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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM ODONTOLOGIA
INFLUÊNCIA DA LASERTERAPIA NA PROLIFERAÇÃO DE
CÉLULAS-TRONCO DO LIGAMENTO PERIODONTAL HUMANO
Diego Moura Soares
Natal/RN
2013
2
Diego Moura Soares
INFLUÊNCIA DA LASERTERAPIA NA PROLIFERAÇÃO DE
CÉLULAS-TRONCO DO LIGAMENTO PERIODONTAL HUMANO
Dissertação apresentada ao Colegiado do
Programa de Pós-Graduação em Saúde
Coletiva, Área de Odontologia, da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
Natal/RN
2013
3
Dedico esta obra...
À Deus,
Por sempre se fazer presente em minha vida
me fazendo forte e perseverante para superar os obstáculos.
Á minha família,
Marinalva, Lourinaldo e Danúbia.
Dedico a você pelo apoio e o amor incondicional de sempre.
Amo cecês!!
4
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À DEUS, por me permitir concluir este curso, me fazendo enxergar
muito além daquilo que se postava em minha frente. Por me dar forças nas
horas certas e de desânimo, pela saúde, pelos amigos e por, através dos
obstáculos, mostrar-me a força, o potencial e a fé existentes em mim.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza, meu
sincero agradecimento pela confiança depositada em mim desde o
primeiro momento. Com você aprendi valiosos ensinamentos acadêmicos e
de vida. Obrigado por ser exemplo de competência, humildade e
simplicidade, sendo um estímulo e exemplo a ser seguido. Que Deus o
abençoe e ilumine.
Á amiga Fernanda Ginani, que com o passar do tempo se tornou
uma irmã. Você é um exemplo de esforço, dedicação e humildade.
Obrigado por permanecer sempre ao meu lado em todos os momentos, por
enxugar minhas lágrimas e por me permitir dividir minhas alegrias. Sua
valiosa ajuda e dedicação foi fundamental no desenvolvimento dos
experimentos laboratoriais deste trabalho. Sentirei saudades de todos os
nossos momentos vividos, porém me conforto na certeza de que o nosso
laço permanecerá por toda a vida!
5
AGRADECIMENTOS
Á Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em especial ao Departamento de Odontologia e ao Departamento de Morfologia por ter proporcionado as condições necessárias para a realização deste trabalho.
Aos meus pais, Lourinaldo Moura Soares e Marinalva Fiel Soares, por sempre contribuírem e apoiarem as minhas decisões e sonhos, mesmo que para isso seja necessário abdicar dos seus para concretizarem os meus. Obrigado por transformarem minhas angústias, agitações e tristezas, em segurança e força. Vocês são e fazem parte do que eu sou, o meu sincero e eterno agradecimento.
À minha irmã, Danúbia Moura Soares, pela amizade, apoio e incentivo durante toda esta jornada.
Ao Prof. Dr. Hugo Rocha, pela cessão do laboratório de cultivo celular
do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da UFRN.
Aos amigos, companheiros de laboratório, Rafael, Luciana e Ruth pelas
conversas descontraídas dentro e fora do laboratório e pelo socorro sempre
que necessário.
Aos Professores Dra. Roseana de Almeida Freitas e Dr. José Sandro Pereira da Silva, pela participação na banca da qualificação, contribuindo para o aprimoramento deste trabalho de dissertação.
Ao Professor e amigo, Dr. Uoston Holder da Silva, agradeço pela força e incentivo dado para o começo de uma carreira acadêmica. É um grande exemplo para minha vida profissional. Aos alunos de iniciação científica, Gabriel Lamak, Haroldo Gurgel e Lucas Xavier, pelo companheirismo, troca de conhecimentos e a disponibilidade sempre que necessária. Nossa convivência nos tornou muito mais do que apenas companheiros de grupo de pesquisa, hoje somos amigos pra vida.
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À todos os colegas do curso de mestrado por compartilharem suas experiências, em especial aos amigos Pryscyla Pascally, Kerlison Paulino e Anna Angélica. Obrigado pelo companheirismo e a ajuda mútua durante todo esse tempo.
Aos amigos Janine Braz e Mardem Portela do curso de especialização em Ciências Morfológicas – UFRN, por compartilharem suas experiências e pela agradável companhia. Foi ótimo estreitar os laços e conviver com vocês.
As técnicas do laboratório de histologia do Departamento de Morfologia da UFRN, Socorro, Melina e Sara, meus agradecimentos pelo companheirismo, eficiência, disponibilidade, paciência e colaboração.
Aos residentes da Cirurgia Buco-Maxilo-Facial, em especial à Giordano Bruno e Assis Felipe, pelo auxílio na obtenção dos dentes.
Ao amigo Leonardo Mozer, obrigado por tonar os meus dias mais leves
com a sua alegria e bom humor de sempre. Sempre me divirto muito em sua companhia, além da amizade sincera que construímos. Você sempre terá um lugar especial na minha vida.
Aos amigos que a odontologia me deu, Gabriela Marques, Mayara
Russana e Nathália Vilar, obrigado por fazer parte do início dessa minha jornada e pela confiança e amizade sempre depositada.
Aos amigos que conheci no primeiro momento que me tornei “potiguar”
Hitaércio e Dilberto, obrigado pelo apoio necessário e por me nortear em uma cidade que passou a ser minha.
Ao amigo Igor Isaac Cunha, que tive o prazer de dividir momentos da minha vida. Obrigado por todos os momentos vividos, pelas alegrias compartilhadas e por ser essa pessoa tão especial. Com você aprendi o verdadeiro valor da amizade e a ver que o orgulho não leva a nada. Agradeço à Deus por ter por ter cruzado o seu caminho, nosso vinculo será eterno. Àqueles amigos que a vida me deu, que nem o tempo, nem a distância pode separar ou se quer enfraquecer o que sentimos. Natália Pimentel, minha fortaleza que sempre estava disposta a me aconselhar, te amo Nana. Juliana Pimentel, obrigado por ser dura quando necessário e ao mesmo tempo amável
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me fazendo ver aquilo que não consegui enxergar. Bruna Andrade, uma amiga que com o tempo e as circunstâncias de convivência tornou-se muito querida, sempre disposta e pronta pra qualquer parada. Everson Lima, o irmão que eu não tive, obrigado pelo companheirismo e amizade de sempre. Tharsis Quaresma, obrigado pela amizade sincera, espero que a odontologia seja tão generosa contigo como tem sido comigo. Obrigado amigos por entenderem minha ausência e se fazerem presentes, mesmo que distantes, me dando força para continuar. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro na forma de bolsa de mestrado.
À toda minha família e amigos, pelo estímulo no sucesso deste trabalho e pela compreensão em todos os momentos de ausência. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, meu sincero agradecimento!
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"É preciso força,
pra sonhar e perceber
que a estrada vai além do que se vê".
(Marcelo Camelo)
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RESUMO O laser de baixa intensidade (LBI) tem sido utilizado na Odontologia com a finalidade de promover cicatrização e regeneração dos tecidos. A literatura mostra um efeito positivo do LBI na proliferação celular, porém pouco se sabe sobre a sua eficácia na proliferação de células-tronco. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da irradiação do LBI na taxa proliferativa de células-tronco do ligamento periodontal humano. Extratos de ligamento periodontal foram isolados de dois terceiros molares hígidos removidos por indicação cirúrgica e/ou ortodôntica. Após a digestão enzimática, as células foram cultivadas em meio de cultura α-MEM suplementado com antibióticos e 15% de soro fetal bovino. No terceiro subcultivo, as células foram irradiadas com um laser diodo InGaAlP, utilizando-se duas diferentes densidades de energia (0,5J/cm2 - 16 segundos e 1,0J/cm² - 33 segundos), comprimento de onda de 660nm e potência de 30mW. Uma nova irradiação, utilizando os mesmos parâmetros, foi realizada 48 h após a primeira. Um grupo controle (não irradiado) foi mantido nas mesmas condições experimentais de cultivo. O método de exclusão por azul de Tripan e a atividade mitocondrial das células medida através do ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio], nos intervalos de 0, 24, 48 e 72 h pós-irradiação, foram utilizados a fim de avaliar a proliferação celular. Os dados das contagens celulares foram submetidos a testes estatísticos não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando um intervalo de confiança de 95%. Com o objetivo de verificar possíveis alterações morfológicas nucleares induzidas pelo laser, as células foram submetidas à marcação com DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole) no intervalo de 72 h. Os resultados do presente estudo mostraram que a densidade de energia de 1,0 J/cm² promoveu maior proliferação das células em comparação com os outros grupos (controle e laser 0,5 J/cm²) nos intervalos de 48 e 72 h. A atividade mitocondrial, medida pelo ensaio de MTT, apresentou resultados semelhantes às contagem celulares com azul de Tripan, com o grupo irradiado com 1,0 J/cm² exibindo uma atividade significativamente maior do MTT nos intervalos de 48 e 72 h, quando comparado com o grupo irradiado com 0,5 J/cm². Nenhuma alteração morfológica nuclear foi observada, tanto das células do grupo controle quanto nas células irradiadas. Conclui-se que o LBI apresenta efeitos estimulantes sobre a proliferação de células-tronco do ligamento periodontal humano. Portanto, a aplicação da laserterapia neste tipo celular pode ser importante para futuros avanços na regeneração periodontal.
