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AVALIAÇÃO DA APLICABILIDADE DE UM BIOSSENSOR
MICROBIANO PARA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO
BIODISPONIVEL EM AMOSTRAS DA BAÍA DE GUANABARA
GISELE DOS SANTOS COSTA
Rio de Janeiro
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
ESCOLA DE QUÍMICA
Pós-Graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos
2
AVALIAÇÃO DA APLICABILIDADE DE UM BIOSSENSOR
MICROBIANO PARA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO
BIODISPONIVEL EM AMOSTRAS DA BAÍA DE GUANABARA
GISELE DOS SANTOS COSTA
Tese submetida ao corpo docente do curso de
Pós-Graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do grau de
Doutor em Ciências.
.
Orientadores:
Andréa Medeiros Salgado, D.Sc.
Paulo Rubens Guimarães Barrocas, D.Sc.
Magali Christe Cammarota, D.Sc.
EQ/UFRJ
Rio de Janeiro
2015
3
FICHA CATALOGRÁFICA
Costa, Gisele dos Santos
Avaliação da aplicabilidade de um Biossensor microbiano para a determinação de mercúrio biodisponível em amostras da Baía de Guanabara
Rio de Janeiro, DEB, EQ/UFRJ, 2015. XVIII, 155, f.: il.
Tese (Doutorado em Ciências) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, 2015. Orientadores: Andréa Medeiros Salgado, Paulo Rubens Guimarães Barrocas e Magali Christe Cammarota. 1. Biossensor; 2. Bioluminescência; 3. Mercúrio biodisponível; 4. Baía de Guanabara
4
Gisele dos Santos Costa
AVALIAÇÃO DA APLICABILIDADE DE UM BIOSSENSOR MICROBIANO
PARA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO BIODISPONIVEL EM AMOSTRAS
DA BAÍA DE GUANABARA
Tese de doutorado apresentada ao corpo docente do curso de Pós-graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como dos requisitos necessário à obtenção
do grau de Doutor em Ciências.
Aprovada em:
Orientador(es):
____________________________________________ Andréa Medeiros Salgado, D.Sc.
____________________________________________
Paulo Rubens Guimarães Barrocas, D.Sc.
____________________________________________
Magali Christe Cammarota, D.Sc.
_____________________________________________ Juacyara Carbonelli Campos D.Sc.
____________________________________________ Karen Signori Pereira, D.Sc.
____________________________________________
Claudia Duarte da Cunha, D.Sc.
____________________________________________ Fernanda Ribeiro do Carmo Damasceno, D.Sc.
____________________________________________
Luana Queiroz Pinho, D.Sc.
Rio de Janeiro
2015
5
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço aos meus pais Sonia Maria e Antonio pelo apoio, amor, dedicação e ajuda em todas as horas. Nos últimos anos foram muitas horas ali me acompanhando, passei por problemas de saúde e duas cirurgias, foram seis meses nos quais eu não podia fazer nada sozinha, momentos muito difíceis de recuperação das cirurgias. Eu certamente não teria enfrentado sem o auxilio, amor, paciência e muita perseverança destas pessoas abençoadas.
Aos meus irmãos Maurício e Ricardo, por me lembrarem de sorrir neste processo todo, mesmo com toda tensão envolvida, não poderia deixar de agradecer aos meus sobrinhos Allan e Pedro que sempre me davam motivos para sorrir.
A todos da minha grande família por sempre movimentarem os ares da casa, mesmo quando eu só queria silêncio, mas é muito amor envolvido.
Ao meu namorado Leonardo, pelo amor, paciência e compreensão não só na fase complicada, com problemas de saúde, mas em todos os momentos de pesquisa, nos incansáveis experimentos, por todas as idas ao Fundão em feriados e fins de semana, obrigada por tudo!
Aos meus amigos pelos momentos de ternura e conforto nos estudos e pelas muitas conversas no telefone e na internet: Kelly Cristina, Kaitusha Giarola, Tilza, Juliana Louzada, Vânia Paula, Roberta Giovanini, Adriana Loeser, Verônica Parente, Carina Caputo, Priscila Abreu, Marcelle Pacheco, Erica Gaspar, Doris Campos, Luana Pinho, Juliana Leal, Karen Einsfeldt, Felipe Rodrigues, Elisângela Schneider, Guillermo Marini, Aldo Júnior, Livia Jatoba, Veronica Marinho, Karla Kitamura, Silvia Azevedo, Alline Coutinho, Verônica Marinho, Márcia Barbochler, pois conseguem entender a dificuldade da caminhada e por isso, me incentivam e apoiam.
Aos meus colegas de trabalho da Escola Municipal Professor Souza Carneiro: Fernanda Leal, Humberto Freitas, Hélio Novaes, Luana Machado, Alexandre Rodrigues, Ana Carolina, Alessandra, Ursula Zampier, e Teresa Stavele por dividirem os momentos complicados e todas as dificuldades envolvidas na educação pública, pelo apoio e incentivo para continuar nessa caminhada. E por muitas vezes me lembrarem de que é insano viver nessa correria.
Aos alunos de iniciação científica Josi Cláire, Juliana Mercadante, Renata Nalin e Luiz Ramos por serem muito dedicados e companheiros. Aos demais alunos e ex-alunos do laboratório pela amizade, carinho e pelo ânimo em cada experimento, mesmo quando dava errado, e ainda aos momentos alegres: Rafael, Rafaela, Mariana, Ana Carina, Gabrielle, Juliana, Francisca e ao Carlos.
Aos professores Andréa Medeiros Salgado, Magali Christe Cammarota, e Paulo Rubens Guimarães Barrocas, pela orientação, dedicação e apoio e pelos momentos de conversa e amizade.
Ao Laboratório de Biogeoquímica, no Departamento de Ecologia, IB/ CCS/UFRJ.
Ao Laboratório do Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental da ENSDP-Fiocruz.
Ao Laboratório de Geoquímica Ambiental da Universidade Federal Fluminense. À Escola de Química e à UFRJ e todos os seus docentes por contribuírem em
mais uma etapa da minha formação. Ao CNPq, pelo apoio financeiro.
6
“A problemática ambiental nos defronta com os desafios relativos aos estoques
de recursos materiais e energéticos e a questão fundamental da sua utilização no
longo prazo, o que impõe uma revalorização da dimensão territorial, regional e
espacial.”
Enrique Leff
7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Uso do mercúrio em pinturas e na alquimia 10
Figura 2: Algumas fontes emissoras de mercúrio e seu destino no ambiente. 17
Figura 3: Ciclo do Mercúrio em Ambientes Naturais. 20
Figura 4: Esquema da resistência bacteriana ao mercúrio baseado no operon mer A. 23
Figura 5: Esquema de Funcionamento de um Biossensor. 38
Figura 6: Esquema da inserção do promotor o transposon Tn 21. 44
Figura 7: Equipamento Luminoskan Ascent utilizado para Medição da Luminescência.
53
Figura 8: Esquema de Preparo das Células. 60
Figura 9: Esquema da lixiviação realizada nas amostras de sedimento. 63
Figura 10: Esquema de preparo de soluções das amostras após a lixiviação. 64
Figura 11: Mapa que apresenta os pontos de coleta na Baía de Guanabara. 67
Figura 12: Curva de Crescimento de Escherichia coli MC1061. 69
Figura 13: Correlação entre Absorbância e Peso Seco da E. coli MC1061. 70
Figura 14: Curva de Calibração de amostras de soluções de mercúrio em diferentes
concentrações (0,001 a 0,01 µg/L) preparadas em água deionizada. 73
Figura 15: Curva de Calibração de amostras de soluções de mercúrio em diferentes
concentrações (0,1 a 20 µg/L) preparadas em água deionizada. 73
Figura 16: Curva de Calibração de amostras de soluções de mercúrio em diferentes
concentrações (0, 001 a 1 µg/L) preparadas em água deionizada. 74
Figura 17: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos
meses de Abril (A,B), Maio (C.D) e Julho (E,F) de 2012. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
79
Figura 18: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Agosto (A,B), Setembro (C.D) e Outubro (E,F) de 2012. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
83
Figura 19: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos
meses de Novembro (A,B), Dezembro (C.D) de 2012. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
86
Figura 20: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Janeiro (A,B), Fevereiro (C,D) e Março (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho),
89
8
Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
Figura 21: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Abril (A,B), Maio (C,D) e Junho (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
93
Figura 22: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos
meses de Julho (A,B), Agosto (C,D) e Setembro (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
97
Figura 23: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas
nos meses de Outubro (A,B), Novembro (C,D) e Dezembro (E,F) de 2013. Pontos A
Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo
Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
101
Figura 24: Concentrações de mercúrio biodisponível nas amostras do ponto A. 103
Figura 25: Concentrações de mercúrio biodisponível nas amostras do ponto D. 104
Figura 26: Gráficos das curvas de calibração, Porto do Rio de Janeiro (losango azul) e Porto de Niterói (quadrado vermelho), Rio Iguaçu (triângulo verde) e Rio Meriti (círculo roxo) e as equações da reta, respectivamente.
112
Figura 27: Gráficos das curvas de calibração, Porto do Rio de Janeiro (triângulo
azul) e Porto de Niterói (quadrado vermelho) do Rio Iguaçu (triângulo verde) e Rio Meriti (círculo roxo) lixiviados com HCl 1M.
114
Figura 28: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de sedimento). 115
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Inventário da Emissão Antrópica de Mercúrio Total Global/Simulação por
Modelo de Transporte de Hg0. 14
Tabela 2: Contribuição de Diferentes Setores na Emissão de Mercúrio no Brasil
(1998 a 2002). 18
Tabela 3: Espécies de mercúrio e suas categorias. 21
Tabela 4: Transformações Mercuriais durante o Ciclo Biogeoquímico do Mercúrio. 24
Tabela 5: Métodos usados na Quantificação do Mercúrio 31
Tabela 6: Biossensores detectores de mercúrio mais recentes. 40
Tabela 7: Biossensores microbianos recombinantes usando genes luc ou lux como repórter luminescente.
43
Tabela 8: Equipamentos e reagentes. 52
Tabela 9: Etapas dos banhos de descontaminação. 53
Tabela 10: Meio Utilizado para o Experimento Luminométrico. 55
Tabela 11: Composição dos Meios LB Broth e LB Ágar. 56
Tabela 12: Soluções de mercúrio utilizadas no presente estudo. 57
Tabela 13: Localização dos pontos de coleta. 66
Tabela14: Resultados dos Ensaios Luminométricos em URL para a água
deionizada. 72
Tabela 15: Resultados dos ensaios de simulação com salinidade. 72
Tabela 16: Resultados dos Ensaios Luminométricos da curva de calibração com
soluções de mercúrio(0,001 a 20 µg/L). 72
Tabela 17: Resultados dos Ensaios Luminométricos da curva de calibração com
soluções de mercúrio (0,001 a 1 µg/L). 74
Tabela 18: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas no mês de
Abril, Maio e Julho de 2012. 78
Tabela 19: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Abril, Maio e Julho de 2012.
80
Tabela 20: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas no mês de Agosto, Setembro e Outubro de 2012.
82
Tabela 21: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Agosto, Setembro e Outubro de 2012.
84
Tabela 22: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Novembro e Dezembro de 2012.
85
10
Tabela 23: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Novembro e
Dezembro de 2012. 86
Tabela 24: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de
Janeiro, Fevereiro e Março de 2013. 88
Tabela 25: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Janeiro, Fevereiro e Março de 2013.
90
Tabela 26: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Abril, Maio e Junho de 2013.
92
Tabela 27: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Abril, Maio e Junho de 2013.
94
Tabela 28: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Julho, Agosto e Setembro de 2013.
96
Tabela 29: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Julho, Agosto e
Setembro de 2013. 98
Tabela 30: curva de calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de
outubro, novembro e dezembro de 2013. 100
Tabela 31: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de outubro,
novembro e dezembro de 2013. 102
Tabela 32: Resultados da Correlação de Spearman para A fundo, A meio e A
superfície, respectivamente. 108
Tabela 33: Resultados da Correlação de Spearman para D fundo e D superfície,
respectivamente. 108
Tabela 34: Resultados da Comparação dos métodos. 110
Tabela 35: Curva de calibração com amostras ambientais de sedimento do Porto do Rio de Janeiro e Porto de Niterói lixiviados com água da Baía de Guanabara.
111
Tabela 36: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de sedimento) no lixiviados com água da Baía de Guanabara.
112
Tabela 37: Curva de calibração com amostras ambientais de sedimento do Porto do Rio de Janeiro e Porto de Niterói lixiviados com HCl 1M.
113
Tabela 38: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de solo) no lixiviados com HCl 1M.
114
Tabela 39: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de sedimento). 115
Tabela 40: Custo de procedimento experimental de Análise usando Biossensor. 120
11
COSTA, Gisele dos Santos. Avaliação da Aplicabilidade de um Biossensor Microbiano para
Determinação de Mercúrio Biodisponível em Amostras da Baía de Guanabara. Rio de
Janeiro, 2010. Tese (Doutorado em Ciências) – Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, 2015.
O mercúrio pode ser considerado um dos elementos de maior potencial tóxico
graças à sua capacidade de bioacumulação e biomagnificação ao longo das
cadeias tróficas. O uso crescente do mercúrio pelo homem tem provocado
sensíveis alterações em seu ciclo biogeoquímico, comprometendo a saúde de
populações humanas expostas. A contaminação com algumas de suas espécies
químicas, como o metilmercúrio, tem causado um número significativo de mortes
humanas em várias partes do mundo. De tal modo que o reconhecimento do perigo
deste contaminante resultou em legislações mais rígidas e modificações de
processos tecnológicos em todo o mundo. A contaminação por mercúrio também
pode ser observada ao redor da Baía de Guanabara, na região sudeste do Brasil ,
pois esta possui atividades industriais e portuárias intensas, agregadas a um
complexo pólo petroquímico. Em virtude de diversas espécies de mercúrio
apresentarem comportamentos diferenciados, observou-se a necessidade de se
buscar métodos que fossem além da determinação quantitativa total. Neste contexto
procurou-se utilizar a técnica de sensores específicos, os biossensores, na qual se
procura identificar a espécie de mercúrio biodisponível. A cepa Escherichia coli
MC1061 foi aplicada na detecção da fração biodisponível do mercúrio presente em
amostras aquosas e sedimento. As amostras aquosas foram coletadas de abril/2012
a dezembro/2013, em dois locais da Baía de Guanabara, já o sedimento foi coletado
em quatro localidades (Porto do Rio de Janeiro, Porto de Niterói, Rio Iguaçu e Rio
Meriti). A bioluminescência produzida por Escherichia coli MC1061 se apresentou
como uma técnica analítica sensível com potencial de aplicação para detecção de
mercúrio biodisponível, pois os valores de desvio padrão em todos os ensaios foram
baixos com os valores de CV < 10% indicando baixa dispersão e valores
homogêneos, tanto nas amostras aquosas como nos sedimentos. Nos pontos A e D,
o mês de setembro de 2012 apresentou os maiores valores de mercúrio
biodisponível (0,352 a 0,765 µg/L). Sendo as amostras de superfície as que
apresentaram valores acima da Resolução CONAMA n° 357/ 2005 (0,2 µg/L). Nas
análises de correlação de Spearman duas variáveis apresentaram resultados
12
significativos no ano de 2012, pH no ponto A meio e salinidade no ponto D
superfície. Com relação à validação do método, foi possível obter 99% do mercúrio
biodisponível no biossensor microbiano e na metodologia tradicional. Os resultados
mostraram que os dois métodos de lixiviação testados foram capazes de lixiviar
mercúrio biodisponível das amostras de sedimento e, portanto, foi comprovado seu
potencial de aplicação. O sedimento do Rio Meriti apresentou uma fração de
mercúrio biodisponível maior que as outras amostras (0,847 μg/Kg de sedimento).
Os resultados obtidos comprovam a eficiência da tecnologia proposta e ainda, a
importância da avaliação da biodisponibilidade do metal no ambiente, para definir
normas ambientais aceitáveis, conduzir avaliações de risco ambiental, e ainda,
estabelecer políticas ambientais.
13
COSTA, Gisele dos Santos. Evaluation of applicability of a Microbial Biosensor for Determination of Mercury Bioavailable in samples of Guanabara Bay. Rio de Janeiro, 2015.
Thesis (Doctorate in Science) – Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2015.
The mercury can be considered one of the greatest potential toxic elements thanks to
its bioaccumulation potential and Biomagnification along the trophic chains. The
increasing use of mercury by man has caused significant changes in its
biogeochemical cycle, compromising the health of exposed human populations.
Contamination with some of its chemical species such as methylmercury, has caused
a significant number of human deaths around the world. Such that the recognition of
the danger of contaminating resulted in more stringent laws and modifications of
technological processes in the world. The mercury contamination can also be seen
around the Guanabara Bay, in southeastern Brazil, as this has intense industrial and
port activities, aggregate to a complex petrochemical complex. In view of various
species of mercury present different behaviors, there is a need to seek methods
which were beyond the total quantitative determination. In this context it is tried to
use a specific technique sensors, biosensors, in which one seeks to identify the
species of bioavailable mercury. The Escherichia coli strain MC1061 has been
applied in the detection of the bioavailable fraction of the mercury present in aqueous
and sediment samples. Aqueous samples were collected from April / 2012 to
December / 2013 in two locations of Guanabara Bay (points A and D), as the
sediment was collected in four locations (Port of Rio de Janeiro, Porto de Niterói, Rio
and Iguaçu Rio Meriti). The bioluminescence produced by Escherichia coli MC1061
introduced as a sensitive analytical technique with potential application for mercury
detection bioavailable because the standard deviation values in all the tests were
with low CV values <10% indicating low dispersion and homogeneous values in both
aqueous samples such as sediments. In A and D, the month of September 2012
showed the highest bioavailable mercury values (from 0.352 to 0.765 µg/L). Since
the surface of the samples that showed values above the CONAMA No. 357/2005
(0.2 µg/L). In Spearman correlation analysis two variables showed significant results
in 2012, pH at point A through point D and salinity in the surface. Regarding the
method validation, it was possible to obtain 99% of bioavailable mercury in microbial
biosensor and traditional methodology. The results showed that both leaching
methods tested were able to leach the mercury bioavailable pellet samples and thus
14
it was demonstrated its potential application. The Meriti River sediment had a
mercury bioavailable fraction larger than the other samples (0.847 μg/Kg pellet). The
results demonstrate the importance of evaluating the zinc bioavailability in the
environment, to define acceptable environmental standards, conduct environmental
risk assessments, and even establish environmental policies.
15
LISTA DE SIGLAS
AMP Adenosina Monofosfato
ATP Adenosina Trifosfato
ATSDR Agency for Toxic Substance and Disease Registry
BID Banco Internacional de Desenvolvimento
CCME Canadian Council of Ministers of the Environment
COD Carbono Orgânico Dissolvido
DQO Demanda Química de Oxigênio
CONAMA Conselho Nacional de Meio Ambiente
CV Coeficiente de Variação
CWA Clean Water Act
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DO Densidade Ótica
DO600 Densidade Ótica no Comprimento de Onda de 600 nm
DPC Diretoria de Portos e Costas
EMGEPRON Empresa Gerencial de Projetos Navais
EQ Escola de Química
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
GEF Global Environmental Facility
GFP Green Fluorescente Protein (Proteína Verde Fluorescente)
INEA Instituto Estadual do Ambiente
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
JICA Japan International Cooperation Agency
LB Luria Bertani
MeHg Metilmercúrio
NOAA National Oceanic and Atmospheric Administration
OMS Organização Mundial da Saúde
PDBG Programa de Despoluição da Baía de Guanabara
pH Potencial Hidrogeniônico
ppb Partes por bilhão (SI)
PPi Ânion Pirofosfato
URL Unidades Relativas de Luz
UV Ultravioleta
WHO World Health Organization
16
ÍNDICE GERAL
1: INTRODUÇÃO 1
2: OBJETIVOS 9
3: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 10
3.1 USOS DO MERCÚRIO AO LONGO DO TEMPO 10
3.2 PROPRIEDADES DO MERCÚRIO 11
3.3 FONTES DO MERCÚRIO 12
3.3.1 FONTES NO BRASIL 16
3.4 CICLOS BIOGEOQUÍMICOS 19
3.5 TOXICIDADE 23
3.6 ESPECIAÇÃO 30
3.6.1 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO 30
3.7 BIOSSENSOR COMO ELEMENTO DE DETECÇÃO 36
3.7.1. BIOSSENSORES MICROBIANOS 40
3.8 BAÍA DE GUANABARA 45
3.9 CONSIDERAÇÕES DO PRESENTE ESTUDO 50
4: MATERIAL E MÉTODOS 52
4.1 EQUIPAMENTOS E REAGENTES 52
4.1.1 DESCONTAMINAÇÃO QUÍMICA DOS MATERIAIS 52
4.1.2 LUMINOSKAN COMO ELEMENTO DE TRANSDUÇÃO 53
4.1.3 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS DE BIOLUMINESCÊNCIA 54
4.2 COMPONENTE BIOLÓGICO: ESCHERICHIA COLI MC1061 54
4.2.1 PREPARO DE MEIOS E SOLUÇÕES 54
4.2.1.1 MEIO MÍNIMO DE SAIS 55
4.2.1.2 MANUTENÇÃO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS 55
4.2.1.3 SOLUÇÃO DE LUCIFERINA 56
4.2.1.4 SOLUÇÕES DE MERCÚRIO 57
4.2.2 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO E CONSTRUÇÃO DA CURVA DE PESO SECO 58
4.2.2.1 CURVA DE CRESCIMENTO 58
4.2.2.2 DETERMINAÇÃO DO PESO SECO 58
4.2.2.3 PREPARO DAS CÉLULAS 59
4.3 CURVA DE CALIBRAÇÃO 60
17
4.3.1 BRANCOS REACIONAIS 60
4.3.2. CURVA DE CALIBRAÇÃO DE MERCÚRIO 61
4.3.2.1 SOLUÇÕES AQUOSAS 61
4.3.2.2 CURVA DE CALIBRAÇÃO DE MERCÚRIO EM AMOSTRAS REAIS 62
4.3.3 CURVA DE CALIBRAÇÃO EM SEDIMENTOS E MÉTODO DE LIXIVIAÇÃO 62
4.4 EXPERIMENTOS DE BIOLUMINESCÊNCIA 64
4.5 DETERMINAÇÃO POR VAPOR FRIO 65
4.6 ÁREA DE ESTUDO 65
4.6.1 LOCALIDADES 65
5: RESULTADOS E DISCUSSÃO 68
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA BACTÉRIA 68
5.1.1 DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO 68
5.1.2 CORRELAÇÃO ENTRE ABSORBÂNCIA E PESO SECO 69
5.2 AMOSTRAS REAIS 70
5.2.1 AMOSTRAS AQUOSAS 70
5.2.1.1CURVA DE CALIBRAÇÃO 71 5.2.1.2CURVA DE CALIBRAÇÃO DO MERCÚRIO NAS AMOSTRAS
AMBIENTAIS 75 5.2.1.3COMPARAÇÃO RESULTADOS OBTIDOS COM BIOSSENSOR COM
AMOSTRAS AQUOSAS E COM METODOLOGIA PADRÃO 109
5.2.2 AMOSTRAS DE SEDIMENTOS 110
5.2.2.1LIXIVIAÇÃO E CURVA DE CALIBRAÇÃO 111
5.2.2.1.1 LIXIVIAÇÃO COM ÁGUA DA BAÍA DE GUANABARA 111
5.2.2.1.2 LIXIVIAÇÃO DO HCL 1M 113
6: ANÁLISE DE CUSTOS DA TECNOLOGIA PROPOSTA 117
7: CONCLUSÕES 121
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 123
18
1. INTRODUÇÃO
Desde os primórdios de sua existência, o homem, como qualquer outra espécie
habitante do planeta, interage com o ambiente à sua volta, modificando-o e
transformando-o de acordo com suas necessidades. Os resultados dessa
modificação são facilmente percebidos ao longo da história. Ainda, nas últimas
décadas do século XX a preocupação com o ambiente tem se disseminado na
sociedade, a princípio individualmente, fluindo para as organizações sociais,
inclusive as escolas, desde o ensino fundamental.
A humanidade em sua narrativa apresenta descobertas de novas fontes,
domínio de técnicas, transformações e novas aplicações de energia. No trajeto do
seu desenvolvimento, desde as primeiras civilizações, tais descobertas
proporcionaram melhoria na qualidade de vida (como na Revolução Industrial, por
exemplo, que tornou possível a produção em larga escala, acarretando
transformações sociais e econômicas), e simultaneamente, o aumento dos impactos
antropogênicos no ambiente (LEFF, 2009).
O desenvolvimento da sociedade organizada sempre esteve vinculado ao
controle da água. Os rios, por exemplo, proporcionavam a água para beber,
facilitavam o deslocamento de pessoas e produtos, eram utilizados como fonte de
irrigação e de energia. Nos últimos cem anos, o desenvolvimento industrial
potencializou uma crescente capacidade de transportar e controlar a água, o que
resultou em um aumento da capacidade de consumir mais, desperdiçar mais e poluir
mais (PNUD, 2006).
Com o avanço da tecnologia, o grau de interferência no ambiente aumentou
bastante. Segundo CUNHA & GUERRA, (2012) estas interferências são efetuadas
de forma inadequada em todo mundo. São diversos os benefícios econômicos e
sociais que explicam a interferência humana nos ciclos naturais. No ciclo hidrológico,
as alterações afetam o funcionamento do sistema de bacia de drenagem (nos
depósitos e transferências das águas), a capacidade de absorção e distribuição das
águas nos seus trajetos originais (sejam fluviais ou litorâneos). Ocasionando
mudanças no relevo (erosão e deposição ficam com seu balanço alterado, este terá
sua duração alterada, encurtado ou acelerado). Estas alterações raramente são
19
sentidas somente no ponto em que ocorreu a interferência (CUNHA & GUERRA,
2012).
Nos ambientes marinhos, o conjunto de fatores que estabilizam os oceanos e o
controlam seu equilíbrio não está completamente compreendido, mas sabe-se que
impactos nestes ambientes poderão afetar ou transformar gravemente todo o
ambiente terrestre (CUNHA & GUERRA, 2012). Muitas das alterações sofridas nos
ambientes litorâneos devem-se principalmente aos fatores demográficos (as áreas
costeiras mundiais são densamente povoadas), e ainda, a própria fragilidade dos
ambientes litorâneos, muitas linhas costeiras são batidas por ondas de alta energia
(PEREIRA & SOARES-GOMES, 2002).
Desta forma, as interferências ocasionaram um aumento na introdução de
contaminantes no ambiente, liberados para atmosfera, solos, sedimentos e sistemas
aquáticos, na forma: de matéria orgânica, poluentes orgânicos e um grande número
de compostos metálicos (BOENING, 2000).
A consciência ecológica gerada no século XX promoveu políticas públicas em
matéria de meio ambiente e desenvolvimento sustentável, e iniciou o
estabelecimento de leis com níveis supostamente seguros para exposição humana a
diversos contaminantes (CARSON, 1962; CARVALHEIRA, 2012).
Entretanto, a crise ambiental segue avançando, se acentuando e se
complexificando (LEFF, 2009). Crise esta decorrente da crescente busca por
recursos naturais, do seu uso intensificado, e por vezes inadequado, das
tecnologias, aliado ao avanço das atividades industriais, por exemplo a extração e
mineração. Esses últimos são os frequentemente apontados como os responsáveis
pela contaminação dos diferentes sistemas: atmosféricos, aquáticos e terrestres
(LEFF, 2009; CUNHA & GUERRA, 2012).
As alterações provocadas nesses sistemas podem ser mais ou menos
abrangentes, localizadas ou extensivas, criando gradientes de interferência nos
macrocompartimentos da biosfera (CUNHA & GUERRA, 2012). Quando liberados
em grande quantidade no ambiente, os impactos podem ser imediatos, e a
recuperação pode ser lenta e gradual, cumulativa, sendo um tema preocupante
durante anos ou décadas. No que se refere aos riscos dos processos produtivos,
20
sobretudo aqueles causados pelos agentes químicos, geralmente ultrapassam os
limites da área física dos locais de trabalho (ACCIOLY & SIQUEIRA, 2000).
Considerar a manutenção da qualidade ambiental é questão decisiva para a
sociedade atual e para as gerações futuras. Atualmente a principal questão,
abordada pelas agências ambientais, não é se um ambiente está contaminado, mas
o quão grave é a contaminação (LACERDA & MALM, 2008). Os problemas e os
desafios são inúmeros na busca por soluções que, na sua grande maioria, seguem,
ainda, a ótica da remediação e da minimização dos danos ambientais. O
desenvolvimento de alternativas seguras exige mudanças de paradigmas, ações que
nos levam não à substituição de problemas, mas a uma real solução. Entende-se
que esta é a ótica correta para a busca de soluções para um real controle da
poluição ambiental (BARBIERE, 2007; CUNHA & GUERRA, 2012).
Em ecossistemas aquáticos, por exemplo, a poluição ambiental pode estar
associada à ineficácia nos tratamentos dos efluentes domésticos e industriais, e
ainda de adjuntos, como por exemplo, muitas regiões não possuem saneamento
básico.
Neste contexto está a Baía de Guanabara, um complexo estuarino, de
aproximadamente 400 km2, para vários rios e canais que cercam as cidades do Rio
de Janeiro, Duque de Caxias, São Gonçalo, Niterói e outras cidades menores. É
uma área importante com relação à produção pesqueira, que recebe efluentes
domésticos e industriais não tratados, sendo a região impactada por matéria
orgânica, óleo e um grande número de outros compostos, incluindo os metais
pesados (SEIXAS et al., 2007). Isso se deve à intensa atividade portuária, à
presença de um complexo pólo petroquímico, além do despejo de esgoto doméstico
e efluentes industriais não tratados, provenientes de uma área densamente
populosa com mais de 10.000 indústrias (JABLONSKI et al., 2006). O volume total
da bacia hidrográfica da Baía de Guanabara é estimado em 2,2 × 109 m³
(JICA,1994).
