MICROBIOLOGIADra. Adenilde Ribeiro Nascimento

CRESCIMENTO DE MICRORGANISMOS O crescimento bacteriano considerado o aumento do nmero de indivduos e no o aumento de tamanho de uma determinada clula.

Os microrganismos em crescimento aumentam seunmero e se acumulam em colnias.

Colnias grupos de clulas que contm milhares de clulas ou populaes que agrupam bilhes de clulas.

Fatores necessrios para o crescimento microbiano TemperaturaA maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos. Cada espcie bacteriana, apresenta para o seu crescimento

uma temperatura mnima, tima e mxima. Temperatura de crescimento mnima: considerada a menor temperatura onde a espcie capaz de crescer.

Temperatura

de crescimento tima: aquela em que a

espcie apresenta o melhor crescimento. Temperatura de crescimento mxima: a temperatura mais

alta onde ainda possvel o crescimento do organismo.

Os microrganismos so classificados em trs grupos primrios considerando as variaes na temperatura de crescimento:

Crescimento mnimo

Termfilos

Mesfilos Crescimento timo

Psicrfilos

Crescimento mximo

Psicotrficos

Psicrfilos crescem a 0C . Existem dois grupos capazes de crescerem nesta temperatura. Psicrfilos pode crescer a 0C, temperatura tima de

crescimento 15C, no cresce a 20C. No causam problemas na preservao dos alimentos. Psicrotrficos crescem a 0C. Apresentam um crescimento timo nas temperaturas de 20C a 30C (temperaturas utilizadas em refrigeradores so mais encontradas em alimentos estragados).

Mesfilos

tipo

de

microrganismo

mais

comumente

encontrados, apresentando a temperatura tima de crescimento entre 25-45C. A temperatura fica tima em torno de de

crescimento de muitas bactrias patognicas 37C. So encontrados a maioria dos organismos que degradam os alimentos e que so patognicos.

Termfilos so microrganismos capazes de crescer em altas temperaturas. Muitos destes organismos tm uma temperatura tima de crescimento entre 50-60C. Alguns membros do grupo Archea, apresentam uma

temperatura timo de crescimento em torno ou superior a 80C (termfilos extremos). A temperatura que mais suporta alta o de

conhecida crescimento 110C.

bacteriano

pH: definido como a acidez ou a alcalinidade de uma soluo. A maioria das bactrias crescem melhor dentro de variaes pequenas de pH sempre perto da neutralidade, entre pH 6,5 e 7,5. Poucas bactrias so capazes de crescer em pH cido com o pH 4,0 e 9,0. Os fungos filamentosos e as leveduras podem crescer em variaes de pH inferior, entre 5,0 e 6,0. O pH timo para o crescimento dos protozorios est

geralmente entre 6,7 e 7,7. As algas tm uma variao de pH mais extensa de 4,0 a 8,5.

pH aproximado para o crescimento de alguns microrganismos de origem alimentar:pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Bolores Leveduras Alicyclobacillus spp. Salmonella spp. Acetobacter spp. Listeria monocytogenes Yersinia enterocolitica Escherichia coli Clostridium botulinum Bacillus cereus Campylobacter spp. Shigella spp. Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Clostridium perfringens

Fonte: Jay (2000)

Presso Osmtica Os microrganismos retiram da gua, presente no seu meio ambiente, a maioria dos seus nutrientes solveis necessitam de gua para seu crescimento e seu contedo celular composto de aproximadamente 80 a 90% de gua. A gua presente dentro da clula pode ser removida por elevao da presso osmtica. A perda da gua por osmose causa a plasmlise diminuio da membrana plasmtica de clula. ou a

Adio de sais (ou outros solutos) aumento da pressoosmtica preservao dos alimentos. Exemplo: Peixe salgado, mel, leite condensado, etc. (alta

concentrao de sal ou de acar, remove a gua do interior daclula microbiana impedindo o seu crescimento). Algumas bactrias necessitam de algumas concentraes de

sais

para

o

seu

crescimento,so

denominadas

haloflicas

obrigatrias. Bactrias haloflicas facultativas, so mais comumente

encontradas e no necessitam de altas concentraes salinas para crescerem (at 2% de NaCl).

Atmosfera Gasosa De acordo com a resposta ao oxignio gasoso, os

microrganismos so divididos em quatro grupos fisiolgicos:

1. Microrganismos aerbios estritos2. Microrganismos anaerbios estritos 3. Microrganismos facultativos 4. Microrganismos microaerbios

Microrganismosque

Aerbios

de

organismos

necessitam

oxignio para a sua sobrevivncia, so denominados aerbicos estritos ou obrigatrios.