Palavras-chave: Ligamento periodontal; células-tronco; laser; proliferação
celular.
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ABSTRACT
Low level laser irradiation (LLLI) has been used in Dentistry to promote wound healing and tissue regeneration. The literature shows a positive effect of LLLI on cell proliferation, but little is known about their effectiveness in promoting stem cells proliferation. The aim of this study was to evaluate the effect of LLLI on the proliferative rate of human periodontal ligament stem cells. Extracts of periodontal ligament were isolated from two third molars removed by surgical and/or orthodontic indication. After enzymatic digestion, the cells were grown in α-MEM culture medium supplemented with antibiotics and 15% fetal bovine serum. On the third subculture, the cells were irradiated with a InGaAlP-diode laser, using two different energy densities (0,5J/cm2 - 16 seconds and 1,0J/cm² - 33 seconds), with wavelength of 660nm and output power of 30mW. A new irradiation, using the same parameters, was performed 48h after the first. A control group (non irradiated) was kept under the same experimental culture conditions. The Trypan blue exclusion test and the mitochondrial activity of the cells measured by MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] essay were performed to assess the cell proliferation in the intervals of 0, 24, 48 e 72 h after irradiation. The data of cell counts were submitted to nonparametrical statistical tests (Kruskal-Wallis and Mann-Whitney), considering a confidence interval of 95%. DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole) staining of the cells was performed at 72h interval to evaluate possible nuclear morphological changes induced by LLLI. The results of this study show that the energy density of 1,0 J/cm² promoted greater cell proliferation compared to the other groups (control and 0,5 J/cm²) at intervals of 48 and 72h. The mitochondrial activity measured by MTT essay showed similar results to the Trypan blue cell counting test. The group irradiated with 1,0J/cm² exhibited a significantly higher MTT activity in the intervals of 48 and 72h, when compared to the group irradiated with 0,5J/cm². No nuclear morphological change was observed in the cells from the three groups studied. It is concluded that LLLI has stimulatory effects on the proliferation of human periodontal ligament stem cells. Therefore, the use of laser irradiation in this cell type may be important to promote future advances in periodontal regeneration.
Key-words: Periodontal ligament; stem cells; laser; cell proliferation.
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Unidirecionalidade dos feixes luminosos da luz laser ................
Figura 2. Coerência da luz laser ................................................................
Figura 3. Monocromaticidade da luz laser .................................................
Figura 4. Armazenamento do elemento dentário em tubo falcon de 50ml
contendo meio de cultura alfa-MEM para transporte ..................................
Figura 5. Remoção das células do ligamento periodontal dos terceiros
molares (A). Digestão enzimática do extrato celular com dispase e
colagenase (B) ...........................................................................................
Figura 6. Desenho experimental da irradiação das células .......................
Figura 7. Irradiação das células em cultura ...............................................
Figura 8. Desenho esquemático da placa de 24 poços e plaqueamento
das células objetivando impedir a dispersão de luz não intencional entre
os poços, sendo utilizadas duas placas de 24 poços para cada intervalo
de tempo estudado .....................................................................................
Figura 9. Desenho esquemático da placa de 96 poços e plaqueamento
das células objetivando impedir a dispersão de luz não intencional entre
os poços .....................................................................................................
Figura 10. Curva de crescimento das células-tronco do ligamento
periodontal humano submetidas ou não a irradiação com laser durante
diferentes tempos de incubação .................................................................
Figura 11. Proliferação das células-tronco do ligamento periodontal
humano durante diferentes tempos de incubação. Os valores são médias
de percentagens em relação ao controle ± DP. (*p<0,05) .........................
Figura 12. Micrografia das células-tronco do ligamento periodontal
22
22
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36
39
39
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12
humano coradas com DAPI. (A) controle (B) laser 0,5 J/cm²; (C) a laser
1,0 J/cm². Aumento original x40 .................................................................
42
13
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros do laser utilizado ..................................................... 35
Tabela 2. Análise do crescimento das células-tronco do ligamento periodontal humano em cada intervalo de tempo após a lasertarpia nos diferentes grupos estudados. (Média e desvio-padrão) ............................. 40
Tabela 3. Percentual de viabilidade das células-tronco do ligamento periodontal humano submetidas ou não a irradiação nos diferentes tempos estudados ....................................................................................... 40
14
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ATP Adenosina trifosfato
ºC Graus Celsius
CD Marcador de superfície celular
CO2 Gás carbônico
CT Células-tronco
DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole)
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
FBS Soro Fetal Bovino
FGF Fator de crescimento fibroblástico
LBI Laser de baixa intensidade
LP Ligamento periodontal
J/cm² Joules por centímetros quadrados
mg/mL Miligramas por mililitro
ml Mililitro
mm Milímetro
MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]
mW Miliwatts
µg/ml Microgramas por mililitro
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
15
nm Nanômetros
pH Potencial hdrogênio iônico
P3 Terceiro subcultivo
RNA Ácido ribonucleico
RPM Rotações por minuto
U.I/ml Unidade internacional por mililitro
α-MEM Meio essencial mínimo tipo alfa
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 17
2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................. 19
2.1 Células-tronco................................................................................................. 19
2.1.1 Células-tronco do ligamento periodontal.............................................. 20
2.2 Laser e laserterapia ....................................................................................... 21
2.2.1 Aspectos históricos do laser ................................................................. 24
2.2.2 Mecanismo molecular do LBI na proliferação celular .......................... 25
2.2.3 Ação do LBI nas células em cultura ..................................................... 27
3 OBJETIVOS............................................................................................................ 31
3.1 Objetivos gerais.................................................................................................... 31
3.2 Objetivos específicos............................................................................................ 31
4 METODOLOGIA..................................................................................................... 32
4.1 Implicações éticas.......................................................................................... 32
4.2 Tipo de estudo................................................................................................ 32
4.3 Amostra.......................................................................................................... 32
4.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra........................................; 32
4.4 Local............................................................................................................... 33
4.5 Cultivo celular................................................................................................. 33
4.5.1 Obtenção e armazenamento dos dentes.............................................. 33
4.5.2 Obtenção das células-tronco do ligamento periodontal........................ 33
4.6 Irradiação laser............................................................................................... 34
4.7 Análise do efeito da irradiação laser na proliferação celular......................... 37
4.8 Análise do efeito da irradiação laser no núcleo das células.......................... 38
4.9 Análise estatística........................................................................................... 38
5 RESULTADOS........................................................................................................ 39
5.1 Efeito da Irradiação Laser na proliferação celular........................................ 39
5.2 Efeito da Irradiação Laser no núcleo celular................................................. 41
6 DISCUSSÃO........................................................................................................... 43
7 CONCLUSÃO.......................................................................................................... 48
8 REFERÊNCIAS....................................................................................................... 49
ANEXO
APÊNDICE
17
1. INTRODUÇÃO
Células-tronco de origem dental foram identificadas na polpa de dentes
permanentes (GRONTHOS et al., 2000), na polpa de dentes decíduos (MIURA
et al., 2003), na papila apical (BAKOPOULOU et al., 2011) e também no
ligamento periodontal (KRAMER et al., 2004; SEO et al., 2004). As células-
tronco do ligamento periodontal são células de fácil isolamento e obtenção que
possuem capacidade de se diferenciar em osteoblastos, fibroblastos e
cementoblastos, sendo essenciais para a reparação dos tecidos periodontais
(SEO et al., 2004; CHEN et al., 2006).
Para aplicação clínica das células-tronco mesenquimais é necessário
que, após a obtenção, um número adequado de células seja conseguido por
proliferação in vitro, visto que o rendimento dessas células normalmente é
baixo (HORVÁT-KARAJZ et al., 2009).
O laser de baixa intensidade (LBI) tem sido utilizado em diversas
situações clínicas, tais como cicatrização de mucosa, ulcerações cutâneas,
dermatites e mucosites (BOUVET-GERBETTAZ et al., 2009), apresentando
resultados satisfatórios. Em virtude das baixas densidades de energias e
comprimentos de onda utilizados, o LBI é capaz de penetrar facilmente nos
tecidos resultando em síntese de fatores de crescimento, aumento da atividade
e proliferação celular, produção de colágeno e angiogênese (LI, CHEN e
WANG, 2006).
A capacidade que o LBI apresenta de estimular a proliferação dos mais
diferentes tipos celulares tem sido relatada como o seu mais importante efeito
fisiológico (WU et al., 2011). A literatura mostra um aumento na taxa
proliferativa, estimulada pelo LBI, em tipos celulares como fibroblastos
(POGREL, CHEN e ZHANG, 1997; MOORE et al., 2005; HAWKINS e
ABRAHAMSE, 2006), células endoteliais (SCHINDL et al., 2003; MOORE et al,
2005), osteoblastos (FUJIHARA, HIRAKI e MARQUE, 2006), células epiteliais
(EDUARDO et al., 2007), linfócitos (BENEDICENTI et al., 2008) e
queratinócitos (POGREL, CHEN e ZHANG 1997; GROSSMAN et al., 1998).