A biota desta região está constantemente exposta a uma infinidade de
substâncias tóxicas lançadas no ambiente, oriunda de diversas fontes de emissão.
Estes contaminantes são capazes de interagir com o organismo vivo causando
múltiplas alterações, que podem gerar consequências em populações, comunidades
21
ou ecossistemas, dependendo do grau de contaminação e do tempo de exposição
(CANELA, 1995).
A Baía de Guanabara é um dos ecossistemas mais poluídos do país (PDRH-
BG, 2005) e o desmatamento histórico da Mata Atlântica, a constante emissão de
esgoto e de lixo nas águas da Baía, a poluição industrial, a poluição causada pelos
derramamentos de óleo e a poluição do ar são fatores que contribuem ativamente
para a permanência deste quadro de profunda degradação ambiental (COELHO,
2007).
Programas de despoluição tem sido matéria de uma série de discussões
envolvendo o Estado, as indústrias, as diversas empresas, as organizações não
governamentais (ONGs) e a população como um todo. Existe o consenso que a
Baía de Guanabara necessita de um plano emergencial de gestão ambiental. Dentre
estes, o Programa de Despoluição da Baía de Guanabara (PDBG) prevê a
diminuição de carga de nutrientes e de metais para a baía, para tanto investiu cerca
de R$ 1,6 bilhão de 1994 até 2009 (dado da avaliação realizada pelo Banco
Internacional de Desenvolvimento – BID, em 2009).
Porém, uma avaliação de sua sustentabilidade não foi ainda realizada. Tais
projetos possibilitaram a promoção de ações do Plano Guanabara Limpa, como Baía
sem Lixo, o início das obras de saneamento da Marina da Glória, a reconstrução das
Estações de Tratamento de Esgoto, coleta e tratamento de esgoto de Alcântara e o
programa Sena Limpa e revitalização dos emissários submarinos da Barra e de
Ipanema (GUANABARA LIMPA, 2014).
Segundo CRUZ e colaboradores (1996), pode-se relacionar a qualidade
ambiental de uma baía com sua localização geográfica, dimensões, rede de
drenagem e as características do litoral no qual se encontra, uma vez que estes
fatores são determinantes na circulação e renovação de suas águas. A área que
apresenta melhor qualidade das águas é delimitada pelo canal central de circulação
e recebe um grande volume de troca de água, promovido pelas correntes de maré
(CONVÊNIO PETROBRAS-DPC-EMGEPRON, 2004).
22
A bacia da Baía de Guanabara sofre modificações desde o início do século
XIX. Como consequências, a renovação e a qualidade das águas têm sido
prejudicadas, acarretando uma elevada taxa de sedimentação.
De acordo com a USEPA (2000) os estuários podem funcionar como
reservatórios de poluentes derivados da bacia de drenagem. Quando corpos
hídricos dulcícolas se encontram com águas salinas da região costeira, os
processos físico-químicos típicos levam a precipitação e sedimentação de boa parte
dos poluentes carreados pelas águas dos rios na forma dissolvida, e com isso, altas
concentrações de metais tóxicos e hidrocarbonetos são evidenciadas nos
sedimentos e alterações nos seres aquáticos.
Outra implicação da poluição da baía é o processo de eutrofização, causado
por elevadas concentrações de nutrientes. Tal processo altera a qualidade da água,
através da redução de oxigênio dissolvido (OD), devido ao intenso consumo na
produção biológica. A baixa oferta de oxigênio acarreta em mortes de peixes e na
perda da biodiversidade aquática (GODOY et al., 1998; BRANCO, 2007).
Segundo PARAQUETTI e colaboradores (2004), nos efluentes das atividades
antrópicas, os compostos metálicos possuem baixas concentrações devido a sua
baixa solubilidade em água. No entanto, em áreas estuarinas, os contaminantes
metálicos estão geralmente complexados ao material particulado em suspensão,
podendo assim, se difundir para áreas mais distantes de suas fontes. Por isso, em
regiões próximas a complexos industriais, há um risco considerável de que a
contaminação por metais pesados desencadeie um desequilíbrio nos seus
ecossistemas (DIAS-JUNIOR et al., 1998).
Concentrações de mercúrio elevadas foram detectadas próximo à
desembocadura do rio São João de Meriti (BARROCAS, 1994; WASSERMAN et al.,
2000). No entanto, a biota da Baía de Guanabara apresenta níveis de mercúrio
baixos, abaixo de 200ppb, inclusive em peixes (KEHRIG et al., 1998; RODRIGUES,
2006; RODRIGUES, 2010), para efeito de mercúrio em peixes observamos o limite
de 500ppb em filés de peixes, para inviabilizar seu comércio – o valor limite para
consumo humano definido pela Organização Mundial de Saúde (CARVALHEIRA,
2012). Em sedimentos superficiais os níveis podem alcançar 10ppm em pontos
23
específicos do setor noroeste, variando de 1 a 2 ppm nos demais setores
(BARROCAS, 1994; WASSERMAN et al., 2000).
Do ponto de vista dos compartimentos ambientais, são nos solos e sedimentos
onde ocorre a maior acumulação dos metais. A contaminação destes por metais
pesados pode acarretar sérias consequências sobre componentes funcionais dos
ecossistemas. Nas plantas, por exemplo, quando são absorvidos, os metais passam
a participar da cadeia trófica, contaminando o homem e animais (ACCIOLY &
SIQUEIRA, 2000). Geralmente são encontrados como contaminantes metálicos:
chumbo, cromo, zinco, mercúrio, cádmio e cobre (MAFFIA & DAVIS, 2001).
Em virtude do reconhecimento do perigo destes contaminantes as nações do
mundo buscam por legislações mais rígidas e substituições por processos
tecnológicos mais limpos. Atualmente, a legislação ambiental ainda é insuficiente
para lidar adequadamente com estas questões, e assim, diversas áreas do planeta
continuam a receber cargas pesadas de poluentes.
Quando se aborda a poluição por metais pesados, sabe-se que são elementos
que ocorrem naturalmente no ambiente e constituem menos de 1% das rochas. Tais
elementos podem causar danos ao ambiente, se as suas concentrações forem
elevadas (COSTA et al., 2004). Dentre os metais pesados encontrados na natureza,
o mercúrio é considerado o mais tóxico. Este metal ocorre naturalmente no
ambiente, mas seu uso indiscriminado vem trazendo o aumento das suas
concentrações no meio ambiente e prejudicando a biota (COSTA, 2010). Grande
parte do mercúrio encontrado no meio ambiente tem origem nas fontes
antropogênicas, que se dão por meio da queima de combustíveis fósseis, na
amalgamação de ouro com mercúrio, em rejeitos de indústrias, em incineradores de
lixo e também no uso de agrotóxicos com mercúrio (MITRA, 1986).
Existem ainda questões relevantes sobre o interesse na determinação dos
seus compostos tóxicos e sobre o ponto de vista da contaminação, do potencial de
bioacumulação e biomagnificação pelos organismos.
O estudo da espécie química é de grande importância para compreensão da
sua toxicologia, e por tratar de uma questão de saúde pública, quando consideramos
os acidentes que já envolveram este metal pesado. A questão da biodisponibilidade
24
deve ser interpretada como o ponto crucial na determinação da toxicidade do metal
(COSTA, 2010). A biodisponibilidade de poluentes pode ser avaliada em diferentes
matrizes ambientais. Em sedimentos, por exemplo, uma substância está disponível
quando se encontra em formas fracamente ligadas (MACHADO et al., 2008).
Enquanto que em águas a substância está disponível quando dissolvida, ou ainda,
quando presente na circulação interna de um organismo vivo (CARVALHEIRA,
2012).
Na investigação das metodologias de detecção, pode ser observado que os
métodos tradicionais não permitem distinguir poluentes que estão disponíveis para
os sistemas biológicos dos que estão inertes ou indisponíveis, uma questão especial
em relação aos metais tóxicos (COSTA, 2010).
Desta forma, os biossensores surgem como alternativa na detecção de
poluentes e se apresentam como nova ferramenta analítica a ser aplicada no
diagnóstico das condições do meio ambiente (TECON & MEER, 2008), sendo
promissores graças à seletividade e ao baixo custo deste tipo de tecnologia
(SALGADO, 2001; MELO, 2008).
Os sensores biológicos podem ser mais lentos e menos duráveis, precisos ou
seletivos que técnicas analíticas instrumentais, mas possuem a vantagem de
proporcionar informação sobre biodisponibilidade ou biotoxicidade da matriz. Dentre
estes sensores, os biossensores microbianos apresentam vantagens sobre aqueles
que utilizam componentes biológicos isolados, como enzimas e anticorpos, por
possuírem vida útil mais longa, serem mais tolerantes a variações de pH e
temperatura e ainda mais baratos, uma vez que o componente biológico não precisa
ser isolado (YAGY, 2007).
No presente estudo, a ferramenta analítica utilizada se baseia em um
biossensor composto pela bactéria geneticamente modificada Escherichia coli
MC1061 (VIRTA et al.,1995), capaz de detectar mercúrio biodisponível, através da
reação da enzima luciferase do vaga-lume (Firefly luciferase), respondendo
quantitativamente quando exposta ao mercúrio, através de bioluminescência.
25
Este trabalho está assim estruturado:
Capítulo 1: Trata da introdução do trabalho onde é apresentado um
panorama geral do assunto.
Capítulo 2: Apresenta os objetivos do presente projeto.
Capítulo 3: Descreve os embasamentos teóricos pertinentes à análise dos
resultados, através de uma revisão bibliográfica referentes ao tema desta tese.
Capítulo 4: Descreve as metodologias e materiais utilizados no
desenvolvimento do presente trabalho.
Capítulo 5: Apresenta os resultados obtidos bem como as discussões
comparando como os resultados encontrados na literatura.
Capítulo 6: Avaliação econômica envolvida no presente trabalho.
Capítulo 7: Relata as conclusões obtidas ao longo do estudo, as
considerações sobre o tema da tese e as sugestões para a continuidade da linha de
pesquisa.
26
2. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo investigar a aplicabilidade e validação
de um biossensor, que utiliza como elemento biológico o micro-organismo
geneticamente modificado Escherichia coli MC1061 (VIRTA et al., 1995) e como
transdutor um luminômetro, para a detecção do mercúrio biodisponível em amostras
ambientais da Baía de Guanabara.
27
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Este capítulo apresenta uma revisão bibliográfica sobre o mercúrio englobando
fontes e usos, contaminações, ciclo biogeoquímico, toxicidade, especiação, e
diversos métodos de quantificação do metal pesado incluindo os biossensores.
3.1 USOS DO MERCÚRIO AO LONGO DO TEMPO
O homem já se relaciona com o mercúrio desde épocas remotas, na pré-
história usava um minério do mercúrio de cor avermelhada, o cinábrio ou sulfeto de
mercúrio, para escrever e desenhar nas paredes de cavernas e em objetos de argila
(Figura 1). Algumas evidências mostram o uso do metal como parte de rituais de
sepultamento na Grécia e no Egito, no ano de 1500 a.C. (GRAEME & POLLOCK,
1998; STILLMAN, 2003), e ainda o uso terapêutico, pois os seus efeitos tóxicos
eram desconhecidos. Acredita-se que o primeiro registro sobre o uso do mercúrio
tenha sido escrito por volta do ano 400 a.C, por Aristóteles em sua obra
“Meteorologia e De Anima”, denominando-o Hydrargyrum, que quer dizer água
prateada. Por isso, a escolha de seu símbolo atômico Hg (BARROCAS, 1994;
AZEVEDO, 2003; MIRANDA et al., 2007). Sabe-se que na Idade Média o metal era
usado na alquimia. Ao longo dos anos, o conhecimento do homem sobre as
propriedades químicas do mercúrio foi expandido e, provavelmente, o primeiro uso
comercial do mercúrio tenha sido a amalgamação (MIRANDA et al., 2007).
Figura 1: Uso do mercúrio em pinturas e na alquimia (Fonte:
http://www.informe10.com/img/fotos; http://palacios49.files.wordpress.com/2008/10/alquimia4.jpg)
28
Historicamente, a amalgamação do mercúrio foi usada para extrair metais
preciosos (isto é, ouro, prata) do minério do metal. Por exemplo, o ouro é
amalgamado com mercúrio, a amálgama é então aquecida para assim volatilizar o
mercúrio e por consequência recuperar o ouro (VASCONCELLOS, 2010).
Os romanos tornaram o uso do mercúrio na extração de ouro e de outros
metais muito popular (GRAEME & POLLOCK, 1998), e no século XVII, época em
que a prioridade era o acúmulo de metais, grandes quantidades de mercúrio foram
usadas para extrair prata em minas por todo o continente americano. No mesmo
período, esse metal teve participação fundamental no desenvolvimento de
instrumentos de medição, em processos industriais, e ainda usado como princípio
ativo em pomadas, no século XVIII, mesmo se conhecendo as propriedades biocidas
deste metal. Essas pomadas foram usadas durante anos para tratamento de
doenças de pele e sífilis (VASCONCELLOS, 2010).
Na segunda metade do século XVIII, os riscos à saúde envolvendo o uso do
mercúrio começaram a ser percebidos. O metal era consumido na mineração, e a
maior parte do mercúrio vinha das Minas de Almadén, na Espanha, extraído por
escravos (AZEVEDO, 2003). Espanha, Itália, Estados Unidos, México, China e
Japão, apresentam as formações geológicas mais abundantes em minérios do
mercúrio. Nas minas de Almadén, há registros que o início da exploração de
mercúrio ocorreu há pelo menos dois mil anos. Na China há registros de que o uso
de cinabre como pigmento ocorreu há três mil anos (VASCONCELLOS, 2010). O
mercúrio metálico é obtido por aquecimento do cinabre seguido de condensação
(BOENING, 2000). No Brasil, não existem registros de minas de mercúrio, por este
motivo todo o mercúrio usado no país é importado (BARROCAS, 1994).
No Brasil, em muitos consultórios odontológicos, ocorre, de forma discreta, uma
migração para técnicas que não utilizam amálgama, e o resíduo gerado nestes pode
ser guardado de maneira segura no próprio local (VASCONCELLOS, 2010).
3.2 PROPRIEDADES DO MERCÚRIO
O mercúrio elementar (Hg0) é o único metal que pode ser encontrado no estado
líquido em temperatura ambiente, passando facilmente para o estado gasoso nessa
29
mesma condição. Este metal pode ocorrer naturalmente no meio ambiente, na água,
na biota, na atmosfera e na crosta terrestre (em sua forma elementar e nas formas
minerais do sulfeto de mercúrio como cinábrio, metacinábrio e hipercinábrio). Pode
se apresentar sob as formas inorgânicas e/ou orgânicas, ou ainda, associado a
outros elementos. Suas propriedades físico-químicas estão intimamente
relacionadas ao ânion ao qual o metal se liga, sendo que o nitrato e o sulfato
possuem elevada hidrossolubilidade, enquanto o cloreto é bastante solúvel em
solventes orgânicos (REIS, 2008).
Outra característica do metal é a absorção da luz ultravioleta a 253,7 nm, de
forma bastante intensa, o que é aproveitado em alguns métodos analíticos, com alta
sensibilidade de detecção (AZEVEDO, 2003).
O metal pode ser encontrado nas diversas formas químicas: solúvel, trocável,
ocluso ou fixado aos minerais, precipitado com outros compostos, na biomassa e
complexado na matéria orgânica. As formas químicas que definem a toxicidade, que
se caracteriza por influenciar: no bloqueio de grupos funcionais essenciais à atuação
de uma biomolécula, na competição e deslocamento de outros metais presentes no
sistema, e na modificação da conformação de sítios ativos e da estrutura quaternária
de proteínas (MANO et. al., 2005). E conforme o estado molecular do elemento
mercúrio, a sua toxicidade varia significativamente. Devem ser distinguidas três
formas químicas principais: os vapores de mercúrio elementar, os sais de mercúrio e
os compostos organomercúricos. A forma mais volátil é Hg0, sendo que o
dimetilmercúrio também pode volatilizar. Sua volatilidade explica a sua baixa
concentração em águas não poluídas (HORVAT, 1996).
3.3 FONTES DE MERCÚRIO
Segundo WANG e colaboradores (2004), as fontes de mercúrio podem ser
naturais, antrópicas e de reemissão. A principal fonte de mercúrio se dá através de
emissões gasosas, que podem ter origem natural ou antrópica.
As fontes naturais de mercúrio são oriundas do desgaste natural da crosta
terrestre, podendo estar associado a outros elementos, sendo o enxofre o mais
comum. A sua forma metálica é obtida pelo aquecimento do sulfeto de mercúrio
30
(HgS) a seco, seguido de condensação (MIRACONI et al., 2000). No interior da
crosta terrestre, as concentrações de mercúrio podem variar entre 21 e 56 ppb,
dependendo da profundidade onde é encontrado (BARKAY et al. 2003).
A associação do metal com enxofre leva à formação do minério cinábrio (HgS),
composto de cor vermelha, cujas maiores reservas encontram-se na Espanha e na
Itália (CANELA, 1995), dentre outras reservas importantes como China, Estados
Unidos, Canadá, Rússia, Irlanda, Turquia, Filipinas e México (BIESTER et al., 1999).
Outra fonte importante é proveniente das emissões vulcânicas que contribuem
com a liberação na atmosfera de aproximadamente 2.500 t ano-1 de mercúrio total
(MARINS et al., 2004), além da evaporação de sistemas aquáticos e erosão de
depósitos minerais.
Dentre as fontes de origem antrópica, destacam-se: a emissão de efluentes
industriais e urbanos; a queima de combustíveis fósseis, que é responsável por
cerca de dois terços dos lançamentos (MARINS et al., 2004), uma vez que o
mercúrio se apresenta como impureza nessas fontes de energia; aterros sanitários,
os quais contém uma infinidade de resíduos contendo mercúrio; e atividades
industriais, agrícolas e mineradoras.
A produção anual de mercúrio vem sendo estimada em torno de 10.000
toneladas, sendo os seus maiores produtores o Canadá, a Rússia e a Espanha
(GRIGOLETTTO et al., 2008). O mercúrio pode ser despejado durante o processo
de produção ou durante a eliminação e incineração de resíduos. Como exemplo, a
indústria de cloro soda foi a principal fonte de poluição de mercúrio no Brasil até a
década de 80, na qual o metal era utilizado como catalisador do processo de
produção (LACERDA, 1997). Pode ser destacada ainda a produção de acetaldeído,
polpa de papel, tintas, pesticidas, fungicidas, lâmpadas de vapor de mercúrio,
baterias, produtos odontológicos, além de incineradores de lixo, amalgamação de
mercúrio em extração de ouro, entre outros, como atividades emissoras de mercúrio
(MIRACONI et al., 2000).
Já a remissão de mercúrio ocorre através de uma remobilização deste metal de
atividades antropogênicas anteriores, que estava acumulado ou depositado em
compartimentos ambientais (NRIAGU & BECKER, 2003; LOPPI, 2001).
31
Estudos indicam que 200.000 toneladas de mercúrio foram emitidas para a
atmosfera desde 1890, sendo aproximadamente 95% em solos, 3% nas águas
oceânicas superficiais e 2% na atmosfera (MIRACONI et al., 2000). A Tabela 1
apresenta um resumo das emissões resultantes de atividades humanas (ano de
referência 2000). Nos Estados Unidos, estima-se que 8000 kg/ano de mercúrio são
processados sendo 6000 kg/ano emitidos direto para a atmosfera (WILHELM, 2001).
A Ásia o continente com a maior contribuição dos lançamentos, seguido pela África.
Na China os números são bastante representativos, com 536 toneladas de mercúrio
em 1999 e 586 toneladas em 2000 (LOHMAN et al., 2008).
Tabela 1: Inventário da Emissão Antrópica de Mercúrio Total Global/Simulação por Modelo de Transporte de Hg
0 (LOHMAN et al.,2008).
País/Continente Emissão anual de Hg 106 Kg/ano Hg0 Hg2+ HgP
Estados Unidos 104 (1999) 60% 31% 9%
Canadá 8 54% 35% 11%
México 26 71% 20% 9%
Ásia 1204 57% 34% 9%
Europa 239 61% 32% 7%
América do Sul e Central 92 71% 23% 6%
África 407 65% 28% 7%
Oceania 125 55% 36% 9%
Total 2206
Segundo LACERDA (2007) as estimativas de emissões de mercúrio para a
atmosfera global sugerem um total de cerca de 6.000 t ano-1, sendo cerca de 2.000 t
ano-1 correspondentes à volatilização natural do Hg presente nos oceanos. Enquanto
que cerca de 1.000 t ano-1 correspondem à reemissão de superfícies terrestres e
3.000 t ano-1 às emissões antrópicas. Destacando as principais fontes antrópicas
nas indústrias químicas e na eletroeletrônica, e ainda, a queima de combustíveis
fósseis.
As emissões provenientes do processamento de petróleo geram resíduos
tóxicos e descargas atmosféricas que contém mercúrio. Em nível global, a queima
de combustíveis fósseis emite para a atmosfera cerca de 1.500 t ano-1. Deste total,
cerca de 300 t ano-1 são emitidas pela geração de energia elétrica e 1.200 t ano-1 por
outros usos industriais (FENG et al., 2009).
32
Nas últimas décadas, uma quantidade considerável de pesquisas tem sido feita
para melhorar inventários de emissões de mercúrio em nível global, incluindo
aqueles países com economias de transição (FENG et al., 2009).
A agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (USEPA, 2013) em seu
último relatório sobre emissões globais de mercúrio, confirma o papel das
mineradoras em pequena escala como emissoras de mercúrio e ainda ressalta que
queima de carvão é um maiores componentes das emissões antropogênicas
seguido pela produção de metais ferrosos e a produção de cimento. Uma grande
quantidade de carvão é queimado em torno do mundo para gerar eletricidade, para
executar plantas industriais, e para o aquecimento de casas. A emissão de mercúrio
pela combustão do carvão emitida alguns países chegou a 475 toneladas de
mercúrio em 2010, a maioria para geração de energia e utilização industrial. Tais
emissões antropogênicas de fontes industriais podem estar subindo. Entretanto
acreditava-se ter atingido o pico na década de 1970, pois houve uma diminuição
durante duas décadas seguintes, e têm sido relativamente estável entre 1990 e
2005, mesmo com algumas indicações de ligeiros aumentos na emissões entre 2000
e 2005. Indicações gerais são que as emissões dos setores industriais têm
aumentado novamente desde 2005.
De acordo com PIRRONE e colaboradores (2010) mudanças no clima global
também podem complicar a resposta dos ecossistemas globais ao mercúrio, as
reduções de emissões, através de efeitos em muitos aspectos de movimento e
transformações químicas do mercúrio no ambiente. Por exemplo, o aumento das
temperaturas influenciam as taxas de da produtividade biológica e as taxas de
atividade bacteriana em ecossistemas de água doce e marinhos, o que
possivelmente, levaria a conversão mais rápida de mercúrio inorgânico ao
metilmercúrio.
Outra preocupação é que em muitas regiões as fontes pontuais não são
adequadamente descritas (África, América do Sul e Ásia). Estas incertezas afetam o
modelo de desenvolvimento, política ambiental e do bem-estar humano. Modelos de
mercúrio para a atmosfera desenvolvidos nos últimos anos para avaliar a relação
entre as regiões-fonte de emissão e regiões-receptoras mostram uma precisão
limitada. A capacidade para determinar a precisão dos modelos é severamente
33
limitada pela falta de um inventário global de emissão que inclua uma melhor
caracterização da emissão das fontes relacionada com as usinas de combustíveis
fósseis nos países em desenvolvimento rápido. Pois nestes países a demanda de
energia segue uma tendência de crescimento na próxima década (NOAA, 2012).
Recentemente, estudos em colaboração do laboratório de modelagem do
National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA) e a EPA vêm investigando
os valores atuais das emissões globais de mercúrio (1° fase dessa investigação foi
realizada em lagos nos Estados Unidos) para o desenvolvimento de um modelo
matemático com objetivo de determinar e compreender as tendências temporais e
espaciais (NOAA, 2012).
3.3.1 FONTES NO BRASIL
O Brasil não possui reserva de cinábrio, e assim, precisa importar todo
mercúrio que necessita para a indústria eletroeletrônica, lâmpadas, aparelhos
científicos, produção de tintas e pilhas, dentre outros setores químicos. Dados do
Ministério do Desenvolvimento, Indústria e Comércio (MDIC, 2013) apontam que
entre janeiro e abril de 2013 foram importados 24.939 kg de mercúrio metálico, dos
quais 18.113 kg foram procedentes dos Estados Unidos, 5.003 kg do Reino Unido,
960 kg da Alemanha e 863 kg do Japão.
Os resíduos dos materiais não tem controle e nem segregação especial, tendo
como exceção as lâmpadas fluorescentes, que contam com empresas recicladoras,
e já reciclaram 6,5 milhões de lâmpadas até 2000 e aterros licenciados para
mercúrio (REIS, 2008). Embora uma pequena quantidade de mercúrio esteja contida
em cada lâmpada, o efeito acumulativo e persistente do mercúrio proveniente de
muitas lâmpadas é considerável. Por esse motivo as lâmpadas que contêm mercúrio
devem ser separadas. Uma prática esta adotada em diversos países e no Brasil, em
que muitas indústrias, universidades, órgãos públicos e empresas concessionárias
de energia elétrica proíbem a disposição de suas lâmpadas no lixo. Por outro lado,
diversos municípios nos estados de São Paulo, Santa Catarina e Minas Gerais já
gozam do benefício da coleta separada e da destinação adequada de suas
lâmpadas de iluminação pública evitando assim que as mesmas tenham como
destinação os aterros municipais. No processo, as lâmpadas são quebradas, com
34
exaustão e captura do mercúrio metálico emitido, e separação dos componentes
metálicos (APLIQUIM, 2004).
O mercúrio subproduto da descontaminação de lâmpadas é usado na
fabricação de novas lâmpadas ou de termômetro, manômetros, etc. (WINDMOLLER
et al., 2008). Dentre os equipamentos contendo mercúrio, utilizados nos Serviços de
Saúde do Brasil, 55% são termômetros, 35% esfignomanômetros e 10% produtos
químicos de laboratórios (MMA, 2010).
No Brasil, as emissões de mercúrio por fontes antrópicas (alguns tipos podem
ser observados na figura 2) são inventariadas desde 1995 (LACERDA, 1997;
LACERDA & MARINS, 1997; MOREIRA & PIVETTA, 1997; VAISMAN et al., 2003;
LACERDA et al., 2007). Segundo LACERDA (1997), embora os dados sejam
apenas locais ou por setores específicos são suficientes para hierarquizar a
participação relativa de cada fonte na emissão total de Hg.
Figura 2: Algumas fontes emissoras de mercúrio e seu destino no ambiente (Adaptado de NOAA, 2012).
Estudos apontam que o Brasil importou, entre as décadas de 1970 e 1980,
cerca de 160 t ano-1, atingindo 340 t ano-1 em 1984 (LACERDA, 1997). As fontes
industriais foram as responsáveis pela totalidade das emissões até 1970, quando se
35
percebeu uma mudança no controle das emissões industriais conhecidas
(LACERDA, 1997). A partir deste momento a carga de mercúrio oriunda dos
garimpos de ouro na Amazônia, passou a ser a principal fonte emissora do metal. A
emissão de fontes difusas, associado a um crescimento acelerado dos grandes
centros urbanos, tem substituído em importância as fontes industriais clássicas, com
a disposição de resíduos sólidos. As emissões com geração de energia elétrica hoje
representam cerca de 300 t ano-1 e a queima de combustíveis fósseis
aproximadamente 1.500 t ano-1 em nível global (LACERDA et al., 2007). Pode ser
observada na Tabela 2, a contribuição dos diversos setores na emissão de mercúrio
no Brasil.
Tabela 2: Contribuição de Diferentes Setores na Emissão de Mercúrio no Brasil (1998 a 2002).
*inclui lâmpadas e produtos eletroeletrônicos. Fonte: LACERDA et al., 2007.
Fonte/Setor Emissão (%)
Garimpo de ouro 29,7
Indústria de cloro/soda 25,2
Produção de aço e ferro 17,8
Queimadas na Amazônia 12,9
Pirometalurgia 6,7
Geração de energia 6,2
*Outras fontes 1,5
LACERDA e colaboradores (2007) afirmam que emissão de mercúrio para a
atmosfera por queima de gás natural é pequena em relação às demais fontes,
incluindo a combustão de outros combustíveis, não resultando em impacto ambiental
ou de saúde pública, significativo. Ressaltando ainda que a geração de energia pela
queima de carvão, óleo combustível e biomassa geram 1.200, 250 e 2 vezes mais
mercúrio para o meio ambiente, respectivamente, que a queima de gás natural, por
unidade de energia gerada. Desta forma, o gás natural seria uma opção “limpa” em
relação esse metal pesado entre os diferentes combustíveis potencialmente
utilizáveis.
É importante ressaltar que grande parte do mercúrio presente no gás natural
fica retido nas etapas de refino e transporte. Assim, fontes pontuais de mercúrio
poderão ser criadas em refinarias, dutos de transporte e usinas termoelétricas
(LACERDA et al., 2007).
36
3.4 CICLOS BIOGEOQUÍMICOS
O homem, há séculos, voluntariamente ou em decorrência de suas atividades,
vem interferindo nos ciclos de nutrientes minerais. O nitrogênio, o fósforo, o cálcio, o
potássio e os ciclos hidrológicos, além dos inúmeros microelementos químicos, são
partes fundamentais para o funcionamento do sistema ambiental. Todos esses
componentes devem influenciar no ciclo do mercúrio.