Facultativos so aqueles que crescem na presena do ar

atmosfrico e podem tambm crescer em anaerobiose. Microaeroflos so microrganismos aerbicos necessitando de ar. oxignio. So capazes de crescer somente em

concentraes de oxignio inferiores queles encontradas no

Anaerbios os microrganismos anaerbios so aqueles que podem ser mortos pelo oxignio, no podem crescer em presena do ar e no utilizam oxignio para as reaes de produo de energia. Anaerbios Estritos so mortos por uma breve exposio ao

oxignio. Anaerbios Facultativos podem utilizar capazes oxignio quando este est de continuar seu

disponvel, mas na sua ausncia socrescimento.

DIVISO BACTERIANA As bactrias normalmente se multiplicam pelo processo de reproduo assexuada, um processo que no envolve clulas

sexuais (fisso binria). Poucas espcies bacterianas podem se reproduzir por

brotamento .

TEMPO DE GERAO o tempo necessrio para uma celular se dividir. Este tempo pode sofrer variaes entre os organismos e depende das condies ambientais, meio de cultura, etc. A maioria das bactrias apresentam um tempo de gerao de 1 a 3 horas, mais algumas bactrias podem necessitar de mais de 24 horas para cada gerao.

CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO Demonstra o crescimento das clulas durante um

perodo de tempo. A maioria obtida quando se realiza a contagem da populaes em intervalos de tempo, aps o inoculo de um nmero pequeno de bactrias no meio lquido. Existem basicamente quatro fases de crescimento: 1. Fase lag: No h multiplicao;

Sintetizao das enzimas.

2. Fase exponencial: Duplicao da populao; Perodo de maior atividade metablica da clula; Sensibilidade s mudanas ambientais; Sensibilidade aos compostos antimicrobianos.

3. Fase estacionria: Taxa de crescimento igual de morte; Esgotamento de nutrientes; Mudanas de ambientes; Produtos txicos.

4. Fase de morte: O nmero de clulas mortas maior do que o nmero de

clulas vivas;

Exemplo de curva de crescimento dos microrganismos:

Curva de Crescimento Padro, em um sistema fechado

FATORES PARA PREVENO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Embalagem com atmosfera modificada;

Altas presses hidrostticas; Luz ultravioleta; Bacteriocinas; Salga; Acidificao; Processamento trmico; Adio de conservantes qumicos.

MEIOS DE CULTURA PARA O CULTIVO DE BACTRIAS Um meio de cultura definido como uma mistura de nutrientes necessrios ao crescimento microbiano e os microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura so denominados cultura. O cultivo em laboratrio das clulas microbianas necessrio para caracterizar as propriedades morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas. Fonte de energia; carbono; nitrognio e fsforo; Isolamento;

Identificao.

rea de Pesquisa: Alimento; gua;

Clnica.

CARACTERSTICAS DO MEIO DE CULTURA Conter quantidade de gua necessria; pH ajustado; Ser estril.

CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURAA) Quanto consistncia: Meio Lquido (Caldo) aquele em que os nutrientes esto dissolvidos em uma soluo aquosa. Ex: caldo

lactosado, caldo lauril, caldo verde brilhante e caldo EC. Meio Semi-slido Alm dos nutrientes adicionado Agar (pequena porcentagem). Ex.: Meio SIM; Meio Slido (Agar) um meio que possui na sua composio nutrientes e Agar-Agar (1,5%). Ex.: Agar Eosina Azul de Metileno, Agar Rambac e Agar m-Enterococcus.

B) Quanto funo: Meio de Enriquecimento aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas no inibem o crescimento de outros. O meio favorece o crescimento da espcie desejada. Exemplo: Caldo Tetrationato usado para a recuperao de clulas de Salmonella

sp. Meio Seletivo aquele que contm substncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, porm permite o crescimento de outros.

Meio Diferencial Este meio possui substncias que evidenciam uma caracterstica que permite separar um grupo ou uma espcie de microrganismo. Essas substncias podem ser carboidratos ou outras. Exemplo: Agar MacConkey e Agar Eosina Azul de Metileno inibidores do crescimento de bactrias gram-positivas; tambm permitem diferenciar as bactrias gram-negativas (fermentadores e

no fermentadores de lactose); Meio de Manuteno a manuteno adequada da viabilidade e das caractersticas fisiolgicas de uma cultura pode exigir um meio

diferente daquele que recomendado para o crescimento timo. Ocrescimento rpido pode estar associado com uma rpida morte celular devido eliminao de substncias txicas como produto de metabolismo dos microrganismos. Exemplo: Agar Nutriente, Agar Triptona de Soja.