No que se refere a aumento na taxa de proliferação de células-tronco
mesenquimais, a literatura mostra a influência positiva do o LBI em células-
18
tronco da medula óssea (BOUVET-GERBETTAZ et al., 2009; SOLEIMANI et
al., 2011; WU et al., 2011) e tecido adiposo (MVULA et al., 2008; MVULA,
MOORE e ABRAHAMSE, 2010; VILLIERS, HOURELD e ABRAHAMSE, 2011).
Todavia, muito pouco ainda se sabe sobre a ação da laserterapia sobre as
células-tronco adultas originadas de outros sítios. Em um dos poucos estudos
disponíveis na literatura, Eduardo et al (2008) verificaram um aumento na
proliferação de células-tronco da polpa de dente permanente, quando
irradiadas com LBI.
A utilização de métodos que busquem aumentar a taxa de proliferação
de células-tronco dentais, fazendo com que se tenha um maior número de
células em um menor intervalo de tempo, pode ser de grande importância para
a medicina regenerativa. Assim, o objetivo deste estudo é avaliar o efeito da
irradiação do LBI na taxa proliferativa de células-tronco do ligamento
periodontal humano.
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Células-tronco
As células-tronco são comumente definidas como células indiferenciadas
que, quando induzidas corretamente, apresentam grande capacidade de auto-
renovação e de diferenciação em tipos celulares especializados (BARRY, 2003;
HOFFMAN e CARPENTER, 2005; FRESHNEY, STACEY e AUREBACH,
2007). Baseado em sua capacidade de originar um ou mais tipos celulares
especializados, são classificadas em diferentes níveis de potencialidade,
incluindo a totipotência do zigoto, a pluripotência de uma célula-tronco
embrionária, a multipotência de uma célula-tronco do tecido adulto e a
unipotência de tipos celulares específicos (KRABBE, ZIMMER e MEYER, 2005;
SERAKINCI e KEITH, 2006).
As células-tronco (CT) embriononárias pluripotentes, procedentes do
embrioblasto durante a fase de blástula do embrião, são capazes de dar origem
a todas as linhagens celulares do corpo, sendo esta a sua maior vantagem
(SOUZA et al., 2003). Contudo, a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade
de sua transplantação para hospedeiros imunocomprometidos e o risco de
formação de teratocarcinomas, além da questão ética, são algumas
desvantagens da sua utilização (SOARES et al., 2007).
Por outro lado, as CT adultas multipotentes são capazes de originar
tipos celulares específicos (SOUZA et al., 2003), mas apresenta como
vantagem o fato de serem autogênicas, não incorrendo em limitações
responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro ou mesmo
questões ético-legais. No entanto o fato de não serem pluripotentes, a
dificuldade de obtê-las, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença
em menor quantidade nos tecidos, têm sido relatadas como desvantagens da
utilização de células-tronco adultas (RISBUD e SHAPIRO, 2005).
Diversos tecidos e órgãos são considerados como fontes de células-
tronco adultas, tais como: medula óssea (BIANCO et al., 2001), tecido adiposo
(MVULA et al., 2008), cordão umbilical (KERN et al., 2006), sangue, córnea,
retina e pâncreas (SLACK, 2000). Há alguns anos, inúmeros estudos têm
isolado células-tronco derivadas dos tecidos orais, dentre os quais podemos
20
citar a polpa de dentes permanentes (GRONTHOS et al., 2000), a polpa de
dentes decíduos (MIURA et al., 2003) e o ligamento periodontal (AKIZUKI,
2005; CHEN et al., 2006; NAGATOMO et al., 2006;).
2.1.1 Células-tronco do ligamento periodontal
O ligamento periodontal (LP) é um tecido conjuntivo especializado não
mineralizado que, juntamente com o cemento e o osso alveolar, compõe o
periodonto de sustentação. Esse tecido tem origem ectomesenquimal, é
altamente vascularizado e atua na manutenção da homeostase, sustentação
do dente no alvéolo, propriocepção, transmissão das forças oclusais e
reparando danos teciduais causados pela doença periodontal ou por trauma
mecânico (SHIMONO et al., 2003). O LP contém uma população celular
heterogênea, incluindo fibroblastos, cementoblastos, osteoblastos, células
endoteliais e epiteliais (LEKIC et al., 2001), além de constituir uma das fontes
de células-tronco adultas (CHEN et al., 2006).
Melcher em 1976, observando que as células presentes no ligamento
periodontal eram capazes de formarem fibroblastos, cementoblastos e
osteoblastos, foi o primeiro a propor o conceito de que células mesenquimais
indiferenciadas poderiam estar presentes neste tecido (BARTOLD, SHI e
GRONTHOS, 2000). Deste então, diversos estudos vêm sendo realizados a fim
de avaliar a capacidade regeneradora das células do ligamento periodontal
(SEO et al., 2004; NAGATOMO et al. 2006; GAY, CHEN e MACDOUGALL,
2007).
Seo et al. (2004) levantaram a hipótese de que o ligamento periodontal
pode conter células indiferenciadas multipotentes, que podem ser usadas para
regenerar o cemento e o ligamento periodontal in vivo. Os autores isolaram
células do ligamento periodontal de terceiros molares extraídos de humanos e
as analisaram através da técnica imunohistoquímica, para identificar
marcadores de células-tronco. Os resultados desta pesquisa mostraram que as
células do ligamento periodontal expressaram os marcadores de células-tronco
mesenquimais STRO-1 e CD146/MUC18 e, em condições de cultura,
diferenciaram- se em cementoblastos, adipócitos e fibroblastos.
21
Nagatomo et al. (2006) também observaram resultados semelhantes em
células obtidas do ligamento periodontal de pré-molares e terceiros molares
humanos. A análise por fluorescência ativada revelou que essas células
expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166 e STRO-1.
Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo em células do
ligamento periodontal humano que expressavam STRO-1, com o objetivo de
analisar sua capacidade de diferenciação em osso, cartilagem e tecido
adiposo. Células da medula óssea foram usadas como controle nas mesmas
condições de cultivo e indução. Os autores concluíram que o ligamento
periodontal contem células mesenquimais com potencial de se diferenciarem
em osteoblastos, condrócitos e adipócitos, semelhantes às células-tronco da
medula óssea.
2.2 Laser e laserterapia
O laser é uma forma de radiação não ionizante, não invasiva, sendo
altamente concentrada, que em contato com os diferentes tecidos resulta em
efeitos térmicos, fotoquímicos ou não lineares, dependendo do seu tipo. A
palavra LASER é um acrônimo de Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation, que significa amplificação da luz por emissão estimulada de
radiação (SULEWSKI, 2000), esse significado expressa bem a forma pela qual
essa luz é produzida.
De acordo com a sua potência e a capacidade de interação com os
tecidos biológicos, os lasers podem ser classificados em laser de baixa
intensidade ou laser terapêutico (Low Intensity Level Treatment) e laser de alta
intensidade ou laser cirúrgico (Hight Intensity Laser Treatment) (NEVES et al.,
2005). Os lasers de baixa intensidade são absorvidos pelos tecidos e
estimulam um efeito biomodulador, enquanto que os de alta potência atuam por
meio do aumento da temperatura e produção de calor (JORGE, CASSONI e
RODRIGUES, 2010).
O laser é um dispositivo composto por substâncias denominadas de
meio ativo, sendo estas essenciais para sua produção. O meio ativo pode ser
um gás, um sólido, um líquido ou ainda uma associação, que quando excitados
por uma fonte de energia externa, geram luz. Dessa forma a luz do laser pode
22
ser definida como sendo um conjunto de fótons que seguem uma trajetória
ondulatória apresentando características especiais de unidirecionalidade,
coerência e monocromaticidade (CATÃO, 2004).
Miserendino e Pick (1995) citam esses fatores como sendo propriedades
únicas e que diferem a luz do laser da luz comum. Neves et al. (2005) definem
unidirecionalidade como a trajetória paralela que os feixes luminosos seguem
entre si, não havendo divergência de seus feixes (Figura 1); coerência como
sendo a propagação na mesma direção dos feixes luminosos, possuindo picos
e vales da sua trajetória coincidente no tempo, espaço e freqüência (Figura 2) e
monocromaticidade como sendo a característica de que todas as ondas da luz
possuir uma mesma cor, ou seja, um mesmo comprimento de onda (Figura 3).
Figura 1. Unidirecionalidade dos feixes luminosos da luz laser. Fonte: Neves et al., 2005
Figura 2. Coerência da luz laser. (A) comprimentos de onda coerentes no tempo e no espaço; (B) comprimentos de onda incoerentes no tempo e no espaço. Fonte: Neves et al., 2005
Figura 3. Monocromaticidade da luz laser. Fonte: Neves et al., 2005
23
Os lasers são nomeados de acordo com o meio ativo pelo qual são
estimulados. Atualmente, diferentes meios ativos estão disponíveis e cada
meio resulta em um tipo diferente de radiação ou comprimento de onda. O
laser de baixa intensidade pode ser composto de um meio sólido, utilizado com
uma combinação de Gálio (Ga), Arsênio (Ar), Alumínio (Al) e Indio (In), ou de
um meio gasoso, através de uma combinação de Hélio (He) e Neônio (Ne)
(PROCKT, TAKAHASHI e PAGNONCELLI, 2008).