Nos diferentes ecossistemas a quantidade armazenada de metal é variável
(dependendo da composição desse ecossistema), e existe ainda, variação nas taxas
de distribuição, transferência e armazenagem dentro de cada sistema (CUNHA &
GUERRA, 2012). As diferentes espécies de mercúrio tem sua distribuição regulada
por processos físicos, químicos e biológicos, e a conversão das mesmas leva a um
ciclo de distribuição que pode ser local ou global, podendo este metal pesado se
alojar nos compartimentos ambientais mais diversos (CANELA, 1995).
Nos ambientes aquáticos envolve uma complexa relação entre os processos
biológicos, principalmente mediados por micro-organismos, e os processos
geoquímicos, que ocorrem em escalas microscópicas e macroscópicas (WARREN &
HAACK, 2001). Nesse ambiente, a especiação de mercúrio depende das interações
com outros elementos (possibilidade de complexação), solubilidade, pH,
temperatura, potencial redox, sorção e dessorção, parâmetros estes, que
influenciam na rota de transformação que o mercúrio pode seguir (STEIN et
al.,1996).
Sabe-se que valores altos de pH (alcalino) de sistemas hídricos pode estar
associado a proliferação de vegetais em geral, pois com o aumento da fotossíntese
há consumo de gás carbônico, e portanto, diminuição do ácido carbônico na água e
consequente aumento do pH. Já a acidez é causada principalmente pela presença
de CO2, ácidos minerais e sais hidrolisados. Quando um ácido reage com a água, o
íon hidrogênio é liberado, acidificando o meio. As variações de pH no meio aquático
estão relacionadas ainda com a dissolução de rochas, absorção de gases da
atmosfera, oxidação da matéria orgânica e fotossíntese (VON SPERLING, 1995).
37
E a acidez de alguns corpos aquáticos facilita a formação de complexos
solúveis (HgCl2 e CH3Hg) enquanto ambiente alcalinos favorecem a formação de
complexos voláteis (Hg0 e (CH3)2Hg) (STEIN et al., 1996).
O mercúrio e seus compostos podem ser biotransformados da forma inorgânica
para forma orgânica, esta última é capaz de ser biomagnificada ao longo da cadeia
alimentar. Os aspectos relacionados à toxicidade e também ao ciclo biogeoquímico,
envolvendo distribuição, bioacumulação, transformação e transporte no ambiente
tem chamado atenção da comunidade científica desde os acidentes com a
contaminação por mercúrio no Japão, nas décadas de 1950 e 1960, e no Iraque, em
1956 e 1971-72 (BAKIR et al., 1973).
As diversas espécies químicas possuem toxicidade elevada e podem causar
danos aos seres humanos dependendo da forma química e dos fatores de
exposição. Um resumo das espécies é apresentado na Tabela 3.
As diferentes formas apresentadas pelo mercúrio no ambiente, orgânicas e
inorgânicas, possuem velocidades distintas de deposição e reações na atmosfera,
do mesmo modo, as emissões também podem variar em função da forma química
(LOHMAN et al., 2008).
O mercúrio apresenta três estados de oxidação: Hg2+ (íon mercúrico, principal
forma dissolvida (como sais ou complexos solúveis) nos sistemas aquáticos), Hg1+
(íon mercuroso) e Hg0 (mercúrio metálico ou elementar) que se transformam entre si
no meio ambiente através de reações bióticas e abióticas (NIES, 1999; MOREL et
al., 1998). O Hg2+ forma ligações covalentes bastante estáveis com o carbono dando
origem a compostos organometálicos lipossolúveis, ao contrário do Hg1+, pouco
estável em sistemas naturais, praticamente não se liga ao carbono e ao nitrogênio
(BARROCAS, 2003). Já os compostos de mercúrio em suspensão, cujos os
exemplos mais comuns são sulfeto (HgS) e seleneto (HgSe) de mercúrio, são
insolúveis em água e óleo, mas podem estar presentes como partículas muito
pequenas, sólidas em suspensão (WILHELM, 1999).
38
Tabela 3: Espécies de mercúrio e suas categorias.
Categorias Espécies Químicas
Espécies Voláteis Mercúrio elementar (Hg0)
Dimetilmercúrio [(CH3)2Hg]
Espécies Muito Reativas Íon Mercúrico (Hg2+
)
Cloreto Mercúrico (HgCl2)
Espécies Pouco Reativas Metilmercúrio (CH3Hg+)
Sulfeto de Mercúrio (HgS)
A forma orgânica metilmercúrio, corresponde de 80% a 95% do teor total de
mercúrio encontrado em peixes, sendo o grande responsável pela intoxicação dos
seres humanos consumidores de pescado (BISINOTI & JARDIM, 2004).
O mercúrio pode ser incorporado ao longo da cadeia trófica (Figura 3) e, assim,
ser bioacumulado e biomagnificado em função de sua longa meia vida nos
organismos vivos (640 a 1200 dias), mesmo em regiões onde as águas apresentem
níveis considerados normais. As espécies piscívoras são as que apresentam os
maiores teores do elemento (YALLOUZ et al., 2001). Estudos têm mostrado que o
metilmercúrio é a espécie dominante de mercúrio na biota (BLOOM, 1992; KASPER
et al., 2007). O metilmercúrio é, em sua maior parte, produzido biologicamente por
bactérias, como um mecanismo natural de detoxificação (LACERDA, 2007).
Figura 3: Ciclo do Mercúrio em Ambientes Naturais (Adaptado: FISHER, 2007; NOAA,
2012).
39
O ciclo do mercúrio é caracterizado pelas várias rotas que este composto pode
seguir no ambiente, desde sua liberação do solo como resíduos de rocha, até o seu
retorno da água para atmosfera, seja na forma de mercúrio elementar (Hg0) gasoso
ou, em menor extensão, como compostos voláteis (BISINOTI & JARDIM, 2004). A
deposição atmosférica (seca ou úmida) é uma importante via de acúmulo de
mercúrio, em muitos ecossistemas, essa pode ser a maior fonte de mercúrio. A rota
atmosférica envolve a retenção do mercúrio elementar (Hg0) na atmosfera por
períodos longos, sendo possível a circulação através de grandes distâncias
(SCHROEDER & MUNTHER, 1998; DASTOOR & LAROCQUE, 2004).
Esta liberação, e o seu retorno, contribuem para o ciclo global do mercúrio
(POISSANT et al., 2004). Quando o mercúrio metálico entra em contato com a
atmosfera pode ser oxidado pelo ozônio ou outros oxidantes para Hg2+. A forma
oxidada é capaz de se complexar com outros íons presentes, como o cloreto, e
formar cloreto de mercúrio (HgCl2), que poderá se depositar na água e no solo, e
nestes pode ainda formar outros compostos ou volatilizar retornando a atmosfera, na
forma de mercúrio metálico, metilmercúrio ou dimetilmercúrio.
Além da atmosfera, o mercúrio é capaz de ser emitido do solo, através de
lixiviação e erosão, para corpos d’água (FOSTIER et al., 2000). Desta maneira, o
solo pode ser visto como uma interface entre atmosfera, hidrosfera, biosfera e
litosfera, sendo estas interações observadas nas Figuras 2 e 3. A transferência de
mercúrio da atmosfera para compartimentos terrestres, como a vegetação, o solo e a
água, pode ocorrer por deposição seca ou úmida (precipitação) e depende das
condições climáticas (PORCELLA, 1994; POISSANT et al., 2008).
Quando em contato com o solo ou sedimento, é possível ocorrer sorção do
mercúrio na forma insolúvel seguida de metilação/desmetilação. O mercúrio
elementar (Hg0) e o íon mercúrico (Hg2+) são geralmente encontrados em solos. O
Hg2+ apresenta uma alta propensão a formar complexos e é difícil de ser encontrado
puro, visto que há uma gama de agentes complexantes em sua matriz. Assim, o
mercúrio pode se ligar aos minerais do solo ou adsorver a sólidos inorgânicos ou à
matéria orgânica, como por exemplo, ácidos húmicos e fúlvicos (STEINNES, 1995).
40
Os solos possuem uma elevada capacidade de reter e armazenar mercúrio,
principalmente os solos argilosos, devido a forte associação deste com o carbono
presente, podendo este acúmulo persistir por muitos anos. A quantidade de mercúrio
acumulada dependerá da história de deposição, da idade e das características do
solo. São estas que determinam a especiação e as rotas de transformação química
que o mercúrio elementar, incluindo a quantidade de matéria de orgânica, a textura e
mineralogia do solo e a composição da solução do solo (RENNEBERG & DUDAS,
2001). Além disso, a parcela de matéria orgânica presente nas fases aquosa e
sólida, vão influenciar na distribuição e no transporte de mercúrio através de perfis
de solo (SEMU et al., 1987).
A composição e o pH do solo será determinante na formação dos complexos
com Cl-, OH-, NH3, F-, SO4
-2 NO3- sendo dominantes os complexos formados com Cl-
e OH- (SCHUSTER, 1991). Além disso, a textura e a mineralogia do solo influenciam
nas reações do mercúrio com os minerais presentes no solo (KOHUT et al., 1995).
Nos sedimentos a distribuição está relacionada com o conteúdo de carbono
orgânico, argila, ferro, fósforo, potencial redox e enxofre, dentre outros. Os agentes
orgânicos complexantes solúveis em água, tais como humatos e fulvatos, podem
quelar as espécies solúveis e insolúveis na água. O pH ácido favorece a absorção
do mercúrio pelo húmus. No pH básico o mercúrio tem maior afinidade pela fração
mineral, desfavorecendo a formação do metilmercúrio (BISINOTI, 2005; CANELA,
1995). A formação de complexos orgânicos de mercúrio é em grande parte devida à
alta afinidade do mercúrio aos sítios ativos de grupos funcionais contendo enxofre
presentes em matéria orgânica. O número de sítios ativos nesses compostos
determina a quantidade de mercúrio que pode se ligar (RENNEBERG & DUDAS,
2001). Devido à essa complexação à matéria orgânica e aos minerais do solo, as
taxas de lixiviação de mercúrio são baixas (MIERLE & INGRAM, 1991). O estudo de
ANDERSON (1979) demonstrou a existência de uma interdependência entre
mercúrio e matéria orgânica em solos ácidos. Já em solos ligeiramente ácidos ou
neutros, observou-se uma correlação mais forte entre mercúrio e Fe, que entre
mercúrio e matéria orgânica.
O processo de metilação é mediado por bactérias redutoras de sulfato,
ocorrendo preferencialmente em ambientes com alta concentração de material
41
orgânico e elevadas taxas de decomposição, sendo favorecida por águas ácidas e
ricas em carbono orgânico dissolvido (BISINOTI & JARDIM, 2004; BISINOTI, 2005).
A Tabela 4 apresenta as transformações mercuriais no ciclo do mercúrio.
Tabela 4: Transformações Mercuriais durante o Ciclo Biogeoquímico do Mercúrio
(Adaptação de BARKAY et al., 2003).
Processo Tipo Mecanismo
Metilação do Hg (II)
Biótico Transferência do grupo metil pelas bactérias sulfato-
redutoras
Abiótico Metilação através de compostos orgânicos
Desmetilação
Biótico Desmetilação redutora através dos genes merA e merB
Desmetilação oxidativa
Abiótico Fotodegradação
Redução do Hg (II)
Biótico Bactérias redutoras (gene merA) e mecanismos pouco
conhecidos de algas
Abiótico Reações fotoquímicas
Oxidação do Hg0
Biótico Oxidação por hidroxiperoxidades de micro-organismos,
plantas e animais
Abiótico Fotoxidação
O ciclo vai se completando pelas rotas de precipitação, bioconversão em
formas voláteis ou solúveis, reinteração deste na atmosfera ou bioacumulação na
cadeia alimentar dos compartimentos aquáticos ou terrestres (Figura 2).
No fundo dos oceanos o mercúrio é depositado na forma insolúvel (HgS),
podendo permanecer ativo nos sedimentos como substrato para a metilação por
cerca de 100 anos, mesmo quando a fonte é eliminada. No entanto, mesmo após a
sua deposição como HgS, sendo um produto de baixa solubilidade, uma pequena
porção de íons mercúrio proveniente do HgS pode sofrer redissolução.
A ampla distribuição do mercúrio na biosfera, mesmo sob condições naturais,
faz com que este elemento seja classificado como um poluente global (MASON et
42
al., 1994; MASON et al., 1996; ZAGAR et al., 2007). O metilmercúrio se encontra
listado pelo Programa Internacional de Segurança Química como um dos seis
produtos químicos mais tóxicos ao meio ambiente (GILBERT & GRANT-WEBSTER,
1995). Sendo mais um motivo para o estudo do seu comportamento no ambiente por
ser este bastante complexo, e fundamental o entendimento do ciclo biogeoquímico,
bem como da análise dos seus efeitos tóxicos na saúde humana e na biota
(BISINOTI & JARDIM, 2004).
É importante ressaltar que a metilação pode ocorrer tanto em ambientes
naturais quanto impactados (COSSA et al., 1994). E o que determinará se o
ambiente atua como fonte ou sumidouro é o balanço das reações de metilação e
desmetilação. Determinadas condições ambientais ajudam a maximizar
os mecanismos de metilação e complexação orgânica de mercúrio, resultando em
processos diferenciados de contaminação. As condições favoráveis para metilação,
em um ambiente redutor são: anoxia e acidez. (WHO, 1990).
Acredita-se que existam no mínimo duas vias diferentes de desmetilação: a
oxidativa e a redutora mediada pelos genes: merA (observe o esquema na figura 4)
e merB (OREMLAND et al. 1991; BARKAY et al., 2003), como pode ser visto na
Tabela 4. Consideram-se ainda fatores físicos e químicos como pH, temperatura,
condutividade, potencial de oxirredução, oxigênio dissolvido, presença de íons
sulfeto e carbono orgânico, quando se busca avaliar a metilação do mercúrio e sua
acumulação na biota aquática. A metilação pode ser inibida na presença de
elevadas concentrações de Demanda Química de Oxigênio (DQO) devido ao
aumento na complexação de Hg com outros ligantes orgânicos, reduzindo a
disponibilidade do Hg para as bactérias, particularmente na faixa de pH 5,0-7,5
(BISINOTI & JARDIM, 2004).
43
Figura 4: Esquema da resi stência bacter iana ao mercúrio baseado no operon mer A (adaptado de Brock Biology of M icroorganisms, 2002).
3.5 TOXICIDADE
Os efeitos da contaminação com mercúrio procedem de estudos com a
população contaminada, normalmente por acidentes de contaminação ambiental que
afetaram os alimentos e a água de consumo. Acidentes com contaminação por
mercúrio ocorreram em Minamata, Iraque, Niigata, Gana e Canadá (AZEVEDO,
2003). Na década de 1950 e 1960, a atenção global se voltou ao problema da
contaminação por esse metal no Japão (poluição de sistemas aquáticos). Um deles
na Baía de Minamata, na Costa do Mar Shiranui e o outro na Bacia do Rio Agano.
Embora este acidente tenha ocorrido há mais de 50 anos, ainda é mostrado
como exemplo da fragilidade do homem mediante os produtos químicos. A
população de uma vila próxima à baía foi contaminada por mercúrio através do
consumo de animais marinhos contaminados. Cerca de 3.000 pessoas
apresentaram sintomas que foram atribuídos a uma doença que mais tarde foi
chamada de “Doença de Minamata” ou “Mal de Minamata”. Na verdade, estima-se
que o número de pessoas que foram contaminadas por metilmercúrio seja muito
maior (ROSS, 1996; HONDA et al., 2006). Ao longo do tempo, foi observado o
44
aumento considerável do número de bebês recém-nascidos com problemas
neurológicos. Essas desordens foram atribuídas à exposição materna ao
metilmercúrio durante a gravidez (ETO, 1997; HONDA et al., 2006; EKINO et al.,
2007; LI et al., 2009).
A doença de Minamata revelou que a assimilação de metais pesados pelos
sistemas biológicos ocorre por diversas vias (MANO et al., 2005). Nas plantas
através das raízes e folhas, e nos animais, mediante a ingestão de alimentos e pela
via respiratória. Os organismos aquáticos extraem da água o oxigênio dissolvido e
os alimentos, estando sempre expostos aos íons existentes no meio. Na época, a
concentração de mercúrio nos sedimentos da baía chegou a 2.010 mg /Kg peso
seco (HARADA, 1995).
Embora o acidente envolvendo mercúrio de maior repercussão mundial tenha
ocorrido no Japão, há relatos de problemas na Suécia, Guatemala, Paquistão, Novo
México, Canadá e Iraque. Sendo considerado mais grave o acidente no Iraque, na
década de 1970, em que foram registrados cerca de 7 mil casos de envenenamento.
A contaminação ocorreu através de sementes tratadas com fungicidas. A causa
dessa tragédia que culminou com a morte de mais de 450 pessoas foi o consumo de
sementes de trigo contaminadas com metilmercúrio. O uso do metilmercúrio, neste
caso, foi para evitar o crescimento de fungos em sementes destinadas ao plantio
(BAKIR et al., 1973; BARROCAS, 1994; REIS, 2008).
O problema da contaminação por mercúrio, no Brasil, tornou-se bastante
conhecido pela comunidade internacional devido à corrida para produção de ouro na
região amazônica durante a década de 1980 (VASCONCELLOS, 2010). E durante
muitos anos, as elevadas concentrações de mercúrio nesse ecossistema foram
relacionadas à atividade garimpeira (MALM et al., 1990; LACERDA & PFEIFFER,
1992; HACON et al., 2008). Porém, de acordo com ROULET & LUCOTTE (1995)
existe a hipótese de que estão presentes fontes naturais de mercúrio no solo
amazônico e, por isso, são detectados níveis elevados de mercúrio na população e
na biota da região.
Existem relatos da presença de mercúrio em corpos hídricos (em rios e mares)
e de contaminações de alimentos e ambientes. Em ambientes marinhos, têm sido
registrados casos de poluição por mercúrio, em decorrência de atividades industriais
45
nos estados da Bahia, Pernambuco, São Paulo e Rio de Janeiro (FERREIRA et al.,
1979; MARINS et a.l, 1998 e KEHRIG et al., 1998; REIS, 2008).
Em águas doces encontram-se:
Estudos em Poconé, no Mato Grosso, que constataram contaminação
decorrente da prática do garimpo (CAMARA et al., 1996);
Estudo que relata a contaminação por mercúrio no rio Botafogo, um dos
principais tributários do canal de Santa Cruz, em Recife, Pernambuco, onde uma
fábrica de cloro-álcalis lançou grandes quantidades de mercúrio até o ano de 1991
(MEYER et al., 1998);
Estudo que evidenciou a presença de mercúrio em sedimentos do rio
Cubatão (resultados variaram de 1,8 a 21,4 ppm de mercúrio e após a dragagem
variaram de 0,015 a 0,93 ppm, no ano de 1998 (AZEVEDO, 2003).
Outro problema de contaminação ocorreu em Canoas (RS), onde a REFAP
S.A. processou 3 milhões de metros cúbicos de petróleo contaminado com mercúrio
entre 1993 e 1997, originando efetiva degradação ambiental (REIS, 2008). Segundo
o Ministério Público, teriam sido lançadas 3,3 toneladas de mercúrio em média nas
águas, no ar e no solo. Por decisão judicial, a empresa não pode processar petróleo
que contenha teores de Hg > 20 ppb, devolvendo o produto contaminado adquirido
ao país de origem com as devidas cautelas para o transporte (ESTADÃO, 2004).
Conforme o estado molecular do mercúrio, a sua toxicidade varia
significativamente. O mercúrio metálico, por exemplo, usado na fabricação de
amálgamas para o uso odontológico, quando inalado apresenta um elevado poder
de toxicidade, pois pode ser convertido à forma metilada nos pulmões. Na forma de
vapor, como é liberado na maior parte em garimpos de ouro, é absorvido através do
pulmão. Em contato com o sangue, o mercúrio é oxidado pelos eritrócitos, a Hg2+ e
rapidamente distribuído pelo corpo, podendo se ligar também à albumina e à
hemoglobina e acumular no sistema nervoso central (OMS, 1978; JAHANBAKHT,
2002; AZEVEDO, 2003). Os sais mercúricos constituem a forma mais irritante e
agudamente tóxica do metal, sendo ainda muito utilizados na indústria como
catalisadores. Sua descarga industrial nos rios tem provocado contaminação do
ambiente em muitas partes do mundo (MANO et al., 2005).
46
O metilmercúrio é a espécie mais tóxica do mercúrio e o interesse em seu
estudo deve-se ao seu potencial de bioacumulação e biomagnificação, e à sua baixa
velocidade de eliminação, por ter uma meia-vida longa. Nos humanos, sua meia vida
é de cerca de 70 dias (NEATHERY & MILLER, 1975), enquanto nos peixes 1000
dias (AZEVEDO, 2003). Este composto age como inibidor e modificador das
atividades protéicas mesmo em baixas concentrações, por se ligar aos grupos
sulfidrila das proteínas (GALVÃO & COREY, 1987), e rapidamente se converter em
um complexo protéico de grande mobilidade através dos tecidos.
A distribuição pode levar até seis dias, já que são lipossolúveis e se difundem
facilmente através das membranas celulares, tendo longo tempo de retenção
biológica. O composto pode ser absorvido pela pele, e aproximadamente 100% pelo
trato gastrointestinal, sendo a dieta uma das principais vias de exposição ao
metilmercúrio (HUGUNIN & BRADLEY, 1975).
Alguns estudos relatam acidentes por intoxicação com metilmercúrio, onde se
observa maior suscetibilidade na vida intrauterina (onde pode interferir nos
processos de divisão celular, causando danos no sistema nervoso central), por ser
uma neurotoxina potente, levando inclusive a má formação cefálica (CANELA,
1995). O estudo descreve ainda que pesquisas realizadas em ratos comprovam que
o metilmercúrio exerce ação cancerígena. Nos seres humanos, o metilmercúrio tem
um tempo de meia-vida biológico relativamente longo, de 44 a 80 dias (NEATHERY
& MILLER, 1975), e sua excreção ocorre via fezes, leite materno e urina. Os
principais sintomas associados à toxicidade incluem tremor, vertigem,
entorpecimento, dor de cabeça, cãibra, fraqueza, depressão, distúrbios visuais,
dispneia, tosse, inflamações gastrointestinais, queda de cabelo, náuseas e vômitos.
A toxicidade do mercúrio vem sendo bastante avaliada atualmente, pois o
metal está incluído no rol das substâncias tóxicas persistentes e está sob o
monitoramento do Global Environmental Facility (GEF), uma organização financeira
independente que promove, desde 1991, projetos e programas internacionais
voltados para a proteção do ambiente global. O GEF apoia diversos projetos
ambientais entre os quais aqueles que envolvem o mercúrio (GRIGOLETTO et al.,
2008). No Reino Unido, o Departamento de Meio Ambiente, incluiu o mercúrio em
sua lista de poluentes para controle prioritário (COSTLEY et al., 1999, 2000).
47
3.6 ESPECIAÇÃO
Em virtude das diversas espécies de um mesmo elemento apresentar
comportamentos diferenciados, como solubilidade, volatilidade e toxicidade distintas,
podem causar danos distintos aos seres humanos, dependendo da forma química e
dos fatores de exposição para cada espécie.
Desta forma, verifica-se a necessidade de buscar métodos que estejam além
da determinação quantitativa dos elementos presentes, ou seja, métodos que sejam
capazes de quantificar e identificar as espécies. Muitos estudos tratam da
necessidade de técnicas mais sensíveis e precisas para a determinação das
espécies em diferentes matrizes amostrais (CANELA, 1995).
As principais áreas de interesse envolvem o monitoramento de locais poluídos
por espécies organometálicas e inorgânicas tóxicas. Muitos estudos relacionados à
biometilação de metais (especialmente mercúrio) e semimetais (arsênio e selênio)
têm sido feitos, uma vez que estes elementos podem apresentar um alto nível de
toxidez, dependendo do estado de oxidação em que se encontram (GERVASIO et
al., 2003).
3.6.1 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO
O interesse na determinação quantitativa do mercúrio gerou um progresso
expressivo no desenvolvimento de técnicas analíticas para este metal. Isso devido a
sua alta toxicidade, baixo teor de mercúrio nas amostras, bem como a sua natureza
volátil e associação com outros compostos (REIS, 2008).
Os métodos analíticos para a determinação de mercúrio são selecionados de
acordo com a natureza da amostra e a concentração de mercúrio esperada. Em
geral, estes métodos obedecem à seguinte metodologia: coleta de amostra, pré-
tratamento/ preservação/ estocagem da amostra, liberação do mercúrio da matriz,
extração/ purificação/ pré-concentração, separação das espécies de interesse e
determinação (MITRA, 1986; CANELA, 1995). As técnicas tradicionais de métodos
específicos em química analítica mostram-se altamente sensíveis.
48
No entanto, estes possuem limites de detecção bastante dependentes do
procedimento analítico global, incluindo coleta e preparação da amostra antes da
quantificação. A necessidade de se monitorar o mercúrio no meio ambiente levou ao
desenvolvimento de técnicas de análise deste elemento, que pode estar presente
em concentrações muito baixas nas amostras. A capacidade de se associar a muitos
tipos de compostos exige técnicas cada vez mais sensíveis e precisas para
determinação das diversas formas mercuriais em diferentes matrizes. A maioria dos
métodos descritos na literatura para a determinação de mercúrio é caracterizado por
baixos limites de detecção, mas apresentam custos elevados de operação,
impossibilitando seu uso em grande escala, o que não é ideal para programas de
monitoramento contínuo (BONTIDEAN et al., 2004). Baseado na toxicidade de um
componente químico, como o mercúrio, sabe-se da importância de um
monitoramento contínuo, principalmente após acidentes envolvendo este metal.
Os métodos mais frequentemente utilizados para a quantificação de mercúrio e
seus respectivos limites de detecção são encontrados na Tabela 5 (MIRACONI et
al., 2000).
Tabela 5: Métodos usados na Quantificação do Mercúrio (Adaptado de MIRACONI et al., 2000).
Método Limite de Detecção
Espectrometria de Absorção atômica Forno de Grafite 1ng/g
Vapor Frio 0,01 - 1 ng/g
Espectrometria de fluorescência atômica Vapor Frio 0,001 - 0,01 ng/g
Detector de Captura eletrônica 0,01 - 0,05 ng/g
Cromatografia gasosa Detector de Emissão Atômica 0,05 ng/g
Espectrometria de massa 0,01 - 0,05 ng/g
Detector de UV 1 ng/mL
As amostras ambientais destinadas às análises de teor de mercúrio
apresentam níveis baixíssimos do metal, em geral na faixa de nanogramas do metal
por grama de amostra (ng/g). Para isto, são requeridos métodos específicos, que
49
englobem aspectos como disponibilidade do equipamento, complexidade do
processamento das amostras, reprodutibilidade dos resultados, sensibilidade do
aparelho e limite de detecção do método empregado (WHO, 1989).
Além disso, verifica-se que a determinação simultânea de mercúrio orgânico e
inorgânico é dificultada. Em meios aquosos, por exemplo, a baixa concentração de
mercúrio leva a grandes volumes requeridos para as análises. Com isso, etapas de
pré-concentração são essenciais para que o detector possa ser sensível às baixas
concentrações (HANDBOOK, 2007).
A análise por ativação com nêutrons é um método não destrutivo, específico e
com alta sensibilidade. O método consiste na irradiação da amostra com um fluxo de
nêutrons, sendo produzidos cinco nuclídeos, mas somente o Hg-197, com meia vida
de 65 horas, e o 203Hg, com meia vida de 47 dias, são determinados. Esta técnica é
muito lenta e cara (Ministério do Meio Ambiente do Japão, 2004).
O método de absorção atômica convencional utilizando chama, é bastante
simples, baseando-se na absorção da radiação pelos átomos de mercúrio em
253,65 nm. No entanto, não apresenta sensibilidade suficiente à determinação de
amostras ambientais, onde as concentrações são da ordem de partes por bilhão e
os resultados podem ser comprometidos por interferentes espectrais (Ministério do
Meio Ambiente do Japão, 2004). Devido à volatilidade do Hg elementar, este pode
ser determinado sem a necessidade de chama. Por não utilizar chama, este método
é denominado de absorção atômica com vapor frio (CVAAS), tal método é de grande
eficácia em diversos tipos de análises (COSTLEY et al., 2000; MIRACONI et al.,
2000). Este método apresenta como principal desvantagem a possibilidade de
ocorrência de interferências espectrais em função da presença de NO2, SO2 ou O3
(MORITA et al., 1998). O emprego deste método exige a redução do íon mercúrico à
forma elementar, empregando cloreto estanoso (SnCl2) como agente redutor
(ZENEBON et al., 1994), que é carreado por uma corrente de ar ou algum outro gás
inerte (TAKASE et al., 2002). O vapor de mercúrio é liberado da solução pela
passagem de ar, nitrogênio (N2) ou argônio (Ar), empregando um separador gás-
líquido. O mercúrio é, então, arrastado pelo caminho ótico do espectrômetro de
absorção atômica, sendo medido por um detector de diodo de silício, onde os seus
átomos absorvem radiação UV em 253,65 nm (COSTLEY et al., 2000).
50
A espectrometria de fluorescência atômica de vapor frio (CVAFS) consiste na
detecção do sinal de fluorescência emitido pelo mercúrio e é considerado um
método mais sensível do que a CVAAS. Assim como a CVAAS, a CVAFS só detecta
mercúrio na forma elementar (Hg0). Substâncias gasosas como CO/CO2, O2 e N2
afetam a sensibilidade do método (Ministério do Meio Ambiente do Japão, 2004).
Para a determinação de mercúrio total, tanto por CVAAS quanto por CVAFS,
os compostos de mercúrio são convertidos a íons Hg2+ com os mais diversos tipos
de agentes oxidantes. Posteriormente, o Hg2+ é reduzido a Hg0, podendo então ser
pré-concentrado (ou não) em coluna de ouro (MIRACONI & BUENO, 2000).