C) Quanto Natureza: Meio Sinttico aquele no qual a composio qumica exata definida. Ex: Caldo Lactosado, Agar Baird-Parker. Meio No-sinttico constitudo por compostos de nutrientes como extratos de levedura, de carne ou de plantas. Ex: Agar Sangue.

PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA As instrues completas para a preparao de cada meio de cultura esto contidas nos rtulos dos produtos. Ento se recomenda os seguintes cuidados:

Prepare o meio em um recipiente de volume maior do que o volume a ser preparado, para se permitir uma melhor hidratao, mistura e aerao adequada; Pese meio de cultura em uma rea livre de corrente de ar e com pouca umidade. Evite contato com a pele e a inalao do p durante a pesagem. Pese com preciso e rapidamente, no expondo ao ar mais do que o necessrio. Feche o frasco rapidamente. Retorne o meio ao local de estocagem; Os meios que contm Agar devem permanecer, em geral, durante 5 a 10 min. em repouso na gua antes de serem aquecidos, para se permitir que as partculas de Agar se reidratem adequadamente, elevando a solubilidade do Agar e resultando em um gel mais uniforme.

ESTERILIZAO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura, antes de sua utilizao, devem ser esterilizados. Esterilizao em microbiologia significa ausncia total de qualquer forma de microorganismos existentes no material; O vapor dgua sob presso incontestavelmente o meio mais eficaz de esterilizao e faz-se em aparelho adequado autoclave. A temperatura adequada para a esterilizao de 121C/15min para meios de cultura e vidrarias e de 127C/30min para material contaminado;

O princpio da autoclave se baseia em um recipiente fechado em que a gua aquecida, e o vapor dgua fica retido sob presso, podendo atingir temperaturas muito elevadas sem ferver. O calor mido tem poder de penetrao superior ao calor seco e constitui, por isso, o agente esterilizante mais eficaz. O calor mido sob presso de ao esterilizante ainda mais energtica que a do vapor fluente.

Durante o procedimento de esterilizao dos meios de cultura recomenda-se: Fechar o frasco com tampes de algodo e gases, permitindo uma pequena folga da tampa antes de autoclavar, e apertar bem a tampa aps o meio ter sido esterilizado, para prevenir a perda de umidade e

possveis contaminaes; Marque corretamente o intervalo de tempo de autoclavao. O tempo normal comear quando a presso e a temperatura tiverem alcanado a temperatura de 121C; No autoclavar excessivamente o meio de cultura. A autoclavao excessiva pode levar a formao de precipitados, alterao de pH, caramelizao, reduo do poder gelificante dos meios com agar e

alterao das respostas dos microrganismos cultivados; Atentar para instrues contidos nos rtulos de cada produto, pois existem meios que no devem ser autoclavados.

Como

os

microrganismos

so

classificados

e

identificados ? Caracterizao dos microrganismos Populao microbiana espcies diferentes Cultura mista Cultura pura

Isolamento e Cultivo de Cultura Pura Meio de cultura

Inculo

Manobras Asspticas

Tcnicas de Inoculao

Tcnica de semeadura em meios lquidos; Tcnicas de semeadura em meio slido inclinado;

Tcnica de semeadura em meio slido em tubo

(repicagem profunda);

Tcnica

se

semeadura

em meio slido em placas (tcnica de esgotamento estrias);

Exemplo da tcnica de semeadura em meio slido emplacas (tcnica de esgotamento);

Inoculao em profundidade (Pour-plate)

Adio do inculo

Adio do meio de cultura

Contagem

Inoculao em superfcie (Spread-plate)

Retirada do inculo

Adio do inculo

Ala de Drigalski

Espalhamento do inculo

Contagem

A semeadura consiste em :

a) Grande N de estrias;

b) No perfurar o meio de cultura;c) No voltar a ala sobre a estria;

d) Pouca quantidade de inculo para semear;

Tcnica de semeadura em placas Pour-Plate Colnias isoladas; Quantitativo- Contagem de colnias em placas; Qualitativo;

Identificao dos Microrganismos Uso de diferentes meios de cultura;

Diferentes reaes bioqumicas;

Microscpio ;

Meu Deus, que maravilhas existem em

uma criatura to pequena!Leeuwenhoek