A laserterapia pode ser realizada em dois diferentes espectros, estes
são estabelecidos a partir do comprimento de onda utilizado. O espectro de
ação vermelho ou visível apresenta comprimento de onda na faixa aproximada
de 630 a 700 nm, já o infravermelho ou invisível comprimentos de onda
próximo ao 700 a 904 nm. Esses dois espectros apresentam mecanismos de
ação diferentes. Os lasers com comprimento de onda na faixa do visível atuam
primeiramente nas mitocôndrias e lisossomos, induzindo diretamente à síntese
de enzimas. Os que possuem luz infravermelha agem nas membranas
celulares através de alterações no potencial das mesmas, desencadeando
efeitos fotofísicos e fotoelétricos, responsáveis pela excitação de elétrons,
vibração e rotação de moléculas, que se traduzem no aumento da síntese
intracelular de ATP (LIZARELLI, 2005).
O meio ativo que compõe o laser influência diretamente com
comprimento de onda (espectro) que o mesmo consegue atingir. O espectro de
luz visível é representado pelo Hélio-Neônio (HeNe), salientado por Tunér e
Hode (1999) como um tipo de laser altamente colimado. Ainda no que se refere
a radiação visível, Guirro e Guirro (2002) relatam a disponibilidade no mercado
nacional o laser de Alumínio-Gálio-Índio-Fósforo (AlGaInP), com comprimento
de onda de 630 e 685 nm na forma de onda contínua. Já os lasers
infravermelhos são constituídos fundamentalmente pelo Arseneto de Gálio
(AsGa), com comprimento de onda de 904 nm na forma de onda pulsada e o
Arseneto de Gálio-Alumínio (AsGaAl), com comprimento de onda de 780 e 870
nm na forma de onda contínua.
Para que o efeito sobre o tecido irradiado seja efetivo, diversos
parâmetros devem ser avaliados, como: comprimento de onda, densidade de
energia ou dose (quantidade de energia por unidade de área transferida ao
24
tecido), potência (valor dado pelo fabricante em watts), densidade de potência
(potência de saída da luz por unidade de área medida em watts dividido por
centímetros quadrados) e intervalo de aplicação (MOORE et al., 2005).
Outra característica relevante que os lasers apresentam, refere-se ao
seu modo de funcionamento. Dessa forma existem os lasers de ondas
contínuas, que quando acionados permanecem ligados continuamente até
serem desligados e os lasers de ondas pulsada, que mesmo após serem
acionados permanecem parte do tempo ligados e outra parte desligados,
fracionando a liberação da luz durante o intervalo de aplicação (ALMEIDA-
LOPES, 2003).
A LBI geralmente utiliza baixas densidades de energias e comprimentos
de onda, porém suficientemente alta para desencadear na célula alvo o
processo de biomodulação, ou seja, a energia é capaz de penetrar facilmente
nos tecidos, resultando em aumento da atividade, proliferação e regeneração
celular, síntese de fatores de crescimento, produção de colágeno,
angiogênese, além de analgesia e efeito antiinflamatório (LI, CHEN e WANG,
2006). Tem sido relatado que a magnitude do efeito de bioestimulação do laser
depende do comprimento de onda utilizado, bem como do estado fisiológico da
célula no momento da irradiação (PINHEIRO et al., 2002).
A ação dos diferentes comprimentos de onda no metabolismo celular
varia segundo a posição que ocupam no espectro de radiações
eletromagnéticas, e que sua ação sobre as células é diferente para os
comprimentos de onda vermelhos e para os infravermelhos (KARU, 1998).
2.2.1 Aspectos históricos do laser
Apesar de nos últimos anos o interesse pela laserterapia ter crescido
bastante, os primeiros relatos da utilização desta técnica datam do início do
século XX, já com resultados satisfatórios. Em 1903, Finsen recebeu o Prêmio
Nobel após conseguir avançar no tratamento do lupus vulgar utilizando
fototerapia com uma fonte de luz ultravioleta (RIGAU, 1996 apud ALMEIDA-
LOPES, 2003). Em 1917, o físico alemão Albert Einstein expôs os princípios
físicos da emissão estimulada, postulando as bases teóricas sobre a
manipulação controlada de ondas de luz (Catão, 2004).
25
Baseado nas teorias apresentadas por Einstein, em 1960 o cientista
americano Theodore H. Maiman teria construído o primeiro laser da história,
tendo como meio ativo uma barra de rubi sintético, que produzia uma luz curta
e de alta densidade de energia, operando em 694,3 nm quando uma luz
comum intensa incidia sobre ela. Porem foi Gould, em 1961, quem obteve a
patente de aplicação, fato que trouxe discussão acerca do verdadeiro inventor.
Nesse mesmo ano a primeira aplicação da laserterapia foi realizada, sendo o
campo da oftalmologia o primeiro a desfrutar dos seus benefícios e das
primeiras complicações clínicas. Em 1962, Dulberger publicou um trabalho
sobre lesões retinais produzidas pela focalização da luz tendo como
conseqüência a perda da visão (GOLDMAN, 1981 apud ALMEIDA-LOPES,
2003).
Os primeiros relatos da utilização do laser de baixa potência são de
1965, por Sinclair e Knoll. Nesse mesmo ano o laser foi utilizado pela primeira
vez na Odontologia por Stern e Sognnaes. Taylor, em 1968, relatou os
primeiros efeitos de tal radiação sobre os tecidos bucais em animais de
experimentação e em humanos, observando em seus experimentos o efeito do
laser de cristal de Rubi nos dentes e na mucosa (SULEWSKI, 2000). O
emprego do laser no processo de reparação dos tecidos foi também estudado
por Mester em 1968 (SULEWSKI, 2000; HENRIQUES et al., 2008).
Nos últimos anos, vários estudos científicos demonstraram os efeitos
benéficos da bioestimulação promovida pelo laser, quando aplicado em
diversas situações clínicas na Medicina e Odontologia, promovendo uma
recuperação mais rápida e menos dolorosa.
2.2.2 Mecanismo molecular do LBI na proliferação celular O mecanismo de ação do LBI no sistema biológico envolve, inicialmente,
a fotoativação de uma molécula fotorreceptora da célula seguida de absorção
da luz e o desencadeamento de dois mecanismos básicos (primários e
secundários). Os mecanismos primários ainda não se encontram bem
esclarecidos na literatura, porém as hipóteses prováveis incluem a formação de
oxigênio singlete (espécie eletronicamente excitada da molécula de oxigênio),
modificações das propriedades do estado redox, presença de óxido nítrico,
26
aumento da temperatura local por tempo determinado ou superprodução de
ânions superóxidos. Já os mecanismos secundários, compreendem a conexão
entre a fotorresposta dos receptores localizados nas mitocôndrias e a síntese
de DNA e RNA no núcleo celular (KARU, 2008). Para Xu et al., (2008) as
alterações na função dos fotorreceptores são as reações primárias, e as
alterações subseqüentes na sinalização e função celulares são reações
secundárias.
Tentando explicar o efeito da bioestimulatorio do LBI em nível molecular,
Karu (1998) propôs uma cadeia de eventos moleculares a partir da absorção
de luz por um fotorreceptor levando à fotoativação de enzimas na mitocôndria,
incluindo a transdução de sinal e eventos de amplificação, terminando com a
foto-resposta. Segundo o mesmo autor, a luz é absorvida pelos componentes
da cadeia respiratória, levando a mudanças nas mitocôndrias e no citoplasma.
Em baixas doses de laser, Ca²+ adicional é transportado para o citoplasma por
um processo que estimula síntese de DNA e RNA, mitose e proliferação
celular. Em altas doses, muito Ca2+ é liberado, resultando em hiperatividade da
ATPase, bombas de cálcio e consequentemente degradação do ATP presente
na célula e inibição do metabolismo celular (SCHINDL et al., 2000). Segundo
Friedmann et al., (1991) a liberação de Ca2+ ocorre a partir da força motriz
protónica e que além da liberação de Ca2+ verifica-se também um aumento de
curto prazo no pH intracelular.
O efeito bioestimulante do LBI resulta em um aumento na
microcirculação, altas taxas de produção para a síntese de ATP, RNA e DNA,
melhorando assim a oxigenação, nutrição e regeneração celular. Há também
um aprimoramento no sistema mitocondrial de transporte de elétrons (YU et al.,
1997) Fótons entram na célula e são facilmente absorvidos pelos cromóforos
localizados na mitocôndria e na membrana celular. Estes cromóforos interagem
fortemente com a irradiação laser. A energia fotônica é convertida em energia
química dentro da célula, na forma de ATP, o que melhora as funções celulares
e a taxa de proliferação. A permeabilidade da membrana celular é alterada,
seguida por alterações fisiológicas nas células-alvo (PINHEIRO et al., 2002). O
incremento na síntese de ATP observado após a irradiação com o laser de
baixa intensidade tem importância salutar para o metabolismo celular,
27
especialmente quando a célula está em situação de estresse ou diante de uma
lesão tecidual (LIZARELLI, 2005).