A maior parte dos métodos analíticos usados para a determinação de traços de
mercúrio requer sua conversão à forma iônica ou elementar. Diferentes métodos têm
sido propostos para este pré-tratamento, no qual a ligação organomercúrica deve
ser destruída.
Outro método é o de HPLC-ICP-MS, que se baseia na utilização de um
espectrofotômetro de massas de plasma indutivamente acoplado a uma coluna de
cromatografia líquida de alto desempenho. Tal método permite realizar a detecção e
subsequente quantificação de determinadas espécies, através do fracionamento das
mesmas (HANDBOOK, 2007). O fracionamento ocorre em uma coluna
cromatográfica líquida de alta performance (HPLC), que efetua a separação, em
paralelo, entre matriz e espécies e entre as espécies entre si, para que, então, o
espectrofotômetro de massas de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) possa
detectar as espécies de interesse, promovendo-se, por fim, a quantificação
(HANDBOOK, 2007). O cromatógrafo, responsável pelo fracionamento, também
permite que sejam obtidos os tempos de residência de cada uma delas. Entretanto,
há a necessidade de comparar estes tempos com padrões, ou até mesmo realizar
uma análise adicional com espectro de massas, o que permitirá ter certeza sobre
cada componente da amostra. Por tal motivo, faz-se necessário o acoplamento
(HANDBOOK, 2007), mas não necessita de etapas de pré-concentração. Este
método permite limites de detecção para metilHg, EtilHg e Hg2+ da ordem de ng/L
(VEIGA, 2000).
Existe ainda uma metodologia de isótopos de mercúrio em fase gasosa. Sabe-
se que isótopos de mercúrio são compostos extremamente estáveis que estão
51
presentes em diferentes formas no ambiente. Este número elevado de espécies é
decorrente de etapas de fracionamento que ocorrem durante o transporte, o
equilíbrio e a transformação do mercúrio (BERGQUIST & BLUM, 2009).
Muitos estudos foram realizados com avaliação dos efeitos dos isótopos de
mercúrio em fase gasosa através da avaliação do equilíbrio líquido/gás (ESTRADE
et al., 2009; GHOSH et al., 2009), da volatilização do mercúrio para a fase gás
(GHOSH et al., 2009), ou associando a redução de mercúrio a Hg0 e inferindo
impactos na fase gasosa (ZHENG et al., 2007). Avaliar os efeitos causados pelos
isótopos durante a evaporação da água é de extrema importância. Para isso, o
método mais utilizado foi determinado empiricamente em MERLIVAT (1978).
GROSS e colaboradores (2014) propuseram um modelo aprimorado para a
quantificação do mercúrio elementar (Hg0) na forma isotópica, permitindo a avaliação
dos efeitos causados pelos mesmos, baseando este modelo na teoria da cinética
dos gases. Neste, a difusão do mercúrio elementar em fase gasosa apresenta
limitações de transferência de massa, concentração do isótopo e transporte do metal
em solos áridos (WALVOORD et al., 2008) e até mesmo baixa remoção do mercúrio
por absorventes de gases de combustão (PAVLISH, 2003). Por isso, associá-la ao
fracionamento isotópico colaboraria com o aperfeiçoamento do método, porém esta
incorporação não exclui todas as limitações.
Por este motivo, a pesquisa de GROSS e colaboradores (2014) mostrou que as
difusividades atômicas dos isótopos de mercúrio no ar são elevadas e podem ser
modeladas com a teoria cinética dos gases. Possibilitando o uso dos resultados
obtidos na interpretação de sinais de isótopos, em contextos ambientais como
industriais, com modelos preditivos para o ciclo biogeoquímico do mercúrio e para a
identificação de fontes de mercúrio.
Outro método baseia-se no efeito de cinzas modificadas com HBr na adsorção
de mercúrio elementar. De acordo com a Sociedade Federativa Brasileira (2014), as
usinas termelétricas são instalações industriais responsáveis pela geração de
energia elétrica a partir de energia liberada em forma de calor, que ocorre, em geral,
por meio da combustão de óleos ou carvões, que promovem a emissão de vapor.
Tal vapor passa por um processo de resfriamento em um condensador, sendo
convertido novamente em água, retornando aos tubos da caldeira e dando início a
52
um novo ciclo. Quando gás natural é utilizado para efetuar a queima, acaba-se
formando uma corrente rica em agentes oxidantes, redutores e com mercúrio nas
formas particulada, oxidada e elementar; além disso, por ser um combustível fóssil,
não se recupera (SONG et al., 2014; SFB, 2014).
SONG e colaboradores (2014) propuseram a utilização de cinzas volantes
modificadas com HBr (impregnados nas cinzas) como absorventes para capturar o
mercúrio elementar. As cinzas são injetadas na corrente de saída do pré-
aquecimento do combustível, para oxidar e absorver o mercúrio. Para que a
capacidade de adsorção das cinzas modificadas pudesse ser certificada, utilizou-se,
em um reator de leito fixo, uma análise termogravimétrica nas cinzas antes do
contato com a corrente de mercúrio e uma análise termogravimétrica acoplada à
espectrometria de massas (TG-MS) após o contato com a corrente de mercúrio,
elucidando-se o mecanismo de captura de Hg0 (SONG et al., 2014).
Outro método consiste na extração do ponto nuvem com utilização do
Surfactante Não-iônico Octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-114). Sabe- se que
amostras biológicas apresentam um elevado nível de complexidade frente à
determinação de quaisquer elementos. Extrações do tipo líquido-líquido e os
métodos convencionais de concentração requerem um tempo elevado e grandes
volumes de solventes com alta pureza. Além disso, tem-se o problema referente ao
tratamento dos solventes utilizados, espécies orgânicas com elevada capacidade
poluente (MANZOORI, 2004). A técnica de ponto nuvem vem sendo utilizada para
fins de extração, purificação e pré-concentração, fundamentais no tratamento de
amostras ambientais contaminadas, sejam estas líquidas (águas) ou sólidas (solos)
(EVDOKIMOV & WANDRUSKA, 1998). Está baseada no comportamento dos
surfactantes não-iônicos em soluções aquosas, havendo, como consequência, a
separação de fases com o aumento da temperatura ou com a adição de um agente,
normalmente um sal (SILVA, et al., 2001; QUINA & HINZE, 1999). O Triton X-114, em
solução aquosa promove a turbidez do meio quando é promovida elevação da
temperatura, em uma estreita faixa, característica demonstrada por qualquer
surfactante sob as mesmas circunstâncias, sendo esta temperatura referida como
ponto nuvem (VEIGA, 2000).
53
Os métodos tradicionais de detecção não permitem distinguir poluentes que
estão disponíveis para os sistemas biológicos dos inertes ou indisponíveis, uma
questão especial em relação aos metais tóxicos. Conforme visto anteriormente a
biodisponibilidade é essencial na determinação da toxicidade e do potencial de
bioacumulação do metal, bem como na busca por métodos eficientes na
remediação. Novas tecnologias a partir do uso de ferramentas analíticas vêm sendo
desenvolvidas para serem aplicadas no diagnóstico do meio ambiente.
Neste contexto, surgem sensores específicos, os biossensores, como
alternativa aos métodos tradicionais, pois permitem determinar diretamente a
biodisponibilidade das substâncias químicas e seus efeitos biológicos, e ainda,
complementar os métodos tradicionais, gerando novas informações que são
fundamentais na avaliação do risco de poluentes (SELIFONOVA et al., 1993).
3.7 BIOSSENSORES COMO ELEMENTOS DE DETECÇÃO
Todos os anos centenas de novas substâncias químicas são sintetizadas e
liberadas no ambiente, sem que se conheçam adequadamente seus efeitos tóxicos,
principalmente os de longo prazo. Há uma continua demanda por novas técnicas
analíticas que sejam capazes de avaliar esses potenciais riscos para o ambiente e
para a saúde humana (CAROLI, 1996).
A importância de um método que permita a obtenção de resultados confiáveis
frente a necessidades relacionadas à eficiência, custo, tomada rápida de resultados
e, se possível, dosagem de mercúrio biodisponível são fatores que levaram à
pesquisa de um método baseado em biossensores (SINGH & MITTAL, 2012). Os
biossensores pertencem a uma área multidisciplinar para a qual não existe uma
definição que contemple todas as suas possíveis configurações, por isso pode-se
encontrar várias formas de definição para estes na literatura.
Em geral trata-se de uma ferramenta analítica, um sensor químico que usa
propriedades de reconhecimento de componentes biológicos com atividade catalítica
ou reações de afinidade em contato íntimo, camada sensível, com um transdutor de
54
sinal. O potencial para aplicação de um biossensor está na habilidade deste em
medir a interação de contaminantes com sistemas biológicos através da capacidade
de reconhecimento biomolecular (ARYA et al., 2008). De acordo com a IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemistry, 2001 apud SALGADO, 2001),
biossensor é “um instrumento integrado que é capaz de fornecer uma informação
analítica específica, quantitativa ou semiquantitativa através do uso de um elemento
de reconhecimento biológico (receptor bioquímico) que está em contato direto com o
elemento de transdução”.
Os componentes usados no desenvolvimento de um biossensor incluem:
Componente biológico;
Sistema de transdução;
Sistema de processamento de dados e registro.
A seleção do material biológico e do transdutor envolve uma série de fatores,
visando especificidade, estocagem e estabilidade operacional e ambiental
(ROSATTO, 2000; ARYA et al., 2008; SALGADO, 2001). A seleção também
depende do analito a ser detectado (MOHANTY & KOUGIANOS, 2006), sendo as
variáveis:
Tipo de amostra,
Tipo de medida pretendida,
Faixa de sensibilidade,
Estabilidade operacional nas condições de medição,
Reprodutibilidade dos resultados,
Minimização de interferências e
Tempo de resposta.
Os biossensores podem ser classificados de acordo com o receptor biológico
que proporciona a resposta seletiva, com destaque para os biossensores
microbianos, enzimáticos, imunossensores e quimiorreceptores (COSTA, 2010).
Entre os compostos adequados para a composição dos biossensores tem-se:
55
enzimas, cofatores, receptores, anticorpos, células de micro-organismos, tecidos de
plantas e animais, e organelas, apresentados na Figura 5.
O receptor bioquímico, ao interagir com o analito por meio de uma reação
química gera um sinal produzido pela difusão de espécies eletroativas, variação de
temperatura, de massa ou viscosidade, da turbidez, emissão ou absorção de luz,
emissão de calor, emissão ou consumo de gases (SILVA, 2009; MELLO & KUBOTA,
2002). Essas alterações são detectadas pelo transdutor escolhido de acordo com a
modificação bioquímica produzida pelo biocomponente. O transdutor é usado para
converter o sinal químico em um sinal elétrico, que poderá ser processado e
reproduzido. Este sinal é proporcional à concentração do analito, permitindo
medições quantitativas em tempo real (o sinal pode ser transformado em um formato
analógico ou digital). A Figura 5 resume de forma clara o que foi supracitado.
Figura 5: Esquema de Funcionamento de um Biossensor (adaptado de BERNAL et al., 2012).
Tais instrumentos apresentam ainda alguns problemas relacionados à
estabilidade e a falta de credibilidade em algumas áreas de aplicação. Estes
desafios contribuem para a escassez de instrumentos no mercado. O fundamental é
almejar a melhoria na confiança e robustez destes sensores de modo a se obter um
biossensor com o desempenho desejado em termos de sensibilidade, alcance
dinâmico e reprodutibilidade (SILVA et al., 2009).
Capazes de combinar a especificidade de um biocomponente ativo a um dado
analito com a sensibilidade de um transdutor, que converte o sinal biológico em um
elétrico, proporcional à concentração do analito e passível de detecção. Isto permite
56
obtenção de respostas mais rápidas e a geração de menos impactos ambientais
(RODRIGUEZ-MOZAZ et al., 2004).
Apresentam características únicas: tamanho, seletividade, especificidade,
reprodutibilidade, curto tempo de análise, capacidade de inclusão em sistemas
integrados, possibilidade de análises em tempo real, relativo baixo custo de
construção e estocagem, potencial para miniaturização, facilidade de automação e
construção de equipamentos simples e portáteis (ROSATTO, 2000, SALGADO,
2001; SADANA, 2003; ARYA et al., 2008; MUTLU, 2010).
A utilização de um biossensor na maioria dos casos, não necessita de técnicos
ou especialistas podendo em alguns casos dispensar o uso de reagentes, podendo
atuar tanto como aparelhos de uso contínuo ou como descartáveis (SILVA, 2009).
Biossensores estão sendo desenvolvidos para diferentes aplicações, incluindo
monitoramento de qualidade de alimentos, através da detecção de contaminantes, e,
particularmente, aplicações médicas, com foco nos ramos clínico e farmacêutico
(COLLINGS & CARUSO, 1997).
Diversos biossensores têm sido desenvolvidos na área ambiental, que utilizam
genes específicos de resistência bacteriana para análise de metais, mecanismo de
resistência desenvolvido ao longo da evolução, que permite a sobrevivência dos
micro-organismos na presença destes metais (CAVALCANTI, 2010). Estes novos
sistemas de detecção, baseados em sensores microbianos, na sua grande maioria,
utilizam a resposta luminescente a um composto tóxico presente no meio poluído
(KARUBE & NAKANISHI, 1994). A tecnologia de DNA recombinante (com uso de
genes repórteres) é usada para projetar e aperfeiçoar tais sensores microbianos,
estes genes produzem respostas fluorescentes ou luminescentes, são bastante
atrativos, uma vez que a bioluminescência é um dos métodos de detecção mais
sensíveis da atividade metabólica (RODA et al., 2004). Apresentam vantagens por
serem não-invasivos e não-destrutivos. A aplicação de fusões gênicas com genes
lux provenientes de várias espécies bacterianas bioluminescentes oferecem a
possibilidade de combinação, em um único micro-organismo, tanto da identificação e
quantificação de um componente específico, quanto do seu potencial de impacto em
um organismo vivo, a biodisponibilidade (RODA et al., 2004).
57
No entanto, a aplicação de biossensores no monitoramento de contaminantes
ambientais enfrenta a dificuldade por trabalhar com matrizes complexas (PATON et
al., 2009). Devido a isso, não se encontram muitos trabalhos com aplicações
genuinamente ambientais na literatura (CAVALCANTI, 2010), como referenciado por
TRANG e colaboradores (2005), que utiliza um sensor microbiano em um estudo de
As em águas potáveis de Bangladesh, e DARDENNE e colaboradores (2007) que
aplicam biossensores na avaliação ecológica de águas na Bélgica. Ambos os
artigos, entretanto, são relacionados a amostras aquosas e focam em analitos
inorgânicos. Assim como em COSTA e colaboradores (2013) que utiliza um sensor
microbiano no estudo de Hg biodisponível em amostras aquosas de chorume. Há
ainda, alguns trabalhos referenciados em amostra de solo contaminado por óleo cru,
no qual utilizaram um biossensor para naftaleno (VALDMAM, 2004; CAVALCANTI,
2010).
A Tabela 6 apresenta três biossensores encontrados na literatura para detecção
de mercúrio em publicações recentes.
Tabela 6: Biossensores detectores de mercúrio mais recentes.
Biossensores Referências
Biossensor a base de Chlorella sp. SINGH & MITTAL, 2012
Biossensor condutimétrico baseado no sistema tri-enzimático para determinação seletiva de íons de metais pesados SOLDATKIN et al., 2012
Biosensor de Grafeno-DNA para detecção seletiva de íons Mercúrio ZHANG et al., 2013
3.7.1 BIOSSENSORES MICROBIANOS
Dentre os biossensores utilizados, os microbianos possuem muitas vantagens
sobre aqueles que utilizam componentes biológicos isolados, como enzimas e
anticorpos: são menos sensíveis a inibição por solutos e mais tolerantes a valores
sub-ótimos de pH e temperatura; possuem uma vida útil mais longa; são mais
baratos, pois geralmente, as células são produzidas facilmente, em grandes
quantidades e não é necessário o isolamento dos componentes celulares receptores
(YAGI, 2007). No entanto, apresentam a desvantagem por terem um longo tempo de
58
resposta quando comparado aos enzimáticos e por serem menos seletivos, já que
um micro-organismo contém inúmeras enzimas.
A utilização de micro-organismos preserva as proteínas em seu ambiente
natural, protegendo-as da inativação por agentes tóxicos externos, tais como, metais
pesados, e ainda evita etapas de purificação. Este tipo de biossensor permite obter
informações do funcionamento do analito dentro da célula, relacionando-os aos seus
efeitos (ex: tóxico, estimulante ou inibidor). Dependendo do objetivo do estudo, estas
informações podem ser muito valiosas.
A chave da utilização de bactérias como biossensores reside no fato de que os
genes que determinam as proteínas envolvidas se transcrevem, quando um
composto contaminante está presente no meio. Desta forma, na presença ou
ausência do contaminante no meio, uma propriedade poderá ser medida. A
tecnologia molecular disponível atualmente permite também aumentar a
sensibilidade do sistema sinalizador frente a um determinado contaminante,
mediante o desenho de cascatas reguladoras que multiplicam ou desfazem a
expressão do gene empregado como indicador. Além disso, a atividade reguladora
pode ser manipulada na direção de ampliar sua resposta frente a variedades
estruturais do contaminante (diferentes espécies).
Biossensores baseados neste tipo de elemento biológico são amplamente
utilizados no monitoramento de contaminantes químicos no meio ambiente, como é
o caso de metais pesados (SELIFONOVA et al., 1993; RAMANATHAN et al., 1997).
O uso da engenharia genética tem facilitado, por exemplo, com a utilização de
micro-organismos geneticamente modificados, e genes sinalizadores de presença
ou ausência de certas enzimas. A utilização destes genes favorece a sensibilidade,
ampliando a faixa dinâmica, a seletividade e especificidade destes biossensores.
Além disso, são de fácil manipulação e alguns estudos já comprovaram ser
ambientalmente seguros (RAMANATHAN et al., 1997). O gene sinalizador é
colocado sob o controle de um promotor, muitas vezes proveniente de um gene de
resistência à substância que se deseja estudar, o qual é induzido apenas pela
presença intracelular desta substância. A sensibilidade é definida pela efetividade da
expressão do gene sinalizador (BARROCAS, 2008).
59
Na construção de biossensores poucos genes sinalizadores são disponíveis. A
maioria deles codifica proteínas repórteres facilmente detectáveis. As proteínas
repórteres mais comuns incluem as luciferases procariota (lux) e eucariota (luc) e a
ainda a proteína verde fluorescente (GFP). Os repórteres que geram respostas
fluorescentes ou luminescentes são bastante atrativos, já que a bioluminescência é
um dos métodos mais sensíveis da atividade metabólica. A proteína verde
fluorescente (GFP) foi isolada de uma água viva e, necessita de uma luz de excitação
prévia para que emita a luz que é quantificada (LEWIS et al, 1998). Outra
desvantagem da proteína verde fluorescente é a necessidade do rompimento celular
para realizar o teste enzimático e ainda o tempo necessário para que a conformação
protéica correta seja alcançada (LAROSSA & VAN DYK, 2000), já que um grande
número de moléculas pode ser necessário para se detectar um mínimo de sinal
(SAGI et al., 2003).
O promotor reage na presença do contaminante e ativa a expressão deste
componente, possibilitando sua quantificação. Tais genes sinalizadores e/ou
reguladores podem ser nativos de uma célula ou adquiridos por transformação
genética. É comum o sistema de regulação transcricional consistir de um gene
regulador, que expressa a sua proteína reguladora e a sequência de DNA promotora,
que controla a sua expressão, a jusante do gene (NIVENS et al., 2004).
Os genes repórteres que geram respostas fluorescentes ou luminescentes são
atrativos devido à quantificação da emissão de luz por um micro-organismo ser
medida por um simples luminômetro. Estes sistemas de regulação são elementos
que trabalham em conjunto para responder a alterações ambientais e controlar a
expressão de um gene ou um operon reforçando a fisiologia celular (NIVENS et al.,
2004).
Para análise ambiental foram desenvolvidos muitos biossensores que utilizam
genes específicos de resistência bacteriana. Ao longo da evolução, os micro-
organismos desenvolveram mecanismos que permitem sua sobrevivência na
presença de componentes tóxicos. Essa variedade de biossensores
bioluminescentes pode ser observada na Tabela 7. Estes são capazes de detectar
as condições gerais de estresse, compostos genotóxicos, oxidantes, metais e
orgânicos xenobióticos (DAUNERT et al., 2000).
60
Tabela 7: Biossensores microbianos recombinantes usando genes luc ou lux como repórter luminescente (CAVALCANTI, 2010).
Célula Recombinante Gene Repórter
Unidade Regulatória
Analito
Escherichia coli luc mer Mercúrio
luxAB Organomercúrios
luxCDABE
Escherichia coli luc ars Arsenito, arsenato,
Staphylococcus aureus luxAB
Staphylococcus aureus luc cad Cádmio
luxAB
Escherichia coli luc znt Zinco
Ralstonia eutrophus luc chr Cromo
Pseudomonas fluorescens luxCDABE nah Naftaleno, salicilato
Escherichia coli luc xyl Benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno (BTEX)
Pseudomonas putida
Pseudomonas putida luxAB dmp Fenóis
Pseudomonas putida luxCDABE tod BTEX
Pseudomonas putida luxCDABE sep Compostos aromáticos
Ralstonia eutrophus luxCDABE bph Bifenilas policloradas
Escherichia coli luxAB alkB Alcanos
Escherichia coli luxCDABE tet Tetraciclinas
Na detecção bioluminescente se faz necessário uma fonte externa de radiação,
uma vez que a luz é produzida pelas reações químicas. A bioluminescência requer
energia na forma de biomoléculas altamente energéticas. As luciferases não
necessitam de luz de excitação e a diferença entre a luciferase procariota e a
eucariota está na sua estrutura e na reação de emissão de luz (LEWIS et al., 1998).
O substrato luciferina da luciferase de vaga-lume (luc) só atravessa a membrana
eucariota em baixos valores de pH e requer a adição de luciferina exógena para a
geração de luz.
A reação da luciferase de vaga-lume (firefly luciferase - Photinus pyralis)
apresenta algumas características únicas, quando comparada a outros ensaios. As
reações enzimáticas, em sua maioria são medidas pelo consumo de um substrato,
ou pela geração de um produto, geralmente um composto estável que pode ser
determinado após um tempo específico. Já na reação da luciferase, os produtos
61
típicos que se acumulam, AMP (adenosina monofosfato), PPi (ânion pirofostato) e
CO2, não são medidos, e sim a luz produzida, que é integrada pela reação durante
um determinado período de tempo (FORD & LEACH, 1998). Dessa forma, a emissão
de luz é função da quantidade de ATP presente no meio.
Em relação ao mecanismo de funcionamento da Escherichia coli MC1061,
usada no presente trabalho, esta tem o gene repórter sob o controle de um promotor
que é induzido pela presença intracelular de um metal específico, o mercúrio. Utiliza
o gene LucFF da luciferase do vaga-lume (firefly) como gene repórter inserido no
transposon 21. O plasmídeo (pT0011) responsável pela detecção do Hg2+ contém o
gene repórter sob o controle do promotor mer (merR + gene promotor), que é
induzido por Hg2+ dentro da célula (BARROCAS, 2003; COSTA, 2010), como pode
ser observado na Figura 6. O sinal de emissão da luz medida por biossensores
deste tipo é dependente não só da concentração do substrato indutor, como da
estabilidade da enzima luciferase e também da presença de outras substâncias
estimulantes ou inibitórias na amostra a ser medida (STICHER et al.,1997).
Figura 6: Esquema da inserção do promotor o transposon Tn 21 (Adaptado de BARROCAS, 2003).
Ainda com relação à estirpe MC1061, esta possui ainda dois outros genes que
conferem resistência aos antibióticos, que são kan = canamicina e cat =
cloranfenicol. A resistência a canamicina é peculiaridade para esta estirpe em
particular, uma vez que o gene que confere a resistência está ativo o tempo todo
(BARROCAS, 2003). Enquanto que o gene de resistência a cloranfenicol se
encontra localizado a jusante do gene da luciferase do vaga-lume e também está
sob o controle do promotor mer (VIRTA et al., 1995).
No caso da Escherichia coli MC1061, a luciferina é o substrato para a reação,
que vai atravessar as membranas celulares bacterianas apenas em pH ácido.
Assim, apenas a forma protonada de luciferina é facilmente permeável pela
membrana celular. Por conseguinte, para um ensaio bem sucedido da reação da
luciferase do vaga-lume in vivo, o pH extracelular do meio deve ser ligeiramente
ácido. Assim, caso esta condição não seja atingida, a membrana celular funciona
62
como uma barreira ao transporte da luciferina, e a medida de luminescência será
mais dependente da taxa de difusão da luciferina do que do montante de luciferase
intracelular (FORD & LEACH, 1998; TAURIAINEN et al., 1999).
3.8 A BAÍA DE GUANABARA
A Baía de Guanabara, segunda maior baía do litoral brasileiro segundo o
Instituto Estadual do Ambiente (INEA), possui uma área de cerca de 380km2,
englobando praticamente toda a Região Metropolitana do Estado do Rio de Janeiro,
de forma total ou parcial o território político-administrativo de 16 municípios, sendo
Cachoeiras de Macacu, Niterói, Nova Iguaçu, Petrópolis, Rio Bonito e Rio de
Janeiro, Nilópolis, Belford Roxo, Mesquita, São João de Meriti, Duque de Caxias,
Guapimirim, Magé, Itaboraí, Tanguá e São Gonçalo (COELHO, 2007).
O território da Bacia da Guanabara está compreendido na área intertropical, e
devido a isso, possui um clima quente e chuvoso tipicamente tropical, a bacia é
drenada por cinquenta e cinco rios, sendo os principais o Macacu, Guapiaçu,
Guapimirim, (Caceribu, Guaxindiba, Guaraí, Imboassica, Magé, Estrela, Saracuruna,
Meriti, Iguaçu e Pavuna (AMADOR, 2012).
A Região Hidrográfica da Baía de Guanabara (RHBG) abriga o maior parque
industrial do Estado, apresenta um alto grau de complexidade tanto em sua
dinâmica ecológica quanto no que se refere à sociedade que dá vida a este espaço
geográfico (PDRH-BG, 2005).
Nela encontram-se 82 km² de importantes áreas de manguezal, 80% das quais
dentro da Área de Proteção Ambiental, de Guapimirim, sob a tutela do IBAMA
(ECOLOGUS-AGRAR, 2005). A baía é resultante de uma depressão tectônica
formada no período Cenozóico, sua topografia acidentada e diversa caracteriza-se
por uma grande planície sedimentar (ECOLOGUS-AGRAR, 2005). Sendo principal
ecossistema da Bacia Hidrográfica a Mata Atlântica, um dos ecossistemas mais
ameaçados do mundo (COELHO, 2007).
A região se encontra inserida na área intertropical, e seu clima é caracterizado
por fatores de ordem geográfica (posição, maritimidade, continentalidade e
63
topografia) e de ordem dinâmica (circulação geral da atmosfera), e grande
diversificação tanto de regime de temperatura, quanto de distribuição de precipitação
(AMADOR, 1997). O clima da região é tropical úmido, com uma estação chuvosa no
verão, de dezembro a abril e outra seca, entre junho e agosto (KJERFVE et at.,
1997). Entretanto a estação seca é pouco pronunciada, com a variação da
precipitação ocorrendo em função do relevo.
A baía possui salinidade alta, e esta decresce da entrada para o interior, devido
à influência das descargas fluviais. Enquanto que com a temperatura se observa o
contrário, devido à água fria do Oceano Atlântico (CARVALHEIRA, 2012). Os fatores
como profundidade, velocidade de corrente e fluxo de água doce proporcionam ao
sistema distintos compartimentos. As correntes provenientes do Oceano Atlântico
atuam na renovação de oxigênio, na troca e na limpeza das águas da baía. O tempo
de renovação de suas águas é de cerca de 10 a 20 dias (WASSERMAN et al.,
2000). O canal central é o principal controlador dos processos hidrodinâmicos da
baía.
Essa região abriga cerca de 10.000 indústrias ao seu redor, as quais são
responsáveis pelo lançamento de 4.800 Kg de metais pesados por dia
(WASSERMAN et al., 2000). Além disso, encontram-se instalados 2 portos, 2 bases
navais, 32 estaleiros, 2 refinarias e terminais marítimos de petróleo (CARVALHEIRA,
2012).
Os rios da bacia, que atravessam as áreas mais densamente povoadas são
vazadouros de esgoto, recebendo ainda grandes contribuições de despejos
industriais e lixo. Nesta situação estão incluídos os afluentes da Costa Oeste da
Baía, que vão do Canal do Mangue ao Canal de Sarapuí, além dos rios Alcântara,
Mutondo, Bomba e Canal do Canto do Rio, na Costa Leste. Esses rios são utilizados
basicamente para diluição de despejos, embora o uso que lhes é recomendado seja
o de harmonia paisagística e estética (ECOLOGUS-AGRAR, 2005). Os demais rios
da bacia são menos degradados. O rio Guapi-Macacu tem a água de melhor
qualidade da Bacia, sendo fonte de abastecimento público para os municípios de
Niterói e São Gonçalo, com captação no canal de Imuana para a Estação de
Laranjal (ECOLOGUS-AGRAR, 2005). A tendência mais preocupante do processo
de degradação da Baía tem sido o rápido crescimento de algas. O elevado grau de
64
eutrofização vem se espalhando das regiões Oeste e Noroeste, altamente
urbanizadas, para as demais regiões (ECOLOGUS-AGRAR, 2005).
A Baía de Guanabara é escolhida como objeto de muitos estudos por ser
“emblemática e genuína representante dos frágeis e produtivos ecossistemas
costeiros tropicais” que, resultantes de uma longa evolução, foram submetidos a
uma rápida degradação ambiental e social (AMADOR, 2012). A Baía de Guanabara
tão impactada, já foi um ambiente ideal para fauna e flora com alta biodiversidade.
Ainda existem regiões que não são tão afetadas, mantendo suas características
naturais quase preservadas.
