tratamentos com 470 nm e 660 nm, enquanto houve

diminuição da expressão da HYAL-1.


45

HaCaT

CTR

HAS 1

HAS 2

HAS 3

HYA

L 1

HYA

L 2

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.5

1.0

1.5

470 nm

660 nm470+660 nm

*

* *

AE

xp

res

sã

o R

ela

tiv

a

A431

CTR

HAS 1

HAS 2

HAS 3

HYAL 1

HYAL 2

0.00.20.40.60.81.01.52.02.53.03.54.04.04.55.05.56.0

470 nm

660 nm

470+660 nm

Ex

pre

ss

ão

Re

lati

va

B

Figura 113. Expressão relativa de Ácido Hialurônico Sintases (HAS1-3) e Hialuronidases

(HYAL1-2). Controle (CTR), sem tratamento; A. Células HaCaT tratada com seis aplicações do laser

de baixa potência. B. Células A431, tratada com seis aplicações do laser de baixa potência, como

descrito em métodos. Os valores expressos são referentes a média e desvio padrão, obtidos em

triplicata. * p < 0,05.

Sabendo que a HYAL-2 degrada especialmente o AH de alto peso molecular

(NOBLE; LIANG; JIANG, 2011), poderíamos sugerir que em células A431

preferencialmente existe tal composto. Ainda, é descrito na literatura que a HYAL-2

pode ser regulada por citocinas inflamatórias, enquanto a HYAL-1 não sofre tal

regulação (FLANNERY et al., 1998).

A diminuição da expressão das ácido hialurônico sintases e hialuronidases foi

observada em células HaCaT tratadas com radiação UVB (280 nm) (HAŠOVÁ et al.,

2011).


46

O estudo evidenciou alterações no perfil e expressão de moléculas da matriz

extracelular, sendo de grande relevância para o estudo dos efeitos do laser de baixa

freqüência em tratamentos dermatológicos, principalmente se ao utilizarmos a

laserterapia com doses inadequadas, pode-se causar alterações irreversíveis as

células epiteliais e facilitar uma progressão tumoral, entanto vale observar, que os

testes in vitro não representam em sua totalidade o tecido epitelial devido a ausência

de interação com outros moléculas, como por exemplo a melanina, e hemoglobina,

respectivamente constituintes de melanócitos e hemácias circulantes no tecido

epitelial, visto que a luz também exerce efeito sobre tais moléculas, e poderiam

modificar a resposta ao tratamento.

CONCLUSÃO

47

6. CONCLUSÕES

A utilização do laser de baixa frequência diminuiu a viabilidade celular de

ambas as linhagens celulares não neoplásicas (HaCaT) e tumoral (A431).

A utilização do laser de baixa frequência alterou o perfil de

glicosaminoglicanos sulfatados das células HaCaT e A431. Nas células

HaCaT observamos aumento do HS, quando utilizado o tratamento de

associação entre os comprimentos de onda 470 nm e 660 nm. Porém, na

linhagem tumoral A431, houve diminuição do HS na fração celular em todos

os tratamentos, após laserterapia.

Foram verificadas diferentes respostas com relação à quantidade de ácido

hialurônico nas diferentes linhagens estudadas. Após irradiação com laser de

baixa potência ocorreu aumento da quantidade de ácido hialurônico na

linhagem HaCaT, não ocorrendo nenhuma alteração para a linhagem tumoral

A431.

Foi observado diminuição da expressão do RNA mensageiro da enzima

HPSE-1, após laserterapia em ambas as linhagens celulares estudadas.

Porém, uma diminuição mais acentuada da expressão do RNA mensageiro

da HPSE-1 foi observada na linhagem HaCaT. Tal resultado possivelmente

corrobora com o aumento do HS observado para a linhagem HaCaT.

Na linhagem HaCaT foi demonstrado diminuição da expressão das ácido

hialurônico sintases e hialuronidases. Entretanto, a linhagem A431 o efeito foi

oposto, sendo observado aumento na expressão das ácido hialurônico

sintases e hialuronidase 2, mas não na expressão de hialuronidase 1.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

48

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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Avaliação de alterações da matriz extracelular em cultura de células após laserterapia