Em se tratando da ação do laser nos diferentes espectros de luz, seu
efeito molecular parece ocorrer de forma distinta quando se compara a luz
vermelha com a infravermelha. A luz visível (vermelha) induz uma reação foto-
química, ocasionando em uma direta ativação da síntese de enzimas, tendo
como principal alvo os lisossomos e as mitocôndrias. As organelas não
absorvem luz infravermelha (espectro invisível), apenas as membranas
celulares apresentam respostas a esse estímulo, logo a luz infravermelha
causa alterações no potencial de membrana induzindo efeitos foto-físicos e
foto-elétricos, levando à excitação dos elétrons e a um aumento na síntese de
ATP (ALMEIDA-LOPES et al., 2001).
2.2.3 Ação do LBI nas células em cultura
A LBI tem sido utilizada tanto no espectro de luz vermelho quanto
infravermelho, mas os resultados mais eficazes vêm do espectro visível,
variando de 600 a 700 nm (WILDEN e KARTHEIN, 1998). Em vários estudos in
vitro observou-se que comprimento de onda de 860 nm estimulou a
proliferação celular (BOLTEN, YOUNG e DYSON, 1995), de 812 nm aumentou
a síntese de DNA (LOEVSHALL e RENHOLT-BINDSLEV, 1994), de 660 nm
aumentou a produção de fator de crescimento fibroblástico (YU, NAIM e
LANZAFAME, 1994), e de 632,8 nm induziu transformação de fibroblastos em
miofibroblastos (POURREAU-SCHNEIDER et al., 1990). Também foi
observado que uma luz laser de 632,8 nm, quando aplicada em culturas de
queratinócitos, aumenta a proliferação celular (STEINLECHNER e DYSONM,
1993), estimula a liberação de IL-1 e IL-8 (YU et al., 1996) e aumenta a taxa de
motilidade (HAAS et al., 1990).
A fim de avaliar o efeito do laser com diferentes comprimentos de onda
(625, 635, 645, 655, 665, 675 e 810 nm) em dois tipos celulares (fibroblastos e
células endoteliais), Moore et al. (2005) avaliaram a taxa de proliferação celular
após um período de 72h de cultivo. Eles verificaram um aumento no
crescimento das células endoteliais em todos os comprimentos de onda
estudados; os fibroblastos também responderam de forma positiva para todos
28
os comprimentos de onda, exceto para o de 810 nm, sugerindo que tipos
celulares distintos podem responder de maneira diferente quando submetidos
aos mesmos parâmetros de irradiação.
Hawkins-Evans e Abrahamse (2008) obtiveram resultados semelhantes
aos verificado por Moore et al (2005) no que se refere a proliferação de
fibroblastos. Eles avaliaram comprimentos de onda de 632,8 e 830 nm e
verificaram um efeito estimulatório na proliferação desse tipo celular mais
efetivo quando tratados com laser de 632,8 nm, sugerindo que o comprimento
de onda interfere potencialmente na resposta celular.
Além do comprimento de onda, a bioestimulação in vitro é dependente
de outros fatores, tais como a potência (ALMEIDA-LOPES et al., 2001), a
densidade de energia (PEREIRA et al., 2002; KREISLER et al., 2003) e o tipo
de célula que está sendo irradiada (MOORE et al., 2005). Estes parâmetros
são úteis para aumentar a taxa de proliferação, porém eventualmente
promovem efeitos adversos sobre a síntese de proteínas (PEREIRA et al.,
2002). Portanto, é crucial identificar a combinação correta desses fatores para
atingir a taxa máxima de proliferação célular.
O efeito positivo LBI na proliferação e diferenciação das células em
cultura vem sendo observado em diversos tipos, como ceratinócitos,
fibroblastos, células endoteliais, mioblastos e osteoblasto, exibindo efeitos
biomodulatórios positivos (KREISLER et al., 2003; EDUARDO et al., 2007;
TUBY, MALTZ e ORON, 2007). No entanto, pouco se sabe sobre a ação da
laserterapia sobre as células-tronco mesenquimais (TUBY, MALTZ e ORON,
2007; EDUARDO et al., 2008; AIGHAMDI et al., 2012).
Tuby, Maltz e Oron (2007) demonstraram que a laserterapia promove a
proliferação de células-tronco mesenquimais e cardíacas in vitro. Foi utilizado
um laser diodo (AsGa) com comprimento de onda de 804 nm e doses de 1,0-
3,0 J/cm2. A proliferação de ambos os tipos celulares aumentou
significativamente após a aplicação do laser quando comparado ao grupo
controle não irradiado sem causar efeito adverso sobre essas células.
Hou et al (2008) usaram o LBI para aumentar a taxa de proliferação de
células-tronco mesenquimais da medula óssea a partir da utilização do laser
com comprimento de onda de 635 nm e doses de 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 J/cm2.
29
Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos não irradiados
e irradiados no que se refere à citotoxicidade. Por outro lado, a taxa de
proliferação das células-tronco mesenquimais da medula óssea foi
significativamente maior no grupo irradiado quando comparado com o grupo
controle, sendo a dose de 0,5 J/cm2 a mais efetiva.
Stein et al (2008) verificaram que o LBI com 670 nm e doses de 1,0
J/cm2 e 2,0 J/cm2 teve um efeito bioestimulatório positivo no crescimento e
diferenciação de osteoblastos humanos durante as primeiras 72 horas após
irradiação, obtendo melhores resultados quando irradiados com dose de 1,0
J/cm2.
Em relação às doses utilizadas na LBI, sabe-se que doses menores (2,0
J/cm2) estimulam a proliferação, enquanto que doses elevadas (16 J/cm2)
inibem este processo, indicando que a laserterapia apresenta um efeito dose
dependente nas respostas biológicas (HUANG et al., 2009). Vale resaltar que
cada tipo celular responde de maneira mais efetiva a parâmetros específicos
(dose) que devem ser avaliados a fim de se conseguir melhores resultados.
Villiers, Houreld e Abrahamse (2011) avaliaram a ação do laser diodo,
com 636 nm e 5,0 J/cm2 na proliferação de células-tronco mesenquimais de
tecido adiposo humano, sendo uma linhagem extraída a partir de procedimento
cirúrgico e uma outra comercial, as quais mostraram resultados completamente
distintos. Na linhagem comercial não houve diferença significativa em nenhum
dos tempos avaliados (24, 48 e 72 h), por sua vez, as células oriundas de
procedimento cirúrgico mostraram diferenças estatisticamente significativas na
proliferação celular nos tempos de 24 e 72 h pós-irradiação quando
comparadas com o controle não irradiado. Esses resultados sugerem que cada
linhagem responde de modo diferente ao efeito do laser.
Quando se trata da LBI em células de origem dental, um estudo
realizado com células-tronco da polpa de dentes decíduos demonstrou que a
irradiação dessas células com deficiência nutricional (10 e 5% de FBS),
utilizando comprimento de onda de 660 nm e 3,0 J/cm2, promoveu aumento na
proliferação celular. Porém quando se avaliou esse mesmo tipo celular em
condições nutricionais normais (15% de FBS), não houve diferença estatística
entre os grupos (EDUARDO et al., 2008).
30
Com o objetivo de avaliar a ação do LBI na liberação de fatores de
crescimento, fibroblastos gengivais humanos foram irradiados com dois
comprimentos de ondas (780 e 660 nm) e duas doses (3 e 5 J/cm²). Dessa
forma verificou-se que a libertação de fator de crescimento de queratinócitos foi
semelhante em todos os grupos, enquanto que a de fator de crescimento de
fibroblastos básico foi significativamente maior nos grupos tratados com laser
infravermelho. Concluiu-se que aumento da produção de fator de crescimento
de fibroblastos básico pode ser um dos mecanismos pelos quais o laser
infravermelho estimula a proliferação celular (DAMANTE et al., 2009).
A proliferação de fibroblastos gengivais humanos induzidas pelo LBI
também foi investigada a partir da irradiação (diodo, 664 nm, 56 mW) com
doses de 2, 5, 10 e 15 J/cm². Após seis dias verificou-se que as células
irradiadas com diferentes doses apresentavam uma taxa de proliferação
semelhante, sem diferença estatística, sendo que os melhores resultados
foram conseguidos com a dose de 2 J/cm² (ALMEIDA-LOPES et al., 2001).
31
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral:
O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de experimentos in
vitro, a influência do laser de baixa intensidade na proliferação de células-
tronco obtidas do ligamento periodontal humano.
3.2 Objetivos específicos:
Avaliar a influência do laser de baixa intensidade, aplicado nas doses de
0,5 e 1,0 J/cm2, na capacidade proliferativa das células-tronco do
ligamento periodontal humano;
Identificar a possível presença de alterações morfológicas nucleares
nessas células, quando submetidas à laserterapia.