A opinião pública passa então a questionar como ficam os responsáveis pelos
danos causados ao meio ambiente. Esse fato vem se intensificando nas últimas
décadas devido ao crescimento das atividades industriais. Diante dessa situação,
melhores padrões de produção e atividades que respeitem os limites de saturação
do meio ambiente foram buscados através de ferramentas ambientais (ECOLOGUS-
AGRAR, 2005). Este paradigma promoveu uma geração de respostas: o setor
produtivo passou a transformar seus processos a fim de demonstrar sua
preocupação com o meio ambiente, incorporando ações efetivas para preservá-lo
como o reaproveitamento de energia, a seleção de matérias-primas, o
desenvolvimento de novos processos e produtos e a reciclagem de resíduos
(SANTOS & GUIMARÃES, 2003).
Desta forma, a Baía de Guanabara passa a ser beneficiada por projetos de
despoluição como o PDBG que prevê a diminuição da carga de matéria orgânica
(DBO) nas águas (estipulando DBO < 5mg/L). Entretanto, sabe-se que o decréscimo
da carga orgânica nas águas alteraria o estado de oxirredução do meio, sobretudo
das camadas superficiais do sedimento (CARVALHEIRA, 2012). Esse programa
abrange programa de saneamento nos municípios do entorno da Baía de
Guanabara, com intuito de reverter à degradação ambiental desta Baía, através da
implantação de sistemas de esgotamento sanitário; do fortalecimento institucional
(melhoria dos serviços por parte das entidades envolvidas) e da promoção das
políticas públicas municipais de saneamento. Algumas ações como implantações de
oito Estações de Tratamento de Esgoto (ETEs) já foram estabelecidas são elas: ETE
Sarapuí, ETE Pavuna, ETIG, ETE São Gonçalo, ETE Penha, ETE Alegria, ETE
65
Icaraí e ETE Barra. Embora estejam operando abaixo de sua capacidade nominal
(GUANABARA LIMPA, 2014).
Atualmente, o Instituto Estadual do Ambiente (INEA) é o órgão responsável por
um monitoramento, para acompanhar e medir as alterações no ecossistema da Baía
de Guanabara, em função das obras de saneamento e de controle industrial,
promovidas pelo PDBG. O monitoramento é um instrumento importante e
imprescindível tanto como suporte ao controle das atividades poluidoras, quanto
como fonte de informações para o planejamento, devendo ser realizado,
preferencialmente, com constância, regularidade e coerência em suas premissas
básicas, de modo a favorecer a obtenção de dados históricos que permitam detectar
mudanças e tendências na qualidade da água (SANTOS & GUIMARÃES, 2003;
ECOLOGUS–AGRAR, 2005).
Os estudos sobre a contaminação com mercúrio na Baía de Guanabara se
iniciaram no final da década de 1970. Alguns trabalhos na literatura abordam a
questão do mercúrio e do saneamento da região. Os atuais níveis de poluição da
Baía de Guanabara são decorrentes de um processo de degradação que se
intensificou, principalmente, nas décadas de 1950-1960, com o elevado crescimento
urbano verificado, especialmente, na Região Sudeste do Brasil (NETO & FONSECA,
2011). As intervenções nas bacias hidrográficas vêm promovendo mudanças nos
ambientes estuarinos, tais como: na qualidade das águas, nos efeitos que alteram
as taxas e os padrões de sedimentação e na qualidade desses sedimentos.
Há uma renovação cíclica de suas águas com as águas do mar; no entanto, é
receptora de uma significativa bacia hidrográfica, a qual, por sua vez, recebe uma
gama variada de lançamentos líquidos e sólidos. Dentre as potenciais fontes
poluidoras, encontram-se diferentes segmentos industriais, terminais marítimos de
produtos oleosos, dois portos comerciais, diversos estaleiros, duas refinarias de
petróleo, entre outras atividades econômicas.
O desenvolvimento industrial e o crescimento populacional trouxeram, além da
poluição, questões ambientais de ordem física, tais como a destruição dos
ecossistemas periféricos à Baía de Guanabara, os aterros de seu espelho d'água, o
uso descontrolado do solo e seus efeitos adversos em termos de assoreamento,
sedimentação de fundo, inundações e deslizamentos de terra (AMADOR, 1997).
66
Como os sedimentos possuem alta capacidade de complexar os poluentes em
sua matriz, podem ser utilizados como indicadores da qualidade da água. Isso
permite monitorar os impactos da atividade antropogênica sobre o ambiente
(RANGEL et al., 2010). A sedimentação estuarina é formada principalmente por
areia e lama síltica e é rica em matéria orgânica. Os sedimentos lamosos, que se
concentram no interior da Baía, principalmente atrás da Ilha do Governador,
possuem altos teores de metais pesados (GODOY et al., 2012; MARINO et al.,
2011).
A deposição de sedimentos na Baía pode ter origem antropogênica, como
efluentes domésticos e industriais, ou em processos naturais, como a ação de
correntes e ventos e as águas das chuvas. A contribuição dos organismos aquáticos
é através da aglomeração de finas partículas em suspensão, realizada por filtragem
(AMADOR, 1997). GODOY e colaboradores (1998) mostraram através de estudos
que não há grande variação entre as taxas de sedimentação em diferentes regiões
da Baía de Guanabara, sendo os valores de velocidade encontrados variando entre
1 a 2 cm por ano. A alta taxa de sedimentação promove um deslocamento rápido de
uma parcela dos contaminantes, dissolvidos ou em suspensão nas águas, o que
explica o elevado potencial tóxico dos sedimentos nesta região.
A taxa de sedimentação da região aumentou consideravelmente ao longo dos
anos, devido ao aumento do fluxo dos rios, o que acarreta em um maior transporte e
distribuição de sedimentos. Isso é atribuído à expansão das atividades humanas ao
redor da Baía, como crescimento de indústrias, da população, das atividades
portuárias e da construção de aterros (GODOY et al., 1998).
A porção noroeste da Baía representa a principal fonte de emissão de metais
pesados, devido à presença de rios bastante poluídos (como Meriti, Iguaçu, Sarapuí,
Estrela e Irajá) e às atividades de uma refinaria de petróleo na região (DE LUCA
REBELLO et al., 1986; PFEIFFER et al., 1980; PFEIFFER et al., 1982; CARVALHO
et al., 1982; BAPTISTA et al., 2006).
A região nordeste, que possui o mesmo tipo de sedimento que a noroeste,
apresenta menores concentrações de metais pesados devido a presença de uma
área de proteção ambiental (BAPTISTA et al., 2006).
67
BAPTISTA NETO e colaboradores (2003) mostraram que rios das áreas de
São Gonçalo e Niterói também são importantes cargas de metais pesados para a
baía, o que pode ser atribuído ao intenso despejo de esgoto doméstico sem
tratamento. Também foram observadas altas concentrações de metais pesados na
região do porto do Rio de Janeiro. Já na região sul, próxima à entrada da Baía, tem-
se as menores taxas de poluição por metais pesados (BAPTISTA NETO et al.,
2006).
Existem estudos na literatura que relatam dados de concentração total de
mercúrio em sedimentos da Baía de Guanabara (BARROCAS, 1994). DE LUCA
REBELLO e seus colaboradores (1986) relataram concentrações de mercúrio entre
0,07 e 9,8 µg/g de sedimento seco em suas amostras. Godoy e colaboradores
(1998) relataram uma variação de 0,4 a 11,1 µg/g de sedimento seco na
desembocadura Rio Estrela. Já BARBOSA e colaboradores (2004) encontraram
valores de concentração variando entre 1,0 e 2,0 µg/g de sedimento seco no Canal
do Fundão.
3.8 CONSIDERAÇÕES DO PRESENTE ESTUDO
O presente trabalho se encontra inserido na categoria dos sensores
microbianos bioluminescentes, no qual o biocomponente é o micro-organismo
geneticamente modificado Escherichia coli MC1061 para detecção de mercúrio
biodisponível em amostras da Baía de Guanabara. A tecnologia de DNA
recombinante vêm sendo utilizada como ferramenta para pesquisar a
biodisponibilidade do mercúrio em amostras ambientais.
A bactéria E. coli MC1061 é capaz de detectar mercúrio biodisponível, através
da reação da enzima luciferase do vaga-lume (Firefly luciferase), respondendo
quantitativamente quando exposta ao mercúrio, através de bioluminescência.
A área de estudo foi escolhida em virtude dos atuais níveis de poluição da Baía
de Guanabara, resultantes de longa degradação ambiental e social.
E a análise de sedimentos, por sua vez, foi selecionada em função destes
apresentarem a maior acumulação dos metais. Assim, buscou-se amostras de
68
sedimento da Baía para realização dos primeiros testes do biossensor para
detecção de mercúrio em sedimento.
69
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 EQUIPAMENTOS E REAGENTES
Neste primeiro item estão descritos os equipamentos e reagentes utilizados,
apresentados na Tabela 8 e as composições dos meios (Tabela 10) utilizados para o
crescimento celular (meio de cultivo/manutenção), e para os experimentos de
bioluminescência.
Tabela 8: Equipamentos e reagentes.
Equipamentos
Estufa de secagem (QUIMIS)
Placa de aquecimento e agitação (QUIMIS)
Agitador de tubos vortex (QUIMIS)
Espectrofotômetro UV-visível (Q798DRM – QUIMIS)
Espectrofotômetro Hach DR 2000
Balança AG 200- IV2000 – Analisador de Umidade por Infra-vermelho (GEHAKA)
Centrífuga (QUIMIS)
Luminômetro (Luminoskan Ascent 2.4)
Oxímetro (DM – 4P Digimed – Digicrom Analytical 41814)
Medidor de pH (Q400MT – QUIMIS)
Reagentes
* Reagentes utilizados foram adquiridos da VETEC e SIGMA de grau P.A.:
MgSO4, Ca(NO3)2, Glicose, Casamino ácidos, Luciferina, Citrato de Sódio, LB Broth, LB Ágar, Na2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, NaNO3, Monossulfato de canamicina, HNO3, HCl
4.1.1 DESCONTAMINAÇÂO QUÍMICA DOS MATERIAIS
Todos os materiais aplicados nos testes foram descontaminados utilizando
procedimentos de lavagem, ajustados para a sua resistência química específica. Os
banhos de descontaminação empregados são descritos na Tabela 9. Após
lavagem, os materiais eram armazenados em sacos plásticos duplos até o momento
do uso. A descontaminação se faz obrigatória para minimizar a contaminação (pelo
metal mercúrio) nos materiais a serem utilizados nos testes bioluminescentes.
70
Tabela 9: Etapas dos banhos de descontaminação.
Vidrarias/Plásticos Tempo
Solução detergente (EXTRAN) 12 horas
Solução de ácido nítrico 10% (v/v) 6 a 8 horas
Enxague 15 minutos
Lavagem com água deionizada 5 minutos
4.1.2 LUMINÔMETRO COMO ELEMENTO DE TRANSDUÇÃO
Nos ensaios de bioluminescência, foi utilizado como transdutor o luminômetro
Luminoskan Ascent da Labsystems, que é um equipamento capaz de detectar
emissões de luz, formulado de modo a evitar a interferência entre captação de luz de
poços vizinhos (COSTA, 2010). As medidas são fornecidas em unidades relativas de
luz (URL) e são proporcionais à concentração do analito. O limite de detecção
permite detectar até mesmo pequenas concentrações de analito.
O equipamento (Figura 7) possui uma bandeja para abrigar uma placa de 96
poços, nos quais são acondicionadas as amostras, cada poço emite uma
determinada quantidade de luz, que é refletida de forma a atravessar um filtro de
emissão, para atingir o tubo fotomultiplicador.
Figura 7: Equipamento Luminoskan Ascent utilizado para Medição da Luminescência.
(Adaptado de COSTA, 2010).
71
4.1.3 AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES ÓTIMAS DE
BIOLUMINESCÊNCIA
O sinal de emissão da luz medida por biossensores de células inteiras é
dependente não só da concentração do substrato indutor, mas também da
estabilidade da enzima luciferase em uma cepa particular, do seu estado fisiológico,
assim como da presença de outras substâncias estimulantes ou inibitórias na
amostra a ser medida (STICHER et al., 1997).
Desta maneira, as condições para o micro-organismo selecionado avaliadas
em COSTA e colaboradores (2011) foram mantidas: como meio de detecção (M9
NO3) e tempo de incubação na câmara luminométrica (45 minutos), concentração
celular de 0,06g/L, um fator de diluição 1:33,3 (diluição das células).
4.2 COMPONENTE BIOLÓGICO: E. COLI MC1061
4.2.1 PREPARO DE MEIOS E SOLUÇÕES
O meios de cultura aplicados neste estudo foram os mesmos já empregados
em trabalhos anteriores COSTA et al., 2013 e BARROCAS (2003):
Ensaios luminométricos – Meio mínimo de sais (Atlas, 1997)
Manutenção - LB (LURIA-BERTANI)
Todas as soluções utilizadas diretamente nos experimentos com o biossensor
de mercúrio foram biologicamente descontaminadas, esterilizadas em autoclave e
guardadas em local limpo. E a manipulação foi cuidadosa, utilizando-se técnicas
assépticas rigorosas.
Protocolo de esterilização:
Autoclave a 121°C
25 minutos
Pressão de 1 atm.
72
4.2.1.1 MEIO MÍNIMO DE SAIS
O meio mínimo de sais (M9NO3) é o principal meio utilizado nos experimentos
com o micro-organismo em questão. Este foi utilizado em estudo anterior por
COSTA (2010) e BARROCAS (2003) para o crescimento prévio e ensaios
luminométricos com o biossensor, pode ser observado na Tabela 10.
A composição do meio M9NO3 é basicamente uma mistura de sais inorgânicos
(Na2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, NaNO3) acrescidos com fatores de crescimento
(glicose e casamino ácidos) preparados em tampão pH 7, elaborado com sais de
fosfato (ATLAS, 1997). Ainda é adicionado o antibiótico canamicina em uma
concentração final de 30mg/L para seleção positiva do transposon luc presente no
plasmídio, garantindo o crescimento de somente células capazes de emitirem luz em
contato com mercúrio. A Tabela 10 apresenta as quantidades utilizadas nas
diferentes etapas. O volume total foi de 50 mL em cada meio de cultivo no
crescimento prévio e de 10 mL nos experimentos luminométricos.
Tabela 10: Meio Utilizado para o Experimento Luminométrico.
Meio de cultura Crescimento prévio
(Volume total: 50 mL)
Preparo da célula no dia do experimento (Volume total: 10
mL)
M9NO3 (Na2HPO4, KH2PO4,
NH4NO3, NaNO3) 48 mL 9,6 mL
MgSO4 0,1 M 500 µL 100 µL
Ca(NO3)2 0,01 M 500 µL 100 µL
Glicose - 200g/L 500 µL 100 µL
Casamino ácidos - 100 g/L 500 µL 100 µL
Canamicina - 30mg/L 150 µL 30 µL
4.2.1.2 MANUTENÇÃO E ARMAZENAMENTO DAS CÉLULAS
O meio LB é utilizado para a reconstituição das unidades populacionais ou
bactérias liofilizadas (devido sua complexa composição) e o meio LB Agar é utilizado
para crescimento em placas, a partir de colônias do micro-organismo, conservadas
sob refrigeração. As células foram mantidas em placas de Petri contendo meio
sólido LB Agar, armazenadas a 5ºC em refrigerador. A composição dos meios
utilizados na manutenção celular podem ser observados na Tabela 11.
73
Repiques semestrais eram feitos para manutenção da viabilidade celular. Neste
procedimento micro-organismos foram inoculados em um tudo de ensaio contendo 5
mL de meio LB com canamicina, partindo de uma colônia isolada recém crescida. A
cultura foi incubada, e crescida (24 horas) a 30º C até atingir a fase estacionária de
crescimento.
Tabela 11: Composição dos Meios de Estocagem das Células (COSTA, 2010).
Constituinte Quantidade
LB Broth 10 g
Água deionizada 400 mL
Canamicina - 30mg/L 1,2 mL
LB Ágar 16 g
Água deionizada 400 mL
Canamicina - 30mg/L 1,2 mL
Como método de estocagem por períodos maiores, as células foram mantidas
em solução de glicerol. O estoque a -5º C foi feito adicionando 1,5 mL do cultivo
bacteriano a um tubo de polipropileno com tampa rosqueada (criotubo) contendo 0,5
mL de glicerol 80% estéril, sendo feita uma mistura vigorosa, com uso do vortex,
para assegurar que o glicerol foi uniformemente disperso, evitando a formação de
cristais de gelo, o que poderia diminuir a viabilidade celular. Os tubos foram então
guardados no congelador a -5oC.
4.2.1.3 SOLUÇÃO DE D-LUCIFERINA 1 mM (pH = 5,0)
A luciferina, é o substrato para a reação, que vai atravessar as membranas
celulares bacterianas em pH ácido. Em um frasco contendo 25mg de luciferina
adicionou-se 1 ml de solução tampão de citrato 100mM, e colocado sob agitação
(vortex). Em seguida, esta foi transferida para um balão volumétrico contendo 79 mL
de solução tampão citrato 100 mM, previamente adicionados. Alíquotas da solução
estoque de luciferina foram transferidas para tubo de polipropileno com tampa
rosqueada, previamente marcado, usando volumes adequados para os ensaios.
Os tubos foram conservados em congelador (-5º C) envoltos por papel
alumínio, pois a luciferina é sensível ao oxigênio e luz, por isso é importante
74
minimizar sua exposição a estes agentes durante a preparação e o armazenamento
da solução.
4.2.1.4 SOLUÇÕES DE MERCÚRIO
As amostras de mercúrio foram preparadas a partir de uma solução padrão de
mercúrio (1g/L). Todas as soluções foram preparadas, no dia de cada experimento,
utilizando solução de HNO3 4,5mM. Na Tabela 12 estão descritas as concentrações
de mercúrio utilizadas durante todo o trabalho, selecionadas em razão de estudos
anteriores, e de valores estabelecidos na Resolução CONAMA n° 357 de 2005, para
água salina de 0,2 µg/L ou ppb.
As soluções de mercúrio utilizadas nos testes foram obtidas a partir de
diluições de soluções estoque (1g/L da SIGMA). Ressaltando-se o cuidado de evitar
contaminação cruzada, utilizando-se sempre os mesmos frascos para os mesmos
níveis de concentração (MARINS, 1990).
Tabela 12: Soluções de mercúrio utilizadas no presente estudo.
Soluções de mercúrio Concentração das amostras de
mercúrio (µg/L)
Curva de calibração e adição
padrão
0,0001
0,0001
0,003
0,006
0,009
0,01
0,1
1
2,99
10,05
17,1
20
75
4.2.2 AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO E CONSTRUÇÃO DA CURVA
DE PESO SECO DE E. COLI MC1061
4.2.2.1 CURVA DE CRESCIMENTO
O crescimento populacional é definido como o aumento do número, ou da
massa microbiana. E a taxa de crescimento é a variação no número ou massa por
unidade de tempo. O método utilizado foi o de monitoramento do crescimento
microbiano por meio da turbidez, realizando medidas de absorvância em
espectrofotômetro. O crescimento foi avaliado através do acompanhamento do
micro-organismo bioluminescente repórter, E. coli MC1061 (VIRTA et al., 1995).
O acompanhamento do perfil de crescimento da cepa E. coli MC1061 se deu
da seguinte forma: adicionou-se a quantidade calculada anteriormente a um
erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL do meio M9NO3 sendo retirada a primeira
alíquota para leitura da Densidade Ótica (DO600) no tempo inicial (0 h). O cultivo foi
mantido a 30ºC com agitação de 150 rpm, sendo o crescimento celular monitorado
em intervalos de 1 hora, pela retirada de alíquotas (2mL) e medida de absorvância
destas a 600 nm, até que fosse alcançado um valor máximo estável. Vale ressaltar
que de acordo com estudo do micro-organismo em questão, realizado por COSTA
(2010), são necessárias onze horas para que se atinja a fase estacionária.
Após o crescimento celular (meio M9NO3, com agitação de 150 rpm a 30°C),
foi realizada a leitura da densidade ótica no comprimento de onda de 600 nm
(DO600) em espectrofotômetro UV-visível. Foi realizado então o cálculo da
quantidade (mL) necessária do pré-inóculo para se obter uma DO600 inicial de
aproximadamente 0,2 em 50 mL de meio M9NO3.
4.2.2.2 DETERMINAÇÃO DO PESO SECO
Após crescimento celular em meio mínimo de sais, por cerca de 16 horas a
30ºC, com agitação de 150 rpm, as células de E. coli MC1061 obtidas em estado
estacionário, foram centrifugadas por 25 minutos a 3500 rpm. O precipitado obtido
foi ressuspendido em um mínimo de água deionizada (cerca de 5 mL) e as células
novamente centrifugadas nas mesmas condições anteriores e lavadas com água
76
destilada. A biomassa foi ressuspendida em 10 mL do meio M9NO3 para se obter
uma suspensão concentrada de células.
Desta mesma suspensão utilizada para o cálculo da concentração celular,
utilizando os três mililitros restantes, várias diluições foram utilizadas para obter
cerca de oito leituras de absorbância a 600nm entre 0,02 e 0,2, correspondendo
cada leitura à sua respectiva concentração celular.
Dessa suspensão celular, retira-se 7 mL para filtração em membrana Millipore.
Cabe ressaltar que a membrana é pesada antes e depois da filtração em uma
balança que elimina toda a umidade da amostra (Balança AG 200, IV2000). Dessa
forma, tem-se o valor de massa das células por diferença. A concentração da
suspensão celular, em g/L, é obtida dividindo-se o valor da massa celular, em g, pelo
volume da alíquota (7mL). Com os 3 mL restantes, foram realizadas 7 diluições para
se obter 7 leituras de absorvância a 600nm entre 0,02 e 0,2, e, então, encontrar as
suas respectivas concentrações celulares. Este procedimento foi feito em duplicata.
4.2.2.3 PREPARO DAS CÉLULAS
O preparo da suspensão celular usada nos ensaios bioluminescentes foi
realizado a partir de uma cultura nova (Figura 8), obtida de inóculo crescido em 50
mL de meio M9NO3, com agitação de 150 rpm e 30ºC. A cultura foi centrifugada por
6 minutos a 3500 rpm, sendo o sobrenadante adicionado de 10 mL de água
deionizada (para o processo de lavagem), centrifugado por mais 6 minutos, retirando
o sobrenadante e adicionando a cultura 10 mL de meio fresco (M9NO3). Este último
passo foi repetido, estando as células prontas para os ensaios, e sendo mantidas no
gelo até o início dos testes.
As diluições que foram utilizadas para os ensaios luminométricos partiram das
obtidas a partir da curva de peso seco. Após obter a suspensão celular concentrada
descrita anteriormente (item 4.2.2.3), a mesma foi mantida em gelo a fim de parar a
atividade microbiana (Figura 8).
77
Figura 8: Esquema de Preparo das Células.
4.3.CURVA DE CALIBRAÇÃO
Para o estudo da sensibilidade do método realizou-se ensaios de detecção da
bioluminescência, para diferentes faixas de concentração de mercúrio em soluções
aquosas (descrita no item 4.2.1.4, Tabela 12), bem como, com amostras
ambientais da Baía de Guanabara diretamente com Hg2+, com limites máximos e
mínimos de concentração e linearidade das curvas de calibração.
A obtenção da curva de calibração para o sistema proposto é essencial, pois
permitirá correlacionar o sinal bioluminescente lido com a concentração de mercúrio
presente nas amostras, considerando os efeitos inibitórios ou interferentes que a
amostra real possa apresentar (brancos reacionais, por exemplo).
4.3.1 BRANCOS REACIONAIS
A sensibilidade é um parâmetro muito importante na validação do método.
Alguns requisitos são necessários, como por exemplo, obtenção de baixos níveis de
resposta do biossensor para o que é considerado como branco reacional (amostra
onde o mercúrio não foi adicionado às soluções sintéticas). Esta resposta residual
pode ser proveniente de níveis traço de Hg2+ nos reagentes ou nos meios utilizados
nos ensaios. Desta forma, foram realizados ensaios de leituras de branco reacional
com a água deionizada e amostras sintéticas com salinidade (para avaliar a
78
influência da salinidade nas amostras ambientais da Baía de Guanabara, levando
em conta que o UPS da Baía de Guanabara está próximo do UPS do mar = 35 (UPS
= unidade prática de salinidade - determinada com base na relação direta entre
condutividade elétrica da água do mar e sua salinidade - 35 UPS => 35 partes por
mil).
Cabe ressaltar que os valores das leituras dos brancos iniciais (tanto da água
como da influência da salinidade) foram descontados dos valores finais em todos os
ensaios realizados neste estudo.
4.3.2 CURVA DE CALIBRAÇÃO DE MERCÚRIO
4.3.2.1 SOLUÇÕES AQUOSAS
Os ensaios luminescentes estão descritos no item 4.4, nos quais placas
brancas foram utilizadas, sendo possível a realização de desenhos experimentais,
de acordo com a ordem de leitura do aparelho. A adição de 10μL das amostras de
mercúrio em soluções aquosas utilizando água deionizada (concentrações definidas
como mostra a Tabela 12, para construção da curva de calibração), foi feita
diretamente nos poços das microplacas, de acordo com o desenho experimental
previamente estabelecido (baseado na ordem de leitura). Esta adição se deu, antes
da introdução das alíquotas das amostras celulares (50 μL), armazenadas, no gelo,
em tubo de Eppendorf.
Após serem adicionadas as soluções, as placas foram incubadas no interior da
câmara do luminômetro à temperatura ambiente por 45 minutos, tempo definido em
função do estudo de otimização em COSTA e colaboradores (2013).
Em seguida, o processo de medição se iniciou com o aparelho dispensando
100μL de substrato da luciferase em cada poço da placa, monitorando cada poço
por 12 segundos. O volume total utilizado em cada poço foi de 160μL. Todas as
condições foram feitas em duplicata, e os resultados da curva de calibração são
apresentados em somatório de luz emitida (URL) em cada condição testada.
79
4.3.2.2 CURVA DE CALIBRAÇÃO DE MERCÚRIO UTILIZANDO
AMOSTRAS REAIS
Neste estudo, por se trabalhar com amostras complexas, uma curva de
adição padrão foi necessária. Nesta etapa, diferentes alíquotas do padrão de
mercúrio foram adicionadas nas próprias amostras reais analisadas, segundo
diferentes faixas de concentração de mercúrio (Tabela 12). Todas as condições
(conforme descrito no item 4.3.2.1) foram feitas em duplicata, e os resultados da
curva de calibração são apresentados em somatório de luz emitida (URL) em cada
condição testada.
4.3.3 CURVA DE CALIBRAÇÃO EM SEDIMENTO E MÉTODO DE
LIXIVIAÇÃO DE MERCÚRIO EM SEDIMENTOS
A curva de calibração das amostras após a lixiviação foi realizada conforme
descrito no item 4.3.2.2. A metodologia para a lixiviação do mercúrio das amostras
de sedimento foi adaptada da técnica utilizada por IVASK e colaboradores (2002).
Para os experimentos de determinação de bioluminescência, seguiu-se a etapa
descrita no item 4.2.2.3 (COSTA, 2010). Dois tipos de métodos de lixiviação foram
testados: com amostra ambiental da Baía de Guanabara e outro com HCl 1M.
Os sedimentos foram lixiviados com água da própria Baía de Guanabara e com
HCl 1M a fim de comparar o potencial de lixiviação dos dois métodos. A água da
Baía de Guanabara foi coletada juntamente com o sedimento e foi utilizada por se
tratar da mesma localidade do sedimento.
As quatro amostras de sedimento (descritas no item 4.6.1) foram armazenadas
em tubos de centrífuga do tipo Falcon (50mL) na geladeira. No dia anterior ao
experimento bioluminescente, os tubos foram levados à capela, onde foi coletado 1g
de cada amostra em uma balança, sendo cada um deles armazenado em novo tubo
(para cada tipo de lixiviação). Em seguida, adicionou-se 12,5 mL de água coletada
da Baía de Guanabara em cada tubo. Esse procedimento foi realizado em duplicata,
totalizando 8 tubos, já que foram usadas 4 amostras (Figura 9).
80
Figura 9: Esquema da lixiviação realizada nas amostras de sedimento.
Repetiu-se o procedimento anterior, também em duplicata, sendo a única
diferença na lixiviação com 12,5 mL de HCl 1M, ao invés de água da Baía de
Guanabara (Figura 9).
Ao final desta etapa, os 16 tubos de centrífuga tipo falcon (50mL), sendo oito
com água da Baía de Guanabara e oito com ácido (HCl 1M), foram levados à
incubadora, onde permaneceram sob agitação a 500 rpm e 30ºC por 24 horas. Após
as 24 horas, retirou-se 50µL da suspensão de cada tubo, sendo armazenados em
tubo tipo Eppendorf.
O volume restante de cada tubo foi centrifugado a 3500 rpm por 25 min, e do
sobrenadante obtido retirou-se 50µL para misturar ao que já havia sido coletado
anteriormente, tendo-se no final 16 tubos tipo Eppendorf com 100µL cada. A seguir
encontra-se o esquema deste procedimento ilustrado para um tubo (Figura 10).
81
Figura 10: Esquema de preparo de soluções das amostras após a lixiviação.
4.4 EXPERIMENTOS DE BIOLUMINESCÊNCIA
Para os procedimentos de determinação da bioluminescência foram utilizadas
placas brancas opacas de 96 poços (Figura 8), sendo possível a realização de
desenhos experimentais, de acordo com a ordem de leitura do aparelho.
Neste protocolo é feita a adição diretamente nos poços das microplacas, sendo
as soluções de mercúrio (amostras sintéticas ou ambientais - 10 μL) adicionadas aos
poços da placa luminométrica, de acordo com o desenho experimental previamente
estabelecido (baseado na ordem de leitura de cada amostra). Em seguida eram
adicionadas alíquotas das amostras celulares (50 μL), com densidade celular
conhecida (COSTA, 2010). As alíquotas das amostras celulares foram adicionadas
em seguida sendo antes diluídas 5 vezes visando atingir a concentração celular de
trabalho desejada.