32
4. METODOLOGIA
4.1 Implicações éticas:
O presente trabalho foi submetido à apreciação do comitê de Ética em
Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes - CEP/HUOL (CAAE:
02920412.4.0000.5292 – Apêndice). Todos os voluntários que aceitaram
participar da pesquisa receberam um Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) (Anexo), explicando a realização do estudo, os objetivos,
os riscos e os benefícios aos quais estariam expostos, de acordo com as
Diretrizes e Normas Regulamentadoras do Conselho Nacional de Saúde
(Resolução n° 196/96).
4.2 Tipo de estudo
Trata-se de um estudo de caráter experimental in vitro do tipo
longitudinal e controlado.
4.3 Amostra
Foram utilizados no experimento 02 (dois) dentes permanentes humanos
hígidos (terceiros molares), que seriam desprezados após a cirurgia, para a
obtenção das células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal.
Os dentes foram obtidos de pacientes que apresentaram indicação prévia de
exodontia por razões cirúrgicas e/ou ortodôntica.
4.3.1 Critérios de inclusão e exclusão
Foram incluídos na pesquisa dentes permanentes humanos hígidos,
extraídos por indicação cirúrgica e/ou ortodôntica, de pacientes de ambos os
sexos e qualquer faixa etária e que concordarem em participar voluntariamente
da pesquisa assinando o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
Foram excluídos do estudo os casos de paciente que apresentaram
alteração sistêmica ou bucal (ex: gengivite severa, abscessos, infecção
fúngica, bacteriana). Também foram excluídos os elementos dentários que não
se apresentaram hígidos após a exodontia (ex: fratura coronária e/ou radicular).
33
4.4 Local
A extração dos dentes e o seu processamento inicial (acondicionamento
em meio de cultura apropriado após as exodontias) foram executados na
disciplina de Cirurgia Buco-Maxilo-Facial do Departamento de Odontologia da
UFRN. O estudo experimental in vitro foi conduzido no laboratório de cultivo
celular do Departamento de Bioquímica da UFRN.
4.5 Cultivo celular
4.5.1 Obtenção e armazenamento dos dentes
Os dois dentes utilizados foram extraídos em sala de cirurgia apropriada,
utilizando técnicas cirúrgicas convencionais, obedecendo às rigorosas técnicas
assépticas. Em seguida, os elementos dentários foram imediatamente
armazenados em tubos tipo Falcon de 50 ml (TTP®, USA) contendo 10 ml de
meio de cultura alfa-MEM (Cultilab, Brasil) (Figura 4).
Em capela de fluxo laminar os dentes foram submetidos a três lavagens
de 15 minutos cada, com 10 ml de solução contendo meio alfa-MEM (Cultilab)
enriquecido com 10.000 U.I./ml de Penicilina (Gibco, USA), 10.000 µg/ml de
Estreptomicina (Gibco), 100 mg/ml de Gentamicina (Gibco) e 250 µg/ml de
Anfotericina B (Gibco), objetivando eliminar possível contaminação.
4.5.2 Obtenção das células-tronco do ligamento periodontal
A obtenção das células-tronco foi realizada com base no protocolo
utilizado por Vasconcelos et al (2012). As fibras do ligamento periodontal foram
cuidadosamente removidas através da raspagem delicada da superfície
Figura 4. Armazenamento do
elemento dentário em tubo falcon
de 50ml contendo meio de cultura
alfa-MEM para transporte.
34
radicular com o uso de uma lâmina de bisturi (Figura 5). O extrato celular foi
submetido à digestão enzimática com 3 mg/mL de colagenase (Gibco) e 4
mg/mL de dispase (Gibco), por 1 hora a 37°C. Em seguida a solução foi
aspirada e processada em filtro de 70 µm; a suspensão centrifugada a 1200
rpm durante 8 minutos e o sobrenadante retirado. As células precipitadas foram
então ressuspensas e cultivadas em placas de Petri de 60 mm de diâmetro
(TTP®), contendo meio básico α-MEM (Cultilab) suplementado com 15% de
soro fetal bovino – FBS (Cultilab). As culturas foram mantidas a 37ºC em 5%
de CO2 até atingirem 70 a 90% de confluência, com troca de meio a cada três
dias.
Figura 5. Remoção das células do ligamento periodontal dos terceiros molares (A). Digestão enzimática do extrato celular com dispase e colagenase (B).
Com a finalidade de identificar a natureza multipotencial das células
antes da laserterapia, as mesmas foram cultivadas em meios de diferenciação
osteogênico e adipogênico (StemPro® Differentiation Kits, Invitrogen Corp.,
Carlsbad, CA, USA) por até 21 dias. Após este período, as células exibiram, na
microscopia de luz, morfologia característica de células osteoblásticas e
adiposas.
4.6 Irradiação laser
No terceiro subcultivo (P3), as células foram cultivadas em placas 24 e
96 poços e irradiadas com um aparelho de Laser diodo (Kondortech – Bio
Wave LLLT Dual, Brazil), com as características apresentadas na Tabela 1.
A B
35
Tabela 1 - Parâmetros do Laser utilizado
Composição InGaAlP
Potência 30 mW
Comprimento de onda 660 nm
Modo de ação Contínuo
Diâmetro da ponta 0,01 cm2
Doses utilizadas 0,5 e 1,0 J/cm²
Tempo de irradiação 16 s (0,5 J/cm²) e 33 s (1,0 J/cm²)
Modo de aplicação sonda de irradiação perpendicular à placa, a
0,5 cm das células
As irradiações foram efetuadas nos intervalos 0 e 48 horas, onde o
tempo 0 corresponde a 24 horas após o plaqueamento celular (Figuras 6 e 7).
As análises da proliferação celular foram realizadas nos seguintes intervalos de
tempo: 0, 24, 48 e 72 horas após a primeira aplicação do laser.
Figura 6. Desenho experimental da irradiação das células.
36
Todo o experimento foi realizado em quadruplicata e o plaqueamento
celular foi feito de forma que entre os poços semeados houvesse um poço
vazio, diminuindo assim a dispersão de luz não intencional entre os poços
durante aplicação da laserterapia. As figuras 8 e 9 ilustram o plaqueamento
celular na placa de 24 e 96 poços, utilizadas para o teste do azul de tripan e
MTT, respectivamente.
Figura 8. Desenho esquemático da placa de 24 poços e plaqueamento das células objetivando diminuir a dispersão de luz não intencional entre os poços, sendo utilizadas duas placas de 24 poços para cada intervalo de tempo estudado.
Figura 7. Irradiação das células em cultura.
37
Figura 9. Desenho esquemático da placa de 96 poços e plaqueamento das células objetivando diminuir a dispersão de luz não intencional entre os poços.
4.7 Análise do efeito da Irradiação Laser na proliferação celular
Para análise do efeito da laserterapia na proliferação celular e obtenção
da curva de crescimento, tanto das células irradiadas quanto das não
irradiadas, foram utilizados os dados obtidos das contagens de células
aderidas às superfícies do plástico dos poços de cultivo celular nos intervalos
de 0, 24, 48 e 72 horas após a irradiação, sendo utilizados quatro poços para
cada grupo (grupo controle, grupo irradiado com 0,5 J/cm² e grupo irradiado
com 1,0 J/cm²). O número de células colhidas de cada poço foi obtido pela
contagem de células viáveis através do uso de hemocitômetro e o método da
exclusão de células coradas pelo azul de tripan, obedecendo-se a seguinte
equação matemática:
Finalmente, o percentual de viabilidade da população celular foi obtido
dividindo-se o número total de células viáveis pelo número total de células e o
resultado, multiplicado por 100.
Outro método utilizado para avaliar a viabilidade celular e traçar as
curvas de crescimento celular foi o ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] que avalia a atividade metabólica das
células quantificando a redução do MTT por desidrogenases associadas ao
Nº de céls.= Número de células viáveis X diluição X 104
Número de quadrados do hemocitômetro usado na contagem
38
NADPH e NADH, resultando na produção de cristais de formazam. Estes
cristais são solubilizados através da adição de DMSO e a sua concentração
pode ser determinada através de densidade óptica a 570 nm.
4.8 Análise do efeito da irradiação laser no núcleo das células
A marcação pelo DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindole) foi realizada no
intervalo de 72 horas após a primeira irradiação a laser, objetivando identificar
a presença de alterações nucleares, tais como núcleos picnóticos e
fragmentação nuclear, ou quaisquer outras alterações morfológicas nas
células. Esta técnica foi realizada tanto nas células irradiadas quanto nas não
irradiadas, que serviram como controle. Para isso as células foram cultivadas
em placas de 24 poços contendo lamínulas do mesmo diâmetro que os poços
de cultivo, após o período experimental (72 h) as lamínulas contendo foram
removidas coradas com o DAPI e montadas em lâminas para posterior análise
em microscópio de fluorescência.
O DAPI é conhecido por formar complexos fluorescentes com fitas
duplas de DNA, e devido a esta propriedade, é uma poderosa ferramenta em
várias investigações histoquímicas. Quando ligado ao DNA de fita dupla o DAPI
apresenta um pico de absorção máxima a um comprimento de onda de 538 nm
(ultravioleta), sendo sua emissão máxima a 465 nm (azul). Portanto, para
análise em microscopia de fluorescência o DAPI foi excitado através da
emissão de luz ultravioleta e detectado na presença de um filtro azul/ciano.