Após serem adicionadas as soluções, mercúrio e células, as placas foram
incubadas no interior da câmara do luminômetro à temperatura ambiente por 45
minutos (COSTA, et al., 2013) para a produção da luciferase, que, por sua vez, deve
ser proporcional ao mercúrio incorporado pelos micro-organismos. Após a etapa de
incubação, o processo de medição se iniciou com o aparelho programado para
dispensar 100μL de substrato da luciferase em cada poço da placa, a luciferina
82
1mM, e em seguida inicia-se o monitoramento de cada poço por 12 segundos. O
volume total utilizado em cada poço foi de 160μL.
4.5 DETERMINAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO
ATÔMICA COM VAPOR FRIO
As amostras sintéticas da curva de calibração foram enviadas a um laboratório
independente, no Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental da ENSDP-
Fiocruz, para análise quantitativa do elemento mercúrio pelo método de
espectrometria de absorção atômica com vapor frio, para que fosse ser verificada a
validação do método testado no presente estudo.
4.6 ÁREA DE ESTUDO
4.6.1 LOCALIDADE
A Baía de Guanabara apresenta profundidade média de 7 metros e 80% de
sua área tem menos de 10 metros de profundidade (NETO & FONSECA, 2011).
As amostras de água foram coletadas de abril/2012 a dezembro/2013, em dois
locais da Baía de Guanabara (Figura 10), sendo o primeiro denominado PONTO A
(latitude: -22° 53'04.200" S e longitude 43°9'20.880" O) coletado em três pontos na
coluna d´água, (superfície, meio e fundo), e o segundo denominado PONTO D
(latitude: -22° 49' 42.960" S e longitude: 43° 12' 51.840" O) coletado em dois pontos
na coluna d´água, (superfície e fundo), totalizando 5 amostras por mês de coleta
(Tabela 13).
As amostras de água foram coletadas em garrafas de van dorn, transferidas
para tubos de centrífuga tipo falcon (50mL) e mantidas sob refrigeração adequada
(5°C) até o experimento luminométrico. O material usado para coleta das amostras
de água foi previamente esterilizado para evitar a contaminação biológica das
amostras. As amostras, assim como os dados físico-químicos: temperatura, pH,
condutividade, oxigênio dissolvido e salinidade, foram gentilmente fornecidas pelo
Laboratório de Biogeoquímica, Departamento de Ecologia, IB/ CCS/UFRJ.
83
As amostras de sedimentos utilizados foram gentilmente cedidos pelo
Laboratório de Geoquímica Ambiental da Universidade Federal Fluminense. As
amostras de sedimento eram provenientes das seguintes localidades: Porto Rio,
Porto Niterói, Rio Iguaçu e Rio Meriti. Não há informações sobre a composição das
amostras fornecidas (Tabela 13 e Figura 11).
As amostras ambientais foram estudadas conforme os experimentos descritos
no item 4.4, por ensaios de bioluminescência para detecção do mercúrio
biodisponível, e por meio das curvas de calibração (água deionizada e adição
padrão nas amostras). No caso das amostras de sedimento uma etapa de lixiviação
foi realizada para só então se realizar os ensaios de bioluminescência.
Todos os parâmetros foram analisados utilizando-se o software Excel, por meio
da média, coeficiente de variação e desvio padrão. Algumas análises estatísticas
foram utilizadas para tentar verificar uma correlação entre os parâmetros físico-
químicos e a concentração de mercúrio biodisponível (com o uso do programa
statistica 6.0).
Tabela 13: Localização dos pontos de coleta.
Pontos de Coleta Coordenadas
Coluna d´água Latidute Longitude
Ponto A (próximo a Ponte Rio -Niterói) 22° 53'04.200" S 43°9'20.880"O
Ponto D (próximo a Ilha do Governador) 22° 49' 42.960" S 43° 12' 51.840" O
Sedimento Latidute Longitude
Rio Iguaçu 22°44'53" S 43°14'28" O
Rio Meriti 22°48'11 S 43°16'17" O
Porto Rio 22°53'46" S 43°12"38" O
Porto Niterói 22°52'42" S 43°7'7" O
84
Figura 11: Mapa que apresenta os pontos de coleta na Baía de Guanabara.
85
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para desenvolvimento de um biossensor deve se ter em mente a escolha do
componente biológico, para que este responda de forma adequada às necessidades
para a sua aplicação. Neste capítulo serão apresentados resultados referentes ao
biocomponente micro-organismo Escherichia coli MC1061, e ainda, a avaliação e
aplicabilidade do biossensor microbiano em amostras ambientais (avaliando valores
de biluminescência URL, desvios padrão e coeficiente de variação de cada ensaio).
Além disso, os valores de análise obtidos com o biossensor serão comparados à
metodologia padrão visando atestar sua confiabilidade.
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA BACTÉRIA
Com objetivo de padronizar o componente biológico usado no biossensor
microbiano do presente estudo foram realizados experimentos de caracterização da
bactéria E. coli MC1061.
5.1.1 DETERMINAÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO
O perfil de crescimento do micro-organismo Escherichia coli MC1061 é
apresentado na Figura 12. A partir da curva de crescimento obtida, pode ser
observado que as células entram na fase exponencial após aproximadamente sete
horas, enquanto que para atingir a fase estacionária foram necessárias em torno de
onze horas. O teste da curva de crescimento foi realizado com medição de pontos
em intervalos de 1 hora, até alcançar o estado estacionário.
86
. Figura 3: Curva de Crescimento de Escherichia coli MC1061 (resultados de três réplicas) .
A curva foi avaliada nos anos de 2010, 2012 e 2014, como forma de observar o
comportamento do micro-organismo ao longo do tempo, não houve mudança no
perfil de crescimento da Escherichia coli MC1061. Tal curva foi considerada para a
obtenção da densidade celular e determinação do perfil de crescimento das células
utilizadas nos experimentos posteriores de bioluminescência.
5.1.2 CORRELAÇÃO ENTRE ABSORBÂNCIA E PESO SECO
Uma curva de peso seco versus absorbância foi obtida, conforme apresentado
na Figura 13. Sendo possível, através da equação da reta (Equação 1),
correlacionar a leitura da absorbância a 600nm com a concentração (g/L) da
suspensão celular:
Concentração celular [g/L] = (Abs600nm – 0,0336)/ 1,636)
(Equação 1)
A equação descrita acima foi utilizada em todos os experimentos posteriores
para determinação da concentração celular, nos ensaios luminométricos, nas curvas
de calibração com amostras padrão e amostras ambientais.
87
Figura 43: Correlação entre Absorbância (600 nm) e Peso Seco de Escherichia coli
MC1061.
5.2 AMOSTRAS AMBIENTAIS
Os resultados dos ensaios luminométricos com as amostras ambientais
(provenientes da Baía de Guanabara) foram obtidos conduzindo-se os experimentos
com o biossensor com uma concentração celular de 0,06 g/L, um fator de diluição
1:33,3 (diluição das células) e tempo de incubação para produção da luciferase na
câmara luminométrica de 45 minutos (parâmetros otimizados por COSTA et al.,
2011).
5.2.1 AMOSTRAS AQUOSAS
Os ensaios de detecção da bioluminescência usando o biossensor de Hg,
conforme descrito no item 4.4, foram realizados com amostras aquosas da Baía de
Guanabara (pontos A e D), coletadas de abril de 2012 a dezembro de 2013, para
diferentes faixas de concentração de mercúrio adicionado em soluções aquosas.
Cabe ressaltar que a metodologia proposta inclui uma bactéria geneticamente
modificada Escherichia coli MC1061 capaz de detectar o mercúrio biodisponível
(Hg2+), espécie essencial na determinação da toxicidade e do potencial de
bioacumulação do metal. Essa espécie, ao ser metilada, torna-se mais tóxica
(metilHg), incorporando-se ao longo da cadeia trófica.A disponibilidade de mercúrio
88
para os micro-organismos metiladores é determinada pela concentração de íons
Hg2+ livres (ULRICH et al., 2001).
5.2.1.1 CURVA DE CALIBRAÇÃO
Ensaios de detecção da bioluminescência (conforme descrito no item 4.4),
para diferentes faixas de concentração de mercúrio (conforme descrito no item
4.3.2), foram realizados para estudo da sensibilidade da medição, avaliação da
repetibilidade, alcance dos limites máximo e mínimo de concentração e linearidade
das curvas de calibração.
A precisão no experimento foi avaliada pela variabilidade de amostras idênticas
analisadas repetidamente, sendo calculadas as variâncias de duplicatas dos URL
obtidos em cada experimento. Considerou-se a precisão de medição do
equipamento, luminômetro, e da preparação da amostra, incluindo a manipulação
(por exemplo, pipetagem de soluções e inóculo usados nas análises do biossensor,
centrifugação e decantação de amostras, etc.).
A estatística descritiva foi empregada na determinação dos valores médios
para as duplicatas de cada amostra, assim como para a determinação do desvio
padrão e o coeficiente de variação para cada ensaio realizado. Neste estudo, só
foram considerados resultados cujo coeficiente de variação foi inferior a 10% entre
as replicatas.
Cabe ressaltar que os valores das leituras dos brancos iniciais, água
deionizada usada nas diluições (conforme descrito no item 4.3.1), foram
descontados dos valores finais em todos os ensaios realizados, e o valor médio
encontrado em URL como branco para a água deionizada foi 0,000876, sendo esse
o valor residual de mercúrio encontrado na água utilizada nas analises, observado
na Tabela 14.
Tabela 14: Resultados dos Ensaios Luminométricos em URL para a água deionizada.
Amostra URL
URL / Branco 0,000899
URL / Branco 0,000855
URL / Branco 0,000875
Média 0,000876
89
A influência da salinidade, já que as amostras provêm de água salina, foi
verificada nos ensaios de bioluminescência, e o valor médio encontrado como
branco de salinidade foi 0,002835, esse valor também foi descontado dos valores
finais de todos os ensaios realizados, estando os valores encontrados para
salinidade demonstrados na Tabela 15.
Tabela 15: Resultados dos ensaios de simulação com salinidade.
S (‰) URL
Amostra sintética com 35 UPS 0,00278
Amostra sintética com 35 UPS 0,00289
Média URL 0,002835
Nos ensaios para elaboração da curva de calibração com água deionizada dois
experimentos independentes foram realizados em duplicata usando concentrações
finais de mercúrio de 0,001 a 20 µg/L. Os valores médios de URL obtidos, seus
desvios padrões e coeficientes de variação calculados são apresentados na Tabela
16 para duas faixas de concentração de mercúrio. As Figuras 14 e 15 apresentam
os gráficos das curvas de calibração e suas respectivas equações da reta e seus R2
> 0,9.
Tabela 36: Resultados dos Ensaios Luminométricos da curva de calibração com soluções de
mercúrio de diferentes concentrações; CV= Coeficiente de Variação.
Curva de Calibração
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,003 0,006 0,009 0,010
Média URL 38,70625 41,2983 43,6889 48,0411 52,8732
Desvio padrão 0,334 0,588 0,550 0,857 2,658
CV(%) 0,289 0,837 0,692 1,529 8,358
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,10 2,99 10,10 17,10 20,00
Média URL 55,14815 58,8794 60,0226 67,78305 72,6143
Desvio padrão 0,995 1,054 1,408 0,791 1,281
CV(%) 1,796 1,886 3,301 0,924 2,260
Os valores de luminescência (URL) encontrados foram altos e os desvios
padrões indicaram que o teste foi realizado com boa repetibilidade. Uma vez que a
água deionizada não apresenta substâncias que possam complexar com o metal
estudado, o URL mais alto encontrado foi 72,6143. Isso demonstra que, neste caso,
90
todo Hg medido é biodisponível, diferente de uma amostra ambiental, na qual a
matriz é complexa e o Hg2+ poderá formar complexos com diversos agentes
complexantes, como matéria orgânica ou sais inorgânicos presentes na coluna
d´água (STEIN et al.,1996; ULRICH et al., 2001).
Os valores de coeficiente de variação foram menores que 10% em torno da
média, indicando uma baixa dispersão e valores homogêneos.
Figura 14: Curva de Calibração de soluções de mercúrio em diferentes concentrações
(0,001 a 0,01 µg/L), preparadas em água deionizada.
Figura 15: Curva de Calibração de soluções de mercúrio em diferentes concentrações (0,1
a 20 µg/L), preparadas em água deionizada.
Embora as curvas de calibração com a água deionizada tenham apresentado
boa repetibilidade e dispersão, a curva estabelecida para o trabalho foi a de 0,001 a
1 µg/L, por ser esta região linear adequada para as amostras ambientais da área de
estudo em questão, o que foi observado em ensaios preliminares. Desta forma, uma
91
nova curva de calibração foi obtida para a região linear, sendo os resultados
apresentados na Tabela 17. A equação da reta obtida para a curva de calibração em
água foi: y = 12,555x + 44,689, com R² = 0,9631, conforme apresentado na Figura
16.
Tabela 47: Resultados dos Ensaios Luminométricos da curva de calibração com soluções de
mercúrio (0,001 a 1 µg/L); CV= Coeficiente de Variação.
Água deionizada Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 43,0797 45,4749 47,0177 57,1314
Desvio padrão 0,201 0,625 0,475 3,084
CV(%) 0,094 0,858 0,481 16,650
Figura 16: Curva de Calibração de soluções de mercúrio em diferentes concentrações (0,
001 a 1 µg/L), preparadas em água deionizada.
Para considerar a interferência de agentes complexantes, a curva de adição
padrão planejada (conforme descrito no item 4.3.2.2) foi utilizada em cada amostra.
Os resultados podem ser visualizados nos itens a seguir.
O mercúrio pode interagir com muitos outros elementos (possibilidade de
complexação), o que pode variar com a solubilidade, pH, temperatura, potencial
redox, sorção e dessorção, pois todos influenciam na rota de transformação que o
mercúrio pode seguir. Sendo importante ressaltar como a acidez pode facilitar a
92
formação de complexos solúveis (HgCl2 e CH3Hg), e ambientes alcalinos a formação
de complexos voláteis (Hg0 e (CH3)2Hg) (STEIN et al., 1996).
5.2.1.2 CURVA DE CALIBRAÇÃO DO MERCÚRIO NAS AMOSTRAS
AMBIENTAIS
As curvas de adição padrão foram elaboradas (conforme descrito no item
4.3.2.2) devido à necessidade de obter curvas de calibração para cada ponto
coletado. Este procedimento possibilitou que as características individuais de cada
ponto de coleta em cada mês fossem respeitadas.
É importante ressaltar que durante a obtenção da curva de calibração há
grande interesse na determinação de uma curva que possa ser utilizada para todas
as amostras ambientais, como em COSTA e colaboradores (2013). Entretanto, as
medições quantitativas em amostras ambientais são mais complexas que a análise
de soluções sintéticas preparadas em laboratório, onde as condições são
controladas.
Isso se deve ao fato de que o mercúrio em amostras naturais pode estar
presente na forma de diferentes espécies químicas, geralmente em concentrações
muito baixas. E dependendo das características físico-químicas do local em estudo,
as espécies podem ser instáveis. Deve ser ressaltado que o micro-organismo em
questão só detecta a fração de mercúrio biodisponível, possivelmente uma pequena
parte de todas as espécies de mercúrio presentes.
Desta forma, nas análises do conteúdo de mercúrio biodisponível nas amostras
da Baía de Guanabara, são levados em consideração os possíveis efeitos de matriz
que estas amostras ambientais podem apresentar, principalmente em função dos
ligantes naturais presentes na amostra, da temperatura, salinidade, condutividade,
potencial redox, e pH de cada ponto de coleta. Por conseguinte, foi desenvolvida
uma curva de adição padrão para cada ponto amostrado (pontos A e D), para cada
mês amostrado, devido ao comportamento diferenciado nos valores em URL.
93
Assim, para cada dia de coleta realizaram-se cinco curvas de calibração
(curvas adição padrão, conforme descrito em 4.3.2.2), com o intuito de obter uma
curva de calibração que pudesse ser melhor comparável ao sistema. As análises
foram feitas mês a mês, e são apresentadas a seguir. Em todos os ensaios
observados pode ser observado que as curvas de adição padrão apresentaram
R2>0,9.
Os resultados dos ensaios de detecção bioluminescente do Hg de amostras de
água da Baia da Guanabara para cada mês amostrado são apresentados,
ressaltando a importância do estudo da sensibilidade da medição, da repetibilidade,
e da linearidade das curvas de calibração, para avaliação da metodologia em
questão no desenvolvimento da tecnologia.
Os resultados das análises das coletas dos meses de abril, maio e julho de
2012 podem ser observados na Tabela 18. É importante observar que os desvios
padrão obtidos foram pequenos, na faixa de 0,001 a 0,958 URL, indicando boa
repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 9,488%, no entanto tal
valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e valores homogêneos
(< 10%).
As curvas dos pontos A superfície (abril/2012), A meio (maio/2012) e D
superfície (julho/2012) apresentaram melhores valor de R2 (0,9973, 0,9651 e 0,9813,
respectivamente, confiabilidade de 95%), significando que os valores experimentais
foram mais precisos nestes testes. As equações da reta para os ensaios
luminométricos dos meses de abril, maio e julho/2012 podem ser observadas na
Figura 17, sendo utilizadas nos cálculos das concentrações de mercúrio
biodisponível presente nas amostras (µg/L). Os resultados para estes meses podem
ser vistos na Tabela 19.
Observa-se na Tabela 19 que o ponto A superfície de abril/2012
(0,281 µg/l) apresentou maior concentração de mercúrio biodisponível,
embora o maior valor de URL (8,54385) neste mês tenha sido no ponto D
superfície (que teve a concentração de mercúrio 0,142 µg/l) . No mês de
Maio/2012, o ponto A superfície (0,184 µg/L) apresentou a maior
concentração de mercúrio biodisponível e a maior URL (14,449). Já no
mês de Julho/2012, com valores menores que os meses de abril e maio ,
94
os pontos A superfície (0,065 µg/L) e D superfície (0,094 µg/L) foram os
que apresentaram a maior concentração de mercúrio biodisponível (o
ponto D superfície apresentou o maior URL= 15,85515). Tais diferenças
reiteram a necessidade da curva de calibração para cada localidade.
A repetibil idade de todos os ensaios foi considerada boa, uma vez
que os coeficientes de variação encontrados foram < 10%, indicando baixa
dispersão e dados homogêneos.
95
Tabela 18: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Abril, Maio e Julho de 2012.
Abril/2012 Maio/2012 Julho/2012
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 4,179 4,322 5,504 12,02595 5,038 8,066 11,084 21,220 10,2451 12,1712 16,1936 26,9784
Desvio padrão 0,630 0,068 0,590 0,498 0,036 0,001 0,017 0,595 0,094 0,169 0,267 0,013
CV (%) 9,488 0,107 6,331 2,063 0,026 0,000 0,003 1,667 0,087 0,234 0,440 0,001
Amostra A meio
Média URL 4,428 5,559 7,807 16,8605 11,256 13,501 15,761 26,927 11,62465 14,3704 17,38545 28,959
Desvio padrão 0,114 0,581 0,219 0,087 0,084 0,016 0,273 0,958 0,079 0,047 0,115 0,033
CV (%) 0,295 6,077 0,615 0,045 0,063 0,002 0,472 4,159 0,053 0,016 0,077 0,004
Amostra A superfície
Média URL 6,390 7,073 8,032 17,5473 10,045 11,908 15,495 25,551 11,7712 14,45645 15,4141 25,89715
Desvio padrão 0,173 0,099 0,063 0,874 0,053 0,381 0,681 0,363 0,137 0,441 0,522 0,040
CV (%) 0,468 0,138 0,049 4,362 0,028 1,217 2,994 0,515 0,160 1,346 1,768 0,006
Amostra D fundo
Média URL 4,7966 7,3394 8,10265 15,42175 3,5321 7,2017 12,05215 26,68965 10,97605 12,41495 18,02515 29,27605
Desvio padrão 0,210 0,375 0,068 0,719 0,391 0,167 0,067 0,360 0,015 0,422 0,029 0,526
CV (%) 1,162 1,919 0,038 4,535 4,320 0,388 0,037 0,484 0,002 1,436 0,005 0,945
Amostra D superfície
Média URL 5,48015 7,69795 9,5463 16,70915 4,5088 6,5732 8,5183 18,308 13,00325 15,26495 16,75965 29,73445
Desvio padrão 0,535 0,133 0,229 0,292 0,603 0,437 0,634 0,274 0,920 0,174 0,440 0,326
CV (%) 5,233 0,231 0,549 1,275 8,076 2,900 4,723 0,410 7,446 0,197 1,153 0,357
78
96
Figura 17: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Abril (A,B), Maio (C.D) e Julho (E,F) de 2012. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho) , Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
A B
C D
E F
97
Tabela 19: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Abril, Maio e Julho/2012.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Abril/2012
A fundo 4,515 0,067 0,098 0,019
A meio 5,571 0,675 8,330 0,009
A superfície 9,799 0,049 0,024 0,281
D fundo 6,3882 0,310 1,460 0,001
D superfície 8,54385 0,290 1,010 0,142
Maio/2012
A fundo 7,812 0,242 0,822 0,024
A meio 12,974 0,819 5,268 0,003
A superfície 14,449 0,264 0,481 0,184
D fundo 6,8532 0,709 7,920 0,006
D superfície 6,4951 0,458 8,399 0,037
Julho/2012
A fundo 12,49775 0,613 3,002 0,018
A meio 13,97375 0,199 0,298 0,010
A superfície 14,2068 0,473 5,276 0,065
D fundo 13,2881 0,231 0,432 0,012
D superfície 15,85515 0,158 0,157 0,094
Os resultados das análises das coletas dos meses de agosto, setembro e
outubro de 2012 podem ser observados na Tabela 20. É importante observar que os
desvios padrão obtidos foram pequenos, na faixa de 0,001 a 1,085 URL, indicando
boa repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 9,849% no entanto tal
valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e valores homogêneos
(< 10%).
As curvas dos pontos D superfície (agosto/2012), D fundo (setembro/2012) e D
fundo (outubro/2012) apresentaram melhores valores de R2 (0,9639, 0,9813 e
0,9731 respectivamente), significando que os valores experimentais foram mais
precisos nestes testes. As equações da reta para os ensaios luminométricos para
os meses de agosto, setembro e outubro de 2012 podem ser observadas na Figura
18, sendo utilizadas também no cálculo da concentração de mercúrio das amostras.
E o cálculo de concentração de mercúrio biodisponível (µg/L) para estes meses
podem ser vistos na Tabela 21.
98
Na Tabela 21 pode ser observado que no mês de agosto o ponto D superfície
(0,119µg/L) foi o que apresentou a maior concentração de mercúrio biodisponível e o
maior valor de URL (15,8495). Já no mês de setembro todos os pontos estão com
mercúrio biodisponível bem maior quando comparados a todos os outros meses
amostrados (0,352 a 0,765 µg/L, sendo todos estes valores >0,2 ppb), sendo o
ponto D superfície (0,765 µg/L) o que apresentou maior concentração de mercúrio
biodisponível. Em outubro observou-se que os pontos A superfície (0,264 µg/L) e D
superfície (0,239 µg/L) foram os que apresentaram maior concentração de mercúrio
biodisponível, embora o ponto com URL mais alto tenha sido o D fundo (10,37005).
Nestes testes a repetibilidade foi considerada boa, pois todos os valores de CV
foram < 10% sendo considerados como baixa dispersão e, por isso, valores
homogêneos.
99
Tabela 20: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Agosto, Setembro e Outubro de 2012.
Agosto/2012 Setembro/2012 Outubro/2012
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 10,42665 13,5403 16,4749 28,45465 5,005 7,455 9,4124 20,51195 6,47295 8,0012 9,59525 17,3589
Desvio padrão 0,072 0,088 0,470 0,478 0,001 0,638 0,597 0,609 0,713 0,775 0,221 0,053
CV (%) 0,050 0,057 1,339 0,804 0,000 5,457 3,786 1,810 7,863 7,498 0,510 0,016
Amostra A meio
Média URL 11,2393 14,02155 17,9296 31,37705 6,61605 9,6709 11,07265 22,16605 7,6153 8,1153 10,3079 17,6182
Desvio padrão 0,222 0,007 0,215 0,016 0,497 0,445 0,028 0,139 0,484 0,060 0,197 0,465
CV (%) 0,438 0,000 0,257 0,001 3,734 2,046 0,007 0,088 3,081 0,045 0,375 1,229
Amostra A superfície
Média URL 9,787455 13,81635 16,88045 32,42685 7,9305 10,0255 13,289 26,15655 5,6363 7,65765 9,1546 17,0444
Desvio padrão 0,286 0,131 0,158 0,522 0,062 0,029 0,304 0,164 0,392 0,460 1,085 0,505
CV (%) 0,838 0,125 0,148 0,840 0,048 0,008 0,696 0,102 2,725 2,766 9,849 1,495
Amostra D fundo
Média URL 10,64625 13,8544 16,71745 29,50835 5,43575 6,89425 9,59425 21,23575 8,87265 10,3732 12,42515 21,6522
Desvio padrão 0,297 0,180 0,273 0,203 0,346 0,017 0,441 0,063 0,073 0,819 0,683 1,822
CV (%) 0,830 0,234 0,444 0,139 2,200 0,004 2,026 0,019 0,060 6,466 3,756 8,778
Amostra D superfície
Média URL 11,59545 15,3781 16,44855 30,90705 6,8213 7,0836 9,4336 17,8213 5,783 7,22155 7,6363 13,9805
Desvio padrão 0,060 0,150 0,540 0,090 0,961 0,004 0,491 0,153 0,199 0,241 0,700 0,640
CV (%) 0,031 0,146 1,771 0,026 9,313 0,000 2,551 0,132 0,687 0,803 6,425 2,927
82
100
Figura 18: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Agosto (A,B), Setembro (C.D) e Outubro (E,F) de 2012. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
A B
C D
E F
101
Tabela 21: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Agosto, Setembro e Outubro de 2012.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Agosto/2012
A fundo 12,987 0,040 0,013 0,010
A meio 13,697 0,267 0,566 0,003
A superfície 12,97375 0,023 0,005 0,015
D fundo 13,78685 0,694 3,764 0,044
D superfície 15,8495 0,185 0,267 0,119
Setembro/2012
A fundo 12,7568 0,061 0,029 0,433
A meio 14,58085 0,239 0,393 0,438
A superfície 17,77405 0,062 0,022 0,484
D fundo 11,8764 0,154 0,200 0,352
D superfície 15,4401 1,183 9,066 0,765
Outubro/2012
A fundo 7,75865 0,275 1,054 0,014
A meio 8,5666 0,455 2,739 0,029
A superfície 9,73325 0,888 8,108 0,264
D fundo 10,37005 0,197 0,416 0,024
D superfície 8,3697 0,349 1,452 0,239
Os resultados das análises das coletas dos meses de novembro e dezembro
de 2012 podem ser observados na Tabela 22. É importante observar que os desvios
padrão obtidos (Tabela 22) foram pequenos, na faixa de 0,001 a 1,085 URL,
indicando boa repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 9,171% no
entanto tal valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e valores
homogêneos (< 10%).
As curvas dos pontos A superfície (novembro/2012) e D fundo (dezembro/2012)
apresentaram melhores valores de R2 (0,9955 e 0,9806 respectivamente),
significando que os valores experimentais foram mais precisos nestes testes. As
equações da reta para os ensaios luminométricos para os meses de agosto,
setembro e outubro de 2012 podem ser observadas na Figura 19, sendo utilizadas
também no cálculo da concentração de mercúrio das amostras. E o cálculo de
concentração de mercúrio biodisponível (µg/L) para estes meses podem ser vistos
na Tabela 23.
102
Na Tabela 23 pode ser observado que no mês de novembro o ponto D
superfície apresentou a maior concentração de mercúrio biodisponível (0,288 µg/L,
sendo maior que o valor estipulado pela CONAMA n° 357/2005). O ponto A meio
apresentou um valor alto em comparação com a concentração de mercúrio deste em
outros meses (0,153 µg/L), e o mesmo ainda apresentou maior URL dos ensaios de
bioluminescência deste mês (16,98875). Já no mês de dezembro observa-se que o
ponto D apresentou maiores valores em concentração de mercúrio biodisponível (D
fundo 0,181 µg/L e D superfície 0,460 µg/L, duas vezes o valor estipulado pela
CONAMA n° 357/2005) os mesmo pontos de coleta também apresentaram maiores
valores para URL (> 40). Nestes testes a repetibilidade foi considerada boa, pois
todos os valores de CV foram < 10% sendo considerados como baixa dispersão e,
por isso, valores homogêneos.
Tabela 22: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Novembro e
Dezembro de 2012.
Novembro/2012 Dezembro/2012
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 12,96925 16,08545 17,36735 27,99495 21,46825 21,2689 24,28815 30,51565
Desvio padrão 0,031 0,001 0,442 0,002 0,665 0,620 0,014 0,343
CV (%) 0,007 0,000 1,124 0,000 2,060 1,805 0,001 0,386
Amostra A meio
Média URL 12,8988 15,1144 18,24125 28,7783 35,60275 38,4547 41,0883 53,8886
Desvio padrão 0,109 0,068 1,012 0,176 0,265 0,504 0,141 0,506
CV (%) 0,093 0,031 5,617 0,108 0,197 0,661 0,048 0,476
Amostra A superfície
Média URL 9,627 11,214 12,105 28,127 22,4188 25,64235 28,2776 39,77665
Desvio padrão 0,898 0,087 0,460 1,223 0,131 0,057 0,227 0,113
CV (%) 8,374 0,067 1,748 5,321 0,077 0,013 0,183 0,032
Amostra D fundo
Média URL 4,0756 5,89705 8,40015 27,29995 43,54 45,9639 47,938 66,79315
Desvio padrão 0,008 0,043 0,112 0,140 0,578 0,023 0,042 0,020
CV (%) 0,002 0,031 0,148 0,072 0,768 0,001 0,004 0,001
Amostra D superfície
Média URL 5,0038 7,2537 7,77925 15,2492 39,323 40,32005 46,82615 57,4074
Desvio padrão 0,109 0,340 1,012 0,242 0,516 0,798 0,432 0,743
CV (%) 0,238 1,595 9,171 0,384 0,678 1,578 0,399 0,961
103
Figura 19: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Novembro(A,B), Dezembro (C.D) de 2012. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
Tabela 23: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Novembro e Dezembro
de 2012.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Novembro/2012
A fundo 14,9805 1,560 6,547 0,003
A meio 16,98875 0,668 2,624 0,153
A superfície 11,935 0,522 2,287 0,091
D fundo 6,08555 0,068 0,077 0,037
D superfície 8,9176 0,918 9,441 0,288
Dezembro/2012
A fundo 22,30565 0,675 2,041 0,038
A meio 38,15875 0,949 2,360 0,027
A superfície 24,9245 0,961 3,815 0,007
D fundo 48,9507 1,128 2,600 0,181
D superfície 41,8286 0,118 0,035 0,460
A B
C D
104
Os resultados das análises das coletas dos meses de janeiro, fevereiro e
março de 2013 podem ser observados na Tabela 24. É importante observar que os
desvios padrão obtidos foram pequenos, na faixa de 0,001 a 1,085 URL, indicando
boa repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 9,254% no entanto tal
valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e valores homogêneos
(< 10%).
As curvas dos pontos A superfície (janeiro/2013), A superfície (fevereiro/2013)
e A superfície (março/2013) apresentaram melhores valores de R2 (0,9714, 0,9743
e 0,9846 respectivamente), significando que os valores experimentais foram mais
precisos nestes testes. As equações da reta para os ensaios luminométricos para
os meses de janeiro, fevereiro e março de 2012 podem ser observadas na Figura
20, sendo utilizadas também no cálculo da concentração de mercúrio das amostras.
E o cálculo de concentração de mercúrio biodisponível (µg/L) para estes meses
podem ser vistos na Tabela 25.
Na Tabela 25 observa-se o mês de janeiro, o ponto A meio (0,111 µg/L) e o A
superfície (0,127 µg/L) foram os que apresentaram a maior concentração de
mercúrio biodisponível. Já em fevereiro observou-se que o ponto A superfície (0,125
µg/L) apresentou a maior concentração de mercúrio biodisponível, enquanto o que
apresentou maior valor de bioluminescência foi o ponto D superfície (URL =
10,1478). Em março todos os pontos de coleta apresentaram baixos valores de
concentração de mercúrio biodisponível (sendo maior valor no ponto A meio = 0,073
µg/L) e o ponto com maior bioluminescência foi o D superfície (URL = 10,6478).
Nestes testes a repetibilidade foi considerada boa, pois todos os valores de CV
foram < 10% sendo considerados como baixa dispersão e, por isso, valores
homogêneos.
105
Tabela 24: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Janeiro, Fevereiro e Março de 2013.
Janeiro/2013 Fevereiro/2013 Março/2013
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 2,82665 3,55705 5,20855 8,8455 7,52955 9,51055 12,3238 22,0369 2,94165 3,55705 5,34055 9,8455
Desvio padrão 0,046 0,167 0,237 0,018 0,160 0,502 0,004 0,621 0,074 0,167 0,050 0,018
CV (%) 0,076 0,782 1,079 0,004 0,340 2,652 0,000 1,750 0,185 0,782 0,048 0,003
Amostra A meio
Média URL 3,5414 4,54395 5,37075 9,7228 4,90195 7,07715 10,55945 20,9723 3,6561 4,14545 5,76575 10,7228
Desvio padrão 0,572 0,102 0,602 0,012 0,048 0,020 0,494 0,009 0,410 0,100 0,170 0,012
CV (%) 9,254 0,230 6,741 0,002 0,048 0,006 2,310 0,000 4,604 0,242 0,503 0,001
Amostra A superfície
Média URL 4,50815 5,2264 6,2246 10,7432 5,89855 8,8925 10,70395 20,294 4,80815 5,7264 6,2246 11,7432
Desvio padrão 0,516 0,835 0,168 0,177 0,025 0,040 0,356 0,731 0,091 0,128 0,168 0,177
CV (%) 5,899 9,330 0,453 0,292 0,010 0,018 1,185 2,632 0,174 0,284 0,453 0,267
Amostra D fundo
Média URL 4,65405 5,4144 8,6009 16,17565 7,87365 9,35645 10,08585 17,1172 7,47365 9,60645 10,48585 17,6172
Desvio padrão 0,303 0,083 0,266 0,006 0,07 0,06 0,12 0,30 0,630 0,420 0,450 0,400
CV (%) 1,974 0,129 0,821 0,000 0,06 0,04 0,14 0,54 5,390 1,820 1,900 0,933
Amostra D superfície
Média URL 4,209 6,49315 9,1148 17,3794 8,36865 10,34455 12,53135 20,74595 8,71865 10,49455 12,8144 21,24595
Desvio padrão 0,275 0,211 0,059 0,080 0,148 0,033 0,227 0,376 0,347 0,462 0,174 0,331
CV (%) 1,803 0,684 0,038 0,036 0,263 0,010 0,410 0,682 1,377 2,037 0,235 0,515
88
106
Figura 20: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Janeiro (A,B), Fevereiro (C,D) e Março (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
A B
C D
E F
107
Tabela 25: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Janeiro, Fevereiro e
Março de 2013.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Janeiro/2013
A fundo 3,756 0,548 8,436 0,023
A meio 4,87285 0,117 0,352 0,111
A superfície 5,8135 0,259 1,301 0,127
D fundo 6,2095 1,27 5,86 0,041
D superfície 6,91665 0,767 9,950 0,070
Fevereiro/2013
A fundo 9,34765 0,690 5,096 0,008
A meio 7,80885 0,106 0,127 0,063
A superfície 9,54575 1,435 4,113 0,125
D fundo 8,92545 0,844 8,168 0,018
D superfície 10,1478 0,240 0,568 0,017
Março/2013
A fundo 3,81 0,088 0,205 0,021
A meio 4,7285 0,025 0,015 0,073
A superfície 5,635 0,449 3,571 0,046
D fundo 9,22545 0,137 0,204 0,044
D superfície 10,6478 0,467 2,048 0,039
Os resultados das análises das coletas dos meses de abril, maio e junho de
2013 podem ser observados na Tabela 26. É importante observar que os desvios
padrão obtidos (Tabela 26) foram pequenos, na faixa de 0,001 a 1,618 URL,
indicando boa repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 9,133% no
entanto tal valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e valores
homogêneos (< 10%).
As curvas dos pontos D fundo (abril/2013), A fundo (maio/2013) e D fundo
(junho/2013) apresentaram melhores valores de R2 (0,9956, 0,996 e 0,963
respectivamente), significando que os valores experimentais foram mais precisos
nestes testes. As equações da reta para os ensaios luminométricos para os meses
de abril, maio e junho de 2013 podem ser observadas na Figuras 21, sendo
utilizadas também no cálculo da concentração de mercúrio das amostras. E o
cálculo de concentração de mercúrio biodisponível (µg/L) para estes meses podem
ser vistos na Tabela 27.
108
Na Tabela 27 pode ser observado que no mês de abril 3 pontos com alta
concentração de mercúrio biodisponível: ponto A superfície (0,213 µg/L), D fundo
(0,185 µg/L) e D superfície (0,156 µg/L). Em maio foi o ponto D superfície (0,174
µg/L) que apresentou a maior concentração de mercúrio biodisponível. No entanto, o
maior valor de URL encontrado foi no ponto A meio (URL = 7,5992). Já em junho, os
pontos A superfície e D fundo (0,165 µg/L e 0,105 µg/L, respectivamente)
apresentaram as maiores concentrações de mercúrio biodisponível. Sendo o maior
valor de bioluminescência o ponto A superfície (URL = 5,11845). Nestes testes a
repetibilidade foi considerada boa, pois todos os valores de CV foram < 10% sendo
considerados como baixa dispersão e, por isso, valores homogêneos.
109
Tabela 26: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Abril, Maio e Junho de 2013.
Abril/2013 Maio/2013 Junho/2013
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 3,67875 4,27235 5,4038 12,02595 3,8814 4,004 4,16725 11,32765 1,9582 3,713 4,85735 10,56875
Desvio padrão 0,488 0,003 0,682 0,498 0,222 0,226 0,020 0,493 0,029 0,101 0,146 0,091
CV (%) 6,480 0,000 8,620 2,064 1,265 1,274 0,009 2,148 0,044 0,272 0,438 0,079
Amostra A meio
Média URL 4,62775 5,7144 7,5072 16,8605 6,0298 7,2819 9,10645 17,48735 2,48835 3,54135 5,0375 10,5266
Desvio padrão 0,027 0,376 0,643 0,088 0,007 0,619 0,066 0,719 0,166 0,069 0,033 0,155
CV (%) 0,016 2,476 5,513 0,046 0,001 5,259 0,048 2,957 1,111 0,133 0,022 0,227
Amostra A superfície
Média URL 7,09045 7,0231 7,13235 17,5473 4,5791 5,1824 9,2989 17,5758 2,6743 3,0335 6,0727 13,07975
Desvio padrão 0,251 0,028 1,618 0,875 0,362 0,760 0,338 0,542 0,237 0,002 0,051 0,220
CV (%) 0,891 0,012 6,715 4,363 2,858 9,133 1,231 1,671 2,096 0,000 0,044 0,370
Amostra D fundo
Média URL 2,6213 3,86425 5,3625 11,42175 4,2328 4,67375 6,5204 11,2656 1,5831 3,29965 5,047385 11,50285
Desvio padrão 0,353 0,089 0,226 0,720 1,02 0,30 0,05 0,42 0,306 0,320 0,050 0,006
CV (%) 4,750 0,207 0,955 4,536 9,066 1,98 0,03 1,60 5,760 3,113 0,035 0,003
Amostra D superfície
Média URL 2,9001 2,8928 3,5075 6,70915 3,2129 5,3791 5,8481 12,97305 2,48495 3,36245 5,6061 12,83535
Desvio padrão 0,134 0,074 0,185 0,293 0,296 0,629 0,189 0,829 0,251 0,082 0,428 0,751
CV (%) 0,618 0,191 0,971 1,275 2,722 7,353 0,610 5,300 2,537 0,200 3,267 4,398
92
110
Figura 21: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Abril (A,B), Maio (C,D) e Junho (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
A B
C D
E F
111
Tabela 27: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Abril, Maio e Junho de
2013.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Abril/2013
A fundo 4,2649 0,4202 4,139 0,015
A meio 5,97085 0,032 0,021 0,041
A superfície 8,9993 0,331 1,220 0,213
D fundo 5,0882 0,119 0,233 0,185
D superfície 3,54385 0,294 2,431 0,156
Maio/2013
A fundo 3,9281 0,335 3,006 0,024
A meio 7,5992 0,153 0,355 0,052
A superfície 6,7492 0,365 2,321 0,076
D fundo 4,9194 0,15 0,46 0,008
D superfície 5,9678 0,591 8,001 0,174
Junho/2013
A fundo 3,7948 0,041 0,060 0,079
A meio 3,92675 0,021 0,014 0,074
A superfície 5,11845 0,146 0,688 0,165
D fundo 3,85925 0,065 0,150 0,105
D superfície 3,5229 0,062 0,158 0,010
Os resultados das análises das coletas dos meses de julho, agosto e setembro
de 2013 podem ser observados na Tabela 28. É importante observar que os desvios
padrão obtidos (Tabela 28) foram pequenos, na faixa de 0,005 a 0,860 URL,
indicando boa repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 6,975% no
entanto tal valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e valores
homogêneos (< 10%). É possível ser observado que no ponto A fundo a
concentração aumentava gradativamente, mês a mês, aumentando o interesse no
estudo do sedimento para confrontar esses rasultados.
As curvas dos pontos A superfície (julho/2013), D superfície (agosto/2013) e D
fundo (setembro/2013) apresentaram melhores valores de R2 (0,9869, 0,986 e
0,9923 respectivamente), significando que os valores experimentais foram mais
precisos nestes testes. As equações da reta para os ensaios luminométricos para
os meses de julho, agosto e setembro de 2013 podem ser observadas na Figuras
22, sendo utilizadas também no cálculo da concentração de mercúrio das amostras.
E o cálculo de concentração de mercúrio biodisponível (µg/L) para estes meses
podem ser vistos na Tabela 29.
112
Na Tabela 29 observou-se no mês de julho dois pontos com valores altos de
concentração de mercúrio biodisponível: o ponto A superfície (0,320 µg/L) e o D
superfície (0,212 µg/L). Sendo o ponto A superfície o maior em URL (6,91505). Em
agosto observou-se que todas as amostras testadas apresentaram baixos valores de
concentração de mercúrio biodisponível, sendo o menor valor 0,004 µg/L para o
ponto D fundo. E o ponto D superfície o que apresentou maior valor em
bioluminescência (URL = 15,58645). Já no mês de setembro pode ser observado
que o maior valor de concentração de mercúrio biodisponível foi para amostra D
superfície (0,181 µg/L). Sendo este ponto o mesmo a apresentar maior valor em
bioluminescência (URL = 13,52465). Nestes testes a repetibilidade foi considerada
boa, pois todos os valores de CV foram < 10% sendo considerados como baixa
dispersão e, por isso, valores homogêneos.
113
Tabela 28: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Julho, Agosto e Setembro de 2013.
Julho/2013 Agosto/2013 Setembro/2013
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 1,1111 2,99825 4,39905 10,6134 10,5135 12,4247 16,49785 28,49625 5,785 7,6947 9,47825 20,0655
Desvio padrão 0,145 0,014 0,559 0,860 0,635 0,542 0,653 0,679 0,027 0,098 0,611 0,086
CV (%) 1,880 0,007 7,103 6,975 3,837 2,361 2,587 1,620 0,013 0,124 3,943 0,037
Amostra A meio
Média URL 2,3582 3,2092 4,8674 10,28925 10,2166 14,1257 17,1516 31,58415 5,785 7,6947 9,47825 20,0655
Desvio padrão 0,376 0,076 0,180 0,398 0,055 0,076 0,183 0,678 0,027 0,098 0,611 0,086
CV (%) 5,983 0,182 0,669 1,536 0,030 0,041 0,195 1,457 0,013 0,124 3,943 0,037
Amostra A superfície
Média URL 3,44045 4,04675 5,5788 13,0473 9,23315 12,24865 16,335 32,2827 5,6612 7,08945 9,33255 22,49175
Desvio padrão 0,244 0,005 0,427 0,168 0,033 0,087 0,241 0,135 0,213 0,126 0,265 0,784
CV (%) 1,725 0,001 3,274 0,216 0,012 0,062 0,355 0,057 0,803 0,223 0,753 2,730
Amostra D fundo
Média URL 2,58985 3,62445 4,20935 10,71145 10,53875 13,4534 16,62245 29,7256 5,27385 6,7193 9,16645 25,535
Desvio padrão 0,100 0,430 0,090 0,191 0,070 0,410 0,192 0,143 0,050 0,004 0,057 0,420
CV (%) 0,380 5,221 0,212 0,342 0,050 1,230 0,210 0,060 0,053 0,030 0,028 0,710
Amostra D superfície
Média URL 2,28045 3,06445 5,1269 11,40935 13,6231 15,8517 16,55905 29,91275 8,07175 10,59415 13,9573 28,73375
Desvio padrão 0,038 0,087 0,048 0,611 0,124 0,094 0,147 0,179 0,236 0,386 0,028 0,061
CV (%) 0,064 0,249 0,044 3,268 0,112 0,056 0,130 0,107 0,690 1,409 0,006 0,013
96
114
Figura 22: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Julho (A,B), Agosto (C,D) e Setembro (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
A B
C D
E F
115
Tabela 29: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Julho, Agosto e Setembro de 2013.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Julho/2013
A fundo 2,60205 0,424 6,911 0,013
A meio 3,85265 0,017 0,011 0,093
A superfície 6,91505 0,257 0,952 0,320
D fundo 3,7479 0,130 0,615 0,074
D superfície 4,9195 0,028 0,025 0,212
Agosto/2013
A fundo 12,70985 0,187 0,270 0,015
A meio 13,4606 0,571 2,615 0,021
A superfície 13,06835 0,798 4,873 0,063
D fundo 12,9068 0,040 0,013 0,004
D superfície 15,58645 0,210 0,325 0,054
Setembro/2013
A fundo 7,1741 0,020 0,005 0,003
A meio 8,4976 0,576 4,427 0,011
A superfície 8,10115 0,007 0,001 0,086
D fundo 6,75125 0,179 0,477 0,023
D superfície 13,52465 0,652 4,045 0,181
Os resultados das análises das coletas dos meses de outubro, novembro e
dezembro de 2013 podem ser observados na Tabela 30. É importante observar que
os desvios padrão obtidos (Tabela 30) foram pequenos, na faixa de 0,016 a 0,768
URL, indicando boa repetibilidade. O maior valor do coeficiente de variação foi 7,075
% no entanto tal valor ainda é considerado baixo, indicando baixa dispersão e
valores homogêneos (< 10%).
As curvas dos pontos A fundo (outubro/2013), A fundo (novembro/2013) A
superfície (dezembro/2013) apresentaram melhores valores de R2 (0,9927, 0,9957 e
0,9934 respectivamente), significando que os valores experimentais foram mais
precisos nestes testes. As equações da reta para os ensaios luminométricos para
os meses de outubro, novembro e dezembro de 2013 podem ser observadas na
Figuras 23, sendo utilizadas também no cálculo da concentração de mercúrio das
amostras. E o cálculo de concentração de mercúrio biodisponível (µg/L) para estes
meses podem ser vistos na Tabela 31.
116
Na Tabela 31 pode ser observado que no mês de outubro o maior valor de
concentração de mercúrio biodisponível foi para amostra A superfície (0,232 µg/L).
Sendo que ponto D fundo foi o que apresentou maior valor em bioluminescência
(URL = 9,98755). Já em novembro, o ponto A superfície (0,113 µg/L) apresentou a
maior concentração de mercúrio biodisponível. Sendo o ponto A meio o que
apresentou maior bioluminescência (URL = 8,4812). E em dezembro observou-se
que o ponto A superfície (0,212 µg/L) apresentou a maior concentração de mercúrio
biodisponível. Sendo o ponto D fundo o que apresentou maior bioluminescência
(URL = 18,9086). Nestes testes a repetibilidade foi considerada boa, pois todos os
valores de CV foram < 10% sendo considerados como baixa dispersão e, por isso,
valores homogêneos.
117
Tabela 30: Curva de Calibração com amostras ambientais coletadas nos meses de Outubro, Novembro e Dezembro de 2013.
Outubro/2013 Novembro/2013 Dezembro/2013
Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00 0,0010 0,0100 0,10 1,00
Amostra A fundo
Média URL 5,70065 6,90275 7,22115 17,18095 6,2106 7,35305 9,62955 26,41195 3,5155 5,8491 7,24245 16,4321
Desvio padrão 0,103 0,016 0,029 0,174 0,374 0,487 0,361 0,516 0,484 0,003 0,247 0,129
CV (%) 0,187 0,004 0,012 0,176 2,258 3,229 1,356 1,009 6,654 0,000 0,842 0,101
Amostra A meio
Média URL 4,4047 6,0611 9,5035 19,45775 6,64615 8,58265 11,48805 20,31595 2,05325 3,2979 6,96445 18,1993
Desvio padrão 0,541 0,022 0,291 0,583 0,218 0,064 0,229 0,028 0,023 0,161 0,702 0,274
CV (%) 6,643 0,008 0,894 1,749 0,713 0,048 0,457 0,004 0,025 0,781 7,075 0,411
Amostra A superfície
Média URL 4,4839 6,7301 8,54345 20,1579 4,34375 5,20005 9,1862 17,6664 2,12925 4,066 7,14695 29,29925
Desvio padrão 0,456 0,212 0,329 0,119 0,404 0,273 0,117 0,140 0,158 0,011 0,121 0,326
CV (%) 4,639 0,670 1,264 0,070 3,762 1,436 0,150 0,111 1,169 0,003 0,204 0,362
Amostra D fundo
Média URL 8,897 9,5595 12,7169 20,10485 4,1200 5,8332 8,5979 18,5428 16,7966 19,3394 21,10265 30,58005
Desvio padrão 0,070 0,123 0,164 0,050 0,080 0,220 0,382 0,150 0,210 0,380 0,768 0,650
CV (%) 0,060 0,165 0,210 0,016 0,140 0,850 1,710 0,120 0,260 0,730 9,412 1,383
Amostra D superfície
Média URL 4,60075 6,857 7,55805 15,52865 5,89305 7,7576 9,3287 18,26145 5,48015 7,69795 9,5463 19,20545
Desvio padrão 0,060 0,151 0,228 0,658 0,070 0,328 0,120 0,125 0,535 0,133 0,229 0,240
CV (%) 0,077 0,333 0,687 2,791 0,084 1,383 0,154 0,086 5,233 0,231 0,549 0,300
100
118
Figura 23: Gráficos das Curvas de Calibração e respectivas equações das retas nos meses de Outubro (A,B), Novembro (C,D) e Dezembro (E,F) de 2013. Pontos A Fundo (Losango Azul), A Meio (Quadrado Verde) e A Superfície (Triângulo Vermelho), Pontos D Fundo (Círculo Roxo) e D Superfície (Quadrado Laranja).
A B
C D
E F
119
Tabela 31: Concentrações de mercúrio biodisponível nos meses de Outubro, Novembro e
Dezembro de 2013.
Amostras Média URL Desvio padrão CV (%)
Concentração de Mercúrio (µg/L)
Outubro/2013
A fundo 6,510635 0,127 0,294 0,028
A meio 6,25385 0,193 0,662 0,012
A superfície 9,3268 0,267 0,859 0,232
D fundo 9,98755 0,050 0,027 0,003
D superfície 6,38485 0,301 1,415 0,044
Novembro/2013
A fundo 7,95315 0,013 0,002 0,050
A meio 8,4812 0,410 2,004 0,007
A superfície 7,09475 0,094 0,126 0,113
D fundo 5,8095 0,038 0,025 0,013
D superfície 8,2578 0,245 0,725 0,094
Dezembro/2013
A fundo 5,667 0,239 1,224 0,052
A meio 3,694 0,386 4,372 0,014
A superfície 8,9606 0,049 0,026 0,212
D fundo 18,9086 0,082 0,037 0,027
D superfície 8,0565 0,128 0,202 0,080
Para uma análise mais detalhada e conjunta dos resultados obtidos na análise
das amostras da Baía da Guanabara entre os meses de abril de 2012 a dezembro
de 2013 são apresentados os gráficos, Figuras 24 e 25, dos pontos A e D
separadamente, com intuito de avaliar a concentração de mercúrio disponível ao
longo dos meses. Observou-se a importância da existência de curva de calibração
para cada ponto amostrado, já que se percebeu que nem sempre um valor de
bioluminescência alto (URL alto) apresentava alto valor de concentração de mercúrio
biodisponível.
Nas Figuras 24 e 25 pode ser observado que em muitos meses a
concentração de mercúrio biodisponível encontrada foi abaixo da recomendada pela
legislação brasileira para fiscalização e gerenciamento de recursos hídricos, a
resolução CONAMA n° 357 /2005, na qual o valor é de 0,2 ppb para água salina -
classe 1.
120
Figura 245: Concentrações de mercúrio biodisponível nas amostras do ponto A.
Em uma análise geral dos resultados do ponto A, observa-se que:
O ponto A fundo do mês de setembro de 2012 apresenta a maior concentração
de mercúrio biodisponível (0,433 µg/L) nesta profundidade.
O ponto A meio do mês de setembro de 2012 foi o que apresentou o maior valor
de concentração de mercúrio biodisponível (0,438 µg/L) nesta profundidade.
O ponto A superfície apresentou 7 meses (abril, setembro e outubro de 2012, e
ainda, abril, julho, outubro e dezembro de 2013) com valores acima de 0,2 µg/L (ou
ppb), sendo o mês de setembro de 2012 o que apresentou a maior concentração
(0,484 µg/L) de mercúrio biodisponível de todos os meses amostrados.
Pode-se então dizer que na superfície da localidade A (próximo à ponte Rio -
Niterói) há uma incidência de maior concentração de mercúrio biodisponível, e
acima do permitido pela legislação, durante o período amostrado.
121
Figura 25: Concentrações de mercúrio biodisponível nas amostras do ponto D.
Em uma análise geral dos resultados do ponto D, observa-se que:
O ponto D fundo apresentou, em setembro de 2012, o maior valor de
concentração de mercúrio biodisponível (0,352 µg/L) nesta profundidade.
O ponto D superfície apresentou 5 meses (setembro, outubro, novembro e
dezembro de 2012 e ainda julho de 2013) com valores acima de 0,2 µg/L (ou ppb),
sendo o mês de setembro de 2012 o de maior concentração de mercúrio
biodisponível de todos os meses amostrados nesta profundidade (0,765 µg/L).
Também a superfície do ponto D (localidade próxima à Ilha do Governador) foi a
que apresentou a incidência de uma concentração maior de mercúrio biodisponível,
acima do permitido pela legislação, durante o período amostrado.
Quando comparados os pontos A e D, aquele que apresenta o maior valor em
concentração de mercúrio biodisponível é o ponto D no mês de setembro de 2012,
no qual a concentração foi de 0,765 µg/L.
122
Entretanto, no mês de setembro de 2012, todos os pontos apresentaram
valores altos de mercúrio biodisponível: A fundo (0,433 µg/L), A meio (0,438 µg/L), A
superfície (0,484 µg/L), D fundo (0,352 µg/L) e D superfície (0,765 µg/L).
Informações a respeito de fatores físico–químicos estudados na região, como
também análises que mostram valores acima de 0,2 µg/L, são de fundamental
importância para corroborar os resultados obtidos.
Neste contexto é importante ressaltar que é a disponibilidade do mercúrio que
permite a entrada na cadeia trófica, e para os micro-organismos metiladores isto é
determinado pela concentração de íons Hg2+ livres (ULRICH et al., 2001). São os
micro-organismos os responsáveis pela ciclagem de mercúrio, sendo capazes de
catalisar muitas das transformações entre as diferentes formas de mercúrio.
Algumas das principais transformações são a conversão do Hg2+ para metilHg e
dimetilHg e a redução do Hg2+ para Hg0 (MIRANDA et al., 2007).
Muitos deles são capazes de desenvolver mecanismos de resistência ao metal
(BARKAY, 2003). Na literatura foram encontradas relações entre a concentração de
mercúrio e a presença de micro-organismos resistentes a este (MULLER et al.,
2001). Dados sobre tais micro-organismos nos pontos de coleta seriam de
fundamental importância para ampliar a discussão. Pois não se pode discutir se os
valores nos outros pontos foram mais baixos devido a uma alta produtividade de
micro-organismos metiladores.
Aparentemente, as maiores taxas de metilação de mercúrio estão relacionadas
com pH ácido, baixa salinidade e a presença de matéria orgânica em decomposição
em condições redutoras (ULRICH et al., 2001). A microbiota associada a ambientes
redutores e com baixa concentração de sulfetos parece ser mais apta a converter o
mercúrio inorgânico em metilHg (MIRANDA et al., 2007).
Outros pontos seriam relevantes para ampliar a discussão, como por exemplo,
buscar monitoramentos na área de estudo por um período maior de tempo e ainda
obter maiores informações com relação à influência da circulação da água e a
influência das marés.
Já se sabe que o ponto D, por se encontrar próximo à Ilha do Governador,
possivelmente tem menor circulação de água, diferentemente do ponto A, que se
123
localiza nas proximidades da ponte Rio- Niterói, área que recebe um grande volume
de troca de água, promovido pelas correntes de maré (CONVÊNIO PETROBRAS-
DPC-EMGEPRON, 2004).
A literatura retrata estudos que mostram a biota da Baía de Guanabara
constantemente exposta a uma série de substâncias tóxicas lançadas no ambiente,
oriundas de diversas fontes de emissão (CANELA, 1995). Mesmo nos estudos que
apontam áreas com concentrações de mercúrio elevadas, próximas a
desembocadura do Rio São João de Meriti (BARROCAS, 1994; WASSERMAN et al.,
2000), nem sempre a biota reflete tais concentrações elevadas. Existem estudos que
revelam que os níveis de mercúrio estão abaixo de 200 ppb, inclusive em peixes
(KEHRIG et al., 1998; RODRIGUES, 2006; KHERIG et al., 2009; RODRIGUES,
2010), sendo estes liberados para consumo, já que o limite é de 500 ppb.
É importante ressaltar que a metodologia do presente estudo mede o mercúrio
biodisponível, que é considerado aquele prontamente disponível para os
organismos, diferentemente dos métodos analíticos que equipam os órgãos
fiscalizadores, os quais determinam limites máximos em concentração total, o que
seria um pouco deficiente do ponto de vista ecológico.
Deve ser levado em consideração ainda que em áreas estuarinas os
contaminantes metálicos se associam ao material particulado em suspensão,
podendo assim, não se encontrarem disponíveis para os organismos na cadeia
trófica, e não estando assim disponíveis para serem detectados pelo biossensor
(PARAQUETTI et al., 2004). Dados com material particulado em suspensão seriam
úteis para mais análises.
KEHRIG e colaboradores (2011) encontraram valores de MetilHg de 0,00028
µg/L dissolvido na coluna d’água da Baía de Guanabara, que a princípio refletem um
baixo valor. As baixas concentrações de MetilHg encontradas podem estar
relacionadas com a qualidade ambiental da Baía de Guanabara, que indicava que o
seu estado era hipereutrófico, com grande quantidade de material particulado em
suspensão e elevada produtividade biológica da área estudada. Nesta situação,
geralmente o metilmercúrio tende a se complexar fortemente ou adsorver-se ao
material particulado em suspensão, diluindo os seus lançamentos no meio e
diminuindo o tempo de residência na coluna d’água (PARAQUETTI et al., 2004).