4.9 Análise estatística
Os dados quantitativos referentes às contagens celulares foram
submetidos à análise não paramétrica. A diferença entre os grupos para cada
um dos intervalos de tempo estudados (0, 24, 48 e 72 h) foi analisada pelos
testes estatísticos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, considerando-se um
intervalo de confiança de 95% (p<0.05).
39
5. RESULTADOS
5.1 Efeito da Irradiação Laser na proliferação celular
A curva de crescimento das células-tronco do ligamento periodontal
humano analisada pelo método de coloração por azul de tripan nos diferentes
grupos estudados é ilustrada na Figura 10. Todos os grupos apresentaram um
incremento na proliferação celular com o decorrer do tempo, sendo que o grupo
irradiado com dose de 1,0 J/cm2 exibiu maior tendência a proliferação quando
comparado aos demais, principalmente nas últimas 24 horas do experimento.
Figura 10. Curva de crescimento das células-tronco do ligamento periodontal humano submetidas ou não a irradiação com laser durante diferentes tempos de incubação.
Comparando-se a média do número de células dos grupos que
receberam laser com o grupo controle, apenas o grupo irradiado com a dose de
1,0 J/cm2 apresentou valores estatisticamente significativos nos dois intervalos
de tempo finais estudados (48 e 72 h). O grupo que recebeu a dose de 0,5
J/cm2 apresentou valores semelhantes aos encontrados no grupo controle em
todos os intervalos de tempo do estudo (Tabela 2).
Analisando apenas os grupos que receberam laser, percebeu-se
diferença estatisticamente significativa apenas nos intervalos de tempo de 48 e
72 h, com maior taxa de crescimento para o grupo de recebeu a dose de 1,0
Controle
Laser 0,5
Laser 1,0
40
J/cm2 (Tabela 2). Apenas a dose de 1,0 J/cm2 parece influenciar positivamente
a proliferação deste tipo celular.
Tabela 2. Análise do crescimento das células-tronco do ligamento periodontal humano em cada intervalo de tempo após a lasertarpia nos diferentes grupos estudados. (Média e desvio-padrão)
*Man-Whitney test; os números em negrito indicam diferença estatística (p<0.05)
A viabilidade celular, analisada a partir do método de coloração por azul
de tripan, mostrou-se semelhante tanto no grupo controle quanto nos grupos
irradiados em todos os intervalos de tempo analisados como apresentado na
tabela 3.
Tabela 3. Percentual de viabilidade das células-tronco do ligamento periodontal humano submetidas ou não a irradiação nos diferentes tempos estudados.
O padrão da atividade mitocondrial das células-tronco do ligamento
periodontal humano, analisado pelo ensaio do MTT, é ilustrado na figura 11. A
avaliação da atividade mitocondrial dos grupos irradiados (0,5 e 1,0 J/cm²)
apresentou comportamento semelhante ao verificado a partir do método de
coloração por azul de tripan, quando se compara os grupos irradiados. A dose
de 1,0 J/cm² foi significativamente melhor quando comparada com a de 0,5
J/cm² nos dois ultimos intervalos de tempo (48 e 72 h).
Controle Laser 0,5 Laser 1,0 p*
Média ± DP Média ± DP Média ± DP C vs. 0,5 C vs. 1,0 0,5 vs. 1,0
T0 2,5 ± 0,6 2,3 ± 0,9 1,8 ± 0,3 0,6423 0,0885 0,6423
T24 5,8 ± 0,3 5,0 ± 1,2 5,5 ± 0,6 0,6423 0,6423 0,6423
T48 6,8 ± 0,3 7,8 ± 0,9 9,8 ± 0,9 0,0885 0,0284 0,0284
T72 14,8 ± 3,2 16,3 ± 3,2 25,3 ± 6,1 0,3065 0,0284 0,0284
Controle Laser 0,5 Laser 1,0
T0 100% 100% 90%
T24 88,5% 94,4% 96,2%
T48 100% 97,2% 100%
T72 96,6% 100% 100%
41
Figura 11. Proliferação das células-tronco do ligamento periodontal humano durante diferentes tempos de incubação. Os valores são médias de percentagens em relação ao controle ± DP. (*p<0,05).
5.2 Efeito da Irradiação Laser no núcleo celular
No que se refere a alterações morfológicas nucleares, após a coloração
com o DAPI nos três grupos estudados, não foi observada nenhuma alteração
morfológica no núcleo das células, sem a presença de fragmentações
nucleares e núcleos pignóticos, tanto das células do grupo controle quanto das
células irradiadas, o que sugere integridade do DNA (Figura 12).
* *
42
Figura 12. Micrografia das células-tronco do ligamento periodontal humano
coradas com DAPI. (A) controle (B) laser 0,5 J/cm²; (C) a laser 1,0 J/cm².
Aumento original x40.
43
6. DISCUSSÃO
A cultura de células tem sido bastante utilizada em diversos estudos in
vitro devido à sua facilidade de padronização das amostras, no que se refere à
parametros como pH, temperatura e pressão, além de se obter amostras
totalmente homogêneas (FRESHNEY, 2000). Nos ultimos anos, vários estudos
in vitro utilizando cultura de células têm avaliado a utilização de células-tronco
na reparação de tecidos (GRONTHOS et al., 2000; MIURA et al., 2003;
KRAMER et al., 2004; SEO et al., 2004). O presente estudo teve como foco o
ligamento periodontal humano, que é uma fonte bastante acessível para
obtenção de células-tronco. Estas apresentam potencialidade de diferenciação
em células específicas da cavidade oral (como cementoblastos) e outros tipos
celulares (como fibroblastos e osteoblastos), e têm sido foco de diversos
estudos visando à regeneração dos tecidos periodontais (KRAMER et al., 2004;
SEO et al., 2004; VASCONCELOS et al., 2012)
A aplicação clínica deste tipo celular, com a finalidade de reconstituir um
tecido perdido, pode ser bastante útil em processos regenerativos que
envolvem o periodonto de proteção e/ou suporte, no caso de pacientes
portadores de doença periodontal avançada. No entanto, um dos requisitos
necessários para o sucesso da terapia com células-tronco é a obtenção de
uma quantidade considerável do tipo celular de interesse. Como a maioria dos
tecidos apresenta uma quantidade reduzida destas células, uma terapia que
proporcione um aumento na taxa proliferativa das células-tronco em cultura, é
de grande interesse para a comunidade científica.
O LBI vem apresentando resultados satisfatórios no que diz respeito à
bioestimulação de diversas células em cultura como ceratinócitos, fibroblastos,
células endoteliais, mioblastos e osteoblasto (KREISLER et al., 2002; RENNO
et al., 2007; EDUARDO et al., 2007; STEIN et al., 2008) e ainda de células-
tronco mesenquimais (TUBY, MALT e ORON, 2007; EDUARDO et al., 2008;
AIGHAMIDI et al, 2012). Os resultados do presente estudo reforça a eficácia do
LBI em aumentar a proliferação de células-tronco in vitro.
Com relação ao efeito biomodulatório do LBI sobre células-tronco de
origem dental, a literatura é bastante escassa, não havendo inclusive nenhuma
44
investigação com células-tronco oriundas do ligamento periodontal. Após
irradiação com laser de baixa intensidade, alguns autores observaram maiores
taxas de proliferação de fibroblastos gengivais (KREISLER et al., 2003;
DAMANTE et al., 2009), células-tronco da polpa de dentes permanentes
(EDUARDO et al, 2008), além de células-tronco derivadas da medula óssea e
do tecido adiposo (MVULA et al., 2008; MVULA, MOORE e ABRAHAMSE,
2010; SOLEIMANI et al., 2011), o que também foi observado no presente
estudo.
No que se refere a irradiação de fibroblastos gengivais, é possível
encontrar resultados distintos na literatura. Uma maior secreção do fator de
crescimento fibroblástico (FGF) (DAMANTE et al., 2009) e maior taxa
proliferativa (KREISLER et al., 2003) foram resultados condizentes com um
efeito biomodulatório positivo promovido pelo LBI. Por outro lado, a diminuição
na quantidade de proteinas totais e principalmente de colágeno tipo I
(MARQUES et al., 2004) são características relacionadas a propriedades
inibitórias. Vale ressaltar que esses estudos utilizaram lasers com
comprimentos de onda no espectro infravermelho.
A laserterapia apresenta algumas controvérias na literatura,
especialmente referentes ao espectro de luz, à melhor potência de trabalho, à
dose e ao comprimento de onda ideais para se obter os resultados desejados
ou para a maximização desses resultados.
Nos estudos in vitro, observa-se que tanto o espectro de luz visível
quanto o invisível pode estimular a proliferação celular, porém a maioria dos
estudos que apresentam resultados satisfatórios utilizam o espectro de luz
visível (ALMEIDA-LOPES, 2003; EDUARDO et al., 2008; HORVAT-KARAJZ et
al., 2009; MVULA et al., 2010), o qual também foi objeto do presente estudo,
variando apenas a dose de irradiação, conseguindo-se assim resultados
satisfatórios com a dose de 1,0 J/cm².
O comprimento de onda utilizado durante a instituição da laserterapia
parece influenciar o seu efeito nas células em cultura. Estudos anteriores
demonstraram que comprimentos de onda no espectro de luz vermelha
variando entre 600 a 700 nm, contribuem com o aumento da proliferação e
diferenciação celular (WILDEN e KARTHEIN, 1998; TUBY, MALTZ e ORON,
45
2007; STEIN et al., 2008). Contrapartida, o espectro de luz infravermelho com
variação do comprimento de onda entre 810 a 830 nm tem sido associado a
inibição da taxa proliferativa de alguns tipos celulares (MOORE et al., 2005;
HAWKINS-EVANS e ABRAHAMSE, 2008). Baseado nesse fato, este estudo,
semelhante aos realizados por Horvat-Karajz et al. (2009) e Eduardo et al.
(2008), utilizou-se o comprimento de onda de 660 nm, o qual resultou em
efeitos estimulantes positivos.
Além do comprimento de onda, a dose é outro parâmetro que deve ser
considerado quando se deseja a bioestimulação celular. Tuner e Hoder (2007)
relataram que o processo de bioestimulação pode ser alcançado com doses
muito baixas como 0,001 J/cm2 até doses maiores, sendo referido 10 J/cm2.
Eduardo et al. (2008) obtiveram êxito na proliferação de células-tronco da polpa
de dentes permanentes utilizando comprimento de onda de 660 nm e dose de
3,0 J/cm2. De acordo com Karu (1987) o aumento da dose pode provocar
danos aos fotorreceptores e como resultado, o efeito biomodulatório do laser é
reduzido. Utilizando doses menores (0,5 e 1,0 J/cm2), o presente estudo
conseguiu promover a bioestimulação sem causar danos a morfologia do
núcleo celular, o que foi demonstrado pela colocação com DAPI das células
irradiadas. Assim, é provável que doses menores diminuam o risco de dano
celular e, no caso das células-tronco, contribuam para o aumento de sua
população, mantendo suas características inicias íntegras.
Além da dose, potência e comprimento de onda, outro ponto ainda
bastante controverso sobre o efeito da laserterapia, se refere à quantidade de
sessões ideais de aplicações do laser para as diferentes enfermidades. O que
verificou-se no presente estudo é que a potência de 30 mW apresenta efeitos
positivos quando associada a dose de 1,0 J/cm² e que doses menores que 1,0
J/cm² parecem não influenciar na taxa de proliferação celular para o tipo de
célula estudado. Com relação aos intervalos de aplicação do laser, baseado
nos resultados encontrados, pode-se afirmar que quando se deseja
proliferação celular o intervalo de 48h entre as aplicações parece ter efeito
positivo. O mesmo foi observado por Li et al. (2010) quando comparou a
proliferação de células-tronco da medula óssea irradiadas uma única vez e com
irradiações em um intervalo de 48h durante 13 dias.
46
Segundo Huang et al (2009) a laserterapia apresenta um efeito dose
dependente nas respostas biológicas e parece ter um efeito cumulativo a cada
nova dose aplicada. Neste estudo, esse fato se confirma pela forma que as
células responderam a laserterapia, uma vez que exibiram curva de
crescimento ascendente nas duas doses utilizadas, com ação cumulativa no
decorrer do tempo. A resposta celular foi mais evidente quando estas foram
irradiadas com dose de 1,0 J/cm2 do que 0,5 J/cm2, apresentando maiores
índices proliferativos nos últimos intervalos de tempo do estudo (T48 e T72),
após a segunda irradiação.
Assim como encontrado em nos resultados deste trabalho, Stein et al
(2008) verificaram melhores resultados no crescimento e diferenciação de
osteoblastos humanos durante as primeiras 72 horas de experimento, após
irradiação com comprimento de onda de 670 nm e dose de 1,0 J/cm2 e 2,0
J/cm2. Ademais, a dose de 1,0 J/cm2 foi mais eficaz em favorecer a proliferação
deste tipo celular nos intervalos de 48 e 72 horas, o que reforça os resultados
do presente estudo com relação ao espectro, comprimento de onda e dose
mais efetiva.
Com a finalidade de restaurar o tecido periodontal perdido, diversas
ferramentas têm sido utilizadas, entre elas o LBI e terapias com células-tronco.
Uma melhoria no potencial de regeneração do osso alveolar perdido vem
sendo demostrado por diversos autores, quando se utiliza a laserterapia como
tratamento alternativo na regeneração periodontal (OZCELIK et al., 2008; ABO-
ELSAAD et al., 2009). Por sua vez, a terapia com células-tronco de diversas
fontes vem apresentando resultados satisfatórios no que diz respeito a
regeneração dos tecidos periodontais de suporte (BARTOLD, SHI e
GRONTHOS, 2006; AKIZUKI et al., 2005).
Em resumo, os resultados deste trabalho mostraram que o LBI infuencia
positivamente a proliferação in vitro de células-tronco derivadas do ligamento
periodontal humano. Baseado nesses dados e na literatura é possível sugerir
que a associação da laserterapia com a engenharia tecidual utilizando células-
tronco pode melhorar os resultados já apresentados em estudos prévios de
regeneração periodontal. No entanto, mais experimentos são necessários para
a investigação de outros protocolos de aplicação do LBI, bem como os seus
47
efeitos sobre as funções celulares, estabelecendo-se assim parâmetros de
laserterapia que possam contribuir com resultados clínicos satisfatórios.
48
7. CONCLUSÃO
Com base nos achados desta pesquisa pode-se concluir que o LBI no
espectro de onda vermelho e dose de 1,0 J/cm2 é capaz de contribuir com
proliferação das células-tronco do ligamento periodontal humano sem causar
alterações morfológicas nucleares e que doses menores que 1,0 J/cm2
parecem não influenciar a taxa proliferativa dessas células.
49
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ANEXO – Termo de consentimento livre e esclarecido para obtenção dos dentes.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Convidamos você para participar da pesquisa sobre “Influência da laserterapia na
proliferação de células-tronco do ligamento periodontal humano” que tem por objetivo
avaliar o efeito do laser no crescimento das células-tronco ligamento periodontal (fibras do
dente), o que pode no futuro contribuir para o avanço no tratamento de doenças
periodontais.
A sua participação terá risco mínimo, nada além daquele que o procedimento cirúrgico
para extração dentária oferece, como inchaço, dor e sangramento. Você não será submetido a
nenhum procedimento (extra) além da cirurgia de remoção do dente, que pode ter sido
indicada porque o dente não erupcionou, por razões ortodônticas ou para prevenir reabsorção
das raízes do dente vizinho. Nós utilizaremos nesta pesquisa apenas terceiros molares (sisos)
que estejam sadios, porém você deve autorizar os pesquisadores a examinarem os seus
fragmentos teciduais (dentes removidos), que seriam tirados de sua boca e desprezados após
a cirurgia. Depois da remoção do ligamento periodontal (fibra do dente), seu dente será
descartado de modo adequado (lixo biológico), seguindo os mesmos procedimentos das
extrações convencionais. Depois de realizar os testes para avaliar como as células do dente
reagem ao laser, todas elas serão descartadas, assim não haverá armazenamento de material
biológico. Todas as informações confidenciais serão guardadas em local seguro e somente
usadas com o propósito científico, sem divulgação do seu nome.
60
Sua participação é voluntária, caso queira, você poderá desistir a qualquer momento,
sem que isso lhe traga prejuízo ou penalidade, basta que retire o seu consentimento em
participar.
A pesquisa deverá contribuir para o aumento do conhecimento na área de engenharia
de tecidos, que abrange um campo interdisciplinar onde princípios de engenharia e ciências
biológicas são utilizados para o desenvolvimento de substitutos biológicos capazes de
recuperar a função do ser vivo. A importância desta pesquisa, portanto, está no fato da
necessidade do desenvolvimento e aprimoramento, assim como, um melhor entendimento
para facilitar na escolha de tratamentos mais eficazes em regeneração tecidual, trazendo
assim, benefícios para a sociedade de um modo geral.
Você não terá nenhum gasto financeiro por qualquer procedimento executado por
essa pesquisa e terá direito a reembolso (ressarcimento) de qualquer gasto comprovadamente
que você tenha feito para a realização desse estudo, bem como será indenizado em caso de
dano comprovadamente ocorrido por sua participação na mesma.
Você receberá uma cópia desse termo no seu endereço via correio com aviso de
recebimento e qualquer dúvida a respeito da pesquisa poderá perguntar a Carlos Augusto
Galvão Barboza, no Camus Universitário S/N no Departamento de Morfologia do Centro de
Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Lagoa Nova, Natal/RN, fone (84)
3215-3431, celular (84) 9401-5955 e E-mail: [email protected]
Consentimento Livre e Esclarecido
Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos
e benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa “Influência da
laserterapia na proliferação de células-tronco do ligamento periodontal humano”.
Assinatura ou impressão
Digital do voluntário: _____________________________ Data:___/___/___
Assinatura do pesquisador: _________________________ Data:___/___/___
Quanto à ética dessa pesquisa poderá ser questionada ao Comitê de Ética em Pesquisa
do Hospital Universitário Onofre Lopes CEP/HUOL, pelo telefone 3342-5003.