124
Com relação a todos os dados disponíveis (concentração de mercúrio
biodisponível e dados físico-químicos) foi realizado o teste de Shapiro-Wilk (teste W)
para analisar a distribuição dos dados. Estes apresentaram uma distribuição não
normal e testes não paramétricos foram, então, aplicados, como a Correlação de
Spearman.
Neste teste a concentração de mercúrio biodisponível de cada ponto foi
correlacionada com os seguintes dados: temperatura, salinidade, oxigênio dissolvido
(OD) e pH, todos obtidos nos dias de cada coleta.
Em relação ao oxigênio dissolvido (OD) pode haver correlação caso o oxigênio
seja totalmente consumido, apresentando condições anaeróbias e geração de
condições redutoras, provocando assim um aumento da toxicidade de muitos
elementos químicos, que tornam-se mais solúveis, como os metais (Balls et al.,
1996).
A temperatura por sua vez pode influenciar na metilação uma vez que afeta
diretamente a atividade microbiana. Em alguns casos, maiores taxas de metilação
são observadas no verão em detrimento de menores taxas durante as estações com
baixa temperatura (WINFREY & RUDD, 1990; MIRANDA et al., 2007).
Entretanto, outras variáveis ambientais relacionadas à estação do ano, como
por exemplo, uma maior entrada de matéria orgânica nos sistemas aquáticos
durante essa época, pode acarretar um aumento da produtividade primária
(MIRANDA et al., 2007). Aspecto importante a ser discutido, uma vez que o mercúrio
é capaz de reduzir a fotossíntese do fitoplâncton.
Com relação à matéria orgânica, sabe-se que quanto maior a concentração de
matéria orgânica na coluna d´água, menores são as taxas de metilação. Isso se
deve a associação do mercúrio a complexos orgânicos presentes no material
particulado. Após a associação o mercúrio complexado se precipita depositando no
sedimento (WINFREY & RUDD, 1990; MIRANDA et al., 2007).
O oposto pode ocorrer nos sedimentos onde as taxas de metilação aumentam
com a entrada de matéria orgânica, principalmente na interface sedimento-água.
Essa interface apresenta um carbono mais lábil, de modo a ser mais facilmente
assimilado pela microbiota metiladora (MIRANDA et al., 2007).
125
Após observação de todas essas influências na química do mercúrio é possível
analisar os resultados das correlações apresentados nas Tabelas 32 a 33 para os
pontos A e D.
Tabela 325: Resultados da Correlação de Spearman para o ponto A.
A meio 2012 Valid N Spearman R p-level
Concentração de Hg Biodisponível (µg/L) x pH 8 0,805118 0,015905
A Tabela 32 apresenta os resultados da correlação de Spearman para o ponto
A. Observa-se que apenas a variável pH apresentou uma correlação significativa (p-
level < 0,05) no ponto A meio para o ano de 2012 ( r = 0,805118, correlação
fortemente positiva), enquanto que os outros testes para o mesmo ponto não foram
significativos. Talvez os fatores mencionados anteriormente, como influência da
maré ou atividade microbiana pudessem explicar melhor os resultados destas
correlações nos pontos amostrados. As variações de pH no meio aquático estão
relacionadas ainda com a dissolução de rochas, absorção de gases da atmosfera,
oxidação da matéria orgânica e fotossíntese (VON SPERLING, 1995). Essa
correlação significativa com a variável pH é interessante, mesmo não havendo
consenso sobre sua influência na metilação. Alguns estudos na década de 90
mostraram que as alterações do pH não afetavam o processo de metilação do
mercúrio em sedimento, mas afetavam na distribuição do metilHg entre o sedimento
e a coluna d´água (WINFREY & RUDD, 1990; MIRANDA et al., 2007). O que
poderia explicar essa correlação ocorrida apenas no ponto A meio.
Tabela 336: Resultados da Correlação de Spearman no ponto D.
D superfície 2012 Valid N Spearman R p-level
Concentração de Hg Biodisponível (µg/L) x Salinidade 8 0,738095 0,036553
A Tabela 33 apresenta os resultados da correlação de Spearman para o ponto
D. Pode ser observado que apenas a variável salinidade apresentou uma correlação
significativa (p-level < 0,05) no ponto D superfície para o ano de 2012 ( r= 0,
0,738095, correlação moderada positiva), enquanto que os outros testes para o
mesmo ponto não foram significativos.
126
Essa correlação significativa com a variável salinidade remete à questão de
como os componentes aniônicos dos sais marinhos possuem um efeito na
especiação do mercúrio nos sistemas aquáticos, por influenciar na transferência dos
grupamentos metil provenientes da metilcobalamina, além de afetar a composição
da comunidade microbiana responsável pela metilação, sendo que metilHg formado
é menos estável sob condições de alta salinidade que em condições de baixa
salinidade (MIRANDA et al., 2007).
Após os questionamentos acerca dos resultados da correlação da
concentração de mercúrio com os parâmetros físico–químicos cabe a discussão da
importância da determinação das espécies de um elemento e de sua especiação no
ambiente a ser estudado, pois são diversos os fatores que influenciam na
determinação deste metal.
E ainda, ressaltar a importância de se avaliar a biodisponibilidade, e tratar da
toxicidade do metal nos ambientes e seus possíveis efeitos tóxicos nos organismos.
O que é essencial para definir normas ambientais aceitáveis, conduzir avaliações de
risco ambiental e, mais amplamente, estabelecer políticas ambientais (URE &
DAVIDSON, 1995; CAROLI, 1996).
5.2.1.3 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS COM
AMOSTRAS AQUOSAS COM BIOSSENSOR E METODOLOGIA
PADRÃO
Com base nos resultados apresentados nos ensaios luminométricos nas
amostras aquosas da Baía de Guanabara verificou-se que os desvios padrão
obtidos foram baixos, mostrando a boa reprodutibilidade do método empregado. O
coeficiente de variação (CV) encontrado, ao longo de todo o estudo, foi sempre
inferior a 10%, significando que o procedimento analítico aplicado foi plenamente
satisfatório. Esses resultados permitem afirmar que o método com o biossensor
microbiano apresentou eficiência e aplicabilidade para ser uma ferramenta biológica
sensível de detecção do mercúrio biodisponível.
127
Para validação da metodologia, amostras da curva de calibração (com a água
deionizada) foram enviadas para análise quantitativa do mercúrio pelo método de
espectrometria de absorção atômica com vapor frio, em laboratório independente do
Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental da ENSDP-Fiocruz.
Entretanto, a metodologia espectrometria de absorção atômica com vapor frio
não apresenta sensibilidade para a faixa de concentração de mercúrio estudada pelo
biossensor microbiano. Assim, só foi possível a realização de apenas um dos pontos
da curva, na concentração de 1 µg/L, e esta foi correlacionada com a metodologia
proposta. Desta forma, a equação da reta da curva de calibração (com água
deionizada), y = 12,555x + 44,689, foi utilizada para verificação da quantidade de
mercúrio biodisponível (no biossensor) na concentração de 1 µg/L.
O resultado obtido foi de 99% do mercúrio biodisponível na metodologia do
biossensor microbiano. E na espectrometria de absorção atômica com vapor frio
obteve-se 99% de mercúrio total na amostra sintética utilizada na outra metodologia
(os experimentos foram realizados em triplicata nas duas metodologias). E assim, a
metodologia proposta apresentou mesmo padrão verificado na metodologia
tradicional (Tabela 34).
Tabela 347: Resultados da Comparação dos métodos.
Amostra Leitura no equipamento
de Hg total Concentração de Hg Total
(µg/L) % de Hg analisado nas amostras
1 0,0004 0,9982 99%
2 0,00039 0,9946 99%
3 0,0004 0,9982 99%
Amostra Leitura no equipamento
de Hg biodisponível Concentração de Hg biodisponível (µg/L) % de Hg analisado nas amostras
1 56,9505 0,98 98%
2 57,3122 1,01 100%
3 57,13135 0,99 99%
5.2.2 AMOSTRAS DE SEDIMENTOS
Os resultados dos ensaios luminométricos com as amostras reais de
sedimentos (provenientes da Baía de Guanabara) são apresentados, tendo sido
conduzidos os experimentos usando o biossensor com uma concentração celular de
0,06g/L, um fator de diluição 1:33,3 (diluição celular), e tempo de incubação para
128
produção da luciferase na câmara luminométrica de 45 minutos (parâmetros
otimizados por COSTA et al., 2011).
5.2.2.1 LIXIVIAÇÃO E CURVA DE CALIBRAÇÃO
A seguir são apresentados os resultados obtidos para as duas metodologias de
lixiviação testadas nos sedimentos da Baía de Guanabara.
5.2.2.1.1 LIXIVIAÇÃO COM ÁGUA DA BAÍA DE GUANABARA
A Tabela 35 apresenta a medida da luminescência para a curva de calibração
com amostras de sedimento das quatro localidades (Porto do Rio de Janeiro, Porto
de Niterói, Rio Iguaçu e Rio Meriti) após lixiviação com água da Baía de Guanabara,
de acordo com o procedimento descrito no item 4.3.3. Os desvios padrão obtidos
foram pequenos, na faixa de 0,001 a 0,075, indicando boa repetibilidade destes.
Observa-se ainda, que o maior valor do coeficiente de variação foi 1,798%, para a
amostra do Rio Meriti, mas todos os valores de CV < 10% indicam baixa dispersão e
valores homogêneos.
Tabela 35: Curva de calibração com amostras ambientais de sedimento do Porto do Rio de Janeiro e Porto de
Niterói lixiviados com água da Baía de Guanabara.
Porto do Rio de Janeiro Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,394 0,420 0,751 1,954
Desvio padrão 0,001 0,054 0,017 0,047
CV (%) 0,000 0,703 0,037 0,114
Porto de Niterói Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,310 0,414 0,612 1,214
Desvio padrão 0,013 0,014 0,010 0,003
CV (%) 0,053 0,047 0,016 0,001
Rio Iguaçu Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,435 0,401 0,627 0,981
Desvio padrão 0,049 0,029 0,027 0,021
CV (%) 0,563 0,208 0,118 0,043
Rio Meriti Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,373 0,309 0,384 2,294
Desvio padrão 0,038 0,075 0,024 0,021
CV (%) 0,386 1,798 0,152 0,019
129
As curvas do Porto do Rio de Janeiro e do Rio Meriti apresentaram melhores
valores de R2 (0,9831 e 0,9938, respectivamente), significando que os valores
experimentais foram mais precisos neste teste. As equações da reta podem ser
observadas na Figura 26, e foram usadas para cálculo de mercúrio nestas amostras,
apresentados na Tabela 36.
O cálculo de concentração de mercúrio biodisponível para as regiões testadas
pode ser visto na Tabela 36. Observa-se que o Rio Meriti (0,736 μg / Kg de
sedimento) apresentou a maior concentração de mercúrio biodisponível e todos os
outros apresentaram concentração de mercúrio biodisponível pouco acima de 0,5
μg/ Kg de sedimento.
Figura 26: Gráficos das curvas de calibração, Porto do Rio de Janeiro (losango azul) e Porto de Niterói (quadrado vermelho), Rio Iguaçu (triângulo verde) e Rio Meriti (círculo roxo) e as equações da reta, respectivamente.
Tabela 36: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de sedimento) no lixiviados com água da Baía de
Guanabara.
Localidade
Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de
sedimento)
Porto do Rio de Janeiro 0,528
Porto de Niterói 0,525
Rio Iguaçu 0,515
Rio Meriti 0,736
130
5.2.2.1.2 LIXIVIAÇÃO COM HCl 1M
A Tabela 37 apresenta a medida da luminescência para a curva de calibração
com amostras de sedimento de quatro localidades (Porto do Rio de Janeiro, Porto
de Niterói, Rio Iguaçu e Rio Meriti) após lixiviação com HCl 1M para cada amostra
de sedimento, de acordo com o procedimento descrito no item 4.3.3. Os desvios
padrão obtidos foram pequenos, na faixa de 0,001 a 0,112, indicando boa
repetibilidade destes. Observa-se ainda, que o maior valor do coeficiente de
variação foi 4,815%. No entanto, todos os valores de CV < 10% indicam baixa
dispersão e valores homogêneos.
Tabela 37: Curva de calibração com amostras ambientais de sedimento do Porto do Rio de Janeiro e Porto de
Niterói lixiviados com HCl 1M.
Porto do Rio de Janeiro Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,49775 0,53115 0,5698 0,9706
Desvio padrão 0,051 0,005 0,083 0,032
CV (%) 0,528 0,004 1,222 0,106
Porto de Niterói Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,3773 0,5033 0,4383 0,97625
Desvio padrão 0,001 0,089 0,073 0,004
CV (%) 0,000 1,557 1,201 0,002
Rio Iguaçu Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,25825 0,5021 0,61295 1,50185
Desvio padrão 0,112 0,005 0,047 0,022
CV (%) 4,815 0,005 0,361 0,033
Rio Meriti Concentração de Mercúrio (µg/L)
0,001 0,01 0,1 1
Média URL 0,4014 0,59785 0,7178 2,02865
Desvio padrão 0,000 0,078 0,037 0,089
CV (%) 0,000 1,010 0,187 0,389
As curvas do Porto do Rio de Janeiro e do Rio Meriti apresentaram melhores
valores de R2 (0,9964 e 0,9875, respectivamente), significando que os valores
experimentais foram mais precisos neste teste. As equações da reta podem ser
observadas na Figura 27, e foram usadas para cálculo de mercúrio nestas amostras,
apresentados na Tabela 38.
131
O cálculo de concentração de mercúrio biodisponível para as regiões testadas
pode ser visto na Tabela 38. Observa-se que o Rio Meriti (0,957 μg / Kg de
sedimento) apresentou a maior concentração de mercúrio biodisponível e todos os
outros apresentaram concentração de mercúrio biodisponível acima de 0,6 μg / Kg
de sedimento.
Figura 27: Gráficos das curvas de calibração, Porto do Rio de Janeiro (triângulo azul) e Porto de Niterói (quadrado vermelho) do Rio Iguaçu (triângulo verde) e Rio Meriti (círculo roxo) lixiviados com HCl 1M.
Tabela 38: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de solo) no lixiviados com HCl 1M.
Localidade
Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de
sedimento)
Porto do Rio de Janeiro 0,694
Porto de Niterói 0,659
Rio Iguaçu 0,675
Rio Meriti 0,957
A Figura 28 apresenta os valores de concentração de mercúrio biodisponível
(μg/Kg de sedimento) para as duas metodologias de lixiviação testadas. E ainda a
Tabela 39 apresenta uma comparação entre as duas metodologias. É importante
ressaltar que a lixiviação com HCl 1M não apresenta agentes complexantes como a
amostra ambiental.
132
Figura 28: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de sedimento).
Tabela 39: Concentração de mercúrio biodisponível (μg / Kg de sedimento).
Localidades
Porto do Rio de Janeiro
Porto de Niterói Rio Iguaçu Rio Meriti
Mercúrio (μg / Kg de sedimento) - Lixiviação com amostra da Baía de Guanabara 0,528 0,525 0,515 0,736 Mercúrio (μg / Kg de sedimento) - Lixiviação feita no ácido (HCl) 0,694 0,659 0,675 0,957
Média URL 0,611 0,592 0,595 0,847
Desvio padrão 0,117 0,095 0,113 0,156
CV (%) 2,260 1,520 2,163 2,862
Na Tabela 39 pode ser observado que ao comparar as duas metodologias os
desvios padrão estão na faixa de 0,592 a 0,847, indicando boa repetibilidade destes.
Observa-se ainda, que o maior valor do coeficiente de variação foi 2,862%, para o
Rio Meriti.
Entretanto, todos os valores de CV < 10% indicam baixa dispersão e valores
homogêneos. O que significa que estatisticamente as duas metodologias
apresentaram resultados similares em relação a concentração de mercúrio
biodisponível. Tendo em vista a complexidade das amostras ambientais o mais
133
adequado seria o uso da lixiviação com a amostra da própria localidade (neste caso
da Baía de Guanabara).
O rio Meriti foi o que apresentou a maior concentração de mercúrio (valor
médio 0,847 µg/kg de sedimento), sugerindo a amostra Rio Meriti como a mais
contaminada por mercúrio. Esse resultado pode ser consequência de anos de
atividade de uma indústria de produção de cloro e soda na porção noroeste da Baía
de Guanabara, próximo ao Rio Meriti. Essa indústria contribuiu para a poluição na
Baía através do despejo de grandes quantidades de mercúrio, que era utilizado
como catalisador (BARROCAS, 1994).
A concentração de mercúrio dos outros pontos coletados se apresentaram
menores que o Rio Meriti (cerca de 30% menores). Sabe-se que regiões de portos
possuem muita movimentação de embarcações, o que leva à poluição de metal
pesado proveniente de combustíveis. No entanto, também há uma maior circulação
de água devido ao fluxo de maré, que pode contribuir para maior aporte de mercúrio.
Maiores discussões com relação aos locais seriam possíveis caso fossem
obtidas mais amostras de sedimentos abrangendo regiões anteriormente estudadas.
Além disso, ter maiores informações com relação a influência da circulação da água,
influência das marés, composição dos sedimentos, textura, mineralogia, partículas
em suspensão, concentração de espécies, como Cl-, OH-, NH3, F-, SO4
-2 NO3, seriam
necessárias para um estudo mais detalhado da biodisponibilidade do mercúrio em
sedimentos, já que a distribuição do mercúrio no solo depende do potencial redox,
pH, do tipo de solo e outros fatores. As formas metálicas e iônicas apresentam baixa
mobilidade e, em grande parte, são adsorvidas por diferentes humatos e minerais.
O que deve ser considerado é que a metodologia proposta também pode ser
utilizada para amostras de sedimentos, o que não havia sido testado para esta
ferramenta analítica. Para uma avaliação ambiental mais completa é necessário
analisar os diferentes compartimentos ambientais, o que geraria mais discussão
acerca dos fatores de contaminação e ainda de possíveis medidas para remediação.
Como também discussões para definição de normas ambientais aceitáveis,
avaliações de risco ambiental e, mais amplamente, o estabelecimento de políticas
ambientais.
134
135
6. ANÁLISE DE CUSTOS DA TECNOLOGIA PROPOSTA
Atualmente há uma contínua demanda por novas técnicas analíticas, que
sejam capazes de avaliar os potenciais riscos para o ambiente e para a saúde
humana (CAROLI, 1996).
O desenvolvimento de um método que permita a obtenção de resultados
confiáveis frente a necessidades relacionadas à eficiência, custo, tomada rápida de
resultados e, se possível, dosagem de mercúrio biodisponível, são fatores que
levaram à pesquisa de uma metodologia baseada em biossensores (SINGH &
MITTAL, 2012).
Quando comparados aos métodos convencionais de análise, os biossensores
se tornam promissores como ferramentas alternativas e complementares aos
métodos existentes, sendo o custo operacional um dos fatores determinantes neste
aspecto.
Um estudo de custo da tecnologia a ser desenvolvida é necessário em
qualquer processo produtivo. Esse estudo leva em conta as condições materiais,
como existência e disponibilidade dos recursos materiais utilizados, e ainda, auxilia
na previsão de necessidade de mão de obra técnica ou qualificada (SILVA, 2009).
Nesses estudos de estimam-se os custos envolvidos, na qual a análise pode
ser feita com diferentes propósitos em diferentes níveis do desenvolvimento de um
processo tecnológico para saber a possibilidade da inserção do produto no mercado
comercial.
Visando a possível utilização do biossensor do presente estudo como
ferramenta complementar a um método analítico, foi necessário avaliar os gastos
envolvidos para determinação de mercúrio biodisponível pelo biossensor microbiano
bioluminescente, utilizando como biocomponente a E. coli MC 1061. E ainda realizar
uma análise esboçando uma comparação a uma metodologia já consagrada, como
por exemplo, a análise de mercúrio pelo método EPA 245.7, espectrometria de
fluorescência atômica com vapor frio.
136
A análise foi realizada com base nos equipamentos, serviços e insumos
básicos para que um laboratório, já existente, possa fazer análises usando esse
biossensor.
O procedimento para uso deste biossensor consiste em cultivar o micro-
organismo em meios e soluções específicas e previamente preparadas e deixá-lo
crescer até um ponto ideal para uso, o que leva cerca de 24h.
Nessa avaliação foram incluídos os insumos, serviços, como fornecimento de
água e de energia elétrica, aparelhagem de laboratório e matéria prima.
Dentre os reagentes estão os sais necessários para preparo de soluções
estoque, meios para cultivo do micro-organismo, e a enzima utilizada para a
produção da luminescência (luciferina).
Com relação aos reagentes foram contabilizados os valores usados na compra
das embalagens, tendo como fonte o site da Didática SP Artigos e Equipamentos
para laboratórios (dentre as diversas buscas realizadas na internet, este site
apresentava valores muito similares aos reagentes do presente estudo quando
adquiridos).
Dentre os reagentes, aqueles que apresentaram os maiores custos foram a
luciferina e o antibiótico (monossulfato de canamicina), representando cerca de 80%
do valor de R$ 4.259,01 aplicado para essa área. Sendo o valor mais expressivo o
da luciferina, custando R$ 1715,00 a embalagem. Outros materiais como tubos,
placas e alças somaram R$ 1.445,46.
Entretanto, deve ser lembrado que não se usa todo o conteúdo da embalagem
do reagente em apenas uma análise, mas sim quantidades menores e específicas.
Desta forma foi calculado o quanto seria gasto para cada experimento (nesse
momento o experimento foi tratado como uma placa com 96 poços em análise). E o
valor encontrado para os 96 poços em análise foi de aproximadamente R$ 203,10.
Nesta avaliação incluiu-se ainda o valor estimado para mão de obra. Através
de pesquisas foi avaliado que o salário correspondente a um técnico em química é
de dois salários mínimos. Baseado em um salário mínimo de R$ 788,00, (D.O.U. de
30/12/2014), o salário final de um técnico em química seria de R$ 1576,00.
137
A categoria com os maiores gastos pertence aos equipamentos. Sendo estes
considerados como gastos iniciais/investimento.
Dentre os equipamentos envolvidos no procedimento de análise do biossensor,
incluem-se os relacionados ao cultivo do micro-organismo, esterilização de materiais
e das soluções, levando em consideração apenas os equipamentos mais básicos
para o procedimento.
Sendo assim, a maior parte dos aparelhos cotados são aparelhos comuns e
necessários a qualquer laboratório que trabalhe com micro-organismos. Isso inclui
aparelhos como capela, fluxo laminar e autoclave. O único aparelho específico para
essa análise, que não é facilmente encontrado em laboratórios comuns, é o
Luminômetro, que realiza a medição da bioluminescência.
Os gastos com equipamento representaram um investimento de R$ 45.797,72.
O luminômetro representou 46% desse orçamento seguido do fluxo laminar, usando
22%. Os outros equipamentos os 32% restantes. O gasto com reagentes não
chegou a 10% do valor dos equipamentos.
Cabe ressaltar a importância da avaliação de alguns serviços como água e
energia elétrica, que são fundamentais para o funcionamento de todos os
procedimentos. Com base em dados fornecidos pela Light/RJ e pela CEDAE/RJ
chegou-se a um valor estimado para um número fixo de experimentos realizados por
mês, visto que a ambas têm sua taxa baseada no consumo de um período de
tempo.
Desta forma, estipulou-se a realização de 30 experimentos, ou seja, trinta
análises, o que inclui todo o procedimento necessário para a leitura final na placa. O
valor aproximado foi de R$ 219,00 com energia elétrica e R$ 20,83 com
fornecimento de água. Sendo o custo aproximado por experimento de R$ 7,30 com
eletricidade e R$ 0,70 com fornecimento de água (sendo um total de R$ 8,00 para
cada experimento).
Com intuito de avaliar as despesas envolvidas em um único experimento, com
serviços, mão de obra e reagentes utilizados, sem considerar nenhuma espécie de
lucro, o custo de cada análise foi de R$ 263,63, como mostra a Tabela 40. Nesta
análise foi incluída o custo de manutenção do micro-organismo.
138
Tabela 40: Custo de procedimento experimental de Análise usando Biossensor.
Categorias Valor (R$)
Reagentes 203,10
Mão de Obra 52,53
Insumos e Serviços 8,00
Total 263,63
No entanto, a placa luminométrica, na qual o experimento é realizado, contém
96 poços, portanto, pode ser considerado cada poço como uma análise. Desta
forma, o valor do custo do experimento foi dividido pelos 96 poços sendo o custo de
R$ 2,74 por amostra. O que foi considerado um valor pequeno para análise de
mercúrio quando comparado a outras metodologias.
Para comparar a metodologia do biossensor do presente estudo foi realizada
análise do preço de mercado em diferentes laboratórios que analisam e quantificam
mercúrio. Neste levantamento o valor de mercado encontrado foi utilizado para
comparação das metodologias, a qual se tratava da espectrometria de fluorescência
atômica com vapor frio (método EPA 245.7 e limite de quantificação de 0,05 µg/L ou
ppb). O valor para análise de mercúrio total foi de R$ 39,81 por cada amostra.
Ao comparar os valores que cada metodologia representa por amostras pode
ser verificado que o método envolvendo o biossensor apresenta um custo bem
menor que o método tradicional (espectrometria de fluorescência atômica com vapor
frio). Sendo o biossensor cerca de 90% mais barato em relação ao outro método.
Desta forma, pode se verificar que a metodologia que envolve biossensores
tem um custo bem menor quando comparado as metodologias tradicionais, e ainda,
que o investimento nessa tecnologia seria viável para um metal de interesse na
saúde pública, como o mercúrio.
Com isso este poderá ser aplicado para fomentar estudos de monitoramentos
em amostras ambientais de longo prazo e não apenas em coletas pontuais, como
ocorre em casos de acidentes ambientais.
139
7. CONCLUSÕES
A partir dos dados obtidos neste trabalho pode se concluir que:
A bioluminescência produzida por Escherichia coli MC1061 tem sido descrita
como uma técnica analítica sensível com potencial de aplicação para detecção de
mercúrio biodisponível em amostras de água e sedimento, o que foi comprovado
pelos resultados obtidos nesse trabalho, pois os valores de desvio padrão na maioria
dos ensaios foram baixos e todos os valores de CV < 10% indicaram baixa
dispersão e valores homogêneos.
Dentre as localidades amostradas na área de estudo, no ponto A (próximo a
Ponte Rio-Niterói) observou-se que o mês de setembro de 2012 apresentou os
maiores valores de mercúrio biodisponível (A fundo = 0,433 µg/L; A meio = 0,438
µg/L e A superfície = 0,484 µg/L). Sendo que a superfície apresentou sete meses
com valores acima de 0,2 µg/L (abril, setembro e outubro de 2012, e ainda, abril,
julho, outubro e dezembro de 2013). No ponto D (próximo a Ilha do Governador)
observou-se que o mês de setembro de 2012 também apresentou os maiores
valores de mercúrio biodisponível (D fundo = 0,352 µg/L e D superfície =0,765 µg/L).
O ponto A superfície apresentando quatro meses com valores acima de 0,2 µg/L
(setembro, outubro e novembro de 2012 e ainda julho de 2013).
As análises de correlação de Spearman apresentaram apenas dois resultados
significativos: a variável pH apresentou uma correlação significativa no ponto A meio
para o ano de 2012 (correlação fortemente positiva). Não há muito consenso na
literatura sobre a influência do pH na metilação do Hg; a variável salinidade
apresentou uma correlação significativa no ponto D superfície para o ano de 2012
(correlação moderada positiva). Remetendo à questão de como os componentes
aniônicos dos sais marinhos possuem um efeito na especiação do mercúrio nos
sistemas aquáticos, além de afetar a composição da comunidade microbiana
responsável pela metilação. Concluindo, é importante a avaliação da
biodisponibilidade do metal no ambiente.
Na validação foi possível obter 99% do mercúrio biodisponível na metodologia
do biossensor microbiano, e 99% do mercúrio na metodologia de espectrometria de
140
absorção atômica com vapor frio nas amostras da curva de calibração elaboradas
usando soluções padrões de Hg. Apresentando assim o mesmo padrão nas duas
metodologias para estas amostras. Assegurando a viabilidade técnica.
A metodologia empregada neste trabalho para a extração de mercúrio,
baseada na técnica utilizada por IVASK e colaboradores (2002), pode ser utilizada
para o biossensor em questão, pois verifica-se o sinal de luminescência nos testes
realizados. Os resultados de concentração de mercúrio biodisponível mostram que
os dois métodos de lixiviação, com água ou HCl, foram capazes de lixiviar mercúrio
biodisponível das amostras de sedimento e, portanto, foi comprovado seu potencial
de aplicação. Além disso, não foi observada diferença significativa entre essas
técnicas.
A amostra de sedimento do Rio Meriti apresentou uma fração de mercúrio
biodisponível maior que as outras amostras (valor médio = 0,847 μg/Kg de
sedimento). Para uma avaliação ambiental mais completa é necessário analisar os
diferentes compartimentos ambientais, o que geraria mais discussão a cerca dos
fatores de contaminação e ainda de possíveis medidas para remediação.
Através de uma análise preliminar de custos pode se verificar que a
metodologia que envolve biossensores tem um custo bem menor quando comparado
às metodologias tradicionais, e que o investimento nessa tecnologia é viável para um
metal de interesse na saúde pública. Podendo ser aplicado no fomento de estudos
de monitoramentos em amostras ambientais de longo prazo e não apenas em
coletas pontuais, como ocorre em casos de acidentes ambientais. Além de
impulsionar discussões para definição de normas ambientais aceitáveis, avaliações
de risco ambiental e, mais amplamente, o estabelecimento de políticas ambientais.
141
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